DE60027295T2

DE60027295T2 - Sphingosinekinase

Info

Publication number: DE60027295T2
Application number: DE60027295T
Authority: DE
Inventors: Maxwell Stuart Norwood PITSON; Wolff Brian Belair WATTENBERG; Pu Magill XIA; James Richard Stonyfell D'ANDREA; Ruth Jennifer Stirling GAMBLE; Alexander Mathew Stirling VADAS
Original assignee: Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development LLC
Current assignee: Janssen Research and Development LLC
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: EP1192247A4; EP1192247A1; WO2000070028A1; KR100798375B1; NZ515132A; DK1192247T3; ES2261200T3; US20040132053A1; US6730480B1; DE60027295D1; EP1192247B9; EP1192247B1; KR20020000805A; JP2002543831A; ATE323153T1; US7112427B2; US20070071752A1; CA2372541A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen neue Protein-Moleküle und Derivate, Analoga, chemische Äquivalente und Mimetika hiervon, die in der Lage sind, die Zellaktivität zu modulieren und insbesondere die Zellaktivität über die Modulation der Signaltransduktion zu modulieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die humane Sphingosin-Kinase und Derivate, Analoga, chemische Äquivalente und Mimetika hiervon. Die vorliegende Erfindung zieht ebenfalls genetische Sequenzen, die die Protein-Moleküle und Derivate, Analoga, chemische Äquivalente und Mimetika hiervon kodieren in Erwägung. Die Moleküle der vorliegenden Erfindung sind in einer Auswahl therapeutischer, profilaktischer und diagnostischer Anwendungen nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bibliographische Details der Veröffentlichungen, auf die in dieser Beschreibung vom Verfasser verwiesen wird, sind am Ende der Beschreibung alphabetisch erfasst.
Die Sphingosin-Kinase ist ein Schlüssel-Regulator-Enzym bei einer Vielfalt von Zellantworten. Ihre Aktivität kann die Entzündung, Apoptose und Zellproliferation beeinflussen und somit ist sie ein wichtiges Ziel für therapeutische Eingriffe.
Für das Sphingosin-1-Phosphat ist bekannt, dass es ein wichtiger „Second-Messenger" in der Signaltransduktion (Meyer et al., 1997) ist. Es ist in verschiedenen Zelltypen mitogen (Alessenko, 1998; Spiegel et al., 1998) und scheint, einen mannigfaltigen Bereich wichtiger regulatorischer Wege zu triggern, einschließlich der Prävention der Ceramid-induzierten Apoptose (Culliver et al., 1996), Mobilisierung von intrazellulärem Calcium durch einen IP₃-unabhängigen Weg, Stimulierung der DNA-Synthese, Aktivierung des mitogen aktivierten Protein-(MAP)-Kinase-Weges, Aktivierung der Phospholipase D und Regulation der Zellbeweglichkeit (zur Übersicht siehe Meyer et al., 1997; Spiegel et al., 1998; Igarashi, 1997).
Neueste Studien (Xia et al., 1998) haben gezeigt, dass das Sphingosin-1-Phosphat ein obligatorisches Signal-Intermediat in der Entzündungsantwort vaskulärer Endothelial-Zellen auf den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) ist. Trotz seiner offensichtlichen Bedeutung ist sehr wenig über den Mechanismus bekannt, der die zellulären Level des Sphingosin-1-Phosphats kontrolliert. Es ist bekannt, dass die Level des Sphingosin-1-Phosphats in der Zelle größtenteils durch seine Bildung aus dem Sphingosin durch die Sphingosin-Kinase und im geringeren Maße durch seinen Abbau durch die mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziierte Sphingosin-1-Phosphat-Lyase und die Sphingosin-1-Phosphat-Phosphatase vermittelt wird (Spiegel et al., 1998). Die Basallevel des Sphingosin-1-Phosphats in der Zelle sind im Allgemeinen niedrig, können aber schnell und vorübergehend („transiently") ansteigen, wenn Zellen mitogenen Mitteln ausgesetzt werden. Diese Antwort scheint mit einer Erhöhung in der Sphingosin-Kinase-Aktivität im Cytosol korreliert zu sein und kann durch Zugabe der Sphingosin-Kinase-Inhibitor-Moleküle N,N-Dimethylsphingosin und DL-threo-Dihydrosphingosin verhindert werden. Dies zeigt, dass die Sphingosin-Kinase ein wichtiges Molekül ist, das für die Regulation der zellulären Level des Sphingosin-1-Phosphats verantwortlich ist. Dies stellt die Sphingosin-Kinase in eine zentrale und obligatorische Rolle im Vermitteln von Effekten, die dem Sphingosin-1-Phosphat in der Zelle zugeordnet werden.
Demgemäß besteht eine Notwendigkeit, neue Sphingosin-Kinase-Moleküle zu identifizieren und zu klonen, um den Fortschritt in Richtung der sensitiveren Kontrolle der intrazellulären Signaltransduktion über zum Beispiel die Aufklärung des Mechanismus, der die Expression und enzymatische Aktivität der Sphingosin-Kinase kontrolliert, zu fördern, wobei eine Basis für die Entwicklung invasiver Therapien zum Regulieren der Expression oder Aktivität der Sphingosin-Kinase bereitgestellt wird. In der Arbeit, die zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, haben die Erfinder ein neues Sphingosin-Kinase-Molekül gereinigt und kloniert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Beschreibung enthält die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzinformation, die unter Verwendung des Programms PatentIn Version 2.0 erstellt wurde, die hier nach der Bibliographie aufgeführt ist: Jede Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenz ist in der Sequenzauflistung durch den numerischen Indikator <210>, gefolgt von dem Sequenz-Identifikator (z.B. <210>1, <210>2, etc.), identifiziert. Die Länge, der Sequenztyp (DNA, Protein (PRT), etc.) und der Ursprungsorganismus für jede Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenz sind durch die Information angezeigt, die in den Feldern des numerischen Indikators <211>, <212> bzw. <213> angegeben sind. Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen, auf die in der Beschreibung verwiesen wird, werden durch die Information, die in den Feldern des numerischen Indikators <400> angegeben wird, gefolgt von dem Sequenz-Identifikator (z.B. <400>1, <400>2, etc.), definiert.
Überall in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen, welche folgen, wird, außer der Kontext erfordert es anders, das Wort „umfassen" und Variationen wie „umfasst" und „umfassend" so verstanden, dass die Einbeziehung einer angegebenen ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten, aber nicht den Ausschluss jeder anderen ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten implizieren.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül bereit, das eine Nukleotid-Sequenz umfasst, kodierend für oder komplementär zu einer Sequenz, die ein neues Sphingosin-Kinase-Protein kodiert, wobei das Nukleinsäure-Molekül die Sequenz SEQ. ID No: 1 umfasst.
Ein noch anderer weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Aminosäure-Sequenz bereit, dargelegt in <400>2.
Ein noch anderer weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Sphingosin-Kinase-Antagonisten, ausgewählt aus den Antisense-Nukleinsäuren, Antikörpern, RNA, DNAzymen und RNA-Aptameren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, charakterisiert durch eine Sphingosin-Kinase-Aktivität, wie der rheumatischen Arthritis, des Asthmas, der Arteriosklerose, der Meningitis, der multiplen Sklerose, des septischen Schocks, der Entzündung, Zellproliferation, Apoptose.
Ein- und Drei-Buchstaben-Abkürzungen, die durch die ganze Beschreibung verwendet werden, sind in Tabelle 1 definiert.
TABELLE 1 Ein- und Drei-Buchstaben-Abkürzungen der Aminosäuren
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung des „Sphingomyelin-Weges".
2 ist eine graphische Darstellung der Anionenaustausch-Chromatographie von humaner Sphingosin-Kinase. A, Anionenaustausch-Chromatographie mit der Q-Sepharose-Fast-Flow von der mit (NH₄)₂SO₄ präzipitierten Fraktion des humanen Plazenta-Extrakts, die zwei Peaks der Sphingosin-Kinase-Aktivität zeigt. Die Extrakte wurden in Puffer A aufgetragen und die Sphingosin-Kinase-Aktivität (•) wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M (----) eluiert. Eluiertes Protein wurde durch die Absorption bei 280 nm (–) verfolgt.
3 ist eine graphische Darstellung der Reinigung der humanen Plazenta-SK1 durch Anionenaustausch-Chromatographie. Die Reinigung auf einer Mono-Q-Säule wird durch Wiederauftragung und Elution von der gleichen Säule in Gegenwart von ATP verstärkt. A, Die Fraktionen von der Calmodulin-Sepharose-4b-Säule, die die Sphingosin-Kinase-Aktivität enthält, wurden gesammelt, entsalzt und auf die Mono-Q-Säule in Buffer A aufgetragen. B, Aktive Fraktionen von der Mono-Q-Säule wurden entsalzt und auf die Mono-Q-Säule in Buffer A mit 1 mM ATP und 4 mM MgCl₂ wieder aufgetragen. In beiden Fällen wurde die Sphingosin-Kinase-Aktivität (•) mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M (----) eluiert, wobei die Protein-Elution durch die Absorption bei 280 nm (–) verfolgt wurde.
4 ist eine Abbildung der SDS-PAGE der gereinigten humanen Plazenta-Sphingosin-Kinase. Die Fraktion von der Superdex-75-Säule, die die höchste Sphingosin-Kinase-Aktivität enthielt, wurde der SDS-PAGE mit Silber-Färbung unterzogen, was eine einzelne Bande von 45 kDa ergab.
5 ist eine graphische Darstellung der präparativen Anionenaustausch-Chromatographie. Nur eine einzelne chromatographisch identifizierte Sphingosin-Kinase-Isoform ist in HUVEC vorhanden. Präparative Anionenaustausch-Chromatographie mit HiTrap-Q-Säulen von humanen Plazenta-, HUVEC- und TNFα-behandelten HUVEC-Extrakten, die in HUVEC die Gegenwart eines einzelnen Sphingosin-Kinase-Peaks zeigt, der nach der Behandlung der Zellen mit TNFα an Aktivität zunimmt. Die Zellen wurden geerntet, lysiert und die löslichen Extrakte auf die HiTrap-Q-Säule in Puffer A aufgetragen. Die gesamte Sphingosin-Kinase-Aktivität in humanen Plazenta-, HUVEC- und TNFα-behandelten HUVEC-Extrakten betrug 51, 78 bzw. 136 U/mg Protein. Die Sphingosin-Kinase-Aktivität (•) wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M (----) eluiert.
6 ist eine schematische Darstellung der Strategie, die zum Klonieren der Sphingosin-Kinase (SPHK) aus HUVEC verwendet wurde.
7 ist eine schematische Darstellung der Nukleotid-(<400>1) und der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen (<400>2) und der mutmaßlichen Domänen-Struktur der humanen Sphingosin-Kinase. A, Die cDNA-Nukleinsäure-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der hSK. Die Aminosäuren sind ab dem ersten Methionin-Rest nummeriert. Das Stop-Codon ist durch ein Sternchen deutlich gemacht. Der die Sphingosin-Kinase kodierende Bereich ist in Großbuchstaben (Nukleotide 33–1187), während Kleinbuchstaben die untranslatierte und die Vektor-Sequenz anzeigen. B, Schematische Darstellung der humanen Sphingosin-Kinase, die die Orte der mutmaßlichen PKC- und CKII-Phosphorylierungsstellen, eine mögliche N-Myristoylierungsstelle, Calcium/Calmodulin-Bindemotive und die Bereiche mit Ähnlichkeit zu der mutmaßlichen katalytischen Domäne der DGK zeigt.
8 ist eine graphische Darstellung der Expression und TNFα-Stimulation der humanen Sphingosin-Kinase-Aktivität in HEK293-Zellen. HEK293-Zellen, die transient mit entweder dem leeren pcDNA-Expressionsvektor allein (A) oder mit der pcDNA, die die humane Sphingosin-Kinase-cDNA (B) enthielt, transfiziert waren. Transfizierte Zellen waren entweder unbehandelt oder wurden für 10 Min. mit TNFα behandelt, geerntet und die Sphingosin-Kinase-Aktivität in den Zell-Lysaten wurde bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte von Duplikaten und stellen drei unabhängige Experimente dar.
9 ist eine schematische Darstellung des Sequenzvergleichs der humanen Sphingosin-Kinase mit anderen bekannten und mutmaßlichen Sphingosin-Kinasen. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz der humanen Sphingosin-Kinase mit den Aminosäure- Sequenzen der Sphingosin-Kinasen aus Maus (mSK1a und mSK1b; Kohama et al., 1998) und S. cerevisiae (LCB4 und LCB5; Nagiec et al., 1998) und den EST-Sequenzen der mutmaßlichen Sphingosin-Kinasen aus S. pombe und C. elegans (Genbank^TM – Zugangsnummern Z98762 bzw. Z66494). Obwohl die Ähnlichkeit der Aminosäure-Sequenz zu der humanen Sphingosin-Kinase hoch war (36% Identität), gab die mutmaßliche Sphingosin-Kinase-Sequenz von A. thaliana (Genbank^TM – Zugangsnummer AL022603) eine relativ schwache Anpassung und wird wegen der Klarheit nicht gezeigt. Die Konsensus-Sequenz stellt die Aminosäuren dar, die in mindestens sechs von den sieben angeordneten Sequenzen konserviert sind, während die Konservierung von strukturell ähnlichen Aminosäuren mit einem Sternchen angezeigt ist. Die Mehrfach-Sequenz-Anordnung wurde mit CLUSTALW durchgeführt und der Prozentsatz der Identitäten zu der humanen Sphingosin-Kinase wurde unter Verwendung des GAP-Algorithmus (Needleman & Wunsch, 1970) bestimmt.
10 ist eine Abbildung der Expression der rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase in E. coli BL21. E. coli BL21 wurde mit dem Expressionskonstrukt aus pGEX4-2T und humaner Sphingosin-Kinase transformiert und die Expression des GST-SK-Fusionsprotein nach der Induktion mit 100 μM IPTG analysiert. A, Die Sphingosin-Kinase-Aktivität in nicht induzierten und IPTG-induzierten E. coli BL21-Zellextrakten. B, Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das die Expression des GST-SK-Fusionsproteins in E. coli-Zell-Lysaten zeigt. C, Die Reinheit der isolierten rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase. Die Fraktion von der Mono-Q-Säule, die die Sphingosin-Kinase-Aktivität enthielt, wurde auf eine SDS-PAGE mit Silber-Färbung aufgetragen, was eine einzelne Bande von 45 kDa ergab.
11 ist eine Abbildung der Reinigung der rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase. Calmodulin-Sepharose-4B ermöglicht die Trennung des aktiven und inaktiven Enzyms. Das GST-SK-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-4B teilweise gereinigt, durch Thrombin geschnitten und auf die Calmodulin-Sepharose-4B-Säule in Puffer B, der 4 mM CaCl₂ enthielt, aufgetragen. Die Elution (↓) der aktiven Sphingosin-Kinase, die an der Säule gebunden war, wurde mit Buffer A, enthaltend 2 mM EGTA und 1 M NaCl, durchgeführt. A, Die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen, die von der Calmodulin-Sepharose-4B-Säule eluiert wurden. B, Die Sphingosin-Kinase-Aktivität (|) in den Säulenfrak tionen, die das meiste des rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase-Proteins zeigten, band nicht an die Säule und zeigte keine katalytische Aktivität.
