DE69432817T2

DE69432817T2 - Thermostabile dna topoisomerase v

Info

Publication number: DE69432817T2
Application number: DE69432817T
Authority: DE
Inventors: Alexei I. Los Angeles Slesarev
Original assignee: Fidelity Systems Inc
Current assignee: Fidelity Systems Inc
Priority date: 1993-03-24
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2014-03-25
Also published as: US5656463A; US5427928A; DE69432817D1; ATE242805T1; JPH08508167A; EP0694075A4; EP0694075B1; WO1994021811A1; EP0694075A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine thermostabile DNA-Topoisomerase V, Typ I, aus dem thermophilen Prokaryoten Methanopyrus kandleri, Verfahren zu ihrer Reinigung und Verfahren zu ihrer Verwendung.
Die Verschlingung der zwei Stränge der DNA-Helix bringt eine Reihe topologischer Probleme, die die Zelle überwinden muss um ihre genetische Information zu regenerieren, rekombinieren und zu exprimieren (M. Gellert, Annu. Rev. Biochem. 50: 879–910 (1981); J. C. Wang, Annu. Rev. Biochem. 54: 665–697 (1985); A. Maxwell und M. Gellert, Adv. Protein Chem. 38: 68–107 (1986); N. Osheroff, Pharmac. Ther. 41: 223–241 (1989); J. C. Wang et al., Cell 62: 403–406 (1990); J. C. Wang, J. Biol. Chem. 266: 6659–6662 (1991); A. Kornberg und T. A. Baker, in DNA Replication (2. Aufl.), W. H. Freeman und Company, New York, 1992, S. 379–401; J. C. Wang und L. F. Liu, in DNA Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990, S. 321–340). Folglich spielen die Enzynme, die den topologischen Zustand von Nukleinsäuren modulieren, die als DNA-Topoisomerasen bekannt sind, eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der physiologischen Funktionen von DNA.
Um die spätere Beschreibung zu vereinfachen, sind einige Definitionen, die für die DNA-Topologie relevant sind, nützlich. Supercoiling ist bei geschlossener, kreisförmiger DNA (ccDNA) wegen der topologischen Bindung der zwei komplementären Stränge typisch. Die Verknüpfungszahl, Lk, ist das quantitative Maß für diese Bindung: Es ist die algebraische Zahl für die Male, die ein Strang die Oberfläche kreuzt, die über den anderen Stamm gespannt ist. Der Lk-Wert ist eine topologische Invariante für ccDNA; es gibt keine Möglichkeit, dass sie verändert werden kann, es sei denn, es werden Kettenspaltungen durchgeführt. Die Zahl der Supercoils kann wie folgt definiert werden: ΔLk = Lk – N/γ0 worin N die Zahl der Basenpaare in einer DNA ist und γ₀ die Zahl der Basenpaare pro Windung der Doppelhelix unter gegebenen Umgebungsbedingungen ist. Die spezifische Verknüpfungsdifferenz oder die superhelikale Dichte ist wie folgt definiert: I' = γ0ΔLk/N
Wenn ΔLk > 0, wird die DNA als positiv supergeknäult bezeichnet; wenn ΔLk < 0, ist die DNA negativ supergeknäult. Eine Folge des negativen Supercoilings (bzw. der Superknäulung) ist die, dass die DNA-Helix leichter entwunden wird, d. h., die Stränge werden leichter getrennt, wohingegen ein positives Supercoiling (bzw. eine Superknäulung) ein Entwinden durch Verdichten der Steigung (bzw. Ganghöhe) der Helix schwieriger machen würde.
Veränderungen beim Lk-Wert werden in seine zwei geometrischen Komponenten aufgelöst (J. H. White, Am. J. Math. 91: 693–728 (1969)) ΔLk = ΔTw + Wrworin ΔTw die Differenz im axialen Twist jedes Strangs um die Achse der Doppelhelix ist, Wr das Ausmaß des Supercoilings ist und durch die räumliche Gestalt der Achse der Doppelhelix bestimmt wird (für detaillierte Diskussionen über den allgemeinen Aspekt der DNA-Topologie siehe DNA Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990)).
DNA-Transformationen, die durch DNA-Topoisomerasen durchgeführt werden, werden durch die Spaltung eines einzelnen Strangs oder beider Stränge erreicht. Die Einheitsänderung bei der Lk nach solchen Transformationen ist die beste funktionelle Unterscheidung zwischen den zwei Klassen von Topoisomerasen (P. O. Brown & N. R. Cozzarelli, Science 206: 1081-1083 (1979)). DNA-Topoisomerasen, deren Reaktionen über einen transienten Einzelstrang-Bruch und Veränderung der Lk in Stufen von eins ablaufen, werden als Typ 1 klassifiziert, wohingegen Enzyme, deren Reaktionen über Doppelstrang-Brüche und Veränderung der Lk in Stufen von zwei ablaufen, als Typ 2 klassifiziert werden.
Mitglieder der Familie der Topoisomerasen, Typ 2, umfassen DNA-Gyrase, bakterielle DNA-Topoisomerase IV, T-Evenphage-DNA-Topoisomerasen, eukaryotische DNA-Topoisomerase II und thermophile Topoisomerase II von Sulfolobus acidocaldarius (siehe die oben angegebenen Übersichten; A. Kikuchi et al., Syst. Appl. Microbiol. 7: 72–78 (1986); J. Kato et al., J. Biol. Chem. 267: 25676–25684 (1992); W. M. Huang in DNA-Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990), S. 265–284; T. -S. Hsieh in DNA Topology and Its Biological Effects, (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990), S. 243–263)). Die codierenden Sequenzen eines Dutzend oder so an Enzymen, Typ 2, wurden bestimmt, und die Daten legen nahe, dass alle diese Enzyme bezüglich der Evolution und der Struktur verwandt sind. Topologische Reaktionen, die durch Topoisomerasen, Typ 2, katalysiert werden, umfassen die Einführung von negativen Supercoils in DNA (DNA-Gyrase), die Relaxation (bzw. Entspannung) supergeknäulter DNA, Kettenbildung (oder Kettenabbau) von Duplexkreisen, Verknoten und Entknoten von DNA.
Die Familie der Topoisomerasen, Typ 1, umfasst bakterielle Topoisomerase I, E. coli-Topoisomerase III, S. cerevisiae-Topoisomerase III (R. A. Kim & J. C. Wang, J. Biol. Chem, 267: 17178–17185 (1992)), die Topoisomerase, Typ 1, aus Chloroplasten, die bakteriellen Enzymen sehr ähnelt (J. Siedlecki et al., Nucleic Acids Res. 11: 1523–1536 (1983)), thermophile reverse Gyrasen (A. Kikuchi in DNA Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990), S. 285–298); C. Bouthier de la Tour et al., J. Bact. 173: 3921–3923 (1991)), thermophile D. amyloticus-Topoisomerase III (A. I. Slesarev et al., J. Biol. Chem. 266: 12321–12328 (1991)), nukleare Topoisomerasen I und eng verwandte Enzyme aus Mitochondrien und Pockenviren (N. Osheroff Pharmac. Ther. 41: 223–241 (1989)). Bezüglich des Katalysemechanismus können diese Topo isomerasen in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die Gruppe A besteht aus Enzymen, die Einzelstrang-spezifisch sind und mit den 5'-Phosphoryltermini einen transienten kovalenten Komplex bilden (prokaryotische Topoisomerasen, Typ 1, und S. cerevisiae-Topoisomerase III). Gruppe B umfasst Topoisomerasen, Typ 1, die an Duplex-DNAs wirken und kovalent an die 3'-Phosphoryltermini binden (nukleare Topoisomerasen I, Enzyme aus Mitochondrien und Pockenviren, die allgemein als eukaryotische Topoisomerasen I bezeichnet werden). Topoisomerasen, Typ 1, können die folgenden topologischen Reaktionen durchführen; sie entspannen superverknäulte DNA (ausgenommen reverse Gyrasen), verketten (oder entketten) einzelstrangige, kreisförmige DNA oder Doppelstränge, vorausgesetzt, dass mindestens eins der Moleküle einen Schnitt oder eine Lücke enthält, wechselwirkend mit Einzelstrang-Kreisen um topologische Knoten einzuführen (Topoisomerasen, Gruppe A, Typ 1). Reverse Gyrase, die zu den Topoisomerasen Gruppe A, Typ 1, gehört, ist die einzige Topoisomerase, die sich als fähig erwiesen hat, positive Supercoils in ccDNA einzuführen.
Untersuchungen über DNA-Topoisomerasen wurden von der DNA-Enzymologie zur Entwicklung von Therapeutika fortgeführt. Bakterielle DNA-Topoisomerase II ist ein wichtiges therapeutisches Ziel von Chinolon-Antibiotika; Säugetier-DNA-Topoisomerase II ist das zelluläre Ziel vieler wirksamer Antitumorarzneimittel (K. Drlica, Microbiol. Rev. 48: 273–289 (1984) und Biochemistry 27: 2253–2259 (1988); B. S. Glisson & W. E. Ross, Pharmacol. Ther. 32: 89–106 (1987); A. L. Bodley & L. F. Liu, Biotechnology 6: 1315–1319 (1988); L. F. Liu, Annu. Rev. Biochem. 58: 351–375 (1989)). Diese Arzneimittel, die als Topoisomerase II-Gifte bezeichnet werden, treten mit der Spaltungs-Wiederverknüpfungsreaktion von Topoisomerasen, Typ II, in Wechselwirkung, indem sie ein kovalentes Schlüsselreaktions-Zwischenprodukt, das als spaltbarer Komplex bezeichnet wird, abfangen. Es hat sich gezeigt, dass Säugetier-Topoisomerase, Typ 1, Gruppe B, das Ziel von Camptothecin (CPT), einem Pflanzenalkaloid mit starker Antitumoraktivität, ist. CPT und seine Derivate fangen auch ein vermeindliches kovalentes Reaktionszwischenprodukt, den spaltbaren Komplex, ab. Dieser Typ einer reversiblen DNA-Schädigung ist für proliferierende Zellen lethal und ist für die Antitumor-Aktivität von Topoisomerasegiften verantwortlich (Y. -H. Hsiang et al., J. Biol. Chem. 260: 14873–14878 (1985); Y. Hsiang et al., Cancer Res. 49: 5077–5082 (1989); C. Holm et al., Cancer Res. 49: 6365–6368 (1989), P. D'Arpa et al., Cancer Res. 50: 6919–6924 (1990); A. Y. Chen et al., Cancer Res. 51: 639–6044 (1991)). Eine erhöhte Beachtung für CPT und seine Derivate als äußerst vielversprechende Antikrebsmittel, die sich derzeit in klinischen Versuchen befinden (W. J. Slichenmyer et al., J. Natl. Cancer Inst. 85: 271–287 (1993); U.S.-Patent Nr. 5 106 742 (Camtothecin-Analoga als wirksame Inhibitoren für Topoisomerase I); U.S.-Patent Nr. 5 122 526 (Camptothecin und Analoga davon und pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren unter Verwendung dieser)) führten zur Isolierung verschiedener CPT-resistenter Zelllinien, und es wurde eine CPT-resistente Mutante der humanen Topoisomerase I charakterisiert (H. Tamura et al., Nucleic Acids Res. 19: 69–75 (1991)). Durch die Verwendung eines Hefestamms, in dem Hefe-Topoisomerase, Gruppe B, Typ 1, durch ihr humanes Gegenstück ersetzt ist, wurden andere CPT-resistente Mutanten des humanen Enzyms isoliert (P. Benedetti et al.; in Drug Resistance as a Biochemical Target in Cancer Chemotherapy (T. Tsuruo, M. Ogawa & S. K. Carter, Herausg., Academic Press, San Diego, CA, 129, 1991)). Darüber hinaus ist eine Identifizierung der Mutationsstellen von CPT-resistenten Topoisomerasen, Gruppe B, Typ I, zur Modellierung neuer Derivate, die gegen CPT-resistente Tumorzellen wirken, äußerst nützlich.
Bis jetzt wurden Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, nur in Eukaryoten gefunden. Man könnte erwarten, dass ein Auffinden von prokaryotischen Gegenstücken zu eukaryotischen Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, sowohl von Pharmakologen, wie auch von Medizinern mit großem Interesse gesehen würde. Obgleich es für die Enwicklung neuer Arzneimittel wichtig wäre, die gemeinsamen Merkmale von Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, zu erklären, wäre es gleichermaßen wichtig, die Unterschiede zwischen ihnen zu erforschen. Auch die neuen Organismen, die Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, beherbergen, wären als potentielle Quellen für die natürlichen Inhibitoren dieser Enzyme von klinischem Interesse. Beispielsweise begünstigt in E. coli das Mini-Plasmid-CcdB-Protein, ähnlich wie Chinolon-Antibiotika und Antitumorarzneimittel, eine von DNA-Gyrase-vermittelte Doppelstrang-DNA-Spaltung (P. Bernard & M. Couturier, J. Mol. Biol. 226: 735–745 (1992)).
Ein weiterer Aspekt der medizinischen Verwendbarkeit von Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, ist die Identifizierung des humanen Scl-70-Antigens als DNA-Topoisomerase I. Patienten mit Sclerodermie (progressive systemische Sklerose) können hohe Titer an autoimmunem Antikörper, der gegen humane Topoisomerase I gerichtet ist, erzeugen (J. H. Shero et al., Science 231: 737–740 (1986)). Die Verfügbarkeit von clonierter humaner Topoisomerase I ermöglicht die Entwicklung von Verfahren zur schnellen Durchmusterung auf das Vorliegen dieser Antikörper in Patientensera (P. D'Arpa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2543–2547 (1988); U.S.-Patent Nr. 5 070 192 (clonierte humane Topoisomerase I: cDNA-Expression und Verwendung zur Autoantikörperdetektion)). Bemerkenswerterweise werden Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, von höheren Pflanzen trotz der Divergenz der Naturreiche von humanen Anti-Topoisomerase-Autoantikörper erkannt (P. F. Agris et al., Exp. Cell Res. 189: 276–279 (1990)). Es ist denkbar, dass humaner Autoantikörper auch Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, aus prokaryotischen Organismen erkennen würde. Bei Anwendung von humanem Antikörper auf prokaryotische Systeme könnten Immunpräzipitationen, kompetetive Bindungsassays, Zellfunktionsstudien und Sondierungsexpressionsbibliotheken erhalten werden. Die Verwendung von humanem Anti-Topoisomerase-Antikörper als Sonden für die prokyryotische Topoisomerase, Gruppe B, Typ 1-Struktur, kann beim weiteren Verständnis der Wechselwirkung von humaner Topoisomerase I und chemotherapeutischen Krebsmitteln wichtig sein. Schließlich würde eine derartige Kreuzreaktivität auch für die Autoimmunität klinische Bedeutung haben. Sera von Patienten mit Sklerodermie hatten mindestens 6 unabhängige Epitope an humaner Topoisomerase I als Ziel. cDNA-Moleküle, die einen Teil der cDNA-Sequenz von humaner Topoisomera se I umfassen, der für mindestens ein Epitop für Auto-Antikörper gegen humane Topoisomerase I codiert, sind verfügbar (P. D'Arpa et al., Arthritis Rheum. 33: 1501–1511 (1990)). Andere Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, die mit antihumanem Topoisomerase I-Antikörper reagieren, könnten auf diese Weise eingesetzt werden. Dies könnte bei der Verfolgung der Entwicklung eines Autoimmunantikörpers gegen besondere Epitope während des Fortschreitens der Erkrankung von Bedeutung sein.
Eine der treibenden Kräfte nach der Molekularbiologie ist die erfolgreiche Verwendung von Enzymen als Reagentien. Mesophile Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, werden in große Umfang zur Analyse des DNA-Supercoilings, der DNA-Konformation, in vitro-Transkription und der Chromatinrekonstitution eingesetzt (M. D. Frank-Kamenetskü, in DNA Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990), S. 185–215; Y. Zivanovic et al., J. Mol. Biol. 214: 479–495)). Die Verfügbarkeit von thermophilen Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, vereinfacht die Manipulation der DNA-Konformation signifikant. Reverse Gyrase ist dabei, ein unverzichtbares Werkzeug zur Herstellung von positiv supergeknäulter DNA zu werden, wohingegen D. amylolyticus-Topoisomerase III ein zweckdienliches Werkzeug zur Herstellung von ccDNA mit unterschiedlichem Grad des negativen Supercoilings ist (A. I. Slesarev et al., J. Biol. Chem. 266: 12321–12328 (1991)).
Eine Chromatin-Rekonstitution in vitro erfolgt üblicherweise bei 0,5–1,0 M, während eukaryotische Topoisomerase I durch eine NaCl-Konzentration von 0,2 M und höher gehemmt wird (P. A. Der Garabedian et al., Biochemistry 30: 9940–9947 (1990)). Bei 0,2 M NaCl ist die Nukleosomanordnung sehr ineffizient, so dass ein Bedarf an Topoisomerasefunktion in einem weiten Bereich der Ionenstärke besteht. Darüber hinaus erhöht der jüngere Fortschritt auf diesem Gebiet den Bedarf an thermostabilen Topoisomerasen mit Eigenschaften, die denen von eukaryotischer Topoisomerase I sehr ähnlich sind (J. Bashkin et al., Biochemistry 32: 1895-1898)).
Andere Anwendungen von Topoisomerasen können ihre Fähigkeit, DNA an spezifischen Stellen zu spalten ("spezifische Endonukleasen"), ihre Fähigkeit, mit DNA einen kovalenten Komplex zu bilden, ihre Substratselektivität ausnützen. Von potentiellem Interesse ist eine Topoisomerase-Religations-Halbreaktion. Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, katalysieren die in vitro-Ligation von nichthomologen DNA-Fragmenten, denen jegliche Sequenzhomologie oder Komplementarität fehlt (M. D. Been & J. J. Champoux, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2883–2887 (1981)). Pan et al. offenbarten ein Verfahren zur Ligation künstlicher Substrate, die einen Tyrosinrest am 3'-PO₄ eines geeigneten Oligonukleotids tragen, mit Säuger-Topoisomerase I (J. Biol. Chem. 268: 3683–3689 (1993)).
Die Herstellung und Analyse von spezifischen Nukleotid- und Protein-Sequenzen bildet eine Basis für die derzeitige Molekularbiologie, Biotechnologie und Molekularmedizin. Die enzymatische DNA-Sequenzierung (F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) unter Verwendung von Sequenase-Enzym (US Biochemical, Cleveland, OH) ist derzeit das poplulärste Verfahren um genetische Information zu erhalten. Für eine Verbesserung bei dem Verfahren, das arbeitsaufwendige Schritte eliminieren wird oder die Empfindlichkeit erhöhen wird, besteht auf dem Gebiet ein großer Bedarf. Es wird im Allgemeinen akzeptiert, dass die Verwendung von doppelsträngiger DNA zur Sequenzierung für den Aufbau und die Verwendung von einzelsträngiger DNA trotz Probleme mit DNA-Denaturierung und Reassozüerung vorteilhaft ist. Die Denaturierung von herkömmlich gereinigter ccDNA beinhaltet eine Alkalibehandlung, die für die DNA gefährlich ist, worauf sich eine Zeit- und Arbeitsaufwändige DNA-Präzipitation anschließt, während der eine Reassozüerung erfolgen kann (S. M. Adams et al., Focus 13: 56–58 (1991); D. F. Barker, Biotechniques 14: 168–169 (1993)). Dies führt zu weniger lesbaren Basen. Eine Sequenzierung bei höheren Temperaturen kann eine Reassozüerung eliminieren, führt aber zu einer höheren Fehlerrate.
Somit besteht ein Bedarf für eine zuverlässige Technologie der Plasmidmatrizenherstellung zur Sequenzierung, die mit populären Sequenzierungsprotokollen kompatibel ist.
Die Polymerase-Kettenreaktion (R. K. Saiki et al., Science 230: 1350–1354 (1985); H. A. Erlich, Herausg., PCR technology: Principles and applications for DNA amplification (Stockton Press, New York, 1989)) ist die Grundtechnik, die eine Amplifizierung von DNA-Stücken, ausgehend von winzigen Materialmengen mit begrenztem Wissen über seine genaue Primärstruktur erlaubt. Ihre Entwicklung und Verfeinerung wird mit raschen Schritten fortgesetzt. Eine andere Kettenreaktion, die 1990 eingeführt wurde (europäische Patentanmeldung EP 88311741.8 ; F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193 (1990)) basiert auf Ligase und ist dabei, ein wirksames Werkzeug in der medizinischen Diagnostik zu werden. Der Erfolg dieser Techniken beruhte auf der Verwendung von thermostabilen Enzymen. Wenn allerdings eine PCR- oder LCR-Amplifikation an einer Plasmidmatrize durchgeführt wird, kann eine schlechte Denaturierung von ccDNA zu einem Versagen bei der Detektion von Produkten führen (E. C. Lau et al., Biotechniques 14: 378 (1993)). Daher benötigen diese Techniken auch ein Verfahren zur Plasmidmatrizenherstellung für ein zuverlässiges Primer-Anlagern.
Eine der Lösungen des obigen Problems besteht im Ersatz einer DNA-Denaturierung durch eine spezielle und einfacherere topologische Behandlung mit einem thermostabilen Enzym (mit thermostabilen Enyzmen), die es erlaubt, dass ein Primer mit derselben Effizienz an die doppelsträngige DNA wie an die einzelsträngige DNA anlagert. Der Effekt basiert auf der topologischen Destabilisierung (Bindungslösung) der Doppelhelix, die in einem weiten Bereich variiert werden kann. Die Grenzprodukte der Bindungslösung sind ccDNA mit wenigen Bindungen oder sogar einzelsträngige, komplementäre Ringe. Eine solche DNA, Form V genannt, kann bei Raumtemperatur 10 bis 40% Einzelstrangregionen enthalten und wird bei erhöhter Temperatur leicht schmelzen (U. H. Stettler et al., J. Mol. Biol. 131: 21–40 (1979)). Der Nicht-Matrizen-Strang des Doppelstrangs wird eine anschließende Verlängerung nicht behindern und wird darüber hinaus eine topologische Kraft zur Begünstigung der Verlängerung schaffen. Das Verfahren ist gleichermaßen auf ein Verfahren anwendbar, das eine Primer-Anlagerung und/oder -Verlängerung, d. h., enzymatische ccDNA-Sequenzierung, PCR, LCR, Hybridisierungssonden-Herstellung, usw., involviert, anwendbar.
Es gibt mehrere enzymatische Verfahren zur Herstellung von in hohem Maße unterwundenen ccDNA-Molekülen (M. Iwabuchi et al., J. Biol. Chem. 258: 12394–12404 (1983); A. M. Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1256–1260 (1983); T. A. Baker et al., Cell 45: 53–64 (1986); B. F. Pugh & M. M. Cox, J. Biol. Chem. 262: 1326–1336 und 1337–1343 (1987); C. A. Parada & K. J. Marians, J. Biol. Chem. 264: 15120–15129 (1989); B. F. Pugh et al., J. Mol. Biol. 205: 487–492 (1989)). Allerdings erfordern die Verfahren Multienzymkomplexe aus mindestens zwei verschiedenen Enzymen und spezifische Pufferbedingungen. Außerdem sind die in diesen Verfahren eingesetzten Enzyme thermolabil und können in PCR oder LCR nicht eingesetzt werden.
Slesarev et al. offenbart, dass thermostabile Topoisomerase III, Gruppe A, Typ 1, aus Desulfurococcus amylolyticus den Lk-Wert von ccDNA wesentlich reduzieren kann und in hohem Maße ungewundene Formen von ccDNA im Schmelzbereich linearer DNA erzeugen kann (J. Biol. Chem. 266: 12321–12328 (1991)). Allerdings ist diese Topoisomerase Mg²⁺-abhängig, bei geringen Salzbedingungen unwirksam und wird durch Einzelstrang-DNA behindert. Außerdem benötigt sie eine sehr hohe Temperatur um bei entspannter und positiv supergeknäulter DNA wirksam zu sein. Diese Eigenschaften von Dam-Topoisomerase III werden mit den Standard-Puffer-Bedingungen, die bei der enzymatischen DNA-Sequenzierung, PCR oder LCR verwendet werden, wechselwirken, und das Enzym wird durch die Reaktionsprodukte gehemmt werden.
Somit besteht ein Bedarf für eine thermostabile (ATP, Mg²⁺)-unabhängige, entspannende DNA-Topoisomerase, die durch einzelsträngige DNA nicht inhibiert wird, die bei positiv und negativ supergeknäulter DNA gleichermaßen aktiv ist, die über einen weiten Temperaturbereich und einen weiten Bereich von Salzbedingungen aktiv ist um so die Leistungsfähigkeit dieser Manipulationen an DNA bequemer und effizienter zu ermöglichen.
ZUSAMMENFASSUNG
Eine thermostabile Topoisomerase, Gruppe B, Typ 1, wurde aus dem hyperthermophilen Methanogenen Methanopyrus kandleri isoliert und zu substanzieller Homogenität gereinigt. Diese Topoisomerase, als Topoisomerase V bezeichnet, ist die erste Topoisomerase, Gruppe B, Typ 1, die aus einem Prokaryoten bekannt wurde. Die im Wesentlichen gereinigte Topoisomerase ist im Wesentlichen frei von anderen Enzymen, die auf DNA wirken. Die gereinigte Topoisomerase ist ein einzelsträngiges Polypeptid mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 110.000 Dalton, basierend auf Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von thermostabiler Topoisomerase V. Das Verfahren umfasst:

