WO1999064584A2 - Protein zur regulation von apoptose - Google Patents

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WO1999064584A2
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Peter Krammer
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    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs

Definitions

  • the present invention relates to a protein which is suitable for regulating apoptosis, a DNA coding for such a protein and a method for producing such a protein.
  • the invention further relates to antibodies directed against the protein and to the use of the DNA and the protein for regulating apoptosis or their diagnostic detection.
  • Apoptosis is programmed cell death. This is subject to precise regulation, whereby apoptosis can be induced or inhibited.
  • the induction of apoptosis can be via a number of so-called death receptors, i.e. Receptors that contain a "death domain” (DD), such as CD95, TNF-RI, DR3, DR4 or DR5, occur which induce apoptosis signaling pathways after their ligands have been bound.
  • DD death domain
  • the CD95 receptor interacts with the adapter protein FADD / M0RT1, thereby inducing the "recruitment” and activation of the protease FLICE / Caspase-8 at the DISC "Death Inducing Signaling Complex".
  • FADD and FLICE contain "Death Effector Domains" (DED).
  • the inhibition of apoptosis can be achieved by the transcription of anti-apoptotic genes, i.e. through their gene products.
  • the protein FLIP FLICE-Inhibitory Protein
  • inhibits the CD95 apoptosis signaling pathway cf. German Patent 19713434 of the German Cancer Research Center.
  • the present invention is therefore based on the object to provide a means by which the regulation of apoptosis can be investigated and, if necessary, interfered with.
  • the present invention thus relates to a protein suitable for regulating apoptosis and a DNA coding for such a protein. With these means it is possible to investigate or intervene in the regulation of apoptosis.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that in animals, especially mammals, especially humans, there is a protein which is suitable for regulating, in particular inducing, apoptosis.
  • a protein which is suitable for regulating, in particular inducing, apoptosis.
  • Such a protein has a size of approx. 34 kD. It comprises the amino acid sequence of FIG. 1A or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.
  • the protein has a "Death Effector Domain" (DED) at its N-terminus. It also includes regions at its C-terminus that have homologies to DNA binding proteins such as histones. Furthermore, the protein forms a strong complex with DNA. It is also ubiquitously expressed.
  • DED Death Effector Domain
  • the knowledge of the applicant is used to provide a protein suitable for regulating apoptosis (hereinafter referred to as DEDD), comprising the sequence of FIG. 1A or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids, where the DNA of the latter amino acid sequence hybridized with the DNA of Fig. 1A.
  • DEDD a protein suitable for regulating apoptosis
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids encompasses any amino acid sequence coding for a DEDD, the DNA sequence of which hybridizes with the DNA of FIG. 1A.
  • the sequence can differ from the DNA of FIG. 1A by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • the DNA sequence can be that of Figure 1B.
  • the DNA sequence can be one which codes for N-DEDD or C-DEDD (cf. Example 2 and FIG. 4A).
  • hybridization indicates hybridization under normal conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the sequence.
  • nucleic acid which codes for DEDD.
  • the nucleic acid can be an RNA or a DNA, e.g. a cDNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • a DNA different by one or more base pairs encompasses any DNA sequence coding for DEDD which hybridizes with the DNA of FIG. 1A.
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 1A by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • the DNA sequence can be that of Figure 1B.
  • the DNAs of FIGS. 1A and B were deposited as plasmid with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cells) under DSM 12174 on May 14, 1998.
  • the DNA sequence can be one that encoded for N-DEDD or C-DEDD (cf. Example 2 and FIG. 4A) With regard to the expression “hybridization”, reference is made accordingly to the above statements.
  • a DNA according to the invention can be present as such or in combination with any other DNA.
  • a DNA according to the invention can be present in an expression vector. Examples of such are known to the person skilled in the art.
  • an expression vector for E. coli these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast e.g. To name pYlOO and Ycpadl
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the bacculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • suitable cells in order to express the DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109, BL21 and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa and the insect cells sf9.
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in conjunction with a DNA coding for another protein or peptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • Another object of the present invention is one directed against an above protein or fusion protein Antibody.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragments thereof. Further "boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • kits Such comprises one or more of the following components:
  • auxiliaries such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.
  • DEDD can be detected with an antibody according to the invention.
  • a relationship can be established, in particular in terms of time and quantity, from DEDD to apoptosis, particularly to its regulation.
