JP2002517236A

JP2002517236A - アポトーシス調節用タンパク質

Info

Publication number: JP2002517236A
Application number: JP2000553574A
Authority: JP
Inventors: ペーテル，マルクス; クラメル，ペーテル
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2002-06-18
Also published as: WO1999064584A2; CA2330168A1; EP1084243A2; WO1999064584A3; US20020099009A1; DE19825621A1; AU5278199A; DE19825621C2; US6696547B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アポトーシスの調節に適したタンパク質、かかるタンパク質をコードするDNA 、及びかかるタンパク質を製造するための方法に関する。本発明はまた、前記タンパク質に指向する抗体、並びに前記DNA 及び前記タンパク質のアポトーシスの調節又は診断検出のための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アポトーシスの調節に適したタンパク質、かかるタンパク質をコー
ドするＤＮＡ、及びかかるタンパク質の産生方法に関する。本発明はまた、前記
タンパク質に対する抗体、並びにアポトーシスを調節するため及び／又はその診
断検出のための前記ＤＮＡ及び前記タンパク質の使用に関する。

【０００２】アポトーシスは、プログラムされた細胞死である。それは、正確に調節されて
おり、アポトーシスは誘導又は阻害されうる。

【０００３】アポトーシスは、多数のいわゆるｄｅａｔｈレセプター、すなわち、それらの
リガンドの結合後、アポトーシスシグナル経路を誘導する、ＣＤ９５、ＴＮＦ−
ＲＩ、ＤＲ３、ＤＲ４又はＤＲ５などの「ｄｅａｔｈドメイン」（ＤＤ）含有レ
セプターにより誘導されうる。例えば、ＣＤ９５レセプターは、ＣＤ９５リガン
ドの結合後に、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１と相互作用し、その
結果、ＤＩＳＣ「ｄｅａｔｈ誘導シグナル伝達複合体」でのプロテアーゼＦＬＩ
ＣＥ／カスパーゼ−８の漸増及び活性化を誘導する。ＦＡＤＤ及びＦＬＩＣＥは
、「ｄｅａｔｈエフェクタードメイン（ＤＥＤ）」を含む。

【０００４】アポトーシスは、抗アポトーシス遺伝子の転写、すなわちその遺伝子産物によ
って阻害されうる。例えば、タンパク質ＦＬＩＰ「ＦＬＩＣＥ−阻害タンパク質
」は、ＣＤ９５アポトーシスシグナル経路を阻害する（ドイチェスクレブスフォ
ルシュンクスツェントルムの独国特許第１９７１３４３４号参照）。

【０００５】しかしながら、十分に計算された様式でアポトーシスの調節に干渉することを
可能にするために、このプロセスに関与するさらなる分子及び／又は機序を知る
ことが必要である。

【０００６】それゆえ、本発明の目的は、それによりアポトーシスの調節が研究され得、必
要に応じて影響を及ぼされうる産物を提供することである。

【０００７】本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。

【０００８】従って、本発明の主題は、アポトーシスを調節するに適したタンパク質及びか
かるタンパク質をコードするＤＮＡに関する。これらの産物により、アポトーシ
スの調節を研究し、及び／又はそれに影響を及ぼすことができる。

【０００９】本発明は、動物、具体的には、哺乳動物、より具体的には、ヒトにおいて、ア
ポトーシスの調節、具体的には、誘導に適したタンパク質が存在するという本発
明者らの見識に基づく。かかるタンパク質は約３４ｋＤの大きさを有する。それ
は、ｆｉｇ．１Ａのアミノ酸配列又はそれとは１若しくは数個のアミノ酸が異な
るアミノ酸配列を含有する。前記タンパク質は、そのＮ末端に「ｄｅａｔｈエフ
ェクタードメイン」（ＤＥＤ）を有する。そのうえ前記タンパク質は、そのＣ末
端に、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質にホモロジーを有する領域を含有す
る。さらに、前記タンパク質は、ＤＮＡと強固な複合体を形成する。前記タンパ
ク質はまた、遍在する様式で発現される。さらに、前記タンパク質は、ＣＤ９５
アポトーシスシグナル経路の誘導の後に、２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）に
よって核、すなわち核小体に移動し、そこでリボソームＤＮＡの転写を阻害し（
ｆｉｇｕｒｅ２〜５を参照のこと）、その結果、タンパク質生合成、さらに抗ア
ポトーシス遺伝子の遺伝子産物の合成を阻害する。

