KR20020000805A

KR20020000805A - 스핀고신 키나제 효소

Info

Publication number: KR20020000805A
Application number: KR1020017014462A
Authority: KR
Inventors: 피슨스튜어트맥스웰; 와튼버그브라이언울프; 시아푸; 드안드레아리차드제임스; 갬블제니퍼루스; 바다스매튜알렉산더
Original assignee: 추후제출; 존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-01-05
Also published as: DK1192247T3; JP2002543831A; CA2372541A1; EP1192247A1; KR100798375B1; US6730480B1; ES2261200T3; DE60027295D1; US20070071752A1; US7112427B2; US20040132053A1; WO2000070028A1; NZ515132A; EP1192247B9; DE60027295T2; EP1192247A4; EP1192247B1; ATE323153T1

Abstract

본 발명은 세포 활성의 조절, 특히 신호 전달계를 조절하여 세포 활성을 조절할 수 있는 새로운 단백질 분자 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 및 모사체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 인간 스핀고신 키나제 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 및 모사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 분자 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 및 모사체를 코딩하는 유전자 서열에 관한 것이다. 본 발명의 분자는 치료, 예방, 및 진단 용도에 유용한 것이다.

Description

스핀고신 키나제 효소 {SPHINGOSINE KINASE ENZYME}

본 명세서에서 인용된 출판물의 상세한 문헌 목록은 상세한 설명 말미에 알파벳 순서로 기록되어 있다.

스핀고신 키나제는 다양한 세포 반응의 중요한 조절 효소이다. 이의 활성은 염증, 세포자멸 및 세포 증식에 영향을 미쳐서 치료 중재를 위한 중요한 표적이 된다.

스핀고신-1-포스페이트는 신호 전달 체계에서 중요한 2번째 메신저로 알려져 있다(Meyeret al., 1997). 다양한 세포 유형에서 분열 촉진인자이고(Alessenko, 1998; Spiegelet al., 1998), 세라마이드-유도된 세포 자멸의 방지(Culliveretal., 1996), IP₃-비의존 경로에 의한 세포내 칼슘의 이동(mobilisation), DNA 합성 자극, 분열 유발 인자-활성화된 단백질(MAP) 키나제 경로의 활성화, 포스포리파제 D의 활성화, 및 세포 운동성의 조절을 포함하는 다양한 중요한 조절 경로를 광범위하게 시발하는 것 같다(Meyeret al., 1997; Spiegelet al., 1998; Igarashi., 1997 참조).

최근의 연구(Xiaet al., 1998)에서는 스핀고신-1-포스페이트는 혈관의 상피 세포의 염증 반응에서 종양괴사 인자-α(TNFα)에 대한 절대적인 신호 중재자라는 것이 밝혀졌다. 이 물질의 확실한 중요성에도 불구하고 세포내 스핀고신-1-포스페이트 수준을 조절하는 대사에 대해서는 거의 알려져 있지 않은 실정이다. 세포 내에서 스핀고신-1-포스페이트 수준은 대부분 스핀고신 키나제에 의해 스핀고신으로부터 형성되고 조정되고, 일부는 소포체-관련 스핀고신-1-포스페이트 리가아제 및 스핀고신-1-포스페이트 포스파다제에 의한 분해에 의해 조정된다는 것이 알려져 있다(Spiegelet al., 1998). 스핀고신-1-포스페이트의 세포내 바닥 수준은 일반적으로 낮지만, 세포가 분열촉진 인자에 노출된 경우 일시적으로 빠르게 증가할 수 있다. 이 반응은 시토졸 내의 스핀고신 키나제 활성 증가와 관련이 있는 것으로 보이고,N,N-디메틸스핀고신 및 DL-threo-디하이드로스핀고신의 스핀고신 키나제 억제 분자를 첨가함으로써 방지할 수 있다. 이것은 스핀고신 키나제는 세포내 스핀고신-1-포스페이트 수준을 조절하는 중요한 분자라는 것을 의미한다. 스핀고신 키나제의 중추적이고 결정적인 역할은 세포내의 스핀고신-1-포스페이트에 관여된작용을 매개하는 것이다.

따라서, 스핀고신 키나제의 발현 및 효소 활성을 조절하는 메커니즘을 밝혀, 세포 내 신호 전달을 보다 민감하게 조절하도록 하는 진전을 용이하게 하는 새로운 스핀고신 키나제를 동정하고 클론화할 필요가 있다. 이에 의해 스핀고신 키나제 발현 또는 활성을 조절하는 중재적 치료법의 개발을 위한 기반을 제공하도록 하게 된다. 본 발명을 달성하기까지의 연구에서, 본 발명자는 새로운 스핀고신 키나제 분자를 정제하고 클로닝하였다.

본 발명은 세포 활성의 조절, 특히 신호 전달을 조절하여 세포 활성을 조절할 수 있는 새로운 단백질 분자 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 및 모사체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간의 스핀고신 키나제 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 및 모사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 분자, 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 및 모사체를 코딩하는 유전자 서열에 관한 것이다. 본 발명의 분자는 치료, 예방, 및 진단 용도에서 유용한 것이다.

도 1은 '스핀고마이엘린 경로'를 도식적으로 나타내는 도면이다.

도 2는 인간의 스핀고신 키나제의 음이온 교환 크로마토그래피를 그래프로 나타내는 도면이다. A, 인간 태반 추출물의 (NH₄)₂SO₄침전 분획을 Q Sepharose 고속 유동으로 음이온 교환 크로마토그래피한 결과에서는 스핀고신 키나제 활성에서 2개의 피크가 나타났다. 추출물을 버퍼 A에 적용하고 스핀고신 키나제 활성(ㆍ)을 0 내지 1M의 구배의 NaCl()로 용리시켰다. 용리된 단백질에 대해 280 ㎚에서 흡광도(---)를 측정하였다.

도 3은 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 인간 태반 SK1의 정제를 그래프로 나타낸 도면이다. ATP의 존재하에 동일한 컬럼에서 재적용하고 용리시켜 Mono-Q 컬럼에 의한 정제는 향상된다. A는 스핀고신 키나제 활성을 포함하는 카모듈린-Sepharose 4b 컬럼에서 얻은 분획을 채워서 탈염하고 버퍼 A에서 Mono-Q 컬럼에 적용하였다. B는 Mono-Q 컬럼에서 얻은 활성 분획을 탈염하고 1mM ATP 및 4mM MgCl₂를 함유하는 버퍼 A에서 Mono-Q 컬럼에 재적용하였다. 양쪽 경우에서 모두 스핀고신 키나제 활성(ㆍ)을 0 내지 1M의 구배의 NaCl()로 용리시키고 단백질 용리액을 280 ㎚에서 흡광도(---)를 측정하였다.

도 4는 정제된 인간 태반 스핀고신 키나제의 SDS-PAGE의 이미지이다. 최고의 스핀고신 키나제 활성을 가진 Superdex 75 컬럼에서 얻은 분획을 은 염색을 하여 SDS-PAGE에 적용하여 45kDa의 단일 밴드를 얻었다.

도 5는 제조용 음이온 교환 크로마토그래피를 그래프로 나타내는 도면이다. 단일 크로마토그래피에 의해 동정된 스핀고신 키나제 이소폼만이 HUVEC에 존재한다. 인간의 태반, HUVEC 및 TNFα 처리된 HUVEC 추출물로 실시한 제조용 음이온 교환 크로마토그래피는 HUVEC에서 세포에 TNFα를 처리한 후에 활성이 증가하는 단일 스핀고신 키나제 피크가 존재하는 것을 보여준다. 세포를 수득하고 용리시키고, 가용성 추출물을 버퍼 A내에서 HiTrap-Q 컬럼에 적용하였다. 인간의 태반, HUVEC 및 TNFα처리된 HUVEC 추출물에서 총 스핀고신 키나제 활성은 각각 51, 78 및 136 U/단백질 ㎎이었다. 스핀고신 키나제 활성(?)은 0 내지 1M의 구배의NaCl()로 용리시켰다.

도 6은 HUVEC 유래의 스핀고신 키나제(SPHK)를 클로닝하는 데 사용되는 전략을 개략적으로 나타내는 도면이다.

도 7은 인간의 스핀고신 키나제의 뉴클레오타이드 서열(<400>1) 및 추론된 아미노산 서열(<400>2) 및 추정 도메인 구조를 개략적으로 나타내는 도면이다. A는 hSK의 c DNA 핵산 서열 및 추론의 아미노산 서열이다. 아미노산은 첫 번째 메티오닌 잔기에서부터 번호를 매긴다. 종료 코돈은 별표로 표시되어 있다. 스핀고신 키나제 코딩 영역은 대문자 (뉴클레오타이드 33-1187)로 표시된 부분이지만, 소문자로 표시된 영역은 번역되지 않은 벡터 서열을 의미한다. B는 추정 PKC 및 CKⅡ 인산화 자리의 위치, 가능한 N-미리스토일화 자리, 칼슘/카모듈린 결합 모티브 및 추정 DGK 촉매 도매인과 유사한 영역을 표시한 인간 스핀고신 키나제를 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 8은 HEK293 세포에서 인간 스핀고신 키나제 활성의 TNFα자극 및 발현을 그래프로 나타내는 도면이다. 빈(empty) pcDNA 발현 벡터 단독(A) 또는 인간 스핀고신 키나제 cDNA를 포함한 pcDNA(B)중 하나로 HEK293 세포를 순간 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포는 10분간 TNFα로 처리하거나 처리하지 않고, 수득한 후, 세포 용균물에서 스핀고신 키나제 활성을 측정하였다. 데이터는 2회 반복 평균치이고 3회의 독립적 실험의 대표치이다.

도 9는 인간의 스핀고신 키나제와 다른 공지되고 추정된 스핀고신 키나제의 서열을 비교하여 개략적으로 나타낸 도면이다. 추론의 인간 스핀고신 키나제 아미노산 서열을 쥐과의 스핀고신 키나제의 아미노산 서열(mSK1a 및 mSK1b; Kohamaet al., 1998) 및S.cereviaiae스핀고신 키나제의 아미노산 서열(LCB4 및 LCB5; Nagiecet al., 1998) 및S. pombe및C. elegans에서 얻은 추정의 스핀고신 키나제의 EST 서열(각각 Genbank™수탁번호 Z98762 및 Z66494)과 비교하였다. 인간 스핀고신 키나제의 아미노산 서열과 높은 유사성(36%, 동일성)을 보임에도 불구하고,A. thaliana추정의 스핀고신 키나제 서열(Genebank™수탁번호 AL022603)은 상대적으로 불량한 배열을 제공하고 명확성(clarity)을 보이지 않는다. 공통 서열은 7개의 배열된 서열의 적어도 6개가 보존되는 아미노산을 나타내는 것으로, 구조적으로 유사한 아미노산의 보존은 별표로 나타낸다. 다중 서열의 배열은 CLUSTALW로 실시하고 인간 스핀고신 키나제에 대한 동일성 백분율은 GAP 알고리즘(Needleman & Wunsch, 1970)을 이용하여 측정하였다.

도 10은E. coliBL21에서 재조합 인간의 스핀고신 키나제 발현의 이미지를 나타내는 도면이다.E. coliBL21은 pGEX4-2T 인간 스핀고신 키나제 발현 구조체에 의해 형질전환되고 100 μM IPTG로 유도한 후 GST-SK 융합 단백질의 발현을 분석하였다. A는 유도되지 않은 것과 IPTG로 유도된E. coliBL21 세포 추출물에서 스핀고신 키나제 활성이고, B는E. coli세포 용균물에서 GST-SK 융합 단백질 발현을 나타내는 Coomassie 염색된 SDS-PAGE 겔이다. C는 분리된 재조합 인간 스핀고신 키나제의 정제물이다. 스핀고신 키나제 활성을 함유하는 Mono-Q 컬럼에서 얻은 분획은 은 염색하여 SDS-PAGE에 적용하여 45kDa의 단일 밴드를 얻었다.

도 11은 재조합 인간 스핀고신 키나제의 정제물의 이미지를 나타내는 도면이다. 카모듈린 Sepharose 4B는 활성 및 불활성 효소를 분리시킨다. GST-SK 융합 단백질은 글루타티온-Sepharose 4B를 이용하여 부분적으로 정제하고, 트롬빈에 의해 분해시키고, 카모듈린-Sepharose 4B 컬럼에 4 mM CaCl₂를 함유한 버퍼 B 내로 적용하였다. 컬럼에 결합된 활성 스핀고신 키나제의 용리(↓)는 2 mM EGTA 및 1M NaCl을 함유한 버퍼 A로 실시하였다. A는 카모듈린-Sepharose 4B 컬럼으로부터 용리시킨 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타내고, B는 컬럼 분획에서 스핀고신 키나제 활성(｜)을 나타내는 것으로 대부분의 재조합 인간 스핀고신 키나제 단백질이 컬럼에 결합하지 않고 촉매의 활성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다.

도 12는 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 물리-화학적 특징을 그래프로 나타내는 도면이다. A는 최적의 pH를 나타낸다. SK 활성에 대한 pH의 작용은 50 mM 버퍼에서 4 내지 11의 pH 범위에 걸쳐(초산나트륨, pH 4.0-5.0; Mes, pH 6.0-7.0; Hepes, pH 7.0-8.2; Tris/HCl, pH 8.2-10.0; Caps, pH 10.0-11.0) 활성을 분석하여 측정하였다. B는 pH 안정성을 나타낸다. 도시된 데이터에서는 4℃에서 5시간 동안 다양한 pH에서 효소의 예비배양 후 SK 활성이 유지된다는 것이 나타난다. C는 열 안정성을 나타낸다. 다양한 온도(4 내지 80℃)에서 pH 7.4(10% 글리세롤, 0.5 M NaCl 및 0.05% Triton X-100을 함유한 50mM Tris/HCl)에서 30분간 효소의 예비배양 후 SK의 활성이 유지된다는 것을 보여준다. D는 금속 이온에 대한 필요성을 나타낸다. 다양한 금속 이온 또는 EDTA를 10mM의 최종 농도로 혼합물을 분석하는 데 적용하였다. 모든 경우에서, 천연(? 및 검은색 막대) 및 재조합(? 및 하얀색 막대) 스핀고신 키나제의 최대 활성은 대수적으로 임의로 100%로 설정되고 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다. 데이터는 평균±S.D.로 표현하였다.

도 13은 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 기질 특이성 및 키네틱을 나타내는 그래프이다. A는 천연(검은색 막대) 및 재조합(하얀색 막대) 스핀고신 키나제와 스핀고신 유사체 및 0.25% Triton X-100이 100μM이 보충된 기타 지질의 기질 특이성을 나타낸다. 천연 및 재조합 SK에 의한 스핀고신의 인산화 비율은 대수적으로 100%로 설정하고 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다. 다른 잠재적인 기질에 대한 활성은 스핀고신에 대한 활성에 대해 상대적으로 표현하였다. DL-threo-디하이드로스핀고신,N,N-디메틸스핀고신,N,N,N-트리메틸스핀고신,N-아세틸스핀고신(C₂-세라마이드), 디아실글리세롤(1,2-디옥타노일-sn-글리세롤 및 1,2-디올레오일-sn-글리세롤) 및 포스파티딜이노시톨에서 인산화는 관찰되지 않았다. B는 기질로 스핀고신(?) 및 D-erythro-디하이드로스핀고신(?)을 가진 재조합 인간 스핀고신 키나제의 기질 키네틱을 나타낸다. C는N,N,N-트리메틸스핀고신이 5 μM(?) 및 25 μM(?)인 경우 및N,N,N-트리메틸스핀고신(?)의 부재시의 재조합 인간 스핀고신 키나제가 억제되는 경우의 키네틱을 나타낸다. 삽입: Lineweaver-Bunk 플롯. 데이터는 평균 ±S.D.로 표현하였다.

