JP2002543831A

JP2002543831A - スフィンゴシンキナーゼ

Info

Publication number: JP2002543831A
Application number: JP2000618434A
Authority: JP
Inventors: ピットソン，スチュアート，マックスウエル; ワッテンバーグ，ブライアン，ウルフ; シャ，プ; ダンドレア，リチャード，ジェイムス; ギャンブル，ジェニファー，ルース; ベイダス，マシュー，アレキサンダー
Original assignee: Johnson and Johnson Research Pty Ltd
Current assignee: Johnson and Johnson Research Pty Ltd
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-12-24
Also published as: EP1192247A4; CA2372541A1; DE60027295D1; DE60027295T2; EP1192247A1; US7112427B2; US20070071752A1; KR100798375B1; NZ515132A; EP1192247B1; US6730480B1; WO2000070028A1; US20040132053A1; DK1192247T3; ATE323153T1; EP1192247B9; ES2261200T3; KR20020000805A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、細胞活性を調節し得る新規タンパク質分子、詳細には、シグナル伝達の調節を介して細胞活性を調節しうる新規タンパク質分子、ならびにその誘導体、類似体、化学的等価物および模倣体に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ、ならびにその誘導体、類似体、化学的等価物および模倣体に関する。本発明はまた、上記タンパク質分子ならびにその誘導体、類似体、化学的等価物および模倣体をコードする遺伝子配列をも包含する。本発明の分子は、治療、予防、および診断の用途の範囲で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野本発明は、一般に、細胞活性を調節し得る新規タンパク質分子、詳細には、シ
グナル伝達の調節を介して細胞活性を調節しうる新規タンパク質分子、ならびに
その誘導体、類似体、化学的等価物および模倣体に関する。さらに詳細には、本
発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ、ならびにその誘導体、類似体、化学的等
価物および模倣体に関する。本発明はまた、上記タンパク質分子ならびにその誘
導体、類似体、化学的等価物および模倣体をコードする遺伝子配列をも包含する
。本発明の分子は、治療、予防、および診断の用途の範囲内において有用である
。

【０００２】発明の背景本明細書中に発明者らにより引用される刊行物の詳細な目録は、発明の詳細な
説明の末尾にアルファベット順に列挙されている。

【０００３】スフィンゴシンキナーゼは、さまざまな細胞応答において重要な制御酵素であ
る。その活性は、炎症、アポトーシスおよび細胞増殖において作用するため、治
療的処置にとって重要な標的である。

【０００４】スフィンゴシン-1-リン酸は、シグナル伝達において重要な二次メッセンジャ
ーであることが知られている(Meyerら、1997)。様々な細胞型において細胞分裂
を促進し(Alessenko、1998；Spiegelら、1998)、そして、セラミド誘導性アポト
ーシスの防止(Culliverら、1996)、IP₃非依存的経路による細胞内カルシウム動
員、DNA合成の刺激、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPキナーゼ)経路
の活性化、ホスホリパーゼDの活性化、および細胞運動の制御などを含む、広範
にわたる重要な制御経路の誘因であると考えられる(総説には、Meyerら、1997；
Spiegelら、1998；Igarashi.,1997を参照のこと)。

【０００５】スフィンゴシン-1-リン酸は、腫瘍壊死因子-α(TNFα)に対する血管内皮細胞
の炎症応答における必須のシグナル伝達媒体であることが最近の研究により示さ
れた(Xiaら、1998)。このような顕著な重要性があるにもかかわらず、細胞内の
スフィンゴシン-1-リン酸のレベルを制御する機構はほとんど知られていない。
細胞内のスフィンゴシン-1-リン酸のレベルの大部分は、スフィンゴシンからの
スフィンゴシンキナーゼによる生成により媒介されており、また、その一部分が
小胞体結合性スフィンゴシン-1-リン酸リアーゼおよびスフィンゴシン-1-リン酸
ホスファターゼによる分解により媒介されていることが知られている(Spiegelら
、1998)。細胞内スフィンゴシン-1-リン酸の通常のレベルは概して低レベルであ
るが、分裂促進剤に細胞が曝露されると、急激に一過性に増大しうる。この応答
は、細胞質におけるはスフィンゴシンキナーゼ活性の増大と相関していると考え
られ、スフィンゴシンキナーゼ阻害分子であるN,N-ジメチルスフィンゴシンおよ
びDL-スレオ-ジヒドロスフィンゴシンの添加により該応答は阻止される。このこ
とは、スフィンゴシンキナーゼが、細胞内スフィンゴシン-1-リン酸レベルの制
御を担う重要な分子であることを示唆する。このことにより、スフィンゴシンキ
ナーゼは、細胞内のスフィンゴシン-1-リン酸に起因する影響を媒介する主要な
必須の役割を担っている。

【０００６】したがって、スフィンゴシンキナーゼの発現および酵素活性の制御機構の解明
などを通して、細胞内シグナル伝達のより微妙な制御の開発を促進するために、
新規のスフィンゴシンキナーゼ分子を特定しクローン化する必要がある。それに
よって、スフィンゴシンキナーゼの発現または活性を制御するための処置的治療
の開発に対する基盤が提供される。本発明に至る研究によって、発明者らは新規
スフィンゴシンキナーゼ分子を精製し、クローニングした。

【０００７】発明の概要本明細書は、本明細書の末尾に添付のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の
情報(プログラムPatentIn Version 2.0を用いて作製した)を含む。各ヌクレオチ
ド配列またはアミノ酸配列は、配列表中で、数字表記<210>の後に記載の配列識
別番号を示して特定されている(例えば、<210>1、<210>2など)。配列の長さ、配
列の種類(DNA、タンパク質(PRT)など)および各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列
の由来する生物は、それぞれ数字表記<211>、<212>および<213>の欄に情報を記
載している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、数字表記<400>の後に配列識
別番号を付した欄(例えば、<400>1、<400>2など)に記載の情報により特定される
。

【０００８】本明細書全体および特許請求の範囲において、前後の文脈から他の意味が求め
られていない限り、「含む」という語およびその活用形は、記載のものもしくは
工程または一群のものもしくは工程を包含することを意味するが、他のものもし
くは工程または一群のものもしくは工程を排除することを意味するわけではない
。

【０００９】本発明の1態様は、新規スフィンゴシンキナーゼタンパク質もしくはスフィン
ゴシンキナーゼタンパク質の誘導体もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配
列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核
酸分子またはその誘導体もしくは類似体を提供する。

【００１０】本発明の別の態様は、ヒトスフィンゴシンキナーゼタンパク質もしくはヒトス
フィンゴシンキナーゼタンパク質の誘導体もしくは模倣体をコードするヌクレオ
チド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸分子またはその誘導体もしくは類似体を提供する。

【００１１】本発明のさらに別の態様は、実質的に＜400＞２に示されるアミノ酸配列もし
くはその誘導体もしくは模倣体または＜400＞２に示されるアミノ酸配列中の少
なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％以上の類似性を有す
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に相
補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子またはその誘導体もしくは類似体を提
供する。

【００１２】本発明のさらに別の態様は、実質的に＜400＞１に示されるヌクレオチド配列
もしくはその誘導体、または＜400＞１に示されるヌクレオチド配列に低ストリ
ンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む、核酸分子
またはその誘導体もしくは類似体を包含する。

【００１３】本発明のさらに別の態様は、実質的に＜400＞１に示されるヌクレオチド配列
もしくはその誘導体、または＜400＞１に示されるヌクレオチド配列に低ストリ
ンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、かつ、＜
400＞２に示されるアミノ酸配列、または＜400＞２に示されるアミノ酸配列中の
少なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有する
アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列をコードする、核酸分子またはその誘導体
もしくは類似体を包含する。

【００１４】本発明のさらに別の態様は、実質的に＜400＞１に示されるヌクレオチド配列
を含む、核酸分子を包含する。

【００１５】本発明のさらに別の態様は、42℃にて低ストリンジェンジー条件下で＜400＞
１に示されるヌクレオチド配列またはその誘導体にハイブリダイズしうる、ゲノ
ム核酸分子またはその誘導体もしくは類似体を包含する。

【００１６】本発明のさらに別の態様は、＜400＞１に示されるヌクレオチド配列、または
＜400＞１に示されるヌクレオチド配列に対して類似性を有するヌクレオチド配
列を含有するその誘導体もしくは類似体を含むcDNA配列を提供する。

【００１７】本発明のさらに別の態様は、＜400＞２に示されるアミノ酸配列もしくは上記
に定義するようなその誘導体、類似体もしくは化学的等価物もしくは模倣体、ま
たは＜400＞２に示されるアミノ酸配列もしくはその誘導体もしくは模倣体中の
少なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有する
誘導体もしくは模倣体を提供する。

【００１８】本発明のさらに他の態様は、（i）新規のスフィンゴシンキナーゼタンパク質またはその誘導体、類似体、
化学的等価物もしくは模倣体、 (ii)ヒトスフィンゴシンキナーゼタンパク質またはその誘導体、類似体、化学
的等価物もしくは模倣体、 (iii)実質的に＜400＞２に示されるアミノ酸配列もしくはその誘導体もしくは
模倣体または＜400＞２に示されるアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続する
アミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有する配列を有するタンパク質ま
たは該タンパク質の誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体、 (iv) 実質的に＜400＞1に示されるヌクレオチド配列もしくはその誘導体もし
くは模倣体または＜400＞2に示されるアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続す
るアミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有するアミノ酸配列をコードす
る配列によりコードされるタンパク質または該タンパク質の誘導体、類似体、化
学的等価物もしくは模倣体、 (v)＜400＞1に示されるヌクレオチド配列またはその誘導体もしくは模倣体に
、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、かつ、実質的に＜
400＞２に示されるアミノ酸配列もしくはその誘導体もしくは模倣体または＜400
＞２に記載のアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少な
くとも約45％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子によりコード
されるタンパク質、 (vi)ホモ二量体を形成している、上記(i)、(ii)、(iii)、(iv)、または(v)に
定義されるタンパク質、 (vii)ヘテロ二量体を形成している、上記(i)、(ii)、(iii)、(iv)、または(v)
に定義されるタンパク質、からなるリストから選択される単離されたタンパク質に関する。

【００１９】本発明の他の態様は、哺乳動物内のスフィンゴシンキナーゼ活性を調節する方
法であって、スフィンゴシンキナーゼ活性を増大または低減させるために十分な
条件下で十分な時間にわたって、調節に有効な量の薬剤を該哺乳動物に投与する
ことを含む上記方法を包含する。

【００２０】本発明のさらに他の態様は、哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であ
って、スフィンゴシンキナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現またはスフ
ィンゴシンキナーゼの活性の調節に十分な条件下で十分な時間にわたって、有効
量の薬剤を該哺乳動物に投与することを含む上記方法を提供する。

【００２１】本発明のさらに他の態様は、哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であ
って、有効量のスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を
該哺乳動物に投与することを含む上記方法を包含する。

【００２２】本発明のさらに他の態様は、哺乳動物を処置する方法であって、スフィンゴシ
ンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナーゼの活性を調節するために
十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の薬剤を該哺乳動物に投与するこ
とを含み、上記の調節により細胞の機能活性が調節されることを特徴とする上記
方法に関する。

【００２３】本発明のさらに他の態様は、哺乳動物を処置する方法であって、細胞の機能活
性の調節に十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量のスフィンゴシンキナ
ーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を該哺乳動物に投与することを含む上
記方法に関する。

【００２４】本発明のさらに他の態様は、細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造に
おける、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナーゼの
活性を調節可能な薬剤の使用に関する。

【００２５】本発明のさらに他の態様は、細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造に
おける、スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の使用に
関する。

【００２６】本発明のさらに他の態様は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフ
ィンゴシンキナーゼの活性の調節に使用するための薬剤であって、上記の調節に
より細胞の機能活性が調節されることを特徴とする上記薬剤に関する。

【００２７】本発明の他の態様は、細胞の機能活性の調節に使用するためのスフィンゴシン
キナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。

【００２８】本発明の関連する態様では、処置を受ける哺乳動物は、治療的または予防的処
置の必要なヒトまたは動物である。

【００２９】本発明のさらなる他の態様では、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子、スフィンゴ
シンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現もしくはスフィンゴ
シンキナーゼ活性を調節可能な薬剤を、１種以上の製薬上許容し得る担体および
/または希釈剤とともに含む、医薬組成物を包含する。スフィンゴシンキナーゼ
遺伝子、スフィンゴシンキナーゼ、または上記薬剤を、活性成分という。

【００３０】本発明のさらなる他の態様は、被検体から得た生物学的サンプル中のスフィン
ゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼｍRNAを検出するための方法であ
って、抗体-スフィンゴシンキナーゼ複合体または抗体-スフィンゴシンキナーゼ
mRNA複合体を形成するために十分な条件下で十分な時間にわたって、該生物学的
サンプルをスフィンゴシンキナーゼもしくはスフィンゴシンキナーゼｍRNA、ま
たはその誘導体もしくは類似体に特異的な抗体と接触させ、その後、該複合体を
検出することを含む上記方法を包含する。

【００３１】本明細書中で用いる1文字表記および3文字表記を表1に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】詳細な説明本発明は、新規スフィンゴシンキナーゼ分子の精製とクローニングに一部基づ
くものである。この新規分子の同定により、治療、診断および抗体作製に使用す
る（例えば、シグナル伝達に使用する）産物の同定および合理的な設計が可能と
なる。また、これらの治療用分子を、スフィンゴシンキナーゼ機能のアンタゴニ
ストもしくはアゴニストとして作用させてもよく、とりわけ望ましくない細胞活
性を特徴とする疾患状態の治療において、細胞活性の調節に有用であろう。

【００３４】従って、本発明の一態様は、新規スフィンゴシンキナーゼタンパク質、または
該スフィンゴシンキナーゼタンパク質の誘導体もしくは模倣体をコードするヌク
レオチド配列またはその配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離さ
れた核酸分子、またはその誘導体もしくは類似体を提供することである。

【００３５】「スフィンゴシンキナーゼ」という用語は、とりわけ、スフィンゴシンキナー
ゼシグナル伝達経路活性化の際のスフィンゴシン-1-リン酸の生成に関与する分
子を指すものとして理解されるべきである。イタリック体で記載される「スフィ
ンゴシンキナーゼ」という用語は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子を指すもの
として理解されるべきである。非イタリック体で記載される「スフィンゴシンキ
ナーゼ」という用語は、スフィンゴシンキナーゼタンパク質分子を指すものとし
て理解されるべきである。

【００３６】さらに詳細には、本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼタンパク質、または
該スフィンゴシンキナーゼタンパク質の誘導体もしくは模倣体をコードするヌク
レオチド配列もしくはその配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子、またはその誘導体もしくは類似体を提供する。

【００３７】好ましい実施形態において、本発明は、実質的に<400>2に示されるアミノ酸配
列またはその誘導体もしくは模倣体、または<400>2に示される配列中の少なくと
も10個の連続したアミノ酸に対して少なくとも約45％以上の類似性を有するアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列に相補的
なヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその誘導体もしくは類似体を提供する
。

【００３８】本明細書で使用される「類似性」という用語は、ヌクレオチドもしくはアミノ
酸レベルでの比較配列間の厳密な同一性を含む。ヌクレオチドレベルで非同一性
である場合に、結果として異なるアミノ酸を生じるが、これらのアミノ酸が構造
的、機能的、生化学的および/または立体配座的レベルでお互いに関連している
場合の配列間の相違は、「類似性」に含まれる。アミノ酸レベルで非同一性であ
る場合でも、これらのアミノ酸が構造的、機能的、生化学的および/または立体
配座的レベルでお互いに関連している場合のアミノ酸は、「類似性」に含まれる
。類似性のパーセンテージは、50％を上回る、例えば、少なくとも70％、少なく
とも80％、少なくとも90％、少なくとも95％またはそれを上回る％であり得る。