【００１０】本発明によれば、本出願人の見識は、ｆｉｇｕｒｅ１Ａの配列又はそれとは１
若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有するものであり、後者のア
ミノ酸配列のＤＮＡがｆｉｇ．１ＡのＤＮＡとハイブリダイズするものである、
アポトーシスの調節に適したタンパク質（以下、ＤＥＤＤと呼ぶ）を提供するの
に利用される。

【００１１】「１若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列」の文言は、ＤＥＤＤをコ
ードし、そのＤＮＡ配列がｆｉｇｕｒｅ１ＡのＤＮＡにハイブリダイズするもの
であるいかなるアミノ酸配列をも含む。前記配列は、１若しくは数個の塩基対の
付加、欠失、置換及び／又は逆位によりｆｉｇｕｒｅ１ＡのDNA と異なってもよ
い。具体的には、ＤＮＡ配列は、ｆｉｇｕｒｅ１ＢのＤＮＡ配列でありうる。前
記ＤＮＡ配列はまた、Ｎ−ＤＥＤＤ又はＣ−ＤＥＤＤをコードするＤＮＡ配列で
ありうる（実施例２及びｆｉｇｕｒｅ４Ａ参照）。「ハイブリダイゼーション」
の文言は、慣用の条件下、具体的にはＤＮＡの融解点より２０℃下でのハイブリ
ダイゼーションをいう。

【００１２】本発明の別の主題は、ＤＥＤＤをコードする核酸に関する。前記核酸は、ＲＮ
Ａ又はＤＮＡ、例えばｃＤＮＡであり得る。（ａ）ｆｉｇｕｒｅ１ＡのＤＮＡ又
はそれとは１若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡであり、後者のＤＮＡがｆｉ
ｇｕｒｅ１ＡのＤＮＡとハイブリダイズするものであるＤＮＡ、又は（ｂ）縮重遺伝コードを介して（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡからなるＤＮＡが好ましい。

【００１３】「１若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ」の文言は、ｆｉｇｕｒｅ１ＡのＤ
ＮＡとハイブリダイズする、ＤＥＤＤをコードするいかなるＤＮＡ配列をも含む
。前記ＤＮＡ配列は、１若しくは数個の塩基対の付加、欠失、置換及び／又は逆
位によりｆｉｇ．１ＡのＤＮＡと異なってもよい。具体的には、前記ＤＮＡ配列
は、ｆｉｇｕｒｅ１ＢのＤＮＡ配列であってもよい。ｆｉｇｕｒｅ１Ａ及びＢの
ＤＮＡを、プラスミドとしてＤＳＭＺ（ドイチェサムラングフォンミクロ
オルガニズメンウントツェーレン（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｅｎ））［ジャー
マン−タイプコレクションオブマイクロオーガニズムズアンドセルズ
（Ｇｅｒｍａｎ−ｔｙｐｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓａｎｄｃｅｌｌｓ）］にＤＳＭ１２１７４の下で１９９８年５
月１４日に寄託した。前記ＤＮＡ配列は、Ｎ−ＤＥＤＤ又はＣ−ＤＥＤＤをコー
ドするＤＮＡ配列であってもよい（実施例２及びｆｉｇｕｒｅ４Ａ参照）。「ハ
イブリダイゼーション」の文言に対して、前記説明が参照される。