  • DEDD can also be used to detect an autoantibody directed against this protein. Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, an immunoprecipitation or by immunofluorescence.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA and primers derived therefrom, the organization and expression of the gene coding for DEDD can be detected. This detection can be carried out in the usual way, in particular in a Southern blot, or via "in situ" hybridization.
  • the present invention is suitable for taking measures for and against the presence of DEDD in animals, particularly mammals and very particularly in humans.
  • DEDD can be inhibited with an antibody according to the invention.
  • it can also be achieved with a nucleic acid according to the invention, coding for DEDD, in particular a DNA, which is placed under the control of a constitutive or inducible promoter and after its expression leads to the provision of DEDD in the body or in the specific tissues .
  • the present invention thus represents means not only to study the regulation of apoptosis, but also to intervene in a targeted manner. This can be of particular importance in many diseases. Such are e.g. Immune system disorders such as AIDS, liver and tumor diseases.
  • FIG. 1 shows the DNA and amino acid sequence of a protein according to the invention (DEDD) from humans (FIG. 1A) and mouse (FIG. 1B) and their differences (FIG. IC).
  • DEDD DNA and amino acid sequence of a protein according to the invention
  • DED means “Death Effector Domain”
  • NLS Nuclear Localization Signal
  • P-rich proline-rich region The isoelectric points for the individual domains are given.
  • FIG. 3 shows the detection of DEDD mRNA in tissues (FIG. 3A) or tumor cells (FIG. 3B).
  • FIG. 4 shows the induction of apoptosis by DEDD.
  • FIG. 4A shows deletion mutants of DEDD, N-DEDD and C-DEDD, and
  • FIG. 4B shows the apoptosis induced by DEDD and these deletion mutants.
  • FIG. 5 shows DEDD as a DNA binding protein that inhibits the transcription of ribosomal DNA in nucleoli.
  • 5A shows the binding of GST-DEDD to ⁇ -DNA.
  • FIG. 5B shows the binding of GST-DEDD to DNA, which is assembled into a nucleosome.
  • FIG. 5C shows that the transcription of an rDNA mini gene, which requires the RNA polymerase I termination factor (TTF-I), is inhibited by GST-DEDD.
  • TTF-I RNA polymerase I termination factor
  • Example 1 Detection of DEDD mRNA in tissues or cells
  • PolyA RNA is subjected to Northern blot hybridization.
  • a membrane containing the polyA RNA (MTN TM Clontech) is used and hybridized with a 32 P-labeled DNA sample from DEDD, which codes for DED, the first NLS and parts of the proline-rich region. The hybridization takes place under the conditions specified by Clontech (cf. FIG. 3A).
  • RNA is isolated from various lymphoid and non-lymphoid tumor cells and subjected to an RT-PCR, the RT-PCR kit from Perkin Elmer being used under the specified conditions.
  • the RT-PCR samples are used in a competitive PCR (1 min 95 ° C, 1 min 59 ° C, 1 min 72 ° C, 35 cycles), the primers 3 (5 '-CGCGGATCCGGGAG- CATGGCGGGCCTAAAGCGGCG-3 ') and 4 (5' -CCGGAATTCCGGCTTGGTTCTG-GATCACTGAAGGC-3 ') and ⁇ -actin primers can be used (see FIG. 3B).
  • Example 2 Induction of apoptosis by DEDD or deletion mutants thereof
  • N-DEDD comprises amino acids 1-114 of DEDD of Fig. 1A, i.e. it includes DED and NLS1.
  • C-DEDD comprises amino acids 109-318 of DEDD of Fig. 1A, i.e. it includes the proline-rich region, NLS2 and the C-terminal half of DEDD.
  • the DEDD deletion mutants each have a FLAG peptide, namely N-DEDD at the C-terminus and C-DEDD at the N-terminus (cf. FIG. 4A).
  • 293 cells are transiently transfected with DNAs that code for DEDD, N-DEDD and C-DEDD, respectively. DNAs which code for FADD or Caspase-8 are also used as controls. The transfection is carried out using the calcium phosphate precipitation method. The cells are harvested 36 hours after transfection and the DNA fragmentation is determined as an indication of apoptosis.
  • DEDD deoxyribonucleic acid
  • N-DEDD can induce apoptosis, the induction effect of N-DEDD being strongest.
  • Apoptosis induction can be inhibited by coexpression of the serpin caspase inhibitor crmA.