【００３９】本発明の別の態様は、実質的に<400>1に示されるヌクレオチド配列もしくはそ
の誘導体、または低ストリンジェンシー条件下で<400>1に示される配列とハイブ
リダイズすることが可能なヌクレオチド配列を含む核酸分子、もしくはその誘導
体もしくは類似体を意図する。

【００４０】本明細書において低ストリンジェンシーという用語は、ハイブリダイゼーショ
ン条件がホルムアミドは少なくとも約0％v/vから少なくとも約15％v/vまでで、
かつ塩は少なくとも約1Mから少なくとも約2Mまでであり、さらに洗浄条件が少な
くとも約1M〜少なくとも約2Mの塩であることを含んで包含する。必要に応じて、
別のストリンジェンシー条件を適用してもよい。このようなストリンジェンシー
条件の例としては、ハイブリダイゼーション条件が少なくともホルムアミドは約
16％v/vから少なくとも約30％v/vまででありかつ塩は少なくとも約0.5Mから少な
くとも約0.9Mまでであり、さらに洗浄条件が少なくとも約0.5Mから少なくとも約
0.9Mまでの塩であることを含んで包含する中程度のストリンジェンシー、および
ハイブリダイゼーション条件がホルムアミドは少なくとも約31％v/vから少なく
とも約50％v/vまででありかつ塩は少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mまで
であり、さらに洗浄条件が少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩であるこ
とを含んで包含する高ストリンジェンシーがある。ストリンジェンシーは、例え
ば約40〜約65℃の温度範囲を用いて測定され得る。特に有用なストリンジェンシ
ー条件は、42℃である。一般的に、洗浄はT_m = 69.3 + 0.41(G+C)％[19] = -12
℃で行われる。しかしながら、二重鎖DNAのT_mは、ミスマッチの塩基対数が1％増
えるごとに1℃低減する（Bonnerら(1973) J.Mol.Biol, 81: 123）。

【００４１】好ましくは、本発明は、実質的に<400>1に示されるヌクレオチド配列もしくは
その誘導体を含む核酸分子またはその誘導体もしくは類似体、または低ストリン
ジェンシー条件下で<400>1に示される配列にハイブリダイズ可能な核酸分子また
はその誘導体もしくは類似体、ならびに<400>2に示されるアミノ酸配列に相当す
るアミノ酸配列、または<400>2に示される配列中の少なくとも10個の連続するア
ミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有する配列をコードする核酸分子ま
たはその誘導体もしくは類似体を意図する。

【００４２】さらに特に好ましくは、本発明は実質的に<400>1に記載のヌクレオチド配列を
含む核酸分子を意図する。

【００４３】本発明のこの態様における核酸分子は、本明細書ではヒトスフィンゴシンキナ
ーゼ遺伝子に相当する。いかなる理論もしくは作用様式にも本発明は限定されな
いが、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子によりコードされるタンパク質は、スフィ
ンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の機能において重要なエレメントである。ス
フィンゴシンキナーゼは、二次メッセンジャーであるスフィンゴシン-1-リン酸
の生成を促進するように作用し、以下の機構： (a) 翻訳後修飾(例えば、リン酸化またはタンパク質分解切断)、 (b) タンパク質-タンパク質相互作用(例えば、二量体化)およびGタンパク質共役
型受容体介在性相互作用、 (c) 転位現象（酵素は、触媒活性を増大させるか、またはその基質に接近しうる
環境に向かう）、によって活性化され得る。

【００４４】ヒトスフィンゴシンキナーゼ遺伝子核酸分子の発現産物は、ヒトスフィンゴシ
ンキナーゼである。スフィンゴシンキナーゼは、<400>2に示されるアミノ酸配列
により定義される。スフィンゴシンキナーゼのcDNA配列は、<400>1に示されるヌ
クレオチド配列により定義される。スフィンゴシンキナーゼをコードする核酸分
子は、デオキシリボ核酸の配列(例えば、cDNA配列またはゲノム配列)であること
が好ましい。ゲノム配列は、またエキソンおよびイントロンを含んでなっていて
もよい。ゲノム配列はまた、プロモーター領域もしくは他の制御領域を含んでい
てもよい。

【００４５】本発明の別の態様は、42℃で低ストリンジェンシー条件下において<400>1に示
される配列もしくはその誘導体にハイブリダイズ可能なゲノム核酸分子もしくは
その誘導体を意図する。

【００４６】本明細書においてスフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシンキナーゼ遺伝子
という用語は、それぞれヒトスフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシンキナ
ーゼ遺伝子のすべての形態（例えば、スフィンゴシンキナーゼmRNAの選択的スプ
ライシングから生じるペプチドおよびcDNAアイソフォーム、スフィンゴシンキナ
ーゼ遺伝子もしくはスフィンゴシンキナーゼの突然変異体もしくは多形性変異体
、スフィンゴシンキナーゼの翻訳後修飾形態もしくは非翻訳後修飾形態が挙げら
れる）を指すものとして理解されるべきである。特に明記しない限りは、本明細
書ではスフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシンキナーゼ遺伝子という用語
には、それらの誘導体、類似体、化学的等価物および模倣体が含まれる。

【００４７】タンパク質および/または遺伝子は、ヒト由来であることが好ましい。しかし
ながらタンパク質および/または遺伝子は、また他の動物または動物以外の種か
ら単離することができる。

【００４８】誘導体には、天然、合成、または融合タンパク質を含む組換えに由来する断片
、一部、部分、突然変異体、変異体および模倣体が含まれる。一部もしくは断片
には、例えばスフィンゴシンキナーゼの活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ
酸の挿入、欠失、または置換によって誘導され得る。アミノ酸挿入誘導体には、
単一もしくは複数アミノ酸のアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合体
ならびに配列内挿入体が含まれる。挿入アミノ酸配列変異体は、1つ以上のアミ
ノ酸残基がタンパク質内の予定された部位に導入されたアミノ酸配列であるが、
無作為的挿入も、得られる産物の適切なスクリーニングを用いることで可能とな
る。欠失変異体は、配列から1つ以上のアミノ酸を除去することを特徴とする。
アミノ酸置換変異体は、その配列内の少なくとも1残基が除去され、さらにその
場所に異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸置換変異体の例としては、
保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換には、典型的には、グリシンと
アラニン；バリン、イソロイシンとロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；
アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニン；および
フェニルアラニンとチロシンのグループでの置換が含まれる。アミノ酸配列に対
する付加には、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合が含ま
れる。

【００４９】スフィンゴシンキナーゼ遺伝子およびスフィンゴシンキナーゼの化学的および
機能的等価物は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子もしくはスフィンゴシンキナー
ゼの任意の1種以上の機能活性を示す分子として理解されるべきであり、化学合
成されるか、またはスクリーニング法(例えば、天然産物スクリーニング）を介
して同定されるような任意の供給源に由来しうる。

【００５０】スフィンゴシンキナーゼの誘導体には、ペプチド、ポリペプチド、またはタン
パク質様もしくは非タンパク質様分子に融合された、全スフィンゴシンキナーゼ
タンパク質の特定のエピトープもしくは一部を有する断片が含まれる。

【００５１】本明細書中で意図するスフィンゴシンキナーゼの類似体には、限定されるもの
ではないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の際
に非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体を組込むこと、および架橋剤を
使用すること、ならびにタンパク質様分子またはそれらの類似体に立体配座的制
限を与える他の方法などが含まれる。

【００５２】核酸配列の誘導体は、同様に他の核酸分子との融合を含めた単一もしくは複数
ヌクレオチドの置換、欠失、および/または付加から誘導し得る。本発明の核酸
分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、
核酸分子のコサプレッション（cosuppression）および融合に使用するのに好適
な分子が含まれる。核酸配列の誘導体には、また縮重変異体が含まれる。

【００５３】本発明の意図する側鎖修飾の例としては、アミノ基の修飾が含まれ、例えば、
アルデヒドと反応させた後NaBH₄を用いて還元することによる還元的アルキル化
；メチルアセチミデートを用いるアミド化；酢酸無水物を用いるアシル化；シア
ネートを用いるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン
酸(TNBS)を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化；コハク酸無水物およびテト
ラヒドロフタル酸無水物を用いるアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-5-
リン酸を用いるリジンをピリドキシル化後のNaBH₄を用いる還元などが挙げられ
る。

【００５４】アルギニン残基のグアニジン基を、試薬(例えば、2,3-ブタンジオン、フェニ
ルグリオキサールおよびグリオキサール）を用いて複素環縮合生成物を形成する
ことによって修飾することができる。

【００５５】カルボキシル基を、O-アシルイソ尿素形成を介するカルボジイミド活性化、次
いで例えば対応するアミドへの誘導体化によって修飾することができる。

【００５６】スルフヒドリル基を、以下の方法、例えばヨード酢酸もしくはヨードアセトア
ミドを用いたカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール
化合物との混合二硫化物の形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換
マレイミドとの反応；4-クロロマーキュリベンゾエート、4-クロロマーキュリフ
ェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロマーキュリ-4-ニトロフェノー
ルおよび他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでのシアネートを
用いるカルバモイル化によって、修飾することができる。

【００５７】トリプトファン残基を、例えばN-ブロモスクシンイミドを用いた酸化、または
臭化2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルもしくはハロゲン化スルフェニルを用いた
インドール環のアルキル化によって修飾することができる。一方、チロシン残基
は、テトラニトロメタンを用いて3-ニトロチロシン誘導体を形成するニトロ化に
よって改変され得る。

【００５８】ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキ
ル化、もしくはジエチルピロカルボネートを用いたN-カルボエトキシル化によっ
て達成され得る。

【００５９】タンパク質合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組込むことの例としては、
限定されるものではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロ
キシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバ
リン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-
メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体を使
用することが挙げられる。本明細書で意図される非天然アミノ酸の一覧を、表２
に示している。

【００６０】

【表２】

【００６１】架橋剤を使用して、例えば３次元構造を安定化させることができ、(CH₂)_nスペ
ーサー基(式中、n＝１〜６)を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデ
ヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のホモ二官能性架橋剤、およびN-
ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応性部分と別の基に特異的な反応性部分
とを通常含有するヘテロ二官能性試薬を使用する。

【００６２】本発明の核酸分子は、好ましくは単離された状態であるか、または、発現ベク
ター等のベクターへ連結されている。「単離(された)」とは、少なくとも１回の精
製工程を経た核酸分子を意味し、簡便には、例えば、分子量、コードされている
活性、ヌクレオチド配列、塩基組成または他の好都合な手段によって判定した場
合に、他の成分に対して少なくとも約10％の対象核酸分子、好ましくは少なくと
も約20％、より好ましくは少なくとも約30％、さらにより好ましくは少なくとも
約40〜50％、より一層好ましくは少なくとも約60〜70％、さらにより一層好まし
くは80〜90％またはそれ以上の対象核酸分子を含んでなる組成物によって定義さ
れるものである。本発明の核酸分子は、好適な実施形態では、生物学的に純粋で
あると考えることもできる。

【００６３】用語「タンパク質」は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含するも
のと理解されたい。タンパク質は、グリコシル化されていてもいなくてもよく、
および／または、ある範囲の他の分子(例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物、ま
たは他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質等)と融合、連結、結合、
あるいは会合していてもよい。以下で言及する「タンパク質」には、アミノ酸が配
列したタンパク質だけでなく、他の分子(例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物ま
たは他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質等)と結合したタンパク質
も含まれる。

【００６４】特に好適な実施形態では、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子に対応するヌクレオ
チド配列は、<400>1に示されるヌクレオチドの配列またはその誘導体もしくは類
似体(例えば、<400>1に対して類似性を示すヌクレオチド配列)を含むcDNA配列で
ある。

【００６５】本発明の核酸分子の誘導体には、<400>1に示されるヌクレオチド配列に低スト
リンジェンシー条件下にてハイブリダイズ可能な核酸分子も含まれる。好ましく
は、低ストリンジェンシーは42℃である。

【００６６】核酸分子は、原核細胞(例えば、大腸菌)または真核細胞(例えば、酵母細胞、
真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞もしくは植物細胞)において発現可能な発現
ベクターへ連結されていてもよい。核酸分子は、例えばシグナルペプチド等の別
の物質(entity)をコードする核酸分子と連結または融合あるいは会合していても
よい。また、核酸分子は、3’もしくは5’末端部分のいずれか一方または3’お
よび5’末端部分の双方に、ヌクレオチド配列情報がさらに融合、連結あるいは
会合していてもよい。核酸分子は、発現ベクター等のベクターの一部であっても
よい。後者の実施形態では、本発明に包含される組換え型スフィンゴシンキナー
ゼの産生が容易になる。

【００６７】本発明の範囲は、先に定義したような核酸分子の発現産物にも及ぶ。

【００６８】発現産物は、<400>2に記載のアミノ酸配列を有するスフィンゴシンキナーゼ、
または、先に定義したようなその誘導体、類似体もしくは化学的等価物もしくは
模倣体、あるいは、<400>2に記載のアミノ酸配列またはその誘導体もしくは模倣
体中の少なくとも10個の連続アミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を示す
アミノ酸配列を有する誘導体もしくは模倣体である。

【００６９】本発明の別の態様は、下記の(i)〜(vii)からなるリストより選択される単離さ
れたタンパク質に関する。

【００７０】 (i)新規なスフィンゴシンキナーゼタンパク質またはその誘導体、類似体、化
学的等価物もしくは模倣体。

【００７１】 (ii)ヒト・スフィンゴシンキナーゼタンパク質またはその誘導体、類似体、化
学的等価物もしくは模倣体。

【００７２】 (iii)実質的に<400>2に示されるアミノ酸配列またはその誘導体もしくは模倣
体を有するタンパク質、あるいは、<400>2中の少なくとも10個の連続するアミノ
酸に対して少なくとも約45％の類似性を示す配列を有するタンパク質、またはそ
の誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体。

【００７３】 (iv)実質的に<400>1に示されるヌクレオチド配列またはその誘導体もしくは類
似体によってコードされるタンパク質、あるいは、<400>2中の少なくとも10個の
連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を示すアミノ酸をコードす
る配列によってコードされるタンパク質、またはその誘導体、類似体、化学的等
価物もしくは模倣体。

【００７４】 (v)<400>1に示されるヌクレオチド配列またはその誘導体もしくは類似体に低
ストリンジェンシー条件下にてハイブリダイズ可能であって、かつ、実質的に<4
00>2に示されるアミノ酸配列またはその誘導体もしくは模倣体をコードするか、
あるいは<400>2中の少なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45
％の類似性を示すアミノ酸配列をコードする核酸分子によってコードされるタン
パク質。

【００７５】 (vi)ホモ二量体の形態である、段落(i)、(ii)、(iii)、(iv)または(v)におい
て定義したタンパク質。

【００７６】 (vii)ヘテロ二量体の形態である、段落(i)、(ii)、(iii)、(iv)または(v)にお
いて定義したタンパク質。

【００７７】本発明のタンパク質は、好ましくは単離された状態である。「単離(された)」と
は、少なくとも１回の精製工程を経たタンパク質を意味し、簡便には、例えば、
分子量、アミノ酸配列または他の好都合な手段によって判定した場合に、他の成
分に対して少なくとも約10％の対象タンパク質、好ましくは少なくとも約20％、
より好ましくは少なくとも約30％、さらにより好ましくは少なくとも約40〜50％
、より一層好ましくは少なくとも約60〜70％、さらにより一層好ましくは80〜90
％またはそれ以上の対象タンパク質を含んでなる組成物によって定義されるもの
である。本発明のタンパク質は、好適な実施形態では、生物学的に純粋であると
考えることもできる。