(a) Lysieren von M. kandleri-Zellen unter Bildung eines Lysats;
(b) Behandeln des Lysats mit Polyethylenimin unter Bildung eines Präzipitats und eines Überstands;
(c) Präzipitieren des Polyethyleniminüberstands mit Ammoniumsulfat unter Bildung eines Ammoniumsulfat-Präzipitats;
(d) Chromatographieren des Ammoniumsulfat-Präzipitats an Phosphocellulose unter Herstellung eines Phosphocellulose-Eluats;
(e) Chromatographieren des Phosphocellulose-Eluats an Heparin unter Herstellung eines Heparin-Eluats;
(f) Chromatographieren des Heparin-Eluats an einer Säule um Proteine durch ein Molekularsieb darin abzutrennen um eine gereinigte thermostabile DNA-Topoisomerase V herzustellen; und
(g) Isolieren der gereinigten thermostabilen Topoisomerase.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Entspannung von supergeknäulter DNA, umfassend Behandlung einer supergeknäulten DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus positiv supergeknäulter DNA und negativ supergeknäulter DNA mit der Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur und bei Ionenbedingungen, bei denen keine Trennung von komplementären DNA-Strängen der linearen Form von behandelter, geschlossener, kreisförmger DNA auftritt, und bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, die es erlauben, dass das Enzym an DNA bindet und die Entspannungsreaktion katalysiert um behandelte DNA zu erzeugen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Trennung geschlossener, ringförmiger DNA (zum Lösen von Verknüpfungen bei geschlossener, ringförmiger DNA), umfassend Behandeln geschlossener, ringförmiger DNA mit der Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur und bei ionischen Bedingungen, die die Trennung von komplementären DNA-Strängen der linearen Form behandelter, geschlossener, kreisförmiger DNA erlauben, und bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, die erlauben, dass das Enzym an DNA bindet und die Trennungsreaktion katalysiert um DNA mit einer Verknüpfungszahl herzustellen, die niedriger ist als die Verknüpfungszahl der DNA vor der Behandlung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Komplex, umfassend die Topoisomerase der vorliegenden Erfindung, nichtkovalent an DNA gebunden.
Ein Komplex, der die erfindungsgemäße Topoisomerase umfasst, kann kovalent an das 3'-Ende eines DNA-Strangs gebunden sein. Die Topoisomerase kann auch kovalent an das 3'-Ende eines gespaltenen Strangs von offener, kreisförmiger DNA gebunden sein.
Ein Verfahren zur kovalenten Komplexbildung kann umfassen:

(1) Inkubieren der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an die DNA und das Spalten eines Strangs durch die Topoisomerase ermöglichen;
(2) Denaturieren der Topoisomerase, wobei ein kovalenter Komplex zwischen der Topoisomerase und der DNA zurückbleibt. Ein Verfahren zur Verwendung von Topoisomerase V als spezifische Endonuklease kann umfassen:
(1) Inkubieren der erfindungsgemäßen Topoisomerase mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an die DNA und das Spalten eines Strangs durch die Topoisomerase an einer spezifischen Sequenz ermöglichen; und
(2) Denaturieren der Topoisomerase, was zu gespaltener DNA führt. Ein Verfahren zur Produktion eines aktivierten DNA-Substrats mit mindestens einem einzelnen Aminosäurerest, der kovalent an das 3'-POa-Ende eines DNA-Strangs, benachbart zur Erkennungsstelle der erfindungsgemäßen Topoisomerase gebunden ist, kann umfassen:
(1) Inkubieren der Topoisomerase mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an DNA und die Spaltung eines Strangs durch die Topoisomerase an einer spezifischen Sequenz ermöglichen; und
(2) danach Denaturieren der Topoisomerase und Hydrolysieren der Topoisomerase mit einer nichtspezifischen Protease.

Partielle Aminosäuresequenzen sind für Topoisomerase V bekannt; diese schließen die Amino-terminale Aminosäuresequenz und Sequenzen von Fragmenten, die durch das proteolytische Enzym Endoproteinase Lys-C produziert werden, ein. Dementsprechend liegen thermophile DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, die eine Amino-terminale Aminosäuresequenz besitzen, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt ist, auch im Rahmen der Erfindung:

(1) Die Amino-terminale Aminosäuresequenz von M. kandleri-Topoisomerase V; und
(2) eine Amino-terminale Aminosäuresequenz, die mit der Amino-terminalen Aminsäuresequenz von M. kandleri-Topoisomerase V durch eine oder mehrere konservative Aminosäure-Substitutionen verwandt ist. Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen thermostabile DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, die mindestens eine Aminosäuresequenz besitzen, die aus der Gruppe, bestehend aus
(1) der Sequenz K-S-D-T-E-T-I-E-T
(2) der Sequenz K-P-E-L-P-Y-V-A-V-P-P-H-M-A-E-R-A-R-R-V-L-T-R-E-D-D-L-A-X-D-V-X-A
(3) der Sequenz K-R-V-P-R-A-X-X-G-X-X-F-D-R-L
(4) der Sequenz K-S-G-R-Q-E-R-S-E-E-E-E-K-E-E-L-E-R-K-V-G-E-G-R-A-R-R-L-I-E-Y-F-G-S-A
(5) der Sequenz K-Y-G-S-A-S-X-X-R-R-L-P-X-E-E-X-R-E-L-G-F-X-D-D-R; und
(6) einer Sequenz, die mit den in (1) bis (5) angegebenen Sequenzen durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen verwandt ist, ausgewählt ist.

Ein Antikörper kann die im Wesentlichen gereinigte, thermostabile DNA-Topoisomerase der vorliegenden Erfindung spezifisch binden. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein.
Es kann ein immunreaktiver Komplex von Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung mit einem anti-humanen Topoisomerase I-Antikörper gebildet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion und/oder Bestimmung der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung, umfassend die Stufen:

(a) Umsetzen der Topoisomerase mit einem Antikörper gegen humane Topoisomerase I; und
(b) Detektion und/oder Bestimmung jener Topoisomerase V durch Detektion und/oder Bestimmung eines Antigen-Antikörper-Komplexes zwischen der Topoisomerase und dem Antikörper.

