【発明の詳細な説明】
チロシンホスファターゼ関連タンパク質
本発明は、チロシンホスファターゼ関連タンパク質、かかるタンパク質をコー
ドするＤＮＡおよびかかるタンパク質を生産する方法に関する。さらに、本発明
は、ＤＮＡ、タンパク質および該タンパク質に対する抗体の使用に関する。
チロシンキナーゼおよびチロシンホスファターゼは、逆の効果を有する酵素で
ある。チロシンキナーゼは、タンパク質中のある一定のチロシン残基のリン酸化
に影響を及ぼし、一方、チロシンホスファターゼは、このリン酸化を再度戻す。
両方の酵素はシグナル伝達、細胞成長および細胞分化の制御に重要な役割を果た
す。
細胞分化において生じる妨害に基づく疾患が知られている。これらの疾患の１
つは、筋細管筋障害である。それは、変性した筋肉細胞に伴なうＸ染色体関連疾
患である。この疾患は、一般的な筋肉虚弱において徴候があらわれ、特に自発的
な進展がほとんどない。同様に、新生児の呼吸を強く制限する。これは、しばし
ば早産死を導く。しかしながら、筋細管筋障害の場合における妨害された細胞分
化の原因は知られていない。
したがって、本発明の目的は、特に筋細管筋障害の場合における細胞分化妨害
の原因を調べること、および任意にそれを治療することが可能である生成物を提
供することにある。
本発明によれば、これは請求項に規定された主題により達成される。
したがって、本発明の主題は、図１のアミノ酸配列または１若しくは複数個の
アミノ酸が該アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有するタンパク質である、
チロシンホスファターゼ関連タンパク質に関する。
本発明は、公知のチロシンホスファターゼとホモロジーを有し、さらにチロシ
ンホスファターゼ活性を有するが、通常の条件下におけるハイブリダイゼーショ
ンによるＤＮＡレベルで公知のチロシンホスファターゼとは異なるタンパク質が
、動物、具体的には哺乳類、さらに具体的にはヒトに存在するという出願人の知
見に基づく。かかるタンパク質は、図１のアミノ酸配列または１若しくは複数個
のアミノ酸が該アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。本出願人は、さら
に該タンパク質が、細胞分化に重要であることを発見した。本出願人は、その短
縮された形および成熟した形、すなわちチロシンホスファターゼ活性なしまたは
制限されたチロシンホスファターゼ活性のみを有するそれぞれにおいて、本タン
パク質が、細胞、具体的には筋肉細胞の分化を妨害すること、さらに具体的には
筋細管筋障害の形成を導くことを見出した。
前記タンパク質は、本発明において「チロシン関連タンパク質」（ＴＶＰ）と
いう。
本発明のさらなる主題は、（ＴＶＰ）をコードする核酸に関する。それは、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡであってもよい。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡであってもｃ
ＤＮＡであってもよい。下記：
（ａ）図１のＤＮＡまたは１若しくは複数個の塩基対が該ＤＮＡと異なるＤＮＡ
、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｃ）縮重した遺伝子コードを介して、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連する
ＤＮＡ
を含有するＤＮＡが好ましい。
「ハイブリダイズするＤＮＡ」の語句は、通常の条件下、具体的には、ＤＮＡ
の融解点より２０℃以下の条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ
に関する。
図１のＤＮＡは、１９９６年３月４日、ＤＳＭ（ドイチェ ザンムルンク フ
ォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルトゥレン（Ｄｅｕｔｓｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ ｚｅｌ
ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）〔ジャーマンタイプ コレクション オブ マイクロオル
ガニズム アンド セル カルチャーズ（Ｇｅｒｍａｎ−ｔｙｐｅ ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ）〕）にＤＳＭ１０５５８のもと、ｈｐ６として寄託された。
本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡの形で下記のように記載される。本発明に該当す
る全てのＤＮＡを説明する。
本発明のｃＤＮＡの生産のために、ヒトゲノムのＸｑ２８領域を含有するコス
ミドライブラリーを基本として使用することが好ましい。かかるコスミドライブ
ラリーは、例えば、細胞ハイブリッドＱＩＺ（ウォーレン（Ｗａｒｒｅｎ），Ｓ
．Ｔ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（１９
９０），３８５６−３８６０を参照のこと）から生産したＸｑ２８特異的コスミ
ドライブラリー（キオシス（Ｋｉｏｓｃｈｉｓ），Ｐ．ら．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．５８，（１９９１），２０７０）などである。その
コスミドクローンＱｃ８Ｄ１１、Ｑｃ３Ｆ１２およびＱｃ１２Ｇ１１（キオシス
（Ｋｉｏｓｃｈｉｓ），Ｐ．ら．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ
．５８，（１９９１），２０７０；キオシュス，Ｐ．ら．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
