DE69435071T2

DE69435071T2 - Das tumore unterdrückende protein prb2, damit zusammenhängende genprodukte, und die dafür kodierende dna

Info

Publication number: DE69435071T2
Application number: DE69435071T
Authority: DE
Inventors: Antonio Radnor GIORDANO
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-08-12
Filing date: 1994-08-12
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2014-08-13
Also published as: EP0737249A4; US5457049A; DE69435071D1; JPH09501568A; WO1995005470A1; ES2301159T3; US5532340A; ATE385255T1; CA2169355C; JP3718848B2; EP0737249A1; AU7567994A; CA2169355A1; EP0737249B1

Description

Feld der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Tumor Suppressor Protein (pRb2) der Retinoblastom Familie, welches sich an die E1A transformierende Domain bindet. Die Erfindung betrifft auch DNA Kodierung für pRb2 [SEQ ID NO: 2] und verknüpfte Genprodukte.
Hintergrund der Erfindung
Man glaubt jetzt, dass viele Typen menschlicher Krebsarten verursacht werden durch ein Ungleichgewicht der Wachstumsregulatoren innerhalb einer Zelle. Eine Abnahme der negativen Kontrollwachstumsregulatoren und/oder deren Deaktivierung kann eine krebsartige Bedingung verursachen. Weiterhin kann eine Zunahme positiver Kontrollwachstumsregulatoren ebenfalls eine krebsartige Bedingung verursachen.
Seit der Identifizierung des ersten Tumor Suppressor Gens wurden große Anstrengungen der Krebsforschung fokussiert auf die Identifikation neuer Tumor Suppressor Gene und deren Anwendung bei Humankrebs. Man denkt, dass viele Typen von Humankrebs sich durch den Verlust an Heterozygosität vermeintlicher noch nicht identifizierter Tumor Suppressor Gene (Lasko et. al., Annu. Rev. Genetics, 25, 281–296 (1991)) sich übereinstimmend mit Knudson's „Zwei-Hit" Hypothese (Knudson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 820–823 (1971)) entwickeln.
Eines der am meisten erforschten Tumor Suppressor Gene ist das Retinoblastom Empfänglichkeitsgen (rb), dessen Gen- Produkt (pRb) nachgewiesenermaßen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Zellteilung spielt. In interphasischen Zellen trägt pRb an der Aufrechterhaltung des Ruhestatus der Zelle durch die Unterdrückung der Transkription von Genen bei, die für den Zellenzyklus benötigt werden durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel E2F (Wagner et al., Nature, 352, 189–190 (1991); Nevins, Science, 258, 424–429 (1992) und Hiebert et al., Genes Develop., 6, 177–185 (1992)). Der Verlust dieser Aktivität kann Zellentransformation induzieren wie durch die Reversion des transformierten Phenotyps in pRb Zellen nach der Entfernung einer funktionalen pRb gezeigt wurde (Huang et al., Science 242, 1563–1565 (1988); Bookstein et al., Science, 247, 712–715 (1990) und Sumegi et al., Cell Growth Differ., 1, 247–250 (1990)).
Mit Eintritt in den Zellenzyklus scheint pRb durch zellenzyklusabhängige Kinasen phosphorylisiert (Lees et al., EMBO J. 10, 4279–4290 (1991); Hu et al., Mol. Cell. Biol., 12, 971–980 (1992); Hinds et al., Cell, 70, 993–1006 (1992); Matsushime et al., Nature, 35, 295–300 (1992)) von der gedacht wird, dass sie ihre Dissoziierung von Transkriptionsfaktoren und folglich, den Ausdruck der geforderten Gene für die Progression durch den Zellzyklus gestattet. Bemerkenswerterweise schlägt die Assoziation von pRb mit Zellzyklusregulatoren wie Zyklinen und zellzyklusabhängigen Kinasen einen universellen Charakter zu deren Funktion vor.
Jedoch wurde die Verwicklung von pRb bei Humankrebs auf eine begrenzte Anzahl von Tumortypen beschränkt, nahelegend dass diese hypothetische universelle Funktion durch andere Genprodukte in einer zelltypisch spezifischen Weise ausgeführt wird. Konsistenterweise beeinflusst eine Ausschaltung des rb Gens in Mäusen nur spezifische Zelltypen und nach mehreren Tagen der embrionalen Entwicklung (Jacks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 820–823 (1992); Lee et al., Nature, 359, 288–294 (1992); Clarke et al., Nature, 359, 328–330 (1992)).