In der vorliegenden Erfindung können auch andere Antikörper verwendet werden. Diese umfassen: (1) einen Antikörper, der spezifisch an ein Fragment mit etwa 70.000 Dalton der im Wesentlichen gereinigten Topoisomerase der vorliegenden Erfindung bindet, das vom Amino-Ende des Topoisomeraseproteins stammt; und (2) einen Antikörper, der spezifisch an ein Fragment mit etwa 33.000 Dalton der im Wesentlichen gereinigten Topoisomerase der vorliegenden Erfindung, das vom Carboxyl-Ende des Topoisomeraseproteins stammt, bindet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung, der angefügten Ansprüche und der beigefügten Zeichnungen besser verständlich; dabei ist
1 ein Diagramm von A₂₈₀ und der NaCl-Konzentration für das Eluat aus der Phosphocellulosesäule bei der Reinigung von Methanopyrus kandleri-Topoisomerase V zusammen mit einer Aufnahme eines silber-gefärbten 4-15%-Gradienten-Polyacrylamidgels, die die Proteinzusammensetzungen von Fraktionen im Eluat zeigt und die Fraktionen angibt, die als Fraktionen IVa und IVb genommen werden;
ist 2 ein Diagramm von A₂₈₀ und der NaCl-Konzentration für das Eluat aus der Heparinchromatographie von Fraktion IVa zusammen mit einer Aufnahme eines Coomassie blau-gefärbten 4-15%-Gradienten-Polyacrylamidgels, die die Proteinzusammensetzungen von Fraktionen im Eluat zeigt und die als Fraktion Va genommenen Fraktionen zeigt;
ist 3 ein Diagramm von A₂₈₀ und der NaCl-Konzentration für das Eluat aus der Heparinchromatographie von Fraktion IVb zusammen mit einer Aufnahme eines Coomassieblau-gefärbten 4-15%-Gradienten-Polyacrylamidgels, die die Proteinzusammensetzungen von Fraktionen im Eluat zeigt und die als Fraktion Vb genommenen Fraktionen anzeigt;
ist 4 eine Photographie von silber-gefärbten 7,5%-Polyacrylamidgelen, die die Proteinzusammensetzungen von Fraktionen aus dem Eluat zeigen, das aus der Gelfiltration der Fraktionen Va, Vb, Vc und Vd aus der Reinigung von M. kandleri-Topoisomerase resultiert;
ist 5A ein Diagramm der A₂₈₀ (-------) und der Topoisomerase V-Aktivität (---o---) des Eluats aus der Gelfiltration von Fraktion Va;
ist 5B eine Aufnahme eines silber-gefärbten 7,5%-Polyacrylamidgels, das die Proteinzusanunensetzung von Fraktionen aus dem Eluat zeigt, das aus einer Gelfiltration von Fraktion Va, die zusätzliche Fraktionen zeigt, resultiert;
ist 6 ein Immunblot von humaner Topoisomerase II, λ Int-Protein, Weizenkeim-Topoisomerase I, Kälberthymus-Topoisomerase I, humaner Topoisomerase I und M. kandleri-Topoisomerase V mit Antikörper gegen humane Topoisomerase I;
ist 7 ein Immunblot von humaner Topoisomerase I, Fraktion 63, aus der Gelfiltration von Fraktion Va(S-200a-63), Fraktionen 59 und 67 aus der Gelfiltration von Fraktion Vc (S-200c-59 und S-200c-67) und Fraktion 63 aus der Gelfiltration von Fraktion Vb (S-200b-63);
sist 8A eine Photographie eines Agarosegels, die den Zeitverlauf der M. kandleri-Topoisomerase V-Aktivität bei positiv oder negativ supergeknäulter pBR322-DNA in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 1 M Kaliumglutamat und 5 mM Na₂EDTA zeigt, wobei eine Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 8B eine Aufnahme eines Agarosegels, die den Effekt der Temperatur auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit positiv supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 1 M Kaliumglutamat und 5 mM Na₂EDTA zeigt;
ist 8C eine Aufnahme eines Agarosegels, die die Wirkung der Temperatur auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit negativ supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 1 M Kaliumglutamat und 5 mM Na₂EDTA zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 25 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 9A eine Photographie eines Agarosegels, das die Wirkung einer ansteigenden Konzentration an Kaliumglutamat auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit einem Gemisch aus negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 88°C und 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C) und 5 mM Na₂-EDTA zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 9B eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Kaliumchlorid auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit einem Gemisch aus negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 88°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 5 mM Na₂EDTA zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 9C eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit einem Gemisch von negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 88°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 5 mM Na₂EDTA zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 10A eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Kaliumglutamat auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit negativ supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 80°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C) und 5 mM Na₂EDTA zeigt.
ist 10B eine Photographie eines Agarosegels, wie in 10A, außer, dass 5 mM MgCl₂ für 5 mM Na₂EDTA eingesetzt wurden;
ist 10C eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Kaliumchlorid auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit negativ supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 80°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C) und entweder 5 mM MgCl₂ oder 5 mM Na₂EDTA zeigt;
ist 10D eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die enzymatische Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit negativ supergeknäulter pBR322-DNA als Substrat bei 80°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C) und entweder 5 mM MgCl₂ oder 5 mM Na₂EDTA zeigt;
ist 11 eine Photographie eines Agarosegels, die die Entspannung eines einzigen Topoisomeren durch M. kandleri-Topoisomerase V mit nativer pUC19-DNA oder ihrem einzigen Topoisomeren als Substrat zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 2 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 12 eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an einsträngiger UX174-DNA auf die Entspannung von positiv oder negativ supergeknäulter pBR322-DNA durch M. kandleri-Topoisomerase V bei 90°C oder 70°C zeigt;
ist 13A eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V bei entspannter pBR322-DNA bei 80°C in Gegenwart von 5 mM Na₂EDTA oder 5 mM MgCl₂ zeigt, was die Trennungsaktivität (Aktivität zum Lösen von Verknüpfungen) des Enzyms demonstriert;
ist 13B eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V bei entspannter pBR322-DNA bei 95°C in Gegenwart von 5 mM Na₂EDTA oder 5 mM MgCl₂ zeigt, was die Trennungsaktivität (Aktivität zum Lösen von Verknüpfungen) des Enzyms demonstriert;
ist 13C eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die Aktivität zur Lösung von Verknüpfungen von M. kandleri-Topoisomerase auf entspannte pBR322-DNA bei 80°C in Gegenwart von 5 mM Na₂EDTA oder 5 mM MgCl₂ bei höheren Konzentrationen von Natriumchlorid zeigt;
ist 13D eine Photograhpie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die Aktivität zur Lösung von Verknüpfungen von M. kandleri-Topoisomerase auf entspannte pBR322-DNA bei 95°C in Gegenwart von 5 mM Na₂EDTA oder 5 mM MgCl₂ bei höheren Konzentrationen von Natriumchlorid zeigt;
ist 14A eine Photographie eines zweidimensionalen Agarosegels, die den Wettbewerb von M. kandleri-Topoisomerase V für Substrat-DNA mit entspannter pBR322-DNA und entspannter pGEM3-DNA bei niedriger oder hoher Natriumchlorid-Konzentration zeigt, wobei die Elektrophorese in der ersten Abbildung ohne Chlorquin durchgeführt wurde und in der zweiten Abbildung mit 4 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 14B eine Photographie eines zweidimensionalen Agarosegels, die die Kompetition von M. kandleri-Topoisomerase V für Substrat-DNA mit entspannter pBR322-DNA und einem Verbundpräparat, das supergeknäulte und entspannte pGEM3-DNA enthält, bei niedriger oder hoher Natriumchlorid-Konzentration zeigt, wobei die Elektrophorese in der ersten Abbildung ohne Chlorquin durchgeführt wurde und in der zweiten Abbildung mit 4 μg/ml Chlorquin durchgeführt wurde;
ist 15 eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung von Dimethylsulfoxid und Camptothecin auf die Aktivität von M. kandleri-Topoisomerase V mit pBR322-DNA als Substrat bei 70°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bei 25°C), 1 M Kaliumglutamat und 5 mM Na₂EDTA zeigt;
ist 16 eine Photographie eines silber-gefärbten 4–15%-Gradienten-Polyacrylamidgels und sein Autoradiogramm, das eine kovalente Komplexbildung zwischen pBR322-DNA und M. kandleri-Topoisomerase V zeigt;
ist 17 ein Autoradiogramm eines denaturierenden 6%Polyacrylamidgels, das pGEMI-DNA, gespalten durch M. kandleri-Topoisomerase V, zeigt, wobei die Spaltungsstelle angezeigt ist;
zeigt 18 die Spaltungsstelle von M. kandleri-Topoisomerase V bei pGEMI-DNA im Vergleich zur eukaryotischen Topoisomerase I-Consensus-Stelle;
ist 19 eine Photographie eines zweidimensionalen Agarosegels, die eine kovalente Komplexbildung zwischen entspannten oder supergeknäulten Plasmid-DNAs und M. kandleri-Topoisomerase V zeigt, wobei die Elektrophorese in Gegenwart von 0,1% SDS durchgeführt wurde,
ist 20 eine Photographie eines silber-gefärbten 7,5% Polyacrylamidgels von Topoisomerase V-Fragmenten, produziert durch die Endoproteinase Lys-C unter nativen Bedingungen; und
ist 21 eine Photographie eines Coomassie blau-gefärbten Immunblots von Topoisomerase V-Fragmenten, produziert durch die Endoproteinase Lys-C unter Bedingungen einer partiellen Proteolyse, die zur Proteinmikrosequenzierung verwendet wurden.
BESCHREIBUNG
DNA-Topoisomerase V wurde aus hyperthermophilem methanogenem Methanopyrus kandleri gereinigt. M. kandleri wurde aus einer thermischen, gebohrten, submarinen Sedimentprobe isoliert, welche bei den Unter-Wasser-Forschungen von Alvin entnommen wurde (R. Huber et al., Nature 342: 833–834 (1989)). Es bildet autolithotrophisch nur unter Verwendung von H₂ und CO₂ als Energie- und Kohlenstoffquelle bei Temperaturen bis zu 110°C Methan; dies ist die obere Temperaturgrenze, bei der lebende Organismen gefunden wurden (K. O. Stetter in Frontiers of Life (J. Tran Than Van et al., Herausg., Editions Frontieres, Gif-sur-Yvette, 1992)).
Die neue Topoisomerase hat Eigenschaften, die denen der eukaryotischen Topoisomerase I entsprechen, was sie von allen vorher bekannten prokaryotischen Topoisomerasen unterscheidet. Das Enzym ist insbesondere Magnesium-unabhängig, es entspannt sowohl negativ wie positiv supergeknäulte DNA, bildet einen kovalenten Komplex mit dem 3'-Ende des gespaltenen DNA-Strangs, spaltet DNA an der Stelle, die der Consensussequenz entspricht, die für eukaryotische Topoisomerasen I gefunden wird, und wird durch einen Antikörper für humane Topoisomerase I erkannt. Da sie allerdings beachtlich thermostabil ist und fähig ist, ccDNA zu entwinden, unterscheidet sich Topoisomerase V von allen bekannten DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1.
I. REINIGUNG VON TOPOISOMERASE V
DNA-Topoisomerase V aus M. kandleri kann durch das folgende Verfahren gereinigt werden: (1) Lyse der Zellen; (2) Präzipitation mit Polyethylenimin und Abtrennung des Überstandes; (3) Präzipitation mit Ammoniumsulfat; (4) Phosphocellulosechromatographie; (5) Chromatographie an Heparin; und (6) Gelfiltration.
Das Produkt dieses Reinigungsschemas ist im Wesentlichen gereinigte M. kandleri-DNA-Topoisomerase V, die im Wesentlichen von anderen Enzymen, die auf DNA wirken, frei ist.
A. Lyse
Ein geeigneter Stamm von M. kandleri ist AV-19, DSM 24, Braunschweig, Deutschland. Die Lyse der Zellen kann nach Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind und die die enzymatische Aktivität konservieren und den Proteinabbau auf ein Minimum beschränken. Vorzugsweise wird eine Lyse bei etwa 4°C in Gegenwart mindestens eines Inhibitors für die proteolytische Aktivität durchgeführt. Eine Lyse wird vorzugsweise in einer aufbrechenden Vorrichtung, z. B. einer French-Druckzelle, durchgeführt.
Ein vorteilhafter Lysepuffer enthält 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 0,5 M NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 50 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 50 μg/ml N-Tosyl-L-Phenylalanin-Chlormethyl-Keton (TPCK), 50 μg/ml N-α-p-Tosyl-L-Lysin-Chlormethyl-Keton (TLCK), 50 μg/ml Pepstatin A, 50 μg/ml Leupeptin und 1 mM Benzamidin.
Typischerweise wird eine Menge an Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur in 1 Milliliter Lysepuffer pro 2 Gramm Zellen gelöst und durch eine French-Druckzelle mit 16.000 psi geführt, wodurch ein Lysat erhalten wird.
B. Polyethylenimin-Präzipitation
Die nächste Stufe ist die Präzipitation des Lysats mit Polyethylenimin (Polymin P) und die Sammlung des Überstands. Typischerweise wird das Lysat mit Lysepuffer zu einem Endvolumen des fünffachen ursprünglichen Volumens an Lysepuffer verdünnt und für 2 Stunden mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert (40.000 UpM in einem Beckmann Instruments- (Fullerton, Californien) Ti-50-Rotor) (144.600 × g). Zu der gewonnenen Lösung wird eine 5%ige Polyethyleniminlösung (pH 7,0) gegeben, und zwar zu dem Überstand zu einer End-Polyethylenimin-Konzentration von 0,3%. Nach Mischen für etwa 30 Minuten bei 0°C wird die Lösung mit 12.000 UpM (23.750 × g) zentrifugiert und der Überstand sichergestellt. Der Überstand enthält die Topoisomerase V.
C. Präzipitation mit Ammoniumsulfat
In der nächsten Reinigungsstufe wird der Überstand aus der Polyethylenimin-Präzipitationsstufe mit gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert. Typischerweise wird ein Volumen von 4 M Ammoniumsulfat, das dem etwa 0,9 Fachen des Volumens des Polyethylenimin-Überstands entspricht, unter Rühren zugesetzt, und danach wird festes Ammoniumsulfat zur 90%igen Sättigung zugegeben. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation nach Dekantieren des Überstands gesammelt.
Etwa die Hälfte der Proteine von M. kandleri sind im Präzipitat. Im Pellet wird im Wesentlichen die gesamte Topoisomerase V-Aktivität gefunden.
D. Phosphocellulose-Chromatographie
Die nächste Stufe ist die Phosphocellulose-Chromatographie. Das Pellet aus der Ammoniumsulfat-Präzipitation wird zur Phosphocellulose-Chromatographie wieder in einem geeigneten Ausgangspuffer gelöst. Ein vorteilhafter Ausgangspuffer ist 0,2 M NaCl, 30 mM Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 25 μg/ml jeweils PMSF, TPCK und TLCK, 5 μg/ml Pepstatin A, 1 μg/ml Leupeptin und 1 mM Benzamidin, der als Puffer A + 0,2 NaCl bezeichnet wird.
