JP3718848B2 - 腫瘍サプレッサ蛋白質ｐｒｂ２、関連遺伝子産生物およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は、Ｅ１Ａ形質転換ドメインに結合する網膜芽細胞腫系統群の腫瘍サプレッサ蛋白質（ｐＲｂ２）に関するものである。さらに本発明は、ｐＲｂ２をコードするＤＮＡおよび関連遺伝子産生物にも関するものである。
発明の背景
多くの種類のヒト癌は現在では、細胞内における成長レギュレータの不均衡によって生ずると思われている。陰性制御の成長レギュレータの減少および／またはその失活は癌状態をもたらしうる。さらに陽性調節成長レギュレータの増加も癌状態を引き起こしうる。
最初の腫瘍サプレッサ遺伝子が同定されて以来、癌研究にて多くの努力は新たな腫瘍サプレッサ遺伝子の同定およびヒト癌におけるその関与に集中されている。多くの種類のヒト癌は、まだ同定されてない推定の腫瘍サプレッサ遺伝子における異型接合性の喪失［ラスコ等、アニュアル・レビュー・ジェネティックス、第２５巻、第２８１〜２９６頁（１９９１）］により、クヌードソンの「ツーヒット」仮説［クノードソン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第６８巻、第８２０〜８２３頁（１９７１）］にしたがって出現すると思われる。
最も研究された腫瘍サプレッサ遺伝子の１種は網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ｒｂ）であり、その遺伝子産生物（ｐＲｂ）は、細胞分裂の調節に重要な役割を演ずることが示されている。静止期の細胞においてｐＲｂは、たとえばＥ２Ｆのような転写因子との相互作用による細胞サイクルに必要とされる遺伝子の転写を抑制することにより、細胞の静止状態を維持するのに貢献する［ワグナー等、ネイチャー、第３５２巻、第１８９〜１９０頁（１９９１）；ネビンス、サイエンス、第２５８巻、第４２４〜４２９頁（１９９２）；およびヒーベルト等、ジーンス・デベロップメント、第６巻、第１７７〜１８５頁（１９９２）］。この活性の喪失は、機能的ｐＲｂを置換した後のｐＲｂ細胞における形質転換表現型の復帰により証明されるように、細胞形質転換を誘発することができる［フアング等、サイエンス、第２４２巻、第１５６３〜１５６５頁（１９８８）；ブックスタイン等、サイエンス、第２４７巻、第７１２〜７１５頁（１９９０）；およびスメギ等、セル・グロース・ディファレンス、第１巻、第２４７〜２５０頁（１９９０）］。
細胞サイクルに入った後、ｐＲｂは細胞サイクル依存性キナーゼによりホスホリル化されると思われ［リース等、ＥＭＢＯジャーナル、第１０巻、第４２７９〜４２９０頁（１９９１）；ヒュー等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１２巻、第９７１〜９８０頁（１９９２）；ヒンズ等、セル、第７０巻、第９９３〜１００６頁（１９９２）；マツシメ等、ネイチャー、第３５巻、第２９５〜３００頁（１９９２）］、これは転写因子からのその解離を可能にし、したがって細胞サイクルを介する進行に必要とされる遺伝子の発現を可能にすると思われる。注目すべきことに、ｐＲｂと細胞サイクルレギュレータ（たとえばサイクリン）および細胞サイクル依存性キナーゼとの結合はその機能に対する普遍的特性を示唆する。
しかしながら、ヒト癌におけるｐＲｂ関与は限られた数の腫瘍種類に限定され、前記仮説による普遍的機能は細胞種類−特異的に他の遺伝子産生物によっても発揮されうることを示唆する。相応に、マウスにおけるｒｂ遺伝子のノックアウトは特定細胞種類に対してのみ数日間の胚発生後に影響を及ぼす［ジャックス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第６８巻、第８２０〜８２３頁（１９９２）；リー等、ネイチャー、第３５９巻、第２８８〜２９４頁（１９９２）；クラーケ等、ネイチャー、第３５９巻、第３２８〜３３０頁（１９９２）］。
ヒトＤＮＡ腫瘍ウィルスからの数種の形質転換性蛋白質が細胞増殖を活性化させる能力は、細胞サイクルの調節に関与する細胞因子の同定につき有用な手段となっている。したがって細胞成長の陰性レギュレータは、網膜芽細胞腫遺伝子の産生物と共に生ずるので、これらウィルス蛋白質による失活の効果的標的となりうる。
アデノウィルスＥ１Ａ、ＳＶ４０ Ｔ抗原および乳頭腫ウィルスＥ７は、ｐＲｂに結合すると判明した３種のウィルス蛋白質である。この結合は、細胞サイクル遺伝子の発現に必要とされる転写因子の放出をもたらしうる［ネビンス、サイエンス、第２５８巻、第４２４〜４２９頁（１９９２）；バンダラ等、ネイチャー、第３５１巻、第４９４〜４９７頁（１９９１）］。