도 14는 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성을 자극하는 산성 인지질을 그래프로 나타내는 도면이다. 이들 인지질이 Triton X-100 10 mol%으로 존재하는 표준 조건하에서 활성을 분석하여 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한다양한 인지질의 작용을 측정하였다. 인지질의 부재시 천연(검은색 막대) 및 재조합(하얀색 막대) 스핀고신 키나제의 활성은 100%로 설정하고 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다. PC, 포스파티딜콜린; PS, 포스파디틸세린; PE, 프로파디틸에탄올아민; PI 포스파티딜이노시톨; PA, 포스파티드산. 테이터는 평균 ±S.D.로 나타난다.

본 명세서에서는 프로그램 PatentIn Version 2.0을 이용하여 만들어진 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 정보를 참조 도서 목록 다음에 기재하였다. 각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 숫자 식별기호 <210> 다음에 서열 번호(예를 들면 <210>1, <210>2 등)를 넣어 서열 목록을 기재한다. 서열의 길이, 형태(DNA, 단백질(PRT) 등), 및 각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 공급처는 각각 숫자 식별기호 <211>, <212>, 및 <213>에 정보로 기재하였다. 본 명세서에서 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 숫자 식별기호 <400>에서 서열 번호(예를 들면 <400>1, <400>2 등) 다음에 나오는 자료로 기재되어 있다.

본 명세서 및 그 다음의 특허청구 범위에 걸쳐, 달리 정의하지 않으면, "포함"의 용어 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 어미 변환된 용어는 언급된 정수 또는 단계나 정수 또는 단계의 군을 내포하는 것을 의미하지만, 다른 정수 또는 단계나 정수 또는 단계의 군을 배제하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 하나의 특징은 새로운 스핀고신 키나제 단백질 또는 상기 스핀고신 키나제 단백질의 유도체 또는 모사체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 코딩하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 이의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

본 발명의 다른 특징은 인간의 스핀고신 키나제 단백질 또는 상기 스핀고신 키나제 단백질의 유도체 또는 모사체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 코딩하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 적어도 약 45% 이상의 유사성을 가지는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 낮은 극한 조건(low stringency condition)하에서 <400>1에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 낮은 극한 조건하에서 <400>1에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체 및, <400>2에 기재된 아미노산서열에 해당하는 아미노산 서열 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 약 45% 유사성을 가지는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 42℃에서 낮은 극한 조건하에서 <400>1 또는 그의 유도체에 혼성화할 수 있는 게놈 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>1에 기재된 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 cDNA 서열 또는 <400>1과 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>2에 기재된 아미노산 서열 또는 상기에 정의된 그의 유사체 또는 화학적 등가물 또는 모사체 또는 <400>2에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 내의 적어도 10개의 인접 아미노산과 적어도 약 45% 유사한 아미노산 서열을 가지는 유도체 또는 모사체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징은 다음에 기재된 것에서 선택된 분리된 단백질에 관한 것이다:

(ⅰ) 새로운 스핀고신 키나제 단백질 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체,

(ⅱ) 인간의 스핀고신 키나제 단백질 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체,

(ⅲ) <400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산과 적어도 약 45% 유사한 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체,

(ⅳ) <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 유사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산과 적어도 약 45% 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 상기 단백질의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 또는 모사체,

(ⅴ) <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 유사체를 낮은 극한 조건하에서 혼성화할 수 있는 핵산 분자 또는 <400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산과 적어도 약 45% 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질,

(ⅵ) (ⅰ) 또는 (ⅱ) 또는 (ⅲ) 또는 (ⅳ) 또는 (ⅴ)에 기재된 호모다이머(homodimeric) 형태의 단백질,

(ⅶ) (ⅰ) 또는 (ⅱ) 또는 (ⅲ) 또는 (ⅳ) 또는 (ⅴ)에 기재된 헤테로다이머(heterodimeric) 형태의 단백질.

본 발명의 다른 특징은 포유류에서 스핀고신 키나제의 활성을 변경시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 스핀고신 키나제 활성을 증가시키거나 또는 감소시키기에 충분한 시간 및 조건 하에서 유효량의 액제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 스핀고신 키나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하기에 충분하거나 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게스핀고신 키나제의 발현을 조절하기에 충분하거나 또는 스핀고신 키나제의 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조절에 의해 세포의 기능적 활성이 조절되는 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 세포 기능적 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 세포의 기능적 활성의 조절을 위한 약제의 제조에스핀고신 키나제의 발현 및 스핀고신 키나제의 활성을 조절할 수 있는 약제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 세포의 기능적 활성의 조절을 위한 약제의 제조에 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은스핀고신 키나제발현 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절하여 세포 기능적 활성을 조절하는 데 사용하기 위한 약제에 관한 것이다.

본 발며의 또 다른 특징은 세포의 기능적 활성을 조절하는 데 사용하기 위한 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제에 관한 것이다.

본 발명에 관하여, 치료를 받은 포유류는 치료 또는 예방 처치가 필요한 동물 또는 인간 일 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은스핀고신 키나제, 스핀고신 키나제, 또는스핀고신 키나제발현 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절할 수 있는 약제를 하나 이상의 약리학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제를 함께 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.스핀고신 키나제, 스핀고신 키나제 또는 상기 약제는 활성 성분으로 칭하여진다.

본 발명의 또 다른 특징은 대상에서 얻은 생물학적 샘플에서 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제mRNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플에 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제mRNA 또는 이의 유도체 또는 상동체에 특이적인 항체를 항체-스핀고신 키나제 또는 항체-스핀고신 키나제 mRNA 복합체를 형성하기에 충분한 시간 및 조건하에서 접촉시키는 단계 및 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 걸쳐 기재된 1글자 및 3글자 약어는 표 1에 정의되어 있다.

[표 1]

1글자 및 3글자 아미노산 약어

아미노산	3글자 약어	1글자 약어
알라닌	Ala	A
아르기닌	Arg	R
아스파라긴	Asn	N
아스파르트산	Asp	D
시스테인	Cys	C
글루타민	Gln	Q
글루탐산	Glu	E
글리신	Gly	G
히스티딘	His	H
이소류신	Ile	I
류신	Leu	L
리신	Lys	K
메티오닌	Met	M
페닐알라닌	Phe	F
프롤린	Pro	P
세린	Ser	S
트레오닌	The	T
트립토판	Trp	W
티로신	Tyr	Y
발린	Val	V
임의의 잔기	Xaa	X

본 발명은 부분적으로 새로운 스핀고신 키나제 분자의 정제 및 클로닝에서 창안된 것이다. 이 새로운 분자의 동정으로 예를 들면 신호 전달에서 사용하는 것과 같은 치료, 진단 및 항체 생성에 사용하기 위한 일련의 산물의 확인 및 이론적인 고안이 가능하게 되었다. 이들 치료학적 분자는 또한 스핀고신 키나제 작용의 길항제 또는 작용제로 작용할 수 있고 특히, 원하지 않는 세포 활성으로 특징되는 질병 상태의 치료에 있어 세포 활성의 조절에 유용할 것이다.

따라서, 본 발명의 하나의 특징은 새로운 스핀고신 키나제 단백질 또는 상기 스핀고신 키나제 단백질의 유도체 또는 모사체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 코딩하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

"스핀고신 키나제"라는 용어는 특히 스핀고신 키나제 신호 경로의 활성화 동안 스핀고신-1-포스페이트의 생산에 관여하는 분자를 칭하는 것으로 이해해야 할 것이다. 이태릭체의 "스핀고신 키나제"라는 용어는 스핀고신 키나제 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해해야 할 것이다. 이태릭체가 아닌 "스핀고신 키나제"라는 용어는 스핀고신 키나제 단백질 분자를 의미하는 것으로 이해해야 할 것이다.

특히, 본 발명은 스핀고신 키나제 단백질 또는 스핀고신 키나제 단백질의 유도체 또는 모사체를 코딩하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 <400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 적어도 약 45% 이상 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체를 제공한다.

"유사성(similarity)"이라는 용어는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 수준에서 서열을 비교한 경우 정확한 동일성(identity)을 포함하는 것으로, 뉴클레오타이드 수준에서 동일하지 않더라도 "유사성"은 구조적, 기능적, 생화학적 및/또는 (입체) 형태(conformation) 수준에서 서로 관련되어 있음에도 불구하고 다른 아미노산을 만드는 서열도 포함한다. 아미노산 수준에서 동일하지는 않지만, 또한 "유사성"은 구조적, 기능적, 생화학적 및/또는 형태 수준에서 서로 관련되어 있는 아미노산을 포함한다. 유사성의 백분율은 50% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 적어도 95% 이상이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 즉, 낮은 극한 조건하에서 <400>1에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체에 관한 것이다.

본 명세서에서 낮은 극한 조건은 적어도 약 0 부피% 내지 적어도 약 15 부피%의 포름아미드, 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M의 혼성화를 위한 염, 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M의 세척 상태를 위한 염을 포함한다. 이 밖의 극한 조건으로는 필요한 경우, 중간의 극한(medium stringency) 조건 또는 고도의 극한(high stringency) 조건이 적용될 수 있다. 중간의 극한 조건에는 적어도 약 16 부피% 내지 약 30 부피%의 포름아미드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M의 혼성화를 위한 염 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M의 세척 조건을 위한 염을 포함하고, 고도의 극한 조건은 적어도 약 31 부피% 내지 적어도 약 50 부피%의 포름아미드 및 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M의 혼성화를 위한 염, 및 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15M의 세척 조건을 위한 염을 포함한다. 극한 정도는 약 40℃ 내지 약 65℃와 같은 온도의 범주에서 측정될 것이다. 특히 유용한 극한 조건은 42℃이다. 일반적으로 세척은 T_m= 69.3 + 0.41(G+C)%[19] = -12℃에서 실시된다. 그러나 이중 가닥 DNA의 T_m은 짝짓지 않은 염기쌍의 개수에서 1% 증가함에 따라 1℃씩 감소한다(Bonneret al.(1973)J. Mol. Biol., 81:123).

바람직하게, 본 발명은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 낮은 극한 조건하에서 <400>1에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체 및, <400>2에 기재된 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 적어도 약 45% 유사한 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 <400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 특징에 따르는 핵산 분자는 인간스핀고신 키나제에 해당한다. 본 발명은 하나의 이론 또는 작용 형태로 제한되지 않지만, 스핀고신 키나제에 의해 코딩되는 단백질은 스핀고신 키나제 신호 경로의 기능에서 중요한 요소이다. 스핀고신 키나제는 제2의 메신저인 스핀고신-1-포스페이트의 생성을 용이하게 하고 다음에 의해 활성화될 수도 있다:

(a) 인산화 또는 단백질 가수분해에 의한 절단과 같은 번역후 변형

(b) 다이머화와 같은 단백질-단백질 상호작용 및 G 단백질-결합된 수용체에 의해 매개되는 상호작용

(c) 효소가 효소 활성을 증가시키거나 또는 기질 내로 유입되도록 하는 환경에 표적되는 경우의 전좌.

인간스핀고신 키나제핵산 분자의 발현 산물은 인간 스핀고신 키나제이다. 스핀고신 키나제는 <400>2에 기재된 아미노산 서열에 의해 정의된다. 스핀고신 키나제의 cDNA 서열은 <400>1에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 정의된다. 스핀고신 키나제를 코딩하는 핵산 분자는 cDNA 서열 또는 게놈 서열과 같은 데옥시리보핵산의 서열이 바람직하다. 게놈 서열은 엑손 또는 인트론을 포함할 수도 있다. 게놈 서열은 프로모터 영역 또는 다른 조절 영역을 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 42℃에서 낮은 극한 조건하에서 <400>1 또는 그의유도체에 혼성화할 수 있는 게놈 핵산 분자 또는 그의 유도체에 관한 것이다.

본 명세서에서 스핀고신 키나제 및스핀고신 키나제를 칭하는 경우에는 각각 모든 형태의 인간 스핀고신 키나제 및스핀고신 키나제를 의미하는 것으로, 예를 들면스핀고신 키나제mRNA, 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제의 돌연변이 또는 다형 변이체, 스핀고신 키나제의 번역후 변형된 형태 또는 스핀고신 키나제의 번역후 변형되지 않은 형태의 교대 슬라이싱(alternative slicing)에서 발생하는 임의의 펩타이드 또는 cDNA 이소폼을 포함한다. 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 스핀고신 키나제 및스핀고신 키나제에 대한 의미는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 및 모사체의 관련물을 포함한다.

단백질 및/또는 유전자는 인간에서 유래한 것이 바람직하다. 그러나 단백질 및/또는 유전자는 다른 동물 또는 비동물 종에서 분리될 수도 있다.

유도체는 융합 단백질을 포함하는 천연, 합성 또는 재조합 기원에서 얻은 단편, 일부, 부분, 돌연변이, 변이체 및 모사체를 포함한다. 일부 또는 단편은 예를 들면 스핀고신 키나제의 활성 영역을 포함한다. 유도체는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환으로부터 유도될 수도 있다. 아미노산 삽입의 유도체는 아미노 및/또는 카르복시 말단 융합 및 단일 또는 다중 아미노산의 서열내 삽입(intrasequence insertion)을 포함한다. 무작위적인 삽입도 얻어진 산물의 적합한 스크리닝에 의해 가능하지만 삽입 아미노산 서열 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 소정의 자리에 도입되는 것이다. 결실 변이체는 하나 이상의 아미노산을 서열로부터 제거하는 것에 특징이 있는 것이다. 치환 아미노산 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 이 자리에 삽입된 것이다. 치환 아미노산 변이체의 예로는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이 있다. 보존적 아미노산 치환은 통상 다음과 같은 군 내에서 이루어지는 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 아미노산 서열에 대한 첨가는 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과의 융합을 포함한다.

스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제의 화학적 및 기능적 등가물은 하나 이상의 기능적 활성을 보이는 분자로 이해해야 할 것이고, 천연 산물 스크리닝과 같은 스크리닝 처리에 의해 화학적으로 합성되거나 또는 동정된 것과 같은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다.

스핀고신 키나제의 유도체는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 다른 단백질 분자 또는 비단백질 분자에 융합된 전체 스핀고신 키나제 단백질의 특정 에피토프 또는 부분을 가지는 단편을 포함한다.

본 명세서에서 고려하고 있는 스핀고신 키나제의 유사체는 측쇄의 변형, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성 중에 천연이 아닌 아미노산 및/또는 이들의 유도체를 혼입하는 것, 및 가교제의 사용 및 기타 방법으로 단백질 분자 또는 이들의 유사체에 형태적 압박을 가하는 것을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.