Das wiederaufgelöste Pellet wird gegen Ausgangspuffer dialysiert und auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird nach dem Beladen mit dem Ausgangspuffer gewaschen. Topoisomerase V wird mit einem linearen Gradienten, der mit 0,2–1,0 M NaCl durchgeführt wurde, eines Puffers, der die anderen Komponenten des Ausgangspuffers enthielt, und anschließend mit einem linearen Gradienten von 1,0–2,0 M NaCl im selben Puffer eluiert. Aktive Topoisomerase V wurde mit 0,55–0,73 M NaCl (Fraktion IVa) und auch mit 0,73–1,45 M NaCl (Fraktion IVb) eluiert.
Die resultierenden Fraktionen wurden gegen Puffer B (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 10% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol) + 0,5 M NaCl, wenn erforderlich, nach Konzentration dialysiert.
E. Heparin-Chromatographie
Die nächste Stufe ist die Heparin-Chromatographie der aktiven Fraktionen aus der Stufe der Phosphocellulose-Chromatographie. Vorzugsweise werden die Fraktionen IVa und IVb getrennt an Heparin chromatographiert. Die dialysierten Fraktionen werden auf eine Heparinsäule, die mit Puffer B + 0,5 M NaCl equilibriert wurde, aufgebracht. Nach Waschen mit dem Ausgangspuffer wird das Enzym mit einem linearen Gradienten von 0,5–1,5 M NaCl in Puffer B eluiert, und Fraktionen werden gesammelt. Aktive Topoisomerase V wird mit etwa 1,0 bis etwa 1,25 M NaCl für Fraktion IVa und mit 0,95 bis 1,25 M NaCl für Fraktion IVb eluiert. Vorzugsweise wird das eluierte Topoisomerase-Enzym durch erneute Chromatographie auf einer kleineren Heparinsäule nach Verringerung der Natriumchlorid-Konzentration auf 0,5 M durch Verdünnung mit Puffer B ohne Natriumchlorid konzentriert. Das Enzym wird dann wieder aus der kleineren Säule eluiert.
F. Gelfiltration
Die Endstufe im Reinigungsverfahren ist eine Gelfiltration an einer Säule, die fähig ist, Proteine im Molekulargewichtsbereich von etwa 50.000 Dalton bis etwa 200.000 Dalton aufzutrennen. Eine vorteilhafte Chromatographiesäule umfasst eine HiLoad 16/60-Superdex 200 PG-Säule (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ): Typischerweise wird die aus der Stufe der Heparin-Chromatographie konzentrierte Topoisomerase durch die Säule geleitet, die mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 1 M NaCl, 5% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol equilibriert worden war.
Topoisomerase V aus Fraktion IVa, die einer Heparin-Chromatographie und einer Gelfiltrationschromatographie unterworfen worden war, hat eine spezifische Aktivität von etwa 2,0 × 10⁶ Einheiten pro Milligramm in einem Assay zur Bestimmung der ATP-unabhängigen und Mg²⁺-unabhängigen Entspannung von supergeknäulter pBR322-DNA. Für den Assay wird 1 μl Topoisomerase V-Präparat mit einem 50 : 50-Gemisch positiv und negativ supergeknäulter pBR322-DNA (0,2 μg) und Assaypuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 1 M Kaliumglutamat und 5 mM Na₂EDTA) in 10 μl Reaktionsgemisch bei Standard-Assay-Bedingungen von 88°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Abkühlen auf 0° und Zugabe von SDS bis zu 1% beendet. Für einen Topoisomerase-Assay in Rohextrakten wurden die Reaktionen nach Beendigung durch SDS mit 400 μg/ml Proteinase K bei 37°C für eine Stunde behandelt und dann für 2 Minuten auf 80°C erhitzt. Topoisomerisierungsprodukte werden durch 1,5% Agarosegel-Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin bei 3 V/cm für 10 Stunden analysiert. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist um 50% der Form I von pBR322-DNA (0,2 μg) unter Standardbedingungen zu entspannen.
Eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese des Peaks, der aus der Heprin-Chromatographie und der Gelfiltration von Phosphocellulose-Peak IVa resultierte, zeigte, dass nur ein Hauptprotein-Peak vorliegt. Dieses Protein hat eine Molekülmasse von 110.000 Dalton, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, obgleich sein Verhalten bei der Gelfiltrationschromatographie dem eines globulären Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 142.000 Dalton entspricht. Solche Unterschiede zwischen Molekulargewichten, die durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Gelfiltration erhalten werden, sind nicht ungewöhnlich und geben einen Grad molekularer Asymmetrie im Protein wieder.
Das Gelfiltrationsprodukt stellt eine etwa 3620fache Reinigung dar. Wenn es genommen wird um die Reinheit darzustellen, so ist die Heparinfraktion etwa 60% rein. Im Kontext dieser Anmeldung bedeutet allerdings der Ausdruck "im Wesentlichen gereinigt" folgendes: (1) eine mindestens etwa 40fache Reinigung bezüglich des geklärten Lysats, und (2) im Wesentlichen frei von anderen Enzymen, die auf DNA wirken. Solche Präparate sind ausreichend rein um in vielen der Anwendungen von DNA-Topoisomerase V einsetzbar zu sein.
Die Reinigung ist in Tabelle I zusammengefasst.
II. EIGENSCHAFTEN VON TOPOISOMERASE V
A. Enzymatische Aktivität
Die Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung ist eine Topoisomerase, Typ 1. Dieses Enzym hat sowohl entspannende, als auch Verknüpfungen lösende (oder entwindende) Aktivität gegenüber ccDNA, was nachfolgend detailliert beschrieben wird.
1. Topoisomerase V ist eine Topoisomerase, Typ 1
Topoisomerase V aus M. kandleri ist eine Topoisomerase, Typ 1, da sie die Verknüpfungszahl eines einmal vorkommenden pUC19-DNA-Topisomeren in Stufen von Eins ändert (11).
2. Die Aktivität von DNA-Topoisomerase V wird durch einzelsträngige DNA nicht beeinträchtigt
Die Aktivität von DNA-Topoisomerase V wird durch das Vorliegen von einzelsträngiger DNA nicht beeinträchtigt. 12 zeigt, dass der Zusatz von einzelsträngiger DNA UX174-DNA die Entspannung von negativ oder positiv supergeknäulter pBR322-Plasmid-DNA durch Topoisomerase V bei 70°C und 90°C bei einem UX174 : pBR322-Verhältnis von bis zu 4,9 : 1 nicht beeinträchtigt. Das Fehlen einer Inhibition durch einzelsträngige DNA unterscheidet dieses Enzym von anderen thermophilen Topoisomerasen, Typ 1, Topoisomerase I (reverse Gyrase) und D. amylolyticus-Topoisomerase III, die zur Gruppe A gehören, und von mesophilen Topoisomerasen, Gruppe B (J. J. Champoux in DNA Topology and Its Biological Effects (N. R. Cozzarelli und J. C. Wang, Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1990), S. 217–242).
Aus der Unfähigkeit einzelsträngiger DNA, Topoisomerase V zu inhibieren, und aus der Fähigkeit von Topoisomerase V, positiv supergeknäulte DNA zu entspannen, entnimmt die Anmelderin, dass Topoisomerase V doppelsträngige DNA-Regionen zur Bindung und Topoisomerisierung benötigt, obgleich die Anmelderin sich durch diese Theorie nicht binden möchte und es nicht notwendig ist, die Eigenschaften des Enzyms zu erklären.
3. Ionische Bedingungen zur Entspannung und Trennung (Lösung von Verknüpfungen)
Die Entspannungsaktivität von Topoisomerase V (tritt unterhalb des Schmelzbereichs von linearer DNA auf) auf supergeknäulte DNA unter verschiedenen ionischen Bedingungen bei 80°C, 88°C und 95°C ist in den 9A–9C und 10A–10D dargestellt und in Tabelle II zusammengefasst. Für die 9A–9C wurde ein Gemisch aus positiv und negativ supergeknäulter DNA als Substrat verwendet, und die Resultate wurden durch Gelelektrophorese in Gegenwart von Chloroquin analysiert um positiv supergeknäulte Substrate von negativ supergeknäulten Substraten zu trennen. In den 10A–10D wurde ein negativ supergeknäultes Substrat verwendet, und die Produkte wurden ohne Chloroquin durch Gelelektrophorese analysiert. Sowohl in den 9A–9C wie auch in den Figuren 10A–10D war die Menge des En zyms niedrig genug um eine vollständige Entspannung zu verhindern und die relative enzymatische Aktivität durch das Ausmaß der Umwandlung des Substrats in das Produkt zu überwachen.
Eine vollständige Entspannung von positiv supergeknäulter DNA und eine praktisch vollständige Entspannung von negativ supergeknäulter DNA durch Topoisomerase V wird bei 1,55 M Kaliumglutamat, 88°C, beobachtet, wobei diese Bedingungen als zur DNA-Entspannung optimal angesehen werden. Beispiele für die enzymatische Aktivität umfassen eine partielle Entspannung von supergeknäulter DNA, eine vollständige Entspannung einer Fraktion supergeknäulter DNA-Substrate und eine vollständige Entspannung von positiv supergeknäulter DNA bei geringer Aktivität auf negativ supergeknäulte DNA. Das Enzym kann distributiv (d. h., das Enzym disoziiert nach jedem katalytischen Zyklus von der DNA) oder progressiv (d. h., das; Enzym erfordert verschiedene katalytische Zyklen, bevor das Enzym disoziiert) wirken. Das Enzym bevorzugt positiv supergeknäulte DNA gegenüber negativ supergeknäulter DNA, obgleich es auf beide wirkt.
Die Substitution von Glutamatanion durch Chloridanion verringert die optimale Salz konzentration zur Entspannung wesentlich, nämlich von etwa 1,5 M auf 0,5 M. Die Verwendugn von Natriumkation anstelle von Kalium senkt das Optimum weiter um etwa 0,15 M, so dass die optimale Natriumchlorid-Konzentration etwa 0,30–0,35 M beträgt. Die spezifische Aktivität des Enzyms bei optimaler Salzkonzentration ist tatsächlich Salz-unabhängig. Es gibt in der Tat keine Wirkung von Magnesium auf die Entspannung durch das Enzym, und EDTA inhibiert die Reaktion nicht. Bei 88°C wurde eine Aktivität bei Kaliumglutamat-Konzentrationen von bis zu 3,1 M nachgewiesen.
Die ionischen Effekte auf die Aktivität der Topoisomerase V zum Trennen von Verknüpfungen (die Aktivität zur Trennung von Verknüpfungen zeigt sich im Schmelzbereich von linearer DNA) differieren von denen auf die relaxierende (bzw. entspannende) Aktivität. Die Daten sind in den 13A–13D dargestellt. Die Entwindung der Topoisomeren durch Topoisomerase V ist für eine hohe NaCl-Konzentration empfindlicher: Bei einer NaCl-Konzentration, die 0,5 M hoch ist, tritt bei 95°C keine Entwindung auf, während die Entspannungsaktivität bei 88°C noch bis zu 0,65 M beobachtet wird. Bei 0,25–2,1 M Kaliumglutamat verwendet Topoisomerase V die Substrat-DNA bei 95°C zur Entwindung effizienter als bei 80 oder 88°C, wenn man einen Vergleich über das Ausmaß der Umwandlung in das Produkt anstellt.
Die Daten über das Ausmaß der Umwandlung in das Produkt in Gegenwart von MgCl₂ zeigen, dass Magnesium weder die Entspannung, noch die Aktivitäten zur Lösung von Verknüpfungen von Topoisomerase V oberhalb 90 mM monovalentes Salz beeinträchtigt. Andererseits gibt es keine Wirkung von NaCl unter 90 mM auf die DNA-Entknüpfung bei 95°C oder die DNA-"Wieder-Entspannung" bei 80°C in Gegenwart von 5 mM MgCl₂. Die Anmelderin glaubt, dass dies durch die stabilisierende Wirkung von Magnesium auf die DNA-Doppelhelix begründet ist, obgleich sich die Anmelderin nicht an diese Theorie binden möchte.
4. Reversibilität der Topoisomerase V-Bindung an DNA
Bei 300 mM NaCl disoziiert Topoisomerase V frei und bindet an DNA (14A und 14B). Dies wird durch Experimente bewiesen, in denen die Topoisomerase an einen DNA-Typ vorgebunden wurde und dann eine Competitur-DNA zugesetzt wurde. Die Resultate dieser Experimente zeigen, dass die Topoisomerase V von dem DNA-Typ, an den sie vorgebunden war, disoziieren kann und an einen anderen DNA-Typ binden kann. Bei geringerer Ionenstärke bleibt das Enzym an die ursprüngliche Substrat-DNA gebunden, trennt Verknüpfungen, bindet aber nicht signifikant an Competitor-DNA. Bemerkenswerterweise trennt Topoisomerase V-DNA-Doppelhelix bei 50 mM NaCl in einem hochprogressiven Modus ohne Magnesium, was im Gegensatz zu eukaryotischer Topoisomerase I steht, die zur Wirkung Magnesium erfordert (P. A. Der Garabedian et al.; Biochemistry 30: 9940–9947 (1990)).
5. Inhibitoren von Topoisomerase V
Camptothecin, das ein spezifischer Inhibitor für eukaryotische Topoisomerase I aus verschiedenen Spezies ist, hat eine begrenzte Wirkung gegen die Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung. Allerdings inhibiert Dimethylsulfoxid, das als Lösungsmittel für Camptothecin verwendet wird und eukaryotische Topoisomerasen selbst nicht hemmt, Topoisomerase V ( 15). Dies unterscheidet das Enzym von eukaryotischer Topoisomerase I.
B. Bildung eines kovalenten Komplexes mit DNA am 3'-Ende
M. kandleri-Topoisomerase V bindet kovalent an das 3'-Ende des DNA-Strangs, den sie während der Trennungs- oder Entwindungs-Reaktion spaltet. Kürzere DNA-Fragmente traten auf einem denaturierenden Gel auf, wenn 3'-markierte DNA mit Topoisomerase V inkubiert wurde und anschließend ein Protein-Denaturierungsmittel zugesetzt wurde (17); dies erfolgte aber nicht, wenn die DNA am 5'-Ende markiert war. Somit bindet das Enzym kovalent an das 3'-Ende des gespaltenen DNA-Strangs, was verhindert, dass der 5'-markierte, spaltbare Komplex in das Gel eintritt. Die Topoisomerase V-Hauptspaltungsstelle (18) an einem 280 bp-Fragment von pGEMI-DNA hat eine Sequenz, die ähnlich der Sequenz der Consensusspaltungsstelle für eukaryotische Topoisomerase I ist, mit dieser aber nicht identisch ist (B. J. Bonven et al., Cell 41: 541–551 (1985)).
Wenn M. kandleri-Topoisomerase V mit entspannter, geschlossener, kreisförmiger DNA, z. B. pBR322, pGEM3 oder einem Derivat von pUC12, enthaltend die Consensusspaltungsstelle für eukaryotische Topoisomerase I und als pHOT1 bezeichnet, inkubiert wird, kann ein kovalenter Komplex isoliert werden, der die Topoisomerase und offene, kreisförmige DNA enthält (Beispiel 12; 19). Die Topoisomerase wird in diesem Komplex kovalent an den aufgebrochenen Strang gebunden, wenn der Komplex mit Protein-Denaturierungsmittel, z. B. Nariumdodecylsulfat, behandelt wird.
Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Komplex, der die Topoisomerase der vorliegenden Erfindung nicht-kovalent an DNA gebunden umfasst, wie auch einen Komplex, der die Topoisomerase der vorliegenden Erfindung kovalent an das 3'-Ende eines DNA-Strangs gebunden umfasst, wobei dieses Ende das 3'-Ende eines aufgebrochenen Strangs offener, kreisförmiger DNA sein kann.
C. Antikörper-Reaktivität
M. kandleri-Topoisomerase V reagiert mit Antikörper gegen humane Topoisomerase I (6–7). Humane Topoisomerase II und λ Int-Protein, das negativ und positiv supergeknäulte DNA entspannt und kovalent an das 3'-Ende des aufgebrochenen DNA-Strangs bindet, reagieren nicht mit Antikörper auf humane Topoisomerase I.
Die beschriebenen Eigenschaften von M. kandleri-Topoisomerase V-Enzym identifizieren es als DNA-Topoisomerase, Gruppe B, Typ 1 (Tabelle III). Dieses ist das erste prokaryotische Enzym in dieser Gruppe.
Somit kann ein Verfahren zum Detektieren und/oder Bestimmen der M. kandleri-Topoisomerase V der vorliegenden Erfindung die folgenden Stufen umfassen:

(1) Umsetzen der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung mit einem Antikörper gegen humane Topoisomerase I; und
(2) Detektion und/oder Bestimmung der Topoisomerase V durch Detektion und/oder Bestimmung eines Antigen-Antikörper-Komplexes zwischen der Topoisomerase und dem Antikörper.

TABELLE III (Fortsetzung)
KLASSIFIZIERUNG VON DNA-TOPOISOMERASEN, TYP 1
Der Consensus zur DNA-Spaltung durch Eco- und Dam-Topoisomerasen III wurde nicht entwickelt, und es wurde gezeigt, dass ein Unterschied zu CNNN↑ besteht. Sce-Topoisomerase III hat eine starke Präferenz für ANNT↑ Hexadecamerer Consensus für eine DNA-Spaltung durch eukaryotische Topoisomerasen I: AGACIT↑AGA(A/G)AAA(A/I)(A/I)(A/I) stammte aus den Tetrahymena-rDNA-Wiederholungen. Dam-Desulfuroccoccus amylolyticus, Eco – Escherichia coli, HSA – Homo sapiens, Mka – Methanopyrus kandleri, Mlu – Micrococcus luteus, Sac – Sulfolobus acidocaldarius, Sce – Saccharomyces cerevisiae, Tth – Tetrahymena thermophilia, Wir – Vaccinia-Virus
D. Partielle Aminosäuresequenzen
Die Amino-terminale Aminosäuresequenz von M. kandleri-DNA-Topoisomerase V ist A-L-V-Y-D-A-E-F-V-G-S-E-R-E-F-E-E-E-R-E-T-F-L-K-G-V-K-A-Y-D-G-V-L-A-T-I-P-F-L. In dieser Sequenz sind die Aminosäuren, die nach dem Alanin (A) bei Aminosäure 23 auftreten, etwas ungewiss.
Es wurde mehrere proteolytische Fragmente von Topoisomerase V mit dem proteolytischen Enzym Endoproteinase Lys-C (Promega, Madison, WI), das an der Carboxyl-Stelle von Lysin (K) spaltet, erzeugt. Fünf derartige Fragmente wurden gebildet: Fragment I mit etwa 50.000 Dalton; Fragment II, ein Fragment mit etwa 42.000 Dalton; Fragment III, ein Fragment mit etwa 36.000 Dalton; Fragment N, ein Fragment mit etwa 33.000 Dalton; und Fragment V, ein Fragment mit etwa 25.000 Dalton. Fragment III stammt vom Carboxylende des Proteins. Außerdem können Fragmente mit etwa 75.000 Dalton und 55.000 Dalton (Fragment N1 bzw. N2) isoliert werden, und nach ihrer Proteinsequenz stammen sie vom Aminoende des Enzyms (Beispiel 13). Obgleich die Anmelderin sich nicht an diese Theorie binden möchte, wird angenommen, dass mindestens Fragment III und Fragment N1 stabile Domänen innerhalb des Enzyms darstellen und als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern, einschließlich monoklonaler Antikörper, wenn dies gewünscht wird, verwendet werden können. Ein solcher Antikörper stellt einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Die Amino-terminale Aminosäuresequenz von Fragment I ist K-S-D-T-E-T-I-E-T.
Die partielle Aminosäuresequenz von Fragment II ist K-P-E-L-P-Y-V-A-V-P-P-H-M-A-E-R-A-R-R-V-L-T-R-E-D-D-L-A-X-D-V-X-A. In dieser Sequenz stellt "X" eine Aminosäure dar, die nicht bestimmt werden kann. Außerdem sind das Prolin (P) an der Aminosäure-Position 11, das Threonin (T) an der Aminosäure-Position 22 und das Arginin (R) in der Aminosäure-Position 23 etwas unsicher.
Die partielle Aminosäuresequenz von Fragment III ist K-R-V-P-R-A-X-X-G-X-X-F-D-R-L. In dieser Sequenz stellt "X" eine Aminosäure dar, die nicht bestimmt werden kann.
Die partielle Aminosäuresequenz von Fragment N ist K-S-G-R-Q-E-R-S-E-E-E-E-K-E-E-L-E-R-K-V-G-E-G-R-A-R-R-L-I-E-Y-F-G-S-A.
Die partielle Aminosäuresequenz von Fragment V ist K-Y-G-S-A-S-X-X-R-R-L-P-X-E-E-X-R-E-L-G-F-X-D-D-R. In dieser Sequenz stellt "X" eine Aminosäure dar, die nicht bestimmt werden kann. Außerdem sind das Thyrosin (Y) in Aminosäure-Position (2), das Serin (S) in Aminosäure-Position 6, die Arginine (R) als Reste 17 und 25 und die Asparaginsäure (D) als Aminosäure 24 etwas unbestimmt.
Die Verfügbarkeit der Amino-terminalen Aminosäuresequenz von M. kandleri-Topoisomerase V bedeutet, dass die vorliegende Erfindung thermostabile DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, welche die Amino-terminale Aminosäuresequenz von M. kandlerito-Topoisomerase V besitzen, umfasst. In diesem Kontext ist der Ausdruck "thermostabil" so definiert, dass das Enzym eine nachweisbare entspannende Aktivität bei einer Temperatur von 50°C oder höher besitzt. Zusätzlich liegen Enzyme, die konservative Aminosäure-Substitutionen innerhalb dieser Sequenz enthalten, im Rahmen der Endung. Solche konservative Aminosäure-Substitutionen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Einsetzen von einer der Aminosäuren Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) für eine andere dieser Aminosäuren; Einsetzen von Asparaginsäure (D) für Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Einsetzen von Glutamin (Q) für Asparagin (N) und umgekehrt; und Einsetzen von Serin (S) für Threonin (T) und umgekehrt. Die oben genannten Substitutionen sind nicht die einzigen Aminosäure-Substitutionen, die als "konservativ" angesehen werden können. Es können auch andere Substitutionen als konservativ angesehen werden, was von der Umgebung der besonderen Aminosäure abhängt. Beispielsweise sind Glycin (G) und Alanin (A) häufig gegeneinander austauschbar, wie es auch bei Alanin (A) und Valin (V) der Fall sein kann. Methionin (M), das relativ hydrophob ist, kann häufig austauschbar mit Leucin (L) und Isoleucin (I) und manchmal mit Valin (V) verwendet werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig an Stellen, in denen das deutliche Merkmal des Aminosäurerestes seine Ladung ist, untereinander austauschbar; die unterschiedlichen pK's dieser zwei Aminosäurereste sind nicht signifikant. Es gibt noch andere Veränderungen, die in besonderen Umgebungen als "konservativ" angesehen werden können.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch thermostabile DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, die mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen, d.h., mindestens eine der folgenden: Fragment I, Fragment II, Fragment III, Fragment IV und Fragment V, die eindeutig bekannt ist, besitzen:

(1) K-S-D-T-E-T-I-E-T (aus Fragment I);
(2) K-P-E-L-P-Y-V-A-V-P-P-H-M-A-E-R-A-R-R-V-L-T-R-E-D-D-L-A-X-D-V-X-A (aus Fragment II);
(3) K-R-V-P-R-A-X-X-G-X-X-F-D-R-L (aus Fragment III);
(4) K-S-G-R-Q-E-R-S-E-E-E-E-K-E-E-L-E-R-K-V-G-E-G-R-A-R-R-L-I-E-Y-F-G-S-A (aus Fragment IV); oder
(5) K-Y-G-S-A-S-X-X-R-R-L-P-X-E-E-X-R-E-L-G-F-X-D-D-R (aus Fragment V).

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner thermostabile DNA-Topoisomerasen, Gruppe B, Typ 1, die mindestens eine Aminosäuresequenz, die mit Sequenz (1), (2), (3), (4) oder (5) durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen verwandt ist, besitzen.
Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen Modifikationen dieser Enzyme, die an feste Träger gebundene Enzyme einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind.
III. VERWENDUNG VON TOPOISOMERASE GEMÄß DER VORLIEGEN-DEN ERFINDUNG
Topoisomerase V gemäß der vorliegenden Erfindung kann, wie es oben beschrieben wurde, entweder zur Entspannung supergeknäulter DNA oder zur Trennung (Lösen von Verknüpfungsstellen) von ccDNA eingesetzt werden.
Im Allgemeinen umfasst die Reaktion zur Lösung von Verknüpfungsstellen Behandeln einer ccDNA mit dem Enzym der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur, die mindestens so hoch wie der Schmelzbereich der linearen Form von behandelter DNA ist, und unter ionischen Bedingungen, die das Enzym an DNA binden lassen und die Trennungsreaktion (bzw. Reaktion zum Lösen von Verknüpfungsstellen) katalysieren; das Enzym bindet an DNA und katalysiert die Trennungsreaktion, gesteuert durch DNA-Schmelzen, und es wird ccDNA mit einer Lk, die niedriger als die Lk der DNA-Vorbehandlung, produziert.
Diese Reaktion ist gleichermaßen auf ein beliebiges Verfahren anwendbar, das eine Primeranlagerung und/oder -Verlängerung, d. h., PCR, LCR, Hybridisierungssonden-Herstellung, einschließlich DNA-Matrizen-Herstellung zur Hybridisierung großer Sonden, beinhaltet, anwendbar.
Die Entspannungsreaktion umfasst Behandeln einer supergeknäulten DNA mit dem erfindungsgemäßen Enzym bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzbereichs der linearen Form der behandelten ccDNA und bei ionischen Bedingungen, die das Enzym an DNA binden lassen und die Entspannungsreaktion unter Herstellung mindestens teilweise entspannter DNA katalysieren. Die DNA, die entspannt werden soll, kann positiv supergeknäulte DNA, negativ supergeknäulte DNA oder ein Gemisch dieser zwei Typen supergeknäulter DNA sein.
Diese Entspannungs- und Trennungsreaktionen sind besonders zur Manipulation einer DNA-Konformation zur Herstellung von ccDNA mit einem gewünschten Grad des Supercoilings anwendbar, wobei nur ein Enzym verwendet wird und nur die ionischen Bedingungen und die Temperatur verändert werden.
Eine einzige Salztoleranz des Enzyms macht es zu einem unverzichtbaren Werkzeug bei der in vitro-Chromatin-Rekonstitution.
Topoisomerase V kann zur Bildung eines kovalenten Komplexes mit DNA verwendet werden. Das Verfahren zur Bildung eines kovalenten Komplexes umfasst:

(1) Inkubieren der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an die DNA und die Aufspaltung eines Strangs durch die Topoisomerase erlauben; und
(2) Denaturieren der Topoisomerase, wobei ein kovalenter Komplex zwischen der Topoisomerase und der DNA zurückbleibt.

Topoisomerase V kann auch als spezifische Endonuklease eingesetzt werden. Das Verfahren einer Verwendung von Topoisomerase V als spezifische Endonuklease umfasst:

(1) Inkubieren der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an die DNA und das Aufspalten eines Strangs durch die Topoisomerase bei einer spezifischen Sequenz ermöglichen; und
(2) danach Denaturieren der Topoisomerase, was zu gespaltener DNA führt.

Die Sequenz, bei der die Spaltung auftritt, wie sie in 18 gezeigt ist, steht mit der Spaltungsstelle durch eukaryotische Topoisomerase I-Enzyme in Beziehung.
Außerdem kann Topoisomerase V zur Herstellung eines aktivierten DNA-Substrats mit mindestens einem einzelnen Aminosäurerest kovalent an das 3'-PO₄-Ende eines DNA-Strangs, benachbart zur Erkennungsstelle der Topoisomerase der vorliegenden Erfindung, verwendet werden. Das Verfahren umfasst:

(1) Inkubieren der Topoisomerase mit DNA unter ionischen Bedingungen, die die Bindung der Topoisomerase an DNA und das Aufspalten eines Strangs durch die Topoisomerase an einer spezifischen Sequenz erlauben; und
(2) danach Denaturieren der Topoisomerase und Hydrolysieren der Topoisomerase mit einer nicht-spezifischen Protease.