Die Fähigkeit mehrerer transformierender Proteine aus humanen DNA Tumorviren zur Aktivierung von Zellvermehrung war ein nützliches Werkzeug für die Identifikation von zellularen Faktoren, die bei der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind. Negative Regulatoren von Zellwachstum können so effektive Ziele für die Inaktivierung durch diese viralen Proteine sein, wie es bei dem Produkt der Retinoblastom Gene auftritt.
Andenovirus E1A, SV40 T Antigen und Papillomavirus E7 sind drei virale Proteine, für die herausgefunden wurde, dass sie sich an pRb binden. Diese Bindung ist verantwortlich für das Loslassen der Transkriptionsfaktoren welche für den Ausdruck der Zellzyklusgene erforderlich sind (Nevins, Science, 258, 424–429 (1992), Bandara et al., Nature, 351, 494–497 (1991)).
Ein in den drei viralen Proteinen gefundener konservierter Leitgedanke erlaubt Interaktion und komplexe Formation mit pRb (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3, 63–70 (1993)).
Im Falle des Adenovirus E1A Proteins wird dieser Leitgedanke in der Transformationsdomain 2 lokalisiert, welche für die Wachstumsaktivierung benötigt wird. Das pRb abhängige Produkt p107 bindet sich ebenfalls in diesem Bereich (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8, 3955–3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56, 67–75 (1989)).
Domain 2 ist ebenfalls die Stelle der Interaktion mit einem zusätzlichen E1A-Bindungsproteins, p130 (Giordano et al., Oncogene, 6, 481–485 (1991)). Dies hat zu der Vorstellung geführt, dass p130 eine strukturelle Beziehung zu pRb und p107 hat (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3, 63–70 (1993)).
Die E1A-Bindungsdomain in pRb und p107 ist eine konservierte Region bezeichnet als „Taschenregion" (Kaelin et al., Mol. Cell. Biol., 10, 3761–3769 (1990); Ewin et al., Cell, 66, 1155–1164 (1991)) und es wird gedacht, dass diese eine Primärrolle in der Funktion dieser Proteine spielt. Die Tasche ist strukturell gebildet durch zwei Bereiche A und B, die in pRb und p107 konserviert sind und durch nicht konservierte Stanzstücke unterschiedlicher Größen in pRb und p107 separiert werden.
Zusätzlich zu pRb und p107 gibt es andere zellulare E1A-Bindungproteine, die durch Ko-Immunoprecipitationsexperimente unter Verwendung von Antikörpern gegen E1A identifiziert worden sind. Diese zellularen Proteine schließen die Hauptpolypeptide p300, p130, p60/Cyclin A und verschiedene andere untergeordnete Formen ein (Yee, et al., Virology, 147, 142–153 (1985); Harlow et al., Mol. Cell. Biol., 6, 1579–1589 (1986); Giordano, et al., Cell, 58, 981–990 (1989); Giordano, et al., Science, 253, 1271–1275 (1991)). Es wurde gezeigt, dass die Bindung an die N-terminale Region exklusiv für p300 ist (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8, 3955–3959 (1988); Whyte et al., Cell., 56, 67–75 (1989); Stein et al., J. Virol., 64, 4421–4427 (1990)) und dass pRb2 konsistenterweise sich nicht an diesen Bereich bindet. Es wurde gezeigt dass beide Domains 1 und 2 des E1A Proteins notwendig für die E1A-Bindung des folgenden Satzes von Proteinen ist: pRb, p107, p60/Zyclin A, und p130 (Egan et al., Mol. Cell. Biol, 8, 3955–3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56, 67–75 (1989); Giordano et al., Science, 253, 1271–1275 (1991)). Weiterhin wurde zuvor gezeigt, dass der E1A-928 Mutant sich an p107 und p60/Zyclin A aber nicht an pRb und p130 bindet.
Die Assoziation von pRb mit den Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel E2F, tritt bei Interaktionen an der Ta schenregion auf (Raychaudhuri et al., Genes Develop., 5, 1200–1207 (1991)) und es wurde kürzlich ebenfalls gezeigt, dass p107 solch ein Bindungsprofil verwendet (Cao et al., Nature, 355, 176–179 (1992)). Weiterhin wird die Taschenregion mutiert gefunden bei verschiedenen Humankrebsen, wobei eine Fehlfunktion des pRb Proteins gedankenmäßig in der Akquisition des transformierten Phenotyps beteiligt ist (Hu et al., EMBO J., 9, 1147–1153 (1990); Huang et al., 1990)).
Dyson et al., J. Virology, 66, 6893–6902 (1992) schlägt vor, dass zwei Bereiche des pRb benötigt werden, damit E1A stabile Komplexe mit Retinoblastom Protein bildet und die notwendig sind zur Assoziation mit E1A mit anderen Proteinen einschließlich p130, p107 Zyclin A und p33^cdk2.