12 ist eine graphische Darstellung der physiko-chemischen Eigenschaften der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen. A, pH-Optima. Der pH-Effekt auf die SK-Aktivität wurde durch Untersuchen der Aktivität über den pH-Bereich von 4 bis 11 in 50 mM Puffern (Natriumacetat, pH 4,0–5,0; Mes, pH 6,0–7,0; Hepes, pH 7,0–8,2; Tris/HCl, pH 8,2–10,0; Caps, pH 10,0–11,0) bestimmt. B, pH-Stabilität. Die gezeigten Daten sind die SK-Aktivität, die nach der Vorinkubation der Enzyme bei verschiedenen pH-Werten bei 4°C während 5 Std. verblieb. C, Temperatur-Stabilität. Die gezeigten Daten sind die SK-Aktivität, die nach der Vorinkubation der Enzyme bei verschiedenen Temperaturen (4 bis 80°C) während 30 Min. bei pH 7,4 (50 mM Tris/HCl, enthaltend 10% Glycerin, 0,5 M NaCl und 0,05% Triton X-100) verblieb. D, Erfordernis nach Metall-Ionen. Die verschiedenen Metall-Ionen oder EDTA wurden in die Versuchsmischung bei einer Endkonzentration von 10 mM bereitgestellt. In allen Fällen wurden die maximalen Aktivitäten der nativen (• und gefüllte Balken) und rekombinanten (o und offene Balken) Sphingosin-Kinasen willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU. Die Daten sind Mittelwerte ± S. A.
13 ist eine graphische Darstellung der Substrat-Spezifität und -kinetiken der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen. A, Die Substrat-Spezifität der nativen (gefüllte Balken) und rekombinanten (offene Balken) Sphingosin-Kinasen mit Sphingosin-Analoga und anderen Lipiden, die mit 100 μM in 0,25% Triton X-100 bereitgestellt wurden. Die Raten der Sphingosin-Phosphorylierung durch die nativen und rekombinanten Sks wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechend 2,65 kU bzw. 7,43 kU. Die Aktivität gegen andere wirksame Substrate wurde relativ zu der Aktivität gegen Sphingosin ausgedrückt. Keine Phosphorylierung wurde mit DL-threo-Dihydrosphingosin, N,N-Dimethylsphingosin, N,N,N,-Trimethylsphingosin, N-Acetylsphingosin (C₂-Ceramid), Diacylglycerin (1,2-Dioctanoyl-sn-Glycerin und 1,2-Dioleoyl-sn-Glycerin) und Phosphatidylinositol beobachtet. B, Die Substrat-Kinetiken der rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase mit Sphingosin (•) und D-erythro-Dihydrosphingosin (o) als Substraten. C, Die Kinetiken der Inhibierung der rekombinanten humanen Sphingosin-Kinase mit N,N,N-Trimethylsphingosin bei 5 μM (o) und 25 μM (
) und in Abwesenheit von N,N,N-Trimethylsphingosin (•). Einfügung: Lineweaver-Burk-Plot. Die Daten sind Mittelwerte ± S. A.
14 ist eine graphische Darstellung der sauren Phospholipide, welche die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen stimulieren. Der Effekt der verschiedenen Phospholipide auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurde durch Untersuchen der Aktivität unter Standardbedingung in Gegenwart dieser Phospholipide bei 10 mol-% Triton X-100 bestimmt. Die Aktivitäten der nativen (gefüllte Balken) und rekombinanten (offene Balken) Sphingosin-Kinasen in Abwesenheit von Phospholipiden wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU. PC, Phosphatidylcholin; PS, Phosphatidylserin; PE, Phosphatidylethanolamin; PI, Phosphatidylinositol; PA, Phosphatidsäure. Die Daten sind Mittelwerte ± S. A.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist teilweise auf der Reinigung und Klonierung eines neuen Sphingosin-Kinase-Molekül begründet. Die Identifizierung dieses neuen Moleküls gestattet die Identifizierung und die vernünftige Konzipierung einer Auswahl an Produkten für die Verwendung in der Therapie, Diagnose und Antikörper-Erzeugung, zum Beispiel zur Verwendung in der Signal-Transduktion. Diese therapeutischen Moleküle können ebenfalls entweder als Antagonisten oder Agonisten der Sphingosin-Kinase-Funktion agieren und werden u.a. in der Modulation der Zellaktivierung in der Behandlung von Krankheitszuständen, die durch ungewollte Zellaktivität charakterisiert sind, nützlich sein.
Dementsprechend stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül oder Derivat oder Analogon hiervon bereit, das eine Nukleotid-Sequenz, kodierend für oder komplementär zu einer Sequenz, die ein neues Sphingosin-Kinase-Protein oder ein Derivat oder Mimetikum des Sphingosin-Kinase-Proteins kodiert, umfasst.
Der Verweis auf „Sphingosin-Kinase" sollte als ein Verweis auf das Molekül verstanden werden, welches u.a. in der Erzeugung des Sphingosin-1-Phosphats während der Aktivierung des Sphingosin-Kinase-Signalweges involviert ist. Der Verweis auf „Sphingosin-Kinase" im kursiv geschriebenen Text sollte als ein Verweis auf das Sphingosin-Kinase-Nukleinsäure-Molekül verstanden werden. Der Verweis auf „Sphingosin-Kinase" in nicht kursiv geschriebenem Text sollte als ein Verweis auf das Sphingosin-Kinase-Protein-Molekül verstanden werden.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül oder Derivat oder Analogon hiervon bereit, das eine Nukleotid-Sequenz, kodierend für oder komplementär zu einer Sequenz, die ein humanes Sphingosin-Kinase-Protein oder ein Derivat oder Mimetikum des Sphingosin-Kinase-Proteins kodiert, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäure-Molekül oder Derivat oder Analogon hiervon bereit, das eine Nukleinsäure-Sequenz, kodierend für oder eine Nukleotid-Sequenz komplementär zu einer Nukleotid-Sequenz umfasst, die eine Aminosäure-Sequenz, im Wesentlichen wie in <400>2 dargelegt, kodiert.
Der Term „Ähnlichkeit", wie hierin verwendet, beinhaltet exakte Identität zwischen den verglichenen Sequenzen auf dem Nukleotid- oder Aminosäure-Level. Sofern Nicht-Identität auf dem Nukleotid-Level vorkommt, beinhaltet „Ähnlichkeit" die Unterschiede zwischen Sequenzen, welche in unterschiedlichen Aminosäuren resultieren, die auf den strukturellen, funktionellen, biochemischen und/oder Konformations-Leveln dennoch zueinander verwandt sind. Wenn Nicht-Identität auf dem Aminosäure-Level vorkommt, beinhaltet „Ähnlichkeit" die Aminosäuren, die auf den strukturellen, funktionellen, biochemischen und/oder Konformations-Leveln dennoch zueinander verwandt sind. Der Prozentsatz der Ähnlichkeit kann größer als 50%, wie mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder höher, sein.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Nukleinsäure-Molekül oder Derivat oder Analogon hiervon, das eine Nukleotid-Sequenz, im Wesentlichen wie in <400>1 dargelegt, umfasst.
Der Verweis hier auf eine niedrige Stringenz beinhaltet und umfasst von mindestens etwa 0% Vol./Vol. bis mindestens etwa 15% Vol./Vol. Formamid und von mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz für die Hybridisierung und mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz für die Waschbedingungen. Alternative Stringenz-Bedingungen können, sofern notwendig, angewendet werden, wie die mittlere Stringenz, welche beinhaltet und umfasst von mindestens etwa 16% Vol./Vol. bis mindestens etwa 30% Vol./Vol. Formamid und von mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz für die Hybridisierung und mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz für die Waschbedingungen beinhaltet und umfasst, oder die hohe Stringenz, welche von mindestens etwa 31% Vol./Vol. bis mindestens etwa 50% Vol./Vol. Formamid und von mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz für die Hybridisierung und mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz für die Waschbedingungen beinhaltet und umfasst. Die Stringenz kann unter Verwendung eines Temperaturbereichs, wie von etwa 40°C bis etwa 65°C, gemessen werden. Besonders geeignete Stringenz-Bedingungen sind bei 42°C.
Insbesondere zieht die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäure-Molekül in Erwägung, das eine Sequenz von Nukleotiden, im Wesentlichen wie in <400>1 dargelegt ist, umfasst.
Das Nukleinsäure-Molekül gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung entspricht hier der humanen Sphingosin-Kinase. Ohne die vorliegende Erfindung auf irgendeine Funktionstheorie oder Funktionsweise zu beschränken, ist das Protein, das durch die Sphingosin-Kinase kodiert wird, ein Schlüsselelement in der Funktion des Sphingosin-Kinase-Signalweges. Die Sphingosin-Kinase agiert, um die Erzeugung des „Second-Messengers", Sphingosin-1-Phosphat, zu ermöglichen, und kann aktiviert werden durch:

(a) Post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder proteolytische Spaltung;
(b) Protein-Protein-Interaktionen, wie Dimerisierung, und G-Protein-gekoppelte Rezeptor-vermittelte Interaktionen;
(c) Translokations-Ereignisse, in denen das Enzym auf eine Umgebung gerichtet ist, die die katalytische Aktivität erhöht oder den Zugang zu seinem Substrat gestattet.

Das Expressionsprodukt des humanen Sphingosin-Kinase-Nukleinsäure-Moleküls ist die humane Sphingosin-Kinase. Die Sphingosin-Kinase ist über die Aminosäure-Sequenz, dargelegt in <400>2, definiert. Die cDNA-Sequenz für die Sphingosin-Kinase ist durch die Nukleotid-Sequenz, dargelegt in <400>1, definiert. Das Nukleinsäure-Molekül, das Sphingosin-Kinase kodiert, ist vorzugsweise eine Sequenz der Desoxyribonukleinsäure, wie eine cDNA-Sequenz oder eine genomische Sequenz. Eine genomische Sequenz kann auch Exons und Introns umfassen. Eine genomische Sequenz kann ferner einen Promoter-Bereich oder andere regulatorische Bereiche beinhalten.
Der Verweis hierin auf die Sphingosin-Kinase und die Sphingosin-Kinase sollte als ein Verweis auf alle Formen der humanen Sphingosin-Kinase bzw. Sphingosin-Kinase verstanden werden, einschließlich zum Beispiel aller beliebigen Peptid- und cDNA-Isoformen, welche aus dem alternativen „Splicing" der Sphingosin-Kinase-mRNA entstehen, der Mutanten oder polymorpher Varianten der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase, der post-translational modifizierten Form der Sphingosin-Kinase oder der nicht post-translational modifizierten Form der Sphingosin-Kinase. Der Verweis hier auf die Sphingosin-Kinase und die Sphingosin-Kinase beinhaltet den Verweis auf Derivate, Analoga, chemische Äquivalente und Mimetika hiervon, in dem Umfang, dass es nicht spezifiziert wird.
Das Protein und/oder Gen stammt vorzugsweise aus dem Menschen. Dennoch kann das Protein und/oder Gen ebenfalls aus anderen tierischen oder nicht-tierischen Arten isoliert werden.
Die Derivate beinhalten Fragmente, Teile, Anteile, Mutanten, Varianten und Mimetika aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quellen, einschließlich der Fusionsproteine. Die Teile oder Fragmente beinhalten, zum Beispiel, aktive Bereiche der Sphingosin-Kinase. Die Derivate können aus der Insertion, Deletion oder Substitution von Aminosäuren abgeleitet sein. Aminosäure-Insertions-Derivate umfassen sowohl Amino- und/oder Carboxylterminale Fusionen als auch Intra-Sequenz-Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Die Insertions-Varianten der Aminosäure-Sequenz sind solche, in welchen eine oder mehrere Aminosäure-Reste an einer vorbestimmten Stelle in dem Protein eingeführt sind, obgleich zufällige Insertion mit einem geeigneten Screening des resultierenden Produkts ebenfalls möglich ist. Die Deletions-Varianten sind charakterisiert durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der Sequenz. Die Substitutions-Varianten der Aminosäuren sind solche, in welchen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein unterschiedlicher Rest an dessen Stelle eingeführt wurde. Ein Beispiel für Substitutions- Varianten der Aminosäuren sind konservative Aminosäure-Substitutionen. Konservative Aminosäure-Substitutionen beinhalten typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin und Alanin; Valin, Isoleucin und Leucin; Asparaginsäure und Glutaminsäure; Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Arginin und Phenylalanin und Tyrosin. Einfügungen in Aminosäure-Sequenzen beinhalten Fusionen mit anderen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen.
Chemische und funktionelle Äquivalente der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase sollten als Moleküle verstanden werden, die eine beliebige oder mehrere der funktionellen Aktivitäten der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase aufweisen, und können aus jeder beliebigen Quelle abgeleitet sein können, wie chemisch synthetisiert oder über Screening-Verfahren, wie dem Screening nach natürlichen Produkten, identifiziert zu sein.
Die Derivate der Sphingosin-Kinase beinhalten Fragmente, die besondere Epitope oder Teile des vollständigen Sphingosin-Kinase-Proteins, fusioniert an Peptide, Polypeptide oder andere proteinische oder nicht proteinische Moleküle, aufweisen.
Die Analoga der Sphingosin-Kinase, die hier in Erwägung gezogen werden, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, die Modifikation an Seitenketten, der Einbau unnatürlicher Aminosäuren und/oder ihrer Derivate während der Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsynthese und die Verwendung von Vernetzern und anderen Verfahren, welche Konformationszwänge auf die proteinischen Moleküle oder ihre Analoga ausüben.
Die Derivate der Nukleinsäure-Sequenzen können in ähnlicher Weise aus Einfach- oder Mehrfach-Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Additionen, einschließlich der Fusion mit anderen Nukleinsäure-Molekülen, abgeleitet sein. Die Derivate der Nukleinsäure-Moleküle der vorliegenden Erfindung beinhalten Oligonukleotide, PCR-Primer, Antisense-Moleküle, Moleküle, geeignet für die Verwendung in der Kosuppression und Fusion von Nukleinsäure-Molekülen. Die Derivate der Nukleinsäure-Sequenzen beinhalten ebenfalls degenerierte Varianten.
Beispiele für Seitenketten-Modifikationen, die durch die vorliegende Erfindung in Erwägung gezogen betrachtet werden, beinhalten Modifikationen der Aminogruppen, wie durch re duktive Alkylierung durch die Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von der Reduktion mit NaBH₄; die Amidierung mit Methylacetimidat; die Acetylierung mit Acetanhydrid; die Carbamoylierung der Aminogruppen mit Cyanat; die Trinitrobenzylierung der Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS); die Acylierung von Aminogruppen mit Succinanhydrid und Tetrahydrophthalanhydrid; und die Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5-phosphat, gefolgt von der Reduktion mit NaBH₄.
Die Guanidin-Gruppe der Arginin-Reste kann durch die Bildung von heterozyklischen Kondensationsprodukten mit Reagenzien wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert sein.
Die Carboxyl-Gruppe kann durch Carbodiimid-Aktivierung über O-Acylisoharnstoffbildung, gefolgt von nachfolgender Derivatisierung, zum Beispiel zu einem entsprechenden Amid, modifiziert sein.
Die Sulfhydryl-Gruppen können durch Verfahren wie Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder Iodacetamid; Perameisensäure-Oxidation zur Cysteinsäure; die Bildung eines gemischten Disulfids mit anderen Thiol-Verbindungen; die Reaktion mit Maleimid, Maleinanhydrid oder anderem substituierten Maleimid; die Bildung von Mercuri-Derivaten, unter Verwendung von 4-Chloromerkuribenzoat, 4-Chloromerkuriphenylsulfonsäure, Phenylmerkurichlorid, 2-Chloro-merkuri-4-nitrophenol und anderen Quecksilbermittel; Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH modifiziert sein.
Die Tryptophan-Reste können zum Beispiel durch Oxidation mit N-Bromosuccinimid oder Alkylierung des Indol-Rings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulfenyl-Halogeniden modifiziert sein. Die Tyrosin-Reste können andererseits durch Nitrierung mit Tetranitromethan verändert werden, um ein 3-Nitrotyrosin-Derivat zu bilden.
