WO1998024894A2 - Pkd1-fragmente mit bindungsregionen für pkd1-spezifische antikörper - Google Patents

Pkd1-fragmente mit bindungsregionen für pkd1-spezifische antikörper Download PDF

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WO1998024894A2
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dna
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Iris Velhagen
Regina Martens
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to PKD1 fragments with binding regions for PKD1 -specific antibodies, DNA encoding such fragments and a method for producing such fragments.
  • the invention further relates to the use of the fragments and the DNA as well as antibodies directed against the fragments.
  • PKD1 polycystine
  • PKD1 is a protein with 4302 amino acids and a molecular weight of approximately 460 kDa. PKD1 is blamed for the autosomal dominant inheritance of polycystic kidney degeneration in modified form or quantity. So far there are not enough options available
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means with which polycystic kidney degeneration can be diagnosed at an early stage and optionally treated.
  • the present invention thus relates to PKD1 fragments which have binding regions for PKD1 -specific antibodies. Such fragments are referred to below as PKD1 fragments.
  • the PKD1 fragments preferably have the amino acids 26-270, 26-480, 361 -540, 480-700, 541 - 840, 700-1 1 00, 1 01 1 -1 220, 21 61 -2370, 2723-2931, 2850-3000, 3100-
  • a method is favorable in which fragments are distributed over the total length of PKD1, at least two fragments each being one have an overlapping area, which allows fragments to react with a PKD 1 -specific antibody and identifies the overlapping area bound by the antibody and provides the PKD1 fragment and, if appropriate, uses this as a basis for one or more repetitions of the above cycle.
  • PKD1 comprises a PKD 1 protein with a wild-type sequence (cf. Hughes, J. et al., Nature Genetics, 1 0, (1 995), 1 51 -1 60; Genbank Accession No. L33243).
  • PKD 1 can also have a different sequence from the wild-type sequence. Such may have additions, deletions, inversions and / or substitutions of one or more amino acids.
  • a sequence that deviates from the wild-type sequence can be one that is found in a modified PKD1 that is responsible for polycystic kidney regeneration.
  • RNA can be isolated from a wide variety of cells, for example HELA, HepG2 or Hy 145.1 9, reverse transcribed and the cDNA obtained can be amplified in a PCR method.
  • PKD 1 -specific primers can be used for the latter method.
  • the known PKD 1 sequence can serve as a template for this (see Hughes, J. et al. Above). Furthermore, this sequence can also be used as a comparison for the amplified cDNA obtained. DNA fragments can then be amplified over the entire length of this cDNA in a PCR method.
  • the above PKD1 sequence can also be used for the selection of the primers.
  • the amplified DNA fragments obtained can be inserted and expressed in expression vectors.
  • PKD 1 may be mentioned as the expression vector.
  • This can be used to transform the bacterial strain SG 1 3009 (see. Gottesmann et al., J. Bacteriol. 148 (1 981), 265-273).
  • the resulting, expressed fragments of PKD 1 can be isolated and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. This can be followed by a Western blot analysis, in which labeled, known PKD 1 -specific antibodies are used for binding to the fragments (cf. Hughes, J. et al., Above). By If one of these antibodies binds to two fragments that have an overlapping region, the binding region of the antibody can be assigned to the overlapping region. This area is called PKD 1 fragment.
  • the binding region of the PKD1 -specific antibody can be further narrowed.
  • the binding region can be limited to a few amino acids.
  • the short PKD1 fragments that may be necessary for this can be produced synthetically.
  • nucleic acids coding for PKD1 fragments, in particular DNA are also provided.
  • These nucleic acids, in particular DNA preferably comprise those for the amino acids 26-270, 26-480, 361 -540, 480-700, 541 -840, 101 1 -1 220, 21 61 -2370, 2723-2931, 2720-3060 , 2850-
  • nucleic acids according to the invention are described below by way of example as DNA.
  • a DNA according to the invention can be present in a vector or expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pet3d and pQE-8, the latter being preferred.
  • yeast e.g. to call pY100 and Ycpad l
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for insect cells.
  • suitable cells for expressing a DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH 1, x1 776, JM 101, JM 109, BL21 and
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in connection with a DNA coding for another polypeptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion polypeptide.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above polypeptide or fusion polypeptide.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) polypeptide. The animals can be boosted further using the same (fusion) polypeptide. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • modified PKD1, ie PKD1 in changed form or amount can be detected in body fluids of people.
  • a relationship between altered PKD1 and the development and development of the above disease can be established.
  • PKD1 fragments according to the invention a counter modified PKD 1 directed autoantibodies can be detected. Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, an immunoprecipitation or by immunofluorescence.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA and primers derived therefrom, the expression of the coding for PKD 1 can
  • Gene can be detected. This detection can be done in the usual way, especially in a Southern or Northern blot.