핵산 서열의 유도체는 단일 또는 다중 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및/또는다른 핵산 분자와의 융합을 포함하는 부가에 의해 유사하게 유도될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 유도체로는 핵산 분자의 억제(cosuppression) 및 융합에 사용하기에 적합한 분자, 올리고뉴클레오타이드, PCR 프라이머, 안티센스 분자를 포함한다. 핵산 서열의 유도체로는 축퇴 변이체(degenerate variant)를 포함한다.

본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예로는 알데하이드와의 반응 후, NaBH₄로 환원시키는 환원성 알킬화; 메틸아세트이미드화에 의한 아미드화; 아세트산 무수물에 의한 아실화; 시아네이트에 의한 아미노산의 카바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)으로 아미노기의 트리니트로벤질화; 숙신산 무수물 및 테트라하이드로프탈산 무수물로 아미노기의 아실화; 및 피리독살-5-포스페이트에 의한 리신의 피로독실화와 이어서 NaBH₄에 의한 환원과 같은 아미노기의 변형을 포함한다.

아르기닌 잔기의 구아니딘기를 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 반응물과의 이종원자 고리 축합 산물의 형성에 의해 변형시킬 수 있다.

카르복시기를 O-아실이소우레아 형성을 통한 카보디이미드 활성화와 이어서 예를 들면 해당 아미드로 후속 유도체화에 의해 변형시킬 수 있다.

술피드릴기를 아이오도아세트산 또는 아이오도아세트아미드에 의해 카르복시메틸화; 시스테인산으로 퍼포름산 산화; 기타 티올 화합물로 혼합된 디술피드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 기타 치환된 말레이미드와 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐술폰산, 페닐머큐리 클로라이드, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 기타 수은제를 이용한 수은 유도체의 형성; 알칼리 pH에서 시아네이트로 카바모일화와 같은 방법으로 변형시킬 수 있다.

트립토판 잔기를 예를 들면 N-브로모숙신이미드에 의한 산화 또는 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 술페닐 할라이드에 의한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형시킬 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 고리를 아이오도아세트산 유도체에 의한 알킬화 또는 디에틸피로카보네이트에 의한 N-카보에톡시화에 의해 변형시킬 수 있다.

천연이 아닌 아미노산 및 유도체를 단백질의 합성 동안 혼입시킬 수 있는 방법은 예를 들면 노르류신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사코신, 4-아미노-3-하이드록시-5-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성체를 사용하는 것을 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 고려되는 천연이 아닌 아미노산의 목록은 표 2에 나타나 있다.

신규 아미노산	코드	신규 아미노산	코드
α-아미노부티르산	Abu	L-N-메틸알라닌	Nmala
α-아미노-α-메틸부티레이트	Mgabu	L-N-메틸아르기닌	Nmarg
아미노사이클로프로판-카르복실레이트	Cpro	L-N-메틸아스파라긴	Nmasn
아미노이소부티르산	Aib	L-N-메틸아스파르산	Nmasp
아미노노르보닐카르복실레이트	Norb	L-N-메틸시스테인	Nmcys
사이클로헥실알라닌		L-N-메틸글루타민	Nmgln
사이클로펜틸알라닌	Cpen	L-N-메틸글루탐산	NMglu
D-알라닌	Dal	Chexa L-N-메틸히스티딘	Nmhis
D-아르기닌	Darg	L-N-메틸이소류신	Nmile
D-아스파르트산	Dasp	L-N-메틸류신	Nmleu
D-시스테인	Dcys	L-N-메틸리신	Nmlys
D-글루타민	Dgln	L-N-메틸메티오닌	Nmmet
D-글루탐산	Dglu	L-N-메틸노르류신	Nmnle
D-히스티딘	Dhis	L-N-메틸노르발린	Nmnva
D-이소류신	Dile	L-N-메틸오르니틴	Nmorn
D-류신	Dleu	L-N-메틸페닐알라닌	Nmphe
D-리신	Dlys	L-N-메틸프롤린	Nmpro
D-메티오닌	Dmet	L-N-메틸세린	Nmser
D-오르니틴	Dorn	L-N-메틸트레오닌	Nmthr
D-페닐알라닌	Dphe	L-N-메틸트립토판	Nmtrp
D-프롤린	Dpro	L-N-메틸티로신	Nmtyr
D-세린	Dser	L-N-메틸발린	Nmval
D-트레오닌	Dthr	L-N-메틸에틸글리신	Nmetg
D-트립토판	Dtrp	L-N-메틸-t-부틸글리신	Nmtbug
D-티로신	Dtyr	L-노르류신	Nle
D-발린	Dval	L-노르발린	Nva
		α-메틸-아미노이소부티레이트	Maib
		α-메틸-γ-아미노부티레이트	Mgabu

D-α-메틸알라닌	Dmala	α-메틸사이클로헥실알라닌	Mchexa
D-α-메틸아르기닌	Dmarg	α-메틸사이클로펜틸알라닌	Mcpen
D-α-메틸아스파라긴	Dmasn	α-메틸-α-나프틸알라닌	Manap
D-α-메틸아스파르테이트	Dmasp	α-메틸페니실라민	Mpen
D-α-메틸시스테인	Dmcys	N-(4-아미노부틸)글리신	Nglu
D-α-메틸글루타민	Dmgln	N-(2-아미노에틸)글리신	Naeg
D-α-메틸히스티딘	Gmhis	N-(3-아미노프로필)글리신	Norn
D-α-메틸이소류신	Dmile	N-아미노-α-메틸부티레이트	Nmaabu
D-α-메틸류신	Dmleu	α-나프틸알라닌	Anap
D-α-메틸리신	Dmlys	N-벤질글리신	Nphe
D-α-메틸메티오닌	Dmmet	N-(2-카바밀에틸)글리신	Ngln
D-α-메틸오르니틴	Dmorn	N-(카바밀메틸)글리신	Nasn
D-α-메틸페닐알라닌	Dmphe	N-(2-카르복시에틸)글리신	Nglu
D-α-메틸프롤린	Dmpro	N-(카르복시메틸)글리신	Nasp
D-α-메틸세린	Dmser	N-사이클로부틸글리신	Ncbut
D-α-메틸트레오닌	Dmthr	N-사이클로헵틸글리신	Nchep
D-α-메틸트립토판	Dmtrp	N-사이클로헥실글리신	Nchex
D-α-메틸티로신	Dmty	N-사이클로데실글리신	Ncdec
D-α-메틸발린	Dmval	N-사이클로도데실글리신	Ncdod
D-N-메틸알라닌	Dnmala	N-사이클로옥틸글리신	Ncoct
D-N-메틸아르기닌	Dnmarg	N-사이클로프로필글리신	Ncpro
D-N-메틸아스파라긴	Dnmasn	N-사이클로운데실글리신	Ncund
D-N-메틸아스파르테이트	Dnmasp	N-(2,2-디페닐에틸)글리신	Nbhm
D-N-메틸시스테인	Dnmcys	N-(3,3-디페닐프로필)글리신	Nbhe
D-N-메틸글루타민	Dnmgln	N-(3-구아니디노프로필)글리신	Narg
D-N-메틸글루타메이트	Dnmglu	N-(1-하이드록시에틸)글리신	Nthr
D-N-메틸히스티딘	Gnmhis	N-(하이드록시에틸)글리신	Nser
D-N-메틸이소류신	Dnmile	N-(이미다졸일에틸)글리신	Nhis
D-N-메틸류신	Dnmleu	N-(3-인돌일리에틸)글리신	Nhtrp
D-N-메틸리신	Dnmlys	N-메틸-γ-아미노부티레이트	Nmgabu
N-메틸사이클로헥실알라닌	Nmchexa	D-N-메틸메티오닌	Dnmmet
D-N-메틸오르니틴	Dnmorn	N-메틸사이클로펜틸알라닌	Nmcpen
N-메틸글리신	Nala	D-N-메틸페닐알라닌	Dnmphe

종래의 아미노산이 아님	코드	종래의 아미노산이 아님	코드
N-메틸아미노이소부티레이트	Nmaib	D-N-메틸프롤린	Dnmpro
N-(1-메티프로필)글리신	Nile	D-N-메틸세린	Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신	Nleu	D-N-메틸트레오닌	Dnmthr
D-N-메틸트립토판	Dnmtrp	N-(1-메틸에틸)글리신	Nval
D-N-메틸트로신	Dnmtyr	N-메틸라-나프틸알라닌	Nmanap
D-N-메틸발린	Dnmval	N-메틸페니실라민	Nmpen
γ-아미노부티르산	Gabu	N-(p-하이드록시페닐)글리신	Nhtyr
L-t-부틸글리신	Tbug	N-(티오메틸)글리신	Ncys
L-에틸글리신	Etg	페니실라민	pen
L-호모페닐알라닌	Hphe	L-α-메틸알라닌	Mala
L-α-메틸아르기닌	Marg	L-α-메틸아스파라긴	Masn
L-α-메틸아스파르테이트	Masp	L-α-메틸-t-부틸글리신	Mtbug
L-α-메틸시스테인	Mcys	L-메틸에틸글리신	Metg
L-α-메틸글루타민	Mgln	L-α-메틸글루타메이트	Mglu
L-α-메틸히스티딘	Mhis	L-α-메틸호모페닐알라닌	Mhphe
L-α-메틸이소류신	Mile	N-(2-메틸티오에틸)글리신	Nmet
L-α-메틸류신	Mleu	L-α-메틸리신	Mlys
L-α-메틸메티오닌	Mmet	L-α-메틸노르류신	Mnle
L-α-메틸노르발린	Mnva	L-α-메틸오르니틴	Morn
L-α-메틸페닐알라닌	Mphe	L-α-메틸프롤린	Mpro
L-α-메틸세린	Mser	L-α-메틸트레오닌	Mthr
L-α-메틸트립토판	Mtrp	L-α-메틸티로신	Mtyr
L-α-메틸발린	Mval	L-N-메틸호모페닐알라닌	Nmhphe
L-(N-(2,2-디페닐에틸)카바밀메틸)글리신	Nnbhm	N-(N-(3,3-디페닐프로필)카바밀메틸)글리신	Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐-에틸아미노)사이클로프로판	Nmbc

가교제로서, 예를 들면 N-하이드록시숙신이미드와 같은 아미노-반응성 작용기 및 기타 기에 특이적인 반응성 작용기를 일반적으로 가진 헤테로-이작용성 반응물, (CH₂)_n스페이서 기(단, n=1 내지 n=6)를 가진 이작용성 이미도 에스테르와 같은 호모-이작용성 가교제, 글루타르알데하이드, 및 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 사용하여 3D 형태를 안정화하는 데 사용할 수도 있다.

본 발명의 핵산 분자는 분리된 형태이거나 또는 발현 벡터와 같은 벡터에 결찰되어 있는 것이 바람직하다. "분리"라는 용어는 적어도 1회의 정제 단계를 실시한 핵산 분자를 의미하는 것으로, 통상적으로 정의된 바와 같이 예를 들면 분자량,코딩 활성, 뉴클레오타이드 서열, 염기 조성 또는 기타 용이한 수단에 의해 결정하는 경우 다른 성분에 대해 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40-50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60-70%, 더욱 더 바람직하게는 80-90% 이상의 대상 핵산 분자를 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자는 바람직한 실시예에서 생물학적으로 순수한 것으로 고려할 수 있다.

"단백질"이라는 용어는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포괄하는 것으로 이해해야 할 것이다. 단백질은 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있고/있거나 아미노산, 지질, 탄수화물, 또는 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 같이 단백질에 융합되거나, 결합되거나, 연결되거나, 또는 회합되는 범주의 기타 분자를 포함할 수도 있다. 이하에서 "단백질"의 용어가 의미하는 것은 아미노산, 지질, 탄수화물, 또는 다른 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질과 같은 기타 분자와 관련된 단백질 및 아미노산의 서열을 포함하는 단백질을 포함한다.

특히 바람직한 실시예에서,스핀고신 키나제에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 <400>1에 기재된 뉴클레오타이드의 서열, <400>1과 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 그의 유도체 및 유사체를 포함하는 cDNA 서열이다.

본 발명의 핵산 분자의 유도체는 낮은 극한 조건하에서 <400>1에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 포함할 수도 있다. 낮은 극한조건은 42℃가 바람직하다.

핵산 분자는 원핵세포(예를 들면E. coli) 또는 진핵세포(예를 들면 효모 세포, 곰팡이 세포, 곤충 세포, 포유류의 세포 또는 식물 세포)에서 발현시킬 수 있는 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다. 핵산 분자는 예를 들면 신호 펩타이드와 같은 또 다른 성분을 코딩하는 핵산 분자와 결찰, 융합, 또는 회합될 수도 있다. 3' 및 5' 말단 부위 중 하나 또는 3' 또는 5' 말단 부위 모두에서 융합, 연결 또는 회합된 추가의 뉴클레오타이드 서열 정보를 포함할 수도 있다. 핵산 분자는 발현 벡터와 같은 벡터의 일부가 될 수도 있다. 후자의 실시예는 본 발명에서 포함하는 형태인 스핀고신 키나제의 재조합 형태의 생산을 용이하게 한다.

본 발명은 이전에 정의된 바와 같은 핵산 분자의 발현 산물을 포함한다.

발현 산물은 <400>2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 스핀고신 키나제 또는 상기에 정의된 그의 유도체, 유사체 또는 화학적 등가물 또는 모사체 또는 <400>2에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 내의 적어도 10개의 인접 아미노산과 적어도 약 45% 유사한 아미노산 서열을 가지는 유도체 또는 모사체를 가지는 스핀고신 키나제이다.

본 발명의 또 다른 특징은 다음에 기재된 것에서 선택된 분리되는 단백질에 관한 것이다:

(ⅵ) (ⅰ) 또는 (ⅱ) 또는 (ⅲ) 또는 (ⅳ) 또는 (ⅴ)에 기재된 호모다이머 형태의 단백질,

(ⅶ) (ⅰ) 또는 (ⅱ) 또는 (ⅲ) 또는 (ⅳ) 또는 (ⅴ)에 기재된 헤테로다이머 형태의 단백질.

본 발명의 단백질은 분리된 형태가 바람직하다. "분리"라는 용어는 적어도 1회의 정제 단계를 실시한 단백질을 의미하는 것으로, 종래에 정의된 바와 같이 예를 들면 분자량, 아미노산 서열, 기타 종래의 수단에 의해 결정하는 경우 다른 성분에 대해 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도약 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 40-50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60-70%, 더욱 더 바람직하게는 80-90% 이상의 대상 단백질 분자를 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자는 바람직한 실시예에서 생물학적으로 순수한 것으로 고려할 수 있다.

본 발명의 스핀고신 키나제는 2개 이상의 분자가 서로 회합된 것을 의미하는 멀티머 형태(multimeric form)일 수도 있다. 동일한 스핀고신 키나제 분자가 서로 회합된 경우, 혼합물은 호모멀티머이다. 호모멀티머의 예로는 호모다이머가 있다. 적어도 하나의 스핀고신 키나제가 적어도 하나의 스핀고신 키나제가 아닌 분자와 회합되는 경우, 혼합물은 헤테로다이머와 같은 헤테로멀티머이다.