【００７８】本発明のスフィンゴシンキナーゼは、２個以上の分子が会合していることを意
味する多量体の形態をとり得る。同一のスフィンゴシンキナーゼ分子が会合して
いる場合には、複合体はホモ多量体となる。ホモ多量体の一例はホモ二量体であ
る。少なくとも１個のスフィンゴシンキナーゼが少なくとも１個のスフィンゴシ
ンキナーゼ以外の分子と会合している場合には、複合体はヘテロ二量体等のヘテ
ロ多量体となる。

【００７９】組換え型スフィンゴシンキナーゼを生産できれば、工業的なスフィンゴシンキ
ナーゼの大規模生産が可能となる。スフィンゴシンキナーゼは、大型のペプチド
、ポリペプチドまたはタンパク質の一部として生産する必要があり、そのまま使
用する場合もあるが、外来のタンパク質性配列を除去するためにまず処理を行う
ことが必要である。このような処理としては、プロテアーゼ、ペプチダーゼおよ
びアミダーゼによる消化、または化学的、電気化学的、音波的または機械的な一
連の分解技術が挙げられる。

【００８０】本発明は組換えタンパク質を包含するものの、化学的な合成技術もまたスフィ
ンゴシンキナーゼの合成において好適である。

【００８１】本発明のスフィンゴシンキナーゼは、簡便には、ヒトから単離された分子に基
づいて合成される。ヒト由来分子の単離は任意の適切な手段によって行えばよく
、例えば、クロマトグラフィーを用いた分離(CM-セルロースイオン交換クロマト
グラフィー等)、次いでセファデックス(G-50カラム等)を用いた濾過によって行
うことができる。多くの他の技術、中でもHPLC、PAGEといった技術も利用可能で
ある。

【００８２】スフィンゴシンキナーゼは、Carpinoら(1991)によって記載されたようなF-moc
化学を利用した固相合成によって合成できる。スフィンゴシンキナーゼおよびそ
の断片は、別の化学(限定するわけではないが、Stewartら(1985)に記載されたよ
うなt-Boc化学等)によっても合成可能であり、また、液相ペプチド合成の古典的
な方法でも合成できる。

【００８３】本発明の理論または作用機序を限定するわけではないが、スフィンゴシンキナ
ーゼは、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性における重要な調節酵
素である。「スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路」とは、スフィンゴシンキ
ナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸の一方または両方を利用するシ
グナル伝達経路を意味する。接着分子の発現をもたらすスフィンゴシンキナーゼ
シグナル伝達経路のカスケードは、下記の形態をとると考えられる。

【００８４】 (i)S.Mase活性を介したスフィンゴミエリンからのセラミドの生成(該セラミド
はスフィンゴシンへ変換される)。

【００８５】 (ii)スフィンゴシンキナーゼの刺激によるスフィンゴシン-1-リン酸(以下、「S
ph-1-P」と称する)の生成。

【００８６】 (iii)Sph-1-P生成の下流にあるMEK/ERKの活性化およびNF-κBの核内転移。

【００８７】スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路は、炎症、アポトーシスおよび細胞
増殖をもたらすような細胞の活性を調節することが知られている。例えば、サイ
トカイン、ケモカイン、eNOS等の炎症性メディエーターの産生のアップレギュレ
ーションおよび接着分子の発現のアップレギュレーションなどである。前記アッ
プレギュレーションは、例えば、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)およびインターロイ
キン-1(IL-1)等の炎症性サイトカイン、エンドトキシン、酸化もしくは変性脂質
、放射線照射または組織損傷といった複数の刺激によって誘導され得る。

【００８８】今回、この遺伝子およびその発現産物のクローニングおよび配列決定によって
、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性を介して直接または間接的に
調節される望ましくない細胞活性を特徴とする疾患の予防および治療処置に使用
するための、さらなる分子が提供される。スフィンゴシンキナーゼによって調節
される望ましくない細胞活性に付随する疾患の例としては、慢性関節リウマチ、
喘息、アテローム性動脈硬化症、髄膜炎、多発性硬化症および敗血症性ショック
が挙げられる。従って、本発明は、例えば炎症の調節といった細胞の機能活性を
調節するために、スフィンゴシンキナーゼの作用薬および拮抗薬以外にも、スフ
ィンゴシンキナーゼのアミノ酸および核酸分子の治療および予防用途を意図した
ものである。

【００８９】本発明は従って、被検体内のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現を調節する
方法であって、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現をアップレギュレートまた
はダウンレギュレートあるいは調節するのに十分な条件下で十分な時間にわたっ
て、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子と有効量の薬剤とを接触させることを含む、
上記方法を意図する。例えば、オリゴヌクレオチド等のスフィンゴシンキナーゼ
遺伝子に対するアンチセンス配列を細胞へ導入して、該細胞の特定の機能活性を
１種以上ダウンレギュレートすることができる。反対に、スフィンゴシンキナー
ゼまたはその誘導体をコードする核酸分子を導入して、内因性スフィンゴシンキ
ナーゼ遺伝子を発現しない任意の細胞の特定の機能活性を１種以上アップレギュ
レートすることもできる。

【００９０】本発明の別の態様は、哺乳動物内のスフィンゴシンキナーゼの活性を調節する
方法であって、スフィンゴシンキナーゼ活性を増加または低下させるのに十分な
条件下で十分な時間にわたって、調節に有効な量の薬剤を該哺乳動物へ投与する
ことを含む、上記方法を意図する。

【００９１】薬剤の哺乳動物への投与による前記活性の調節は、前記哺乳動物に、 (i)スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現を調節する (ii)スフィンゴシンキナーゼのアンタゴニストとして機能する (iii)スフィンゴシンキナーゼのアゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入するといった(但し、これらに限
定されない)複数の技術のうちのいずれかによって達成可能である。

【００９２】前記タンパク質性分子は、融合タンパク質または天然物スクリーニング等の天
然または組換え供給源から誘導してもよい。前記非タンパク質性分子は、例えば
核酸分子であってよく、また、天然物スクリーニング等の天然供給源から誘導し
てもよく、また、化学的に合成してもよい。本発明は、スフィンゴシンキナーゼ
の化学的な類似体、またはスフィンゴシンキナーゼのアゴニストもしくはアンタ
ゴニストして作用し得る小型分子を意図する。化学的アゴニストは必ずしもスフ
ィンゴシンキナーゼから誘導する必要はなく、一定の構造類似性を共有していれ
ばよい。あるいは、化学的アゴニストは、スフィンゴシンキナーゼの一定の物理
化学的特性を模倣するよう特別に設計してもよい。アンタゴニストは、スフィン
ゴシンキナーゼがその正常な生物学的機能を果たすのを阻止、阻害あるいは妨害
し得る任意の化合物であってよい。アンタゴニストとしては、スフィンゴシンキ
ナーゼに対して特異的なモノクローナル抗体、またはスフィンゴシンキナーゼの
一部、およびスフィンゴシンキナーゼ遺伝子もしくはmRNAの哺乳動物細胞におけ
る転写もしくは翻訳を妨害するアンチセンス核酸が挙げられる。スフィンゴシン
キナーゼ遺伝子発現の調節は、抗原、RNA、リボソーム、DNAzyme、RNAアプタマ
ーまたは抗体を用いても達成可能である。

【００９３】前記タンパク質性または非タンパク質性分子は直接または間接的に作用して、
スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナーゼの活性を調
節することができる。スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナ
ーゼと結合してスフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼの
発現または活性を調節する場合には、上記分子は直接作用する。スフィンゴシン
キナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼの発現または活性を直接または間
接的に調節するスフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼ以
外の分子と結合する場合には、上記分子は間接的に作用する。従って、本発明の
方法は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼの発現ま
たは活性の調節をもたらす調節工程のカスケードを誘発することにより、スフィ
ンゴシンキナーゼ遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼの発現または活性を調節
することを包含する。

【００９４】本発明の別の態様は、哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であって、
スフィンゴシンキナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を調節するか、ま
たはスフィンゴシンキナーゼの活性を調節するために十分な条件下で十分な時間
にわたって、有効量の薬剤を該哺乳動物へ投与することを含む、上記方法を意図
する。

【００９５】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であ
って、有効量のスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を
該哺乳動物へ投与することを含む、上記方法を意図する。

【００９６】使用するスフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子または薬剤
は、モノクローナル抗体等の標的化手段へ連結してもよく、これによりスフィン
ゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子または薬剤が標的細胞へ特異的
に送達される。

【００９７】本発明の好適な実施形態では、該方法に使用するスフィンゴシンキナーゼ、ス
フィンゴシンキナーゼ遺伝子または薬剤を前記標的細胞に特異的な抗体へ連結し
、これらの細胞への特異的な送達を可能にする。

【００９８】「細胞の機能活性を調節する」とは、１種以上のケモカインの産生、サイトカイ
ンの産生、酸化窒素の合成、接着分子の発現、および他の炎症性モジュレーター
の産生といった(但し、これらに限定されない)、細胞が実施し得る任意の１以上
の活性をアップレギュレート、ダウンレギュレートあるいは改変することをいう
。

【００９９】スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子または薬剤は、都合
のよい任意の手段によって、医薬組成物の形態で投与することができる。医薬組
成物のスフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子または薬剤は、
個々の場合に応じた量で投与すれば治療活性を発揮するものと考える。例えば、
ヒトまたは動物のいずれであるか、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキ
ナーゼ遺伝子または薬剤のいずれを選択するかによって変動する。広範囲の用量
を適用することができる。患者の場合を考えると、例えば、体重１kg当たり日に
約0.1mg〜約１mgのスフィンゴシンキナーゼまたは薬剤を投与すればよい。薬剤
投与計画を調整して最適な治療応答を得ることができる。例えば、用量を複数回
に分割して毎日、毎週、毎月または他の適切な時間間隔で投与してもよく、また
、状況の緊急度で判断する場合にはそれに合わせて用量を減らしてもよい。スフ
ィンゴシンキナーゼまたは薬剤は、経口、静脈内(水溶性の場合)、鼻腔内、腹腔
内、筋肉内、皮下、皮内もしくは坐剤経路または埋め込み(例えば、徐放性分子
を用いる場合)等の都合のよい方法で投与すればよい。特にスフィンゴシンキナ
ーゼまたは薬剤の使用については、これらのペプチドを、酸付加塩または金属錯
体(例えば、亜鉛、鉄等との錯体；これらは本出願では塩とみなす)等の製薬上許
容される非毒性の塩の形態で投与してもよい。このような酸付加塩の例は、塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安
息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。有
効成分を錠剤の形態で投与する場合には、該錠剤は、トラガカント、トウモロコ
シデンプンまたはゼラチン等の結合剤、アルギン酸等の崩壊剤、およびステアリ
ン酸マグネシウム等の滑沢剤を含んでいてもよい。

【０１００】本発明のさらなる態様は、哺乳動物の疾患症状に対して本発明を利用すること
に関する。例えば、本発明は炎症性疾患での利用に特に有用であるが、これに限
定されない。

【０１０１】従って、本発明の別の態様は、哺乳動物を処置する方法であって、スフィンゴ
シンキナーゼ遺伝子の発現を調節するのに十分であるか、またはスフィンゴシン
キナーゼの活性を調節するのに十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の
薬剤を該哺乳動物へ投与することを含み、前記調節によって細胞の機能活性を調
節することを特徴とする、上記方法に関する。

【０１０２】別の態様では、本発明は、哺乳動物を処置する方法であって、細胞の機能活性
を調節するのに十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量のスフィンゴシン
キナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を該哺乳動物へ投与することを含
む、上記方法に関する。

【０１０３】本発明のさらに別の態様は、細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造に
おける、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現を調節可能な、またはスフィンゴ
シンキナーゼの活性を調節可能な薬剤の使用に関する。

【０１０４】本発明のさらなる態様は、細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造にお
ける、スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の使用に関
する。

【０１０５】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフ
ィンゴシンキナーゼの活性の調節に使用するための薬剤であって、該調節により
細胞の機能活性が調節されることを特徴とする上記薬剤に関する。

【０１０６】本発明の別の態様は、細胞の機能活性の調節に使用するための、スフィンゴシ
ンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。

【０１０７】本発明の関連の態様では、処置を受ける哺乳動物は、治療または予防処置を必
要とするヒトまたは動物である。

【０１０８】別のさらなる態様では、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子、スフィン
ゴシンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現もしくはスフィン
ゴシンキナーゼの活性の調節が可能な薬剤を、１種以上の製薬上許容し得る担体
および／または希釈剤とともに含む、医薬組成物を意図する。スフィンゴシンキ
ナーゼ遺伝子、スフィンゴシンキナーゼまたは前記薬剤を、有効成分と呼ぶ。

【０１０９】注射用途に適した製剤の剤形としては、滅菌水溶液(水溶性の場合)や、滅菌注
射液もしくは分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、剤形
は無菌状態でなければならず、かつ容易に注射できる程度に流動的でなければな
らない。製造および貯蔵条件下では安定でなければならず、かつ細菌や真菌等の
微生物の汚染作用を受けないようにしなければならない。担体は、例えば、水、
エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび
液体ポリエチレングリコール等)、これらの適切な混合物、並びに植物油を含む
溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチン(licithin)等のコーティング
を用いたり、分散液の場合には必要な粒径を維持したり、また、界面活性剤(sup
erfactant)を使用したりすることで、適切な流動性を維持することができる。各
種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール
、ソルビン酸、チメロサール(thirmerosal)等によって微生物の作用を防ぐこと
ができる。多くの場合、糖または塩化ナトリウム等の等張剤を配合するのが好ま
しいであろう。モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収遅延剤の
組成物中で使用することにより、注射用組成物の吸収を長期化させることができ
る。

【０１１０】滅菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて先に列挙した他の各種成
分と共に適切な溶媒へ配合し、次いで濾過滅菌することにより調製する。一般に
分散液は、各種の滅菌有効成分を、基本分散媒と先に列挙した中から選ばれる他
の必要な成分とを含む滅菌媒体へ配合することにより調製する。滅菌注射液調製
用の滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は、予め濾過滅菌しておいた溶液から
有効成分と任意の所望の追加成分との粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術で
ある。

【０１１１】スフィンゴシンキナーゼ遺伝子、スフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシ
ンキナーゼ調節因子が適切に保護されれば、例えば、不活性希釈剤または吸収性
の可食担体と共に経口投与したり、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル内に封入
したり、錠剤に圧縮したり、また、治療食の食品と直接配合したりすることが可
能である。治療を目的とした経口投与の場合には、活性化合物を賦形剤と配合し
、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、
シロップ剤、カシェ剤等の剤形で使用すればよい。このような組成物および調製
物には、少なくとも１重量％の活性化合物が含まれていなければならない。組成
物および調製物のパーセンテージは当然のことながら変動し、単位重量の約５〜
約80％であるのが好都合である。このような治療上有用な組成物における活性化
合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。本発明の好適な組成物ま
たは調製物は、経口投与単位剤形に約0.1μg〜2000mgの活性化合物が含まれるよ
うに調製される。

【０１１２】錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、以下の成分を含んでいてもよい：
トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンもしくはゼラチン等の
結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデ
ンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；並びに
スクロース、ラクトースまたはサッカリン等の甘味剤を添加してもよく、または
、ハッカ、冬緑油もしくはサクランボ着香剤等の着香剤。投与単位剤形がカプセ
ル剤である場合には、上記種類の物質の他に、液体担体を含有していてもよい。
他の各種物質は、コーティングとして、あるいは投与単位の物理的な剤形を修飾
するものとして存在させてもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セ
ラック、糖、またはこの両者でコーティングしてもよい。シロップ剤またはエリ
キシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルお
よびプロピルパラベン、サクランボもしくはオレンジ風味等の着色・着香剤を含
んでいてもよい。当然のことながら、いずれかの投与単位剤形を調製するのに使
用する物質はいずれも、製薬上純粋であって、かつ、使用する量において実質的
に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物を徐放性調製物および製剤へ
配合してもよい。