  • the present invention is suitable for taking measures against the presence of modified PKD1 in people.
  • modified PKD1 can be inhibited in people with an antibody according to the invention.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA, can also be used to inhibit modified PKD1.
  • the nucleic acid e.g. used as the basis for the creation of anti-sense oligonucleotides for the expression inhibition of the gene coding for the modified PKD 1.
  • a kit is also provided for carrying out the present invention.
  • This contains one or more PKD1 fragments and / or the DNAs coding for them.
  • it comprises those PKD1 fragments and / or DNAs which are mentioned as preferred above.
  • the kit also includes the usual ones
  • Excipients such as carriers, buffers, solvents and controls.
  • the kit is also the subject of the present invention.
  • Example 1 Production and purification of a PKD 1 fragment according to the invention
  • the above amplified cDNA was used as a template to provide a PKD1 fragment according to the invention, namely that comprising the amino acids 26-270 of PKD1.
  • a PCR method was carried out, for which the primers PK1 + 5'-CAGGGATCCATGCCCGGGCGCGGCTGCG-3 'and PK1 - 5'-GGGAAGCTTATCAAGGGAAGACGTGCTGGAGG-3' were used.
  • the PCR approach and the PCR conditions were as follows:
  • Oligonucleotides, 1, 5 ⁇ l 3 / vl 1 50 ng H 2 O bidest ad 99 / I each
  • the amplified DNA was digested with BamHI and HindIII and inserted into the expression vector pQE-8 digested with BamHI and HindIII.
  • the expression plasmid pQE-8-PK1 was obtained.
  • pQE-8-PK1 was used to transform E.coli SG 1 3009 (see Gottesmann, S. et al., supra).
  • the bacteria were cultivated in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 25 ⁇ g / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 // M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG). A 6 M guanidine hydrochloride was added
  • Lysis of the bacteria was achieved, then chromatography (Ni-NTA resin) was carried out with the lysate in the presence of 8 M urea in accordance with the manufacturer's (Diagen) instructions for the chromatography material.
  • the bound fusion polypeptide was eluted in a pH 3.5 buffer. After neutralization, the fusion polypeptide was subjected to an 18% SDS
  • Example 2 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 was subjected to 1 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 sts
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • a fusion polypeptide according to the invention from Example 1 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • This antibody was a goat anti-rabbit IgG (Dianova) monoclonal monoclonal antibody coupled to alkaline phosphatase (1: 5000) in PBS. After incubation at RT for 60 minutes, there were several washing steps with TBST and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium,
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft PKD1-Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1-spezifische Antikörper, solche Fragmente codierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung solcher Fragmente. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Fragmente und der DNA sowie gegen die Fragmente gerichtete Antikörper.

Description

PKD1 -Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1 -spezifische Antikörper
Die vorliegende Erfindung betrifft PKD1 -Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1 -spezifische Antikörper, solche Fragmente codierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung solcher Fragmente. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Fragmente und der DNA sowie gegen die Fragmente gerichtete Antikörper.
PKD1 (Polycystin) ist ein Protein mit 4302 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 460 kDa. PKD1 wird in veränderter Form bzw. Menge für die autosomal dominant vererbte polycystische Nierendegeneration verantwortlich gemacht. Bisher stehen keine ausreichenden Möglichkeiten zur Verfügung, diese
Erkrankung nachzuweisen und frühzeitig therapeutische Maßnahmen zu ergreifen, bevor es zum akuten Nierenversagen kommt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu- stellen, mit dem frühzeitig polycystische Nierendegeneration diagnostisch erfaßt und gegebenenfalls therapiert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit PKD1 -Fragmente, die Bindungsregionen für PKD1 -spezifische Antikörper aufweisen. Solche Fragmente werden nachstehend mit PKD1 -Fragmente bezeichnet. Vorzugsweise weisen die PKD1 -Fragmente die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361 -540, 480-700, 541 - 840, 700-1 1 00, 1 01 1 -1 220, 21 61 -2370, 2723-2931 , 2850-3000, 3100-
3280, 3200-3400, 331 1 -3603 und 4090-4302 von PKD 1 auf.
Zur Herstellung von PKD1 -Fragmenten können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist ein Verfahren, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD1 verteilt Fragmente konstruiert, wobei jeweils mindestens zwei Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem PKD 1 -spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und das PKD1 -Fragment bereitstellt sowie dieses ggfs. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung obigen Zyklus ver- wendet.
Der Ausdruck PKD1 umfaßt ein PKD 1 -Protein mit Wildtyp-Sequenz (vgl. Hughes, J. et al., Nature Genetics, 1 0, ( 1 995), 1 51 -1 60; Genbank Accession Nr. L33243) . PKD 1 kann auch eine von der Wildtyp-Sequenz abweichende Sequenz haben. Eine solche kann Additionen, Deletionen, Inversionen und/oder Substitutionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen. Insbesondere kann eine von der Wildtyp-Sequenz abweichende Sequenz eine solche sein, die man bei einem veränderten, für polycystische Nierendegneration erantwortlichen PKD1 findet.