Die Modifizierung des Imidazol-Rings eines Histidin-Restes kann durch Alkylierung mit Iodessigsäure-Derivaten oder N-Carboethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat erreicht werden.
Beispiele für das Einbringen unnatürlicher Aminosäuren und Derivate während der Protein-Synthese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, die Verwendung von Norleucin, 4-Amino-Butansäure, 4-Amino-3-hydroxy-5-phenylpentansäure, 6-Aminohexansäure, t-Butylglycin, Norvalin, Phenylglycin, Ornithin, Sarcosin, 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, 2-Thienylalanin und/oder D-Isomere von Aminosäuren. Eine Liste von unnatürlichen Aminosäuren, die hier in Erwägung gezogen werden, ist in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
Vernetzer können, zum Beispiel, verwendet werden, um die 3D-Konformationen unter Verwendung von homo-bifunktionellen Vernetzern, wie den bifunktionellen Imidoestern, die (CH₂)_n-Abstandsgruppen mit n = 1 bis n = 6 aufweisen, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidestern und hetero-bifunktionellen Reagenzien, welche gewöhnlich ei nen Amino-reaktiven Rest wie N-Hydroxysuccinimid und einen reaktiven Rest, spezifisch für anderen Gruppe, enthalten, zu stabilisieren.
Das Nukleinsäure-Molekül der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise in isolierter Form oder in einem Vektor, wie einem Expressionsvektor, ligiert, vor. Mit „isoliert" ist ein Nukleinsäure-Molekül gemeint, das mindestens einem Reinigungsschritt unterzogen wurde und dies ist in geeigneter Weise definiert, zum Beispiel, durch eine Zusammensetzung, umfassend mindestens etwa 10% des vorliegenden Nukleinsäure-Moleküls, vorzugsweise mindestens etwa 20%, bevorzugter mindestens etwa 30%, am bevorzugtesten mindestens etwa 40–50%, sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 60–70%, aber sogar noch mehr bevorzugt 80–90% oder mehr des vorliegenden Nukleinsäure-Moleküls, relativ zu anderen Komponenten, wie durch das Molekulargewicht, die kodierende Aktivität, die Nukleotid-Sequenz, die Grundzusammensetzung oder andere geeignete Mittel bestimmt. Das Nukleinsäure-Molekül der vorliegenden Erfindung kann in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls als biologisch rein betrachtet werden.
Der Term „Protein" sollte so verstanden werden, dass er Peptide, Polypeptide und Proteine umfasst. Das Protein kann glykosyliert oder unglykosyliert sein und/oder kann eine Auswahl an anderen Molekülen, wie Aminosäuren, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, enthalten, die mit dem Protein fusioniert, vernetzt, gebunden oder auf andere Weise assoziiert sind. Der Verweis hier auf „Protein" beinhaltet sowohl ein Protein, das eine Sequenz aus Aminosäuren umfasst, als auch ein Protein, das mit anderen Molekülen, wie Aminosäuren, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, assoziiert ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotid-Sequenz, die der Sphingosin-Kinase entspricht, eine cDNA-Sequenz, die eine Sequenz aus Nukleotiden, wie in <400>1 dargelegt, umfasst oder ein Derivat oder Analogon hiervon, einschließlich einer Nukleotid-Sequenz, die Ähnlichkeit zu <400>1 aufweist.
Ein Derivat eines Nukleinsäure-Moleküls der vorliegenden Erfindung beinhaltet ebenfalls ein Nukleinsäure-Molekül, das in der Lage ist, an eine Nukleotid-Sequenz, wie in <400>1 dargelegt, unter niedrigen Stringenz-Bedingungen zu hybridisieren. Vorzugsweise liegt niedrige Stringenz bei 42°C vor.
Das Nukleinsäure-Molekül kann an einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, in einer prokaryontischen Zelle (z.B. E. coli) oder einer eukaryontischen Zelle (z.B. Hefe-Zellen, Pilz-Zellen, Insekten-Zellen, Säugetier-Zellen oder Pflanzen-Zellen) zu exprimieren, ligiert sein. Das Nukleinsäure-Molekül kann ligiert oder fusioniert oder auf andere Weise mit einem Nukleinsäure-Molekül assoziiert sein, das eine andere Einheit, wie zum Beispiel ein Signalpeptid, kodiert. Es kann ebenfalls zusätzliche Nukleotid-Sequenzinformation umfassen, die fusioniert, verbunden oder in einer anderen Weise mit ihm entweder an den 3'- oder 5'-terminalen Teilen oder an sowohl den 3'- als auch 5'-terminalen Teilen assoziiert ist. Das Nukleinsäure-Molekül kann ebenfalls ein Teil eines Vektors, wie eines Expressionsvektors, sein. Die letzte Ausführungsform ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Formen der Sphingosin-Kinase, wobei diese Formen durch die vorliegende Erfindung umfasst werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf das Expressionsprodukt der Nukleinsäure-Moleküle, wie hier zuvor definiert.
Das Expressionsprodukt ist die Sphingosin-Kinase, die eine Aminosäure-Sequenz, dargelegt in <400>2, aufweist oder ein Derivat, Analogon oder chemisches Äquivalent oder Mimetikum hiervon, wie oben definiert, oder ein Derivat oder Mimetikum, das eine Aminosäure-Sequenz von mindestens etwa 45% Ähnlichkeit zu mindestens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren in der Aminosäure-Sequenz, wie in <400>2 dargelegt, oder einem Derivat oder Mimetikum hiervon aufweist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein isoliertes Protein gerichtet, ausgewählt aus der Liste, bestehend aus:

(i) einem neuen Sphingosin-Kinase-Protein oder einem Derivat, Analogon, chemischen Äquivalent oder Mimetikum hiervon;
(ii) einem humanem Sphingosin-Kinase-Protein oder einem Derivat, Analogon, chemischen Äquivalent oder Mimetikum hiervon;
(iii) einem Protein mit einer Aminosäure-Sequenz, im Wesentlichen wie in <400>2 dargelegt, oder einem Derivat oder Mimetikum hiervon oder einer Sequenz mit mindestens etwa 45% Ähnlichkeit zu mindestens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren in <400>2 oder einem Derivat, Analogon, chemischen Äquivalent oder Mimetikum des Proteins;
(iv) einem Protein, das durch eine Nukleotid-Sequenz, im Wesentlichen wie in <400>1 dargelegt, kodiert wird, oder einem Derivat oder Analogon hiervon oder einer Sequenz, die eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens etwa 45% Ähnlichkeit zu mindestens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren in <400>2 oder einem Derivat, Analogon, chemischen Äquivalent oder Mimetikum des Proteins aufweist, kodiert;
(v) einem Protein, das durch ein Nukleinsäure-Molekül kodiert wird, das in der Lage ist, an die Nukleotid-Sequenz, wie in <400>1 dargelegt, oder ein Derivat oder Analogon hiervon unter niedrigen Stringenz-Bedingungen zu hybridisieren, und welches eine Aminosäure-Sequenz, im Wesentlichen wie in <400>2 dargelegt, oder ein Derivat oder Mimetikum hiervon oder eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens etwa 45% Ähnlichkeit zu mindestens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren in <400>2 aufweist, kodiert;
(vi) einem Protein, wie in den Absätzen (i) oder (ii) oder (iii) oder (iv) oder (v) definiert, in einer homodimeren Form, und
(vii) einem Protein, wie in den Absätzen (i) oder (ii) oder (iii) oder (iv) oder (v) definiert, in einer heterodimeren Form.

Das Protein der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise in isolierter Form vor. Mit „isoliert" ist ein Protein gemeint, das mindestens einem Reinigungsschritt unterzogen wurde und dies ist in geeigneter Weise definiert, zum Beispiel, durch eine Zusammensetzung, um fassend mindestens etwa 10% des vorliegenden Proteins, vorzugsweise mindestens etwa 20%, bevorzugter mindestens etwa 30%, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 40–50%, sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 60–70%, aber sogar noch mehr bevorzugt 80–90% oder mehr des vorliegenden Proteins, relativ zu anderen Komponenten, wie durch das Molekulargewicht, die Aminosäure-Sequenz oder andere geeignete Mittel bestimmt. Das Protein der vorliegenden Erfindung kann, in einer bevorzugten Ausführungsform, ebenfalls als biologisch rein betrachtet werden.
Die Sphingosin-Kinase der vorliegenden Erfindung kann in einer multimeren Form vorliegen, wobei gemeint ist, dass zwei oder mehrere Moleküle zusammen assoziiert sind. Sofern die gleichen Sphingosin-Kinase-Moleküle zusammen assoziiert sind, ist der Komplex ein Homomultimer. Ein Beispiel eines Homomultimers ist ein Homodimer. Sofern mindestens eine Sphingosin-Kinase mit mindestens einem Nicht-Sphingosin-Kinase-Molekül assoziiert ist, dann ist der Komplex ein Heteromultimer, wie ein Heterodimer.
Die Fähigkeit, rekombinante Sphingosin-Kinase herzustellen, gestattet die Herstellung der Sphingosin-Kinase in großen Mengen für die kommerzielle Verwendung. Für die Sphingosin-Kinase kann es notwendig sein, dass sie als Teil eines großen Peptids, Polypeptids oder Proteins hergestellt wird, welches so verwendet werden kann, wie es ist, oder für welches es zuerst notwendig sein kann, dass es prozessiert wird, um fremde proteinische Sequenzen zu entfernen. Eine solche Prozessierung beinhaltet die Verdauung mit Proteasen, Peptidasen, Amidasen oder einer Auswahl an chemischen, elektrochemischen, Schall- oder mechanischen Spaltungstechniken.
Obwohl die vorliegende Erfindung rekombinante Proteine umfasst, werden ebenfalls chemische synthetische Techniken in der Synthese der Sphingosin-Kinase bevorzugt.
Die Sphingosin-Kinase gemäß der vorliegenden Erfindung wird in geeigneter Weise synthetisiert, basierend auf Molekülen, die aus dem Menschen isoliert werden. Die Isolierung der humanen Moleküle kann durch jedes beliebige geeignete Mittel, wie durch die chromatographische Trennung, zum Beispiel unter Verwendung der CM-Zellulose-Ionenaustausch-Chromatographie, gefolgt von der Sephadex-(z.B. G-50-Säule)-Filtration, erreicht werden. Viele andere Techniken sind verfügbar, einschließlich u.a. HPLC, PAGE.
Die Sphingosin-Kinase kann durch die Festphasen-Synthese unter Verwendung der Fmoc-Chemie, wie durch Carpino et al. (1991) beschrieben, synthetisiert werden. Die Sphingosin-Kinase und Fragmente hiervon können ebenfalls durch alternative Chemie-Techniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die t-Boc-Chemie, wie in Stewart et al. (1985) beschrieben, oder durch klassische Verfahren der Flüssigphasen-Peptid-Synthese synthetisiert werden.
Ohne die Funktionstheorie oder die Funktionsweise der vorliegenden Erfindung zu beschränken, ist die Sphingosin-Kinase ein Schlüssel-Regulator-Enzym in der Aktivität des Sphingosin-Kinase-Signalweges. Mit „Sphingosin-Kinase-Signalweg" ist ein Signalweg gemeint, welcher eine oder beide aus der Sphingosin-Kinase und/oder dem Sphingosin-1-Phosphat verwendet. Es wird angenommen, dass eine Sphingosin-Kinase-Signalweg-Kaskade, welche in der Expression des Adhesionsmoleküls resultiert, die folgende Form annehmen kann:

(i) die Erzeugung des Ceramids aus dem Sphingomyelin über die S. Mase-Aktivität, wobei das Ceramid in das Sphingosin umgewandelt wird;
(ii) die Erzeugung des Sphingosin-1-Phosphats (hiernach verwiesen auf als „Sph-1-P") durch Stimulierung der Sphingosin-Kinase, und
(iii) die Aktivierung von MEK/ERK und der Kern-Translokation von NF-κB, downstream der Sph-1-P-Erzeugung.

Für den Sphingosin-Kinase-Signalweg ist es bekannt, dass er Zellaktivitäten, wie solche, welche zur Entzündung, Apoptose und Zellproliferation führen, reguliert. Zum Beispiel, die Hochregulation der Herstellung von Entzündungs-Vermittlern, wie Cytokinen, Chemokinen, eNOS, und die Hochregulation der Expression des Adhesionsmoleküls. Die Hochregulation kann durch eine Anzahl an Reizmitteln („stimuli"), einschließlich, zum Beispiel, der Entzündungs-Cytokine, wie des Tumor-Nekrose-Faktors α (TNFα) und Interleukins-1 (IL-1), Endotoxins, oxidierter oder modifizierter Lipide, der Strahlung oder Gewebsverletzung, induziert werden.
Die Klonierung und Sequenzierung dieser Gene und seiner Expressionsprodukte stellen jetzt zusätzliche Moleküle für die Verwendung in der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Krankheiten bereit, die durch ungewollte Zellaktivität charakterisiert sind, welche Aktivität jetzt entweder direkt oder indirekt über die Aktivität des Sphingosin-Kinase-Signalweges moduliert wird. Bespiele von Krankheiten, die die ungewollte Sphingosin-Kinase-regulierte Zellaktivität einbeziehen, beinhalten die rheumatische Arthritis, das Asthma, die Arteriosklerose, Meningitis, multiple Sklerose und den septischen Schock. Demgemäß zieht die vorliegende Erfindung die therapeutischen und prophylaktischen Verwendungen der Sphingosin-Kinase-Aminosäure- und -Nukleinsäure-Moleküle, zusätzlich zu Sphingosin-Kinase-agonistischen und -antagonistischen Mitteln für die Regulation der zellulären funktionellen Aktivität, wie zum Beispiel die Regulation der Entzündung in Erwägung.
Die vorliegende Erfindung zieht deshalb ein Verfahren zum Modulieren der Expression der Sphingosin-Kinase in einem Probanden in Erwägung, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen des Sphingosin-Kinase-Gens mit einer wirksamen Menge eines Mittels für eine Dauer und unter Bedingung, die zum Hochregulieren oder Herunterregulieren oder zum Modulieren der Expression der Sphingosin-Kinase in einer anderen Weise ausreichend sind, umfasst. Zum Beispiel können Sphingosin-Kinase-Antisens-Sequenzen, wie Oligonukleotide, in eine Zelle eingeführt werden, um eine oder mehrere spezifische funktionelle Aktivitäten dieser Zelle herunterzuregulieren. Umgekehrt kann ein Nukleinsäure-Molekül, das die Sphingosin-Kinase oder ein Derivat hiervon kodiert, eingeführt werden, um eine oder mehrere spezifische funktionelle Aktivitäten jeder beliebigen Zelle, die das endogene Sphingosin-Kinase-Gen nicht exprimiert, hochzuregulieren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung erwägt ein Verfahren zum Modulieren der Sphingosin-Kinase-Aktivität in einem Säugetier, wobei das Verfahren das Verabreichen einer modulierenden, wirksamen Menge eines Mittels für eine Dauer und unter Bedingung, die ausreichend sind, um die Sphingosin-Kinase-Aktivität zu erhöhen oder zu erniedrigen, an ein Säugetier umfasst.
Die Modulation der Aktivität durch die Verabreichung eines Mittels an ein Säugetier kann durch eine oder verschiedene Techniken, einschließlich, aber in keiner Weise beschränkt auf, das Einführen eines proteinartigen oder nicht proteinartigen Moleküls in ein Säugetier, erreicht werden, wobei das Molekül:

(i) die Expression der Sphingosin-Kinase moduliert;
(ii) als ein Antagonist der Sphingosin-Kinase fungiert;
(iii) als ein Agonist der Sphingosin-Kinase fungiert.