【０１１３】製薬上許容し得る担体および／または希釈剤としては、あらゆる溶媒、分散媒
、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤等が挙げ
られる。このような媒体および剤を製薬上活性な物質に対して用いることは、当
該技術分野で周知である。従来慣用の媒体または剤が有効成分と不相溶とならな
い限りにおいては、治療用組成物におけるその使用は意図するところである。二
次的な有効成分を組成物に配合することもできる。

【０１１４】投与を容易にし、かつ投与量を均一にするため、非経口組成物を投与単位剤形
として製剤化するのが特に有用である。本明細書中で使用する「投与単位剤形(do
sage unit form)」とは、治療対象の哺乳動物被検体にとって単位投与量として適
切な物理的に独立した単位のことをいい、各単位には、所望の治療効果を発揮す
るように計算された所定量の活性物質が、必要な医薬用担体と共に含まれている
。本発明の新規な投与単位剤形の詳細は、(a)活性物質に特有の特性および達成
すべき特定の治療効果、並びに(b)身体の健康が損なわれている疾患症状を示す
生存被検体の疾患を治療する目的でこのような活性物質を調合する調剤分野に固
有の制限によって決まり、かつこれらに直接依存する。

【０１１５】有効量を簡便かつ有効に投与するために、主要な有効成分を適切な製薬上許容
し得る担体と共に、先に開示したような投与単位剤形に調合する。単位投与剤形
は、例えば、主要な活性化合物を0.5μg〜約2000mgの範囲の量にて含有すること
ができる。割合で表すと、活性化合物は通常、担体１ml当たり約0.5μg〜約2000
mgにて含まれる。二次的な有効成分を含む組成物の場合には、該成分の常用量お
よび投与方法を参照して投与量を決定する。

【０１１６】医薬組成物は、標的細胞をトランスフェクトし得るベクター等の遺伝学的分子
を含んでいてもよく、該ベクターは、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子を発現し得
る核酸分子、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナー
ゼの活性を調節し得る核酸分子を保有している。ベクターは例えばウイルスベク
ターである。

【０１１７】スフィンゴシンキナーゼ遺伝子を使用して、細胞または動物レベルにて、細胞
または動物によって発現されるスフィンゴシンキナーゼ遺伝子をノックアウトし
た遺伝子ノックアウトモデルを作製することもできる。従って別の態様では、本
発明の範囲は、スフィンゴシンキナーゼを利用して細胞または動物の内因性スフ
ィンゴシンキナーゼ遺伝子のノックアウトを促進させたスフィンゴシンキナーゼ
遺伝子の細胞または動物ノックアウトモデルの作製方法、および該方法から作製
されたノックアウトモデルにも及ぶものと理解されたい。

【０１１８】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼに対する抗体(触媒抗体
を含む)に関する。このような抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのい
ずれであってもよく、スフィンゴシンキナーゼに対する自然発生抗体から選択し
てもよいし、スフィンゴシンキナーゼに対して特異的に誘起させてもよい。後者
の場合には、まずスフィンゴシンキナーゼを担体分子と結合させる必要がある。
本発明の抗体および／または組換え型スフィンゴシンキナーゼは、治療薬または
診断薬として特に有用である。あるいは、Fab断片等の抗体断片を使用してもよ
い。さらに、本発明の範囲は、組換え型抗体および合成抗体並びに抗体ハイブリ
ッドにも及ぶ。「合成抗体」は、本明細書中では、抗体の断片およびハイブリッド
を含むものとする。本発明のこの態様の抗体は免疫療法に特に有用であり、例え
ば、治療計画のプログラムをモニタリングするといった診断ツールとしても使用
できる。

【０１１９】例えば、スフィンゴシンキナーゼを使用して、スフィンゴシンキナーゼに対す
る自然発生抗体についてスクリーニングを行うことができる。このような抗体は
、例えば、ある種の炎症性疾患において生じる場合がある。

【０１２０】例えば、特異的な抗体を使用して、スフィンゴシンキナーゼタンパク質につい
てスクリーニングを行うことができる。後者は、例えば、細胞抽出物もしくは他
の生物学的な液体に含まれるスフィンゴシンキナーゼのレベルをスクリーニング
する手段、または組換え手段によって作製されたスフィンゴシンキナーゼを培養
上清液から精製する手段として重要である。本明細書中で意図したアッセイを行
うための技術は当該技術分野で公知であり、例えば、サンドイッチアッセイ、EL
ISAおよびフローサイトメトリーが挙げられる。

【０１２１】上述したような一次抗体に対する任意の二次抗体(モノクローナル、ポリクロ
ーナルまたは抗体の断片)を含むことも本発明の範囲内である。一次抗体および
二次抗体の双方を検出アッセイに使用してもよく、また、一次抗体を市販の抗免
疫グロブリン抗体と併用してもよい。本明細書中で意図する抗体には、スフィン
ゴシンキナーゼの任意の領域に特異的な任意の抗体が含まれる。

【０１２２】ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はいずれも、タンパク質またはペプ
チド誘導体を用いた免疫感作によって得られ、いずれのタイプもイムノアッセイ
に利用可能である。両タイプの血清を取得する方法は当該技術分野で周知である
。ポリクローナル血清は好適さでは劣るものの、適切な実験動物に有効量のスフ
ィンゴシンキナーゼまたはその抗原性部分を注射し、血清を動物から回収し、特
異的な血清を公知の免疫吸着剤技術のいずれかにて単離することで比較的に容易
に調製される。この方法で産生された抗体は実質的にいずれのタイプのイムノア
ッセイにも利用できるが、産物が不均一となる可能性があるため、一般にはあま
り有利ではない。

【０１２３】イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体の使用は、該モノクローナル抗体
が大量に産生可能であり、かつ産物が均一であることから、特に好適である。不
死化細胞系と免疫原性調製物に対して感作させたリンパ球とを融合させることに
よるモノクローナル抗体産生用ハイブリドーマ細胞系の調製は、当業者に周知の
技術によって行うことができる。(例えば、DouillardおよびHoffman, 「ハイブリ
ドーマに関する基礎事実(Basic Facts about Hybridomas)」, Compendium of Imm
unology Vol II, Schwartz編, 1981; KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-4
99, 1975; European Journal of Immunology 6:511-519, 1976を参照)。

【０１２４】本発明の別の態様では、本発明の分子は、スフィンゴシンキナーゼによって調
節される障害の診断等の用途に用いるスクリーニング標的としても有用である。

【０１２５】本発明のさらに別の態様は、被検体由来の生物学的サンプルにおけるスフィン
ゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼmRNAの検出方法であって、抗体-
スフィンゴシンキナーゼ複合体または抗体-スフィンゴシンキナーゼmRNA複合体
が形成するのに十分な条件下で十分な時間にわたって、生物学的サンプルと、ス
フィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼmRNAまたはその誘導体もし
くは相同体に特異的な抗体とを接触させ、次いで該複合体を検出することを含む
、上記方法を意図する。

【０１２６】スフィンゴシンキナーゼの有無は、ウェスタンブロッティング法、ELISA法ま
たはフローサイトメトリー法等の複数の方法で判定することができる。スフィン
ゴシンキナーゼmRNAは、例えば、in situハイブリダイゼーションまたはノーザ
ンブロッティングによって検出することができる。これらには、当然のことなが
ら、従来の競合結合アッセイだけでなく、非競合タイプの単一部位(single-site
)および2つの部位(two-site)を用いる両アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイ
が含まれる。これらのアッセイには、標識抗体の標的への直接結合も含まれる。

【０１２７】サンドイッチアッセイは、中でも最も有用かつ常用されているアッセイであり
、本発明で使用するのに有利である。サンドイッチアッセイ技術には複数の変法
が存在し、いずれも本発明に包含されるものとする。簡単に言うと、典型的なフ
ォワードアッセイ(forward assay)では、未標識抗体を固相支持体上に固定化し
、サンプルを該結合分子と接触させる。適切な時間、即ち、抗体-抗原複合体を
形成させるのに十分な時間インキュベートした後、検出可能なシグナルを発生し
得るリポーター分子で標識した抗原特異的な二次抗体を添加してインキュベート
し、抗体-抗原-標識抗体からなる別の複合体を形成させるのに十分な時間放置す
る。未反応物質はいずれも洗い流し、リポーター分子から発生したシグナルを観
察することで抗原の有無を判定する。結果は、可視シグナルを単に観察する定性
的なものであってもよいし、既知量のハプテンを含む対照サンプルとの比較によ
る定量的なものであってもよい。フォワードアッセイの変法としては、サンプル
と標識抗体の双方を同時に結合抗体へ添加する同時アッセイが挙げられる。これ
らの技術は、容易に分かるような任意の若干の改変も含めて、当業者には周知で
ある。本発明によれば、サンプルは、スフィンゴシンキナーゼを含む可能性のあ
るものであり、例えば、細胞抽出物、組織生検材料、または場合によっては、血
清、唾液、粘膜分泌物、リンパ液、組織液、および呼吸液(respiratory fluid)
が挙げられる。従ってサンプルは、通常では、生物学的液体を含む生物学的サン
プルであるが、その範囲は細胞培養等から得られる醗酵液および上清液にも及ぶ
。

【０１２８】典型的なフォサードサンドイッチアッセイでは、スフィンゴシンキナーゼまた
はその抗原性部分に対して特異性を有する一次抗体を、固相表面へ共有結合によ
って、または受動的に結合させる。固相表面は、典型的にはガラスまたはポリマ
ーであり、最も常用されているポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナ
イロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固相支持
体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、または、イムノアッセ
イを行うのに適した任意の他の表面形状であってよい。結合過程は当該技術分野
で周知であって、通常は架橋性共有結合または物理吸着からなり、得られたポリ
マー-抗体複合体を被検サンプルに備えて洗浄する。次いで被検サンプルのアリ
コートを固相複合体へ添加し、十分な時間(例えば、２〜40分間)かつ適切な条件
下(例えば、25℃)にてインキュベートし、抗体中に存在するいずれかのサブユニ
ットを結合させる。インキュベーション後、抗体サブユニット-固相複合体を洗
浄および乾燥させ、ハプテン部分に対して特異的な二次抗体とインキュベートす
る。二次抗体は、二次抗体のハプテンへの結合の指標となるリポーター分子に結
合している。

【０１２９】別の方法では、生物学的サンプル中の標的分子を固定化し、次いで固定化標的
を、リポーター分子で標識されていてもいなくてもよい特異抗体へ曝露する。標
的の量およびリポーター分子シグナルの強度によっては、抗体で直接標識するこ
とにより、結合標的を検出することができる。あるいは、一次抗体に対して特異
的な第２標識抗体を標的-一次抗体複合体へ暴露し、標的-一次抗体-二次抗体の
三成分複合体を形成させる。リポーター分子から放出されるシグナルによって複
合体を検出する。

【０１３０】本明細書中で使用する「リポーター分子」とは、その化学的性質によって、抗原
-結合抗体の検出を可能にする分析上同定可能なシグナルを発生する分子を意味
する。検出は、定性的または定量的のいずれであってもよい。この種のアッセイ
に最も常用されるリポーター分子は、酵素、蛍光団または放射性核種含有分子(
即ち、放射性同位体)および化学発光分子のいずれかである。

【０１３１】エンザイムイムノアッセイの場合には、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ
素酸を用いて、酵素を二次抗体へ結合させる。しかしながら、容易に分かるよう
に、当業者にとって容易に利用し得る多種多様な結合技術が存在する。常用され
る酵素としては、中でも、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特定の
酵素と共に使用される基質は、一般に、対応の酵素によって加水分解されると検
出可能な色の変化をもたらすものを選択する。適切な酵素の例としては、アルカ
リホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。上述の色素原基質では
なく、蛍光物を生成する蛍光原基質を利用することも可能である。いずれの場合
においても、酵素標識抗体を一次抗体-ハプテン複合体へ添加して結合させ、次
いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含む溶液を抗体-抗原-抗体か
らなる複合体へ添加する。基質は、二次抗体に結合された酵素と反応して定性的
な可視シグナルを発生するため、一般には分光測光法によって該シグナルをさら
に定量することができ、サンプルに含まれていたハプテンの量が分かる。「リポ
ーター分子」の範囲には、ラテックスビーズ上の赤血球といった細胞凝集または
凝集抑制などを利用するものも含まれる。

【０１３２】あるいは、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光化合物を抗体にその結合
活性を変えないで化学的に結合させてもよい。特定波長の光を照射することによ
り活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収して分子中で励起状
態となり、光学顕微鏡で視覚的に検出し得る特徴的な色をした光を発する。EIA
の場合と同様に、蛍光標識抗体を一次抗体-ハプテン複合体へ結合させる。未結
合試薬を洗い流した後、残存する三成分複合体に適切な波長の光を照射し、蛍光
が観察されれば目的のハプテンの存在が明らかとなる。免疫蛍光技術およびEIA
技術はいずれも、当該技術分野で十分に確立されており、本発明の方法にとって
特に好適である。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子等
の他のリポーター分子も利用できる。

【０１３３】本発明はまた、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその誘導体を検出するの
にPCR分析等をはじめとする遺伝学的アッセイも意図する。

【０１３４】本発明のさらなる特徴は、下記の非限定的な実施例においてさらに詳述する。

【０１３５】実施例１ヒトスフィンゴシンキナーゼの精製およびクローニング−実験手順材料 D-エリトロ−スフィンゴシン、D-エリトロ−ジヒドロスフィンゴシン、DL-ト
レオ-ジヒドロスフィンゴシン、N’N-ジメチルスフィンゴシン、N-アセチルスフ
ィンゴシン (C₂-セラミド)、S1PおよびFumosin B1を、Biomol Research Laborat
ories Inc. (Plymouth Meeting、PA)から購入した。フィトスフィンゴシン、L-
α-ホスファチジン酸、L-α-ホスファチジルイノシトール、L-α-ホスファチジ
ルセリン、L-α-ホスファチジルコリン、L-α-ホスファチジルエタノールアミン
、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール、
ATP、カルモジュリン、グルタチオンおよびウシ血清アルブミン（BSA）は、Sigm
aから購入した。N,N,N-トリメチルスフィンゴシンおよびADPはCalbiochem (Band
Soden、Germany)から、[γ³²P]ATPはGeneworks (Adelaide、South Australia)
から、TNFαはR&D Systems Inc. (Minneapolis、MN)から、そしてイソプロピル-
β-D-チオガラクトシド(IPTG)はPromega (Madison、WI)から購入した。充填済み
(prepacked)Mono-Q、セファロース75およびHiTrap-Qカラム、Q セファロースフ
ァストフロー、カルモジュリンセファロース4B、グルタチオンセファロース4B、
トロンビンおよびゲル濾過用分子質量タンパク質基準物については、Amersham P
harmacia Biotechから購入した。SDS-PAGE分子質量タンパク質基準物、銀染色プ
ラスキット、クマシーブリリアントブルー R250およびクマシータンパク質試薬
については、Bio-Radから購入した。Centricon濃縮器はAmicon Inc. (Beverly、
MA)から購入し、BCAタンパク質試薬はPierce Chemical Company (Rockford、IL)
から購入した。