Es gibt einen Bedarf zur Identifikation und Sequenzierung neuer rb-abhängiger Gene, die eine Beteiligung in der Verhinderung von Zellwachstum haben. Es werden Gene benötigt, die abhängig von rb und deren Proteinprodukten sind und die ebenfalls Tumorsuppressoraktivität in spezifischen Zelltypen haben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung wilder Typen und mutierter Formen des E1A Proteins. Die Mutantformen sind pm928/961, dl2-36, dl38-67 und dl73-120. Die Natur jeder Mutation wird schematisch fortgesetzt.
2 ist ein SDS-PAGE Gel welches die Bindung des pRb2 Proteins an eine Fusionskonstruktion zwischen einem wilden E1A Protein und einem Glutathion-S-Transferase (GST) Protein (Bahn 2) und an E1A Mutantbildungen zeigt, die mit einem GST Protein verschmolzen sind: dl2-36 (Bahn 3), dl38-67 (Bahn 4), dl73-120 (Bahn 5) und pm928/961 (Bahn 6). GST Protein mit nicht verschmolzener E1A wurde als Kontrolle eingeführt (Bahn 1), und zeigte keine Bindung mit dem pRb2 Protein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird definiert in den Ansprüchen dieser Beschreibung, auf die sich jetzt bezogen werden soll.
Die vorliegende Erfindung kann auf diese Weise ein rekombinantes DNA Klonvehikel bereitstellen, welches eine DNA Sequenz enthält, welche die pRb2 Gen DNA Humansequenz enthält. Eine bevorzugte DNA Sequenz ist eine Sequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 1. Die DNA enthält eine Sequenzcodierung für die Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 2.
In einem anderen Ausführungsbeispiel sieht die vorliegende Erfindung ein Protein vor, welches eine Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 2 enthält. Das Protein ist nicht phosphorylisiert.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel sieht die vorliegende Erfindung eine Gastzellenkette vor, welche durch die DNA des Klonvehikel nach obiger Beschreibung transformiert ist, wobei die Gastzellenkette die DNA des Klonvehikel zur Herstellung eines Proteins bestimmt. Bevorzugterweise hat die DNA eine Sequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 1 und das hergestellte Protein hat eine Sequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 2.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das pRb2 Protein ist ein zunächst nicht sequenziertes nicht charakterisiertes Mitglied der pRb-Familie der Tumor Suppressor Proteine. Dieses Protein wurde als pRb2 bestimmt, weil es sich an das Adenovirus E1A Protein in gleicher Weise wie pRb und P107 bindet. Deshalb wurde die cDNA Sequenzkodierung für pRb2 als das pRb2 Gen bestimmt.
Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendende Proben, abgeleitet aus den Domains 1 und 2 des rb Gens wurde verwendet zur Identifizierung der pRb2 cDNA Sequenz wie folgt.
Synthetisch degenerierte Oligonucleotiden wurden bestimmt, basierend auf konservierten Arminosäuresequenzen benachbart zu den Abstandsstücken in pRb und p107. Diese Oligonucleotiden wurden bestimmt als Primer A und Primer B und verwendet als PCR Primer zur Isolierung und zum Klonen der pRb2 cDNA Sequenz.
Primer A ist ein Oligonucleotid enthaltend 18 Nucleotide kodiert für die Aminosäuresequenz Phe-Tyr-Lys-Val-Ile-Glu (SEQ ID NO: 3). Das 5' Ende des Primer A enthält ebenfalls neun Nucleotide die eine BamHI Restriktionsstelle bilden.
Primer B ist ein Oligonucleotid enthaltend 18 Nucleotide kodiert für die Aminsäuresequenz Gln-Asp-Leu-His-Arg-Asp (SEQ ID NO: 4). Das 5' Ende des Primer B enthält ebenfalls neun Nucleotide die eine HindIII Restriktionsstelle bilden.
Jede der 18-mer Primer A und B korrespondieren zu konservierten Bereichen in den Taschenregionen von pRb und p107. Die beiden Restriktionsstellen (BamHI für Primer A und HindIII für Primer B) wurden verwendet zum passenden Subklonen der verstärkten PCR Fragmente in einen kommerziell verfügbaren Vektor (pBluescript, Stratagene, La Jolla, CA).
Das PCR Produkt wurde als Probe verwendet für das Screening von cDNA Bibliotheken aus humanen 293 und HeLa Zellen. Aus dem Screening wurden verschiedene positive Klone identifiziert. Diese Klone wurden sequenziert und analysiert für einen Klon, der eine cDNA in voller Länge enthält.