Das proteinartige Molekül kann aus natürlichen oder rekombinanten Quellen, einschließlich der Fusionsproteine, oder nach zum Beispiel dem Screening nach natürlichen Produkten stammen. Das nicht proteinartige Molekül kann zum Beispiel ein Nukleinsäure-Molekül sein oder kann aus natürlichen Quellen, wie zum Beispiel dem Screening nach natürlichen Produkten, stammen oder kann chemisch synthetisiert sein. Die vorliegende Erfindung zieht chemische Analoga der Sphingosin-Kinase oder kleine Moleküle, die in der Lage sind, als Agonisten oder Antagonisten der Sphingosin-Kinase zu agieren, in Erwägung. Chemische Agonisten müssen nicht notwendiger Weise von der Sphingosin-Kinase stammen, können aber bestimmte Konformations-Ähnlichkeiten teilen. Alternativ können chemische Agonisten spezifisch konstruiert sein, um bestimmte physiochemische Eigenschaften der Sphingosin-Kinase nachzuahmen. Die Agonisten können jede beliebige Verbindung sein, die in der Lage ist, die Sphingosin-Kinase zu blockieren, zu inhibieren oder in einer anderen Weise am Ausführen ihrer normalen biologischen Funktion zu hindern. Die Antagonisten beinhalten monoklonale Antikörper, die für die Sphingosin-Kinase spezifisch sind, oder Teile der Sphingosin-Kinase und „Antisense"-Nukleinsäuren, welche die Transkription oder Translation der Sphingosin-Kinase-Gene oder der mRNA in Säugetier-Zellen verhindern. Die Modulation der Sphingosin-Kinase-Expression kann ebenfalls durch Benutzen von Antigenen, RNA, Ribosomen, DNAzymen, RNA-Aptameren oder Antikörpern erreicht werden.
Das proteinartige oder nicht proteinartige Molekül kann entweder direkt oder indirekt agieren, um die Expression der Sphingosin-Kinase oder die Aktivität der Sphingosin-Kinase zu modulieren. Das Molekül agiert direkt, wenn es mit der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase assoziiert, um die Expression oder die Aktivität der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase zu modulieren. Das Molekül agiert indirekt, wenn es mit einem anderen Molekül als die Sphingosin-Kinase oder die Sphingosin-Kinase assoziiert ist, wobei das andere Molekül die Expression oder die Aktivität der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase entweder direkt oder indirekt moduliert. Demgemäß umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Regulierung der Sphingosin-Kinase- oder Sphingosin-Kinase-Expression oder -Aktivität über die Induktion einer Kaskade aus regulatorischen Schritten, welche zu der Regulation der Sphingosin-Kinase- oder Sphingosin-Kinase-Expression oder -Aktivität führen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Verfahren zum Modulieren der zellulären funktionellen Aktivität in einem Säugetier, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Mittels für eine Dauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Expression einer Nukleotid-Sequenz, die die Sphingosin-Kinase kodiert, zu modulieren oder ausreichend sind, die Aktivität der Sphingosin-Kinase zu modulieren, an das Säugetier umfasst.
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Verfahren zum Modulieren der zellulären funktionellen Aktivität in einem Säugetier, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase an das Säugetier umfasst.
Die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase oder das verwendete Mittel können ebenfalls mit einem zielgerichteten Mittel, wie einem monoklonalen Antikörper, verknüpft sein, welches die spezifische Abgabe der Sphingosin-Kinase, der Sphingosin-Kinase oder des Mittels zu der Zielzelle bereitstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase oder das in dem Verfahren verwendete Mittel mit einem Antikörper, der für die Zielzellen spezifisch ist, verknüpft, um die spezifische Abgabe zu diesen Zellen zu ermöglichen.
Der Verweis auf „Modulieren der zellulären funktionellen Aktivität" ist ein Verweis auf die Hochregulation, Herunterregulation oder das anderweitige Verändern jeder beliebigen oder mehrerer Aktivitäten, welche eine Zelle in der Lage ist, durchzuführen, wie, aber nicht be schränkt auf, eine oder mehrere aus der Chemokin-Produktion, Cytokin-Produktion, Stickoxid-Synthetase, Expression des Adhesionsmoleküls und Produktion anderer Entzündungs-Modulatoren.
Die Verabreichung der Sphingosin-Kinase, der Sphingosin-Kinase oder des Mittels in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, kann mit jedem beliebigen geeigneten Mittel durchgeführt werden. Die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase oder das Mittel der pharmazeutischen Zusammensetzung sind dazu vorgesehen, dass sie therapeutische Aktivität aufweisen, wenn sie in einer Menge, welche von dem speziellen Fall abhängt, verabreicht werden. Die Variation hängt, zum Beispiel, von dem Menschen oder dem Tier und der Sphingosin-Kinase, der Sphingosin-Kinase oder dem gewählten Mittel ab. Eine breite Auswahl an Dosen kann anwendbar sein. Entsprechend einem Patienten kann, zum Beispiel, von etwa 0,1 mg bis etwa 1 mg der Sphingosin-Kinase oder des Mittels pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Die Dosisformen können angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort bereitzustellen. Zum Beispiel können verschiedene getrennte Dosen täglich, wöchentlich, monatlich oder in anderen geeigneten Zeitintervallen verabreicht werden oder die Dosen können, wie durch die Erfordernisse der Situation angedeutet, proportional reduziert werden. Die Sphingosin-Kinase oder das Mittel können in einer geeigneten Weise, wie auf dem oralen, intravenösen (wo wasserlöslich), intranasalen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intradermalen oder auf Suppositorium-Wegen oder durch Implantieren (z.B. unter Verwendung von Molekülen mit langsamer Freisetzung) verabreicht werden. Mit besonderem Verweis auf die Verwendung der Sphingosin-Kinase oder des Mittels können diese Peptide in Form von pharmazeutisch verträglichen nicht toxischen Salzen, wie Säureadditionszsalzen oder Metallkomplexen, z.B. mit Zink, Eisen oder Ähnlichem (welche als Salze für die Zwecke dieser Anwendung betrachtet werden), verabreicht werden. Veranschaulichend für solche Säure-Additions-Salze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und Ähnliche. Sofern der aktive Inhaltsstoff in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette ein Bindemittel, wie Tragant, Maisstärke oder Gelatine; ein Trennmittel, wie Algin-Säure; und ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Erfindung in Verbindung mit Krankheitszuständen des Säugetiers. Zum Beispiel ist die vorliegende Erfindung besonders geeignet für, aber in keiner Weise beschränkt auf, die Verwendung in Entzündungs-Krankheiten.
Demgemäß betrifft ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Säugetiers, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge des Mittels für eine Dauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Expression der Sphingosin-Kinase zu modulieren, oder ausreichend sind, die Aktivität der Sphingosin-Kinase zu modulieren, wobei die Modulation in der Modulation der zellulären funktionellen Aktivität resultiert, an das Säugetier umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Säugetiers, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase für eine Dauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, die zelluläre funktionelle Aktivität zu modulieren, an das Säugetier umfasst.
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels, das in der Lage ist, die Expression der Sphingosin-Kinase zu modulieren oder die Aktivität der Sphingosin-Kinase zu modulieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der zellulären funktionellen Aktivität.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der zellulären funktionellen Aktivität.
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Mittel zur Verwendung beim Modulieren der Sphingosin-Kinase-Expression oder der Sphingosin-Kinase-Aktivität, wobei die Modulation in der Modulation der zellulären funktionellen Aktivität resultiert.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Sphingosin-Kinase oder die Sphingosin-Kinase zur Verwendung zum Modulieren der zellulären funktionellen Aktivität.
In einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Säugetier, das sich der Behandlung unterzieht, ein Mensch oder ein Tier sein, das der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung bedarf.
In einem noch anderen weiteren Aspekt betrachtet die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase oder ein Mittel, das in der Lage ist, die Sphingosin-Kinase-Expression oder die Sphingosin-Kinase-Aktivität zu modulieren, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Streckmitteln umfasst. Die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase oder das Mittel werden als die aktiven Inhaltsstoffe bezeichnet.
Die pharmazeutischen Formen, die für die injizierbare Verwendung geeignet sind, beinhalten sterile wässrige Lösungen (wo wasserlöslich) und sterile Pulver für die improvisorische Präparation der sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersion. In allen Fällen muss die Form steril sein und in dem Maße fluid sein, dass eine einfache Spritzbarkeit („syringability") vorliegt. Sie muss unter den Erzeugungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen die Kontaminierungsaktivität von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein, das, zum Beispiel, Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und Ähnliche), geeignete Mischungen hiervon und Pflanzenöle enthält. Die ordnungsgemäße Fluidität kann, zum Beispiel, durch die Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall der Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden beibehalten werden. Die Verhinderung der Aktivität der Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antifungale-Mittel, zum Beispiel, Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thirmerosal und Ähnliches, bewirkt werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, dass isotonische Mittel, zum Beispiel, Zucker und Natriumchlorid, beinhaltet sind. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, zum Beispiel, Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen bewirkt werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch das Einbringen der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen der anderen oben aufgezählten Inhaltsstoffen, wie erforderlich, gefolgt von gefilterter Sterilisation, vorbereitet. Im Allgemeinen werden die Dispersionen durch das Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Inhaltsstoffe in ein steriles Vehikel, welches das Basis-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe aus den oben aufgezählten enthält, präpariert. Im Fall der sterilen Pulver für die Präparation der sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Präparationsverfahren die Vakuumtrocknungs- und die Gefriertrocknungs-Techniken, welche ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs plus jeden beliebigen, zusätzlichen, gewünschten Inhaltsstoff aus der zuvor steril-filtrierten Lösung hiervon ergeben.
Wenn die Sphingosin-Kinase, die Sphingosin-Kinase und die Sphingosin-Kinase-Modulatoren in geeigneter Weise geschützt sind, können sie oral verabreicht werden, zum Beispiel, mit einem inerten Streckmittel oder mit einem vergleichbaren essbaren Träger, oder sie können in einer Gelatine-Kapsel mit harter oder weicher Schale eingeschlossen sein, oder sie können in Tabletten zusammengepresst sein, oder sie können direkt mit der Diätnahrung aufgenommen werden. Für die orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Excipientien aufgenommen werden und in Form von einnehmbaren Tabletten, Bukkal-Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixiers, Suspensionen, Sirups, Oblaten („wafers") und Ähnlichem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparationen sollten mindestens 1 Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparationen kann natürlich variiert werden und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 5 bis etwa 80% des Gewichts der Einheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch geeigneten Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Präparationen gemäß der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, dass eine orale Dosierungseinheitsform zwischen etwa 0,1 μg und 2000 mg der aktiven Verbindung enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnliches können ebenfalls das folgende enthalten: Ein Bindemittel wie Tragantgummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; Excipientien wie Dicalciumphosphat; ein Trennmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und Ähnliches; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat und einen Süßstoff wie Sacherose, Laktose oder Saccharin können zugegeben werden oder ein Geschmacks-/Aromastoff wie Pfefferminz, Öl der Moosbeere oder Kirsch-Geschmacks-/Aromastoff. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des oberen Typs einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen oder, um die Gestalt der Dosierungseinheit in einer anderen Weise zu modifizieren, vorhanden sein. Zum Beispiel können die Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder mit beidem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Sacherose als Süßstoff, Methyl- und Propylparabens als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und Geschmacks-/Aromastoff wie Kirsch- oder Orangen-Geschmack-/Aroma enthalten. Natürlich sollte jedes beliebige Material, das im Präparieren jeder beliebigen Dosierungseinheitsform verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den angewendeten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch sein. Zusätzlich kann die aktive Verbindung in Präparationen und Formulierungen mit einer Dauerfreisetzung aufgenommen werden.
Pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Streckmittel beinhalten jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antifungale-Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und Ähnliches. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Ausgenommen insofern als irgendein konventionelles Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff inkompatibel sind, wird die Verwendung davon in den therapeutischen Zusammensetzungen vorgesehen. Zusätzlich können ebenfalls aktive Inhaltsstoffe in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in der Dosierungseinheitsform zur Erleichterung der Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. Die Dosierungseinheitsform, wie hier verwendet, bezieht sich auf physikalisch eigenständige Einheiten, geeignet als einheitliche Einheitsdosierungen für die Säugetier-Probanden, die behandelt werden sollen; jede Einheit, die eine vorbestimmte Menge des aktiven Materials enthält, die berechnet wurde, um den gewünschten therapeutischen Effekt in Assoziation mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger zu ergeben. Die Spezifikation auf die neuen Dosierungseinheitsformen der Erfindung ist vorgeschrieben und direkt abhängig von (a) den einzigartigen Charakteristika des aktiven Materials und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erreicht werden soll, und (b) den Beschränkungen inhärent im Stand der Technik des Einbindens eines solchen aktiven Materials zur Behandlung von Krankheiten in lebenden Probanden, die einen Krankheitszustand aufweisen, in welchem die körperliche Gesundheit beeinträchtigt ist.
Der aktive Hauptinhaltsstoff ist für die geeignete und wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger in der Dosierungseinheitsform, wie hierin zuvor offenbart, zusammengesetzt. Eine Einheitsdosierungsform kann zum Beispiel die aktive Hauptverbindung in Mengen im Bereich von 0,5 μg bis etwa 2000 mg, enthalten. Ausgedrückt in Proportionen, ist die aktive Verbindung im Allgemeinen in von etwa 0,5 μg bis etwa 2000 mg/ml Träger vorhanden. In dem Fall, dass die Zusammensetzungen zusätzliche aktive Inhaltsstoffe enthalten, werden die Dosierungen durch Verweis auf die gewöhnliche Dosis und Art der Verabreichung der Inhaltsstoffe bestimmt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ebenfalls genetische Moleküle, wie einen Vektor, der in der Lage ist, die Zielzellen zu transfizieren, sofern der Vektor ein Nukleinsäure-Molekül trägt, das in der Lage ist, die Sphingosin-Kinase zu exprimieren, die Sphingosin-Kinase-Expression oder die Sphingosin-Kinase-Aktivität zu modulieren, umfassen. Der Vektor kann zum Beispiel ein viraler Vektor sein.
Die Sphingosin-Kinase kann ebenfalls benutzt werden, um Gen-„Knockout"-Modelle in entweder Zellen oder in nicht humanen Lebewesen zu erzeugen, deren „ausgeknocktes" Gen das Sphingosin-Kinase-Gen ist, das in den Zellen oder Lebewesen exprimiert wird. Demgemäß sollte in einem anderen Aspekt verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung sich auf Verfahren zum Erzeugen von Zell- oder nicht humanen Lebewesen-„Knockout"-Modellen des Sphingosin-Kinase-Gens erstreckt, wobei die Sphingosin-Kinase benutzt wurde, um das „Ausknocken" des endogen Sphingosin-Kinase-Gens der Zelle oder des Lebewesens zu ermöglichen, und auf hergestellte „Knockout"-Modelle davon.
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf die Antikörper zur Sphingosin-Kinase gerichtet, einschließlich katalytischer Antikörper. Solche Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können aus natürlich vorkommenden Antikörpern zur Sphingosin-Kinase ausgewählt sein oder können spezifisch gegen Sphingosin-Kinase erzeugt worden sein. Im Falle des Letztgenannten kann es für die Sphingosin-Kinase zuerst notwendig sein, dass sie mit einem Trägermolekül assoziiert wird. Die Antikörper und/oder die rekombinante Sphingosin-Kinase der vorliegenden Erfindung sind insbesondere als therapeutische oder diagnostische Mittel geeignet.
Alternativ können Fragmente von Antikörpern, wie Fab-Fragmente, verwendet werden. Weiterhin erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante und synthetische Antikörper und auf Antikörper-Hybride. Für einen „synthetischen Antikörper" wird hierin angenommen, dass er Fragmente und Hybride von Antikörpern beinhaltet. Die Antikörper dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Immuntherapie geeignet und können ebenfalls als ein diagnostisches Werkzeug, zum Beispiel, zum Kontrollieren des Programms eines therapeutischen Regimes verwendet werden.