【００１４】本発明のＤＮＡは、それ自体で又はいかなる他のＤＮＡとも組み合わせて存在
しうる。具体的には、本発明のＤＮＡは、発現ベクター中に存在してもよい。当
業者はその例に精通している。大腸菌用の発現ベクターの場合には、これらは、
例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂ及びｐＱＥ−
８である。酵母における発現については、例えば、ｐＹ１００及びＹｃｐａｄ１
が言及されるべきであり、一方、動物細胞における発現については、例えば、ｐ
ＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８及びｐＣＥＶ４が示されるべきである。昆虫細
胞における発現については、具体的には、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃ
ＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが適切である。

【００１５】当業者は、発現ベクター中に存在する本発明のＤＮＡを発現するに適切な細胞
を知っている。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７
７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１及びＳＧ１３００９が挙げられ、酵母
株サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）並びに動物細胞Ｌ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅ
ｒｏ及びＨｅＬａ並びに昆虫細胞ｓｆ９が挙げられる。

【００１６】当業者は、本発明のＤＮＡを発現ベクターにどのように挿入すべきかを知って
いる。また、当業者は、このＤＮＡを他のタンパク質及び／又はペプチドをコー
ドするＤＮＡと組み合わせて挿入でき、そのため、本発明のＤＮＡを融合タンパ
ク質の形態で発現させうるという事実にも精通する。

【００１７】また、当業者は、形質転換細胞又はトランスフェクト細胞を培養する条件を知
っている。当業者は、発現されたタンパク質及び／又は融合タンパク質を単離し
、精製する方法にも精通する。

【００１８】本発明の別の主題は、前記タンパク質又は融合タンパク質に対する抗体に関す
る。かかる抗体は慣用の方法により作製し得る。それはポリクローナルであって
もよいしモノクローナルであってもよい。その作製のために、動物−具体的には
ポリクローナル抗体についてはウサギ又はニワトリ、モノクローナル抗体につい
てはマウス−を前記（融合）タンパク質又はそのフラグメントで免疫することが
好ましい。動物のさらなる「追加免疫」は、同一の（融合）タンパク質又はその
フラグメントで実施されうる。ポリクローナル抗体は、動物血清又は卵黄から入
手し得る。モノクローナル抗体を入手するために、動物脾臓細胞をミエローマ細
胞と融合する。

【００１９】本発明の別の主題はキットに関する。かかるキットは、（ａ）本発明のＤＮＡ、（ｂ）本発明のタンパク質（ＤＥＤＤ）、（ｃ）本発明の抗体、及び（ｄ）キャリアー、緩衝液、溶媒、対照等の従来の補助薬剤を含む。

【００２０】個々の成分の１又は数個の例示が各々存在しうる。個々の発現に対して、前記
説明が参照される。それらは、本明細書中で相応しく適応する。

【００２１】本発明は、アポトーシス、具体的には研究対象であるアポトーシスの調節を可
能にする。ＤＥＤＤを、本発明の抗体によって検出しうる。ＤＥＤＤとアポトー
シス、具体的にはその調節との関係、具体的には時間及び量に関する関係を確立
しうる。さらに、当該タンパク質に対する自己抗体をＤＥＤＤで検出し得る。両
方の検出は、慣用の方法、具体的にはウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈
殿又は免疫蛍光によって実施し得る。さらに、ＤＥＤＤをコードする遺伝子の機
構及び発現は、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡ及びそれに由来するプライマー
で検出しうる。当該検出は、常法、具体的にはサザンブロット、又は「インサイ
チュ」ハイブリダイゼーションで実施しうる。

【００２２】さらに、本発明は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトにおける
ＤＥＤＤの存在について、そしてそれに対して手段を講じるのに適切である。Ｄ
ＥＤＤは、本発明の抗体によって阻害されうる。他方で、これはまた、ＤＥＤＤ
をコードする本発明の核酸、具体的には、構成的プロモーター又は所定の組織に
おける誘導可能プロモーターによって制御され、その発現の後に、身体又は所定
の組織においてＤＥＤＤの供給をもたらす特定の遺伝子によって達成されうる。