Einer der HeLa cDNA Klone enthielt einen putativen Start Codon, der kompatibel mit der Kozak Startsequenz ist (Kozak, J. Mol. Biol., 196, 947–950 (1987). Dieser Klon zeigte einen einheitlich offenen Leserahmen endend in einem Abschlusscodon 3,249 Basispaare stromabwärts (siehe SEQ ID NO: 1). Diese vollständige Sequenz beinhaltet 55 Basispaare stromaufwärts des offenen Leserahmens, die keine putative Startstelle enthielten und einen 3' nicht kodierenden Bereich endend in einen Poly A Schwanz. Der offene Leserahmen dekodierte ein Polypeptid aus 1,082 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) mit einer vorhersagbaren molekolaren Masse von ungefähr 120 kD. Dieser cDNA Klon wurde bezeichnet als rb2 und war folglich das dekodierte Protein pRb2.
Die Sequenz des Proteins pRb2 (SEQ ID NO: 2) im Vergleich mit den pRb und p107 Proteinsequenzen zeigte einen hohen Level an Identität, bezüglich p107 53% und bezüglich pRb 32%. Dies suggeriert eine engere Beziehung zwischen pRb2 und p107. Ein teilweiser Vergleich der Aminosäuresequenzen dieser drei Proteine zeigt, dass die Taschenregion klar in pRb2 konserviert ist, hauptsächlich auf dem Level der Domains A und B. Dies suggeriert, dass pRb2 Eigenschaften ähnlich wie pRb und p107 hat, wie z. B. die Bildung von dem Zellzyklus zugeordneten Proteinkomplexen, die bekannter Weise über die Taschenregion auftreten. Dies suggeriert, dass pRb2 in der Zellzyklusmaschinerie beteiligt ist. Darüber hinaus suggerieren die hohen Identitäten, die in den C- und N-terminalen Bereichen zwischen pRb2 und p107 gefunden wurden, eine Beteiligung dieser Bereiche bei einer Funktion von p107 und pRb2, die sich von der von pRb differenzieren kann.
Der pRb2 cDNA Klon wurde in ein RNA Segment in vitro überschrieben durch eine T7 RNA Polymerase Capping Reaktion auf dem linearisierten pBluescript-pRb2. Das sich ergebende Transkriptionsprodukt (RNA Segment) wurde mit einer Phenol/Chloroform Lösung extrahiert und schlug sich in einer Ethanol Lösung nieder.
Das Transkriptionsprodukt wurde als Substrat für eine in vitro Übersetzung in ein Protein verwendet unter Verwendung eines rabbit reticulocyte lysats (Promega, Biotec, Madison, WI) und ³⁵S-methionin als radioaktives Label (Pelham et al., Eur. J. Biochem., 67, 248–256 (1976)). Unterschiedlich trunkierte Formen des Proteins wurden hergestellt. Die größte pRb2 Proteinform migrierte zu ungefähr 120 kD durch SDS-PAGE. Das bekannteste dieser Bänder korrespondiert mit einer Proteinform die bis ungefähr 90 kD migrierte, und eine dritte Proteinform wurde gefunden zur Migration bis 85 kD.
Nach der Isolation wurden das 120 kD pRb2 Protein und seine 90 kD und 85 kD trunkierten Formen getestet auf E1A Proteinbindungseigenschaften. Die E1A Bindungsergebnisse wurden verglichen mit den E1A Bindungseigenschaften des pRb und p107 Proteins. Sowohl pRb als auch p107 Proteine binden sich an das Adenovirus E1A Protein durch ihre diesbezüglichen Taschenregionen. Das Aufzeigen der Bindung von E1A Protein durch das pRb2 Protein würde indizieren, dass letzteres Protein eine Schlüsselrolle in der Regulierung der Zellteilung hat. Die E1A Bindungskapazität von pRb2 wurde auf diese Weise wie folgt bestimmt.
Wilde Typen und mutierte Formen des E1A Proteins wurden erhalten. Die Natur der Mutationen wird in 1 fortgesetzt. Eine bindende Grundlage wurde erzielt um die Bindung der wilden Typen und des Mutanten E1A Proteins an in vitro übersetztem pRb2 Protein (102 kD und trankierte 90 kD und 85 kD Proteine) zu testen vorgeklärt aus Translationslösung. Jedes der drei in vitro Translationshauptformen des pRb2 Proteins band sich an E1A.