Zum Beispiel kann die Sphingosin-Kinase verwendet werden, um nach natürlich vorkommenden Antikörpern zur Sphingosin-Kinase zu screenen. Diese können, zum Beispiel, in manchen Entzündungs-Funktionsstörungen vorkommen.
Zum Beispiel können spezifische Antikörper verwendet werden, um nach den Sphingosin-Kinase-Proteinen zu screenen. Die Letztgenannten wären wichtig, zum Beispiel, als ein Mittel zum Screenen nach Sphingosin-Kinase-Leveln in einem Zellextrakt oder einem anderen biologischen Fluid oder Reinigen der Sphingosin-Kinase, die durch rekombinante Mittel aus dem Kulturüberstandsfluid hergestellt ist. Techniken für die Versuche, die hierin betrachtet werden, sind nach dem Stand der Technik bekannt und beinhalten, zum Beispiel, Sandwich-Assays, ELISA und die Durchflusscytometrie.
Es liegt im Rahmen dieser Erfindung, dass alle beliebigen zweiten Antikörper (monoklonale, polyklonale oder Fragmente von Antikörpern), die gegen die erwähnten ersten Antikörper gerichtet sind, wie oben diskutiert, beinhaltet sind. Sowohl die ersten als auch die zweiten Antikörper können in Detektionsversuchen verwendet werden oder ein erster Antikörper kann mit einem kommerziell erhältlichen Anti-Immunoglobulin-Antikörper verwendet werden. Ein Antikörper, wie hierin betrachtet, beinhaltet jeden beliebigen Antikörper, der zu jedem beliebigen Bereich der Sphingosin-Kinase spezifisch ist.
Sowohl die polyklonalen als auch die monoklonalen Antikörper sind durch Immunisierung mit den Protein- oder Peptid-Derivaten erhältlich und jeder Typ ist für Immunoassays geeignet. Die Verfahren zum Erhalten beider Serentypen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Polyklonale Seren sind weniger bevorzugt, werden aber relativ leicht durch Injek tion einer wirksamen Menge der Sphingosin-Kinase oder antigener Teile hiervon in ein geeignetes Labortier, Sammeln des Serums aus dem Tier und Isolieren spezifischer Seren durch jede beliebige der bekannten Immunadsorptions-Techniken präpariert. Obwohl Antikörper, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, in geradezu jedem beliebigen Immunversuchs-Typ verwendbar sind, werden sie im Allgemeinen wegen der möglichen Heterogenität des Produkts weniger favorisiert.
Die Verwendung monoklonaler Antikörper in einem Immunversuch ist insbesondere wegen der Fähigkeit, diese in großen Mengen herzustellen, und wegen der Homogenität des Produkts bevorzugt. Die Präparation von Hybridom-Zelllinien für die Herstellung monoklonaler Antikörper, die aus dem Fusionieren einer unsterblichen Zelllinie und Lymphozyten, die gegen die immunogene Präparation sensibilisiert wurden, abgeleitet sind, können durch Techniken durchgeführt werden, welche einem Fachmann gut bekannt sind. (Siehe, zum Beispiel, Douillard und Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, in Compendium of Immunology Vol II, verlegt durch Schwartz, 1981; Kohler und Milstein, Nature 256: 495–499, 1975; European Journal of Immunology 6: 511–519, 1976).
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Zielobjekte des Screenings für die Verwendung in Anwendungen, wie der Diagnose von Funktionsstörungen, welche durch die Sphingosin-Kinase reguliert werden, geeignet.
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Verfahren zum Detektieren der Sphingosin-Kinase oder der Sphingosin-Kinase-mRNA in einer biologischen Probe aus einem Probanden, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antikörper, der für die Sphingosin-Kinase oder die Sphingosin-Kinase-mRNA oder ihre Derivate oder Homologe spezifisch ist, für eine Dauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, einen Antikörper-Sphingosin-Kinase- oder einen Antikörper-Sphingosin-Kinase-mRNA-Komplex zu bilden, und dann das Detektieren des Komplexes umfasst.
Das Vorliegen der Sphingosin-Kinase kann auf vielen Wegen, wie durch Western-Blotting, ELISA oder Durchflusscytometrie-Verfahren, bestimmt werden. Die Sphingosin-Kinase-mRNA kann, zum Beispiel, durch in situ-Hybridisierung oder Northern-Blotting detektiert werden. Diese beinhalten natürlich sowohl Einzel-Stellen- als auch Zwei-Stellen- oder „Sandwich"-Assays der nicht kompetitiven Typen, genauso wie die traditionellen kompetitiven Bindeassays. Diese Assays beinhalten ebenfalls das direkte Binden eines markierten Antikörpers an ein Zielobjekt.
Sandwich-Assays sind unter den geeignetesten und am häufigsten verwendeten Assays und werden für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung favorisiert. Es gibt eine Anzahl an Variationen der Sandwich-Assaystechniken und für alle wird beabsichtigt, dass sie von der vorliegenden Erfindung umfasst werden. Kurz gesagt wird in einem typischen Vorwärtsassay („forward assay") ein unmarkierter Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert und die Probe, die getestet werden soll, wird in Kontakt mit dem gebundenen Molekül gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird dann, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes zu gestatten, ein zweiter Antikörper, spezifisch für das Antigen, der mit einem Reporter-Molekül markiert ist, das in der Lage ist, ein detektierbares Signal herzustellen, zugegeben und inkubiert, um ausreichend Zeit für die Bildung eines anderen Komplexes aus Antikörper-Antigen-markierter Antikörper zu haben. Jedes nicht umgesetzte Material wird herausgewaschen und die Gegenwart des Antigens wird durch die Beobachtung eines Signals, das durch das Reporter-Molekül hergestellt wird, bestimmt. Die Ergebnisse können entweder qualitativ, durch einfache Beobachtung des sichtbaren Signals, sein oder können durch Vergleichen mit einer Kontrollprobe, die bekannte Mengen des Haptens enthält, quantifiziert werden. Varianten des Vorwärtsassays beinhalten einen simultanen Versuch, in welchem sowohl die Probe als auch der markierte Antikörper simultan zu dem gebundenen Antikörper zugegeben werden. Diese Techniken sind einem Fachmann gut bekannt, einschließlich aller beliebiger Mindervariationen, wie ohne Weiteres offensichtlich wird. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung könnte die Probe solche sein, die die Sphingosin-Kinase enthält, einschließlich des Zellextrakts, der Gewebsbiopsie oder möglicherweise des Serums, Speichels, mukosaler Ausscheidungen, der Lymphe, des Gewebsfluids und Atmungsfluids. Die Probe ist deshalb im Allgemeinen eine biologische Probe, die das biologische Fluid umfasst, sich aber ebenfalls auf das Fermentationsfluid und Überstandsfluid, wie aus einer Zellkultur, erstreckt.
In dem typischen Vorwärts-Sandwich-Assay wird ein erster Antikörper, der Spezifität für die Sphingosin-Kinase oder für antigene Teile hiervon aufweist, entweder kovalent oder passiv an eine feste Oberfläche gebunden. Die feste Oberfläche ist typischerweise Glas oder ein Polymer, wobei die am häufigsten verwendeten Polymere Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen sind. Die festen Träger können in der Form von Röhrchen, Kugeln, Mikroplatten-Scheiben oder jeder anderen beliebigen Oberfläche sein, die zum Ausführen eines Immunoassays geeignet ist. Die Bindeverfahren sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und bestehen im Allgemeinen aus kreuzvernetzendem kovalentem Binden oder physikalischem Adsorbieren, wobei der Polymer-Antikörper-Komplex in der Präparation für die Testprobe gewaschen wird. Ein Aliquot der Probe, die getestet werden soll, wird dann zu dem Festphasen-Komplex zugegeben und für eine ausreichende Zeitdauer (z.B. 2–40 Minuten) und unter geeigneten Bedingungen (z.B. 25°C) inkubiert, um das Binden jeder beliebigen Untereinheit, die in dem Antikörper vorhanden ist, zu gestatten. Nach der Inkubationsdauer wird die Antikörper-Untereinheit-Festphase gewaschen, getrocknet und mit einem zweiten Antikörper, der für einen Teil des Haptens spezifisch ist, inkubiert. Der zweite Antikörper ist mit einem Reporter-Molekül verknüpft, welches verwendet wird, um das Binden des zweiten Antikörpers an das Hapten anzuzeigen.
Ein alternatives Verfahren involviert das Immobilisieren der Zielmoleküle in der biologischen Probe und dann das Aussetzen des immobilisierten Zielobjekts einem spezifischen Antikörper, welcher mit einem Reporter-Molekül markiert oder nicht markiert sein kann. Abhängig von der Menge des Zielobjekts und der Stärke des Reporter-Molekül-Signals kann ein gebundenes Zielobjekt durch direktes Markieren mit dem Antikörper detektierbar sein. Alternativ wird ein markierter zweiter Antikörper, der für den ersten Antikörper spezifisch ist, dem Komplex aus dem Zielobjekt und dem ersten Antikörper ausgesetzt, um einen tertiären Komplex aus dem Zielobjekt, dem ersten Antikörper und dem zweiten Antikörper zu bilden. Der Komplex wird durch das Signal detektiert, das von dem Reporter-Molekül emittiert wird.
Mit „Reporter-Molekül", wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, ist ein Molekül gemeint, welches durch seine chemische Natur ein analytisch identifizierbares Signal bereitstellt, welches die Detektion eines Antigen-gebundenen Antikörpers gestattet. Die Detektion kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die am häufigsten verwendeten Reporter-Moleküle in diesem Assaystyp sind entweder Enzyme, Fluorophore oder Radionuklid-enthaltende Moleküle (d.h. Radioisotope) und chemilumineszente Moleküle.
Im Fall eines Enzym-Immunversuchs wird ein Enzym an den zweiten Antikörper, im Allgemeinen durch Glutaraldehyd oder Periodat, konjugiert. Wie ohne Weiteres erkennbar wird, existiert dennoch eine große Vielfalt an unterschiedlichen Konjugationstechniken, welche für einen Fachmann ohne Weiteres zugänglich sind. Gewöhnlich verwendete Enzyme beinhalten u.a. die Meerrettich-Peroxidase, Glukose-Oxidase, beta-Galaktosidase und Alkalin-Phosphatase. Die Substrate, die mit den spezifischen Enzymen verwendet werden sollen, werden im Allgemeinen nach der Hydrolyse durch das entsprechende Enzym für die Herstellung einer detektierbaren Farbänderung gewählt. Beispiele geeigneter Enzyme beinhalten die Alkalin-Phosphatase und Peroxidase. Es ist ebenfalls möglich, fluorogene Substrate, welche ein fluoreszentes Produkt ergeben, eher als chromogene Substrate, die oben vermerkt wurden, einzusetzen. In allen Fällen wird der Enzym-markierte Antikörper zu dem erster Antikörper-Hapten-Komplex zugegeben, das Binden wird gestattet und dann wird der Reagenzüberschuss herausgewaschen. Eine Lösung, die das geeignete Substrat enthält, wird dann zu dem Komplex aus Antikörper-Antigen-Antikörper zugegeben. Das Substrat wird mit dem Enzym, das mit dem zweiten Antikörper verknüpft ist, reagieren, was ein qualitatives visuelles Signal ergibt, welches weiter gewöhnlich spektrophotometrisch quantifiziert werden kann, um einen Hinweis auf die Hapten-Menge, die in der Probe vorhanden war, zu ergeben. „Reporter-Molekül" erstreckt sich ebenfalls auf die Verwendung der Zellagglutination oder die Inhibition der Agglutination, wie roter Blut-Zellen an Latex-Kugeln und Ähnlichem.
Alternativ können Fluoreszenzverbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper gekoppelt sein, ohne ihre Bindekapazität zu verändern. Sofern durch die Belichtung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge aktiviert wird, adsorbiert der mit dem Fluorochrom verknüpfte Antikörper die Lichtenergie, was einen angeregten Zustand in dem Molekül induziert, gefolgt von der Emission des Lichts mit einer charakteristischen Farbe, die mit einem Lichtmikroskop sichtbar detektierbar ist. Wie im EIA, kann der Fluoreszenz-markierte Antikörper an den erster Antikörper-Hapten-Komplex binden. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Reagenzes wird der verbliebene tertiäre Komplex dann dem Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, wobei die beobachtete Fluoreszenz die Gegenwart des Haptens von Interesse andeutet. Die Immunfluoreszenz- und EIA-Techniken sind beide sehr gut im Stand der Technik etabliert und werden für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Dennoch können andere Reporter-Moleküle, wie Radioisotope, chemilumineszente oder biolumineszente Moleküle, ebenfalls eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls genetische Versuche wie die Beteiligung der PCR-Analyse, um die Sphingosin-Kinase oder ihre Derivate zu detektieren.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden ausführlicher in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1
DIE REINIGUNG UND KLONIERUNG DER HUMANEN SPHINGOSIN-KINASE-EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Materialien
D-erythro-Sphingosin, D-erythro-Dihydrosphingosin, DL-threo-Dihydrosphingosin, N,N-Dimethylsphingosin, N-Acetylsphingosin (C₂-Ceramid), S1P und Fumosin B1 wurden von Biomol Research Laboratories Inc. (Plymouth Meeting, PA) erworben.
Phytosphingosin, L-α-Phosphatidsäure, L-α-Phosphatidylinositol, L-α-Phosphatidylserin, L-α-Phosphatidylcholin, L-α-Phosphatidylethanolamin, 1,2-Dioctanoyl-sn-glycerin, 1,2-Dioleoyl-sn-glycerin, ATP, Calmodulin, Glutathion und Rinderserumalbumin (BSA) waren von Sigma. N,N,N-Trimethylsphingosin und ADP wurden von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland), [γ³²P]ATP von Geneworks (Adelaide, Süd-Australien), TNFα von R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN) und Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) von Promega (Madison, WI) erworben. Vorgepackte Mono-Q-, Superose-75- und HiTrap-Q-Säulen, Q-Sepharose-fast flow, Calmodulin-Sepharose-4B, Glutathion-Sepharose-4B, Thrombin und Gelfiltrations-Molekularmassen-Proteinstandards waren von Amersham Pharmacia Biotech. Die SDS-PAGE-Molekularmassen-Proteinstandards, das „Silver stain plus kit", Coomassie Brilliant Blue R250 und Coomassie-Proteinreagenz waren von Bio-Rad. Die Centricon-Konzentratoren wurden von Amicon Inc. (Beverly, MA) erworben und das BCA-Proteinreagenz war von Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
Der Sphingosin-Kinase-Enzym-Versuch
Die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde unter Verwendung von D-erythro-Sphingosin und [γ³²P]ATP als Substrate, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Olivera et al., 1998), mit einigen Modifikationen, routinemäßig bestimmt. Kurz gesagt wurden die Versuche durch Inkubieren der Probem bei 37°C für 30 Min. mit Sphingosin (100 μM Stammlösung, gelöst in 5% Triton X-100) und [γ³²P]ATP (1 mM; 10 μCi/ml) im Versuchspuffer, enthaltend 100 mM Tris/HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl₂, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 15 mM NaF, 0,5 mM 4-Deoxypyridoxin, in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Die Reaktionen wurden beendet und das Sphingosin-1-Phosphat wurde durch die Zugabe von 700 μl Chloroform/Methanol/HCl (100:200:1, Vol./Vol.), gefolgt von kräftigem Mischen, der Zugabe von 200 μl Chloroform und 200 μl 2 M KCl und der Phasentrennung durch Zentrifugation, extrahiert. Das markierte S1P in der organischen Phase wurde durch TLC auf Silica-Gel 60 mit 1-Butanol/Ethanol/Essigsäure/Wasser (8:2:1:2, Vol./Vol.) isoliert und mit dem Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Eine Aktivitätseinheit (U) ist definiert als 1 pmol S1P, gebildet pro Minute.