【００２３】従って、本発明は、十分に計算された様式でのアポトーシスの調節のため、さ
らにそれに影響を及ぼすために働く産物を提供する。これは、例えば、ＡＩＤＳ
などの免疫系の疾患、肝臓の疾患及び腫瘍の疾患のような多数の疾患に関して特
別な意義を有しうる。

【００２４】本発明は、以下の実施例によって例示される。

【００２５】実施例１：組織又は細胞におけるＤＥＤＤｍＲＮＡの検出心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、リンパ節、胸腺、骨
髄及び胎児肺などの組織由来のポリＡＲＮＡをノザンブロットハイブリダイゼ
ーションに供す。この目的のために、ポリＡＲＮＡを含有するメンブレン（Ｍ
ＴＮ^TM クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）製）を使用し、ＤＥＤ、第１のＮ
ＬＳ及びプロリンリッチ領域の一部分をコードするＤＥＤＤの³²Ｐ標識ＤＮＡサ
ンプルとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションを、クローンテックに
より指示される条件下で行う（ｆｉｇｕｒｅ３Ａ参照）。

【００２６】さらに、全ＲＮＡを、種々のリンパ腫瘍細胞及び非リンパ腫瘍細胞から単離し
、ＲＴ−ＰＣＲに供す。パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）製のＲ
Ｔ−ＰＣＲキットを指示される条件下で使用する。ＲＴ−ＰＣＲサンプルを、競
合的ＰＣＲ（１分９５℃、１分５９℃、１分７２℃、３５サイクル）に使用し、
プライマー３（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＣＣＴ
ＡＡＡＧＣＧＧＣＧ−３’）及び４（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＴＧ
ＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣ−３’）並びにβ−アクチンプライマ
ーを使用する（ｆｉｇｕｒｅ３Ｂ参照）。

【００２７】ＤＥＤＤが遍在的に発現することが示される。

【００２８】実施例２：ＤＥＤＤ又はその欠失変異体によるアポトーシスの誘導２個のＤＥＤＤ欠失変異体を作製する。一方（Ｎ−ＤＥＤＤと呼ぶ）は、ｆｉ
ｇｕｒｅ１ＡのＤＥＤＤのアミノ酸１〜１１４を含有、すなわちＤＥＤ及びＮＬ
Ｓ１を含有する。他方（以下ではＣ−ＤＥＤＤと呼ぶ）は、ｆｉｇｕｒｅ１Ａの
ＤＥＤＤのアミノ酸１０９〜３１８を含有、すなわちプロリンリッチ領域、ＮＬ
Ｓ２及びＤＥＤＤのＣ末端の半分を含有する。さらに、ＤＥＤＤ欠失変異体は、
それぞれ、ＦＬＡＧペプチド、すなわちＣ末端にＮ−ＤＥＤＤを、Ｎ末端にＣ−
ＤＥＤＤを有する（ｆｉｇｕｒｅ４Ａ参照）。

【００２９】２９３細胞を、ＤＥＤＤ、Ｎ−ＤＥＤＤ及び／又はＣ−ＤＥＤＤをコードする
ＤＮＡで一過的にトランスフェクトする。さらに、ＦＡＤＤ又はカスパーゼ−８
をコードするＤＮＡを対照として使用する。トランスフェクションを、リン酸カ
ルシウム沈殿法によって行う。トランスフェクションの３６時間後、細胞を収集
し、ＤＮＡ断片化をアポトーシスの指標として測定する。

【００３０】ＤＥＤＤ、Ｎ−ＤＥＤＤ及びＣ−ＤＥＤＤが、アポトーシスを誘導し得、Ｎ−
ＤＥＤＤの誘導効果が最も強いことを示す。アポトーシス誘導は、セルピンカス
パーゼインヒビターｃｒｍＡの共発現によって阻害されうる。