Eine E1A Zerstörungsmutation beinhaltend die N-terminal Bereiche von E1A (dl2-36) beeinflusste nicht die Bindung von pRb2 an E1A. Die Bindung von pRb2 wurde auch nicht beeinflusst durch Zerstörungsmutationen mit der transformierenden Domain 1 von E1A (E1A Mutanten dl38-67 und dl73-120). Dies suggeriert, dass die Bindung von pRb2 an E1A nicht über diese Bereiche der E1A stattfindet. Jedoch war die Fähigkeit des pRb2 Proteins zur Bindung fast vollständig abgeschafft, wenn ein E1A Mutantprotein verwendet wurde, welches eine zweifache Punktmutation der transformierenden Domain 2 des E1A enthielt (E1A Mutant pm928/961, bei welchem Cys substituiert wurde für Gly an Position 124 und Lys für Glu an Position 135). Deshalb wird die transformierende Domain 2 von E1A für die Bindung an pRb2 benötigt. Dies suggeriert, dass die E1A Bindungskapazität von pRb2 erreicht wird, wenigstens teilweise, durch die transformierende Aktivität von E1A.
Obwohl das pRb2 Protein das gleiche Molekulargewicht wie das p130 Protein hat und sie beide gleiche Bindungsprofile an dem wilden Typ und dem Mutantenprotein zum E1A haben, sind die beiden Proteine nicht identisch. Das p130 Protein ist phosphorylisiert an Ser und Thr Residuen während pRb2 nicht phosphorylisiert ist. Darüber hinaus existiert p130 in mehr als einer phosphorylisierten Form.
Ein als pBluescript-pRb2 bezeichneter Klonvektor, der die pRb2 cDNA enthielt, wurde abgelegt auf der American Type Culture Collection, Rockville, MD am 11 August 1993 und ihm wurde die Folgenummer 75521 gegeben.
Eine E. Colibakterienspielart, bezeichnet als E. coli pBluescript-pRb2, welche ein Plasmid enthielt mit der pRb2 cDNA wurde bei ATCC, hinterlegt, Rockwill, MD am 11. August 1993 und ihr wurde die Folgenummer 69383 gegeben.
Es ist dem Fachmann der genetischen Ingenieurwissenschaften bekannt, die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder verwandte Sequenzen zur Kodierung des pRb2 Proteins nach vorliegender Erfindung zur Herstellung von pRb2 Protein über mikrobiologische Prozesse zu verwenden. Die Verwendung der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 zur Herstellung von pRb2 wird erleichtert für den Fachmann durch Verwendung des pBluescript-pRb2 Klonvektors in Übereinstimmung mit dieser Erfindung.
Die Verschmelzung der Nukleotidsequenzen zur Kodierung für das pRb2 Protein in einen Expressionsvektor und zur Übertragung oder Impfung von Gastzellen, entweder eukariotisch (Hefe oder Säugetierzellen) oder prokariotisch (bakterielle Zellen) sind Standardverfahren, die bei der Herstellung anderer vorbekannter Proteine verwendet werden, d. h., Insulin, Interferon, humane Wachstumshormone oder ähnlichem. Gleichartige Verfahren oder offensichtliche Abweichungen davon können angewendet werden zur Bereitung von pRb2 Proteinen durch mikrobiologische Mittel oder Säugetiergewebekulturtechnelogie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleinsäuremoleküle, die das pRb2 Protein kodieren, können in bekannte Vektoren zum Gebrauch bei standardrekombinanten DNA Techniken zur Herstellung rekombinanter pRb2 Proteine eingesetzt werden. Standardrekombinante DNA-Techniken beinhalten solche Techniken, wie sie durch Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und durch Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York, NY (1991) beschrieben sind. Die Vektoren können zirkular oder nicht zirkular sein. Die Gastzelle kann prokariotisch oder eukariotisch sein. Die bevorzugte prokariotische Gastzelle enthält E. coli. Bevorzugte eukariotische Gastzellen beinhalten Hefen, Insekten- und Säugetierzellen. Bevorzugte Säugetierzellen beinhalten die Primatzellen wie Affenzellen, die durch Simiam Viren (d. h., COS Zellen), Humanzellen und chinesische Eierstockzellen (CHO) eines Hamsters transformiert wurden.
Der Fachmann wird die Tatsache bevorzugen, dass das cDNA Fragment, welches sich in der SEQ ID NO: 1 fortsetzt, nur ein DNA Segment ist, welches sich für pRb2 kodiert. Andere equivalente DNA Sequenzen von wesentlicher Gleichheit werden sofort ins Auge gefasst, die sich für pRb2 kodieren werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls derartige equivalente DNA Sequenzen.
Darüberhinaus wird die Substitution equivalenter Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 nicht erwartet um die pRb2 Proteinaktivität zu beeinflussen. Diese Aminosäuresubstitutionen wurden durch den hier in Rede stehenden Fachmann ins Auge gefasst. Solche eqivalenten Aminosäuresequenzen sind ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die folgenden nicht begrenzten Beispiele werden zur Illustration der Erfindung vorgesehen.