재조합 스핀고신 키나제를 생산하는 능력으로 광범위한 상업용 스핀고신 키나제의 생산을 가능하게 한다. 스핀고신 키나제는 대형 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 일부를 그 자체로 또는 우선 외부 단백질의 서열을 제거하한 후 처리하여 생산할 수 있다. 이러한 처리로는 프로테아제, 펩티다제 및 아미다제 또는 화학, 전기화학, 초음파, 또는 기계적 분열법으로 분리하는 것을 포함한다.

본 발명은 재조합 단백질을 포괄하지만, 화학적 합성법은 스핀고신 키나제의 합성에서도 바람직하다.

본 발명에 따르는 스핀고신 키나제는 인간으로부터 분리된 분자에 기준하여 종래의 방법에 따라 합성된다. 인간 분자의 분리는 크로마토그래피 분리, 예를 들면 CM-셀룰로즈 이온 교환 크로마토그래피, 이후, Sephadex(예를 들면 G-50 컬럼) 여과를 실시하는 것과 같은 적합한 수단으로 실시할 수 있다. 여러 가지 중에서HPLC, PAGE를 포함하는 수많은 다른 기술도 가능하다.

스핀고신 키나제는 Carpinoet al.(1991)에 기재된 F-moc 화학을 이용한 고상 합성에 의해 합성될 수 있다. 스핀고신 키나제 및 그의 단편은 이외에 Stewartet al.(1985)에 기재된 t-Boc 화학을 포함하는 대체 화학 또는 액상 펩티드 합성의 전통적인 방법에 의해 합성할 수도 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 이론, 형태 또는 작용을 제한하지 않고, 스핀고신 키나제는 스핀고신 키나제 신호 경로의 활성에서 중요한 조절 효소이다. "스핀고신 키나제 신호 경로"라는 용어는 스핀고신 키나제 및/또는 스핀고신-1-포스페이트 중 하나 또는 양자를 활용하는 신호 경로를 의미한다. 부착 분자 발현을 유발하는 스핀고신 키나제 신호 경로 캐스캐이드(cascade)는 다음의 형태를 취할 것으로 생각된다:

(ⅰ)S. Mase활성을 통해 스핀고마이엘린으로부터 세라마이드 생산, 상기 세라마이드는 스핀고신으로 전환됨;

(ⅱ) 스핀고신 키나제의 자극에 의해 스핀고신-1-포스페이트(이하, "Sph-1-P"로도 칭해짐) 생성; 및

(ⅲ) Sph-1-P 생선으로부터 NF-κB 하류의 핵 전좌 및 MEK/ERK의 활성화.

스핀고신 키나제 신호 경로는 염증, 세포자멸, 및 세포증식을 초래하는 것과 같은 세포 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 사이토킨, 케모킨, eNOS 및 부착분자 발현의 상향조절과 같은 염증 매개인자의 생산의 상향 조절을 예로 들 수 있다. 상기 상향 조절은 예를 들면 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 인터루킨-1(IL-1)과 같은 염증성 사이토킨, 엔도톡신, 산화 또는 변성 지질, 광조사 또는 조직의 손상을 포함하는 다수의 자극에 의해 유도될 수도 있다.

이 유전자와 이의 발현 산물의 클로닝 및 서열분석에 의해 원하지 않는 세포 활성을 특징으로 하는 질병의 예방 및 치료 처치에 사용하기 위한 부가적인 분자를 제공한다. 상기 활성은 스핀고신 키나제 신호 경로의 활성을 통해 직접 또는 간접적으로 조정된다. 원하지 않는 스핀고신 키나제 조절된 세포 활성에 관여하는 질병의 예로는 류마티스성 관절염, 천식, 동맥경화, 수막염, 다중 경화성 및 패혈성 쇼크를 포함한다. 따라서, 본 발명은 스핀고신 키나제 작용제 및 길항제 외에 예를 들면 염증의 조절과 같은 세포 기능 활성의 조절을 위한 스핀고신 키나제 아미노산 및 핵산 분자의 치료학적 및 예방학적 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 대상에서스핀고신 키나제의 발현을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은스핀고신 키나제의 발현을 상향 조절하거나 하향 조절하거나 또는 달리 조절하기에 충분한 시간과 조건하에서 유효량의 약제를스핀고신 키나제유전자에 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드와 같은스핀고신 키나제안티센스 서열은 세포의 하나 이상의 특이적 기능 활성을 하향 조절하기 위해 그 세포에 도입될 수 있다. 반대로, 스핀고신 키나제 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산 분자는 내인성스핀고신 키나제유전자를 발현시키지 않는 임의의 세포의 하나 이상의 특이적 기능 활성을 상향 조절하기 위해 도입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류에서 스핀고신 키나제의 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 스핀고신 키나제 활성을 증가시키거나 감소시키기에 충분한 시간과 조건하에서 조절 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함한다.

포유류에게 약제를 투여하여 상기 활성을 조절하는 것은 상기 포유류에게 다음과 같은 작용을 하는 단백질 또는 비단백질 분자를 도입하는 것을 포함하는 비제한적인 방법 중 하나에 의해 달성할 수 있다:

(ⅰ)스핀고신 키나제의 발현 조절;

(ⅱ) 스핀고신 키나제의 길항제로서 기능;

(ⅲ) 스핀고신 키나제의 작용제로서 기능.

상기 단백질성 분자는 융합 단백질 또는 다음에 예를 들면 천연 산물 스크리닝체를 포함하는 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 비단백질의 분자는 예를 들면 핵산 분자이거나, 예를 들면 천연 산물 스크리닝체와 같은 천연 공급원으로부터 유래되거나 또는 화학적으로 합성될 수도 있다. 본 발명은 스핀고신 키나제의 작용자 또는 길항제로 작용할 수 있는 작은 분자 또는 스핀고신 키나제의 화학적 유사체에 관한 것이다. 화학적 작용제는 스핀고신 키나제로부터 유래되지 않아도 되지만 일정한 형태적 유사성을 가지고 있어야 한다. 또한, 화학적 작용제는 스핀고신 키나제의 특정 생리화학적 특성을 모사하기 위해 특이적으로 설정될 수 있다. 길항제는 스핀고신 키나제가 통상의 생물학적 기능의 실현을 방지, 억제, 또는 막을 수 있는 임의의 화합물일 것이다. 길항제로는 스핀고신 키나제 또는 스핀고신 키나제 일부에 특이적인 단일 클론성 항체 및 포유류의 세포에서스핀고신 키나제유전자 또는 mRNA의 전사 또는 번역을 방지하는 안티센스 핵산을 포함한다.스핀고신 키나제발현의 조절은 항원, RNA, 리보솜, DNA자임, RNA 압타머(aptamer) 또는 항체일 수도 있다.

상기 단백질성 또는 비단백질성 분자는 직접 또는 간접적으로스핀고신 키나제의 발현 또는 스핀고신 키나제의 활성을 조절한다. 상기 분자는스핀고신 키나제또는 스핀고신 키나제와 회합하는 경우스핀고신 키나제또는 스핀고신 키나제의 발현 또는 활성을 직접적으로 조절한다. 따라서, 본 발명의 방법은스핀고신 키나제또는 스핀고신 키나제 발현 또는 활성의 조절을 유도하는 일련의 조절 단계의 유도로스핀고신 키나제또는 스핀고신 키나제 발현 또는 활성의 조절에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 유효량의 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제를 투여하는 단계를 포함한다.

사용되는 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제또는 약제는 표적 세포로 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제또는 약제를 특이적으로 전달하는 모노클로날 항체와 같은 표적화 수단에 연결될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 이 방법에 사용된 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제또는 약제는 상기 표적 세포에 특이적인 항체에 연결하여 이들 세포로 특이적인 운반이 가능하도록 한다.

"세포 기능 활성의 조절(modulating cellular functional activity)"라는 용어는 세포가 예를 들면 하나 이상의 케모킨 산물, 키토킨 산물, 산화질소 합성효소, 부착 분자 발현 및 기타 염증 조절인자의 생산과 같은 것을 실시할 수 있는 하나 이상의 활성을 상향 조절, 하향 조절 또는 변경시키는 것을 의미한다.

제약학적 조성물의 형태에서 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제,또는 약제의 투여는 종래의 수단에 의해 실시할 수 있다. 제약학적 조성물에서 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제또는 약제는 특정 경우에 따라 결정되는 함량으로 투여하는 경우 치료 활성을 보여주는 것으로 고려된다. 변수는 예를 들면 인간 또는 동물 및 선택된 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제, 또는 약제에 따라 변경된다. 광범위한 함량이 적용 가능하다. 환자에 따라 예를 들면 1일 체중 1 킬로그램당 약 0.1 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 스핀고신 키나제 또는 약제를 투여할 수도 있다. 투약량은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정할 수 있다. 예를 들면 수회로 나눈 투여량을 매일, 주마다, 달마다, 또는 적당한 시간의 간격으로 투여하거나, 투여는 상황의 위급에 따라 비례적으로 감소시킬 수도 있다. 스핀고신 키나제 또는 약제는 경구, 정맥내(수용성인 경우), 비강내, 복막내, 근육내, 피하, 피부내, 또는 좌약의 경로 또는 이식(예를 들면 서방성 분자 사용)과 같은 종래의 방법으로 투여할 수도 있다. 스핀고신 키나제 또는 약제의 사용에 있어서, 이들 펩타이드는 산 부가염 또는 예를 들면 아연, 철 등에 의한 금속 착물(이 용도의 목적에 맞는 염)과같은 제약학적으로 수용가능한 비독성 염의 형태로 투여할 수도 있다. 이러한 산 부가염으로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 말레이트, 아스코르베이트, 타르트레이트 등을 예로 들 수 있다. 활성 성분을 정제 형태로 투여하고자 하는 경우, 정제는 트라가칸트, 콘 스타치 또는 젤라틴과 같은 바인더; 일긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 특징은 포유류 질병 상태에 관련하여 본 발명의 약제를 사용하는 용도에 관한 것이다. 예를 들면 본 발명은 염증성 질병에 특히 유용하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 다른 특징은 포유류를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 포유류에게스핀고신 키나제의 발현을 조절하기에 충분하거나 또는 스핀고신 키나제의 활성을 조절하기에 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조절에 의해 세포의 기능적 활성이 조절되는 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 포유류를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 상기 포유류에게 세포 기능적 활성을 조정하기에 충분한 시간 및 조건하에서 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 세포의 기능적 활성의 조절을 위한 약제의 제조에스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은스핀고신 키나제발현 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절하여 세포의 기능적 활성을 조절하는 데 사용하기 위한 약제에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 세포의 기능적 활성을 조절하는 데 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명에 관하여, 치료를 받은 포유류는 치료 또는 예방 처치가 필요한 동물 또는 인간일 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은스핀고신 키나제, 스핀고신 키나제, 또는스핀고신 키나제발현 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절할 수 있는 약제를 하나 이상의 약리학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.스핀고신 키나제, 스핀고신 키나제 또는 상기 약제는 활성 성분으로 칭하여진다.

주사용도에 적합한 제약학적 형태로는 멸균 수용액(수용성인 경우) 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제형용 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에서, 형태는 멸균되어야 하고, 용이하게 실린지에서 빠져나갈 정도로 유동성이 있어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 저장성이 있어야만 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이들의 혼합물, 및 식물성 오일과 같은 용매 또는 분산매일 수 있다. 리시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지키거나 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 터메로살(thirmerosal) 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 미생물의 작용을 방지시킬 수가 있다. 많은 경우에서, 예를 들면 설탕 또는 염화나트륨과 같은 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제 조성물을 사용하여 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기에서 언급한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입하고 이어서 여과에 의한 살균을 행하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본적인 분산매 및 상기에서 언급된 기타 필요 성분을 포함하는 멸균 비히클 내로 혼입하여 분산액이 제조된다. 멸균 주사액의 제조용 멸균 분말의 경우, 제조의 바람직한 방법은 진공 건조 및 동결 건조법으로, 이전의 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 부가적인 소망의 성분의 분말을 생산하게 된다.

스핀고신 키나제, 스핀고신 키나제 및 스핀고신 키나제 조절인자가 적절하게 보호된다면, 이들은 예를 들면 불활성 희석제와 함께 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 함께 경구로 투여할 수도 있고 또는 경질 또는 연질의 쉘 젤라틴 캡슐로 포장되거나 또는 정제로 압축되거나 또는 식이 식품에 직접 혼입할 수도 있다. 경구 치료용의 치료 투여에서는 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되거나 소화가능한 정제, 볼의 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 와이퍼 등의 형태로 사용될 수도 있다. 이러한 조성물 및 제형은 적어도 1 중량% 이상의 활성 화합물을 함유하여야 한다. 조성물 및 제형의 백분율은 물론 변경될 수 있는 것이고, 보편적으로 단위량의 약 5 내지 약 80 중량%가 될 수도 있다. 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 성분의 함량은 적합한 투여량이 얻어질 수 있도록 하는 양이다. 본 발명에 따르는 바람직한 조성물 또는 제형은 경구 투여 단위체가 약 0.1 ㎍ 내지 2000 ㎎의 활성 성분을 함유하도록 제조된다.

정제, 트로키, 필, 캡슐 등은 다음과 같은 성분을 함유할 수도 있다: 검 트라가간트, 아카시아, 콘 스타치 또는 젤라틴과 같은 바인더; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 슈크로즈, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미료와 페파민트, 윈터그린 오일, 체리 향미와 같은 향미제가 추가될 수도 있다. 투여 단위체가 캡슐인 경우, 상기 형태의 물질 외에도 액상 담체를 포함할 수도 있다. 다양한 다른 물질은 코팅 형태로 존재하거나 또는 투여 단위의 물질적 형태를 변경시킬 수도 있다. 예를 들면 정제, 환약, 또는 캡슐을 셀락, 슈가 또는 이들 모두로 피복시킬 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미료로 슈크로즈, 방부제로 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 감미료로 체리 및 오렌지 향미제를 포함할 수도 있다. 물론, 임의의 투여 단위체를 제조하는 데 사용되는 모든 물질은 제약학적으로 정제된 것으로 사용된 함량에서 실질적으로 무독성이여야만 한다. 또한, 활성 화합물 방출이 지연되는 제형 또는 제제 내로 혼입되어야 한다.

제약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제는 임의의 모든 용매, 분산매,코팅, 살균제 및 살진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 상기 제약학적 활성 성분용 상기 매질 및 제제의 사용은 본 기술 분야에 잘 공지된 것이다. 종래의 매질 또는 약제가 활성 성분과 혼성할 수 없는 경우를 제외하고, 치료학적 조성물에서 이것을 사용하는 용도가 고려된다. 보조적인 활성 성분을 이 조성물에 혼입시킬 수도 있다.

투여의 용이성 및 투여의 균일성 때문에 투여 단위체를 비경구 조성물로 제조하는 것이 특히 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 투여 단위체는 치료하고자 하는 포유류 대상에 단일 투여로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것으로, 각기 단위는 필요한 제약학적 담체와 관련된 소망의 치료학적 효과를 생산하는 것으로 산출된 활성 물질의 소정량을 함유한다. 본 발명의 새로운 투여 단위체에 대한 상세한 내용은 (a) 활성 물질의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 효과, 및 (b) 신체의 건강이 손상되는 질병 상태를 가진 생체에서 질병의 치료용 활성 물질을 화합하는 기술 분야에서 본질적인 제한에 의해 결정되고 직접적으로 변경된다.