  • DEDD is in the form of a glutathione-S-transferase (GST) -DEDD- Fusion protein produced.
  • GST-DEDD is used with ⁇ -DNA at 0.5 - 2 M NaCl in a binding test and then subjected to agarose gel electrophoresis. The same is done with GST alone or GST-FADD (see FIG. 5A).
  • DEDD can form a complex with a DNA (cf. FIG. 5A, lane 5).
  • This complex is salt-resistant (see FIG. 5A, lane 7).
  • GST-DEDD is used in a binding test with a 248 bp fragment of the mouse rDNA promoter, which is assembled into a nucleosome.
  • the molar ratios of GST-DEDD to DNA are 0-27.
  • the reaction mixture is subjected to 4.5% polyacrylamide gel electrophoresis (cf. FIG. 5B).
  • DEDD can form a complex with nucleosomes.
  • GST-DEDD and GST-FADD are used in an in vitro transcription test.
  • a mouse rDNA minigen is transcribed in the presence or absence of the RNA polymerase I termination factor (TTF-I).
  • TTF-I RNA polymerase I termination factor
  • 32 P-labeled transcripts obtained are subjected to 4.5% polyacrylic acid gel electrophoresis (cf. FIG. 5C).
  • DEDD can inhibit the transcription of rDNA. This indicates that DEDD can inhibit protein biosynthesis and thus the synthesis of gene products of anti-apoptotic genes.
  • Example 4 Production and purification of a protein according to the invention (DEDD)
  • the DNA of FIG. 1A is provided with BamHI linkers, cleaved with BamHI and into those cleaved with BamHI Expression vector pQE-8 (Qiagen) inserted.
  • the expression plasmid pQE-8 / DEDD is obtained.
  • pQE-8 / DEDD is used to transform E.coli SG 13009 (see. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273).
  • the bacteria are cultivated in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 25 ⁇ g / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG). Lysis of the bacteria is achieved by adding 6 M guanidine hydrochloride, then chromatography (Ni-NTA resin) is carried out with the lysate in the presence of 8 M urea in accordance with the manufacturer's (Qiagen) instructions for the chromatography material. The bound fusion protein is eluted in a pH 3.5 buffer.
  • the fusion protein is subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
  • Example 5 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 4 is subjected to an 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 34 kD band is cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Gel pieces are sedimented before the protein concentration of the supernatant is determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, which is followed by a Coomassie blue staining. Animals are immunized with the gel-purified fusion protein as follows: Immunization protocol for polyclonal antibodies in rabbits
  • 35 ⁇ g of gel-purified fusion protein in 0.7 ml of PBS and 0.7 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.
  • the rabbit's serum is tested in an immunoblot.
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al. , Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter is incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody is rabbit serum (1: 10000 in PBS). After several washing steps with PBS, the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody.
  • This antibody is an alkaline phosphatase-linked monoclonal goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, there are several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands become visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2
  • Antibodies are extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention are detected.
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das sich zur Regulation von Apoptose eignet, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Regulation von Apoptose bzw. deren diagnostischer Erfassung.

Description

Protein zur Regulation von Apoptose
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das sich zur Regulation von Apoptose eignet, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Regulation von Apoptose bzw. deren diagnostischer Erfassung.
Apoptose ist der programmierte Zelltod. Dieser unterliegt einer genauen Regulation, wobei Apoptose induziert bzw. inhibiert werden kann.
Die Induktion von Apoptose kann über eine Reihe von sog. Todesrezeptoren, d.h. Rezeptoren, die eine "Death Domain" (DD) enthalten, wie CD95, TNF-RI, DR3 , DR4 oder DR5 , erfolgen, die nach Bindung ihrer Liganden Apoptose-Signalwege induzieren. Beispielsweise interagiert nach Bindung des CD95-Liganden der CD95-Rezeptor mit dem Adapterprotein FADD/M0RT1, wodurch das "Recruitment " und die Aktivierung der Protease FLICE/Caspase- 8, am DISC "Death Inducing Signalling Complex" induziert werden. FADD und FLICE enthalten "Death Effector Domains" (DED) .
Die Inhibition von Apoptose kann durch die Transkription von anti-apoptotischen Genen, d.h. durch deren Genprodukte, erfolgen. Beispielsweise inhibiert das Protein FLIP "FLICE- Inhibitory Protein" den CD95-Apoptose-Signalweg (vgl. Deutsches Patent 19713434 des Deutschen Krebsforschungszentrums) .