３３，（１９９６）、印刷中を参照のこと）を使用し、ｃＤＮＡ選別に供して、
ｃＤＮＡ断片７９ｇ１Ｐ５を得た（コーン（Ｋｏｒｎ），Ｂ．ら．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．４（１９９２），２３５−２４２を参照のこと）。それはヒト胎盤の
ｃＤＮＡライブラリー（例えば、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ），カ
タログＮｏ．９３６２０３など）をハイブリダイズするために使用される。本発
明のｃＤＮＡを得る。
本発明のｃＤＮＡは、ベクターおよび発現ベクターのそれぞれに存在してもよ
い。当業者は、その例に精通している。大腸菌用の発現ベクターの場合、例えば
、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂ、ｐＱＥ−８など
であり、後者が好ましい。酵母における発現用として、例えば、ｐＹ１００、Ｙ
ｃｐａｄ１が挙げられ、一方、動物細胞における発現用として、例えば、ｐＫＣ
Ｒ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などが示される。バキュロウイルス発
現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細胞における発現に特に好適であ
る。
当業者は、発現ベクター中に存在する本発明のｃＤＮＡを発現するための好適
な細胞に精通している。かかる細胞の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＨＢ１０１、Ｄ
Ｈ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１、ＳＧ１３００９などが
含まれ、後者が好ましく、酵母株サッカロミセス セレビシエおよび動物細胞Ｌ
、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓ
ｆ９などが含まれる。
当業者は、本発明のＤＮＡを発現ベクターに挿入すべき方法を熟知している。
また、当業者は、本発明のｃＤＮＡが融合タンパク質の形で発現できるように、
該ＤＮＡを他のタンパク質およびペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡと組み
合わせて挿入することができるという事実に精通している。
さらに、当業者は、形質転換細胞およびトランスフェクト細胞のそれぞれの培
養の条件を熟知している。さらに、当業者は、本発明のｃＤＮＡにより発現され
るタンパク質を単離し、生成する方法に精通している。したがって、融合タンパ
ク質であってもよい、かかるタンパク質も、本発明の主題である。
本発明のさらなる主題は、前記タンパク質および融合タンパク質のそれぞれに
対する抗体に関する。かかる抗体は慣用の方法により生産できる。それは、ポリ
クローナルおよびモノクローナルのそれぞれであってもよい。その生産のために
、動物−具体的には、ポリクローナル抗体用としてウサギまたはニワトリであり
、モノクローナル抗体用としてマウス−を前記（融合）タンパク質でまたはその
断片で免疫することが好ましい。さらに動物の「ブースター」は、同じ（融合）
タンパク質でまたはその断片で実施されうる。ついで、ポリクローナル抗体を動
物血清および鶏卵の卵黄のそれぞれから得てもよい。モノクローナル抗体の生産
のために、動物脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。
本発明は、具体的には筋肉細胞の場合、さらに具体的には筋細管筋障害の場合
において、細胞分化妨害の原因を調べることが可能である。本発明の核酸、特に
ＤＮＡ、およびそれから派生したプライマーにより、哺乳類、特にヒトにおいて
、それらが前記センスの範囲内で、短くされた（ＴＶＰ）および変異した（ＴＶ
Ｐ）のそれぞれをコードする遺伝子を含むおよび／または発現するかどうかを決
定することができる。この目的のために、当業者は逆転写、ＰＣＲ反応、ハイブ
リダイゼーション、シークエンスなどの慣用の方法を行なうであろう。前記核酸
、特にＤＮＡ、および／またはそれから派生したプライマーならびに担体および
慣用の補助剤を含むキットも本発明により提供される。
さらに、本発明は、細胞分化妨害、具体的には筋肉細胞の場合、さらに具体的
には筋細管筋障害の場合における治療処置を講ずるのに適する。本発明の（ＴＶ
Ｐ）は哺乳類、特にヒトに挿入することができる。この目的のために、（ＴＶＰ
）を、例えば、トランスフェリン、またはＢＳＡなどの各身体に異質とは見なさ
れないタンパク質と結合させることが好ましい。本発明の核酸、特にＤＮＡを哺
乳類、特にヒトに挿入し発現することもできる。この目的のために、組織特異的
プロモーター、特に筋肉特異的なプロモーターにより本発明の核酸の発現を制御
することが好ましい。（ＴＶＰ）の発現は本発明の抗体により制御され調節され
る。
したがって、本発明は、具体的には筋肉細胞の場合、さらに具体的には筋細管
筋障害の場合における細胞分化の妨害の診断的および治療的検出に大きな貢献を
示す。これに関して、診断的な検出は、出生後だけでなく、出生前にすでに行な
うことができる。図面の簡単な説明
図１は、本発明の（ＴＶＰ）の塩基配列およびそれから派生したアミノ酸配列
を示す。
本発明を下記の実施例により説明する。
実施例１： 本発明の（ＴＶＰ）の生産および精製
本発明の（ＴＶＰ）の生産のために、図１のＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣ
Ｒ法を行なった。下記プライマー対を使用した：
ＭＴＭ−Ｆ：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣ
ＴＧＧＣＡＡＣ−３’および