주된 활성 성분은 이전에 기재된 바와 같은 적합한 제약학적으로 수용가능한 담체의 유효량을 투여 단위체 형태로 용이하고 효과적으로 투여하기 위해 화합된다. 투여 단위체는 예를 들면 0.5 ㎍ 내지 약 2000㎎의 함량으로 주된 활성 화합물을 포함할 수 있다. 비율로 표현하면, 활성 화합물은 담체 ㎖당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2000 ㎎으로 존재한다. 보충 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 투여 방식 및 통상 투여량에 따라 결정된다.

제약학적 조성물은 벡터가스핀고신 키나제를 발현시킬 수 있거나,스핀고신 키나제발현 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절할 수 있는 핵산 분자를 운반하는 경우 표적 세포를 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터와 같은 유전학적 분자를 포함할 수도 있다. 벡터는 예를 들면 박테리아 벡터일 수도 있다.

스핀고신 키나제는 세포 또는 동물에서 유전자 넉아웃 모델을 형성시키는 데 활용될 수도 있다. 넉아웃된 유전자는 상기 세포 또는 동물에 의해 발현된 스핀고신 키나제 유전자이다. 따라서 다른 면에서는 스핀고신 키나제 유전자 세포 또는 동물 넉아웃 모델을 제작하는 방법 및 그 방법으로 생산된 넉아웃 모델로까지 본 발명의 범주가 확장되는 것으로 이해해야 할 것이다. 여기서, 스핀고신 키나제는 상기 세포 또는 동물의 내인성 스핀고신 키나제 유전자의 넉아웃을 용이하게 하는 데 활용되는 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 촉매 항체를 포함하는 스핀고신 키나제에 대한 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 단일 클론성 또는 다중 클론성이고 스핀고신 키나제에 대해 천연적으로 발생하는 항체로부터 선택되거나 또는 스핀고신 키나제에 대해 특이적으로 발생하는 것일 수 있다. 후자의 경우, 스핀고신 키나제는 우선 담체 분자와 회합시켜야 할 필요가 있다. 본 발명의 항체 및/또는 재조합 스핀고신 키나제는 치료제 및 진단제로서 특히 유용한 것이다.

또는, 항체의 단편은 Fab 단편과 같이 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명은 재조합 및 합성 항체 및 항체 혼성체로 연장된다. "합성 항체"는 본 명세서에서 단편 및 항체 혼성체를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명의 특징의 항체는 면역치료에 특히 유용하고 예를 들면 치료과정의 프로그램을 모니터링하기 위한 진단 수단으로 사용할 수도 있다.

예를 들면 스핀고신 키나제는 스핀고신 키나제에 대해 천연적으로 발생하는 항체를 스크리닝하는 데 사용할 수도 있다. 예를 들면 일부 염증 이상증에서도 일어날 수도 있다.

예를 들면 스핀고신 키나제 단백질을 스크리닝하는 데 특이적인 항체를 사용할 수도 있다. 후자는 예를 들면 세포 추출물 또는 기타 생물학적 유체에서 스핀고신 키나제의 수준을 스크리닝하거나 또는 배양 상층액으로부터 재조합 수단에 의해 제조되는 스핀고신 키나제의 정제 수단으로 중요할 것이다. 본 명세서에서 고려되는 분석을 위한 기술은 본 기술 분야에 공지된 것으로, 예를 들면 샌드위치 분석, ELISA 및 유동 세포계수를 포함한다.

본 발명의 범주 내에서는 상기 논의된 제1 항체에 대한 제2 항체(단일 클론성, 다중 클론성, 또는 항체의 단편)를 포함한다. 제1 및 제2 항체 모두는 검출 분석에 사용할 수 있거나 제1 항체는 시판되고 있는 항면역글로불린 항체로 사용할 수 있다. 본 명세서에서 고려되고 있는 항체로는 스핀고신 키나제의 임의의 영역에 특이적인 모든 항체를 포함한다.

다중 클론성 및 단일 클론성 항체 모두는 단백질 또는 펩타이드 유도체로 면역화함으로써 얻을 수 있고, 어떠한 유형이든 면역 분석을 위해 활용할 수 있다. 두가지 유형의 혈청을 얻는 방법은 본 기술 분야에서 잘 공지되어 있다. 폴리글로날 혈청은 덜 바람직하지만, 스핀고신 키나제 또는 그의 항원 부분의 유효량을 적합한 실험 동물에 주사하고, 동물로부터 혈청을 수집하고, 공지된 면역흡착 방법 중 하나로 특이한 혈청을 분리함으로써 상대적으로 용이하게 제조할 수 있다. 이 방법으로 제조된 항체는 사실상 모든 종류의 면역분석 유형에서 활용할 수 있지만, 일반적으로 산물이 잠재적으로 이질성분이 생성될 가능성이 있기 때문에 덜 바람직하다.

면역분석에서 단일 클론성 항체의 사용은 산물을 대량 생산할 수 있고 균질하게 생산할 수 있는 능력 때문에 특히 바람직하다. 영구 세포주와 면역원 제제에 대해 감작된 임파구를 융합하여 유도된 단일 클론성 항체 생산을 위한 하이브리도마 세포주의 제조는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 실시할 수 있다(예를 들면 Douillard and Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, inCompendium of ImmunologyVol II, ed. by Schwartz, 1981; Kohler and Milstein,Nature 256: 495-499, 1975;European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976 참조).

본 발명의 다른 특징에서, 본 발명의 분자는 또한 스핀고신 키나제에 의해 조절되는 이상의 진단과 같은 용도에 사용하기 위한 표적물을 스크리닝하는 것과 같은 데 유용하다.

본 발명의 또 다른 특징은 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제mRNA를 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플에서 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플에 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제mRNA 또는 이의 유도체 또는 상동체에 특이적인 항체를 항체-스핀고신 키나제 또는 항체-스핀고신 키나제 mRNA 복합체를 형성하기에 충분한 시간 및 조건하에서 접촉시키는 단계 및 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

스핀고신 키나제의 존재는 웨스턴 블로팅, ELISA 또는 유동 세포계수법과 같은 다수의 방법으로 검출할 수 있다. 스핀고신 키나제 mRNA는 예를 들면in situ혼성화 또는 노던 블로팅에 의해 검출할 수 있다. 물론 비경쟁적인 유형 뿐 아니라 전통적인 경쟁적인 결합 분석의 단일 자리 및 이중 자리 또는 "샌드위치(sandwich)" 분석을 포함한다. 이들 분석은 또한 표적에 라벨링된 항체의 직접 결합을 포함한다.

샌드위치 분석이 가장 유용하고 통상적으로 사용되는 분석이고, 본 발명에서 사용하기에 알맞은 것이다. 다수의 샌드위치 분석법의 변형된 방법이 존재하고, 이들 모두는 본 발명에 포함되는 것으로 고려되는 것이다. 간략하면, 통상의 전향 분석에서, 라벨링되지 않은 항체는 고체 기질 상에 고정되고 테스트하고자 하는 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적절한 기간동안 배양한 후에, 항체-항원 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 동안, 항원에 특이적인 제2 항체를 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 리포터 분자로 라벨링하고 이것을 첨가하고 항체-항원 라벨링된 항체의 다른 복합체의 형성에 충분한 시간 동안 배양한다. 임의의 미반응 물질을 세척한 후 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생산된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 정성적이거나, 가시적인 신호의 단순한 관찰에 의한 것이거나 또는 기지의 함량의 합텐을 함유하는 대조군의 샘플과 비교하여 정량할 수도 있다. 전향 분석에 대한 변형은 샘플과 라벨링된 항체 모두가 결합된 항체에 동시에 첨가되는 동시 분석(simultaneous assay)을 포함한다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려진 것으로, 용이하게 알 수 있는 사소한 변형도 포함한다. 본 발명에 따르면, 이 샘플은 세포 추출물, 조직 생검물, 또는 가능한 혈청, 타액, 점막 분비물, 림프액, 조직액 및 호흡기의 유체를 포함한다. 따라서 이 샘플은 일반적으로 생물학적 유체를 포함하는 생물학적 샘플이지만 세포 배양물에서와 같은 발효액 및 상층액으로도 확장된다.

통상적인 전향 샌드위치 분석에서, 스핀고신 키나제 또는 그의 항원부에 대해 특이적인 제1 항체는 고체 표면에 공유결합 또는 수동으로 결합되어 있다. 고체의 표면은 통상 유리 또는 폴리머로, 가장 흔하게 사용되는 폴리머는 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나이론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이 있다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 미소 평판 디스크 또는 기타 면역분석을 실시하기에 적합한 다른 형태가 가능하다. 결합 공정은 본 기술 분야에서 공지되어 있는 것으로 일반적으로, 가교 결합, 공유결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 폴리머-항체 복합체를 테스트 샘플의 제조를 위해 세척한다. 이후 테스트하고자 하는 샘플의 일부를 고상 복합체에 첨가하고 항체에 존재하는 서브유닛을 결합시키기에 충분한 시간(예를 들면 2-40분) 및 적합한 조건(예를 들면 25℃)에서 배양한다. 배양 기간 후, 항체 서브유닛 고상을 세척하고 건조하고 합텐부에 대해 특이적인 제2 항체와 함께 배양한다. 제2 항체는 합텐에 제2 항체를 결합하는 것을 지시하기 위해 사용되는 리포터 분자에 연결된다.

대안의 방법으로는 생물학적 샘플에 표적 분자를 부동화하는 단계; 및 리포터 분자로 라벨링하거나 하지 않은 특이 항체에 부동화된 표적을 노출시키는 단계를 포함한다. 표적의 함량 및 리포터 분자 시그널의 강도에 따라, 결합된 표적을 항체로 직접 라벨링함으로써 검출할 수도 있다. 또한, 제1 항체에 특이적인 제2의 라벨링된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜 표적-제1 항체-제2 항체 3가지 복합체를 형성한다. 이 복합체는 리포터 분자에 의해 발산된 신호에 의해 검출된다.

본 명세서에서 사용된 바에 의하면 "리포터 분자(reporter molecule)"는 화학적 상태에 따라 분석학적으로 확인할 수 있는 신호를 제공하여 항원-결합 항체의 검출을 가능하게 하는 분자를 의미한다. 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 이러한 유형의 분석에서 가장 흔하게 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성 핵종 함유 분자(즉, 방사성 동위 원소) 및 화학발광(chemilyminescent) 분자 중 하나이다.

효소 면역분석의 경우, 효소는 일반적으로 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트에 의해 제2 항체에 접합된다. 그러나 쉽게 인식할 수 있는 광범위한 다른 접합 기술이 존재하여 당업자들이 손쉽게 활용하고 있다. 통상적으로 사용되는 효소에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 해당 효소의 가수분해에 의해 탐지가능한 색상의 변화를 이룰 수 있도록 선택된다. 적합한 효소의 예로는 알칼리 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기 기재된 발색 기질보다는 형광 산물을 생산하는 형광발생 기질을 사용하는 것도 가능하다. 모든 경우에서, 효소-라벨링된 항체를 제1 항체 합텐 복합체에 첨가하여 결합하도록 한 후, 과잉의시약을 세척해 낸다. 이후 적합한 기질을 포함하는 용액을 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질을 제2 항체에 연결된 효소와 반응시켜 정성적인 가시적 신호를 제공하고, 추가로 일반적으로 분광분석에 의해 정량화하여 샘플 내에 존재하는 합텐의 함량을 표시하였다. "리포터 분자"는 또한 락텍스 비드 상에 적혈구와 같은 세포 유착(cell agglutination) 또는 세포 유착의 방지에 사용하는 용도까지 확장된다.

또한, 형광체 및 로다민과 같은 형광 화합물은 결합능의 변경없이도 항체에 화학적으로 결합될 수도 있다. 특정 파장의 광선으로 조사하여 활성화되는 경우, 형광 색소-라벨링된 항체는 광에너지를 흡수하여 분자 내에서 여기되는 상태가 되어서 광 현미경에 의해 가시적으로 탐지할 수 있는 특징적인 색상에서 광을 발산하게 된다. EIA에서와 같이, 형광성 라벨링된 항체는 제1 항체-합텐 복합체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 반응물을 세척한 후, 남은 3개의 복합체를 적합한 파장의 광선에 노출시키고 관찰된 형광성은 관심의 합텐의 존재를 가리키게 된다. 면역형광 및 EIA 기법은 본 기술 분야에 매우 잘 설정되어 있고 본 발명의 방법에 특히 바람직하다. 그러나 방사성 동위원소, 화학발광 분자 또는 생물발광 분자와 같은 다른 리포터 분자도 사용할 수 있다.

본 발명은 또한스핀고신 키나제또는 이의 유도체를 탐지하기 위해 PCR 분석을 포함하는 유전자 분석에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 다음의 비제한적인 실시예에서 보다 완전하게 설명된다.

실시예 1

인간 스핀고신 키나제의 정제 및 클로닝-실험 방법

실험 재료

D-erythro-스핀고신, D-erythro-디하이드로스핀고신, DL-threo-디하이드로스핀고신,N,N-디메틸스핀고신,N-아세틸스핀고신 (C₂-세라마이드), S1P 및 Fumosin B1은 Biomol Research Laboratories Inc. (Plymouth Meeting, PA)에서 구입하였다. 피토스핀고신, L-α-포스파티드산, L-α-포스파티딜이노시톨, L--포스파티딜세린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜에탄올아민, 1,2-디옥타노일-sn-글리세롤, 1,2-디올레오일-sn-글리세롤, ATP, 카모듈린, 글루타티온 및 소혈청 알부민(BSA)은 Sigma에서 구입하였다.N,N,N-트리메틸스핀고신 및 ADP 는 Calbiochem (Band Soden, Germany)에서 구입하고, [³²P]ATP는 Geneworks (Adelaide, South Australia)에서, TNF는 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN)에서, 그리고 이소프로필--D-티오갈락토사이드 (IPTG)는 Promega (Madison, WI)에서 구입하였다. 미리 포장된 Mono-Q, Superose 75 및 HiTrap-Q 컬럼, Q Sepharose 고속 유동, 카모듈린 Sepharose 4B, 글루타티온 Sepharose 4B, 트롬빈 및 겔 여과 분자량 단백질 표준물질(gel filtration molecular mass protein standards)은 Amersham Pharmacia Biotech에서 구입하였다. SDS-PAGE 분자량 단백질 표준물질, 은염색 플러스 키트(silver stain plus kit), Coomassie Brilliant Blue R250 및 Coomassie 단백질 시약은 Bio-Rad에서 구입하였다. Centricon 농도계는 Amicon Inc. (Beverly,MA)에서 구입하였고 BCA 단백질 시약은 Pierce Chemical Company (Rockford, IL)에서 구입하였다.