Zur Herstellung von PKD1 -Fragmenten kann RNA aus verschiedensten Zellen, z.B. HELA, HepG2 oder Hy 145.1 9, isoliert, revers transkribiert und die erhaltene cDNA in einem PCR-Verfahren amplifiziert werden. Für letzteres Verfahren können PKD 1 -spezifische Primer verwendet werden. Hierzu kann die bekannte PKD 1 -Sequenz als Vorlage dienen (vgl. Hughes, J. et al. vorstehend) . Ferner kann diese Sequenz auch als Vergleich für die erhaltene, amplifizierte cDNA verwendet werden. Über die Gesamtlänge dieser cDNA verteilt können dann DNA-Fragmente in einem PCR-Verfahren amplifiziert werden. Für die Auswahl der Primer kann ebenfalls vorstehende PKD1 -Sequenz verwendet werden. Die erhaltenen, amplifizierten DNA-Fragmente können in Expressionsvektoren inseriert und exprimiert werden. Als Expressionsvektor ist z.B. pQE-8 zu nennen. Dieser kann zur Transformation des Bakterienstammes SG 1 3009 verwendet werden (vgl. Gottesmann et al., J. Bacteriol. 148 ( 1 981 ), 265-273). Die erhaltenen, exprimierten Fragmente von PKD 1 können isoliert und einer Polyacrylamid- Gelektrophorese unterzogen werden. Dieser kann eine Westernblot-Analyse folgen, worin markierte, bekannte PKD 1 -spezifische Antikörper zur Bindung an die Fragmente eingesetzt werden (vgl. Hughes, J. et al., vorstehend) . Durch Bindung eines dieser Antikörper an zwei einen überlappenden Bereich aufweisende Fragmente kann die Bindungsregion des Antikörpers dem überlappenden Bereich zugewiesen werden. Dieser Bereich wird mit PKD 1 -Fragment bezeichnet. Ferner kann er Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung vorstehenden Zyklus sein, wodurch die Bindungsregion des PKD1 -spezifischen Antikörpers weiter eingegrenzt werden kann. Die Bindungsregion kann bis auf wenige Aminosäuren eingegrenzt werden. Die hierzu u.U. notwendigen kurzen PKD1 - Fragmente können synthetisch hergestellt werden. Dem Fachmann sind die vorstehenden Verfahren und die zu ihrer Durchführung notwendigen Materialien und Bedingungen bekannt.
Erfindungsgemäß werden auch die für PKD1 -Fragmente codierenden Nukleinsäuren, insbesondere DNA, bereitgestellt. Vorzugsweise umfassen diese Nukleinsäuren, insbesondere DNA, die für die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361 -540, 480-700, 541 -840, 101 1 -1 220, 21 61 -2370, 2723-2931 , 2720-3060, 2850-
3000, 2932-3067, 31 00-3280, 3200-3400, 331 1 -3603, 4090-4302 codierenden Nukleotide. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren werden nachstehend beispielhaft als DNA beschrieben.
Eine erfindunggemäße DNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pet3d und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpad l zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in
Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH 1 , x1 776, JM 101 , JM 109, BL21 und
SG 1 3009 und BL21 , wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharo- myces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionspolypep- tids exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans- fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Polypeptid zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Polypeptid, das auch ein Fusionspolypeptid sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)polypeptid zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)polypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, polycystische Nierendegeneration frühzeitig zu diagnostizieren. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann verändertes PKD1 , d.h. PKD1 in veränderter Form bzw. Menge, in Körperflüssig- keiten von Personen nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von verändertem PKD1 zur Entstehung und Ausbildung vorstehender Erkrankung hergestellt werden. Ferner kann mit erfindungsgemäßen PKD1 -Fragmenten ein gegen verändertes PKD 1 gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Expression des für PKD 1 kodierenden
Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher weise, insbesondere in einem Southern oder Northern Blot, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen gegen das Vorliegen von verändertem PKD1 in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann ein solches PKD1 in Personen inhibiert werden. Auch kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, zur Inhibierung von verändertem PKD1 genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z.B. als Basis für die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expres- sions-lnhibierung des für das veränderte PKD 1 kodierenden Gens verwendet.