Die Reinigung der Sphingosin-Kinase aus humaner Plazenta
Die Sphingosine-Kinase wurde aus 1240 g humaner Plazenta (4 Plazentas) gereinigt, wobei alle Schritte bei 4°C durchgeführt wurden. Die Plazentas wurden in Würfel geschnitten, in Puffer A (25 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 0,05% Triton X-100 und 1 mM Dithiothreitol) gewaschen, in 1,5 l frischen Puffer A, enthaltend einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Complete^TM, Boehringer Mannheim), (Puffer B) transferiert und in einem Waring-Mischer zerkleinert. Das resultierende Homogenat wurde für 30 Min. auf Eis aufbewahrt, um die Enzymextraktion zu verstärken, und die lösliche Fraktion des Homogenats wurde dann durch Zentrifugation bei 17.000 g für 60 min isoliert. Diese Präparation wurde dann durch (NH₄)₂SO₄-Päzipitation durch die Zugabe von festem (NH₄)₂SO₄ bei pH 7,4 und das Sammeln der präzipitierten Proteine durch Zentrifugation (17.000 g, 30 Min.) fraktioniert. Die 25–35%-ige, gesättigte (NH₄)₂SO₄-Fraktion wurde dann wieder in einem Puffer B gelöst, durch umfangreiche Dialyse gegen den gleiche Puffer entsalzt und zentrifugiert (17.000 g, 30 Min.), um das unlösliche Material zu entfernen. Alle nachfolgenden chomatographischen Schritte wurden unter Verwendung eines FPLC-Systems (Pharmacia Biotech) bei 4°C durchgeführt.
Die dialysierte (NH₄)₂SO₄-Fraktion wurde auf eine Q-Sepharose-fast-flow-Säule (50 mm Durchmesser, 250 ml Bettvolumen), voräquilibriert mit Puffer A, bei einer Flussrate von 7 ml/min aufgetragen. Die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M in Puffer A eluiert und 10-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen, die die höchste SK1-Aktivität enthielten, wurden dann vereinigt und CaCl₂ und NaCl zugegeben, um eine Endkonzentration von 4 mM bzw. 250 mM zu ergeben. Dieser gesammelte Extrakt wurde dann auf eine Calmodulin-Sepharose-4B-Säule (16 mm Durchmesser, 10 ml Bettvolumen), voräquilibriert mit Puffer A, enthaltend 2 mM CaCl₂, bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde dann mit einigen Säulenvolumen des Äquilibrierungspuffers gewaschen, gefolgt von Puffer A, enthaltend 4 mM EGTA, und SK1 dann mit Puffer A, enthaltend 4 mM EGTA und 1 M NaCl, eluiert. Die Fraktionen, die die höchste Sphingosin-Kinase-Aktivität enthielten, wurden gesammelt, auf einer Sephadex-G-25-Säule entsalzt und bei einer Flussrate von 1 ml/min auf eine Mono-Q-Säule (5 mm Durchmesser, 1 ml Bettvolumen), voräquilibriert mit Puffer A, aufgetragen. Die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M in Puffer A eluiert. NaCl (auf 500 mM) wurde direkt zu den gesammelten Fraktionen (1 ml) zugegeben, um die Enzymaktivität zu stabilisieren. Die Mono-Q-Fraktionen, die die höchste Sphingosin-Kinase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und auf einer Sephadex-G-25-Säule entsalzt. ATP und MgCl₂ wurden dann zu den gesammelten Fraktionen zu einer Endkonzentration von 1 mM bzw. 5 mM vor der Wiederauftragung bei einer Flussrate von 1 ml/min auf die Mono-Q-Säule, voräquilibriert mit Puffer A, enthaltend 1 mM ATP und 5 mM MgCl₂, zugegeben. Die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M im Äquilibrierungspuffer eluiert. Erneut wurde NaCl (auf 500 mM) direkt zu den gesammelten Fraktionen (1 ml) zugegeben, um die Enzymaktivität zu stabilisieren. Die ATP-Mono-Q-Fraktionen, die die höchste Sphingosin-Kinase-Aktivität enthielten, wurden gesammelt, auf ein Endvolumen von 200 μl in einem Centricon-10-Konzentrator 10-fach konzentriert und bei einer Flussrate von 0,4 ml/min auf eine Superdex-75-Säule (10 mm Durchmesser, 20 ml Bettvolumen), voräquilibriert mit Puffer A, enthaltend 500 mM NaCl, aufgetragen. Die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde mit dem gleichen Puffer eluiert und 0,4-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Molekularmasse des Enzyms wurde durch den Vergleich mit den Elutionsvolumina von der Ribonuklease A, Chymotrypsinogen A, Ovalbumin und BSA aus dieser Säule abgeschätzt.
Die Klonierung der humanen Sphingosin-Kinase
Die humane Sphingosin-Kinase (hSK) wurde aus einer HUVEC-λ-Zap-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von PCR-Primern, abgeleitet von den humanen EST-Sequenzen (Gen-Bank^TM Zugangsnummern D31133, W63556, AA026479, AA232791, AA081152, AI769914 und AI769914), angeordnet („aligned") zu der Sphingosin-Kinase der Maus (Olivera et al., 1998), amplifiziert. Diese Primer, die eine zentrale SacII-Stelle (PI, 5'-CGGAATTCCCAGTCGGCCGCGGTA-3' [<400>3] und P2, 5'-TAGAATTCTACCGCGGCCGACTGGCT-3' [<400>4]) umfassen, wurden in Kombination mit T3- und T7-Primern verwendet, um zwei überlappenden PCR-Produkte von 669 bp und 550 bp zu erzeugen, die die 5'- bzw. 3'-Enden der hSK repräsentieren. Diese zwei PCR-Produkte wurden dann getrennt in pGEM4Z kloniert. Ein 584-bp-SacII-Fragment von dem 5'-hSK-PCR-Klon wurde dann in der korrekten Orientierung in die SacII-Stelle des 3'-hSK-PCR-Klons subkloniert, um einen partiellen hSK-cDNA-Klon von 1130 zu erzeugen. Ein Volllängen-Klon, kodierend für hSK, wurde dann durch die Subklonierung eines 120-bp-EcoRI/StuI-Fragments aus dem 669-bp-5'-hSK-Klon in diesen pGEM4Z-1130-bp-Klon, verdaut mit EcoRI/StuI, erzeugt. Die Sequenzierung des cDNA-Klons in beide Richtungen bestätigte die Integrität der hSK-cDNA-Sequenz.
Für die Säugetier-Zellexpression wurde die hSK-cDNA mit FLAG-Epitopen am 3'-Ende durch die PFU-Polymerase-PCR mit Oligonukleotid-Primern T7 und 5'-TAGAATTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTAAGGGCTCTTCTGGCGGT-3' [<400>5] markiert. Diese FLAG-markierte hSK-cDNA wurde dann durch den Verdau mit EcoRI in pCDNA3 kloniert. Die Orientierung wurde durch die Restriktionsanalyse bestimmt und die Sequenzierung bestätigte die Integrität der hSK-FLAG-cDNA-Sequenz. Für bakterielle Expression wurde die Volllängen-hSK-cDNA in pGEX4T2 subkloniert. Der pGEM4Z-hSK-Klon wurde mit BamHI verdaut und mit 3 U PFU-Polymerase in 1 × PFU-Puffer, 50 μM dNTPs bei 72°C für 30 Minuten „stumpf gemacht" („blunted"). Die 1163-bp-hSK-cDNA wurde über das Gel gereinigt, nachfolgend dem Verdau mit SalI und das stumpfe/SalI-Fragment wurde dann in pGEX4T2-SmaI/XhoI ligiert.
Die Aminosäuresequenzanalyse der Sphingosin-Kinase
Die Aminosäuresequenz der humanen Sphingosine-Kinase wurde gegen nicht redundante Aminosäure- und Nukleotidsequenz-Datenbanken am Australian National Genome Infor mation Service unter Verwendung der blastp- und tblastn-Alogorithmen (Altschul et al., 1990) geprüft.
Die Zellkultivierung
Humane Nabelvenen-Endothelial-Zellen („human umbilical vein endothelial cells", HUVEC) wurden, wie zuvor beschrieben (Wall et al., 1978), isoliert und auf mit Gelatine beschichteten Kulturkolben im Medium M199 mit Earleschem Salz, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 25 μg/ml endothelialer Wachstumsergänzung (Collaborative Research) und 25 μg/ml Heparin, kultiviert. Die Zellen wurden dreimal übertragen und bis 80% Konfluenz vor der Behandlung und dem Ernten gezüchtet. Humane embryonale Nieren-Zellen (HEK293, ATCC CRL-1573) wurden auf Dulbecco's modifiziertem Eagleschem Medium, mit 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 0.2% (Gew./Vol.) Natriumbicarbonat, Penicillin (1,2 mg/ml) und Gentamycin (1,6 mg/ml) kultiviert. Die HEK293-Zellen wurden unter Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens (Graham & van der Eb, 1973) transient transfiziert. Die Behandlung von HUVEC und HEK293-Zellen mit TNFα (1 ng/ml) wurde, wie zuvor beschrieben (Xia et al., 1998), durchgeführt.
BEISPIEL 2
DIE EXPRESSION UND DIE ISOLIERUNG DER RECOMBINANTEN HUMANEN SPHINGOSIN-KINASE AUS E. COLI – EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Die Volllängen-SPHK-cDNA, die in pGEX4T2 kloniert wurde, wurde in E. coli BL21 transformiert. Über-Nacht-Kulturen (100 ml) der transformierten Isolate wurden unter Schütteln (200 rpm) bei 30°C im „Superbroth" (20 g/l Glukose, 35 g/l Trypton, 20 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,5)-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l), gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:20 mit frischem Medium verdünnt und bei 30°C unter Schütteln bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6–0,7 gezüchtet. Die Expression der mit der Glutathion-s-Transferase (GST) gekoppelten Sphingosin-Kinase (GST-SK) wurde dann durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid und weitere Inkubation der Kulturen bei 30°C für 3 Std. induziert. Nach dieser Zeit wurden die bakteriellen Zellen dann durch Zentrifugation bei 6.000 g während 20 Min. bei 4°C geerntet und in 20 ml Puffer B, enthaltend 250 mM NaCl, resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit dem Lysozym bei einer Endkonzentration von 0,3 mg/ml für 15 Min. bei 25°C lysiert, gefolgt von der Sonifikation (Ultraschallbehandlung), bestehend aus drei Zyklen von 20-s-Ultraschallpulsen, gefolgt von 1-minütigem Kühlen. Das Lysat wurde dann durch Zentrifugation bei 50.000 g während 45 Min. bei 4°C geklärt, gefolgt vom Filtrieren durch 0,22-pm-Filter. Der zu filtrierende Überstand wurde dann mit 0,2 Volumenteilen 50%-iger (Gew./Vol.) Glutathion-Sepharose-4B (Pharmacia), die mit Puffer B gewaschen und voräquilibriert wurde, während 60 Min. bei 4°C unter ständigem Mischen inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Mischung in eine Chromatographiesäule aus Glas (10 mm Durchmesser) gegossen und die Kugeln (mit gebundener GST-SK) mit 10 Säulenvolumen Puffer B bei 4°C gewaschen. Die GST-SK wurde dann von der Säule mit 10 ml Puffer B, enthaltend 10 mM reduziertes Glutathion, eluiert. Das Abspalten von GST von der Sphingosin-Kinase wurde dann durch die Inkubation mit 20 μg (30 N. I. H-Einheiten) Thrombin (Pharmacia) während 3 Std. bei 25°C durchgeführt. Die freigesetzte Sphingosin-Kinase wurde dann durch Auftragung der Spaltungsmischung auf eine Calmodulin-Sepharose-Säule und dann auf eine Mono-Q-Anionenaustausch-Säule für die Reinigung der Sphingosin-Kinase aus der humanen Plazenta gereinigt. Diese Säulen ergaben die Reinigung der rekombinanten Sphingosin-Kinase zur Homogenität.
BEISPIEL 3
DIE CHARAKTERISIERUNG DER SPHINGOSIN-KINASEN – EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Der pH-Effekt auf die Aktivität der isolierten Sphingosin-Kinasen wurde über den pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 in 50 mM Puffern (Natriumacetat, pH 4,0–5,0; Mes, pH 6,0–7,0; Hepes, pH 7,0–8,2; Tris/HCl, pH 8,2–10,0; Caps, pH 10,0–11,0) bei 37°C bestimmt. Die pH-Stabilität wurde durch Untersuchen der Restaktivität nach der Vorinkubation der Enzyme in den gleichen Puffern während 5 Std. bei 4°C bestimmt. In ähnlicher Weise wurden die thermischen Stabilitäten durch Untersuchen der Restaktivität nach der Vorinkubation der Enzyme bei verschiedenen Temperaturen (4–80°C) während 30 Min. bei pH 7,4 (50 mM Tris/HCl, enthaltend 10% Glycerin, 0,5 M NaCl und 0,05% Triton X-100) bestimmt. Die Substratkinetiken wurden unter Verwendung der Michaelis-Menten-Kinetiken mit einem gewichteten, nicht linearen Regressionsprogramm (Easterby, 1996) analysiert. Da das Sphingosin und seine Analoga zu den Enzymversuchen in mit Triton X-100 gemischten Mizellen zugegeben wurden, sofern sie Oberflächenverdünnungs-Kinetiken aufwiesen (Buehrer und Bell, 1992), wurden alle K_m- und K_i-Werte, die für diese Moleküle erhalten wurden, als mol-% Triton X-100, eher als Konzentrationen der Bulklösung, ausgedrückt. Für Versuche zum Bestimmen des Effekts von Calcium/Calmodulin auf die Sphingosin-Kinase-Aktivität, wurden Calcium und Calmodulin zu den Standard-Assaymischungen, enthaltend 20 nM isolierte Sphingosin-Kinase bei Endkonzentrationen von 4 mM bzw. 0,6 μM, zugegeben.
BEISPIEL 4
ANDERE ANALYTISCHE VERFAHREN
Die Proteine wurden entweder unter Verwendung des Coomassie-Brilliant-Blue-(Bradford et al., 1976) oder der Bicinchoninsäure („bicinchoninic acid")-Reagenzien (Smith et al., 1985) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt. In einigen Fällen wurden die Proteinabschätzungen nach der Konzentration und Entfernung des Detergenzes durch Präzipitation (Wessel und Flügge, 1984) durchgeführt, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmungen zu erhöhen. Die SDS-PAGE wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) unter Verwendung 12%-iger Acrylamid-Gele durchgeführt. Die Proteinbanden auf den Gelen wurden entweder mit Coomassie Brilliant Blue R250 oder mit der Silberfärbung visualisiert. Die Molekularmasse wurde durch den Vergleich zu der elektrophoretischen Beweglichkeit von Myosin, β-Galaktosidase, BSA, Ovalbumin, Kohlenstoff-Anhydrase, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Lysozym und Aprotinin abgeschätzt.