스핀고신 키나제 효소 분석

스핀고신 키나제활성은 원칙적으로 종래에 개시된 바(Oliveraet al., 1998)에서 약간 변경하여, D-erythro-스핀고신 및 기질로서 [³²P]ATP를 사용하여 통상적으로 특정하였다. 간략하면, 스핀고신 (5% Triton X-100에 용해시킨 100 μM 스톡) 및 [γ-³²P]ATP (1 mM; 10 μCi/㎖)을 100 mM Tris/HC1 (pH 7.4), 10 mM MgCl₂10% (v/v) 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 15mM NaF, 0.5 mM 4-데옥시피리독신을 100 ㎕의 총부피로 함유하는 분석용 버퍼 내에서 37℃에서 30분간 샘플을 배양하여 분석을 실시하였다. 반응을 종결시키고 스핀고신-1-포스페이트를 클로로폼/메탄올/HC1 (100:200:1, v/v) 700 ㎕을 첨가하여 추출하고 이어서 격렬하게 혼합하고, 200 ㎕의 클로로폼 및 200 ㎕의 2 M KC1을 첨가하고 원심분리에 의해 상분리하였다. 유기상에 녹인 라벨링된 S1P를 실리카 겔 60 상에서 1-부탄올/에탄올/초산/물r (8:2:1:2, v/v)로 TLC하여 분리하고 포스포리마거(phosphorimager) (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)에 의해 정량하였다. 1 단위(U)의 활성은 1분당 형성된 S1P의 1pmol로 정의된다.

인간 태반에서 스핀고신 키나제의 정제

스핀고신 키나제를 인간 태반 1240 g(4개의 태반)으로부터 정제하였다. 모든 단계는 4℃에서 실시하였다. 태반을 건조하고 버퍼 A(10% (v/v) 글리세롤, 0.05% Triton X-100 및 1 mM 디티오트레이톨을 함유하는 25 mM Tris/HC1 버퍼, pH 7.4)에서 세척하고 단백질 분해효소 억제제 칵테일(Complete^TM; Boehringer Mannheim)(버퍼 B)을 함유한 새로운 버퍼 A 1.5ℓ에 옮겨서 Waring 블랜더에서 잘게 저몄다. 얻어진 균질물을 얼음상에서 30분간 저장하여 효소 추출을 촉진하고 균질물의 가용성 분획을 17 000 g로 60분간 원심분리하여 분리하였다. 얻어진 제조물은 이후 pH 7.4에서 고상의 (NH₄)₂SO₄를 첨가하여 (NH₄)₂SO₄침전 및 원심분리(17 000 g, 30분)에 의해 침전된 단백질을 수집하여 분획하였다. 25-35%-포화 (NH₄)₂SO₄분획을 버퍼 B에 재용해시키고, 동일한 버퍼에 대해 광역 투석에 의해 탈염시키고 원심분리(17 000 g, 30 분)하여 불용성 물질을 제거하였다. 이어지는 모든 크로마토그래피 단계를 4℃에서 FPLC 시스템 (Pharmacia Biotech)을 사용하여 실시하였다.

투석된 (NH₄)₂SO₄분획을 7 ㎖/분의 유속으로 미리 버퍼 A와 평형을 유지시킨 Q-Sepharose 고속 유동 컬럼(50 mm 투석기, 250 ml 베드 용량)에 적용하였다. 스핀고신 키나제 활성을 버퍼 A에서 0 내지 1M의 NaCl 구배로 용리시키고 10 ㎖ 분획에 수집하였다. 최고의 SK1 활성을 함유하는 분획을 혼합하고 CaCl₂및 NaCl을 첨가하여 각각 4 mM 및 250 mM의 최종 농도가 되도록 하였다. 이렇게 섞은 추출물을 카모듈린-Sepharose 4B 컬럼 (16 mm diameter, 10 ml bed volume)에 적용하여, 1 ㎖/분의 유속으로 2 mM CaC1₂을 함유한 버퍼 A로 미리-평형을 유지시켰다. 컬럼을 여러 컬럼 부피의 평형 버퍼로 세척하고 4 mM EGTA를 함유하는 버퍼 A로 다시 세척한 후 SKI를 4 mM EGTA 및 1 M NaC1을 함유한 버퍼 A로 용리시켰다. 가장 높은 스핀고신 키나제 활성을 가진 분획들을 섞고 Sephadex G-25 컬럼 상에서 탈염시키고 1 ㎖/분의 유속으로 버퍼 A로 미리 평형 유지시킨 Mono-Q 컬럼 (5 mm 지름, 1 ㎖ 베드 용량)에 적용하였다. 스핀고신 키나제 활성은 버퍼에서 0 내지 1M의 NaCl 구배로 용리시켰다. NaCl(500 mM까지)를 즉시 효소 활성을 안정화시키기 위해 수집된 분획(1 ㎖)에 첨가하였다. 가장 높은 스핀고신 키나제 활성을 가진 Mono-Q 분획들을 조합하고 Sephadex G-25 컬럼 상에서 탈염시켰다. 이후 ATP 및 MgC1₂를 섞은 분획들에 첨가하여 각각 1 mM 및 5 mM의 최종 농도가 되도록 한 후, 1 ㎖/분의 유속으로 1 mM ATP 및 5 mM MgC1₂를 함유한 버퍼 A로 미리-평형 유지된 Mono-Q 컬럼에 재적용하였다. 스핀고신 키나제 활성을 평형 버퍼에서 0 내지 1M의 NaCl 구배로 용리시켰다. 다시, NaCl (500 mM까지)를 즉시 효소 활성을 안정화시키기 위해 수집된 분획(1 ㎖)에 첨가하였다. 가장 높은 스핀고신 키나제 활성을 가진 Mono-Q 분획들을 섞고 Centricon-10 농축기에서 200㎕의 최종 부피까지 10배 농축하고 0.4 ㎖/분의 유속으로 500 mM NaCl을 함유한 버퍼 A로 미리-평형 유지된 Superdex 75 컬럼(100㎜ 지름, 20㎖ 베드 용량)에 적용하였다. 스핀고신 키나제를 동일한버퍼로 용리시키고 0.4 ㎖ 분획을 수집하였다. 효소의 분자량을 리보뉴클레아제 A, 키모트립시노겐 A, 오브알부민 및 BSA의 용리량과 비교하여 이 컬럼으로부터 예측하였다.

인간 스핀고신 키나제의 클로닝

인간 스핀고신 키나제(hSK)를 인간 스핀고신 키나제로 배열된 인간 EST 서열(GenBank^TM수탁번호 D31133, W63556, AA026479, AA232791, AA081152, AI769914 및 AI769914)로부터 유래된 PCR 프라이머를 이용한 a HUVEC Zap cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다(Oliveraet al., 1998). 이들 프라이머들은 중앙SacII 자리(P1, 5'-CGGAATTCCCAGTCGGCCGCGGTA-3' [<400>3] 및 P2, 5'-TAGAATTCTACCGCGGCCGACTGGCT-3' [<400>4])에 걸쳐있는 것으로, T3 및 T7 프라이머를 결합하는 데 사용되어 각각 hSK의 5' 및 3' 말단을 의미하는 669 bp 및 550 bp의 2개의 중첩하는 PCR 산물을 만들었다. 이들 2개의 PCR 산물은 이후 별도로 pGEM4Z로 클로닝되었다. 5'hSK PCR 클론으로부터 유래된 584 bpSacII 단편은 이후 정방향으로 3' hSK PCR 클론의SacⅡ 자리로 서브 클로닝되어 1130 bp 일부 hSK cDNA 클론을 생산하였다. 이후 669 bp의 5' hSK 클론으로부터 120 bp의EcoRI/StuI 단편을EcoRI/StuI로 분해된 pGEM4Z-1130 bp 클론으로 서브 클로닝함으로써 hSK를 코딩하는 완전한 길이의 클론이 생산되었다. 양 방향에서 cDNA 클론을 서열결정하여 hSK cDNA 서열의 완전성을 보장하였다.

포유류 세포에서 발현 hSK cDNA는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 T7 및 5'--TAGAATTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTAAGGGCTCTTCTGGCGGT-3' [<400>5]를 이용한 PFU 폴리머라제 PCR에 의해 3'-말단에서 태그된 FLAG 에피토프이었다. 이 FLAG-태그된 hSK cDNA는 이후EcoRI로 분해된 pCDNA3으로 클로닝되었다. 방향은 제한 분석(restriction analysis) 및 완전성이 확인된 hSK-FLAG cDNA 서열을 서열결정하여 결정되었다. 박테리아의 발현을 위한 완전한 길이의 hSK cDNA를 pGEX4T2로 서브 클로닝하였다. pGEM4Z-hSK 클론을 72℃에서 30분간 1 ×PFU 버퍼, 50μM dNTP에서BamHI로 분해하고, 3U PFU 폴리머라제로 블런트하게 만들었다(blunted). 1163 bp의 hSK cDNA를SalI으로 분해한 후 겔 정제한 후 블런트/SalI 단편을 pGEX4T2SmaI/XhoI에 결찰시켰다.

스핀고신 키나제 아미노산 서열 분석

인간 스핀고신 키나제 아미노산 서열을 blastp 및 tblastn 알고리즘(Altschulet al., 1990)을 이용하여 Australian National Genome Information Service의 비-잉여의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대립하여 연구하였다.

세포 배양

인간 배꼽의 정맥 상피 세포(HUVEC)를 종래의 방법(Wallet al., 1978)에 따라 분리하고 젤라틴 도포된 배양 플라스크 내에 20% 소의 태아 혈청, 25 ㎍/㎖ 내피 성장 보충물(Collaborative Research) 및 25 ㎍/㎖ 헤파린으로 보충된 Earle's 염을 포함한 배지 M199에서 배양시켰다. 세포를 처리 및 수득하기 전에 3회 통과시키고 80% 융합도까지 성장시켰다. 인간의 태아의 신장 세포 (HEK293, ATCC CRL-1573)를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM의 글루타민, 0.2 %(w/v) 중탄산나트륨, 페니실린(1.2 ㎎/㎖) 및 겐타마이신(1.6 ㎎/㎖)를 함유한 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 배양하였다. 인산칼슘 침전법(Graham & van der Eb, 1973)을 이용하여 HEK293 세포를 순간 트랜스펙션시켰다. HUVEC 및 HEK293 세포를 종래의 방법(Xiaet al., 1998)에 따라 TNF (1 ng/㎖)으로 처리하였다.

실시예 2

E. coli 유래의 재조합 인간 스핀고신 키나제의 발현 및 분리 - 실험 방법

pGEX4T2로 클로닝된 완전한 길이의 SPHK cDNA를E. coliBL21로 형질전환시켰다. 형질전환된 분리물의 하룻밤 배양물(100 ㎖)을 암피실린(100 ㎎/ℓ)을 함유한 Superbroth(20 g/ℓ의 글루코스, 35 g/ℓ의 트립톤, 20 g/ℓ의 이스트 추출물, 5 g/ℓ의 NaCl, pH 7.5)에서 30℃에서 진동(200 rpm)시키면서 배양하였다. 배양물을 새로운 배지로 1:20까지 희석하고, 30℃에서 진동하면서 0.6-0.7의 OD₆₀₀까지 배양하였다. 0.1 mM 이소프로필--D-티오갈락토사이드를 첨가하고 배양물을 30℃에서 3시간 동안 추가 배양하여, 글루타티온-s-트랜스퍼라제(GST)-결합된 스핀고신 키나제 (GST-SK)의 발현을 유도하였다. 이 시간 후, 박테리아 세포를 4℃에서 6,000 g로 20분간 원심분리에 의해 수득하였고 250 mM NaCl을 함유한 버퍼 B 20㎖에서 재현탁시켰다. 이후, 세포를 최종 농도 0.3 ㎎/㎖까지 리소자임으로 25℃에서 15분간 용균시키고 20 초음파 펄스 후 1분간 냉각하는 사이클을 3회 실시하는 초음파 처리를 실시하였다. 이후 용균물을 4℃에서 45분간 50,000 g로 원심분리 시켰 정화시켰다. 세척되고 일정하게 혼합하면서 4℃에서 60분간 버퍼 B와 이미 평형을 유지시킨 50%(w/v)의 글루타티온-Sepharose 4B (Pharmacia) 0.2 용량으로 여과하고자 하는 상층액을 배양하였다. 이후, 혼합물을 유리 크로마토그래피 컬럼(10 ㎜ 지름)에 넣고 비드 (결합된 GST-SK)를 4℃에서 버퍼 B의 10 컬럼 용량으로 세척하였다. GST-SK는 이후 10 mM 환원된 글루타티온을 함유한 버퍼 B 10 ㎖에서 컬럼으로부터 용리시켰다. 25℃에서 3 시간 동안 20 μg(30 N.I.H. 단위)의 트롬빈(Pharmacia)으로 배양하여 스핀고신 키나제로부터 GST를 절단시켰다. 인간 태반에서 얻은 스핀고신 키나제을 정제하기 위해, 절단 혼합물을 카모듈린-Sepharose 컬럼에 적용하고 Mono-Q 음이온 교환 컬럼에 적용하여 방출된 스핀고신 키나제를 정제하였다. 이들 컬럼은 재조합 스핀고신 키나제를 균질하게 정제하도록 하였다.

실시예 3

스핀고신 키나제의 특징 분석 - 실험 방법

37℃에서 50 mM 버퍼(초산나트륨, pH 4.0-5.0; Mes, pH 6.0-7.0; Hepes, pH7.0-8.2; Tris/HC1, pH 8.2-10.0; Caps, pH 10.0-11.0)에서 4.0 내지 11.0의 pH 범주에 걸쳐 분리된 스핀고신 키나제의 활성에 대한 pH의 작용을 결정하였다. 4℃에서 5시간 동안 동일한 버퍼에서 효소의 예비 배양후 잔류 활성을 분석하여 pH 안정성을 측정하였다. 유사한 방법으로 pH 7.4(50mM Tris/HC1 함유 10% 글리세롤, 0.5 M NaC1 및 0.05% Triton X-100)에서 30분간 다양한 온도(4-80℃)에서 효소의 열 안정성을 측정하였다. 가중 비선형 회귀 프로그램 (Easterby, 1996)으로 Michaelis-Menten 키네틱을 이용하여 기질의 키네틱을 분석하였다. 스핀고신 및 이의 유사체를 Triton X-100과 미셀을 혼합하는 중 효소 분석에 첨가하였다. 이들은 이들 분자에 대해 얻어진 표면 희석 키네틱(Buehrer 및 Bell, 1992), 모든 K_m및 K_i값은 벌크 용액 농도보다는 Triton X-100의 몰%로 표현하였다. 스핀고신 키나제 활성에 대한 칼슘/카모듈린의 작용을 측정하는 분석에서, 칼슘 및 카모듈린을 각각 4 mM 및 0.6 mM의 최종 농도까지 분리된 스핀고신 키나제 20 nM을 함유한 표준 분석 혼합물에 첨가하였다.