【００３１】実施例３：ＤＥＤＤによるＤＮＡ結合及びリボソーム（ｒ）ＤＮＡの転写の阻害ＤＥＤＤは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ＤＥＤＤ融合タン
パク質の形態で産生される。ＧＳＴ−ＤＥＤＤを、０．５〜２ＭＮａＣｌでの
λ−ＤＮＡとの結合試験に使用し、次いでアガロースゲル電気泳動に供す。同じ
ことを、ＧＳＴ単独又はＧＳＴ−ＦＡＤＤで行う（ｆｉｇｕｒｅ５Ａ参照）。

【００３２】ＤＥＤＤがＤＮＡと複合体を形成し得ることを示す（ｆｉｇｕｒｅ５Ａ、レー
ン５参照）。当該複合体は、塩に対して耐性である（ｆｉｇｕｒｅ５Ａ、レーン
７参照）。

【００３３】さらに、ＧＳＴ−ＤＥＤＤを、ヌクレオソーム中に組み込まれたマウスｒＤＮ
Ａプロモーターの２４８ｂｐフラグメントとの結合試験に使用する。ＤＮＡに対
するＧＳＴ−ＤＥＤＤのモル比は、０〜２７である。結合試験の後、反応バッチ
を４．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供す（ｆｉｇｕｒｅ５Ｂ）。

【００３４】ＤＥＤＤがヌクレオソームと複合体を形成しうることを示す。

【００３５】さらに、ＧＳＴ−ＤＥＤＤ又はＧＳＴ−ＦＡＤＤを、インビトロ転写試験に使
用する。当該試験において、マウスｒＤＮＡミニ遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼ
Ｉ転写因子（ＴＴＦ−Ｉ）の存在下又は非存在下で転写させる。得られる³²Ｐ標
識転写産物を、４．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供す（ｆｉｇｕｒｅ
５Ｃ参照）。

【００３６】ＤＥＤＤがｒＤＮＡの転写を阻害しうることを示す。これは、ＤＥＤＤがタン
パク質生合成を阻害し、従って抗アポトーシス遺伝子の遺伝子産物の合成を阻害
するという事実に帰する。

【００３７】実施例４：本発明のタンパク質（ＤＥＤＤ）の産生及び精製ｆｉｇｕｒｅ１ＡのＤＮＡは、ＢａｍＨＩリンカーとともに提供され、引き続
いて、これをＢａｍＨＩによって切断し、ＢａｍＨＩ切断した発現ベクターｐＱ
Ｅ−８（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）に挿入する。発現プラスミドｐＱＥ
−８／ＤＥＤＤを得る。かかるプラスミドは、６個のヒスチジン残基（Ｎ末端パ
ートナー）とｆｉｇｕｒｅ１Ａの本発明のＤＥＤＤ（Ｃ末端パートナー）との融
合タンパク質をコードする。ｐＱＥ−８／ＤＥＤＤを、大腸菌ＳＧ１３００９
の形質転換のために使用する（ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）、Ｓ．ら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８、（１９８１）、２６５〜２７３参照）。前記
細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌカナマイシンを有す
るＬＢブロス中で培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導する。前記細菌の溶解を、６Ｍ塩酸グアニジンの
添加によって達成する。その後、クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を、
クロマトグラフィー材料の製造業者（キアジェン）の説明書に従って８Ｍ尿素の
存在下で前記溶解物を用いて行う。結合した融合タンパク質を、ｐＨ３．５の緩
衝液中に溶出させる。その中和後、融合タンパク質を、１８％ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、クーマシーブルーで染色する（トーマス（Ｔｈｏ
ｍａｓ）、Ｊ．Ｏ．及びコーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）、Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５）、７０９〜７３３参照）。