Das gereinigte Protein kann auch zur Herstellung von Antikörpern, sowohl polyklonalen Antikörpern wie auch monoklonalen Antikörpern, verwendet werden. Ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 110.000 ist ausreichend groß, so dass es nicht an einen Träger, z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hemocyanin, gebunden werden muss um imunogen zu sein. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und brauchen nicht im Detail beschrieben zu werden. Solche Verfahren werden z. B. in E. Harlow & D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988), S. 53–137, beschrieben, wobei diese Literaturstelle hier expressis verbis aufgenommen wird.
Sobald polyklonale Antikörper produziert sind, können Antikörper-produzierende Zellen mit geeigneten Melanomzellen unter Bildung von Hybridomen fusioniert werden um monoklonale Antikörper zu produzieren. Solche monoklonalen Antikörper können durch fachbekannte Techniken produziert werden; dies sind typischerweise Entwicklungen und Anpassungen der Grundtechnik von G. Köhler & C. Milstein, "Continous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256: 495–497 (1975), wobei diese Literaturstelle hier expressis verbis aufgenommen wird. Solche Entwicklungen und Anpassungen werden z. B. von Harlow & Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, oben, S. 139–281, beschrieben; auch diese Literaturstelle wird hier aufgenommen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele dienen nur Zwecken der Veranschaulichung und beschränken die Erfindung nicht.
Beispiel 1
Reinigung von DNA-Topoisomerase V aus Methanonyrus kandleri
Materialien und Verfahren
Methanopyrus kandleri, Stamm AV-19, DSM 6324, Braunschweig, Deutschland, wurde verwendet. Die Zellen wurden in einem 300 Liter-Fermentator, der mit Emaille geschützt war (HTE Bioengineering, Wald, Schweiz), in BSM-Medium bei 100°C unter Rühren und kontinuierlichem Begasen (H₂/CO₂, 80 : 20) wachsen gelassen. Exponentiell wachsende Zellen wurden rasch abgekühlt und mit einem Separator (Westfalia, Deutschland) geerntet. Die Zellen wurden bei –70°C gelagert.
Die Proteaseinhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), N-Tosyl-L-phenylalanin-Chlormethylketon (TPCK), N-α-p-Tosyl-L-lysinchlormethylketon (TLCK), Pepstatin A, Leupeptin und Benzamidin waren von Calbiochem (La Jolla, CA). β-Mercaptoethanol war von Fisher (Pittsburg, PA), Polyethylenimin (Polymin P) war von Sigma (St. Louis, MO), Ammoniumsulfat war von BRL (Gaithersburg, MD) und Glycerin war von Mallinckrodt (Chesterfield, MO). Phosphocellulose P11 war von Whatman (Clifton, NJ). HiTrap-Heparinsäulen (Volumen 1 ml und 5 ml) und HiLoad 16/60-Superdex 200 PG-Gelfiltrationssäulen waren von Pharmacia LKB (Piscataway, NJ). Centriprep 30-Konzentrierungspatronen waren von Amicon (Beverly, MA).
Verfahren zur Proteincharakterisierung
Proteinkonzentrationen wurden spektrophotometrisch bestimmt. Proteinzusammensetzungen der Fraktion wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese an Bio-Rad (Richmond, CA)-Mini-Protein II nach dem Verfahren von Laemmli oder unter Verwendung von vorgegossenen Bio-Rad-Gelen analysiert. Die Gele wurden mit Silber, wobei der Bio-Rad-Silber-Färbekit verwendet wurde, oder mit Coomassie G-250-Brilliantblau nach dem Verfahren von Merril (C. R. Merril in Protein Purification (M. P. Deutscher, Herausg., Academic Press, San Diego, 1990), S. 685–687)) gefärbt.
Topoisomerase-Assay
Die Topoisomerase V-Aktivität wurde durch eine ATP-unabhängige und Mg²⁺unabhängige Entspannung von supergeknäulter pBR322-DNA untersucht. Ein Aliquot (1 μl) Topoisomerase V-Präparation wurde mit 0,2 μg eines 50 : 50-Gemisches aus positiv und negativ supergeknäulter pBR322-DNA in "Standard"puffer (30 M Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 1 M Kaliumglutamat und 5 M Na₂-EDTA) in einem 10 μl-Reaktionsgemisch bei "Standard" bedingungen von 88°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch rasches Abkühlen auf 0°C und Zusetzen von Natriumdodecylsulfat zu einer Konzentration von 1% beendet. Für einen Topoisomerase-Assay bei Rohextrakten wurden die Reaktionen, die durch SDS beendet worden waren, mit Proteinase K (400 μg/ml bei 37°C für eine Stunde) behandelt und dann für 2 Minuten auf 80°C erwärmt. Die Topoisomerisierungsprodukte wurden durch 1,5% Agarosegel-Elektrophorese in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chlorquin bei 3 V/cm für 10 Stunden analysiert. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist um 50% der Form I von pBR322-DNA (0,2 μg) in Standardpuffer in 15 Minuten bei 88°C zu entspannen.
Proteinreinigung
Alle Stufen wurden bei 4°C durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Chromatographie wurde an einem LKB-Flüssigkeitschromatographie-System durchgeführt, das aus einer HPLC-Pumpe, einer Monitorablesung mit variabler Wellenlänge, eingestellt auf 280 nm, einer Steuervorrichtung, einem 2-Kanal-Aufzeichnungsgerät und einem Ständer bestand.
M. kandleri-Zellen (120 g Nassgewicht) wurden in einem Wasserbad mit Raumtemperatur in 60 ml Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 0,5 M NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, je 50 μg/ml PMSF, TPCK, TLCK, Pepstatin A und Leupeptin und 1 mM Benzamidin) aufgetaut und durch eine French-Druckzelle (American Instrument (Baltimore, MD)) mit 16.000 psi geführt. Die erhaltene Lösung wurde mit Lysepuffer zu einem Endvolumen von 300 ml verdünnt und zwei Stunden mit 40.000 UpM in einem Beckman Instruments (Fullterton, CA)-Ti-50-Rotor zentrifugiert (Fraktion I, 259 ml). Eine 5%ige Polyethyleniminlösung (Polymin P) (pH 7,0) wurde tropfenweise bei konstantem Rühren zu einer Endkonzentration von 0,3%o zu dem Überstand gegeben. Nach 30-minütigem Mischen bei 0°C wurde die Lösung 40 Minuten lang mit 2000 UpM in einer Sorvall RC-SB-Zentrifuge für 40 min zentrifugiert. Der Überstand wurde sichergestellt (Fraktion II, 265 ml), und unter Rühren wurden 245 ml 4 M Ammoniumsulfat zugegeben. Danach wurde Ammoniumsulfat bis zur 90%igen Sättigung zugesetzt, und die Lösung wurde über Nacht bei Rühren in einem kalten Raum belassen. Es wurde nicht das gesamte Ammoniumsulfat gelöst. Der Überstand (545 ml) wurde dekantiert und bei 11.000 UpM in einer Sorvall RC-SB-Zentrifuge zwei Stunden zentrifugiert.
Das Pellet aus der Ammoniumsulfat-Präzipitation wurde in 400 ml Ausgangspuffer für eine Phosphocellulose-Chromatographie (Puffer A + 0,2 M NaCl) gelöst. Puffer A ist 30 M Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 10 M β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, je 25 μm PMSF, TPCK und TLCK, 5 μg/ml Pepstatin A, 1 μg/l Leupeptin und 1 mM Benzamidin. Das gelöste Pellet wurde gegen zwei Liter desselben Puffers mit zwei Änderungen (Fraktion III, 438 ml) dialysiert. Nach der Zentrifugation wurde die Lösung auf eine Phosphocellulose P11-Säule (Whatman) (2,6 × 30 cm), die mit Puffer A + 0,2 M NaCl äquilibriert worden war, aufgebracht. Nach dem Aufbringen wurde die Säule mit drei Volumina Puffer A + 0,2 M NaCl gewaschen. Topoisomerase V wurde mit einem 600-minütigem linearen Gradienten von 0,2 bis 1,0 M NaCl in Puffer A mit 1,5 ml/min, gefolgt von einem 400-minütigen linearen Gradienten von 1,0 bis 2,0 M NaCl in Puffer A, eluiert. Fraktionen mit 15 ml wurden gesammelt und auf DNA-Entspannungsaktivität untersucht. Aktive Fraktionen wurden in 2 Pools kombiniert: Ein erster Pool mit 0,55 bis 0,73 M NaCl (135 ml) und ein zweiter Pool mit 0,73 bis 1,45 M NaCl (620 ml). Der Letztgenannte wurde in Centriprep 30-Patronen zu einem Endvolumen von 100 ml konzentriert.
1 zeigt die Resultate der Phosophocellulose-Chromatographie. Der A₂₈₀-Wert und die NaCl-Konzentration für das Eluat aus der Phosphocellulosesäule sind zusammen mit einer Photographie eines Silber-gefärbten 4–15%-SDS-Polyacrylamidgels, das die Proteinzusaminen setzungen von Fraktionen im Eluat zeigt und die Fraktionen angibt, die zur weiteren Reinigung als Fraktionen IVa und IVb genommen wurden, gezeigt. Für das Polyacrylamidgel wurden 5 μl (Fraktionen 29–41) oder 20 μl (Fraktionen 51–75) der Elektrophorese unterworfen.
Beide Pools wurden gegen Puffer B + 0,5 M NaCl dialysiert. Puffer B war 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 10% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol (Fraktion IVa, 135 ml, bzw. Fraktion IVb, 100 ml).
Fraktion IVa wurde auf eine 5 ml-HiTrap-Heparin-Säule, die mit Puffer B + 0,5 M NaCl äquilibriert worden war, aufgebracht. Nachdem die Säule mit fünf Volumina Puffer B + 0,5 M NaCl gewaschen worden war, wurde ein 100-minütiger linearer Gradient mit 0,5 bis 1,5 M NaCl in Puffer B mit 0,5 ml/min angewendet.
2 zeigt die Resultate der Heparin-Chromatographie von Fraktion IVa. Die A₂₈₀-Werte und die NaCl-Konzentration sind dargestellt; gleichzeitig ist eine Photographie eines Coomassieblau-gefärbten 4–15%-Gradienten-SDS-Polyacrylamidgels gezeigt, die die Proteinzusammensetzungen der Fraktionen im Eluat zeigt und die Fraktionen angibt, die als Fraktion Va genommen wurden. Für das Polyacrylamidgel wurden 5 μl-Aliquots der Fraktionen einer Elektrophorese unterworfen. Topoisomerase war eine Hauptproteinbande bei den Fraktionen 30 und 32.
Aktive Fraktionen (1 ml) mit zwischen 1,0 und 1,25 M NaCl wurden gesammelt (Fraktion Va, 13 ml) und an einer 1 ml-HiTrap-Heparinsäule konzentriert, indem die Natriumchloridkonzentration durch Verdünnung mit Puffer B ohne Natriumchlorid auf 0,5 M gesenkt wurde, die Probe auf eine kleinere Säule gegeben wurde und erneut mit dem linearen NaCl-Gradienten eluiert wurde. Das Konzentrat wurde durch eine HiLoad 16/60-Superdex 200-PG-Säule, welche mit 10 ml Natriumphosphat, pH 7,4 bei 25°C, 1 M NaCl, 5% Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol äquilibriert worden war, geleitet (Fraktion Va, 13 ml).
Die Fraktion IVb wurde in der gleichen Weise wie Fraktion IVa an einer 5 ml-HiTrap-Heparinsäule mit den in 3 dargestellten Resultaten chromatographiert. Die aktiven Fraktionen wurden zwischen 0,95 und 1,25 M NaCl eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert (Fraktion Vb, 15 ml) und wie oben an einer 1 ml-HiTrap-Heparinsäule konzentriert. 90% der Gesamtaktivität, die zwischen 1,07 und 1,17 M NaCl eluiert wurde, wurde in drei getrennten Pools aus 3, 2 bzw. 3 ml kombiniert. Jeder der Pools wurde wie oben einer Gelfiltration unterworfen. Dies führte zu den Fraktionen VIb, VIc und VId mit je 13 ml. Die Fraktionen VIa bis VId wurden bei 4°C oder –80°C gelagert.
Die Proteinzusammensetzungen der Fraktionen aus den Eluaten, die aus der Gelfiltration der Fraktionen Va, Vb, Vc und Vd resultierten, sind in 4 dargestellt. Gemäß 4 wurden 5 μl (für Va, Vb und Vc) oder 10 μl einer Elektrophorese an einem 7,5% Polyacrylamidgel unterworfen und durch Silber gefärbt.
5A zeigt das Gelfiltrationsprofil von Fraktion Va als A₂₈₀ (-------) und enzymatische Aktivität (----o----).
5B zeigt die Proteinzusammensetzung von Fraktionen aus diesem Gelfiltrationseluat, wie in 4, wobei zusätzliche Fraktionen gezeigt werden.
Die Reinigung ist in Tabelle I zusammengefasst. Die Gesamtreinigung, wie sie durch die Fraktion mit der höchsten spezifischen Aktivität, Fraktion VIa, bestimmt wurde, war die 3620-fache.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Fraktion VIa (4 und 5B) zeigt, dass die einzige signifikante Proteinkomponente in dieser Fraktion ein Molekulargewicht von etwa 110.000 hat. Dies ist mit dem scheinbaren Molekulargewicht bei der Gelfiltration von etwa 142.000 (5A) zu vergleichen. Solche Diskrepanzen sind nicht ungewöhnlich und resultieren aus einer Molekularasymmetrie des Proteins. Das Gelfiltrationsmolekulargewicht gibt an, dass das Enzym als Monomer auftritt.
Die Heparin-Chromatographie von Fraktion IVb führte zu einer 12-fachen Reinigung. Die Proteinzusannensetzung dieser Fraktion blieb allerdings komplex (3). Die Sammlung des Heparineluats in drei Pools und das getrennte Aufbringen jedes Pools auf eine Superdex 200-Gefiltrationssäule führte zu Präparaten, die einen Proteinpeak in der Position liefern, in der reine Topoisomerase V eluiert wurde (4). In allen drei Fällen konzentrierte sich die Topoisomerase-Aktivität um diesen Peak. Die aktiven Fraktionen enthielten auch ein unbekanntes Protein mit 75.000 Dalton (Fraktionen VIb und VId) oder sowohl ein Protein mit 75.000 Dalton, als auch ein Protein mit 80.000 Dalton (Fraktion VIc) zusammen mit Topoisomerase V (4). Fraktion VIc, die eine ebenso hohe enzymatische Aktivität wie Fraktion VIa enthielt, wurde in der Gelfiltrationsstufe 10-fach zu einer etwa 50%igen Reinheit gereinigt.
Beispiel 2
Erkennung von M. kandleri-Topoisomerase V durch Antikörper gegen humane
Topoisomerase I
Polyklonale Antikörper gegen humane Topoisomerase I bindet M. kandleri-Topoisomerase V, wie es durch Western-Blotting bestimmt wurde. Gemäß 6 wurden humane Topoisomerase II (Topogen, Columbus, OH, 10 μl, 20 Einheiten) (Bahn 1), λ-Int-Protein (220 ng) (Bahn 2), Weizenkeim-Topoisomerase I (Promega, Madison, WI) (5 μl, 50 Einheiten) (Bahn 3), Thymus-Topoisomerase (US Biochemical, Cleveland, OH) (5 μl, 50 Einheiten) (Bahn 4), humane Topoisomerase I (Topogen) (5 μl, 25 Einheiten) (Bahn 5) und M. kandleri-Topoisomerase V (200 ng (Bahn 6) und 50 ng (Bahn 7)) einer Elektrophorese an einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen und auf Immobilon P-Membran (Millipore, Bedford, MA) zum Western-Blotting aufgeblottet. Der Blot wurde mit 5% Trockenmilch in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) blockiert und mit Kaninchen-Antikörper gegen humane Topoisomerase I (Dr. L. Liu, John Hopkins-University, Baltimore, MD), verdünnt 1 : 500, sondiert. Immunreaktives Material wurde mit [¹²⁵I]-Protein A (NEN, Boston, MA) detektiert und mit einem Phospholmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) bearbeitet. Dieser Western-Blot zeigt, dass der Antikörper nur humane Topoisomerase I, Weizenkeim-Topoisomerase I und M. kand leri-Topoisomerase V erkannte. Es wurde auch ein Abbauprodukt von humaner Topoisomerase I mit einem Molekulargewicht von etwa 66.200 Dalton erkannt.
Ein ähnlicher Western-Blot wurde an einzelnen Fraktionen des Eluats aus der Gelfiltrationssäule für Fraktionen VIa, VIb und VIc durchgeführt (7). Für 7 wurden 50 Einheiten humaner Topoisomerase I (Bahn 1), 2 μl Gelfiltrationsfraktion 63 aus Fraktion VIa (Bahn 2), 5 μl Gelfiltrationsfraktionen 59 und 67 aus Fraktion VIc (Bahnen 3 und 4) und 5 μl Gelfiltrationsfraktion 63 aus Fraktion VIb (Bahn 5) verwendet. Diese Resultate zeigen, dass die kleineren Proteine, die in den Fraktionen VIb und VIc auftraten, anders als das Abbauprodukt von humaner Topoisomerase I selbst nicht mit Antikörper gegen humane Topoisomerase reagierten. Dies zeigt, dass das 75.000 Dalton-Protein und das 80.000 Dalton-Protein keine Abbauprodukte von Topoisomerase V sind.
Beispiel 3
Zeitlicher Verlauf und Temperaturabhängigkeit der Topoisomerase V-Aktivität
Der zeitliche Verlauf und die Temperaturabhängigkeit der Topoisomerase V-Aktivität wurden bestimmt, indem positiv oder negativ supergeknäulte pBR322-DNA mit 2 ng oder 20 ng Topoisomerase V über unterschiedlich lange Zeiten (8A) oder bei unterschiedlichen Temperaturen (8B und 8C) inkubiert wurden.
Für 8A wurde positiv supergeknäulte (Bahnen 1–5) oder negativ supergeknäulte (Bahnen 6–10) pBR322-DNA mit 2 ng M. kandleri-Topoisomerase V unter Standard-Assay-Bedingungen für die angegebenen Zeiten inkubiert. In Gegenwart von 1,6 μg/ml Chloroquin wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt, so dass die Entspannung sowohl von positiv, als auch von negativ supergeknäulter DNA zu einer Verringerung der Mobilität von Topoisomeren führte.
Für 8B wurde positiv supergeknäulte pBR322-DNA mit 20 ng Topoisomerase V bei den angegebenen Temperaturen inkubiert, und es wurde eine Gelelektrophorese ohne Chloroquin durchgeführt. Vollständig entspannte pBR322-DNA ("rel") ist während der Inkubation bei 70 bis 90°C leicht negativ supergeknäult.
In 8C wurde negativ supergeknäulte pBR322-DNA mit 20 ng Topoisomerase V bei den angegebenen Temperaturen inkubiert, und es wurde eine Gelelektrophorese mit 25 μg/ml Chloroquin durchgeführt. Die negativ supergeknäulte Substrat-DNA läuft an dem Gel wie leicht positiv supergeknäulte DNA. Die Produkt-Topoisomere hatten bei 94°C eine niedrigere Lk als die Substrat-DNA, während die Produkte ("U") bei 100°C eine wesentlich geringere Lk als das Substrat hatten; die Topoisomere blieben selbst in Gegenwart von 25 μg/ml Chloroquin in hohem Maße entwunden.
Das gereinigte Enzym entspannt sowohl positiv wie auch negativ supergeknäulte DNA mit nahezu gleicher Leistungsfähigkeit. Die Endverteilung an Topoisomeren hängt nicht vom ursprünglichen Supercoiling ab und wird durch mehrfache Änderungen im Enzym : DNA-Verhältnis nicht beeinträchtigt. Die Entspannungsaktivität ist katalytisch und progressiv. Der Grad der DNA-Entspannung ist proportional zur zugesetzten Enzymmenge und ist etwa 15 Supercoils pro Minute pro Enzymmonomer. Bei 70–90°C führt die enzymatische Reaktion zu voll-ständig entspannter Doppelstrang-DNA. Bei Temperaturen über 90°C produziert das Enzym in hohem Maße getrennte Formen der DNA. Dieser Effekt, als "unlinking" (bzw. Lösen von Verknüpfungen) bezeichnet, d. h. eine wesentliche Verringerung der DNA-Verknüpfungszahl, wird durch DNA-Schmelzen bewirkt.
Beispiel 4
Effekt von Ionen auf die Aktivität von Topoisomerase V
DNA-Topoisomerase V erfordert keine spezifischen Ionen zur Aktivität. Sie entspannt DNA in NaCl, KCl und Kaliumglutamat (9A–9C, 10A–10D). Die optimalen Bedingungen zur Entspannung sind 1,55 M Kaliumglutamat. EDTA und Mg²⁺ wechselwirken nicht mit der Entspannungsaktivität.
9A ist eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt der Konzentrationserhöhung von Kaliumglutamat auf die enzymatische Aktivität von Topoisomerase V (1,5 Einheiten) bei einem Gemisch von negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA (0,1 μg von jeder Form) als Substrat bei 88°C und 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, und 5 mM Na₂EDTA zeigt. Die Kaliumglutamat-Konzentration ist angezeigt. Inkubationen wurden für 15 Minuten durchgeführt, wie es für alle anderen Assays der Fall ist, wenn nichts anderes angegeben ist. Eine Elektrophorese wurde in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chloroquin durchgeführt. Bahn 1 ist eine Kontrolle.
9B ist eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an Kaliumchlorid auf die enzymatische Aktivität von Topoisomerase V (1,5 Einheiten) bei einem Gemisch aus negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA (für jede Form 0,1 μg) als Substrat bei 88°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, und 5 mM Na₂EDTA zeigt. Die Kaliumchlorid-Konzentration ist wie angegeben. In Gegenwart von 1,6 μg/ml Chloroquin wurde eine Elektrophorese durchgeführt. Bahn 1 ist eine Kontrolle.
9C ist eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer zunehmenden Konzentration an Natriumchlorid auf die enzymatische Aktivität von Topoisomerase V (1,5 Einheiten) bei einem Gemisch aus negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA (0,1 μg für jede Form) als Substrat bei 88°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, und 5 mM Na₂EDTA zeigt. Die Natriumchlorid-Konzentration war wie angegeben. Die Elektrophorese wurde in Gegenwart von 1,6 μg/ml Chloroquin durchgeführt. Bahn 1 ist eine Kontrolle.