실시예 4

기타 분석 방법

표준 물질로 BSA를 이용하고 Coomassie Brilliant Blue (Bradfordet al., 1976) 또는 Bicinchoninic acid (Smithet al., 1985) 시약 중 하나를 이용하여 단백질을 측정하였다. 일부 경우에서, 측정의 감수성 및 정확도를 높이기 위해 침전에 의해 t세제를 농축시켜 제거한 후 단백질의 평가를 실시하였다(Wessel 및 Flgge, 1984). 12% 아크릴아미드 겔을 이용하여 Laemmli (1970)의 방법에 따라 SDS-PAGE를 실시하였다. 겔 상에서 단백질 밴드를 Coomassie Brilliant Blue R250 또는 은 염색으로 가시화하였다. 마이오신, β-갈락토시다제, BSA, 오브알부민, 탄소의 무수물 분해효소, 대두 트립신 억제제, 리소자임 및 아프로티닌의 전기영동 이동도와 비교하여 분자량을 추정하였다.

실시예 5

인간 스핀고신 키나제의 정제 - 결과

인간 태반에서 총 스핀고신 키나제 활성의 절반 이상이 조직 균질화 후에 사이토졸에 존재하였다(표 3). 인간 태반에서 얻은 스핀고신 키나제의 정제는 표 4에 요약되어 있다. 4개의 인간 태반의 균질물로부터 얻은 가용성 분획에 우선 암모늄 설페이트 침전을 실시하였다. 현저하게 우수한 스핀고신 키나제의 정제(33배)가 되어 25-35% 포화된 암모늄 설페이트 분획에 침전하였다. 음이온 교환 크로마토그래피에서 Sephadex G25 컬럼을 통해 암모늄 설페이트 분획을 빠르게 탈염시키고, 탈염된 분획을 즉시 Q Sepharose FF 컬럼에 부가하였다. 이 탈염 단계의 속도는 스핀고신 키나제 활성이 약 0.2M 이하의 NaCl 농도에서 매우 불안정하여 투석과 같은 느린 탈염 단계로 인해 효소 활성이 실질적으로 손실되게 되어 스핀고신 키나제 활성이 약 0.2M 이하의 NaCl 농도에서 매우 불안정하기 때문에 결정적인 것 같다. 0 내지 1M의 NaCl 구배로 Q Sepharose FF 컬럼을 적용하여 스핀고신 키나제활성이 0.15M 및 0.6 M NaCl에서 용리되어 각각 SK1 및 SK2로 지정된 2개의 피크가 생기게 된다(도 2). 이 연구에서는 풍부함과 안정성; SK2 활성이 SK1과는 달리 매우 불안정하여 0.5M NaC1, 10% 글리세롤 및 0.05% Triton X-100을 첨가하여도 안정화할 수 없기 때문에 추가의 정제를 위해 SK1을 선택하였다. 또한 이후에 논의하게 되는 바와 같이 HUVEC에 이소폼이 존재하는 것 같기 때문에 SK1을 선택하였다.

SK1을 함유한 Q Sepharose FF 컬럼에서 얻은 분획은 4mM CaCl₂의 존재시 카모듈린-Sepharose 4B 컬럼에 적용하여 친화성 정제되었고 SK1의 용리는 EGTA 및 NaCl로 용리를 실시하여서 추가의 실제적인 정제(38배) 및 높은 효소 산출이 이루어졌다. SK1은 EGTA 단독으로 카모듈린 Sepharose 4B 컬럼으로부터 용리되지는 않았고, 따라서 친화성 매트릭스와 효소의 비상한 회합을 가리킨다. 카모듈린 Sepharose 4B 컬럼으로부터 용리된 활성 분획은 이후 탈염되어 MonoQ 컬럼 상에서와 1 mM ATP 및 5 mM MgCl₂의 존재시 실시되는 제2 단계의 분석용 이온 교환 크로마토그래피의 2개의 후속 단계에 적용되었다(도 3). 이들 음이온 교환 단계에서 얻어진 활성 분획은 이후 최종 정제 단계로서 Superdex 75 컬럼으로 겔 여과 크로마토그래피에 적용하였다. SK1은 44kDa에 해당하는 분자량을 가진 단일 피크로 이 컬럼에서 용리되었다. 은 염색으로 SDS-PAGE에 의해 최종 컬럼으로부터 이활성 분획을 분석하여 45 kDa의 분자량의 단일 밴드를 보이므로, 따라서 원래의 태반 추출물로부터 100만배 이상 정제되고 원래의 스핀고신 키나제 활성의 7%의 매우 우수한 수율을 가진 균질한 단백질이라는 것을 가리킨다(표 4). 최종 스핀고신 키나제는인간 기원으로부터 균질하게 정제되었다.

실시예 6

HUVEC에서 스핀고신 키나제 이소폼 - 결과

2개의 스핀고신 키나제 활성이 인간 태반에서 동정되었기 때문에(도 2), 제조용 음이온 교환 컬럼을 사용하여 HUVEC에서 효소 활성의 다중성을 실험하였다. 다른 인간 조직 및 세포와는 달리, HUVEC 추출물을 이들 컬럼에 적용하여 인간 태반 SK1으로 동일한 지점에서 용리된 단일 스핀고신 키나제 피크만이 나타나게 되었다(도 5). 유사하게, 스핀고신 키나제 활성이 TNFα로 HUVEC을 10분 처리하여 자극되는 HUVEC의 추출물을 적용한 후에 단일 스핀고신 키나제 피크만이 용리되었다(Xiaet al., 1999). 이러한 결과는 이 연구에서 분리된 인간 태반의 스핀고신 키나제인 SK1이HUVEC에서 발견되는 주된 이소폼일 것이고, TNFα 처리로 다른 잠재적인 이소폼의 활성 보다는 이 효소의 활성을 증가시키게 된다는 것을 가리키게 된다.

실시예 7

인간 스핀고신 키나제의 클로닝 및 HEK293 세포에서 순간 발현 - 결과

인간 스핀고신 키나제 cDNA를 공지된 쥐과의 스핀고신 키나제 서열(Kohamaet al., 1998)에 따라 배열된 인간의 EST로부터 고안된 설정된 프라이머를 이용하여 HUVECλZap 라이브러리로부터 생산하였다. 클로닝 전략은 도 6에 도시되어 있다. cDNA는 384 아미노산을 코딩한 명확한 오픈리딩 프레임을 가진다(도 7). 서열은 인식가능한 Kozak 공통서열 모티브가 부족하여 실재의 초기 서열이 이 cDNA에 포함되지 않을 것이라는 것을 주지하여야 한다. 스핀고신 키나제 cDNA는 6.64의 예상된 등전점 및 정제된 인간 태반 스핀고신 키나제(SK1)로 측정된 분자량과 동일한 42,550 kDa의 분자량을 가지는 단백질(hSK)을 코딩한다. pcDNA3으로 서브클로닝하고 HEK293 세포에서 hSK의 순간 발현으로 이들 세포에서 스핀고신 키나제 활성이 트랜스펙션되지 않은 HEK293 세포 또는 벤 벡터로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포와 비교하여 3200배 증가하였다(도 8). 이것은 발생된 hSK cDNA가 진정한 스핀고신 키나제를 코딩한다는 것이다. 흥미롭게도, hSK-트랜스펙션된 HEK293 세포는 스핀고신 키나제 활성의 3200배 더 크고, 이들 세포를 얻어진 TNFα로 처리하여 트랜스펙션되지 않은 HEK293 세포에서 보여지는 바와 동일한 비율로 스핀고신 키나제 활성이 증가한다(도 8)(Xiaet al., 1998). 이것은 이들 세포에서 고수준의 과잉 발현된 스핀고신 키나제가 TNFα에 의해 매개되는 활성 메카니즘을 충족시키지 않는다는 것을 가리킨다.

실시예 8

인간 스핀고신 키나제 분석 - 결과

데이터베이스 조사에서 최근 동정된 2개의Saccharomyces cerevisiae스핀고신 키나제 (Nagiecet al., 1998)와Schizosaccharomyces pombe,Caenorhabditiselegans및Arabidopis thaliana에서 얻은 추정의 스핀고신 키나제 단백질을 코딩하는 여러개의 다른 EST와 높은 아미노산 서열 유사성(28 내지 36% 동일성)을 가진다는 것이 나타났다. 상동성을 가진 hSK의 다중 서열 배열(도 9)에서는 단백질을 통해 매우 높은 아미노산 서열이 보존된 여러 영역이 나타났지만 특히 N-말단에 대해 높게 나타났다.

hSK 서열의 도메인 구조의 연구에서는 3가지 칼슘/카모듈린 결합 모티브를 나타냈다(Rhoads & Friedberg, 1997). 하나의 1-8 14 타입 A (+3 내지 +6의 알짜 전하를 가지는 [FILVW]xxx{FAILVW]xx[FAILVW]xxxxx{FILVW])은 잔기 290에서 303에 걸쳐있고 2개의 1-8 14 타입 B (+2 내지 +4의 알짜 전하를 가지는 [FILVW]xxxxx{FAILVW]xxxxx[FILVW])은 잔기 134에서 153 사이에서 중첩된다. hSK 서열의 추가 단백질이 단백질 가수분해성 절단된다면 적용가능한 N-말단(Gly⁵에서)에 밀접한 가능한 N-미리스토일화 자리가 분석에서 밝혀졌다. 하나의 추정의 카제인 키나제 Ⅱ(CKⅡ) 인산화 자리(Ser¹³⁰) 및 4개의 추정의 PKC 인산화 자리(Thr⁵⁴, Ser¹⁸⁰, Thr²⁰⁵및 Ser³⁷¹)(도 7)도 동정되었다. 마우스 효소도 6개 이상의 가능한 인산화 자리; PKC에 4개, 및 hSK에서 나타나지 않는 단백질 키나제 A 및 CKⅡ 각각 하나를 나타내고 있지만, 2개의 쥐과의 스핀고신 키나제 이소포옴에서도 이들 추정의 인산화 자리가 발견된다.

SMART 조사 수단을 이용한 신호 도메인 서열의 연구(Schultzet al., 1998; Pontinget al., 1999)에서는 추정의 디아실글리세롤 키나제(DGK) 촉매 도메인에대해 hSK의 잔기 16 내지 153에서 유사성이 나타났다. hSK는 DGK 촉매 도메인의 공통 서열에 대해 대략 36%의 상동성을 나타내고 이 도메인의 잘 보존된 24개의 아미노산 중 17개를 가지고 있다. 그러나 DGK에 대한 이 단백질 키나제 ATP-결합 자리 모티브의 적용 가능성((Hankset al., 1988)이 논쟁거리이긴 하지만 (Schaapet al., 1994); Sakaneet al., 1996; Masaiet al., 1993), hSK은 이 도메인(GxGxxGx_nK)의 제안된 ATP 결합 모티브와 상동성을 보이지 않았다. 또한, 인간 스핀고신 키나제의 추가 서열 분석에서는 다른 단백질 군에서 발견되는 제안된 뉴클레오타이드-결합 모티브에 대해 현저한 유사성을 나타내는 영역을 발견하지는 못하였다(Sarasteet al., 1990; Walkeret al., 1982). DGK 촉매 자리에 대한 유사성과는 별도로, hSK는 다른 지질 결합 효소에 대한 유사성을 전혀 보이지 않았고, PKC C2 또는 pleckstrin 상동 도메인과 같은 임의의 인지 가능한 지질 결합 도메인을 가지지 않는 것 같다. SH3 결합 도메인에 대한 일부 유사성을 가진 C-말단에서 프롤린이 풍부한 영역을 제외하고는 다른 분명한 정규 도메인은 없었다(Renet al., 1993; Yuet al., 1994).

실시예 9

E. COLI 의 발현 및 재조합 스핀고신 키나제의 분리 - 결과

hSK cDNA를 pGEX 4T-2 플라스미드에 서브클로닝하고 hSK는 IPTG 유도에 의해E. coliBL21에서 글루타티온 s-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질을 발현시켰다(도10). GST-hSK 융합 단백질을 글루타티오 Sepharose 4B를 사용해 부분적으로 정제하고 트롬빈 절단을 이용해 GST를 제거한 후, 이어서 카모듈린 Sepharose 및 Mono-Q 음이온 교환 컬럼으로부터 용리시켜 hSK를 더욱 정제하였다. 이로 부터 스핀고신 키나제 활성(원래 유도된 활성의 70% 이상) 및 전기영동에 의한 순수한 스핀고신 키나제(도 10)가 높은 비율로 회수되었다. 그러나 IPTG에 의해 유도된 대부분의 트롬빈-절단된 hSK 단백질이 카모듈린 Sepharose 컬럼에 결합하지 않기 때문에, 재조합 효소의 낮은 단백질 수율이 얻어질 수도 있다(도 11). hSK의 결합되지 않은 형태는 뚜렷한 촉매의 활성을 나타내지 않았으며, 이는 비결합 형태의 hSK가 부정확하게 폴딩되어 있음을 시사한다.

실시예 10

스핀고신 키나제 기능성 활성을 위한 번역후 변형의 필요조건

천연 스핀고신 키나제의 활성을 위해 번역후 변형이 필요한 지에 대해 결정하기 위해 천연 분자를 변형이 일어나지 않는 경우E. coli에서 생산된 재조합 효소와 비교하였다. 특히, 효소를 기질 친화성 및 접근성에 있어서의 차이에 대해 실험하였다. 이 연구의 전제로는 번역후 변형이 효소의 물리화학적 또는 촉매적 특성에서 탐지할만한 변화를 일으킬 수 있는 스핀고신 키나제의 구조에서 형태의 변화를 일으킨다는 것이다. 요약하면, 재조합으로 생산된 스핀고신 키나제가 번역후 변형이 없는 경우에서도 기능적 활성을 유지한다는 것이 측정되었다.

방법

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 기질 특이성

천연 및 재조합 스핀고신 키나제에 의해 스핀고신의 인산화의 상대적 비율은 대수적으로 100%로 고정되었고 각각 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하였다. 실험된 기질을 0.25% (w/v) Triton X-100에서 100 μM의 최종 농도까지 첨가하였고 이전에 개요된 표준 분석 조건하에서 분석하였다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 기질 및 억제자 키네틱

스핀고신 유사체 0.5 내지 200μM 및 ATP 5 내지 100 μM의 농도 범위로 기질에 적용하여 기질 키네틱을 측정하였다. 2 내지 50μM의 농도 범위에 걸쳐 억제자를 사용하여 억제 키네틱을 측정하였다(표 5). 양쪽의 경우에서, 데이터는 비선형 회귀 분석하였다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 열 안정성

효소의 예비 배양후 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 열안정성을 다양한 온도(4 내지 80℃)에서 pH 7.4(10% 글리세롤, 0.5M NaCl 및 0.05% Triton X-100을 함유한 50mM Tris/HCl)에서 30분간 측정하였다. 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 원래의 활성은 대수적으로 100%로 설정하고 이것은 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 pH 안정성

효소의 예비 배양후 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 pH 안정성을 4℃에서 다양한 pH(4 내지 80℃)에서 5시간 측정하였다. 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 원래의 활성은 대수적으로 100%로 설정하고 이것은 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 pH의 작용

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 pH의 작용을 50 mM 버퍼(초산나트륨, pH 4.0-5.0; Mes, pH 6.0-7.0; Hepes, pH 7.0-8.2; Tris, pH 8.2-10.0; Caps, pH 10.0-11.0)에서 4 내지 1의 pH 범위에 걸쳐 활성을 분석하여 결정하였다. 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 최대 활성은 대수적으로 100%로 설정하고 이것은 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 금속 이온의 작용

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 금속 이온의 작용을 10mM에서 다양한 금속 이온 또는 EDTA의 존재하의 표준 조건하에서 활성을 분석하여 결정하였다. 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 최대 활성은 대수적으로 100%로 설정하고 이것은 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 인지질의 작용

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성에 대한 다양한 인지질의 작용을 10몰%의 Triton X-100에서 인지질의 존재하의 표준 조건하에서 분석하여 결정하였다. 인지질의 부재시 천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 활성은 대수적으로 100%로 설정하고 이것은 각각 2.65 kU 및 7.43 kU에 해당하는 것이다. PC, 포스파티딜콜린; PS, 포스파티딜세린; PE, 포스파티딜에탄올아민; PI, 포스파티딜이노시톨.