BEISPIEL 5
DIE REINIGUNG DER HUMANEN SPHINGOSIN-KINASE – ERGEBNISSE
Etwas über die Hälfte der gesamten Sphingosin-Kinase-Aktivität in der humanen Plazenta war in dem Cytosol nach der Gewebshomogenisierung vorhanden (Tabelle 3). Die Reinigung der Sphingosin-Kinase aus der humanen Plazenta ist in Tabelle 4 zusammengefasst. Die lösliche Fraktion aus dem Homogenat von vier humanen Plazentas wurde zunächst der Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen. Dies resultierte in einer bemerkenswert guten Reinigung der Sphingosin-Kinase (33-fach), welche in der 25–35%-igen, gesättigten Ammoniumsulfat-Fraktion präzipitierte. Für die Anionenaustausch-Chromatographie wurde die Ammoniumsulfat-Fraktion durch die Verwendung der Sephadex-G25-Säule schnell entsalzt und die entsalzte Fraktion sofort auf eine Q-Sepharose-FF-Säule geladen. Die Geschwindig keit des Entsalzungsschrittes erschien kritisch, da die Sphingosin-Kinase-Aktivität bei NaCl-Konzentrationen unter etwa 0,2 M sehr instabil erschien, was bedeutet, dass langsamere Entsalzungsschritte, wie die Dialyse, in wesentlichen Verlusten der Enzymaktivität resultierten. Die Auftragung eines NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M auf die Q-Sepharose-FF-Säule resultierte in zwei Peaks der Sphingosin-Kinase-Aktivität, die bei ungefähr 0,15 M und 0,6 M NaCl eluierten, und als SK1 bzw. SK2 (2) bezeichnet werden. Für diese Studie wurde die SK1 für weitere Reinigung aufgrund seiner größeren Menge und Stabilität gewählt; die SK2-Aktivität erschien sehr instabil und konnte, im Gegensatz zur SK1, durch Zugabe von 0,5 M NaCl, 10% Glycerin und 0,05% Triton X-100 nicht stabilisiert werden. Die SK1 wurde ebenfalls ausgewählt, weil sie die in HUVEC vorhandene Isoform zu sein schien, wie später diskutiert.
Die Fraktionen von der Q-Sepharose-FF-Säule, die die SK1 enthielten, wurden dann durch Auftragung auf eine Calmodulin-Sepharose-4B-Säule in Gegenwart von 4 mM CaCl₂ über die Affinität gereinigt, und die Elution von SK1 wurde mit EGTA und NaCl durchgeführt, was in einer weiteren wesentlichen Reinigung (38-fach) und in hohen Enzymausbeuten resultierte. Die SK1 konnte von der Calmodulin-Sepharose-4B-Säule nicht mit EGTA allein eluiert wurden, was eine ungewöhnliche Assoziation des Enzyms mit dieser Affinitätsmatrix andeutet. Die aktiven Fraktionen, die von der Calmodulin-Sepharose-4B-Säule eluierten, wurden dann entsalzt und zwei nachfolgenden Schritten der analytischen Anionenaustausch-Chromatographie auf einer MonoQ-Säule unterzogen, wobei der zweite Schritt in der Gegenwart von 1 mM ATP und 5 mM MgCl₂ durchgeführt wurde (3). Die aktiven Fraktionen, die aus diesen Anionenaustausch-Schritten resultierten, wurden dann der Gelfiltrations-Chromatographie mit einer Superdex-75-Säule als einem Endreinigungsschritt unterzogen. Die SK1 eluierte von dieser Säule als ein einzelner Peak mit einer Molekülmasse, die 44 kDa entsprach. Die Analyse der aktiven Fraktion dieser letzten Säule durch die SDS-PAGE mit Silberfärbung (4) offenbarte eine einzelne Bande mit einer Molekularmasse von 45 kDa, was ein homogenes Protein andeutet, das über eine Million-fach aus dem ursprünglichen Plazenta-Extrakt mit einer bemerkenswert guten Ausbeute von 7% der ursprünglichen Sphingosin-Kinase-Aktivität gereinigt wurde (Tabelle 4). Dies ist die erste Sphingosin-Kinase, die aus einer humanen Quelle zur Homogenität gereinigt wurde.
BEISPIEL 6
DIE SPHINGOSIN-KINASE-ISOFORMEN IN HUVEC – ERGEBNISSE
Da zwei Sphingosin-Kinase-Aktivitäten in der humanen Plazenta identifiziert wurden (2), untersuchten wir die Vielfalt dieser Enzymaktivität in HUVEC unter Verwendung von präparativen Anionenaustausche-Säulen. Im Gegensatz zu anderen human Geweben und Zellen resultierte die Auftragung der HUVEC-Extrakte auf diese Säulen im Auftreten nur eines einzelnen Sphingosin-Kinase-Peaks, der an dem gleichen Punkt wie die SK1 aus der humanen Plazenta eluierte (5). In ähnlicher Weise eluierte nur ein einzelner Sphingosin-Kinase-Peak nach der Auftragung der HUVEC-Extrakte, in welchen die Sphingosin-Kinase-Aktivität durch die 10 minütige Behandlung von HUVEC mit TNFα (Xia et al., 1999) stimuliert wurde. Diese Ergebnisse würden andeuten, dass die SK1, die in dieser Studie aus der humanen Plazenta isolierte Sphingosin-Kinase wahrscheinlich die hauptsächliche Isoform ist, die in HUVEC gefunden wird, und dass die TNFα-Behandlung eher in einem Anstieg in der Aktivität dieses Enzyms als in der Aktivierung einer anderen, ansonsten latenten, Isoform resultiert.
BEISPIEL 7
DIE KLONIERUNG DER HUMANEN SPHINGOSIN-KINASE UND TRANSIENTE EXPRESSION IN HEK293-ZELLEN – ERGEBNISSE
Die humane Sphingosin-Kinase-cDNA wurde aus einer HUVEC-λ-Zap-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Primern, konstruiert aus den humanen ESTs, angeordnet zu den veröffentlichten Sphingosin-Kinase-Sequenzen der Maus (Kohama et al., 1998), erzeugt. Die Klonierungsstrategie ist in 6 (prov) gezeigt. Die cDNA weist einen scheinbar offenes Leserraster auf, kodierend für 384 Aminosäuren (7). Es sollte vermerkt werden, dass der Sequenz ein erkennbares Kozak-Übereinstimmungsmotiv fehlt, was die Möglichkeit eröffnet, dass die tatsächliche Initiationssequenz in dieser cDNA nicht beinhaltet sein kann. Die Sphingosin-Kinase-cDNA kodiert für ein Protein (hSK) mit einem vorhergesagten isoelektrischen Punkt von 6,64 und einer Molekularmasse von 42,550 kDa, konsistent mit der Molekularmasse, die für die gereinigte Sphingosin-Kinase aus der humanen Plazenta (SK1) bestimmt wurde. Die Subklonierung in pcDNA3 und (transiente) Expression der hSK in HEK293-Zellen resultierte in einem 3.200-fachen Anstieg in der Sphingosin-Kinase-Aktivität in diesen Zellen (8), im Vergleich mit nicht transfizierten HEK293-Zellen oder HEK293-Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert wurden, was andeutet, dass die erzeugte hSK-cDNA eine echte Sphingosin-Kinase kodiert. Interessanterweise, obwohl die hSK-transfizierten HEK293-Zellen 3.200-fach höhere Level an Sphingosin-Kinase-Aktivität aufwiesen, resultierte die Behandlung dieser Zellen mit TNFα in einem schnellen (10 Min.) Anstieg in der Sphingosin-Kinase-Aktivität, in einem ähnlichen Ausmaß (ungefähr 2-fach) zu dem, der in nicht transfizierten HEK293-Zellen (8) (Xia et al., 1998) gesehen wurde. Dies deutet an, dass die hohen Level an überexprimierter Sphingosin-Kinase den TNFα-vermittelten Aktivierungsmechanismus in diesen Zellen nicht sättigen.
BEISPIEL 8
DIE ANALYSE DER HUMANEN SPHINGOSIN-KINASE – ERGEBNISSE
Eine Prüfung der in der Datenbank gezeigten hSK wies eine hohe Aminosäure-Sequenzähnlichkeit (28 bis 36% Identität) zu zwei kürzlich identifizierten Sphingosin-Kinasen von Saccharomyces cerevisiae (Nagiec et al., 1998) und verschiedenen anderen ESTs, die die mutmaßlichen Sphingosin-Kinase-Proteine aus Schizosaccharomyces pombe, Caenorhabditis elegans und Arabidopis thaliana kodieren. Die Mehrfach-Sequenzanordnung der hSK mit diesen Homologa (9) offenbarte verschiedene Bereiche hoch konservierter Aminosäuren durch das ganze Protein hindurch, aber insbesondere in Richtung des N-Terminus.
Eine Prüfung der Domänen-Strukturen der hSK-Sequenz offenbarte drei Calcium/Calmodulin-Bindemotive (Rhoads & Friedberg, 1997), eine der 1-8 14 Typ A ([FILVW]xxx{FAILVW]xx[FAILVW]xxxxx{FILVW] mit der Nettoladung von +3 bis +6), die die Reste 290 bis 303 umspannen, und zwei der 1-8 14 Typ B ([FILVW]xxxxx{FAILVW]xxxxx[FILVW] mit der Nettoladung von +2 bis +4), die zwischen den Resten 134 bis 153 überlappen. Weitere Analyse der hSK-Sequenz offenbarte eine mögliche N-Myristoylierungsstelle, nah dem N-Terminus (bei Gly⁵), die verwendbar sein kann, sofern das Protein der proteolytischen Spaltung unterliegt. Ebenfalls wurde eine mutmaßliche Casein-Kinase-II(CKII)-Phosphorylierungsstelle (bei Ser¹³⁰) und vier mutmaßliche PKC-Phosphorylierungsstellen (bei Thr⁵⁴, Ser¹⁸⁰ Thr²⁰⁵ und Ser³⁷¹) (7) identifiziert. Diese mutmaßlichen Phosphorylierungsstellen werden ebenfalls in beiden Sphingosin-Kinase- Isoformen der Maus gefunden, obwohl die Maus-Enzyme ebenfalls sechs wahrscheinlichere Phosphorylierungsstellen zeigen; vier für PKC und jeweils eine für CKII und die Protein-Kinase A, die in hSK nicht vorkommen.
Eine Prüfung der Signaldomän-Sequenzen unter Verwendung des SMART-Prüfungswerkzeugs (Schultz et al., 1998; Ponting et al., 1999) offenbarte Ähnlichkeit in den Resten 16 bis 153 der hSK zu der mutmaßlichen katalytischen Domäne der Diacylglycerin-Kinase (DGK). Die hSK zeigte eine Gesamtidentität von 36% zu der übereinstimmenden Sequenz der katalytischen Domänenfamilie der DGK und besaß 17 der 24 sehr stark konservierten Aminosäuren dieser Domäne. Die hSK zeigte dennoch keine Homologie mit den vorgeschlagenen ATP-Bindemotiven dieser Domäne (GxGxxGx_nK), obwohl es vermerkt werden sollte, dass die Anwendbarkeit dieser ATP-Bindestellenmotive der Protein-Kinase (Hanks et al., 1988) für die DGKs umstritten bleibt (Schaap et al., 1994; Sakane et al., 1996; Masai et al., 1993). Die weitere Sequenzanalyse der humanen Sphingosin-Kinasen fand ebenfalls keine Bereiche, die irgendeine markierte Ähnlichkeit zu den vorgeschlagenen Nukleotid-Bindemotiven zeigte, die in anderen Proteinfamilien gefunden wurden (Saraste et al., 1990; Walker et al., 1982). Außer der Ähnlichkeit zu der katalytischen Domäne der DGK, zeigt die hSK keine Ähnlichkeit zu anderen Lipid-bindenden Enzymen und scheint nicht, irgendwelche erkennbaren Lipid-bindenden Domänen, wie PKC C2 oder Pleckstrin-Homologie-Domänen, aufzuweisen. Ebenfalls kommen keine anderen offensichtlichen Regulator-Domänen vor, mit der möglichen Ausnahme eines Prolin-reichen Bereichs an dem C-Terminus, welche gewisse Ähnlichkeit zu SH3-Bindedomänen (Ren et al., 1993; Yu et al., 1994) aufweist.
BEISPIEL 9
DIE EXPRESSION IN E. COLI UND DIE ISOLIERUNG DER RECOMBINANTEN SPHINGOSIN-KINASE – ERGEBNISSE
Die hSK-cDNA wurde in das pGEX4T-2-Plasmid subkloniert und die hSK als ein Glutathion-s-Transferase(GST)-Fusionsprotein in E. coli BL21 durch IPTG-Induktion exprimiert (10). Nachdem das GST-hSK-Fusionsprotein unter Verwendung der Glutathion-Sepharose-4B teilweise gereinigt und die GST durch Thrombin-Spaltung entfernt wurde, wurde die hSK durch nachfolgende Elutionen von den Calmodulin-Sepharose- und Mono-Q- Anionenaustausch-Säulen weiter gereinigt. Dies resultierte in hoher Rückgewinnung der Sphingosin-Kinase-Aktivität (größer als 70% der ursprünglich induzierten Aktivität) und einer elektrophoretisch reinen Sphingosin-Kinase (10). Dennoch konnten nur niedrige Proteinausbeuten des rekombinanten Enzyms erhalten werden, da ein großer Teil des IPTG-induzierten, Thrombin-gespaltenen hSK-Proteins nicht an die Calmodulin-Sepharose-Säule gebunden hat (11). Diese nicht bindende Form der hSK wies keine nachweisliche katalytische Aktivität auf, was darauf hinweist, dass sie inkorrekt gefaltet war.
BEISPIEL 10
DAS POST-TRANSLATIONALE MODIFIKATIONS-ERFORDERNIS FÜR DIE FUNKTIONELLE AKTIVITÄT DER SPHINGOSIN-KINASE
Um zu bestimmen, ob post-translationale Modifikationen für die Aktivität der nativen Sphingosin-Kinase erforderlich sind, wurde das native Molekül zu rekombinanten Enzymen, die in E. coli hergestellt wurden, wo solche Modifikationen nicht vorkommen würden, verglichen. Speziell wurden die Enzyme auf Unterschiede in der Substrat-Affinität und -Zugänglichkeit untersucht. Die Vorraussetzung für diese Studie war, dass die posttranslationalen Modifikationen Konformationsänderungen in der Struktur der Sphingosin-Kinase verursachen können, welche in detektierbaren Änderungen in den physikochemischen oder katalytischen Eigenschaften des Enzyms resultieren können. Zusammengefasst, wurde bestimmt, dass die rekombinant hergestellte Sphingosin-Kinase ihre funktionelle Aktivität sogar in der Abwesenheit post-translationaler Modifikation beibehält.
VERFAHREN
Die Substrat-Spezifität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Die relative Phosphorylierungsraten des Sphingosin durch die nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU der nativen bzw. rekombinanten Sphingosin-Kinasen. Die untersuchten Substrate wurden zu einer Endkonzentration von 100 μM in 0,25%-igem (Gew./Vol.) Triton X-100 zugegeben und unter den Standard-Versuchsbedingungen, die vorher dargestellt wurden, untersucht.
Die Substrat- und Inhibitor-Kinetiken der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Die Substrat-Kinetiken wurden durch Bereitstellen von Substraten über den Konzentrationsbereich von 0,5 bis 200 μM für die Sphingosin-Analoga und 5 bis 1000 μM für ATP bestimmt. Inhibitionskinetiken wurden durch die Verwendung von Inhibitoren über einen Konzentrationsbereich von 2 bis 50 μM bestimmt (Tabelle 5). In beiden Fällen wurden die Daten über nicht lineare Regression analysiert.
Die thermische Stabilitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Die thermische Stabilitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden durch Untersuchen der Restaktivität, die nach der Vorinkubation der Enzyme bei verschiedenen Temperaturen (4 bis 80°C) während 30 Min. bei pH 7,4 (50 mM Tris/HCl, enthaltend 10% Glycerin, 0,5 M NaCl und 0,05% Triton X-100) verblieb, bestimmt. Die ursprünglichen Aktivitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU.
Die pH-Stabilitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Die pH-Stabilitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden durch Untersuchen der Restaktivität, die nach der Vorinkubation des Enzyms bei verschiedenen pHs bei 4°C für 5 Std. verblieb, bestimmt. Die ursprünglichen Aktivitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU.