Mit 1,55 M Kaliumglutamat wurde bei 88°C eine vollständige Entspannung von positiv supergeknäulter DNA und eine praktisch vollständige Entspannung von negativ supergeknäulter DNA durch Topoisomerase V erreicht.
Die 10A bis 10D zeigen den Effekt variierender ionischer Umgebungen auf die Aktivität von Topoisomerase V auf negativ supergeknäulte DNA als Substrat.
10A ist eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Kaliumglutamat auf die enzymatische Aktivität von Topoisomerase V (3 Einheiten) bei negativ supergeknäulter pBR322-DNA (0,2 μg; "-sc") als Substrat bei 80°C und 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, und 5 nM Na₂EDTA zeigt. Bahn 1 ist eine Kontrolle. Die Elektrophorese wurde ohne Chloroquin durchgeführt.
10B ist eine Photographie eines Agarosegels wie in 10A, außer dass 5 mM MgCl₂ für 5 mM Na₂EDTA eingesetzt wurden. Bahn 1 ist eine Kontrolle.
10C ist eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Kaliumchlorid auf die enzymatische Aktivität von Topoisomerase V (3 Einheiten) bei negativ supergeknäulter pBR322-DNA (0,2 μg) als Substrat bei 80°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, und entweder 5 mM MgCl₂ (Bahnen 1–8) oder 5 mM Na₂EDTA (Bahn 9–16) zeigt.
10D ist eine Photographie eines Agarosegels wie in 10C, außer dass Natriumchlorid für Kaliumchlorid eingesetzt wurde.
Diese Resultate zeigen, dass das Cl^–-Anion die optimale Salzkonzentration für eine DNA-Entspannung durch Topoisomerase V wesentlich erniedrigt. Die Verwendung von Na⁺-Kation anstelle von K⁺ verringert ebenfalls das Optimum. Es besteht allerdings die Tendenz, dass die optimalen NaCl- und KCl-Konzentrationen sich mit steigender Temperatur erhöhen.
Beispiel 5
M. kandleri-Topoisomerase V ist eine Topoisomerase, Typ 1
M. kandleri-Topoisomerase V ist eine Topoisomerase, Typ 1. Das Enzym ändert die Verknüpfungszahl des einzigen pUC19-DNA-Topoisomeren in Stufen von 1 (11).
11 ist eine Photographie eines Agarosegels, die die Entspannung eines einzigen Topoisomeren durch Topoisomerase V mit 0,2 μg nativer pUC19-DNA (Bahnen 1 und 2) oder ihres einzigen Topoisomeren (Bahnen 3 und 4) als Substrat und 15 Einheiten Enzym (Bahnen 2 und 4) bei Elektophorese in Gegenwart von 2 μg/ml Chloroquin zeigt.
Die Resultate von 11 zeigen, dass eine Reihe von Topoisomeren als Resultat der Wirkung von Topoisomerase V auf ein einzelnes negativ supergeknäultes Topoisomer von pUC19-DNA detektierbar sind. Die Lk der produzierten Topoisomere steigt in Stufen von 1.
Beispiel 6
Einzelsträngige DNA beeinträchtigt die Entspannung von negativ oder positiv supergeknäulter DNA durch M. kandleri-Topoisomerase V nicht
Einzelsträngige UX174-DNA beeinträchtigt die Entspannung von negativ oder positiv supergeknäulter pBR322-DNA durch Topoisomerase V bei 70°C und 90°C bei einem beliebigen UX : pBR322-Verhältnis bis zu 4,9 nicht (12).
12 ist eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung einer steigenden Konzentration an einzelsträngiger UX174-DNA auf die Entspannung von positiv (0,2 μg; Bahnen 2 bis 6) oder negativ (0,2 μg; Bahnen 7 bis 11) supergeknäulter pBR322-DNA durch To poisomerase V (5 Einheiten) bei 90°C (A) oder 70°C (B) zeigt. Kontrollen waren positiv supergeknäulte pBR322-DNA (Bahn 1) bzw. negativ supergeknäulte pBR322-DNA (Bahn 12), einzelsträngige UX174-DNA vor Inkubation (Bahn 13) und einzelsträngige UX174-DNA nach Inkubation (Bahn 14).
Diese Daten legen nahe, dass das Enzym Topoisomerase V keinen irreversiblen Komplex zwischen dem Enzym und kurzen Doppelstrangregionen einzelsträngiger UX174-DNA bildet, was im Gegensatz zu mesophilen eukaryotischen Enzymen Topoisomerase I steht, die durch kurze Doppelstrangregionen, die in einzelsträngiger UX174-DNA gebildet werden, inhibiert werden. Diese Resultate zeigen auch, dass Topoisomerase V zur Bindung und Topoisomerisierung doppelsträngige DNA-Regionen benötigt.
Beispiel 7
Trennungsaktivität (Aktivität zur Lösung von Verknüpfungen) von Topoisomerase V
Topoisomerase V aus M. kandleri katalysiert eine Trennungsreaktion (eine Reaktion zur Lösung von Verknüpfungen), d. h. eine Reaktion, die die Lk geschlossener, zirkulärer DNA unter ihren Ursprungswert verringert. Dies ist ein Hinweis für eine mindestens partielle Entwindung der Watson-Crick-Doppelhelix-Struktur. Die Trennungsaktivität ist bei höherer Temperatur begünstigt: Je höher die Temperatur ist, desto mehr entwundene DNA wird gebildet ( 8B, C).
Die Trennungsaktivität (die Aktivität zum Lösen von Verknüpfungen) der Topoisomerase V wird am deutlichsten durch die Aktivität auf entspannte DNA demonstriert (13A-13D). Denn die Produkte sind auf Gelelektrophorese deutlich vom Substrat unterscheidbar, da die Lösung von Verknüpfungen eine erhöhte Mobilität der entspannten DNA verursacht.
13A ist eine Photographie eines Agarosegels, die den Effekt einer steigenden Konzentration an Natriumchlorid auf die Aktivität von Topoisomerase V (2 Einheiten) auf entspannte pBR322-DNA (0,2 μg) bei 80°C in Gegenwart von 5 mM Na₂EDTA (Bahnen 2 bis 7) oder 5 mM MgCl₂ (Bahnen 9 bis 14) zeigt. Die Bahnen 1 und 8 enthielten kein Enzym.
13B ist eine Photographie eines Agarosegels wie in 13A, allerdings für die enzymatische Reaktion, die bei 95°C durchgeführt wurde.
13C ist eine Photographie eines Agarosegels wie in 13A, wobei allerdings bei höheren Natriumchlorid-Konzentrationen und mit einer größeren Enzymmenge (10 Einheiten) gearbeitet wurde. Die Bahnen 5 und 10 enthielten kein Enzym. Die Bahnen 1 bis 5 enthielten 5 mM Na₂EDTA; die Bahnen 6 bis 10 enthielten 5 mM MgCl₂.
Die 13D ist eine Photographie eines Agarosegels wie in 13C, allerdings wurde die enzymatische Reaktion bei 95°C durchgeführt.
Entsprechende Resultate wurden bei einer steigenden Konzentration an Kaliumglutamat für den Umwandlungsgrad des Anfangssubstrats (ein Gemisch aus negativ und positiv supergeknäulter pBR322-DNA (0,1 μg für jede Form)) in in hohem Maße entwundener ccDNA durch Topoisomerase V (1,5 Einheiten) bei 95°C in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 5 mM Na₂EDTA erhalten.
Bei 75 und 150 mM monovalentem Kation können die Produkte der Trennungsreaktion als die Bande zwischen +sc- und -sc-Banden in den 9A, 9B und 9C, in den Banden 2 und 3 erkannt werden. Bei konstanter Temperatur führt eine Erhöhung bei der Ionenstärke des Reaktionsgemisches zu einem Umschalten der Aktivität vom Modus zum Lösen von Verknüpfungen zum Entspannungsmodus.
Topoisomerase V behält ihre Aktivität zum Lösen von Verknüpfungen bei NaCl-Konzentrationen, die so niedrig wie 1 mM sind, bei. Je niedriger die Ionenstärke ist, desto niedriger ist die Temperatur, bei der eine Trennung auftritt (13A, Bahn 2; 13B, Bahn 9). Wenn die Trennungsreaktion bei 95°C durchgeführt wird, werden Zwischenprodukt-Topoisomere bei 155 und 191 mM NaCl erkannt und sind bei Salzkonzentrationen von 1 mM NaCl bis 91 mM NaCl nicht vorhanden (13B, 13D). Dies legt nahe, dass die Trennung von entspannter DNA bei niedrigen Salzkonzentrationen progressiv ist und neigt dazu, bei hohen Salzkonzentrationen distributiv zu sein.
Beispiel 8
Reversibilität der Bindung von M. kandleri-Topoisomerase V an DNA
Bei hohen ionischen Stärken dissoziiert Topoisomerase V leicht von einem DNA-Molekül und bindet an ein anderes, wobei sie auf beide DNA-Moleküle wirkt. Bei niedriger Ionenstärke wird Topoisomerase V fest an das DNA-Molekül gebunden, an das es zuerst bindet, und eine Dissoziation und Bindung an ein anderes DNA-Molekül tritt nicht auf. Diese Resultate sind in den 14A und 14B dargestellt.
Bei diesen Experimenten wurde Topoisomerase V bei hoher Salzkonzentration (300 mM NaCl) mit der Substrat-DNA vorinkubiert. Dann wurde die Probe verdünnt, und die NaCl-Konzentxation wurde entweder auf 300 mM NaCl oder auf eine geringere Salzkonzentration (50 mM) eingestellt. Dann wurde Competitor-DNA zugesetzt. Die enzymatische Reaktion wurde bei 90°C durchgeführt, und die Resultate wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert.
14A ist eine Photographie eines zweidimensionalen Agarosegels, die den Wettbewerb von Topoisomerase V (100 Einheiten) um Substrat-DNA mit entspannter pBR322-DNA und entspannter pGEM3-DNA zeigt, wobei die Elektrophorese für die erste Abbildung ohne Chloroquin und für die zweite Abbildung mit 3 μg/ml Chloroquin durchgeführt wurde. Die Bahnen 1 bis 3 beinhalteten eine anfängliche Inkubation mit 300 mM NaCl mit einer der zwei DNAs, gefolgt von einer Einstellung der NaCl-Konzentration auf 50 mM und Zusatz der Competitor-DNA.
Nach Erhöhen der Temperatur auf 90°C wurde die Inkubation für 15 Minuten fortgesetzt. In den Bahnen 6 bis 8 blieb die NaCl-Konzentration bei 300 mM. In den Bahnen 1 und 6 waren sowohl 0,2 μg entspannte pBR322-DNA, als auch 0,2 μg entspannte pGEM3-DNA zu Beginn der Inkubation vorhanden. In den Bahnen 2 und 7 waren 0,2 μg entspannte pBR322-DNA zu Inkubationsbeginn vorhanden, und es wurden 0,2 μg pGEM3-DNA nach Verdünnung oder Verringerung der NaCl-Konzentration zugesetzt. In den Bahnen 3 und 8 waren 0,2 μg entspannte pGEM3-DNA zu Beginn der Inkubation vorhanden, und es wurden 0,2 μg pBR322-DNA nach Verdünnung oder Verringerung der NaCl-Konzentration zugesetzt. Bahn 4 enthielt entspanntes pGEM3, Bahn 5 entspanntes pBR322, Bahn 9 enthielt negativ supergeknäultes pGEM3 und Bahn 10 enthielt negativ supergeknäulte pBR322-DNA.
14B entspricht 14A, außer dass die Verbundpräparation von pGEM3, die supergeknäultes und entspanntes pGEM3 enthielt, verwendet wurde und eine Inkubation bei 90°C für 10 Minuten durchgeführt wurde.
Ungeachtet, ob das Substrat pBR322-DNA und der Competitor pGEM3 oder umgekehrt war, ob sowohl Substrat als auch Competitor entspannt waren, das Substrat entspannt und der Competitor supergeknäult waren oder umgekehrt, in allen Fällen mit 300 μM NaCl trennte das Enzym sowohl Substrat, wie auch Competitor-DNA (14A, 14B). Dies bedeutet, dass bei dieser Salzkonzentration Topoisomerase frei dissoziiert und DNA bindet. Wenn allerdings die NaCl-Konzentration auf 50 mM eingestellt wurde, bevor Competitor-DNA zugesetzt worden war, war der Grad der Umsetzung bei der Competitor-DNA sehr niedrig.
Beispiel 9
Inhibitoren von Topoisomerase V
Camptothecin ist als Inhibitor von M. kandleri-Topoisomerase V nicht so wirksam wie für viele eukaryotische Topoisomerase I-Spezies. Camptothecin ist in Dimethylsulfoxid, einem organischen Lösungsmittel, das eukaryotische Topoisomerasen nicht inhibiert, löslich. Allerdings hemmt Dimethylsulfoxid allein, d. h. ohne Camptothecin, M. kandleri-Topoisomerase V (15).
15 ist eine Photographie eines Agarosegels, die die Wirkung von Dimethylsulfoxid und Camptothecin auf die Aktivität von Topoisomerase V (15 Einheiten) bei 0,2 μg pBR322-DNA als Substrat bei 70°C zeigt. Die angegebenen Konzentrationen an Dimethylsulfoxid (DMSO) und Camptothecin (CPT) wurden angewendet. Inkubationen wurden für 15 Minuten durchgeführt.
Beispiel 10
Kovalente Komplexbildung zwischen Topoisomerase V und DNA
M. kandleri-Topoisomerase V bildet mit DNA einen kovalenten Komplex. Dies wird in 16 demonstriert. Einheitlich markierte pBR322-DNA wurde mit dem T7-QuickPrime-Kit (Pharmacia) und [α-³²P]dCTP (NEN) hergestellt. Markierte DNA (5 ng) wurde mit 40 ng Topoisomerase V in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl bei 70°C für 3 Minuten inkubiert. Dann wurde KOH zu 0,05 N zugesetzt, und die Inkubation wurde eine Minute fortgesetzt. Das Gemisch wurde durch Tris-HCl neutralisiert, und Magnesiumacetat wurde zu 10 mM zugesetzt. Die DNA wurde durch 20 Einheiten DNase I und 300 Einheiten Exonuclease III (Pharmacia) bei 37°C über 50 Minuten verdaut. Die Produkte wurden durch SDS-PAGE an einem 4–15%-Gradientengel analysiert. Das Silber-gefärbte Gel (Bahn 1) und sein Autoradiogramm (Bahn 2) sind dargesellt (16). Diese Resultate zeigen, dass DNA mit Topoisomerase V einen kovalenten Komplex bildet.
Beispiel 11
DNA-Spaltung durch M. kandleri-Topoisomerase V
Wie oben angegeben wurde (Beispiel 5; 11), ist Topoisomerase V eine Topoisomerase, Typ 1, die Schnitte in einem Strang zu einer Zeit durchführt. Die genaue Spaltungsstelle wurde als die in 17 dargestellte bestimmt. pGEMI-DNA (Promega) wurde mit HindIII-Restriktionsendonuklease geschnitten, und das 3'-Ende wurde mit [α-³²P]dCTP und unmarkierten Desoxyribonukleosidtriphosphaten durch das Klenow-Fragment von Escherichia coli-DNA-Polymerase I, anschließendem Verdau mit Nae I-Restriktionsendonuklease aufgefüllt. Das 280 bp-Fragment mit endständiger Markierung wurde gelgereinigt und mit (17, Bahn 2) oder ohne (17, Bahn 1) Topoisomerase V inkubiert. Die Proben wurden in Laufpuffer (6 M Harnstoff, 0,5 × TBE) gekocht und unter Verwendung denaturierender 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Hauptspaltungsstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Die genaue Position der Haupt-Topoisomerase V-Spaltungsstelle an dem 280 bp-Fragment der pGEMI-DNA wurde bestimmt, indem die Mobilität des Spaltungsproduktes mit der Maxam-Gilbert-Sequenzierleiter verglichen wurde. Die Sequenz ist in 18 dargestellt. Die Sequenz ist ähnlich den stärksten Spaltungsstellen für eukaryotische Topoisomerasen I, aber nicht identisch mit diesen (B. J. Bonven et al., Cell 41: 541–551 (1985)).
Beispiel 12
Isolierung eines kovalenten Komplexes zwischen M. kandleri-Topoisomerase V und offener, kreisförmiger DNA
Kovalente Komplexe zwischen M. kandleri-Topoisomerase V-Enzym wurden für drei verschiedene Plasmide isoliert: pHOT1, das die Consensus-Spaltungsstelle für eukaryotische Topoisomerase I in den pUCl2-Vektor, pGEM3 und pBR322 insertiert, enthält. Entspannte DNA (0,2 μg für jedes Plasmid) wurde in 30 mM Tris-HCl, pH 8,0 bei 25°C, 300 mM NaCl, 5 mM Magnesiumacetat mit oder ohne Topoisomerase V (100 Einheiten) bei 90°C für 3 Minuten inkubiert. Natriumdodecylsulfat wurde mit 1% zugesetzt, und die resultierenden Gemische wurden für 1 Minute bei 90°C inkubiert. Eine ähnliche Reaktion wurde unter Verwendung von supergeknäulter DNA für jedes Plasmid und humaner Topoisomerase I mit NaCl mit 85 mM durchgeführt. Für jeden Assay (d. h. jedes Plasmid, entspannt oder supergeknäult, mit oder ohne M. kandleri-Topoisomerase V oder humane Topoisomerase V) wurde ein Aliquot mit 2 μg Proteinase K bei 42°C für 4 Stunden verdaut.
Eine zweidimensionale 1,5% Agarose-Gelelektrophorese wurde in TAE-Puffer mit 0,1% SDS für die erste Abbildung und mit 4 μg/ml Chloroquin für die zweite Abbildung durchgeführt.
Die Resultate sind in 19 für jedes der drei Plasmide (pHOT1, oben; pGEM3, Mitte; pBR322 (unten)) dargestellt. Für jedes Plasmid sind die gezeigten Bahnen wie folgt: Bahn 1, unbehandelte supergeknäulte DNA; Bahn 2, entspannte DNA, inkubiert mit M. kandleri-Topoisomerase V; Bahn 3, entspannte DNA, inkubiert mit M. kandleri-Topoisomerase V und verdaut mit Proteinase K; Bahn 4, entspannte DNA ohne M. kandleri-Topoisomerase V; Bahn 5, entspannte DNA ohne M. kandleri-Topoisomerase V und verdaut mit Proteinase K; Bahn 6, unbehandelte, entspannte DNA; Bahn 7, supergeknäulte DNA, inkubiert mit humaner Topoisomerase I; Bahn 8, supergeknäulte DNA, inkubiert mit humaner Topoisomerase I und verdaut mit Proteinkinase K; Bahn 9, supergeknäulte DNA ohne humane Topoisomerase I, und Bahn 10, supergeknäulte DNA ohne humane Topoisomerase I und verdaut mit Proteinase K. Bahn 1 enthielt auch 1 μg pGEM3-DNA.
Bahn 2 für alle drei getesteten Plasmide zeigt, dass die Inkubation entspannte DNA in einer in hohem Maße ungewundene Form umwandelt. Außerdem erscheint eine Bande (mit einem Pfeil gekennzeichnet) oberhalb der offenen, kreisförmigen DNA. Bahn 3 zeigt, dass dieses Produkt gegenüber Proteinase K empfindlich ist, was angibt, dass es sich dabei um einen kovalenten Komplex von M. kandleri-Topoisomerase V mit kreisförmiger DNA, die durch das Protein-Denaturierungsmittel fixiert ist, handelt. Proteinase K verdaut Topoisomerase und führt zu einem geschnittenen DNA-Kreis mit einer Aminosäure oder wenigen Aminosäuren, die an die DNA gebunden sind, die mit der offenen, kreisförmigen DNA wandert.
Nur etwa 1% der Enzymmoleküle wurden eingefangen. Es gab keinen wesentlichen Unterschied unter den drei DNA-Substraten, die zum Erhalt der Komplexe verwendet wurden, wenn auch pHOT1 die Consensusstelle für Topoisomerase I hat und pGEM3 und pBR322 diese Stelle fehlt.
Zum Vergleich ist die kovalente Komplexbildung durch humane Topoisomerase V ebenfalls dargestellt (Bahnen 7 und 8). Die Resultate sind ähnlich denen, die mit M. kandleri-Topoisomerase V erhalten wurden.
Beispiel 13
Proteolytische Fragmente der M. kandleri-Topoisomerase V
Eine Behandlung der M. kandleri-Topoisomerase V mit Endoproteinase Lys-C, einer Protease, die an der Carboxylstelle von Lysin (K) spaltet, erzeugt zwei große Fragmente, die gegenüber einer weiteren Verdauung relativ stabil sind (20).
Proben von Topoisomerase V (10 μg/ml und 35 μg/ml) wurden mit 0,1 μg/ml Lys-C (Promega, Madison, WI) in 30 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol für 30 und 150 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 1 mM TLCK beendet. Fraktionen wurden durch SDS-PAGE (7,5%) analysiert und mit Silber gefärbt.
Für eine Proteolyse im großen Maßstab wurden etwa 100 μg Topoisomerase V mit 3 μg Lys-C in dem obigen Puffer für 3 Stunden verdaut. Fragmente wurden durch 6% SDS-PAGE abgetrennt und auf Immobilon P-Membran (Millipore, Bedford, MA) geblottet.
20 zeigt, dass die Molekularmassen der Fragmente etwa 75 kD und 33 kD waren. Eine Bestimmung der N-terminalen Sequenzen dieser Fragmente zeigte, dass sie vom N-Terminus (75 kD-Fragment) und vom C-Terminus (33 kD-Fragment) von Topoisomerase V stammten. Das 33 kD-Fragment, als Fragment IV bezeichnet, hat die folgende N-terminale Aminosäuresequenz: K-S-G-R-Q-E-R-S-E-E-E-E-K-E-E-L-E-R-K-V-G-E-G-R-A-R-R-L-I-E-Y-F-G-S-A.
Es wurde festgestellt, dass die Fragmente gegenüber einer weiteren Verdauung unter den Bedingungen von 20 resistent sind und strukturelle und/oder funktionelle Domänen innerhalb der M. kandleri-Topoisomerase V darstellen könnten. Allerdings führen verlängerte Inkubation und ein erhöhtes Lys-C : Topoisomerase V-Verhältnis zum Auftreten einer Reihe zusätzlicher Fragmente (21), was ein N-terminales Fragment von etwa 55.000 Dalton einschließt.
VORTEILE DER ERFINDUNG
Thermostabile Topoisomerase V aus Methanopyrus kandleri kann über einen breiten Bereich von Temperaturen und Ionenbedingungen dahingehend wirken, dass sowohl Entspannung von Supercoils, als auch die Lösung von Verknüpfungen von ccDNA begünstigt werden. Das Enzym hat viele Anwendungen bei der enzymatischen DNA-Sequenzierung, der Genclonierung, der Nukleinsäure-Amplifikation durch PCR- oder LCR-Techniken und bei der Herstellung von Hybridisierungssonden, d. h. in einem beliebigen Verfahren, das eine Denaturierung von ccDNA oder einer Anlagerung von Primern oder Hybridisierungssonden erfordert.
Obgleich die vorliegende Endung in beträchtlichen Details bezüglich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, sind auch andere Versionen möglich. Daher sollte der Schutzumfang der angefügten Ansprüche nicht auf die Beschreibung der hier enthaltenen bevorzugten Ausführungsform beschränkt werden.