【００３８】本発明の（融合）タンパク質が、高度に精製された形態で産生しうることが示
される。

【００３９】実施例５：本発明の抗体の作製及び検出本発明の実施例４の融合タンパク質を、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供す。４Ｍ酢酸塩を用いてゲルを染色した後、約３４ｋＤバンドをゲ
ルから切り出し、リン酸緩衝化慣用塩溶液中でインキュベートする。ゲル切片を
沈降させた後に、上清のタンパク質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって測定し、続いてクーマシーブルー染色を行う。動物を、精製された
融合タンパク質で下記のように免疫する。

【００４０】ウサギにおけるポリクローナル抗体に関する免疫プロトコール０．７ｍｌのＰＢＳ中３５μｇのゲル精製した融合タンパク質と０．７ｍｌの
完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントとを免疫毎に使
用する：０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント）１４日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）２８日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）５６日目：４回目の免疫（ｉｃＦＡ）８０日目：放血させ屠殺。

【００４１】ウサギ血清を、イムノブロットにおいて試験する。この目的のために、本発明
の実施例１の融合タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
、そしてニトロセルロースフィルターに移す（キース−アンダーソン（Ｋｈｙｓ
ｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ），Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ
．１０（１９８４），２０３〜２０９）。ウエスタンブロット分析を、ボック（
Ｂｏｃｋ），Ｃ．−Ｔ．ら、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ８，（１９９４），２１
５〜２２９に記載されるように行う。この目的のために、ニトロセルロースフィ
ルターを、一次抗体とともに３７℃で１時間インキュベートする。当該抗体はウ
サギ血清である（ＰＢＳ中に１：１００００）。ＰＢＳを使用する数回の洗浄工
程の後に、ニトロセルロースフィルターを、二次抗体とともにインキュベートす
る。当該抗体は、アルカリホスファターゼを結合させたモノクローナルヤギ抗ウ
サギＩｇＧ抗体（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）社製）である（ＰＢＳ中に（１
：５０００））。３７℃で３０分間のインキュベーションの後に、ＰＢＳを用い
る数回の洗浄工程を行い、それに続いて発色液（３６μＭの５’−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスファターゼ、４００μＭのニトロブルーテトラゾリ
ウム、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５
ｍＭのＭｇＣｌ₂）を用いて室温で、バンドが見えるようになるまでアルカリホ
スファターゼ検出反応を行う。

【００４２】本発明のポリクローナル抗体が調製されうることを示す。

【００４３】ニワトリにおけるポリクローナル抗体に関する免疫プロトコル０．８ｍｌのＰＢＳ中の４０μｇのゲル精製した融合タンパク質と０．８ｍｌ
の完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントとを免疫毎に
使用する。

【００４４】０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント）２８日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）５０日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）

【００４５】抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験する。本発明のポリクロー
ナル抗体を検出する。

【００４６】マウスにおけるモノクローナル抗体に関する免疫プロトコル０．２５ｍｌのＰＢＳ中１２μｇのゲル精製した融合タンパク質と０．２５ｍ
ｌの完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントとを免疫毎
に使用する。前記融合タンパク質を、４回目の免疫において０．５ｍｌ（アジュ
バントなし）に溶解させる。

【００４７】０日目：１回目の免疫（完全フロイントアジュバント）２８日目：２回目の免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）５６日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）８４日目：４回目の免疫（ＰＢＳ）８７日目：融合。

【００４８】ハイブリドーマの上清を、ウエスタンブロットにおいて試験する。本発明のモ
ノクローナル抗体を検出する。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇ．１は、ヒト（ｆｉｇｕｒｅ１Ａ）及びマウス（ｆｉｇｕｒｅ１Ｂ）由
来の本発明のタンパク質（ＤＥＤＤ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列並びにその差異
（ｆｉｇｕｒｅ１Ｃ）を示す。

【図２】Ｆｉｇ．２は、ＤＥＤＤの構造的機構を示し、ＤＥＤは「ｄｅａｔｈエフェク
タードメイン」を表し、ＮＬＳは「核局在化シグナル」を表し、Ｐ−リッチはＰ
−リッチ領域である。個々のドメインの等電点を示す。