Der Effekt des pH-Wertes auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Der Effekt des pH-Wertes auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurde durch Untersuchen der Aktivität über den pH-Bereich von 4 bis 1 in 50 mM Puffern (Natriumacetat, pH 4,0–5,0; Mes, pH 6,0–7,0; Hepes, pH 7,0–8,2; Tris, pH 8,2–10,0; Caps, pH 10,0–11,0) bestimmt. Die maximalen Aktivitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU.
Der Effekt der Metall-Ionen auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Der Effekt der Metall-Ionen auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden durch Untersuchen der Aktivität unter Standard-Bedingungen in der Gegenwart verschiedener Metall-Ionen oder EDTA bei 10 mM bestimmt. Die maximalen Aktivitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU.
Der Effekt der Phospholipide auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Der Effekt der verschiedenen Phospholipide auf die Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden durch Untersuchen der Aktivität unter Standard-Bedingungen in Gegenwart dieser Phospholipide bei 10 mol-% Triton X-100 bestimmt. Die Aktivitäten der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen in Abwesenheit von Phospholipiden wurden willkürlich auf 100% gesetzt und entsprechen 2,65 kU bzw. 7,43 kU. PC, Phosphatidylcholin; PS, Phosphatidylserin; PE, Phosphatidylethanolamin; PI, Phosphatidylinositol.
ERGEBNISSE
Die maximale Aktivität der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden bei pH 7,4 beobachtet, wobei beide Enzyme mehr als 60% der maximalen Aktivität in dem pH-Bereich von 6,8 bis 7,4 (12) zeigten. Beide Sphingosin-Kinasen behielten mehr als 90% der ursprünglichen Aktivität nach 5 Std. Inkubation bei 4°C in dem pH-Bereich von 6 bis 7,8 (12) und bei pH 7,4 in Gegenwart von 10% Glycerin, 0,5 M NaCl und 0,05% Triton X-100 waren beide Enzyme für 30 Min. bei Temperaturen bis zu 37°C stabil (12). Die Enzyme waren in Puffern, denen Glycerin, NaCl und Triton X-100 fehlten, viel weniger stabil (Daten nicht gezeigt), was mit vorherigen Beobachtungen der Sphingosin-Kinasen aus Rinder-Hirn und Ratten-Niere (Louie et al., 1976; Olivera et al., 1998) konsistent war. Beide humanen Sphingosin-Kinasen zeigten ein Erfordernis für zweiwertige Metall-Ionen, da die Gegenwart von EDTA in den Versuchen die Aktivität eliminierte (12). Wie andere untersuchte Sphingosin-Kinasen (Louie et al., 1976; Buehrer & Bell. 1992; 1993; Olivera et al., 1998; Nagiec et al., 1998) zeigten beide humanen Enzyme höchste Aktivität mit Mg²⁺, et was niedrigere Aktivität mit Mn²⁺ und nur sehr niedrige Aktivität mit Ca²⁺. Andere untersuchte zweiwertige Metall-Ionen, einschließlich Zn²⁺, Cu²⁺ und Fe²⁺, unterstützten die Sphingosin-Kinase-Aktivität nicht (12).
Die nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen weisen sehr ähnliche und enge Substrat-Spezifitäten auf (13), wobei beide die größte Aktivität sowohl mit dem natürlich vorkommenden Säugetier-Substrat D-erythro-Sphingosin als auch mit D-erythro-Dihydrosphingosin zeigen. Niedrige Aktivität wurde ebenfalls für beide Enzyme gegen Phytosphingosin detektiert, während eine Auswahl anderer Sphingosin-Derivate und verwandter Moleküle nicht phosphoryliert wurde. Diese beinhalteten DL-threo-Dihydrosphingosin, N,N-Dimethylsphingosin, N,N,N-Trimethylsphingosin, N-Acetylsphingosin (C₂-Ceramid), Diacylglycerin (1,2-Dioctanoyl-sn-glycerin und 1,2-Dioleoyl-sn-glycerin) und Phosphatidylinositol. Die weitere Analyse der humanen Sphingosin-Kinasen mit sowohl D-erythro-Sphingosin als auch mit D-erythro-Dihydrosphingosin offenbarte Michaelis-Menten-Kinetiken über den verwendeten Konzentrationsbereich (13), wobei sowohl die nativen als auch die rekombinanten Sphingosin-Kinasen sehr ähnliche kinetische Eigenschaften und leicht höhere Affinität für D-erythro-Sphingosin genauso wie für D-erythro-Dihydrosphingosin zeigten (Tabelle 5). Beide Enzyme zeigten ebenfalls ähnliche Kinetiken, wenn Sphingosin als ein Sphingosin-BSA-Komplex bereitgestellt wurde, wenngleich das Vorliegen des Substrats in dieser Weise in niedrigeren k_cat-Werten für beide Enzyme (28 s^–1 und 39 s^–1 für die nativen bzw. rekombinanten Sphingosin-Kinasen) resultierte, im Vergleich zu seinem Vorliegen in mit Triton X-100 gemischten Mizellen, wie für alle anderen Versuche, die in dieser Studie durchgeführt wurden, verwendet. Das Sphingosin lieferte als ein BSA-Komplex K_m-Werte von 16 ± 4 mM bzw. 17 ± 2 mM für die nativen bzw. rekombinanten Sphingosin-Kinasen. Sowohl die nativen als auch die rekombinanten Sphingosin-Kinasen wiesen die gleiche Affinität für ATP auf (K_m von ungefähr 80 mM) (Tabelle 5).
Sowohl die native als auch die rekombinante Sphingosin-Kinase wurden durch DL-threo-Dihydrosphingosin, N,N-Dimethylsphingosin und N,N,N-Trimethylsphingosin inhibiert (13), wobei alle drei dieser Moleküle kompetitive Inhibition in Bezug auf das Sphingosin zeigten. Obwohl die Inhibitionskonstanten für diese Moleküle recht ähnlich waren, ergab N,N,N-Trimethylsphingosin etwas wirksamere Inhibition als DL-threo-Dihydrosphingosin, welches ein marginal wirksamerer Inhibitor als N,N-Dimethylsphingosin war (Tabelle 5).
Das ADP zeigte ebenfalls schwache kompetitive Inhibition mit Hinsicht auf das ATP (Tabelle 5). In allen Fällen wurden bemerkenswert ähnliche Inhibitionskonstanten für die nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen beobachtet (Tabelle 5). Keine Inhibition wurde mit N-Acetylsphingosin oder Fumosin B1, einem Ceramid-Synthase-Inhibitor, beobachtet.
Der Effekt von Calcium/Calmodulin auf die Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde untersucht. Unter den verwendeten Versuchsbedingungen wies Calcium/Calmodulin keinen Effekt auf die Aktivität der entweder nativen oder rekombinanten humanen Sphingosin-Kinasen auf (Daten nicht gezeigt). Während dieses Ergebnis ein Fehlen der Regulation der Sphingosin-Kinase-Aktivität durch Calmodulin andeutet, verbleibt die Möglichkeit, dass Calmodulin in einige andere Funktionen mit der Sphingosin-Kinase, wie das Regulieren deren subzellulären Lokalisation, involviert sein kann.
Die Stimulation der Sphingosin-Kinase-Aktivität durch saure Phospholipide wurde untersucht. Die Zugabe der neutralen Phospholipide Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin zu der Enzym-Versuchsmischung resultierte nicht in irgendwelchen detektierbaren Unterschieden in der Aktivität der humanen Sphingosin-Kinase, jedoch wurden merkliche Anstiege in der Aktivität (1,6- bis 2-fach) mit den sauren Phospholipiden, Physphatidylserin, Phosphatidylinositol und der Phosphatidsäure, beobachtet (14). Sowohl die nativen als auch die rekombinanten Sphingosin-Kinasen wurden in einer ähnlichen Weise durch diese sauren Phospholipiden aktiviert, wobei die kinetischen Analysen offenbarten, dass alle drei Phospholipide einen Anstieg in K_cat der Enzyme verursachten, während die K_m-Werte unverändert verblieben.
Der Fachmann wird verstehen, dass die hierin beschriebene Erfindung für andere Variationen und Modifikationen als die speziell beschriebenen offen ist. Es soll verstanden werden, dass die Erfindung alle solche Variationen und Modifikationen beinhaltet. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls alle der Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die, individuell oder zusammen, in der Beschreibung verwiesen wird, oder die angedeutet werden, und jede beliebige und alle Kombinationen von beliebigen zwei oder mehreren der Schritte oder Merkmale.
Tabelle 3 – Vergleich der Sphingosin-Kinase-Aktivität in humaner Plazenta mit verschiedenen tierischen Geweben
Frische tierische Gewebe wurden gewaschen und homogenisiert, wie für die humane Plazenta beschrieben. Der Anteil der cytosolischen Sphingosin-Kinase-Aktivität wurde durch den Vergleich der Gesamtaktivität in dem Homogenat zu der aus dem Ultrazentrifugations-Überstand (100.000 × g, 60 min) bestimmt. Die spezifische Aktivität der Sphingosin-Kinase ist als pmol S1P, gebildet pro Minute (U) pro g Gewebe, ausgedrückt.
Tabelle 4 – Die Reinigung der Sphingosin-Kinase aus der humanen Plazenta
Die Sphingosin-Kinase wurde aus 1240 g frischer humaner Plazenta (4 Plazentas) gereinigt. Eine Einheit (U) der Sphingosin-Kinase-Aktivität ist definiert als 1 pmol S1P, gebildet aus dem Sphingosin und ATP pro Minute.
Tabelle 5 – Die Substrat- und Inhibitionskinetiken der nativen und rekombinanten Sphingosin-Kinasen
Die Substrat-Kinetiken wurden durch Zuführen von Substraten über den Konzentrationsbereich von 0,5 bis 200 μM (0,0125 bis 5 mol-%) für Sphingosin-Analoga und 5 bis 1000 μM für ATP bestimmt. Die Inhibitionskinetiken wurden durch die Verwendung von Inhibitoren über einen Konzentrationsbereich von 2 bis 50 μM (0,05 bis 1,25 mol-%) für Sphingosin-Analoga und 0,1 bis 5 mM für ADP bestimmt. Für den Vergleich zu vorherigen Studien sind alle K_m- und K_i-Werte für das Sphingosin und seine Derivate sowohl als Konzentrationen der Bulklösung als auch als mol-% Triton X-100, sofern Triton X-100 bei einer Endkonzentration von 0,25% (Gew./Vol.) vorhanden war. Alle kinetischen Werte und Standardfehler (Duggleby, 1981) wurden durch nicht lineare Regressionsanalyse erhalten (Easterby, 1996).
BIBLIOGRAPHIE

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meier, E. W. und Lipman. D. J., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410
Alessenko, A. V., (1998) Biochemistry 63: 62–68
Bonner et al., (1973) J. Mol. Biol. 81: 123
Bradford, M. M., (1976) Anal. Biochem. 72: 248–254
Buehrer, B. M. und Bell, R. M., (1992) J. Biol. Chem. 267: 3154–5159
Buehrer, B. M. und Bell, R. M., (1993) Adv. Lipid Res. 26: 59–67
Buehrer, B. M., Bardes, E. S. und Bell, R. M., (1996) Biochim. Biophys. Acta 1303: 233–242
Culliver, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutkind, J. S. und Spiegel, S., (1996) Nature 381: 800–803
Douillard und Hoffman, Basic facts about hybridomas in Compendium of Immunology, Band II, verlegt von Schwartz (1981)
Duggleby, R. G., (1981) Anal. Biochem. 110: 9–18
Easterby, J. S., (1996) Hyper 1.1s: Hyperbolic Regression Analysis of Enzyme Kinetic Data. Liverpool University, Liverpool
Graham, F. L. und van der Eb, A. J., (1973) Virology 54: 536–339
Hanks, S. K., Quinn, A. M. und Hunter, T., (1988) Science 241: 42–52
Igarashi. Y., (1997) J. Biochem. 122: 1080–1087
Kohama. T., Olivera, A., Edsall. L., Nagiec. M. M., Dickson, R. und Spiegel, S., (1998) J. Biol. Chem. 273: 23722–23728
Kohler und Milstein., (1975) Nature 256: 495–499
Laernmli, U. K., (1970) Nature 227: 680–685
Louie, D. D., Kisic, A. und Schroepfer. G. J., (1976) J. Biol. Chem. 251: 4557–4564
Masai, I., Okazaki, A., Hosoya, T. und Hotta, Y., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11157–11161
Melendez, A., Floto, R. A., Gillooly, D. J., Harnett, M. M. und Allen, J. M., (1998) J. Biol. Chem. 273: 9393–9402
Meyer zu Heringdorf, D., van Koppen. C. J. und Jakobs, K. H., (1997) FEBS Lett 410: 34–38
Nagiec, M. M., Skrzypek, M., Nagiec, E. E., Lester, R. L. und Dickson, R. C., (1998) J. Biol. Chem. 273: 19437–19442
Olivera, A. und Spiegel, S., (1993) Nature 365: 557–560
Olivera, A., Kohama, T., Tu, Z., Milstein, S. und Spiegel, S., (1998) J. Biol. Chem. 273: 12576–12583
Ponting, C. P., Schultz, J., Milpetz. und Bork, P., (1999) Nucleic Acids Res. 27: 229–232
Ren, R., Mayer, B. J., Cicchetti, P. und Baltimore, D., (1993) Science 259: 1157–1161
Rhoads. A. R. und Friedberg, F., (1997) FASEB J. 11: 331–340
Sakane. F., Lai, M., Wada. I., Imai, S. und Kohoh, H., (1996) Biochem. J. 318: 583–590
Saraste, M., Sibbald, P. R. und Wittinghofer, A., (1990) Trends Biochem. Sci. 15: 430–434
Schaap, D., van der Wal, J. und van Blitterswijk, W., (1994) Biochem. J. 304: 661–662
Schultz, J., Milpetz, F., Bork, P., und Ponting, C. P., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 5857–5864
Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. und Klenk, D. C., (1985) Anal. Biochem. 150: 76–85
Spiegel, S., Culliver, O., Edsall, L., Kohama, T., Menzeleev, R., Olivera, A., Thomas, D., Tu, Z., Van Brocklyn, J. und Wang, F., (1998) Biochemistry (Mosc) 63: 69–73
Walker, J. E., Saraste, M., Runswick, M. J. und Gray, N. J., (1982) EMBO J. 8: 945–951
Wall, R. T., Harker, L. A., Quadracci, L. J. und Striker, G. E., (1978) J. Cell. Physiol. 96: 203–213
Wessel, D. und Flügge, U. I., (1984) Anal. Biochem. 138: 141–143
Xia, P., Gamble, J. R., Rye, K.-A., Wang, L., Hii, C. S. T., Cockerill, P., Khew-Goodall, Y., Bert, A. G., Barter, P. J. und Vadas, M. A., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14196–14201
Yu H., Chen, J. K., Feng, S., Dalgarno, D. C., Brauer, A. W. und Schreiber, S. L., (1994) Cell 76: 933–945

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für eine Sphingosin-Kinase kodiert, wobei das Nucleinsäuremolekül umfasst: (a) die Sequenz von Seq.-ID Nr. 1; oder (b) eine Sequenz, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 kodiert; oder eine zu der Sequenz von (a) oder (b) komplementäre Nucleotidsequenz.
Isoliertes Sphingosin-Kinase-Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2.
Verwendung eines Antagonisten eines Sphingosin-Kinase-Proteins nach Anspruch 2, ausgewählt aus der aus Antisense-Nucleinsäuren, Antikörpern, RNA, DNAzymen und RNA-Aptameren bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch Sphingosin-Kinase-Aktivität gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Erkrankung aus rheumatoider Arthritis, Asthma, Atherosklerose, Meningitis, multipler Sklerose, septischem Schock, Entzündung, Zellproliferation und Apoptose ausgewählt ist.