Claims

Gereinigte, thermostabile DNA-Topoisomerase V, erhältlich aus Methanopyrus kandleri, wobei die Topoisomerase eine Topoisomerase Gruppe B, Typ 1, ist, die für ihre katalytische Aktivität kein Magnesium benötigt, deren Reaktion über einen transienten Einzelstrangbruch abläuft und die die Verknüpfungszahl in Stufen von 1 ändert und die auf Doppelstrang-DNA wirkt, indem sie an das 3'-Phosphorylende der gespaltenen DNA bindet, wobei die Topoisomerase mindestens eine Aminosäuresequenz besitzt, die aus der Gruppe, bestehend aus (1) der Sequenz K-S-D-T-E-T-I-E-T, (2) der Sequenz K-P-E-L-P-Y-V-A-V-P-P-H-M-A-E-R-A-R-R-V-L-T-R-E-D-D-L-A-X-D-V-X-A, (3) der Sequenz K-R-V-P-R-A-X-X-G-X-X-F-D-R-L, (4) der Sequenz K-S-G-R-Q-E-R-S-E-E-E-E-K-E-E-L-E-R-K-V-G-E-G-R-A-R-R-L-I-E-Y-F-G-S-A, (5) der Sequenz K-Y-G-S-A-S-X-X-R-R-L-P-X-E-E-X-R-E-L-G-F-X-D-D-R und (6) einer Sequenz, die mit den in (1) bis (5) angegebenen Sequenzen durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen verwandt sind, ausgewählt ist.
DNA-Topoisomerase V nach Anspruch 1, die ein Einzelketten-Polypeptid mit einem geschätzten Molekulargewicht von etwa 11000 Dalton, basierend auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, ist.
Verfahren zur Herstellung gereinigter thermostabiler DNA-Topoisomerase V aus Methanopyrus kandleri nach Anspruch 1, umfassend die Stufen: (a) Lysieren von Methanopyrus kandleri-Zellen unter Bildung eines Lysats; (b) Behandeln des Lysats mit Polyethylenimin unter Bildung eines Präzipitats und eines Überstands; (c) Präzipitieren des Polyethylenimin-Überstands mit Ammoni amsulfat unter Bildung eines Ammoniumsulfat-Präzipitats; (d) Chromatographieren des Ammoniumsulfat-Präzipitats an Phosphocellulose unter Herstellung eines Phosphocelluloseelu ts; (e) Chromatographieren des Phosphocelluloseeluats an Heparin unter Herstellung eines Heparineluats; (f) Chromatographieren des Heparineluats an einer Säule, um Proteine durch ein Molekularsieb darin zu trennen, um eine gereinigte thermostabile DNA-Topoisomerase V herzustellen, und (g) Isolieren der gereinigten thermostabilen Topoisomerase.
Gereinigte thermostabile Topoisomerase V, herstellbar durch das Verfahren nach Anspruch 3.
In vitro-Verfahren zur Entspannung supergeknäulter DNA, umfassend Behandlung einer supergeknäulten DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus positiv supergeknäulter DNA und negativ supergeknäulter DNA, mit der DNA-Topoisomerase V nach Anspruch 1 bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, bei denen die Trennung komplementärer DNA-Stränge der linearen Form behandelter geschlossener ringförmiger DNA nicht auftritt, und bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, die das Enzym an DNA binden lässt und die Entspannungsreaktion katalysieren lässt, um behandelte DNA herzustellen.
In vitro-Verfahren zur Trennung geschlossener ringförmiger DNA, umfassend Behandeln geschlossener ringförmiger DNA mit der Topoisomerase V nach Anspruch 1 bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, die die Trennung von komplementä ren DNA-Strängen der linearen Form behandelter geschlossener ringförmiger DNA erlauben, und bei einer Temperatur und ionischen Bedingungen, die es ermöglichen, dass das Enzym an DNA bindet und die Trennungsreaktion katalysiert, um DNA mit einer Verknüpfungszahl herzustellen, die niedriger ist als die Verknüpfungszahl der DNA vor Behandlung.
Komplex, umfassend die Topoisomerase V nach Anspruch 1, nicht kovalent an DNA gebunden.
Verfahren zur Detektion und/oder Bestimmung der Methanopyrus kandleri-Topoisomerase V nach Anspruch 1, umfassend die Stufen: (a) Umsetzen der Topoisomerase V nach Anspruch 1 mit einem Antikörper gegen humane Topoisomerase I und (b) Detektion und/oder Bestimmung jener Topoisomerase V durch Detektion und/oder Bestimmung eines Antigen-Antikörper-Komplexes zwischen der Topoisomerase und dem Antikörper.