ＭＴＭ−Ｒ：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＣ
ＡＴＧＧＧＧ−３’
ＰＣＲバッチおよびＰＣＲ条件は下記の如くであった：ＰＣＲバッチ
鋳型ＤＮＡ（図１） ：１μｌ＝１ｎｇ
Ｐｆｕポリメラーゼ １０×緩衝液 ：１０μｌ＝１×
ＤＭＳＯ ：１０μｌ＝１０％
ｄＮＴＰ’ｓ ：１μｌ=各２００μＭ
オリゴヌクレオチド、各１．５μｌ ：３μｌ＝各１５０ｎｇ
Ｈ2Ｏ 再蒸留したもの ：９９μＬとなるように添加ＰＣＲ条件
９２℃、５分
−１μｌ Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）＝２．５ユニットの添加
− パラフィンの添加ＰＣＲ
９２℃ １分
５８℃ １分 １サイクル
７２℃ １０分
９２℃ １分
５８℃ １分 ３９サイクル
７２℃ ２分
７２℃ １０分 １サイクル
増幅したＤＮＡをそれぞれＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩで切断した発現ベ
クターｐＱＥ８（ダイアジェンカンパニー（Ｄｉａｇｅｎ ｃｏｍｐａｎｙ））
に挿入した。発現プラスミドｐＱ／ＴＶＰを得た。かかるプラスミドは６個のヒ
スチジン残基（Ｎ末端部分）および本発明の図１の（ＴＶＰ）（Ｃ末端部分）を
含有する融合タンパク質をコードする。ｐＱ／ＴＶＰをＥ．ｃｏｌｉ ＳＧ１３
００９（ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ），Ｓ．ら．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１４８，（１９８１），２６５−２７３を参照のこと）を形質転換するた
めに使用した。該細菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを有するＬＢ培地で培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細菌の溶解を６Ｍグアニジン
塩酸塩の添加により達成した。その後、８Ｍ尿素の存在下、クロマトグラフィー
試薬の製造者（ダイアジェンカンパニー）の説明書に従って、溶解物のクロマト
グラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を行なった。結合した融合タンパク質をｐＨ３
．５の緩衝液で溶出した。その中和後、融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルーで染色した（トーマス（Ｔｈｏ
ｍａｓ），Ｊ．Ｏ．およびコーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ），Ｒ．Ｄ．，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５），７０９−７３３を参照のこと）。
本発明の（融合）タンパク質を高純度の形で生産することができることを示し
た。
実施例２： 本発明の抗体の生産および検出
本発明の実施例１の融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動に供した。４Ｍ酢酸ナトリウムでゲルを染色後、約２０５ｋＤバンドをゲ
ルから切り出し、リン酸緩衝化慣用塩溶液中でインキュベートした。ゲル小片を
沈降させた後、上清のタンパク質濃度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
、ついでクマシーブルー染色により決定した。下記のように、動物をゲル精製し
た融合タンパク質で免疫した：ウサギにおけるポリクローナル抗体の免疫化プロトコール
０．７ｍｌＰＢＳ中３５μｇのゲル精製タンパク質ならびに０．７ｍｌの完全
フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントそれぞれを免疫化
毎に使用した：
０ 日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント）
１４日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）
２８日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ）
５６日目：４回目の免疫化（ｉｃＦＡ）
８０日目：採血して死亡
ウサギ血清をイムノブロットで試験した。この目的のために、本発明の実施例
１の融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセ
ルロースフィルターに転写した（キーセ−アンダーセン（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅ
ｒｓｅｎ），Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．１０（
１９８４），２０３−２０９）。ウェスタンブロット解析をボック（Ｂｏｃｋ）
，Ｃ．−Ｔ．ら．，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ８，（１９９４），２１５−２２
９に記載のように行なった。この目的のために、該ニトロセルロースフィルター
を３７℃で１時間、１次抗体とインキュベートした。この抗体はウサギ血清（Ｐ
ＢＳ中１：１００００）であった。ＰＢＳを用いた数回の洗浄工程の後、該ニト
ロセルロースフィルターを２次抗体とインキュベートした。この抗体は、ＰＢＳ
中アルカリホスファターゼ共役モノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体〔ダイア
ノーバカンパニー（Ｄｉａｎｏｖａ ｃｏｍｐａｎｙ）〕（１：５０００）であ
った。３７℃で３０分間のインキュベーション後、ＰＢＳを用いた数回の洗浄工