Um jedoch gezielt in die Regulation von Apoptose eingreifen zu können ist es notwendig, weitere Moleküle bzw. Mechanismen zu kennen, die hieran beteiligt sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Regulation von Apoptose untersucht und gegebenenfalls in sie eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein zur Regulation von Apoptose geeignetes Protein und eine für ein solches Protein kodierende DNA. Mit diesen Mitteln ist es möglich, die Regulation von Apoptose zu untersuchen bzw. in sie einzugreifen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelder, daß in Tieren, besonders Säugetieren ganz besonders dem Menschen, ein Protein vorliegt, das sich zur Regulation, insbesondere Induktion, von Apoptose eignet. Ein solches Protein weist eine Größe von ca. 34kD auf. Es umfaßt die Aminossäuresequenz von Fig. 1A oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz. Das Protein weist an seinem N-Terminus eine "Death Effector Domain" (DED) auf. Ferner umfaßt es an seinem C-Terminus Bereiche, die Homologien zu DNA-Bindungsproteinen, wie Histone, besitzen. Desweiteren bildet das Protein einen starken Komplex mit DNA aus. Auch wird es ubiquitär exprimiert. Darüberhinaus wandert es nach Induktion des CD95- Apoptose-Signalwegs mittels zweier Kernlokalisations-Signale "Nuclear Localization Signals" (NLS) in den Kern bzw. in die Nukleoli und inhibiert dort die Transkription ribosomaler DNA (vgl. Fig. 2-5), womit die Protein-Biosynthese und damit auch die Synthese von Genprodukten anti-apoptotischer Gene inhibiert wird.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein zur Regulation von Apoptose geeignetes Protein (nachstehend mit DEDD bezeichnet) bereitzustellen, umfassend die Sequenz von Fig. 1A oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche für ein DEDD kodierende Aminosäuresequenz, deren DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1A durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz jene von Fig. 1B sein. Ferner kann die DNA-Sequenz eine solche sein, die für N-DEDD bzw. C-DEDD kodiert (vgl. Beispiel 2 und Fig. 4A) . Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für DEDD kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z.B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) Die DNA von Fig. 1A oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für DEDD kodierende DNA- Sequenz, die mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert. Die DNA- Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1A durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Insbesondere kann die DNA- Sequenz jene von Fig. 1B sein. Die DNAs von Fig. 1A und B wurden als Plasmid bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen) unter DSM 12174 am 14. Mai 1998 hinterlegt. Ferner kann die DNA-Sequenz eine solche sein, die für N-DEDD bzw. C-DEDD kodiert (vgl. Beispiel 2 und Fig. 4A) Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC- Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pYlOO und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT- A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E . coli-Stämme HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions) protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten :
(a) eine erfindungsgemäße DNA,
(b) ein erfindungsgemäßes Protein (DEDD) ,
(c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
(d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Apoptose, insbesondere ihre Regulation, zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann DEDD nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung, insbesondere in zeitlicher und quantitativer Hinsicht, von DEDD zu Apoptose, besonders zu ihrer Regulation, hergestellt werden. Ferner kann mit DEDD ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für DEDD kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Southern Blot, oder über "in situ" Hybridisierung, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen für und gegen das Vorliegen von DEDD in Tieren, besonders Säugetieren und ganz besonders dem Menschen, zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann DEDD inhibiert werden. Andererseits kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, kodierend für DEDD, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die Kontrolle eines konstitutiven oder in bestimmten Geweben, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstellung von DEDD im Körper oder in den bestimmten Geweben führt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, die Regulation von Apoptose nicht nur zu untersuchen, sondern auch gezielt in sie einzugreifen. Dies kann eine besondere Bedeutung bei vielen Erkrankungen haben. Solche sind z.B. Erkrankungen des Immunsystems, wie AIDS, der Leber und Tumorerkrankungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins (DEDD) aus Mensch (Fig. 1A) und Maus (Fig. 1B) sowie deren Unterschiede (Fig. IC) .
Fig. 2 zeigt die strukturelle Organisation von DEDD, wobei DED "Death Effector Domain", NLS "Nuclear Localization Signal" und P-rich Prolin-reiche Region bedeuten. Die isoelektrischen Punkte für die einzelnen Domänen sind angegeben.
Fig. 3 zeigt den Nachweis von DEDD mRNA in Geweben (Fig. 3A) bzw. Tumorzellen (Fig. 3B) .