これら３種のウィルス蛋白質に見られるモチーフの保持は、ｐＲｂとの相互作用および複合体形成を可能にする［モラン、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．、第３巻、第６３〜７０頁（１９９３）］。アデノウィルスＥ１Ａ蛋白質の場合、このモチーフは成長活性化に必要とされる形質転換性ドメイン２に位置する。さらにｐＲｂ関連産生物ｐ１０７もこの領域で結合する［エガン等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第３９５５〜３９５９頁（１９８８）；ホワイト等、セル、第５６巻、第６７〜７５頁（１９８９）］。
さらにドメイン２は、追加Ｅ１Ａ−結合性蛋白質ｐ１３０の相互作用の部位でもある［ギオルダーノ等、オンコジーン、第６巻、第４８１〜４８５頁（１９９１）］。これは、ｐ１３０がｐＲｂおよびｐ１０７に対する構造関連性を有することを示唆するようになった［モラン、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．、第３巻、第６３〜７０頁（１９９３）］。
ｐＲｂおよびｐ１０７におけるＥ１Ａ−結合性ドメインは「ポケット領域」と称する保持領域［ケリン等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第３７６１〜３７６９頁（１９９０）；エビン等、セル、第６６巻、第１１５５〜１１６４頁（１９９１）］であって、これら蛋白質の機能にて主たる役割を演ずると思われる。このポケットは２つの領域ＡおよびＢにより構造的に形成され、これら領域はｐＲｂおよびｐ１０７で保持されると共にｐＲｂおよびｐ１０７における異なる寸法の非保持スペーサにより分離される。
ｐＲｂおよびｐ１０７の他に、Ｅ１Ａに対する抗体を用いる共免疫沈澱実験により同定された他の細胞Ｅ１Ａ−結合性蛋白質が存在する。これら細胞蛋白質は主ポリペプチドｐ３００、ｐ１３０、ｐ６０／サイクリンＡおよび数種の他の副ポリヘプチドを包含する［イー等、バイロロジー、第１４７巻、第１４２〜１５３頁（１９８５）；ハーロウ等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第６巻、第１５７９〜１５８９頁（１９８６）；ギオールダーノ等、セル、第５８巻、第９８１〜９９０頁（１９８９）；ギオルダーノ等、サイエンス、第２５３巻、第１２７１〜１２７５頁（１９９１）］。Ｎ−末端領域への結合はｐ３００に対し限定的であることが示され［エガン等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第３９５５〜３９５９頁（１９８８）；ホワイト等、セル、第５６巻、第６７〜７５頁（１９８９）；スタイン等、ジャーナル・バイロロジー、第６４巻、第４４２１〜４４２７頁（１９９０）］、ｐＲｂ２は常にこの領域に結合しなかった。Ｅ１Ａ蛋白質の両ドメイン１および２は、次の群の蛋白質のＥ１Ａ結合に必要であることが示されている：ｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ６０／サイクリンＡおよびｐ１３０［エガン等、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第３９５５〜３９５９頁（１９８８）；ホワイト等、セル、第５６巻、第６７〜７５頁（１９８９）；ギオルダーノ等、サイエンス、第２５３巻、第１２７１〜１２７５頁（１９９１）］。さらに、Ｅ１Ａ−９２８突然変異体はｐ１０７およびｐ６０／サイクリンＡに結合するが、ｐＲｂおよびｐ１３０には結合しないことが従来示されている。
ｐＲｂとたとえばＥ２Ｆのような転写因子との結合はポケット領域における相互作用によって生じ［レイショードフリ等、ジーン・ディベロップメント、第５巻、第１２００〜１２０７頁（１９９１）］、ｐ１０７もこの種の結合特性を発揮することが最近示された［カオ等、ネイチャー、第３５５巻、第１７６〜１７９頁（１９９２）］。さらにポケット領域は、ｐＲｂ蛋白質の機能の欠如が形質転換表現型の獲得に関与すると思われる数種のヒト癌にて突然変異すると判明した［ヒュー等、ＥＭＢＯジャーナル、第９巻、第１１４７〜１１５３頁（１９９０）；フアング等、（１９９０）］。
細胞成長抑制に関与しうる新規なｒｂ−関連遺伝子の同定および配列決定につきニーズが存在する。特定細胞種類にて同様に腫瘍サプレッサ活性を有するｒｂに関連する遺伝子およびその蛋白質産生物も必要とされる。
【図面の簡単な説明】
第１図は野生型および突然変異型のＥ１Ａ蛋白質の略図である。突然変異型はｐｍ９２８／９６１、ｄｌ ２−３６、ｄｌ ３８〜６７およびｄｌ ７３〜１２０である。各突然変異の性質を図示する。