程を行ない、つづいてバンドが可視化されるまで室温で展開溶液（３６μＭ５’
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、４００μＭニトロブルーテトラ
ゾリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣ１
、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）でアルカリホスファターゼ検出反応を行なった。
本発明のポリクローナル抗体を生産することができることを示した。ニワトリにおけるポリクローナル抗体の免疫化プロトコール
０．８ｍｌ ＰＢＳ中４０μｇのゲル精製した融合タンパク質ならびに０．８
ｍｌの完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントそれぞ
れを免疫化毎に使用した。
０ 日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント）
２８日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）
５０日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ）
抗体を鶏卵卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリク
ローナル抗体を検出した。マウスにおけるモノクローナル抗体の免疫化プロトコール
０．２５ｍｌ ＰＢＳ中１２μｇのゲル精製した融合タンパク質ならびに０．
２５ｍｌの完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントそ
れぞれを免疫化毎に使用した。融合タンパク質を４回目の免疫化に際して０．５
ｍｌ（アジュバントなし）に溶解した。
０ 日目：１回目の免疫化（完全フロイントアジュバント）
２８日目：２回目の免疫化（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）
５６日目：３回目の免疫化（ｉｃＦＡ）
８４日目：３回目の免疫化（ＰＢＳ）
８７日目：融合
ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクロー
ナル抗体を検出した。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】１９９８年４月１７日（１９９８．４．１７）
【補正内容】
請求の範囲
１． タンパク質がチロシンホスファターゼ活性を有し、かつ公知のチロシンホ
スファターゼとハイブリダイゼーションによるＤＮＡレベルで異なる、または細
胞の分化がチロシンホスファターゼ活性なしで若しくは限定されたチロシンホス
ファターゼでそれぞれ妨害するタンパク質である、図１のアミノ酸配列または１
もしくは複数個のアミノ酸が該アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有してな
るチロシンホスファターゼ関連タンパク質。
２． ＤＮＡが、
（ａ）図１のＤＮＡまたは１若しくは複数個の塩基対が該ＤＮＡと異なるＤＮＡ
であり、後者のＤＮＡが図１のＤＮＡにハイブリダイズする、または
（ｂ）縮重した遺伝子コードを介して、（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ、
を含有してなる、請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
３． 請求項２記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。
４． 請求項３記載の発現プラスミドを含んでなる形質転換体。
５． 適切な条件下での請求項４記載の形質転換体の培養を含有する請求項１記
載のタンパク質の製造方法。
６． 請求項１記載のタンパク質に対する抗体。
７． 妨害された細胞分化を治療するための薬剤としての請求項１記載のタンパ
ク質の使用。
８． 筋細管筋障害の場合において妨害された細胞分化が存在する、請求項７記
載の使用。
９． 妨害された細胞分化の診断および／または治療用の薬剤としての請求項２
記載のＤＮＡの使用。
１０． 筋細管筋障害の場合において妨害された細胞分化が存在する、請求項９
記載の使用。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19
1/19 1/21
1/21 9/16 Ｂ
5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08
9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/54
(72)発明者 プーストカ，アンネマリー
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
―69120 ウェルデルシュトラーセ 36
(72)発明者 キオシス，ペトラ
ドイツ連邦共和国 ヘッデシャイム デー
―68542 ヴィーラントシュトラーセ ５
(72)発明者 ラポーテ，ジョスリン
フランス国 ストラスバー デー―67000
ルー ド ベイン―フィンクウィラー
７
(72)発明者 フー，リン，チア
アメリカ合衆国 コロラド州 80262 デ
ンバー イー．ナインス アヴェニュー
4200
(72)発明者 マンデル，ジーン，ルイ
フランス国 イルキルシュ セデックス
エフ―67404 ボー ポステール 163，イ
ンスティトゥー ド ゲネティーク エ
ド ビオロジー モレキュレール エ セ
ルレール（シーエヌアールエス／インサー
ム，ユーエルピー)
(72)発明者 ダール，ニクラス
スウェーデン国 ウプサラ エス―752
36 アロスガタン ５