DE19650758C1 - PKD1-Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1-spezifische Antikörper - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft PKD1-Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1-spezifische Antikörper, solche Fragmente codierende DNA und ein Ver­ fahren zur Herstellung solcher Fragmente. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Fragmente und der DNA sowie gegen die Fragmente gerichtete Antikörper.

PKD1 (Polycystin) ist ein Protein mit 4302 Aminosäuren und einem Molekularge­ wicht von etwa 460 kDa. PKD1 wird in veränderter Form bzw. Menge für die autosomal dominant vererbte polycystische Nierendegeneration verantwortlich gemacht. Bisher stehen keine ausreichenden Möglichkeiten zur Verfügung, diese Erkrankung nachzuweisen und frühzeitig therapeutische Maßnahmen zu er­ greifen, bevor es zum akuten Nierenversagen kommt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem frühzeitig polycystische Nierendegeneration diagnostisch erfaßt und gegebenenfalls therapiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit PKD1-Fragmente, die Bin­ dungsregionen für PKD1-spezifische Antikörper aufweisen. Solche Fragmente werden nachstehend mit PKD1-Fragmente bezeichnet. Vorzugsweise weisen die PKD1-Fragmente die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361-540, 480-700, 541-840, 700-1100, 1011-1220, 2161-2370, 2723-2931, 2850-3000, 2932-3067, 3100-3280, 3200-3400, 3311-3603 und 4090-4302 von PKD1 auf.

Zur Herstellung von PKD1-Fragmenten können übliche Verfahren verwendet werden. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren angewendet, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD1 verteilt Fragmente konstruiert, wobei jeweils mindestens zwei Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem PKD1-spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebun­ denen Bereich identifiziert und das PKD1-Fragment bereitstellt sowie dieses ggfs. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung obigen Zyklus ver­ wendet.

Der Ausdruck PKD1 umfaßt ein PKD1-Protein mit Wildtyp-Sequenz (vgl. Hughes, J. et al., Nature Genetics, 10, (1995), 151-160; Genbank Accession Nr. L33243). PKD1 kann auch eine von der Wildtyp-Sequenz abweichende Sequenz haben. Eine solche kann Additionen, Deletionen, Inversionen und/oder Sub­ stitutionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen. Insbesondere kann eine von der Wildtyp-Sequenz abweichende Sequenz eine solche sein, die man bei einem veränderten, für polycystische Nierendegneration verantwortlichen PKD1 findet.

Zur Herstellung von PKD1-Fragmenten kann RNA aus verschiedensten Zellen, z. B. HELA, HepG2 oder Hy 145.19, isoliert, revers transkribiert und die erhalte­ ne cDNA in einem PCR-Verfahren amplifiziert werden. Für letzteres Verfahren können PKD1-spezifische Primer verwendet werden. Hierzu kann die bekannte PKD1-Sequenz als Vorlage dienen (vgl. Hughes, J. et al. vorstehend). Ferner kann diese Sequenz auch als Vergleich für die erhaltene, amplifizierte cDNA verwendet werden. Über die Gesamtlänge dieser cDNA verteilt können dann DNA-Fragmente in einem PCR-Verfahren amplifiziert werden. Für die Auswahl der Primer kann ebenfalls vorstehende PKD1-Sequenz verwendet werden. Die erhaltenen, amplifizierten DNA-Fragmente können in Expressionsvektoren inse­ riert und exprimiert werden. Als Expressionsvektor ist z. B. pQE-8 zu nennen. Dieser kann zur Transformation des Bakterienstammes SG 13009 verwendet werden (vgl. Gottesmann S. et al., J. Bacteriol. 148 (1981), 265-273). Die erhaltenen, exprimierten Fragmente von PKD1 können isoliert und einer Poly­ acrylamid-Gelektrophorese unterzogen werden. Dieser kann eine Westernblot-Ana­ lyse folgen, worin markierte, bekannte PKD1-spezifische Antikörper zur Bindung an die Fragmente eingesetzt werden (vgl. Hughes, J. et al., vorste­ hend). Durch Bindung eines dieser Antikörper an zwei einen überlappenden Bereich aufweisende Fragmente kann die Bindungsregion des Antikörpers dem überlappenden Bereich zugewiesen werden. Dieser Bereich wird mit PKD1-Frag­ ment bezeichnet. Ferner kann er Basis für eine ein- oder mehrfache Wie­ derholung vorstehenden Zyklus sein, wodurch die Bindungsregion des PKD1-spe­ zifischen Antikörpers weiter eingegrenzt werden kann. Die Bindungsregion kann bis auf wenige Aminosäuren eingegrenzt werden. Die hierzu u. U. notwendi­ gen kurzen PKD1-Fragmente können synthetisch hergestellt werden. Dem Fachmann sind die vorstehenden Verfahren und die zu ihrer Durchführung notwendigen Materialien und Bedingungen bekannt.

Erfindungsgemäß werden auch die für PKD1-Fragmente codierenden Nukleinsäu­ ren, insbesondere DNA, bereitgestellt. Vorzugsweise umfassen diese Nukleinsäu­ ren, insbesondere DNA, die für die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361-540, 480-700, 541-840, 700-1100, 1011-1220, 2161-2370, 2723-2931, 2850-3000, 2932-3067, 3100-3280, 3200-3400, 3311-3603, 4090-4302 codieren­ den Nukleotide. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren werden nachstehend bei­ spielhaft als DNA beschrieben.