【０１３６】スフィンゴシンキナーゼの酵素アッセイスフィンゴシンキナーゼの活性は、通常、D-エリトロ-スフィンゴシンおよび[
γ³²P]ATPを基質として使用し、実質的にはすでに公知の方法(Olivera ら、 199
8)に若干の変更を加えた方法により測定した。簡潔に言えば、100mM Tris/HCl (
pH7.4)、10mM MgCl₂ 10% (v/v)グリセロール、1mM ジチオトレイトール、1mM EG
TA、1mM Na₃VO₄、15mM NaF、0.5mM 4-デオキシピリドキシンを含有する全量100
μlのアッセイバッファー中で、サンプルをスフィンゴシン(5% Triton X-100に
溶解した100μMの保存溶液)および[γ³²P]ATP (1mM; 10μCi/ml)と37℃で30分間
インキュベートすることによりアッセイを行なった。反応を停止し、700μlのク
ロロホルム／メタノール／HCl(100:200:1、v/v)を添加することによってスフィ
ンゴシン-1-リン酸を抽出し、次に200μlのクロロホルムおよび200μlの2M KCl
を添加して激しく混合し、遠心分離によって相分離を行なった。1-ブタノール／
エタノール／酢酸／水 (8:2:1:2、v/v)を用いて、有機相における標識されたS1P
を、Silica Gel 60を使用するTLCによって単離し、ホスホルイメージャー(phosp
horimager；Molecular Dynamics. Sunnyvale、CA)で計量した。１分あたり1pモ
ルのS1Pを形成することを活性１ユニット（U）と定義する。

【０１３７】スフィンゴシンキナーゼのヒト胎盤からの精製全工程を4℃で、1,240gのヒト胎盤（胎盤４個）からスフィンゴシンキナーゼ
を精製した。胎盤を細かくきざみ、バッファーA（10%(v/v)グリセロール、0.05%
Triton X-100および1mM ジチオトレイトールを含有する25mM Tris/HClバッファ
ー (pH7.4)）で洗浄した。1.5Lのプロテアーゼ阻害剤混合物(Complete^TM、Boehr
inger Mannheim)を含有する新しいバッファーA（バッファーB）に移し、ワーリ
ングブレンダー(Waring Blender)内でさらに細かくきざんだ。得られたホモジネ
ート物を、酵素抽出を促進するために30分間氷冷下で保存し、次にこのホモジネ
ート物の可溶性画分を17,000 gでの60分間の遠心分離によって単離した。続いて
この調製物を、固体(NH₄)₂SO₄をpH7.4で添加することによる(NH₄)₂SO₄沈殿によ
って分画し、遠心分離(17,000 g、30分)によって沈殿したタンパク質を回収した
。次に25〜35%飽和(NH₄)₂SO₄画分をバッファーBに再び溶解し、同バッファーに
対して徹底的に透析を行なうことにより脱塩し、さらに遠心分離(17,000 g、30
分)を行なって不溶性の物質を除去した。次のクロマトグラフィーの全工程は、F
PLCシステム(Pharmacia Biotech)を使用して4℃で実施した。

【０１３８】透析した(NH₄)₂SO₄画分を、バッファーAであらかじめ平衡化したQ-セファロー
スファストフローカラム（直径50mm、250ml総容量）に、流速7ml/分でアプライ
した。スフィンゴシンキナーゼ活性を、バッファーA中で0〜1MのNaCl勾配で溶出
し、10mlの画分に回収した。次に最も高いSK1活性を含む画分をまとめて、CaCl₂ およびNaClを添加して最終濃度をそれぞれ4mMおよび250mMとした。次に、この集
めた抽出物を、2mM CaCl₂を含むバッファーAであらかじめ平衡化しておいたカル
モジュリン‐セファロース4Bカラム（直径16mm、10mlベッドボリューム）に流速
1ml/分でアプライした。続いてこのカラムを、数倍カラム容量の平衡化バッファ
ー、次に4mM EGTAを含有するバッファーAで洗浄し、さらに4mM EGTAおよび1M Na
Clを含むバッファーAでSKIを溶出した。最も高いスフィンゴシンキナーゼ活性を
含む画分を集め、セファデックスG-25カラムで脱塩し、バッファーAであらかじ
め平衡化しておいたMono-Qカラム（直径5mm、1ml総容量）に流速1ml/分でアプラ
イした。スフィンゴシンキナーゼ活性を、バッファーA中0〜1MのNaCl勾配で溶出
した。酵素活性を安定させるために、回収した画分(1ml)にNaClを (500mMとなる
ように)即座に添加した。最も高いスフィンゴシンキナーゼ活性を含むMono-Q画
分をまとめ、セファデックスG-25カラムで脱塩した。次に保存した画分にATPお
よびMgCl₂を加え、最終濃度をそれぞれ1mMおよび5mMとし、続いて1mM ATPおよび
5mM MgCl₂を含むバッファーAであらかじめ平衡化しておいたMono-Qカラムに流速
1ml/分で再びアプライした。スフィンゴシンキナーゼ活性を、平衡化バッファー
中0〜1MのNaCl勾配で溶出した。再度、酵素活性を安定させるために、回収した
画分(1ml)にNaClを (500mMとなるように)即座に添加した。最も高いスフィンゴ
シンキナーゼ活性を含むATP-Mono-Q画分を集め、Centricon-10濃縮器で10倍濃縮
して最終量200μlとし、500mM NaClを含むバッファーAであらかじめ平衡化して
おいたスーパーデックス(Superdex) 75カラム（直径10mm、20ml総容量）に流速0
.4ml/分でアプライした。スフィンゴシンキナーゼ活性を同じバッファーで溶出
させ、0.4mlずつ画分を回収した。リボヌクレアーゼA、キモトリプシノーゲンA
、オボアルブミンおよびBSAの溶出量と比較することによって、該カラムから得
られた酵素の分子量を推定した。

【０１３９】ヒトスフィンゴシンキナーゼのクローニングマウススフィンゴシンキナーゼとアラインするヒトEST配列 (GenBank^TM受託番
号D31133、W63556、AA026479、AA232791、AA081152、AI769914およびAI769914)
由来のPCRプライマーを使用して (Olivera ら、 1998)、ヒトスフィンゴシンキ
ナーゼ (hSK)をHUVECλZap cDNAライブラリーから増幅させた。中にあるSacII部
位をまたぐこれらのプライマー(P1,5’-CGGAATTCCCAGTCGGCCGCGGTA-3’[<400>3]
およびP2,5’-TAGAATTCTACCGCGGCCGACTGGCT-3’[<400>4])を、T3プライマーおよ
びT7プライマーと組み合わせて使用し、それぞれhSKの5’末端および3’末端を
示す、669bpおよび550bpの２つの重複するPCR産物を作製した。次にこれら２つ
のPCR産物をpGEM4Z中でそれぞれ別々にクローニングした。その後、5’hSK PCR
クローン由来の584bpのSacII断片を、3’hSK PCRクローンのSacII部位に正しい
方向でサブクローニングし、1,130bpの部分的hSK cDNAクローンを作製した。続
いて、669bp 5’hSKクローン由来の120bpのEcoRI/StuI断片を、EcoRI/StuIで消
化した上記pGEM4Z-1,130bpクローン中にサブクローンすることによって、完全長
のhSKをコードするクローンを生成した。このcDNAクローンを両方向に配列決定
し、hSK cDNA配列の完全性を確認した。哺乳動物細胞での発現のために、オリゴ
ヌクレオチドプライマーT7および5’-TAGAATTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTAAGG
GCTCTTCTGGCGGT-3’ [<400>5]を用いたPFUポリメラーゼPCRによって、hSK cDNA
の3’末端にFLAGエピトープで標識した。このFLAG標識hSK cDNAを、次にEcoRIで
消化してpCDNA3中でクローニングした。その方向性は制限酵素分析により決定し
、配列決定を行なってhSK-FLAG cDNA配列の完全性を確認した。細菌での発現の
ために、完全長hSK cDNAをpGEX4T2中でサブクローニングした。pGEM4Z-hSKクロ
ーンをBamHIで消化し、1×PFUバッファー、50μM dNTP中で、72℃にて30分間3U
のPFUポリメラーゼで平滑末端化した。SalIで消化した後、1,163bpのhSK cDNAを
ゲル精製し、次に平滑末端／SalI断片をpGEX4T2 SmaI/XhoIに連結した。

【０１４０】スフィンゴシンキナーゼアミノ酸配列分析 blastpおよびtblastnアルゴリズムを使用して(Altschul ら、 1990)、オース
トラリア国立ゲノム情報サービス(Australian National Genome Information Se
rvice)の非重複性(non-redundant)アミノ酸配列および塩基配列のデータベース
についてヒトスフィンゴシンキナーゼアミノ酸配列を検索した。

【０１４１】細胞培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、すでに公知の方法(Wallら、 1978)によって
単離し、ゼラチンで被膜した培養フラスコで20%ウシ胎児血清添加Earle’s塩、2
5μg/ml内皮細胞増殖添加剤(Collaborative Research)および25μg/mlヘパリン
を含むM199培地中で培養した。細胞を３回継代し、80%コンフルエンシーにまで
増殖させた後、処理および回収を行なった。ヒト胚性腎臓細胞 (HEK293、ATCC C
RL-1573)を、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、0.2%(w/v)重炭酸ナトリウム、
ペニシリン(1.2mg/ml)およびゲンタマイシン(1.6mg/ml)を含有するダルベッコ改
変イーグル(Dulbecco’s modified Eagle’s)培地で培養した。リン酸カルシウ
ム沈殿法により（Graham & vander Eb, 1973）、HEK293細胞を一過性トランスフ
ェクトした。すでに公開の通り（Xia ら、 1998）、HUVECおよびHEK293細胞をTN
Fα(1ng/ml)で処理した。

【０１４２】実施例２大腸菌での組換えヒトスフィンゴシンキナーゼの発現および単離−実験手順 pGEX4T2中でクローニングした完全長SPHK cDNAを大腸菌(E.coli)BL21中で形質
転換した。単離形質転換体を一晩培養して得た培養物(100ml)を、アンピシリン(
100mg/L)を含むSuperbroth培地（20g/Lグルコース、35g/Lトリプトン、20g/L酵
母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5）中にて、30℃で振盪(200rpm)することにより増殖
させた。得られた培養物を、新しい培地中で1:20に希釈し、30℃で振盪すること
により0.6〜0.7のOD₆₀₀まで増殖させた。次に0.1mMイソプロピル-β-D-チオガラ
クトシドを添加し、その培養物を30℃で３時間さらにインキュベートすることに
よって、グルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)結合スフィンゴシンキナーゼ
(GST-SK)の発現を誘導した。その後、この細菌細胞を6,000 g、20分、4℃の遠心
分離によって回収し、250mM NaClを含む20mlのバッファーBに再懸濁した。続い
て細胞を25℃で15分間最終濃度0.3mg/mlのリゾチームで溶解させ、20sの超音波
パルス3サイクルの超音波処理を行ない、その後１分間冷却した。溶解物を50,00
0 g、4℃にて45分間の遠心分離によって浄化し、0.22μmのフィルターで濾過し
た。濾過後の上清を、バッファーBで洗浄してあらかじめ平衡化しておいた0.2ボ
リュームの50%(w/v)グルタチオン−セファロース4B（Pharmacia）と、60分間4℃
で継続的に混合しながらインキュベートした。その後、得られた混合液をガラス
製のクロマトグラフィーカラム(直径10mm)に注入し、ビーズ（GST-SKに結合して
いる）を10カラム容量のバッファーBで4℃で洗浄した。次に、GST-SKを、カラム
から10mM還元型グルタチオンを含む10mlのバッファーB中に溶出した。その後、2
0μg (30 N.I.H.ユニット)のトロンビン(Pharmacia)と3時間25℃でインキュベー
トすることにより、GSTをスフィンゴシンキナーゼから切断分離した。その後、
スフィンゴシンキナーゼをヒト胎盤から精製するために用いたカルモジュリン−
セファロースカラムおよび続いてMono-Q陰イオン交換カラムに切断後の混合液を
アプライすることによって、遊離しているスフィンゴシンキナーゼを精製した。
これらのカラムを使用することによって、組換えスフィンゴシンキナーゼを均質
なものに精製することができた。

【０１４３】実施例３スフィンゴシンキナーゼの特性解析−実験手順単離したスフィンゴシンキナーゼの活性へのpHの影響は、37℃にて4.0〜11.0
のpH範囲の50mMバッファー(酢酸ナトリウム、pH4.0〜5.0; Mes、pH6.0〜7.0; He
pes、pH7.0〜8.2; Tris/HCl、pH8.2〜10.0; Caps、pH10.0〜11.0)中で測定した
。同一のバッファー中で該酵素を4℃で5時間プレインキュベーションした後の残
存活性をアッセイすることにより、pH安定性を測定した。同様に、該酵素を様々
な温度（4〜80℃）で30分間pH7.4（10%グリセロール、0.5M NaClおよび0.05% Tr
iton X-100を含む50mM Tris/HCl）にてプレインキュベーションした後の残存活
性をアッセイすることにより、熱安定性を測定した。ミカエリス-メンテンの反
応速度論的解析(Michaelis-Menten Kinetics)を用いて、加重非線形回帰プログ
ラム(weighted non-linear regression program)(Easterby、1996)により基質の
反応速度論を解析した。ミセルとTriton X-100が混合している酵素アッセイにス
フィンゴシンおよびその類似体を加えたため、表面希釈反応速度論(surface dil
ution kinetics)（BuehrerおよびBell、1992）を示し、これらの分子に関して得
られたすべてのK_m値およびK_i値は、バルク溶液(bulk solution)濃度というより
はむしろTriton X-100のモル％として表される。カルシウム／カルモジュリン
がスフィンゴシンキナーゼの活性に及ぼす影響を測定するアッセイにおいては、
カルシウムおよびカルモジュリンを、20nMの単離したスフィンゴシンキナーゼを
含む標準アッセイ混合液に最終濃度がそれぞれ4mMおよび0.6μMになるように添
加した。

【０１４４】実施例４その他の分析方法標準物質としてBSAを使用して、クマシーブリリアントブルー(Bradford ら、1
976)またはビシンコニン酸(Smith ら、1985)試薬のいずれかを用いてタンパク質
を測定した。場合によっては、沈殿により濃縮および界面活性剤の除去後、タン
パク質の推定を行ない（WesselおよびFlugge、1984）、測定の感度および精度を
向上させた。Laemmliの方法 (1970)にしたがって、12%アクリルアミドゲルを使
って、SDS-PAGEを行なった。ゲル上のタンパク質のバンドをクマシーブリリアン
トブルーR250または銀染色のいずれかによって視覚化した。ミオシン、β-ガラ
クトシダーゼ、BSA、オボアルブミン、炭酸脱水酵素、ダイズトリプシンインヒ
ビター、リゾチームおよびアプロチニンの電気泳動における移動度と比較するこ
とによって、分子量を推定した。

【０１４５】実施例５ヒトスフィンゴシンキナーゼの精製−結果ヒト胎盤におけるスフィンゴシンキナーゼの総活性の半分よりもやや多い活性
が、組織のホモジネート後の細胞質ゾル中に存在した（表３）。スフィンゴシン
キナーゼのヒト胎盤からの精製を表４にまとめている。４個のヒト胎盤のホモジ
ネ−ト物由来の可溶性画分をまず硫酸アンモニウム沈殿に供した。これにより、
スフィンゴシンキナーゼの顕著に優れた精製が得られ（33倍）、それは25〜35%
飽和硫酸アンモニウム画分中に沈殿していた。陰イオン交換クロマトグラフィー
において、セファデックス(Sephadex)G25カラムを使用して硫酸アンモニウム画
分を迅速に脱塩し、得られた脱塩画分をただちにQ セファロース(Sepharose) FF
カラムにロードした。スフィンゴシンキナーゼの活性は約0.2M以下のNaCl濃度で
は非常に不安定であり、すなわち、例えば透析のように脱塩工程が遅いと酵素活
性が著しく失われてしまうため、この脱塩工程の速度はきわめて重要である。0
〜1MのNaCl勾配をQ セファロース FFカラムにアプライすることにより、約0.15M
と0.6MのNaClで溶出されるスフィンゴシンキナーゼ活性の２つのピークが得られ
、それぞれをSK1およびSK２と定めた（図２）。この実験では、SK1は量的に豊富
でありより安定性があることからさらなる精製に利用すべく選択したが、SK2活
性は、SK1とは異なり非常に不安定と思われ、0.5M NaCl、10%グリセロールおよ
び0.05% Triton X-100を加えることによっても安定化できなかった。また、後述
するように、SK1はHUVEC中に存在するアイソフォームであると考えられることか
らもSK1を選択した。