第２図は野生型Ｅ１Ａ蛋白質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）蛋白質との融合作成物（レーン２）、並びにＧＳＴ蛋白質に融合したＥ１Ａ突然変異体作成物：すなわちｄｌ ２〜３６（レーン３）、ｄｌ ３８〜６７（レーン４）、ｄｌ ７３〜１２０（レーン５）およびｐｍ９２８／９６１（レーン６）に対するｐＲｂ２蛋白質の結合を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ｅ１Ａを融合してないＧＳＴ蛋白質を比較（レーン１）として示し、これはｐＲｂ２蛋白質との結合を示さない。
発明の要点
本発明は、ヒトｐＲｂ２遺伝子ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡクローン化ビークルを提供する。好適ＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１による配列である。このＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によるアミノ酸配列をコードする配列からなっている。
他の実施形態において本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によるアミノ酸配列を主として有する蛋白質を提供する。好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応する蛋白質はホスホリル化されない。
他の実施形態において本発明は上記クローン化ビークルのＤＮＡにより形質転換された宿主細胞ラインを提供し、この宿主細胞ラインはクローン化ビークルからＤＮＡを発現して蛋白質を産生させる。好ましくは、このＤＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１による配列を有し、産生された蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２による配列を有する。
発明の詳細な説明
ｐＲｂ２蛋白質は、従来まだ配列決定されずかつ特性化されてない腫瘍サプレッサ蛋白質のｐＲｂ系列群の要員である。この蛋白質は、ｐＲｂおよびｐ１０７と同様にアデノウィルスＥ１Ａ蛋白質に結合するのでｐＲｂ２と命名された。したがって、ｐＲｂ２をコードするｃＤＮＡ配列はｐＲｂ２遺伝子と命名された。ｒｂ遺伝子のドメイン１および２から得られたプローブを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、次のようにｐＲｂ２ ｃＤＮＡ配列を同定した。
合成の退化（変性）オリゴヌクレオチドを、ｐＲｂおよびｐ１０７におけるスペーサにフランキングする保持アミノ酸配列に基づいて命名した。これらオリゴヌクレオチドをプライマーＡおよびプライマーＢと称し、ｐＲｂ２ ｃＤＮＡ配列を分離すると共にクローン化させるＰＣＲプライマーとして使用した。
プライマーＡは、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をコードする１８個のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。プライマーＡの５′末端も９個のヌクレオチドを含有してＢａｍＨＩ制限部位を形成する。プライマーＢは、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードする１８個のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。プライマーＢの５′末端も９個のヌクレオチドを含有してＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を形成する。
１８量体プライマーＡおよびＢのそれぞれはｐＲｂおよびｐ１０７のポケット領域における保持部分に対応する。２個の制限部位（プライマーＡについてはＢａｍＨＩおよびプライマーＢについてはＨｉｎｄＩＩＩ）を用いて、増幅ＰＣＲ断片を市販入手しうるベクター（ｐＢｌｕｅスクリプト、ストラタジーン社、ラ・ヨラ、ＣＡ）に便利にサブクローンさせた。
ＰＣＲ産生物を、ヒト２９３およびＨｅＬａ細胞からｃＤＮＡ保存物（ライブラリー）をスクリーニングするためのプローブとして使用した。このスクリーニングから、数種の陽性クローンを同定した。これらクローンを配列決定すると共に、全長ｃＤＮＡを含有するクローンにつき分析した。