Eine erfindungsgemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vor­ liegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expres­ sionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pet3d und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionspolypep­ tids exprimiert werden kann.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans­ fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Polypeptid zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Polypeptid, das auch ein Fusionspolypeptid sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen­ des Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona­ len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)polypeptid zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)polypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, polycystische Nierendegeneration frühzeitig zu diagnostizieren. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann verändertes PKD1, d. h. PKD1 in veränderter Form bzw. Menge, in Körperflüssig­ keiten von Personen nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von ver­ ändertem PKD1 zur Entstehung und Ausbildung vorstehender Erkrankung herge­ stellt werden. Ferner kann mit erfindungsgemäßen PKD1-Fragmenten ein gegen verändertes PKD1 gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Expression des für PKD1 kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbeson­ dere in einem Southern oder Northern Blot, erfolgen.

Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen gegen das Vorliegen von verändertem PKD1 in Personen zu ergreifen. Mit einem erfin­ dungsgemäßen Antikörper kann ein solches PKD1 in Personen inhibiert werden. Auch kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, zur Inhibierung von verändertem PKD1 genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäu­ re, z. B. als Basis für die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expres­ sions-Inhibierung des für das veränderte PKD1 kodierenden Gens verwendet.

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein Kit bereitge­ stellt. Dieser enthält ein oder mehrere PKD1-Fragmente und/oder die für sie codierenden DNAs. Insbesondere umfaßt er solche PKD1-Fragmente und/oder DNAs, die vorstehend als bevorzugt genannt sind. Ferner enthält der Kit übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen. Der Kit ist eben­ falls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen PKD1-Frag­ mentes

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen PKD1-Fragmentes wurde RNA aus Hy 145.19-Zellen isoliert und revers transkribiert. Die erhaltene cDNA wurde einem PCR-Verfahren unterworfen, in dem PKD1-spezifische Primer verwendet wurden (vgl. Hughes, J. et al, vorstehend). Es wurde eine amplifizierte cDNA für PKD1 erhalten. Diese wurde durch Vergleich mit der bekannten Sequenz von PKD1 bestätigt (vgl. Hughes, J. et al., vorstehend).

Vorstehende amplifizierte cDNA wurde als Template verwendet, um ein erfin­ dungsgemäßes PKD1-Fragment, nämlich jenes, das die Aminosäuren 26-270 von PKD1 umfaßt, bereitzustellen. Hierzu wurde ein PCR-Verfahren durchge­ führt, für das die Primer PK1 + 5′-CAGGGATCCATGCCCGGGCGCGGCTGCG-3′ und PK1- 5′-GGGAAGCTTATCAAGGGAAGACGTGCTGGAGG-3′ verwendet wurden. Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

PCR-Ansatz

Template DNA: 1 µl = 1 ng
Pfu-Polymerase 10x-Puffer: 10 µl = 1 x
DMSO: 10 µl = 10%
dNTP′s: 1 µL = je 200 µM
Oligonukleotide, je 1,5 µl: 3 µl = je 150 ng
H₂O-bidest: ad 99 µl

PCR-Bedingungen

• - 92°C - 5 min
• - Zugabe von µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
• - Zugabe von Paraffin

PCR

92°C 1 min
58°C 1 min 1 Zyklus
72°C 10 min
92°C 1 min
58°C 1 min 39 Zyklen
72°C 2 min
72°C 10 min 1 Zyklus

Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und HindIII gespalten und in den mit BamHI und HindIII gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pQE-8-PK1 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusions­ polypeptid aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und einem erfindungs­ gemäßen PKD1-Fragment (C-Terminuspartner). pQE-8-PK1 wurde zur Trans­ formation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., vorstehend) verwen­ det. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100 µm/ml Ampicillin und 25 µm/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra­ nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromato­ graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionspolypeptid wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionspolypeptid einer 18% SDS-Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)polypeptid in hoch reiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 2 Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 18% SDS-Po­ lyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 28 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen­ tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionspolypeptid wurden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung wurden 50 µg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem oder inkomplettem Freund′s Adjuvans bzw. PBS eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gel­ elektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei RT mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10 000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit TBST wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 60-minütiger Inkubation bei RT folgten mehrere Waschschritte mit TBST und an­ schließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5′ Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung wurden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb- wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung wurden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0,125 ml PBS und 0,125 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund′s Adju­ vans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionspolypeptid in 0,25 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund′s Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund′s Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs­ gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims (11)

1. PKD1-Fragment mit Bindungsregion für PKD1-spezifischen Antikörper, erhältlich durch ein Verfahren, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD1 verteilt Fragmente in üblicher Weise konstruiert, wobei jeweils min­ destens 2 Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Frag­ mente mit einem PKD1-spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und als eingangs definiertes Fragment in üblicher Weise bereitstellt.

2. PKD1-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Frag­ ment als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung des Zyklus ver­ wendet wird.

3. PKD1-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361-540, 480-700, 541-840, 700-1100, 1011-1220, 2161-2370, 2723-2931, 2850-3000, 2932-3067, 3100-3280, 3200-3400, 3311-3603 und 4090-4302 umfaßt.

4. DNA eines PKD1-Fragments nach Anspruch 1.

5. DNA eines PKD1-Fragments nach Anspruch 3.

6. Verfahren zur Herstellung eines PKD1-Fragments nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD1 verteilt Fragmente in üblicher Weise konstruiert, wobei jeweils mindestens 2 Fragmente einen überlappen­ den Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem PKD1-spezifischen Anti­ körper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebun­ denen Bereich identifiziert und als eingangs definiertes Fragment in üblicher Weise bereitstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung des Zyklus verwendet wird.

8. Antikörper, gerichtet gegen das PKD1-Fragment nach Anspruch 1 oder 3.

9. Verwendung des PKD1-Fragments nach Anspruch 1 oder 3 als Reagens zur Diagnose von polycystischer Nierendegeneration.

10. Verwendung der DNA nach Anspruch 4 oder 5 als Reagens zur Diagnose von polycystischer Nierendegeneration.

11. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 8 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von polycystischer Nierendegeneration.