【０１４６】次に、SK1を含むQ セファロースFFカラム由来の画分を、4mM CaCl₂の存在下、
カルモジュリン−セファロース4Bカラムに通し、EGTAおよびNaClでSK1を溶出す
ることによってアフィニティー精製したことにより、さらに優れた精製（38倍）
を行なうことができ、高い酵素収量が得られた。EGTAのみではカルモジュリン−
セファロース4BカラムからSK1を溶出させることはできず、これにより該酵素と
このアフィニティーマトリックス間は特別な結合であることが示唆された。次に
、カルモジュリン−セファロース4Bカラムから溶出した活性画分を、脱塩しMono
Qカラムによる陰イオンクロマトグラフィー解析を続けて２回行った。そのうち
の２回目の工程は、1mM ATPおよび5mM MgCl₂の存在下で行った（図３）。こうし
た陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られた活性画分を、次に最終精製
工程であるスーパーデックス75カラムを使用したゲル濾過クロマトグラフィーに
アプライした。SK1は、該カラムから44kDaに相当する分子量をもつ単一のピーク
として溶出された。この最終カラムから得た活性画分をSDS-PAGEおよび銀染色を
用いて分析したところ（図４）、分子質量45kDaの単一のバンドが得られた。こ
れは、出発時のスフィンゴシンキナーゼ活性の7%というきわめて良好な収率で（
表４）、当初の胎盤抽出物からは100万倍以上に精製された均一なタンパク質を
示している。これが、ヒトを供給源として、そこから精製し均質物とした最初の
スフィンゴシンキナーゼである。

【０１４７】実施例６ HUVEC中のスフィンゴシンキナーゼアイソフォーム−結果ヒト胎盤中で２つのスフインゴシンキナーゼ活性が同定されたことから（図２
）、分離用陰イオン交換カラムを使用して、HUVEC中の該酵素活性の多重性を調
べた。HUVEC抽出物をこのカラムにアプライしたところ、他のヒト組織や細胞と
は異なり、ヒト胎盤SK1と同じ箇所にスフィンゴシンキナーゼのピークが１つだ
け溶出された（図５）。同様に、HUVEC抽出物をアプライ後溶出したこの単一の
スフィンゴシンキナーゼピークでも、HUVECをTNFαで10分間処理することによっ
てスフィンゴシンキナーゼの活性は刺激された(Xiaら、1999)。こうしたことか
ら、本研究において単離されたヒト胎盤スフィンゴシンキナーゼ、SK1は、おそ
らくHUVEC中に見出される主要なアイソフォームであり、TNFα処理は、この酵素
の活性を、別のあるいは潜在するアイソフォームの活性よりも増大するという結
果が得られた。

【０１４８】実施例７スフィンゴシンキナーゼのクローニングおよびHEK293細胞における一過性発現− 結果ヒトスフィンゴシンキナーゼcDNAを、すでに公開されているマウススフィンゴ
シンキナーゼ配列(Kohamaら、1998)にアラインするヒトESTから設計したプライ
マーを使用して、HUVECλZapライブラリーから作製した。クローニングの方法を
図６(prov)に示す。このcDNAは、384個のアミノ酸をコードする明らかなオープ
ンリーディングフレームを有している（図７）。該cDNA配列は認識可能なコザッ
クコンセンサスモチーフを欠如していたことから、実際の開始配列はこのｃDNA
に包含されていない可能性がある点に注意されたい。スフィンゴシンキナーゼcD
NAは、6.64の推定等電点と、精製したヒト胎盤スフィンゴシンキナーゼ(SK1)に
ついて測定された分子量と一致する42,550kDaの分子量を有するタンパク質(hSK)
をコードする。pcDNA3にサブクローニングし、HEK293細胞中にhSKを一過性に発
現させたところ、トランスフェクトしていないHEK293細胞または空の(インサー
トのない)ベクター (empty vector)でトランスフェクトしたHEK293細胞と比較し
て、この細胞中でのスフィンゴシンキナーゼの活性が3,200倍に増大し、これに
より作製したhSK cDNAが純正なスフィンゴシンキナーゼをコードすることを示し
た。興味深いことに、hSKでトランスフェクトしたHEK293細胞は3,200倍もの量の
スフィンゴシンキナーゼ活性を有していたにもかかわらず、この細胞をTNFαで
処理したところ、トランスフェクトしていないHEK293細胞で見られるのと同程度
の比率で（約2倍）、この酵素の活性が短時間で(10分)増加した（図８）（Xiaら
、1998）。これは、高レベルで過剰発現したスフィンゴシンキナーゼが、該細胞
におけるTNFα介在性活性化機構に対して飽和状態ではないことを示している。

【０１４９】実施例８ヒトスフィンゴシンキナーゼ分析−結果データベース検索により、hSKは、最近同定された２つのサッカロミセス・セ
ルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)スフィンゴシンキナーゼ(Nagiecら、1998)
と、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、線虫(Caenorha
bditis elegans)およびシロイヌナズナ(Arabidopis thaliana)由来の推定スフィ
ンゴシンキナーゼタンパク質をコードするその他のいくつかのESTに対して、高
いアミノ酸配列類似性（28〜36%同一）を有していることがわかった。hSKとこれ
ら類似体との多重配列アラインメント（図９）によって、タンパク質全体を通し
て、特にN-末端側に、アミノ酸が高度に保存されているいくつかの領域が明らか
になった。

【０１５０】 hSK配列のドメイン構造の検索により、３つのカルシウム／カルモジュリン結
合モチーフ(RhoadsとFriedberg、1997)が明らかとなった。そのうち１つは、残
基290〜303にわたる1-8 14タイプA (+3〜+6の純電荷(net charge)を有する[FILV
W]xxx{FAILVW}xx[FAILVW]xxxxx{FILVW})であり、残りの２つは、残基134〜153で
重複している1-8 14タイプB（(+2〜+4の純電荷を伴う[FILVW]xxxxx{FAILVW}xxxx
x[FILVW])である。hSK配列のさらなる分析によって、N-末端に近い位置（Gly⁵）
に、N-ミリストイル化部位が存在する可能性が明らかとなった。該部位は、タン
パク質をタンパク質分解酵素的切断する際に利用されうる。さらに、１つの推定
カゼインキナーゼII（CKII）リン酸化部位（Ser¹³⁰）と、４つの推定PKCリン酸
化部位（Thr⁵⁴、Ser¹⁸⁰、Thr²⁰⁵およびSer³⁷¹）が同定された（図７）。これら
の推定リン酸化部位は、マウススフィンゴシンキナーゼアイソフォームの双方で
も見出される。こうしたマウスの酵素も６つの可能性のあるリン酸化部位(すな
わち４つのPKCリン酸化部位とそれぞれCKIIおよびプロテインキナーゼAリン酸化
部位１つずつ)を示すが、プロテインキナーゼAリン酸化部位はhSKにはない。

【０１５１】 SMART探索ツール (Schultz ら、1998; Ponting ら、1999)を使用してシグナリ
ングドメイン配列の検索を行ない、推定ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)触
媒ドメインに対するhSKの残基16〜153の類似性を明らかにした。hSKはDGK触媒ド
メインファミリーのコンセンサス配列に対して全体として36%の同一性を示し、
きわめて高度に保存されているこのドメインのアミノ酸24個のうちの17個を有し
ていた。しかし、hSKは提唱されているこのドメインのATP結合モチーフ(GxGxxGx _n K)には全く相同性を示さなかったが、このプロテインキナーゼATP結合部位モチ
ーフ(Hanks ら、1988)のDGKへの適用についてはさらに議論の余地があることは
留意しておくべきである(Schaap ら、1994; Sakane ら、1996; Masaki ら、1993
)。ヒトスフィンゴシンキナーゼのさらなる配列解析では、他のタンパク質ファ
ミリーにおいて見られる提唱されているヌクレオチド結合モチーフに顕著な類似
性を示す領域を見つけることはできなかった(Saraste ら、1990; Walker ら、19
82)。DGK触媒ドメインに対する類似性にもかかわらず、hSKは他の脂質結合性酵
素に対しては全く類似性を示さず、さらに、PKC C2またはプレックストリン(ple
ckstrin)相同ドメインのような、認識可能な脂質結合ドメインのいずれかを有し
ていないと考えられる。SH3結合ドメイン (Ren ら、1993; Yu ら、1994)にやや
類似した、C−末端にあるプロリンに富んだ領域を除けば、明らかな制御ドメイ
ンもまったく存在しない。

【０１５２】実施例９組換えスフィンゴシンキナーゼの大腸菌における発現と単離-結果 hSK cDNAをpGEX 4T-2プラスミド中にサブクローニングし、hSKは大腸菌(E. co
li）BL21においてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質とし
てIPTG誘導によって発現された(図10)。GST-hSK融合タンパク質をグルタチオン
セファロース4Bを用いて部分精製し、GSTをトロンビン切断により除去した後、h
SKをさらに、カルモジュリンセファロースおよびMono-Q陰イオン交換カラムから
の連続的溶出によって精製した。これによりスフィンゴシンキナーゼ活性が高い
回収率で回収され(元々の誘導された活性の70%を超える値)、電気泳動レベルで
純粋なスフィンゴシンキナーゼが得られた(図10)。しかしながら、組換え酵素は
低いタンパク質収量で得られるのみであったが、これはIPTG誘導されトロンビン
切断されたhSKタンパク質の大部分はカルモジュリンセファロースカラムに結合
しなかったからである(図11)。この非結合型hSKは、明瞭に示されるほどの触媒
活性を有さず、これにより、非結合型hSKが不適切にフォールディングされたこ
とを示唆していた。

【０１５３】実施例10 スフィンゴシンキナーゼの機能活性に対する翻訳後修飾の必要性天然スフィンゴシンキナーゼの活性に対して翻訳後修飾が必要か否かを決定す
るため、天然分子を、このような修飾が起こらない大腸菌内で産生された組換え
酵素と比較した。具体的には、酵素を、基質親和性および接触性の差異について
試験した。この研究は、翻訳後修飾によりスフィンゴシンキナーゼの構造中でコ
ンホメーション変化が生じ、それにより酵素の物理化学的特性または触媒特性に
おいて検出可能な変化が起こり得ることを前提としていた。結論を述べると、組
換えにより産生されたスフィンゴシンキナーゼは、翻訳後修飾を受けなくても自
身の機能的活性を保持していると決定された。

【０１５４】方法天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの基質特異性天然および組換えスフィンゴシンキナーゼによるスフィンゴシンのリン酸化の
相対的比率を任意に100%と設定した。これらは、天然および組換えスフィンゴシ
ンキナーゼについてそれぞれ2.65 kUおよび7.43 kUに相当した。試験される基質
を、0.25% (w/v) Triton X-100中に最終濃度100μMまで添加し、以前に概要を述
べた標準的なアッセイ条件下でアッセイした。

【０１５５】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの基質および阻害剤の反応速度論的解析基質反応速度論は、基質を、スフィンゴシン類似体については0.5〜200μMの
濃度範囲、ATPについては５〜1000μMの濃度範囲にわたり供給して測定された。
阻害剤反応速度論は、阻害剤を２〜50μMの濃度範囲にわたり使用して測定され
た(表５)。どちらの場合も、データを非線形回帰により解析した。

【０１５６】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの熱安定性天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの熱安定性を、酵素を種々の温度(
４〜80℃)で、pH 7.4 (10%グリセロール、0.5M NaClおよび0.05% Triton X-100
を含む50mM Tris/HCl)で30分間にわたりプレインキュベーションした後の残存活
性をアッセイして決定した。任意に100%に設定された天然および組換えスフィン
ゴシンキナーゼの元々の活性は、それぞれ2.65 kUおよび7.43 kUに相当する。

【０１５７】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼのpH安定性天然および組換えスフィンゴシンキナーゼのpH安定性を、酵素を種々のpHで、
４℃で５時間にわたりプレインキュベーションした後の残存活性をアッセイして
決定した。任意に100%に設定された天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの
元々の活性は、それぞれ2.65 kUおよび7.43 kUに相当する。

【０１５８】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼ活性に対するpHの影響天然および組換えスフィンゴシンキナーゼ活性に対するpHの影響を、４〜11の
pH範囲にわたり、50mMのバッファー(pH 4.0〜5.0では酢酸ナトリウム; pH 6.0〜
7.0ではMes; pH 7.0〜8.2ではHepes; pH 8.2〜10.0ではTris; pH 10.0〜11.0で
はCaps)中で活性をアッセイして決定した。任意に100%に設定された天然および
組換えスフィンゴシンキナーゼ活性の最大値は、それぞれ2.65 kUおよび7.43 kU
に相当する。

【０１５９】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの活性に対する金属イオンの影響天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの活性に対する金属イオンの影響を
、1OmMでの種々の金属イオンまたはEDTAが存在する標準的な条件下で活性をアッ
セイして決定した。任意に100%に設定された天然および組換えスフィンゴシンキ
ナーゼ活性の最大値は、それぞれ2.65 kUおよび7.43 kUに相当する。

【０１６０】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼ活性に対するリン脂質の影響天然および組換えスフィンゴシンキナーゼ活性に対する種々のリン脂質の影響
を、10 mol%のTriton X-100においてこれらのリン脂質が存在する標準的な条件
下で、活性をアッセイすることにより決定した。任意に100%に設定された、リン
脂質の不在下での天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの活性は、それぞれ
2.65 kUおよび7.43 kUに相当する。略語PCはフォスファチジルコリン、PSはフォ
スファチジルセリン、PEはフォスファチジルエタノールアミン、PIはフォスファ
チジルイノシトールである。結果天然および組換えスフィンゴシンキナーゼ活性の最大値はpH 7.4で見られ、双
方の酵素とも6.8〜7.4のpH範囲では最大活性の60%を超える活性を示した(図12)
。双方のスフィンゴシンキナーゼは、６〜7.8のpH範囲で、４℃での５時間にわ
たるインキュベーションの後に元々の活性の90%超を維持しており(図12)、10%グ
リセロール、0.5M NaClおよび0.05% Triton X-100の存在下のpH 7.4では、双方
の酵素は37℃までの温度での30分間の処理に対して安定であった(図12)。酵素の
安定性は、グリセロール、NaClおよびTriton X-100を含まないバッファー中では
遙かに低かった(データは示さない)。この事象はウシ脳およびラット腎臓スフィ
ンゴシンキナーゼについて以前に観察された結果と一致している(Louieら、1976
; Oliveraら、1998)。双方のヒトスフィンゴシンキナーゼが、EDTA存在下でのア
ッセイで活性を示さず、２価金属イオン要求性を示した(図12)。試験された他の
スフィンゴシンキナーゼ(Louieら、1976; BuehrerとBell, 1992; 1993; Olivera
ら、1998; Nagiecら、1998)と同様に、双方のヒト酵素はMg²⁺で最も高い活性、M
n²⁺ではやや低い活性、およびCa²⁺では非常に低い活性のみを示した。Zn²⁺、Cu² ⁺ およびFe²⁺などの他の試験した２価金属イオンは、スフィンゴシンキナーゼ活
性をサポートしなかった(図12)。