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein Kit bereitgestellt. Dieser enthält ein oder mehrere PKD1 -Fragmente und/oder die für sie codierenden DNAs. Insbesondere umfaßt er solche PKD1 -Fragmente und/oder DNAs, die vorstehend als bevorzugt genannt sind. Ferner enthält der Kit übliche
Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen. Der Kit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen PKD 1 -Fragmentes
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen PKD 1 -Fragmentes wurde RNA aus Hy
145.1 9-Zellen isoliert und revers transkribiert. Die erhaltene cDNA wurde einem PCR-Verfahren unterworfen, in dem PKD1 -spezifische Primer verwendet wurden (vgl. Hughes, J. et al, vorstehend) . Es wurde eine amplifizierte cDNA für PKD1 erhalten. Diese wurde durch Vergleich mit der bekannten Sequenz von PKD1 bestätigt (vgl. Hughes, J. et al., vorstehend).
Vorstehende amplifizierte cDNA wurde als Template verwendet, um ein erfindungsgemäßes PKD1 -Fragment, nämlich jenes, das die Aminosäuren 26-270 von PKD1 umfaßt, bereitzustellen. Hierzu wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt, für das die Primer PK1 + 5'-CAGGGATCCATGCCCGGGCGCGGCTGCG-3' und PK1 - 5'-GGGAAGCTTATCAAGGGAAGACGTGCTGGAGG-3' verwendet wurden. Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
PCR-Ansatz
Template DNA : λμ\ = 1 ng
Pfu-Polymerase 1 0x-Puffer 10/yl = 1 x DMSO 10μ\ = 10 % dNTP's 1 L = je 200 /M
Oligonukleotide, je 1 ,5μl 3/vl = je 1 50 ng H2O-bidest ad 99/ I
PCR-Bedingungen
- 92°C - 5 min
- Zugabe von 1μl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
- Zugabe von Paraffin
PCR
92°C 1 min
58°C 1 min 1 Zyklus
72°C 1 0 min 92°C 1 min 58°C 1 min 39 Zyklen
72°C 2 min 72°C 1 0 min 1 Zyklus Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und Hindlll gespalten und in den mit BamHI und Hindlll gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pQE-8-PK1 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusions- polypeptid aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und einem erfindungsgemäßen PKD1 -Fragment (C-Terminuspartner). pQE-8-PK1 wurde zur Transformation von E.coli SG 1 3009 (vgl. Gottesmann, S. et al., vorstehend) verwendet. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin und 25μg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60//M Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyra- nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine
Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionspolypeptid wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionspolypeptid einer 1 8 % SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophoreseunterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 1 49 ( 1 975), 709-733).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)poiypeptid in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 2: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 1 8 % SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M
Natriumacetat wurde eine ca. 28 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen- tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionspolypeptid wurden Tiere wie folgt immunisiert: Immunisierungsprotokoil für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 50μg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem oder inkomplettem Freund's Adjuvans bzw. PBS eingesetzt. Tag O: 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (PBS) Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die
Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, ( 1 994), 21 5-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei RT mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens ( 1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit TBST wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert.
Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) ( 1 :5000) in PBS. Nach 60- minütiger Inkubation bei RT folgten mehrere Waschschritte mit TBST und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium,
100mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können. Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 40μg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 1 2μg Gel-gereinigtes Fusionspolypeptid von Beispiel 1 in 0, 1 25 ml PBS und 0, 1 25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionspolypeptid in 0,25 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1 . PKD1 -Fragment mit Bindungsregion für PKD 1 spezifischen Antikörper, erhältlich durch ein Verfahren, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD 1 verteilt Fragmente in üblicher Weise konstruiert, wobei jeweils mindestens 2 Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem PKD 1 -spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und als eingangs definiertes Fragment in üblicher Weise bereitstellt sowie dieses ggfs. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung des
Zyklus verwendet.
2. PKD1 -Fragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 26-270, 26-480, 361 -540, 480-700, 541 -840, 700- 1 100, 101 1 -1 220, 21 61 -2370, 2723-2931 , 2850-3000, 2932-3067,
3100-3280, 3200-3400, 331 1 -3603 und 4090-4302 umfaßt.
3. DNA eines PKD 1 -Fragments nach Anspruch 1 .
4. DNA eines PKD 1 -Fragments nach Anspruch 2.
5. Verfahren zur Herstellung eines PKD1 -Fragments nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man über die Gesamtlänge von PKD 1 verteilt Fragmente in üblicher Weise konstruiert, wobei jeweils mindestens 2 Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem PKD1 -spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und als eingangs definiertes Fragment in üblicher Weise bereitstellt sowie dieses ggfs. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung des Zyklus verwendet.
Antikörper, gerichtet gegen das PKD1 -Fragment nach Anspruch 1 oder 2.
7. Verwendung des PKD 1 -Fragments nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose von polycystischer Nierendegeneration.
8. Verwendung der DNA nach Anspruch 3 oder 4 als Reagens zur Diagnose von polycystischer Nierendegeneration.
9. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 3 oder 4 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von polycystischer Nierendegeneration.
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