Beispiele
BEISPIEL 1: Erzielen von pRb2 cDNA und Aminosäure Sequenzen
A. Synthese der PCR Primer
Primer A und B wurden unter Verwendung von Techniken der Standardoligonukleotid Synthese synthetisiert und gereinigt.
Primer A enthielt 18 Nukleotide die sich für die Polypeptidsequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 3 kodieren. Das 5'-Ende hatte neun zusätzliche Nukleotide, welche eine BamHI Restriktionsstelle bildeten. Primer B enthielt 18 Nukleotide, die sich für die Polypeptidsequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 4 kodierten. Das 5'-Ende hatte neun zusätzliche Nukleotide, welche eine HindIII Restriktionsstelle bildeten.
B. PCR Verstärkung einer Human 293 cDNA Bibliothek
Eine lamda-ZAPII cDNA Bibliothek wurde aus der Rückwärtstranskription von RNA aus 293 Humanzellen unter Verwendung von Standardtechnik gewonnen. Die cDNA Bibliothek wurde über PCR mit Primer A und B aus dem Beispiel 1A oben verstärkt. Das PCR wurde unter Verwendung eines GenePmp^TMkit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CN) in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Danach folgten dreißig Zyklen einschließlich einer einminütigen Denaturisation bei 94°C, einer Minute Tempern bei 37°C und zwei Minuten Ausdehnung bei 68°C gefolgt durch eine fünfzehnminütige Ausdehnung. Dies führte zu PCR Verstärkung eines 1 kb Fragmentes zusätzlich zu pRb und p107 Segmenten.
C. Subklonen und Nukleotidsequenzierung des 1 kb Fragments
Das verstärkte 1 kb Fragment wurde in einem pBluescript Vektor (Stratagene) subgeklont. Nach dem Subklonen wurde Nukleotidsequenzierung unter Verwendung der Dideoxymethode des Sequenase Kits (United States Biochemicals) ausgeführt. Die Nukleotidsequenz des 1 kb Fragments wies einige Homologie mit pRb und p107 cDNAs auf.
D. Prüfen der cDNA Bibliotheken aus 293 und HeLa Zellen
Das 1 kb Fragment wurde als Probe verwendet zum Screening zusätzlicher cDNA Bibliotheken. Lamda-ZAPII cDNA Bibliotheken aus menschlichen 293 und HeLa Zellen (Stratagene) wurden unter Verwendung des 1 kb Fragments gescreent, welches mit einem α-³²P-CTP durch die Zufallsprimermethode (Boehringer Mannheim) gekennzeichnet war. Kurz, lambda-ZAP Geschwür wurde an Escherichia coli BB4 Streifenbakterien absorbiert und in Agar Medium platziert. Nitrocellulosefilter wurden hybridisiert zur PCR Probe in einem hochstringenten Protokoll welches die folgende Pre-hybridisierungsmixtur enthielt: 5 × SSPE, 10 × Denhardt's Lösung, 150 μg/ml DNA aus He ringssperma, 50% Formamid und 2% SDS, eine Hybridisierungsmixtur mit 10⁶ cpm/ml der 1 kb PCR Probe zur Prehybridisierungsmixtur und dreimaliges Waschen von zwanzig Minuten, jeweils bei 42°C mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS.
E. Analysierung der positiven Klone aus der Probe
Aus den Probenverfahren nach Beispiel 1D wurden mehrere positive Klone lokalisiert. In vivo Reizmittel (Stratagene) wurde auf den verschiedenen positiven Lambda-ZAP Klonen ausgebracht. pBlueskript Vektoren, die cDNA Klone enthielten, wurden erzielt. Die cDNA Klone wurden reproduziert und Nukleotidsequenzen auf jedem cDNA Klon wurden, wie oben unter Beispiel 1C beschrieben, erzeugt. Die Sequenzierungsergebnisse wurden für die Volllängen cDN analysiert einschließlich des 1 kb Fragments.
Eines der HeLa cDNA Klone enthielt ein putatives Startkodon welches mit der Kozak Startsequenz kompatibel war. Dieses Klon zeigte einen einheitlichen offenen Leserahmen, der in einem Abschlusskodon 3,249 Basispaar stromabwärts endete (siehe SEQ ID NO: 1). Die komplette Sequenz beinhaltete 55 Basispaare stromaufwärts des offenen Leserahmens, welcher nicht irgendeine putative Anfangsstelle enthielt und eine 3' nicht kodierende Region, die in einem mehrfachen A Schwanz endete. Der offene Leserahmen kodierte ein Polypeptid der 1,082 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) mit einer vorhergesagten Molekularmasse von ungefähr 120 kD. Dieser cDNA Klon wurde rb2 und folglich das kodierte Protein pRb2. Der pBluescript Vektor, welcher mit dem pRb2 Gen geklont war, wurde als pBluescript-pRb2 bezeichnet.