Fig. 4 zeigt die Induktion von Apoptose durch DEDD. In Fig. 4A werden Deletionsmutanten von DEDD, N-DEDD bzw. C- DEDD, und in Fig. 4B die durch DEDD bzw. diese Deletionsmutanten induzierte Apoptose gezeigt.
Fig. 5 zeigt DEDD als ein DNA-Bindungsprotein, das in Nukleoli die Transkription von ribosomaler DNA inhibiert. In Fig. 5A wird die Bindung von GST-DEDD an λ-DNA gezeigt. In Fig. 5B wird die Bindung von GST-DEDD an DNA gezeigt, die zu einem Nukleosom assembliert ist. In Fig. 5C wird gezeigt, daß die Transkription eines rDNA-Minigens, das hierfür den RNA Polymerase I -Terminationsfaktor (TTF-I) benötigt, durch GST-DEDD inhibiert wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Nachweis von DEDD mRNA in Geweben bzw. Zellen
Aus Geweben, wie Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelett-Muskel, Niere, Pancreas, Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark und fötaler Leber, wird PolyA RNA einer Northern Blot-Hybridisierung unterzogen. Hierzu wird eine die PolyA RNA enthaltende Membran (MTN™ Clontech) verwendet und mit einer 32P markierten DNA-Probe von DEDD, die für DED, das erste NLS und Teile der Prolin-reichen Region kodiert, hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt unter den von Clontech angegebenen Bedingungen (vgl. Fig. 3A) .
Ferner wird Gesamt-RNA aus verschiedenen lymphoiden und nicht- lymphoiden Tumorzellen isoliert und einer RT-PCR unterzogen, wobei der RT-PCR Kit von Perkin Eimer unter den angegebenen Bedingungen verwendet wird. Die RT-PCR Proben werden in einer kompetetiven PCR (1 min 95°C, 1 min 59°C, 1 min 72°C, 35 Zyklen) verwendet, wobei die Primer 3 ( 5 ' -CGCGGATCCGGGAG- CATGGCGGGCCTAAAGCGGCG-3 ' ) und 4 ( 5 ' -CCGGAATTCCGGCTTGGTTCTG- GATCACTGAAGGC-3 ' ) sowie ß-Actin-Primer eingesetzt werden (vgl. Fig. 3B) .
Es zeigt sich, daß DEDD ubiquitär exprimiert wird.
Beispiel 2: Induktion von Apoptose durch DEDD bzw. Deletionsmutanten davon
Es werden zwei DEDD-Deletionsmutanten hergestellt. Die eine (nachstehend mit N-DEDD bezeichnet) umfaßt die Aminosäuren 1- 114 von DEDD von Fig. 1A, d.h. sie umfaßt DED und NLS1. Die andere (nachstehend mit C-DEDD bezeichnet) umfaßt die Aminosäuren 109 - 318 von DEDD von Fig. 1A, d.h. sie umfaßt die Prolin-reiche Region, NLS2 und die C-terminale Hälfte von DEDD. Ferner weisen die DEDD-Deletionsmutanten jeweils ein FLAG-Peptid auf, nämlich N-DEDD am C-Terminus und C-DEDD am N- Terminus (vgl. Fig. 4A) .
293 Zellen werden mit DNAs transient transfiziert, die für DEDD, N-DEDD bzw. C-DEDD kodieren. Ferner werden als Kontrolle DNAs verwendet, die für FADD bzw. Caspase-8 kodieren. Die Transfektion wird mittels des Calciumphosphat-Präzipitations- Verfahrens durchgeführt. 36 Stunden nach Transfektion werden die Zellen geerntet und die DNA-Fragmentation wird als Indiz für Apoptose bestimmt.
Es zeigt sich, daß DEDD, N-DEDD bzw. C-DEDD Apoptose induzieren können, wobei die Induktions-Wirkung von N-DEDD am stärksten ist. Durch Coexpression des Serpin Caspase- Inhibitors crmA kann die Apoptose-Induktion inhibiert werden.
Beispiel 3 : DNA-Bindung durch DEDD und Inhibierung der
Transkription von ribosomaler (r)DNA
DEDD wird in Form eines Glutathion-S-Transferase (GST)-DEDD- Fusionsproteins hergestellt. GST-DEDD wird mit λ-DNA bei 0,5 - 2 M NaCl in einen Bindungstest eingesetzt und anschließend einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Gleiches wird mit GST alleine bzw. GST-FADD durchgeführt (vgl. Fig. 5A) .