ＨｅＬａ ｃＤＮＡクローンの１種は、コザック開始配列［コザック、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１９６巻、第９４７〜９５０頁（１９８７）］に適合しうる推定開始コドンを含有した。このクローンは、３，２４９塩基対下流停止コドンで終端する独特の読取枠を示した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１参照）。完全配列は、推定開始部位を含まない読取枠の上流５５塩基対およびポリＡテールで終端する３′非コード化領域を含む。この読取枠は約１２０ｋＤの推定分子量を有する１，０８２個のアミノ酸のポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードした。このｃＤＮＡクローンをｒｂ２と称し、したがってコード化蛋白質をｐＲｂ２と命名した。
蛋白質ｐＲｂ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）はｐＲｂおよびｐ１０７蛋白質の配列と比較してｐ１０７に対し５３％の高レベルの同一性およびｐＲｂ２に対し３２％の同一性を示す。これは、ｐ１０７に対するｐＲｂ２の一層近い関係を示唆する。これら３種の蛋白質におけるアミノ酸配列の部分比較は、ポケット領域がｐＲｂ２中に主としてドメインＡおよびＢのレベルで明かに保持されることを示す。これは、ｐＲｂ２がｐＲｂおよびｐ１０７と同様な性質、たとえばポケット領域を介して生ずることが知られた細胞サイクル関連の蛋白複合体の形成を示唆する。これは、ｐＲｂ２が細胞サイクルのメカニズムに関与することを示唆する。さらに、ｐＲｂ２とｐ１０７との間のＣおよびＮ−末端部分に見られる高い同一性は、ｐＲｂ２およびｐ１０７をｐＲｂから区別させうるｐ１０７およびｐＲｂ２の機能における前記領域の役割を示唆する。
ｐＲｂ２ ｃＤＮＡクローンを、線状化ｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２に対するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼキャッピング反応によりインビトロでＲＮＡセグメントに転写させた。得られた転写生成物（ＲＮＡセグメント）をフェノール／クロロホルム溶液で抽出すると共にエタノール溶液で沈澱させた。
転写生成物を、ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、バイオテク社、マジソン、ＷＩ）および放射性標識としてのＳ³⁵−メチオニンを用いて蛋白質中へインビトロ翻訳するための基質として使用した［ペルハム等、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第６７巻、第２４８〜２５６頁（１９７６）］。数種の切形型蛋白質を産生させた。最大ｐＲｂ２蛋白質型は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１２０ｋＤまで移動した。最も顕著なバンドは約９０ｋＤまで移動した蛋白質型に相当し、第３の蛋白質型は８５ｋＤまで移動することが判明した。
分離の後、１２０ｋＤのｐＲｂ２蛋白質、並びにその９０ｋＤおよび８５ｋＤ切形型をＥ１Ａ蛋白質結合特性につき試験した。Ｅ１Ａ結合結果を、ｐＲｂおよびｐ１０７蛋白質のＥ１Ａ結合特性と比較した。ｐＲｂおよびｐ１０７の両蛋白質は、その各ポケット領域を介しアデノウィルスＥ１Ａ蛋白質に結合する。ｐＲｂ２蛋白質により示されるＥ１Ａ蛋白質結合は、ｐＲｂ２蛋白質が細胞分裂の調節に重要な役割を有することを示す。ｐＲｂ２のＥ１Ａ結合能力を次のように決定した。
野生型および突然変異型のＥ１Ａ蛋白質が得られた。突然変異の性質を第１図に示す。結合分析を行って、翻訳溶液が予め除去されたインビトロ翻訳ｐＲｂ２蛋白質（１２０ｋＤおよび切形型９０ｋＤおよび８５ｋＤ蛋白質）に対する野生型および突然変異型Ｅ１Ａ蛋白質の結合につき試験した。これら３種のインビトロ翻訳された主型ｐＲｂ２蛋白質のそれぞれはＥ１Ａに結合した。
Ｅ１ＡのＮ−末端部分を含むＥ１Ａ欠失突然変異（ｄｌ ２〜３６）はＥ１Ａに対するｐＲｂ２の結合に影響を与えなかった。ｐＲｂ２の結合は、Ｅ１Ａの形質転換性ドメイン（Ｅ１Ａ突然変異体ｄｌ ３８〜６７およびｄｌ ７３〜１２０）を含む欠失突然変異によっても影響されなかった。これは、Ｅ１Ａに対するｐＲｂ２の結合がＥ１Ａのこれら領域を介し生じないことを示唆する。しかしながら、ｐＲｂ２蛋白質が結合する能力は、Ｅ１Ａの形質転換性ドメイン２における二重点突然変異（ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するＥ１Ａ突然変異蛋白質（Ｃｙｓが位置１２４におけるＧｌｙにつき置換され、かつＬｙｓが位置１３５にてＧｌｕにつき置換されたＥ１Ａ突然変異体ｐｍ９２８／９６１）を使用した場合には、殆ど完全に排除された。したがって、ｐＲｂ２に結合するには、Ｅ１Ａの形質転換性ドメイン２が必要とされる。これは、ｐＲｂ２のＥ１Ａ−結合能力が少なくとも部分的にＥ１Ａの形質転換活性に関与することを示唆する。