Die Sequenz des Proteins pRb2 (SEQ ID NO: 2, welche auf der korrespondierenden CDNA Sequenz hergeleitet wurde) im Vergleich mit pRb und p107 Proteinsequenzen zeigte ein hohes Niveau an Identität, bezüglich p107 von 53% und 32% bezüglich pRb. Dies suggeriert eine nähere Beziehung zwischen pRb2 und p107. Partielle Vergleiche dieser drei Proteinsequenzen zeigen, dass die Taschenregion klar in pRb2 konserviert ist, hauptsächlich auf dem Level der Domains A und B.
BEISPIEL 2: E1A Bindung von in vitro-übertragener pRb2
A. Überschreibung und Übertragung von pBluescript-pRb2
Der Beispiel 1E pBluescript-pRb2 cDNA Klon wurde in ein RNA Segment in vitro überschrieben durch eine T7 RNA Polymerase Verkapselungsreaktion auf dem linearisierten pBlueskript-pRb2. Das sich ergebende Überschreibungsprodukt (RNA Segment) wurde mit einer Phenol/Chloroform Lösung extrahiert und in einer Ethanol Lösung niedergeschlagen.
Das Überschreibungsprodukt RNA Segment wurde als Substrat für eine in vitro Übertragung in ein Protein verwendet durch Verwendung von Rabbit Reticulocyte Lysate (Promega, Biotec, Madison, WI) und ³⁵S-Methionin als radioaktive Kennzeichnung (Pelham et al. Eur. J. Biochem., 67, 248–256 (1976)). Verschiedene trunkierte Formen des Proteins wurden hergestellt. Die größte Form migrierte zu ungefähr 120 kD durch SDS-PAGE. Das bekannteste dieser Bänder migrierte zu ungefähr 90 kD und eine dritte wurde gefunden die zu 85 kD migrierte.
B. Erhalt von wilden Typen und Mutanten E1A Proteinen
Wilde Typen und mutante Formen des E1A Proteins wurden erhalten. Die mutanten Formen waren pm928/96, dl2-36, dl38-67 und dl73-120. Die Natur der Mutationen wird fortgesetzt in 1. Die Wildtypen und mutierten Formen der E1A wurden in pGEX-2T subgeklont und in E. coli als GST-Fusionsproteine ausgedrückt. Die E1A Proteine wurden dann von den E. coli Kulturen durch Standardtechniken isoliert.
C. Bindungsanalyse für pRb2 und E1A Proteine
Eine Bindungsanalyse wurde durchgeführt um die Bindung der Wildtypen und Mutanten E1A Proteine aus Beispiel 2B mit den in vitro-übertragenen pRb2 Proteinen aus Beispiel 2A, vorgeklärt von Übertragungslösung zu testen. Das pRb2 Protein (120 kD, 90 kD und 85 kD) wurde mit Glutathion-Sepharose und GST-Glutathion-Separose Perlen in NEIN Puffer, enthaltend 1 mM DTT, 1 mM PMSF und 10 μg/ml Leupeptin bei 4°C vorgeklärt.
Zwei μg jedes E1A Proteins wurden mit vorgeklärter pRb2 eine Stunde bei 4°C inkubiert und Glutathion-Sepharose Perlen wurden hinzugefügt und für eine zusätzliche Stunde inkubiert. Proteine wurden unter Verwendung von SDS-PAGE in Übereinstimmung mit Standardprotokollen aufgelöst und ein Fuji Phosphorimage Analysesystem wurde verwendet um das Proteinsignal zu entwickeln.
Die Ergebnisse der Bindungsprobe werden fortgeführt in 2, welches SDS-PAGE ist und die Bindung an wilde E1A (Bahn 2) und an E1A Mutantenkonstrukte zeigt: dl2-36 (Bahn 3), dl38-67 (Bahn 4), dl73-120 (Bahn 5) und pm928/961 (Bahn 6). GST nicht, mit verschmolzen E1A wurde als Kontrolle auf Bahn 1 beigeschlossen. Das in vitro übertragene Produkt als Ergebnis aus einer Rabbit Reticulocyt Übertragungsreaktion mit keiner exogenen RNA wurde als Kontrolle beigefügt, welches kein Signal gab (nicht gezeigt).