【０１６１】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼは、非常に類似性が高くかつ範囲の
狭い基質特異性を有し、双方の酵素は天然の哺乳動物の基質であるD-エリスロ-
スフィンゴシンおよびD-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシンに対して最大の活性
を示す(図13)。また酵素の双方について、フィトスフィンゴシンに対する低い活
性が検出され、一方で一連の他のスフィンゴシン誘導体および関連分子はリン酸
化されなかった。これらの物質には、DL-スレオ-ジヒドロスフィンゴシン、N, N
-ジメチルスフィンゴシン、N, N, N-トリメチルスフィンゴシン、N-アセチルス
フィンゴシン(C₂-セラミド)、ジアシルグリセロール(1, 2-ジオクタノイル-sn-
グリセロールおよび1, 2-ジオレオイル-sn-グリセロール)およびフォスファチジ
ルイノシトールが含まれる。さらにヒトスフィンゴシンキナーゼをD-エリスロ-
スフィンゴシンならびにD-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシンに関してさらに分
析して、使用した濃度範囲にわたりミカエリス-メンテン反応速度論を示したと
ころ(図13)、単離された天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの双方は非常
に類似性の高い反応速度論的特性を示し、またD-エリスロ-スフィンゴシンキナ
ーゼならびにD-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシンに対してやや高い親和性を示
すつことが明らかとなった(表５)。また双方の酵素は、スフィンゴシンがスフィ
ンゴシン-BSA複合体として供給された場合にも同様に類似した反応速度論を示し
たが、このような状態で基質を供給した場合には、本研究において行われた他の
全てのアッセイにおいて使用した、基質をTriton X-100混合ミセル中で供給した
場合と比較して、k_cat値が双方の酵素とも低くなった(天然および組換えスフィ
ンゴシンキナーゼについて、それぞれ28s^-1、39s^-1)。BSA複合体として提供され
たスフィンゴシンのK_m値は、天然および組換えスフィンゴシンキナーゼについて
、それぞれ16±４mM、17±２mMであった。天然および組換えスフィンゴシンキナ
ーゼの双方は、ATPに対して同様の親和性(K_mは約80mMである)を有していた(表５
)。

【０１６２】天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの双方は、DL-スレオ-ジヒドロスフ
ィンゴシン、N, N-ジメチルスフィンゴシンおよびN, N, N-トリメチルスフィン
ゴシン(図13)により阻害され、これらの３種類の分子全てがスフィンゴシンに関
して競合的阻害を示した。これらの分子に関する阻害定数は非常に類似している
が、N, N, N-トリメチルスフィンゴシンは、N, N-ジメチルスフィンゴシンより
もごく僅かに効率的な阻害剤であったDL-スレオ-ジヒドロスフィンゴシンよりも
若干効率的に阻害した(表５)。

【０１６３】 ADPもまたATPに関して弱い競合的阻害を示した(表５)。全ての場合において、
天然および組換えスフィンゴシンキナーゼについて、顕著に類似した阻害定数が
得られた(表 5)。N-アセチルスフィンゴシン、またはセラミド合成阻害剤である
フモシン(Fumosin B 1)に関しては阻害は見られなかった。

【０１６４】カルシウム/カルモジュリンのスフィンゴシンキナーゼ活性に対する影響を試
験した。使用したアッセイ条件下で、カルシウム/カルモジュリンは、天然また
は組換えヒトスフィンゴシンキナーゼのいずれの活性に対しても影響を及ぼさな
かった(データは示さない)。この結果はカルモジュリンによるスフィンゴシンキ
ナーゼ活性の調節が欠如していることを示しているが、イストス(ists)の細胞小
器官(subcellular)局在化の調節などの、スフィンゴシンキナーゼの他の機能に
カルモジュリンが関与している可能性は残されている。

【０１６５】スフィンゴシンキナーゼ活性の酸性リン脂質による刺激を試験した。中性リン
脂質であるフォスファチジルコリンおよびフォスファチジルエタノールアミンの
酵素アッセイ混合物への添加によっては、ヒトスフィンゴシンキナーゼ活性の検
出可能な差異は起こらなかったが、酸性リン脂質であるフォスファチジルセリン
、フォスファチジルイノシトールおよびフォスファチジン酸については著しい活
性の増加(1.6〜２倍)が見られた(図14)。天然および組換えスフィンゴシンキナ
ーゼの双方が、これらの酸性リン脂質により類似した様式で活性化された。また
反応速度論的解析により、３種類のリン脂質の全てが酵素のK_cat値を増加させる
一方、K_m値はそのまま変化させないことが判明した。

【０１６６】当業者には、本明細書に記載の発明には具体的に記載されたもの以外にも変更
と改変の余地があることが理解される。そのような変更と改変の全てが本発明に
含まれると理解されるべきである。また本発明は、本明細書中で言及または示さ
れた全てのステップ、特徴、組成物および化合物を、個別にまたは集合として、
また２種類以上の前述のステップまたは特徴の組合せのいずれか、および全ての
組合せを含む。

【０１６７】表３-ヒト胎盤中のスフィンゴシンキナーゼ活性の、種々の動物組織との比較新鮮な動物組織を、ヒト胎盤に関して記述した通りに洗浄し、ホモジナイズし
た。サイトゾル性スフィンゴシンキナーゼ活性の比率を、ホモジネート中の全活
性と超遠心分離した上清(100,000×g、60分)の全活性とを比較して決定した。ス
フィンゴシンキナーゼの比活性を、１分間に生成したS1Pのpmol(U)/g組織として
示す。

【０１６８】

【表３】

【０１６９】表４-ヒト胎盤からのスフィンゴシンキナーゼの精製スフィンゴシンキナーゼを、1240 gの新鮮なヒト胎盤(４個の胎盤)から精製し
た。スフィンゴシンキナーゼ活性の１ユニット(U)を、１分間にスフィンゴシン
とATPから生成される１pmolのS1Pと定義した。

【０１７０】

【表４】

【０１７１】表５-天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの基質と阻害剤の反応速度論的
解析基質反応速度論を、スフィンゴシン類似体については0.5〜200μM (0.0125〜5
mol %)の濃度範囲にわたり、またATPについては５〜1000μMの濃度範囲にわた
り基質を供給して決定した。阻害剤反応速度論を、スフィンゴシン類似体につい
ては２〜50μM (0.05〜1.25 mol %)の濃度範囲にわたり、またADPについては0.1
〜５mMの濃度範囲で阻害剤を用いて決定した。以前の研究との比較のため、スフ
ィンゴシンおよびその誘導体についてのK_mおよびK_i値は全て、バルク溶液濃度と
Triton X-100のmol %との双方で記載した。Triton X-100は全てのアッセイにお
いて最終濃度0.25% (w/v)で存在した。全ての反応速度論的数値と標準誤差(Dugg
leby, 1981)は、非線形回帰分析により得られた(Easterby, 1996)。

【０１７２】

【表５】

【０１７３】引用文献 Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meyer, E. W.およびLipman, D. J.
, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Alessenko, A. V., (1998) Biochemistry 63: 62-68. Bonnerら、(1973) J. Mol. Biol. 81: 123. Bradford, M. M., (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254. Buehrer, B. M.およびBell, R. M., (1992) J. Biol. Chem. 267: 3154-3159. Buehrer, B. M.およびBell, R. M., (1993) Adv. Lipid Res. 26: 59-67. Buehrer, B. M., Bardes, E. S.およびBell, R. M., (1996) Biochim. Biophy
s. Acta 1303: 233-242. Culliver, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gu
tkind, J. S.およびSpiegel, S., (1996) Nature 381: 800-803. DouillardおよびHoffman, 「免疫学の概説におけるハイブリドーマについての
基本的事実(Basic facts about hybridomas in Compendium of Immunology)」,
Vol II Schwartz編(1981). Duggleby, R. G., (1981) Anal Biochem. 110: 9-18. Easterby, J. S., (1996) 「Hyper 1.1s：酵素反応速度論データの双曲線回帰
分析(Hyper 1.1s: Hyperbolic Regression Analysis of Enzyme Kinetic Data)
」.Liverpool University, Liverpool. Graham, F. L.およびvan der Eb, A. J. (1973) Virology 54: 536-539. Hanks, S. K., Quinn, A. M.およびHunter, T., (1988) Science 241: 42-52. Igarashi, Y., (1997) J Biochem. 122: 1080-1087. Kohama, T., Olivera, A., Edsall, L., Nagiec. M. M., Dickson, R.およびS
piegel, S., (1998) J. Biol. Chem. 273: 23722-23728. KohlerおよびMilstein., (1975) Nature 256: 495-499. Laemmli, U. K., (1970) Nature 227: 680-685. Louie, D. D., Kisic, A.およびSchroepfer, G. J., (1976) J. Biol. Chem.
251: 4557-4564. Masai, I., Okazaki, A., Hosoya, T.およびHotta, Y., (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 11157- 11161. Melendez, A., Floto, R. A., Gillooly, D. J., Harnett, M. M.およびAllen
, J. M., (1998) J. Biol. Chem. 273: 9393-9402. Meyer zu Heringdorf, D., van Koppen, C. J.およびJakobs, K. H., (1997)
FEBS Lett 410: 34-38. Nagiec, M. M., Skrzypek, M., Nagiec, E. E., Lester, R. L.およびDickson
, R. C., (1998) J. Biol.Chem. 273: 19437-19442. Olivera, A.およびSpiegel, S., (1993) Nature 365: 557-560. Olivera, A., Kohama, T., Tu, Z., Milstein, S.およびSpiegel, S., (1998)
J. Biol. Chem. 273: 12576-12583. Ponting, C. P., Schultz, J., Milpetz.およびBork, P., (1999) Nucleic Ac
ids Res. 27: 229-232. Ren, R., Mayer, B. J., Cicchetti, P.およびBaltimore, D., (1993) Scienc
e 259: 1157-1161. Rhoads. A. R..およびFriedberg, F., (1997) FASEB J. 11 : 331-340. Sakane, F., Lai, M., Wada, I., Imai, S.およびKohoh, H., (1996) Biochem
. J. 318: 583-590. Saraste, M., Sibbald, P. R.およびWittinghofer, A., (1990) Trends Bioch
em. Sci. 15: 430-434. Schaap, D., van der Wal, J.およびvan Blitterswijk, W., (1994) Biochem. J. 304: 661-662. Schultz, J., Milpetz, F., Bork, P.およびPonting, C. P., (1998) Proc. N
atl, Acad. Sci. USA 95: 5857-5864. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner,
F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J.お
よびKlenk, D. C., (1985) Anal. Biochem. 150: 76-85. Spiegel, S., Culliver, O., Edsall, L., Kohama, T., Menzeleev, R., Oliv
era, A., Thomas, D., Tu, Z., Van Brocklyn, J.およびWang, F., (1998). Bio
chemistry (Mosc) 63: 69-73. Walker, J. E., Saraste, M., Runswick, M. J.およびGray, N. J., (1982) E
MBO J. 8: 945-951. Wall, R. T., Harker, L. A., Quadracci, L. J.およびStriker, G. E., (197
8) J. Cell. Physiol. 96: 203-213. Wessel, D.およびFlugge, U. I., (1984) Anal. Biochem. 138: 141-143. Xia, P., Gamble, J. R., Rye, K.-A., Wang, L., Hii, C. S. T., Cockerill
, P., Khew-Goodall, Y., Bert, A. G., Barter, P. J.およびVadas, M. A., (1
998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14196-14201. Yu, H., Chen, J. K., Feng, S., Dalgarno, D. C., Brauer, A. W.およびSch
reiber, S. L., (1994) Cell 76: 933-945.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、スフェンゴミエリン経路の概略図である。

【図２】図２は、ヒトスフィンゴシンキナーゼの陰イオン交換クロマトグラフィーの図
表である。A. (NH₄)₂SO₄のQセファロースファストフローを用いた陰イオン交換
クロマトグラフィーにより、スフィンゴシンキナーゼ活性の2つのピークを示す
ヒト胎盤抽出物の画分が沈降した。抽出物を、バッファーA中に注ぎ、スフィン
ゴシンキナーゼ活性(^*)を0〜1M(----)のNaCl勾配を用いて溶出した。次いで、溶
出されるタンパク質を280nm(-)での吸収度により調べた。

【図３】図３は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるヒト胎盤SKI精製の図式的表
示である。モノ-Qカラムにおける精製を、再びアプライしてATP存在下で同一カ
ラムから溶出することにより向上させた。A. スフィンゴシンキナーゼキナーゼ
活性を含むカルモジュリン-セファロース4bカラムから得た画分を集め、脱塩後
バッファーAを含むモノ-Qカラムにアプライした。B. モノ-Qカラムから得た活性
画分を脱塩し、1mM ATPおよび4mM MgCl₂を含むバッファーAを含むモノ-Qカラム
に再びアプライした。双方の場合において、スフィンゴシンキナーゼ活性(^*)を0
〜1M(----)のNaCl勾配を用いて溶出し、タンパク質の溶出を280nm(-)での吸収度
によって調べた。

【図４】図４は、精製ヒト胎盤スフィンゴシンキナーゼのSDS-PAGEのイメージである。
Superdex 75カラムから得た、最も高いスフィンゴシンキナーゼ活性を含む画分
をSDS-PAGEに供すると、銀染色により45kDaの単一のバンドが得られた。

【図５】図５は、予備的陰イオン交換クロマトグラフィーの図表である。単一のクロマ
トグラフィーにより同定されるスフィンゴシンキナーゼアイソフォームだけが、
HUVEC中に存在する。ヒト胎盤、HUVEC、およびTNFα処理HUVEC抽出物のHiTrap-Q
カラムを用いた予備的陰イオン交換クロマトグラフィーにより、HUVEC中にはTNF
α処理後の細胞において活性が増大する単一のスフィンゴシンキナーゼのピーク
の存在が示された。細胞を回収して溶解し、得られた可溶性抽出物をバッファー
Aを含むHiTrap-Qカラムにアプライした。ヒト胎盤、HUVEC、およびTNFα処理HUV
EC抽出物中のスフィンゴシンキナーゼ活性の合計は、それぞれタンパク質1mgあ
たり51U、78Uおよび136Uであった。スフィンゴシンキナーゼ活性(□）を、0〜1M
(----）のNaCl勾配を用いて溶出した。

【図６】図６は、HUVEC由来のスフィンゴシンキナーゼ(SPHK)をクローン化するために
使用されるストラテジーの概念図である。

【図７】図７は、ヒトスフィンゴシンキナーゼのヌクレオチド(<400>1)および推定アミ
ノ酸(<400>2)ならびに推定のドメイン構造を示す。A. hSKのcDNA核酸配列および
推定アミノ酸配列である。アミノ酸は、1番目のメチオニン残基から番号が付け
られる。ストップコドンを、星印で示す。スフィンゴシンキナーゼコドン領域は
、大文字で示されており(ヌクレオチド33〜1187)、小文字は、非翻訳配列および
ベクター配列を示す。B. ヒトスフィンゴシンキナーゼの概略図であり、推定のP
KCおよびCKIIリン酸化部位、潜在的N-ミリストイル化部位、カルシウム/カルモ
ジュリン結合モチーフ、および推定のDGK触媒ドメインに類似した領域の位置を
示している。

【図８】図８は、HEK293細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ活性の発現およびTN
Fα刺激の図示である。HEK293細胞を、インサートのないpcDNA発現ベクター(A)
単独で、またはヒトスフィンゴシンキナーゼcDNAを含有するpcDNA(B)で一過性に
トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、未処理またはTNFαで
の10分間処理後、回収し、細胞溶解物におけるスフィンゴシンキナーゼ活性を測
定した。データは、二連の実験の平均値であり、3回の独立した実験うちの代表
例である。