ｐＲｂ２蛋白質は分子量においてｐ１３０蛋白質に類似すると共にこれら両者はＥ１Ａ野生型および突然変異体の蛋白質に対し類似の結合特性を有するが、これら２種の蛋白質は同一でない。ｐ１３０蛋白質はＳｅｒおよびＴｈｒ残基にてホスホリル化されるのに対し、ｐＲｂはホスホリル化されない。さらに、ｐ１３０は２種以上のホスホリル化型で存在する。
ｐＲｂ２ ｃＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２と称するクローン化ベクターを１９９３年８月１１日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤに寄託し、受託番号７５５２１が付与された。
ｐＲｂ２ ｃＤＮＡを含有するプラスミドを含んだイー・コリｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２と称するイー・コリ細菌株を１９９３年８月１１日付けでＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤに寄託し、受託番号６９３８３が付与された。
遺伝子工学の分野における当業者には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列または本発明のｐＲｂ２蛋白質をコードする関連配列を使用して、微生物過程によりｐＲｂ２蛋白質を産生させることが周知されている。ｐＲｂ２を産生させるためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列の使用は、本発明によるｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２クローン化ベクターを用いることにより当業者に一層容易となる。
ｐＲｂ２蛋白質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに融合させると共に宿主（すなわち真核性（酵母もしくは哺乳動物細胞）または原核性（細菌細胞））への形質転換もしくはトランスフェクトは、他の周知の蛋白質、たとえばインシュリン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン等を産生させる際に使用される標準的方法である。その同様な手法または明らかな改変を用いて本発明に相当する微生物手段または哺乳動物組織培養技術によりｐＲｂ２蛋白質を作成することもできる。
ｐＲｂ２蛋白質をコードする核酸分子を、組換ｐＲｂ２蛋白質を産生させるための標準的組換ＤＮＡ技術に使用するため公知のベクターに挿入することができる。標準的組換ＤＮＡ技術はサムブルック等編、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マュニアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（１９８９）およびアウスイーベル等、カレント・プロトコールス・イン・モレキュラ・バイオロジー、Ｊ．ウィリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、ＮＹ（１９９１）に記載された技術を包含する。ベクターは円形もしくは非円形とすることができる。宿主は原核性でも真核性でもよい。好適な原核性宿主はイー・コリを包含する。好適な真核性宿主は酵母、昆虫および哺乳動物細胞を包含する。好適な哺乳動物細胞は霊長類細胞、たとえばサル ウィルスにより形質転換されたサル細胞（たとえばＣＯＳ細胞）、ヒト細胞および支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。
当業者は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示したｃＤＮＡ断片がｐＲｂ２をコードする唯一のＤＮＡ断片であるという事実を了解するであろう。ｐＲｂ２をコードする実質的な類似性を持った他の均等なＤＮＡセグメントも直ちに具体化されよう。さらに本発明は、この種の均等ＤＮＡ配列をも包含する。
さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における均等アミノ酸の置換もｐＲｂ２蛋白質活性に影響を与えないと思われる。これらアミノ酸置換も当業者により具体化されよう。この種の均等アミノ酸配列も本発明に包含される。
以下、限定はしないが実施例により本発明を例示する。
実施例
実施例１：ｐＲｂ２ ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の取得
Ａ．ＰＣＲプライマーの合成
プライマーＡおよびＢを標準的オリゴヌクレオチド合成技術により合成し、精製した。
プライマーＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によるポリペプチド配列をコードする１８個のヌクレオチドを含有した。５′末端は９個の追加ヌクレオチドを有して、ＢａｍＨＩ制限部位を形成した。プライマーＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４によるポリペプチド配列をコードする１８個のヌクレオチドを含有した。５′末端は９個の追加ヌクレオチドを有し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を形成した。
Ｂ．ヒト２９３ ｃＤＮＡ保存物のＰＣＲ増幅
λ−ＺＡＰＩＩ ｃＤＮＡ保存物を、標準技術を用いてヒト２９３細胞からのＲＮＡの逆転写によって得た。ｃＤＮＡ保存物を上記実施例１ＡからのプライマーＡおよびＢによりＰＣＲを介して増幅させた。ＰＣＲは、ジェネアンプ（登録商標）をキット［パーキン・エルマー・シータス社、ノーウォーク、ＣＮ）を用いて製作業者の指針にしたがい行った。要するに、９４℃における１分間の変性と３７℃における１分間のアニールと６８℃における２分間の延長とを含む３０サイクルを行った後、１５分間の延長を行った。この結果、ｐＲｂおよびｐ１０７セグメントの他に、１ｋｂ断片のＰＣＲ増分が生じた。
Ｃ．１ｋｂ断片のサブクローン化およびヌクレオチド配列決定
増幅された１ｋｂ断片をｐＢｌｕｅスクリプト ベクター（ストラタジーン）にサブクローン化させた。サブクローン化の後、ヌクレオチド配列決定をシクエナーゼキット（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルス社）のジデオキシ法により行った。１ｋｂ断片のヌクレオチド配列はｐＲｂおよびｐ１０７の各ｃＤＮＡに対し或る程度のホモロジーを示した。
Ｄ．２９３およびＨｅＬａ細胞からのｃＤＮＡ保存物の検定
１ｋｂ断片を、追加ｃＤＮＡ保存物をスクリーニングするためのプローブとして用いた。それぞれヒト２９３およびＨｅＬａ細胞（ストラトジーン）からのλ−ＺＡＰＩＩ ｃＤＮＡ保存物を、ランダム プライマー法（ベーリンガー・マンハイム社）によりα−Ｐ³²−ＣＴＰで標識された１ｋｂ断片を用いてスクリーニングした。要するに、λ−ＺＡＰファージを大腸菌ＢＢ４菌株の細菌に吸着させると共に寒天培地に塗沫した。ニトロセルロースフィルタを高厳密プロトコールにてＰＣＲプローブにハイブリッド化させ、このプロトコールは予備ハイブリッド化混合物：すなわち５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト溶液、１５０μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミドおよび２％ＳＤＳを含んだ。ハイブリッド化混合物はこの予備ハイブリッド化混合物に１０⁶ｃｐｍ／ｍＬの１ｋｂ ＰＣＲプローブを添加した。さらに、それぞれ４２℃にて２０分間にわたり０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。
Ｅ．検定からの陽性クローンの分析
実施例１Ｄの検定過程から数種の陽性クローンを見出した。インビボ切除（ストラタジーン）を数種の陽性λ−ＺＡＰクローンにつき行った。ｃＤＮＡクローンを含有するｐＢｌｕｅスクリプト ベクターが得られた。これらｃＤＮＡクローンを再現させると共に、各ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列決定を実施例１Ｃに上記したように行った。この配列決定の結果を、１ｋｂ断片を含む全長ｃＤＮＡにつき解析した。
ＨｅＬａ ｃＤＮＡクローンの１種は、コザック開始配列に適合しうる推定開始コドンを含有した。このクローンは、３，２４９塩基対下流停止コドンで終端する独特の読取枠を示した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１参照）。完全配列は推定開始部位を含まない読取枠の上流の５５塩基対およびポリＡテールで終端する３′非コード化領域を含んだ。この読取枠は、約１２０ｋＤの推定分子量を有する１，０８２アミノ酸のポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードした。このｃＤＮＡクローンをｒｂ２と命名し、したがってコードされた蛋白質をｐＲｂ２と命名した。ｐＲｂ２遺伝子でクローン化させたｐＢｌｕｅスクリプト ベクターをｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２と命名した。