【図３】Ｆｉｇ．３は、組織（ｆｉｇｕｒｅ３Ａ）又は腫瘍細胞（ｆｉｇｕｒｅ３Ｂ）
におけるＤＥＤＤｍＲＮＡの検出を示す。

【図４】Ｆｉｇ．４は、ＤＥＤＤによるアポトーシスの誘導を示す。ｆｉｇｕｒｅ４Ａ
は、ＤＥＤＤ、Ｎ−ＤＥＤＤ及びＣ−ＤＥＤＤの欠失変異体を示し、ｆｉｇｕｒ
ｅ４Ｂは、ＤＥＤＤ又はこれらの欠失変異体により誘導されるアポトーシスを示
す。

【図５】Ｆｉｇ．５は、核小体においてリボソームＤＮＡの転写を阻害するＤＮＡ結合
タンパク質としてのＤＥＤＤを示す。ｆｉｇｕｒｅ５Ａは、λ−ＤＮＡへのＧＳ
Ｔ−ＤＥＤＤの結合を示す。ｆｉｇｕｒｅ５Ｂは、ヌクレオソームに組み込まれ
たＤＮＡへのＧＳＴ−ＤＥＤＤの結合を示す。ｆｉｇｕｒｅ５Ｃは、この目的の
ためにＲＮＡポリメラーゼＩ−終結因子（ＴＴＦ−Ｉ）を必要とするｒＤＮＡミ
ニ遺伝子の転写がＧＳＴ−ＤＥＤＤによって阻害されることを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月１９日（２０００．９．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クラメル，ペーテルドイツ連邦共和国ハイデルベルクデー −69120 ヴェルデルシュトラーセ 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 HA15 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CE10 DA01 DA05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA76 DA86 EA22 EA28 FA72 FA74 GA22 GA32

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｆｉｇ．１Ａのアミノ酸配列又はそれとは１若しくは数個の
アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有してなるものであり、後者のアミノ酸配列
のＤＮＡ配列がｆｉｇ．１ＡのＤＮＡとハイブリダイズするものである、アポト
ーシスの調節に適したタンパク質。
【請求項２】ｆｉｇ．１Ａのアミノ酸１〜１１４を含有してなる、請求項
１記載のタンパク質。
【請求項３】ｆｉｇ．１Ａのアミノ酸１０９〜３１８を含有してなる、請
求項１記載のタンパク質。
【請求項４】（ａ）ｆｉｇ．１ＡのＤＮＡ又はそれとは１若しくは数個の塩
基対が異なるＤＮＡであり、後者のＤＮＡがｆｉｇ．１ＡのＤＮＡとハイブリダ
イズするものであるＤＮＡ、又は（ｂ）縮重遺伝コードを介して（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡを含有してなる、請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】ＤＮＡがｆｉｇ．１Ａの塩基対２８〜３６９からなるもので
ある、請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】ＤＮＡがｆｉｇ．１Ａの塩基対３５２〜９８１からなるもの
である、請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項７】ＤＮＡがｆｉｇ．１ＢのＤＮＡである、請求項４記載のＤＮ
Ａ。
【請求項８】請求項４〜７いずれかに記載のＤＮＡを含有してなる発現プ
ラスミド。
【請求項９】請求項８記載の発現プラスミドを含んでなる形質転換体。
【請求項１０】適切な条件下で請求項９記載の形質転換体を培養する工程
を含む、請求項１記載のタンパク質の調製方法。
【請求項１１】請求項１〜３いずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１２】請求項１〜３いずれかに記載のタンパク質又は請求項４〜
７いずれかに記載のＤＮＡの、アポトーシスの調節又はその診断的検出のための
使用。
【請求項１３】アポトーシスが疾患の症例において調節される、請求項１
２記載の使用。
【請求項１４】疾患が、ＡＩＤＳのような免疫系の疾患、又は腫瘍性疾患
である、請求項１３記載の使用。