【図９】図９は、ヒトスフィンゴシンキナーゼと他の公知の推定スフィンゴシンキナー
ゼとの配列比較の図示である。推定ヒトスフィンゴシンキナーゼアミノ酸配列と
、マウススフィンゴシンキナーゼ(mSK1aおよびmSK1b; Kohamaら, 1998)およびサ
ッカロミセス・セレビシアエ酵母（S. cerevisiae）(LCB4およびLCB5; Nagiecら
, 1998)スフィンゴシンキナーゼのアミノ酸配列ならびに分裂酵母(S.pombe)およ
び線虫(C. elegans)(それぞれ、Genbank^TM寄託番号 Z98762およびZ66494)由来の
推定スフィンゴシンキナーゼのEST配列との比較を示す。シロイヌナズナ(A. tha
liana)推定スフィンゴシンキナーゼ配列（Genbank^TM寄託番号 AL022603）のヒト
スフィンゴシンキナーゼに対するアミノ酸配列類似性は高かった(36％の同一性)
が、アラインメントが比較的乏しかったので、明確には示されていない。コンセ
ンサス配列は、7種のアラインメントされた配列のうち少なくとも6種において保
存されているアミノ酸を表す。一方、構造的に類似するアミノ酸の保存を、星印
で表示する。多重配列アラインメントを、CLUSTALWで行い、ヒトスフィンゴシン
キナーゼに対する同一性％は、GAPアルゴリズム(Needleman & Wunsch, 1970)を
用いて決定された。

【図１０】図１０は、大腸菌(E.Coli)BL21における組換えヒトスフィンゴシンキナーゼの
発現の図である。大腸菌BL21を、pGEX4-2Tヒトスフィンゴシンキナーゼ発現構築
物で形質転換し、GST-SK融合タンパク質の発現を、100μM IPTGを用いた誘導後
に分析した。A. 非誘導およびIPTGで誘導した大腸菌BL21抽出物におけるスフィ
ンゴシンキナーゼ活性である。B. 大腸菌細胞溶解物におけるGST-SK融合タンパ
ク質発現を示す、クマシー染色したSDS-PAGEゲルである。C. 単離された組換え
ヒトスフィンゴシンキナーゼの精製度を示す。スフィンゴシンキナーゼ活性を含
むモノ-Qカラムから得た画分をSDS-PAGEにアプライして、銀染色により45kDaの
単一のバンドが得られた。

【図１１】図１１は、組換えヒトスフィンゴシンキナーゼの精製の図である。カルモジュ
リンセファロース4Bは、活性および不活性酵素の分離を可能にする。GST-SK融合
タンパク質を、グルタチオン-セファロース4Bを用いて部分精製し、トロンビン
で切断し、4mM CaCl₂を含むバッファーBを含有するカルモジュリン-セファロー
ス4Bカラムにアプライした。カラムに結合した活性のあるスフィンゴシンキナー
ゼの溶出(↓)を、2mM EGTAおよび1M NaClを含有するバッファーAを用いて行った
。A. カルモジュリン-セファロース4Bカラムから溶出された画分のSDS-PAGE分析
である。B. 組換えヒトスフィンゴシンキナーゼタンパク質の多くが、カラムに
結合せず、触媒活性を示さなかったことを示す、カラム画分におけるスフィンゴ
シンキナーゼ活性(|)である。

【図１２】図１２は、天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの物理-化学特性の図示
である。A. 至適pHを示す。50mMバッファー(酢酸ナトリウム、 pH4.0〜5.0；Mes
, pH6.0〜7.0；Hepes, pH7.0〜8.2；Tris/HCl, pH8.2〜10.0；Caps, pH10.0〜11
.0)における4〜11のpH範囲にわたって活性をアッセイすることによって、SK活性
におけるpHの影響を測定した。示したデータは、さまざまなpHで4℃にて5時間酵
素をプレインキュベーションした後の残存SK活性である。C. 温度安定性を示す
。示したデータは、種々の温度(4〜80℃)で、30分間、pH7.4（10％のグリセロー
ル、0.5M NaCl、および0.05％のTriton X-100を含有する50mM Tris/HCl）にて、
酵素をプレインキュベーションした後の残存SK活性である。D. 金属イオン要件
を示す。種々の金属イオンまたはEDTAを、最終濃度10mMにてアッセイ混合物中に
添加した。すべての場合において、天然(□および黒塗りバー)および組換え(□
および空白バー)スフィンゴシンキナーゼの最大活性を、任意に100％に設定した
。それらは、それぞれ2.65kU、7.43kUに相当した。データは、平均値±S.D.で示
す。

【図１３】図１３は、天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの基質特異性および反応
速度論的解析の図である。A. 0.25％のTriton X-100中に100μMで添加されたス
フィンゴシン類似体および他の脂質を用いた、天然（黒塗りバー）および組換え
（空白バー）スフィンゴシンキナーゼの基質特異性を示す。天然および組換えSk
sによるスフィンゴシンのリン酸化の割合を、任意に100％に設定した。それらは
、それぞれ2.65kU、7.43kUに相当した。他の潜在的な基質に対する活性を、スフ
ィンゴシンに対する活性に対して示した。DL-トレオ-ジヒドロスフィンゴシン、
N,N-ジメチルスフィンゴシン、N,N,N-トリメチルスフィンゴシン、N-アセチルス
フィンゴシン(C₂-セラミド)、ジアシルグリセロール(1,2-ジオクタノイル-sn-グ
リセロールおよび1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール)およびホスファチジルイ
ノシトールでは、いずれもリン酸化は観察されなかった。B. 基質としてスフィ
ンゴシン(□)およびD-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシン（□）を用いた組換え
ヒトスフィンゴシンキナーゼの基質の反応速度論的解析を示す。C. N,N,N-トリ
メチルスフィンゴシンを5μM（□）および25μM（□）で用いて組換えヒトスフ
ィンゴシンキナーゼを阻害した場合の反応速度論的解析、ならびにN,N,N-トリメ
チルスフィンゴシン（□）不在下での反応速度論的解析を示す。差し込み図：ラ
インウィーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロット。データは、平均値±S.D
.である。

【図１４】図１４は、天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの活性を刺激する酸性リ
ン脂質の図式的表示である。天然および組換えスフィンゴシンキナーゼの活性に
おける種々のリン脂質の影響を、これらのリン脂質がTriton X-100の10mol％で
存在する標準的条件下で活性をアッセイすることによって測定した。リン脂質の
不在下での天然(黒塗りバー)および組換え(空白バー)の活性を、任意に100％に
設定した。それらは、それぞれ2.65kU、7.43kUに相当した。PC：ホスファチジル
コリン、PS：ホスファチジルセリン、PE：ホスファチジルエタノールアミン、PI
：ホスファチジルイノシトール、PA：ホスファチジン酸。データは、平均値±S.
D.である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１４Ｃ０８４ 45/00 11/06 ４Ｃ０８５ 48/00 25/00 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 25/28 ４Ｈ０４５ 11/06 29/00 １０１ 25/00 31/10 25/28 43/00 １１１ 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 16/40 31/10 Ｃ１２Ｎ 9/12 43/00 １１１ 9/96 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 5/10 1/68 Ａ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 9/96 33/577 ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/48 5/00 Ｂ 1/68 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/64 33/577 37/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ピットソン，スチュアート，マックスウエルオーストラリア国 5067 サウスオーストラリアノーウッド，スレルフォールアベニュー１ビイ (72)発明者ワッテンバーグ，ブライアン，ウルフオーストラリア国 5052 サウスオーストラリアベレイア，シーオークロード 137 (72)発明者シャ，プオーストラリア国 5072 サウスオーストラリアマギル，シェイクスピアアヴェニュー 97 (72)発明者ダンドレア，リチャード，ジェイムスオーストラリア国 5066 サウスオーストラリアストニーフェル，アレンデイルグローブ 54 (72)発明者ギャンブル，ジェニファー，ルースオーストラリア国 5152 サウスオーストラリアスティルリング，ブランチロード８ (72)発明者ベイダス，マシュー，アレキサンダーオーストラリア国 5152 サウスオーストラリアスティルリング，ブランチロ −ド８Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA07 CA20 DA03 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 HA17 4B050 CC01 CC04 CC05 DD11 EE01 FF03E FF05E FF11E FF12E FF14E GG01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA19 QQ27 QQ44 QQ53 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA30 BB01 BC01 BC03 BD01 BD14 BD45 CA29 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA09 BA10 BA22 CA18 CA29 CA53 CA59 DC01 DC32 NA14 ZA01 ZA15 ZA45 ZA59 ZB15 ZB32 ZB35 ZC19 ZC20 4C085 AA13 AA14 BB11 BB22 CC03 CC22 CC23 CC27 DD33 DD34 DD37 DD43 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA15 ZA45 ZA59 ZB15 ZB32 ZB35 ZC19 ZC20 4H045 AA11 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スフィンゴシンキナーゼタンパク質もしくはスフィンゴシン
キナーゼタンパク質の模倣的誘導体をコードするヌクレオチド配列、または該ヌ
クレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子、また
はその誘導体もしくは類似体。
【請求項２】スフィンゴシンキナーゼタンパク質がヒトスフィンゴシンキ
ナーゼタンパク質である、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】実質的に＜400＞２に示されるアミノ酸配列もしくはその誘
導体もしくは模倣体または＜400＞２に示されるアミノ酸配列中の少なくとも10
個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％以上の類似性を有するアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に相補的なヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸分子またはその誘導体もしくは類似体。
【請求項４】実質的に＜400＞１に示されるヌクレオチド配列または＜400
＞１に示されるヌクレオチド配列に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイ
ズ可能なその誘導体を含む、単離された核酸分子またはその誘導体もしくは類似
体。
【請求項５】＜400＞２に示されるアミノ酸配列または＜400＞２に示され
るアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45
％の類似性を有するアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列をさらにコードする、
請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】実質的に＜400＞１に示される請求項３または４に記載の単
離された核酸分子。
【請求項７】スフィンゴシンキナーゼタンパク質である、単離されたタン
パク質またはその誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体。
【請求項８】スフィンゴシンキナーゼタンパク質がヒトスフィンゴシンキ
ナーゼタンパク質である、請求項７記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】実質的に＜400＞２に示されるアミノ酸配列もしくはその誘
導体もしくは模倣体、または＜400＞２に示されるアミノ酸配列中の少なくとも1
0個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約45％の類似性を有するアミノ酸配
列を含む、単離されたタンパク質または該タンパク質の誘導体、類似体、化学的
等価物もしくは模倣体。
【請求項１０】実質的に＜400＞１に示されるヌクレオチド配列もしくは
その誘導体もしくは類似体または＜400＞１に示されるヌクレオチド配列と低ス
トリンジェンジー条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列にコードされ
る、請求項９記載の単離されたタンパク質または該タンパク質の誘導体、類似体
、化学的等価物もしくは模倣体。
【請求項１１】実質的に＜400＞２に示される請求項０または１０記載の
単離されたタンパク質。
【請求項１２】被検体内のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現を調節す
る方法であって、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現を調節するために十分な
条件下で十分な時間にわたって、有効量の薬剤とスフィンゴシンキナーゼ遺伝子
を接触させることを含む、上記方法。
【請求項１３】哺乳動物内のスフィンゴシンキナーゼの機能活性を調節す
る方法であって、スフィンゴシンキナーゼ活性を増大または低減させるために十
分な条件下で十分な時間にわたって、上記調節に有効な量の薬剤を該哺乳動物に
投与することを含む、上記方法。
【請求項１４】哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であって、ス
フィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナーゼの活性を調節
するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の薬剤を該哺乳動物に
投与することを含む、上記方法。
【請求項１５】哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であって、該
細胞の機能活性を調節するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量
の請求項７〜１１いずれか１項に記載のタンパク質またはその誘導体、類似体、
化学的等価物もしくは模倣体を該哺乳動物に投与することを含む、上記方法。
【請求項１６】哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であって、該
細胞の機能活性を調節するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量
の請求項１〜６いずれか１項に記載の核酸分子、またはその誘導体、類似体、化
学的等価物もしくは模倣体を該哺乳動物に投与することを含む、上記方法。
【請求項１７】哺乳動物内の細胞の機能活性を調節する方法であって、ス
フィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現またはスフィンゴシンキナーゼの活性を調節
するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の薬剤を該哺乳動物に
投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼ遺伝子発現産物またはスフィン
ゴシンキナーゼが細胞の活性を調節することを特徴とする、上記方法。
【請求項１８】哺乳動物を処置する方法であって、スフィンゴシンキナー
ゼ遺伝子の発現を調節するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量
の薬剤を該哺乳動物に投与することを含み、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の発
現の調節により細胞の機能活性が調節されることを特徴とする、上記方法。
【請求項１９】哺乳動物を処置する方法であって、スフィンゴシンキナー
ゼの活性を調節するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の薬剤
を該哺乳動物に投与することを含み、スフィンゴシンキナーゼ活性の調節により
細胞の機能活性が調節されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２０】哺乳動物を処置する方法であって、細胞の機能活性を調節
するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の請求項７〜１１いず
れか１項に記載のタンパク質またはその誘導体、類似体、化学的等価物もしくは
模倣体を該哺乳動物に投与することを含む、上記方法。
【請求項２１】哺乳動物を処置する方法であって、細胞の機能活性を調節
するために十分な条件下で十分な時間にわたって、有効量の請求項１〜６いずれ
か１項に記載の核酸分子またはその誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣
体を該哺乳動物に投与することを含む、上記方法。
【請求項２２】細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造における、
スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその誘導体、類似体、化学的等価物もしく
は模倣体の発現を調節可能な薬剤の使用。
【請求項２３】細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造における、
スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣
体の活性を調節可能な薬剤の使用。
【請求項２４】細胞の機能活性を調節するための医薬品の製造における、
スフィンゴシンキナーゼもしくはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子、またはそれら
の誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体の使用。
【請求項２５】スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体、類似体、化学
的等価物もしくは模倣体の活性の調節に使用するための薬剤であって、スフィン
ゴシンキナーゼ活性の調節により細胞の機能活性が調節されることを特徴とする
、上記薬剤。
【請求項２６】スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその誘導体、類似体
、化学的等価物もしくは模倣体の発現の調節に使用するための薬剤であって、ス
フィンゴシンキナーゼ遺伝子の発現の調節により細胞の機能活性が調節されるこ
とを特徴とする、上記薬剤。
【請求項２７】細胞の機能活性の調節に使用するための、スフィンゴシン
キナーゼもしくはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその誘導体、類似体、化
学的等価物もしくは模倣体。
【請求項２８】スフィンゴシンキナーゼ遺伝子、スフィンゴシンキナーゼ
、またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子もしくはスフィンゴシンキナーゼもしく
はそれらの誘導体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体の調節が可能な薬剤を
、１種以上の製薬上許容し得る担体および/または希釈剤とともに含む、医薬組
成物。
【請求項２９】請求項７〜１１のいずれか１項記載のタンパク質を標的と
する、単離された抗体。
【請求項３０】請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸分子を標的とする
、単離された抗体。
【請求項３１】モノクローナル抗体である、請求項２９または３０記載の
抗体。
【請求項３２】ポリクローナル抗体である、請求項２９または３０記載の
抗体。
【請求項３３】哺乳動物の疾患症状を診断またはモニタリングする方法で
あって、該哺乳動物から単離された生物学的サンプル中のスフィンゴシンキナー
ゼまたはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子についてスクリーニングすることを含む
、上記方法。