蛋白質ｐＲｂ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、これは対応のｃＤＮＡ配列から得られる）は、ｐＲｂおよびｐ１０７蛋白質配列と比較して、ｐ１０７に対し５３％およびｐＲｂに対し３２％の高レベルの同一性を示した。これは、ｐ１０７に対するｐＲｂ２の一層近い関係を示唆する。これら３種の蛋白質配列の部分比較は、ポケット領域がｐＲｂ２に主としてドメインＡおよびＢのレベルで明かに保持されることを示す。
実施例２：インビトロ翻訳ｐＲｂ２のＥ１Ａ結合
Ａ．ｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２の転写および翻訳
実施例１ＥのｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２ ｃＤＮＡクローンを、線状化ｐＢｌｕｅスクリプト−ｐＲｂ２に対するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ キャッピング反応によりインビトロでＲＮＡセグメントに転写させた。得られた転写生成物（ＲＮＡセグメント）をフェノール／クロロホルム溶液で注出すると共に、エタノール溶液で沈澱させた。
転写生成物ＲＮＡ断片を、ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、バイオテク社、マジソン、ＷＩ）および放射性標識としてのＳ³⁵−メチオニンを用いて、蛋白質中にインビトロ翻訳するための基質として用いた［ペルハム等、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第６７巻、第２４８〜２５６頁（１９７６）］。数種の切形型の蛋白質を産生させた。最大のものは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１２０ｋＤまで移動した。これらバンドの最も顕著なものは約９０ｋＤまで移動し、第３のものは８５ｋＤまで移動することが判明した。
Ｂ．野生型および突然変異型Ｅ１Ａ蛋白質の取得
野生型および突然変異型のＥ１Ａ蛋白質を得た。突然変異型はｐｍ９２８／９６１、ｄｌ ２〜３６、ｄｌ ３８〜６７およびｄｌ ７３〜１２０であった。突然変異の性質を第１図に示す。野生型および突然変異型のＥ１ＡをｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローン化させると共に、ＧＳＴ−融合蛋白質としてイー・コリで発現させた。Ｅ１Ａ蛋白質を次いで標準技術によりイー・コリ培養物から分離した。
Ｃ．ｐＲｂ２およびＥ１Ａ蛋白質の結合分析
結合分析を行って、実施例２Ｂの野生型および突然変異型Ｅ１Ａ蛋白質と翻訳溶液が予備除去された実施例２Ａのインビトロ翻訳ｐＲｂ２蛋白質との結合につき試験した。ｐＲｂ２蛋白質（１２０ｋＤ、９０ｋＤおよび８５ｋＤ）をグルタチオン−セファロースおよびＧＳＴ−グルタチオン−セファロースの各ビーズにより、１ｍＭのＤＴＴと１ｍＭのＰＭＳＦと１０μｇ／ｍＬのロイペプチンとを含有するＮＥＴＮ緩衝液にて４℃で予備清澄させた。
２μｇの各Ｅ１Ａ蛋白質を予備清澄されたｐＲｂ２と共に４℃にて１時間培養し、グルタチオン−セファロースビーズを添加し、次いでさらに１時間培養した。これら蛋白質を標準プロトコールにしたがいＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割し、フジ写真画像解析装置を用いて蛋白質シグナルを発生させた。
結合分析の結果を第２図に示し、これは野生型Ｅ１Ａ（レーン２）およびＥ１Ａ突然変異体作成物：すなわちｄｌ ２〜３６（レーン３）、ｄｌ ３８〜６７（レーン４）、ｄｌ ７３〜１２０（レーン５）およびｐｍ９２８／９６１（レーン６）に対する結合を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｅ１Ａが融合してないＧＳＴを比較（レーン１）として含ませた。外生ＲＮＡを持たないウサギ網状赤血球翻訳反応から生じたインビトロ翻訳生成物をも比較として含ませ、これは何らのシグナルを与えなかった（図示せず）。
主たる３種のインビトロ翻訳されたｐＲｂ２蛋白質のそれぞれ（１２０ｋＤ、９０ｋＤおよび８０ｋＤ）はＥ１Ａに結合した。Ｅ１ＡのＮ−末端部分を含む欠失突然変異（ｄｌ ２〜３６）はｐＲｂ２の結合に対し影響を与えなかった。ｐＲｂ２に対するＥ１Ａ結合はｄｌ ３８〜６７またはｄｌ ７３〜１２０欠失突然変異により影響を受けず、これら両者はＥ１Ａの形質転換性ドメイン１を含む。これは、Ｅ１Ａに対するｐＲｂ２の結合がこれら領域では生じないことを示唆する。しかしながら結合は、Ｅ１Ａの形質転換性ドメイン２における二重点突然変異を有するＥ１Ａ融合蛋白質（Ｅ１Ａ突然変異体ｐｍ９２８／９６１、ここでＣｙｓは位置１２４にてＧｌｙにつき置換され、Ｌｙｓは位置１３５にてＧｌｕにつき置換された）を用いた場合には、ほぼ完全に排除された。したがって、ｐＲｂ２に対する結合にはＥ１Ａの形質転換性ドメイン２が必要とされる。これは、ｐＲｂ２のＥ１Ａ−結合能力が少なくとも部分的にＥ１Ａの形質転換活性に関与することを示唆する。