결과

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 최대 활성을 pH 7.4에서 관찰하였다. 두가지 효소 모두에서 pH 4.8 내지 7.4에서 최대 활성의 60% 이상을 보였다(도 12). 두 스핀고신 키나제 모두 4℃, 4 내지 7.8의 pH 범위에서 5시간 배양한 후 원래의 활성의 90% 이상을 유지하였고, 10% 글리세롤, 0.5M NaC1 및 0.05% Triton X-100 존재하의 pH 7.4에서 양쪽의 효소는 37℃이하의 온도에서 30분동안 안정하였다(도 12). 소의 뇌 및 래트의 신장 스핀고신 키나제에 대한 이전의 관찰(Louieet al., 1976; Oliveraet al., 1998)과 동일하게, 효소는 글리세롤, NaC1 및 Triton X-100가 결여된 버퍼에서 훨씬 덜 안정하였다(데이터는 도시되지 않음). 분석에서 EDTA의 존재가 활성을 감소시키기 때문에, 양쪽의 인간 스핀고신 키나제는 모두 2가의 금속 이온이 필요하다는 것을 보여주었다(도 12). 다른 스핀고신 키나제의 실험과 같이(Louieet al., 1976; Buehrer & Bell, 1992; 1993; Oliveraet al., 1998; Nagiecet al., 1998), 양쪽의 인간 효소 모두는 Mg²⁺에 대해 가장 높은 활성을 보여주었으나 Mn²⁺에 대해서는 다소 낮은 활성을 나타내고, Ca²⁺에 대해서는 매우 낮은활성을 나타내었다. Zn²⁺, Cu²⁺및 Fe²⁺를 포함하는 다른 실험된 2가의 금속 이온은 스핀고신 키나제 활성을 지지하지는 않았다(도 12).

천연 및 재조합 스핀고신 키나제는 매우 유사하고 한정된 기질 특이성을 가진다. 양쪽 모두 천연 발생 포유류 기질인 D-erythro-스핀고신 및 D-erhthro-디하이드로스핀고신에서 가장 큰 활성을 보인다. 양쪽 효소에서 피토스핀고신에 대해 낮은 활성이 측정되었지만, 피토스핀고신 이외의 다른 스핀고신 유도체 및 관련된 분자의 범위에서는 관찰되지 않았다. 이들은 DL-트레오-디하이드로스핀고신, N,N-디메틸스핀고신, N,N,N-트리메틸스핀고신, N-아세틸스핀고신(C₂-세라마이드), 디아실글리세롤 (1,2-디옥타노일-sn-글리세롤 및 1,2-디올레오일-sn-글리세롤), 및 포스파티딜이노시톨을 포함한다. 인간 스핀고신 키나제를 D-erythro-스핀고신 및 D-erhthro-디하이드로스핀고신으로 추가 분석하여 사용된 농도 범위에 대해 Michaelis-Menten 키네틱을 나타냈다(도 13). 양쪽의 분리된 천연 및 재조합 스핀고신 키나제는 D-erythro-스핀고신 및 D-erhthro-디하이드로스핀고신에 대해 약간 높은 친화성 및 매우 유사한 키네틱 특성을 나타낸다(표 5). 이 연구에서 실시된 다른 분석에서 모두 사용된 바와 같이 이 방법에서 기질의 존재에 의해 양쪽 효소가 Triton X-100 혼합된 마이셀에 존재하는 경우와 비교하면 스핀고신 키나제가 스핀고신-BSA 복합체로서 적용된 경우 낮은k _cat값(천연 및 재조합 스핀고신 키나제 28 s^-1및 39 s^-1)을 초래함에도 불구하고, 양쪽 효소도 역시 유사한 키네틱을 나타내었다. 스핀고신을 각각 천연 및 재조합 스핀고신 키나제에 16 ±4 mM 및 17 ±2 mM의 BSA complexK _m값으로 공급하였다. 천연 및 재조합 스핀고신 키나제 모두는 ATP에 대해 동일한 친화성(K _mof approx. 80 mM (표 5)을 가졌다.

천연 및 재조합 스핀고신 키나제 모두는 DL-threo-디하이드로스핀고신,N,N-디메틸스핀고신 및N,N,N-트리메틸스핀고신에 의해 억제되었고(Fig. 13), 이들 분자의 3가지 모두는 스핀고신에 대해 경쟁적인 억제를 나타내었다. 이들 분자에 대한 억제 상수는 상당히 유사함에도 불구하고,N,N,N-트리메틸스핀고신 은 DL-threo-디하이드로스핀고신 보다 약간 더 효과적으로 억제되어,N,N-디메틸스핀고신보다 더욱 효과적인 억제제이다(Table 5).

ADP는 ATP에 대해 약한 경쟁적 억제를 보인다(Table 5). 모든 경우에서, 현저하게 유사한 억제 상수는 천연 및 재조합 스핀고신 키나제에 대해 관찰되었다(Table 5). N-아세틸스핀고신 또는 Fumosin B1, 세라마이드 합성효소 억제제에서 억제는 나타나지 않았다.

스핀고신 키나제에 대한 칼슘/카모듈린의 효과를 시험하였다. 사용된 분석 조건 하에서, 칼슘/카모듈린은 천연 또는 재조합 인간 스핀고신 키나제 중 하나에 대한 작용이 없었다(데이터는 도시되지 않음). 이 결과는 카모듈린에 의해 스핀고신 키나제 활성 조절이 부족하다는 것을 가리키지만, 카모듈린이 준세포 배치(subcellular localisation)를 조절하는 것과 같은 스핀고신 키나제의 다른 기능에 어느 정도 관여할 것이라는 가능성은 남아 있다.

산성 인지질에 의한 스핀고신 키나제 활성의 자극을 시험하였다. 천연 인지질 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 효소 분석 혼합물에 첨가하는 것으로 인간 스핀고신 키나제 활성에서 탐지할만한 차이는 나타나지 않았지만, 활성에서 커다란 증가(1.6 내지 2 배)가 산성 인지질 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티드산으로 관찰되었다(도 14). 천연 및 재조합 스핀고신 키나제 모두 이들 산성 인지질에 의해 동일한 방식으로 활성화되었다. 키네틱 분석에서는 3개의 모든 인지질은 효소에서K _cat의 증가를 일으켰지만K _m값은 변화되지 않고 유지되었다.

당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명이 본 명세서에 상세하게 기재된 바 외에도 변경 및 변형이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변경 및 변형을 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 총괄적으로 언급하거나 지정한 모든 단계, 특징, 조성, 및 화합물을 포함하는 것이고 상기 단계 또는 특징 중 하나 이상의 조합의 일부 및 전부를 포함하는 것이다.

[표 3]

스핀고신 키나제 활성을 인간의 태반과 다양한 동물 조직에서 비교

새로운 동물 조직을 세척하고 인간의 태반에 대해 설명한 바와 같이 균질화시켰다. 사이토졸의 스핀고신 키나제 활성의 비율을 균질화에 대해 총 활성을 한외여과(100,000 x g, 60 min) 상층액의 결과와 비교하여 측정하였다. 스핀고신 키나제의 특정 활성을 조직 g당 분당 형성된 S1P의 pmol로 표현하였다.

	특정 활성(U/ 조직 g)	사이토졸 농도(%)
인간 태반	13	51
래트의 신장	28	63
래트의 간	19	37
래트의 뇌	13	52
양의 신장	38	58
양의 간	17	31
양의 뇌	16	63
양의 비장	9	34

[표 4]

인간 태반으로부터 스핀고신 키나제의 정제

스핀고신 키나제를 새로운 인간의 태반 1240 g(4개 태반)으로부터 정제하였다. 스핀고신 키나제 활성의 1 단위(U)는 분당 스핀고신 및 ATP로부터 형성된 S1P의 1 pmol로 정의된다.

단계	활성(U ×10³)	단백질 (㎎)	비활성 (U/㎎)	회복율(%)	정제배율
균질물의 가용성 분획	7943	123600	58	100
암모늄 설페이트	7723	3527	1966	97	33
Q Sepharose 음이온 교환	4048	1098	4597	63	79
카모듈린 Sepharose	3197	18.23	1.75 ×10⁵	40	3.0 ×10³
Mono Q 음이온 교환	1706	2.921	1.75 ×10⁵	21.5	1.0 ×10⁴
ATP-Mono Q 음이온 교환	1133	0.419	2.70 ×10⁶	14.3	4.6 ×10⁴
Superdex 75 겔 여과	549	0.008	6.64 ×10⁷	6.9	1.1 ×10⁶

[표 5]

천연 및 재조합 스핀고신 키나제의 기질 및 억제 키네틱

스핀고신 유사체 0.5 내지 200 μM(0.0125 내지 5 mol%) 및 5 내지 1000 μM ATP의 농도 범위에 걸쳐 기질을 제공하여 기질 키네틱을 측정하였다. 2 내지 50μM(0.05 내지 1.25 mol%) 스핀고신 유사체 및 0.1 내지 5 mM ADP의 농도 범위에 걸쳐서 억제제를 사용하여 억제 키네틱을 측정하였다. 이전의 연구와 비교하기 위해, 스핀고신 및 이의 유도체의 모든K _m및K _i값을 벌크 용액 농도 및 Triton X-100의 mol%로 표현하였다. 이 때 Triton X-100은 모든 분석에서 0.25% (w/v)의 최종 농도로 존재하였다. 모든 키네틱 값 및 표준 오차(Duggleby, 1981)는 비선형 회귀분석으로부터 얻었다(Easterby, 1996).

참조 문헌 목록

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Claims

새로운 스핀고신 키나제 단백질 또는 상기 스핀고신 키나제 단백질의 유도체 또는 모사체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 코딩하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 이의 유도체 또는 유사체.
제1항에 있어서,

상기 스핀고신 키나제 단백질이 인간 스핀고신 키나제 단백질인 분리된 핵산 분자.
<400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 적어도 약 45% 이상의 유사성을 가지는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체.
<400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 낮은 극한 조건(low stringency condition)하에서 <400>1에 혼성화할 수 있는 그의 유도체를 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유도체 또는 유사체.
제4항에 있어서,

<400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 <400>2에서 적어도 10개의 인접 아미노산에 대해 적어도 약 45% 유사성을 가지는 서열을 추가로 코딩하는 분리된 핵산 분자.
제3항 또는 제4항에 있어서,

<400>1에 실질적으로 기재된 분리된 핵산 분자.
새로운 스핀고신 키나제 단백질인 분리된 단백질 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
제7항에 있어서,

상기 스핀고신 키나제 단백질이 인간 스핀고신 키나제 단백질인 분리된 단백질.
<400>2에 실질적으로 기재된 아미노산 서열 또는 그의 유도체 또는 모사체 또는 <400>2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 45% 유사한 서열을 포함하는 분리된 단백질 또는 상기 단백질의 모사체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
제9항에 있어서,

<400>1에 실질적으로 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 유사체 또는 낮은 극한 조건하에서 <400>1에 혼성화할 수 있는 서열에 의해 코딩되는 분리된 단백질 또는 상기 단백질의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
제0항 또는 제10항에 있어서,

<400>2에 실질적으로 기재된 분리된 단백질.
스핀고신 키나제 발현을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서스핀고신 키나제유전자를 유효량의 약제와 접촉시키는 단계를 포함하는스핀고신 키나제의 발현 조절 방법.
포유류에게 스핀고신 키나제 활성을 증가시키거나 또는 감소시키기에 충분한 시간 및 조건하에서 조절 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류에서 스핀고신 키나제의 기능적 활성을 조절하는 방법.
포유류에게스핀고신 키나제의 발현을 조절하기에 충분하거나 또는 스핀고신 키나제의 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법.
포유류에게 세포의 기능적 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 단백질 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 또는 모사체의 유효량를 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법.
포유류에게 세포의 기능적 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 분자 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 또는 모사체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법.
포유류에게스핀고신 키나제의 발현을 조절하기에 충분하거나 또는 스핀고신 키나제 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하며,

상기스핀고신 키나제발현 산물 또는 스핀고신 키나제는 세포의 활성을 조절하는

상기 포유류에서 세포의 기능적 활성을 조절하는 방법.
포유류에게스핀고신 키나제의 발현을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제을 투여하는 단계를 포함하며,

상기 조절로 세포의 기능적 활성이 조절되는

상기 포유류의 치료방법.
포유류에게 스핀고신 키나제의 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하며,

상기 조절로 세포의 기능적 활성이 조절되는

상기 포유류의 치료방법.
포유류에게 세포의 기능적 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 단백질 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 또는 모사체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류의 치료방법.
포유류에게 세포의 기능적 활성을 조절하기에 충분한 시간 및 조건하에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 분자 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물, 또는 모사체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는

상기 포유류의 치료방법.
세포의 기능적 활성을 조절하는 약제의 제조에스핀고신 키나제발현을 조절할 수 있는 제제 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체를 사용하는 용도.
세포의 기능적 활성을 조절하는 약제의 제조에 스핀고신 키나제 활성을 조절할 수 있는 제제 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체를 사용하는 용도.
세포의 기능적 활성을 조절하는 약제의 제조에 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체를 사용하는 용도.
스핀고신 키나제 활성을 조절하는 데 사용되는 제제 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체로서,

상기 스핀고신 키나제 활성을 조절하는 것이 세포의 기능적 활성을 조절하는

제제 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
스핀고신 키나제발현을 조절하는 데 사용되는 제제 또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체로서,

상기스핀고신 키나제발현을 조절하는 것이 세포의 기능적 활성을 조절하는

제제 및 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
세포의 기능적 활성을 조절하는 용도의 스핀고신 키나제 또는스핀고신 키나제또는 그의 유도체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체.
스핀고신 키나제,스핀고신 키나제또는 스핀고신 키나제,스핀고신 키나제를 조절할 수 있는 제제 또는 그의 유도체, 상동체, 유사체, 화학적 등가물 또는 모사체를 하나 이상의 제약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 포함하는 제약학적 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 단백질에 대한 분리된 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 핵산에 대한 분리된 항체.
제29항 또는 제30항에 있어서,

상기 항체가 단일 클론성 항체인 항체.
제29항 또는 제30항에 있어서,

상기 항체가 다중 클론성 항체인 항체.
스핀고신 키나제 또는 스핀고신 키나제를 포유류에서 분리된 생물학적 샘플에서 스크리닝하는 단계를 포함하는

포유류 질병 상태의 진단 또는 감시하는 방법.