Jede der drei in vitro übertragenen Hauptformen des pRb2 Proteins (120 kD, 90 kD und 80 kD) band sich an E1A. Eine Zerstörungsmutation unter Einschluss des N-Anschlussbereichs von E1A (dl2-36) beeinflusste die pRb2 Bindung nicht. E1A Bindung an pRb2 wurde nicht beeinflusst durch dl38-67 oder dl73-120 Zerstörungsmutationen, beide unter Einschluss der Übertragungsdomain 1 von E1A. Dies suggeriert dass die Bindung von pRb2 an E1A nicht in diesen Bereichen stattfindet. Jedoch wurde die Bindung fast vollständig abgeschafft, wenn ein E1A Verschmelzungsprotein mit einer Zweipunktmutation in der Übertragungsdomain 2 von E1A verwendet wurde (E1A Mutant pm928/961, bei welcher Cys durch Gly an Position 124 ersetzt war und Lys für Glu an Position 135). Deshalb wird die umwandelnde Domain 2 von E1A zur Bindung an pRb2 benötigt. Dies suggeriert das die E1A Bindungskapazität von pRb2 beteiligt ist in der Umwandlungsaktivität von E1A, wenigstens teilweise.
Zu Vergleichszwecken wurden die pRb und p107 Proteine erhalten und eine Bindungsprobe mit den Wildtypen und Mutanten E1A Proteinen erzeugt. Das pRb2 Protein zeigte ähnliche Bindungscharkteristiken an die pRb und p107 Proteine.
Da das pRb2 Protein das E1A Protein in ähnlicher Weise wie das pRb Protein bindet, ist das pRb Protein ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Identifizierung von Zellen, die mit dem Adenovirus E1A infiziert sind oder ein zugehöriges DNA Virus, welches Oncoproteine in Bezug auf das E1A Protein produziert. Aufgrund der E1A Bindungskapazität an pRb2 kann das Protein von Zellen verwaltet werden, die mit Adenovirus E1A infiziert sind, wo es als Zellenwachstumssuppressor handeln kann um die Effekte des E1A Oncoproteins umzukehren. Diese Umkehr der E1A Proteineffekte könnten die Balance des Zellwachstums in einem Retinoblastomeren Krebstumor wiederherstellen. Deshalb ist pRb2 möglicherweise nützlich als Tumorsuppressoragent, zur Behandlung von Krebsarten wie Retionblastomeren Interocularem Krebs. Weiterhin kann pRb2 nützliches Forschungswerkzeug zur Bindung und Identifizierung anderer DNA Tumor Viren Oncoproteine sein die Sequenzen bezüglich des E1A Proteins haben.
Die vorliegende Erfindung kann in anderen speziellen Ausführungsformen ohne Verlassen der essentiellen Attribute ausgeführt werden und, übereinstimmend, sollte Bezug auf die anhängenden Ansprüche genommen werden und ebenso auf die vorangegangene Beschreibung zur Darstellung des Schutzbereichs der Erfindung.
Sequenzlisten
Sequenzlisten

Claims

Ein rekombinanter DNA Vektor mit einer DNA Sequenz, die sich für ein Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 besitzt.
Ein Vektor nach Anspruch 1, wobei die DNA Sequenz eine DNA Sequenz SEQ ID NR: 1 enthält.
Ein Vektor nach Anspruch 1 oder 2, der ein pBluescript Vektor ist.
Ein Vektor nach Anspruch 3, der ATCC Nr. 75521 ist.
Im wesentlichen reine DNA, enthaltend eine DNA Sequenz die sich für ein Protein codiert welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 besitzt.
Im wesentlichen reine DNA nach Anspruch 5, wobei die DNA Sequenz die DNA Sequenz SEQ ID NR: 1 enthält.
Ein isoliertes Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, wobei das Protein nicht phosphorylisiert ist.
Eine Gastzelle oder Zellenkette, die durch einen rekombinanten DNA Vektor nach Anspruch 1 oder 2 transformiert wurde.
Eine Gastzelle oder Zellenkette nach Anspruch 8, wobei die Gastzelle prokaryotisch ist.
Eine transformierte Gastzellenkette nach Anspruch 1, die ATCC No. 69383 ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht phosphorisierten menschlichen pRb2 Protein, welches die Kultivierung einer Gastzelle enthält die einen rekombinanten DNA Vektor nach Anspruch 1 oder 2 beinhaltet.
Verwendung eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2, die bei der Herstellung eines Medikaments zum Gebrauch in der Behandlung von Krebs nicht phosphorylisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Protein die Effekte des E1A Onkoprotein umkehrt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Protein zur Wiederherstellung des Gleichgewichts im Zellenwachstum in Retinoblastoma Zelltumoren wirkt.