比較目的で、ｐＲｂおよびｐ１０７蛋白質を得ると共に、野生型および突然変異型Ｅ１Ａ蛋白質に対する結合分析を行った。ｐＲｂ２蛋白質は、ｐＲｂおよびｐ１０７蛋白質に類似する結合特性を示した。
ｐＲｂ２蛋白質はｐＲｂ蛋白質と同様にＥ１Ａ蛋白質を結合するので、このｐＲｂ２蛋白質はアデノウィルスＥ１ＡまたはＥ１Ａ蛋白質に関連するオンコプロテインを産生する関連ＤＮＡウィルスで感染された細胞を同定するための有用な診断手段となる。ｐＲｂ２のＥ１Ａ結合能力により、この蛋白質はアデノウィルスＥ１Ａで感染された細胞に投与することができ、Ｅ１Ａオンコ蛋白質の作用を逆転させる細胞成長サプレッサとして作用することができる。Ｅ１Ａ蛋白質作用のこの逆転は、網膜芽細胞腫の癌腫瘍における細胞成長の均衡を回復させる。したがって、ｐＲｂ２はたとえば網膜芽細胞腫の両眼間癌のような種々の癌を処置するため腫瘍サプレッサ剤として有用であると思われる。さらにｐＲｂ２はＥ１Ａ蛋白質に関連した配列を有する他のＤＮＡ腫瘍ウィルスオンコ蛋白質を結合および同定するための有用な研究手段にもなりうる。
合成、作成および分析の各手法に関し引用した刊行物を全て参考のためここに引用する。
以上、本発明を実施例につき詳細に説明したが、本発明の思想および範囲を逸脱することなく各種の改変をなし得ることが当業者には了解されよう。
配列リスト
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：アントニオ ジオルダーノ
（ｉｉ）発明の名称：腫瘍サプレッサ蛋白質ＰＲＢ２、関連遺伝子産生物およびそれをコードするＤＮＡ
（ｉｉｉ）配列の数：４
（ｉｖ）通信宛先：
（Ａ）宛名：サイデル、ゴンダ、ラボンニャ アンド モナコ、Ｐ．Ｃ．
（Ｂ）町名：ツー ペン センター、スウート１８００
（Ｃ）市名：フィラデルフィア
（Ｄ）州名：ペンシルバニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：１９１０２
（ｖ）コンピュータ解読フォーム：
（Ａ）メディア種類：ディスケット、３．５０インチ、７２０Ｋｂ
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＳ／２
（Ｃ）作動システム：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエアー：ワードパーフェクト５．１
（ｖｉ）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９４年８月１２日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ ０８／１０６，４９３
（Ｂ）出願日：１９９３年８月１２日
（ｖｉｉｉ）代理人の情報：
（Ａ）氏名：ダニエル エイ モナコ
（Ｂ）登録番号：３０，４８０
（Ｃ）参照番号：６０５６−１８８ ＰＣ
（ｉｘ）電信情報：
（Ａ）電話：（２１５）５６８−８３８３
（Ｂ）テレファックス：（２１５）５６８−５５４９
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３２４９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：

（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１０８２アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：

（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：

（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：

Claims (5)

1. アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする分離及び精製されたＤＮＡ。
2. ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むことを特徴とする請求項１のＤＮＡ。
3. 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター。
4. 請求項３の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
5. 請求項４の宿主細胞により生産される分離された蛋白質。

Images