Es zeigt sich, daß DEDD einen Komplex mit einer DNA ausbilden kann (vgl. Fig. 5A, Spur 5). Dieser Komplex ist salzbeständig (vgl. Fig. 5A, Spur 7).
Ferner wird GST-DEDD in einen Bindungstest mit einem 248 bp Fragment des Maus-rDNA Promotors eingesetzt, das zu einem Nukleosom assembliert ist. Die molaren Verhältnisse von GST- DEDD zur DNA sind 0-27. Nach dem Bindungstest wird der Reaktionsansatz einer 4,5 % Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen (vgl. Fig. 5B) .
Es zeigt sich, daß DEDD einen Komplex mit Nukleosomen ausbilden kann.
Desweiteren werden GST-DEDD bzw. GST-FADD in einen in vitro Transkriptionstest eingesetzt. In diesem wird ein Maus-rDNA Minigen in Gegenwart bzw. Abwesenheit des RNA Polymerase I- Terminationsfaktors (TTF-I) transkribiert. Erhaltene, 32P- markierte Transkripte werden einer 4,5 % Polyacryla id- Gelelektrophorese unterzogen (vgl. Fig. 5C) .
Es zeigt sich, daß DEDD die Transkription von rDNA inhibieren kann. Dies weist darauf hin, daß DEDD die Protein-Biosynthese und somit die Synthese von Genprodukten anti-apoptotischer Gene inhibieren kann.
Beispiel 4 : Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Proteins (DEDD)
Die DNA von Fig. 1A wird mit BamHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/DEDD erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Hi s t idin-Res ten (N- Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen DEDD von Fig. 1A (C-Terminuspartner) . pQE-8/DEDD wird zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al . , J. Bacteriol . 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB- Medium mit lOOμg/ml Ampicillin und 25μg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18 % SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 5: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 4 wird einer 18 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 34 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert , bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gelgereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert: Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0 , 7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund' s Adjuvans) Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans ; icFA) Tag 28: 3. Immunisierung (icFA) Tag 56: 4. Immunisierung (icFA) Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys . Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phospha- tase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können. Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0 , 8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund' s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund' s Adjuvans) Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans ; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung werden 12μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund' s Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund' s Adjuvans)
Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans; icFA)
Tag 56 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen. BUDAPESTΞR VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Deutsches
Krebs orschungsZentrum
Schwerpunkt Tumorimmunologie
Abt. Immungenetik
Im Neuenheimer Feld 280 LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10 2 von der unten angegebenen
69120 Heidelberg INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name DβUCΞ Cne S Von αer Ps'TERNATION ALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
KrecsforscnungsZentrum zugeteilte EINGANGSNUMMER Anschπtt Schwerpun t Tumorimmunologie DSM 12174
Abt. Immungenetik
Im Neuenheimer Feld 280 Datum der Hinterlegung oder Weiterleirung
1998 - 05 - 14
69120 Heidelberg
III LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 19 9 8 - 05 - geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)' lebensfähig
( ) nicht menr leoenstahis
IV BEDINGUNGEN UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTURJEN GmbH betuεtcn Person(en) oαer des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb
-7 D-3812 Brauπschweiε ■ — u cχ ^-^*- -
Darum 19 9 8 - 0 5 - 1
Angabe des Datums der Ersthintcrleεung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitunε vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oαer Weiterleirung
In den in Regel 102 Buchstabe a Ziffer n unα m vorgesehenen Fällen Angabe αer letzten Lebenstahigkettsprutung
Zutreffendes ankreuzen
Ausfüllen, wenn die Angaben beamraet worαen sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
.ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Deutsches
Krebsforschungszenti m
Schwerpunkt Tumorimmunologie
Abt. Immungenetik
Im Neuenheimer Feld 280 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 I von der unten angegebenen
69120 Heidelberg INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeicnen Von der INTERNATIONALEN HrNTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER DEDD
DSM 12174
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeicnneten Mikroorganismus wurαe
(X ) eine wissenschaftliche BeschreiDuπg
( ) eine vorgeschlagene taxonomiscne Bezeicnnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen i
III. EINGANG UND .ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeicnneten Mikroorganismus an. der bei ihr am 1 9 9 8 - 0 : _ 4 (Datum der Ersthinterlegung)- eingegangen ist
IV. EINGANG DES .ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum αer Erst- himerlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapesier Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags aut Umwandlung)
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπftlenl der zur Vertretung αer internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von inr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg 1 b D-58124 Braunschweis Datum. 1998 - 05 - 18
Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft ist dies der Zeitpunkt, zu αem der Status einer intemauonalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
RECOGNΓΠON OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS
FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE
INTERNATIONAL FORM
Deutsches
KrebsforschungsZentrum
Schwerpunkt Tumoπmmunoiogie
Abt. Immungenetik
Im Neuenheimer Feld 280 VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 102 bv the
69120 Heidelberg INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page
I DEPOSITOR II IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Name Deutsches Accession number given b\ the
KrebsforschungsZentrum INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Address Schwerpunkt Tumorimmunologie DSM 12174
Abt. Immungenetik
Im Neuenheimer Feld 280 Date ot the deposit or the transter
1998 - 05 - 14
69120 Heidelberσ
III. VIABILITY STATEMENT
The viabilitv of the microorganism identified under II above was tested on 1998 - 05 - 14 On that date. the saiα microorεanism was
(X)' viaDle
( )' no lonεer viaole
IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED'
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Sιgnarure(s) ot person(s) having the power to represent the
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositare Authoπrv or ot authonzed officιal(s)
Address Mascheroder Weg lb D 8124 Braunschweiε ~J> ι •^t* ~
Date. 1998 - 05 - 15
Indicate the date of original deposit or. where a new deposit or a transter has been made. the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transter)
In the cases referreα to in Rule 10 2(a) (n) and (in), reter to the most recent viaoilitv tcst
Mark wuh a cross die applicable box
Fill in if the Information has been requested and if the results of the test were negative BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS
FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE
INTERNATIONAL FORM
Deutsches
KreßsforscnungsZentrum
Schwerpun t Tumorimmunologie
Abt. Immungenetik
Im Neuenneimer Feld 280 RECEIPT IN THE CASE OF ΛN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7 1 bv the
69120 Heidelberg INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bortom ot this paεe
I IDENTIFICATION OF THE VQCROORGANISM
Identification reierence given bv the DEPOSITOR Accession number εiven bv the INTERNATIONAL DEPOSITAR**! AUTHORITY DEDD
DS 12174
II SCIENTIFIC DESCRΓPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I above was accompamed bv
(X ) a scieπtific descπption
( ) a proposed taxonomic αesiεnation
(Mark witn a cross where apphcable)
III RECEIPT AND ACCEPTANCE
This International Depositar*. Authontv accepts the microoreanism identified under I aoove uhich was receiveα b\ ιt on 19 9 8 - 05 - 14 (Date ot the original deposit)1
IV RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorεanism identified under I above was received bv this International Depositarv Authontv on (date of original deposit) and a request to conveπ the original deposit to a deposit under the Budapest Trearv was received bv it on (date of receφt ot request for conversion)
V INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Sιgnature(s) of person(s) having the powcr to rcpresem the
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositarv Authontv or of authonzed officιal(s)
Address Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Date 1998 - 05 - 18
Where Rule 64 (d) app es. such date is the date on which the Status of international depositarv authontv was acquired

Claims

Patentansprüche
1. Protein, geeignet zur Regulation von Apoptose, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1A oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert.
2. Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuren 1 - 114 von Fig. 1A.
3. Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuren 109 - 318 von Fig. 1A.
4. DNA, kodierend für das Protein nach Anspruch 1, umfassend: (a) Die DNA von Fig. 1A oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1A hybridisiert, oder (b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
5. DNA nach Anspruch 4, wobei die DNA die Basenpaare 28 - 369 von Fig. 1A umfaßt.
6. DNA nach Anspruch 4, wobei die DNA die Basenpaare 352 - 981 von Fig. 1A umfaßt.
7. DNA nach Anspruch 4, wobei die DNA jene von Fig. 1B ist.
8. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 4-7.
9. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 8.
10. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 9 unter geeigneten Bedingungen.
11. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach einem der Ansprüche 1- 3.
12. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1-3 oder einer DNA nach einem der Ansprüche 4-7 zur Regulation von Apoptose bzw. deren diagnostischer Erfassung.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Regulation von Apoptose bei Erkrankungen erfolgt.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Erkrankungen solche des Immunsystems, wie AIDS, oder Tumorerkrankungen umfassen.
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