DE19835910C1 - Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17 - Google Patents

Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die die Information für ein menschliches Gen, das auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 isoliert worden ist, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthaltende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die die Information für ein menschliches Gen, das auf dem kurzen Arm von Chromsom 17 isoliert worden ist, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthal­ tende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arznei­ mittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA- Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper.
Das Smith-Magenis-Syndrom (SMS) ist eine multiple kongenitale Anomalie. Die davon betroffenen Patienten leiden an einer mentalen Retardierung, Größen­ wachstumsstörungen, Abnormalitäten der REM-Schlafphase und einem ab­ normalen Verhalten (Hamill et al., Ann. Gent. 31, S. 36-38 (1990)). Es wurde inzwischen herausgefunden, daß SMS auf einer internen Deletion/Mutation in der p11.2-Region von Chromsom 17 beruht. Generell wurde herausgefunden, daß auch andere Mutationen in dieser Region zu neurodegenerativen Erkrankun­ gen führen, die teilweise von den oben genannten Symptomen begleitet sind.
Da die Gene in dieser Region noch nicht vollständig bekannt sind, konnten die molekularen Mechanismen, die zu obigen Smptomen, insbesondere in Verbin­ dung mit Smith Magenis Syndrom führen, noch nicht aufgeklärt werden.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, die molekularen Grundlagen zu schaffen, um neurodegenerative Erkrankungen, die verglichen mit dem Smith Magenis Syndrom ähnliche oder gleiche Symptome hervorrufen, aufzuklären sowie eine geeignete Diagnostik und/oder Therapie dafür bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Es konnte ein DNA-Molekül isoliert und identifiziert werden, das in Zusammenhang mit SMS steht.
Die Identifizierung eines Gens (HSGT1), das bei seiner teilweisen oder vollständi­ gen Deletion mit SMS in Verbindung steht, ist von Interesse, da dies einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der SMS und somit verbes­ serter Therapien gewährleistet. Parallel dazu bildet die Klonierung des SMS-Gens die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünftig eine zuver­ lässigere und frühzeitige Diagnose bei Betroffenen zu gewährleisten. Darüberhin­ aus werden funktionelle Analysen des Proteins zweifellos zum Verständnis der Neuronenentwicklung beitragen, da das Gen in einer Region im Genom liegt (humanes Chromosom 17p11.2; s. Fig. 4), die mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen assoziiert ist. Es ist somit als ein Kandidatengen für Untersuchun­ gen der Pathomechanismen anzusehen, die neurodegenerativen Krankheiten und entwicklungsbedingten Störungen der Differenzierung des Zentralnervensystems zugrunde liegen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül (HSGT1), die folgendes umfaßt:
  • a) die Nukleinsäure von Fig. 1, oder eine hiervon durch ein oder meh­ rere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
  • b) eine mit der Nucleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
  • c) eine mit der Nucleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle codieren für Proteine, Polypeptide oder Peptide, die mindestens noch eine der nachstehend beschrie­ benen biologischen Aktivitäten des von der Nukleinsäure gemäß Fig. 1 codierten Proteins aufweisen, beispielsweise als Differenzierungsfaktor bei der Neuronen­ entwicklung und/oder Intermediärfilament in Neuronen, oder dessen Verände­ rung oder Ausfall zu SMS führt oder führen kann.
Die unter (a) definierten DNA-Moleküle umfassen auch DNA-Moleküle, die sich gegenüber der in Fig. 1 angegebenen Sequenz durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen, z. B. alternatives Splicing, unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Moleküle codierte Protein noch eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen biologischen Aktivitäten aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispiels­ weise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fach­ mann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über eine der biologischen Aktivitä­ ten von HSGT1 verfügt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß unter­ sucht wird, ob in Zellkulturmodellen das veränderte Protein die gleichen Funktio­ nen übernimmt wie das Wildtyp-HSGT1-Protein.
Der Begriff "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs­ bedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., supra). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al ., supra, beschrieben sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül eine cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA- Molekül eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispiels­ weise einem Menschen stammt. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genom­ ischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischen DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Fig. 1 angegebene Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten. Anhand der genomischen DNA, beispielsweise aus einem Menschen, können weitere Mutationen identifi­ ziert werden, die an der Entstehung von neurodegnerativen Erkrankungen, insbesondere SMS, beteiligt sind, beispielsweise Mutationen, die zu Aminosäu­ renaustauschen, zur Hemmung das Spleißens oder zu fehlerhaftem Spleißen führen.
Interessanterweise wurde im HSGT1-Gen ein Polymorphismus gefunden, der sich in der Protein-kodierenden Region des Gens befindet und für eine Polygluta­ minanhäufung codiert, d. h. es kommt eine variable Wiederholung der Sequenz CAG (vgl. Fig. 1) vor. Polyglutaminanhäufungen sind bereits in verschiedenen Genen in Zusammenhang mit neuropathologischen Erkrankungen, z. B. Chorea Huntington, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Ex­ pressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate (z. B. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich beson­ ders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phäno­ typische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatori­ schen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukary­ onten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.
Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch T7 basierende Expressions­ vektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56(1987), 125) oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3521).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen DNA- Moleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia- Virus oder ein AAV-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transforma­ tion dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Ein Klon, der für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert, wurde am 31. Juli 1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Hinterlegungs­ nummer DSM 12357 (= E. coli/PSB8.7-I13281) hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch obige Nukleinsäure kodiert wird, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Bio­ chem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993),187; Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Bio­ tech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präpa­ rative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffini­ tätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen (HSGT1) codiertes oder nach dem vor­ stehenden Verfahren erhaltenes Protein. Die Aminosäuresequenz eines solchen Proteins ist in Fig. 2 gezeigt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungsgemäße Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekann­ ten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austau­ sche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Pro­ teins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäu­ re gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Um noch die Funktion eines erfin­ dungsgemäßen Proteins zu erfüllen, sollte auf Aminosäureebene zu der Sequenz von Fig. 2 eine Homologie von mind. 50% vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die das vorstehend beschrie­ bene Protein HSGT1 spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragments davon, beispiels­ weise Fab-, Fv-oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monoclonale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyclonalen und Mäuse für einen monoclona­ len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu­ sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyclonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungs­ gemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren herge­ stellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stam­ menden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf ver­ schiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsver­ fahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend be­ schriebenen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper. Vorzugs­ weise werden diese zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere SMS, ver­ wendet. Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien des erfin­ dungsgemäßen Gens mehr besitzen, ausreichende Mengen des biologisch aktiven Proteins zur Verfügung zu stellen. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn in dem betreffenden Patienten biologisch aktives Protein nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden. Es gibt Hinweise darauf, daß dieses Gen bei der Entstehung von Autismus eine Rolle spielt.
Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arznei­ mittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parente­ rale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, sub­ kutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperito­ neale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, bei­ spielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine diagnostische Zusammensetzung, die das vorstehend beschriebene DNA-Molekül oder den Antikörper enthält oder Kombinationen davon, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Nach­ weismittel.
Das erfindungsgemäße, wie vorstehend definierte DNA-Molekül kann auch als Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein codieren mit einer ebensolchen biologischen Aktivität. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 15 Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern, Metallchelaten, Enzymen etc..
Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von der Sequenz in Fig. 1 abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizieren­ den Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren erlauben auch die Identifizierung weiterer Mutationen, die in Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankun­ gen stehen, wobei die Sequenz eines Patienten mit SMS oder dazu ähnlichen Symptomen mit gesunden Patienten verglichen wird.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere SMS, in vitro, die folgenden Schritte umfassend:
  • - Isolierung von Nucleinsäure aus dem Patienten,
  • - Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
  • - Vergleich der Längen der amplifizierten bzw. hybridisieren­ den Fragmente mit den Längen von Kontrollfragmenten aus dem nichtmutierten HSGT1-Gen, oder
  • - Sequenzierung der amplifizierten Fragmente und Vergleich mit der Sequenz von Kontrollfragmenten aus dem nichtmu­ tierten HSGT1-Gen, wobei Längenunterschiede oder Muta­ tionen, die zu Substitutionen, Deletionen oder Additionen von Aminosäuren oder zu vorzeitiger Termination der Trans­ lation führen, indikativ für neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere SMS, sind.
Alternativ kann die Diagnose auch dadurch erfolgen, daß Lymphoblasten isoliert werden und Metaphase-Präparate hergestellt werden, die einer FISH-Analyse unterworfen werden, um festzustellen, ob bestimmte Bereiche des Genoms überhaupt vorhanden sind.
Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispiels­ weise über "Southern-Blot"; angewandt werden.
Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR oder LCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die erfindungsgemäße Sequenz oder ge­ eignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Am­ plifikationsprodukte von DNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich, beispiels­ weise hinsichtlich ihrer Länge und/oder der Sequenz, von den Amplifikations­ produkten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.
In einer alternativen Ausführungsform kann ein Verfahren angewendet werden, das folgende Schritte umfaßt:
  • - Isolierung von RNA aus dem Patienten,
  • - Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehre­ ren geeigneten Sonden,
  • - Vergleich der Konzentration und/oder Länge HSGT1-mRNA der Patientenprobe mit einer mRNA einer gesunden Person, wobei Längenunterschiede oder das Fehlen bzw. eine gerin­ gere Konzentration der HSGT1-mRNA (beispielsweise be­ dingt durch Mutationen in regulatorischen Sequenzen, die mit der Transkription in Zusammenhang stehen) im Vergleich zur Kontroll-mRNA indikativ für eine neurogenerative Erkran­ kungen, insbesondere für SMS, ist.
Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) + RNA aus biologischen Proben, dar Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann eine mögliche Erkrankung auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:
  • - Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
  • - Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem vorste­ hend beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper als Son­ de unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers erlau­ ben, wobei eine nichtstattgefundene oder schwache Bindung des Antikörpers auf eine mangelnde oder erniedrigte Expres­ sion von HSGT1 hinweist, was indikativ für eine Erkrankung ist.
Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekann­ ten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschluß­ verfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlau­ ben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispielsweise Western-Blot, ELISA oder RIA.
Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können auch als pränatale Diagnose­ verfahren gemäß dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der erfin­ dungsgemäßen Diagnoseverfahren, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül als Sonde oder ein für PCR oder LCR geeignetes, auf der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Mole­ küls basierendes Primerpaar enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.
Je nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden DNA-Moleküle, Antikör­ per oder Fragmente davon an einem geeigneten Träger immobilisiert sein.
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1: Nucleinsäuresequenz der cDNA des HSGT1-Gens Der CAG-Trinukleotidrepeat ist fett dargestellt. Die Primer-Bin­ dungsstellen für die PCR, die einen Polymorphismus amplifizieren, sind unterstrichen.
Fig. 2: von Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz
Fig. 3: Northern Blot-Analyse, bei der RNAs aus verschiedenen Geweben verwendet wurde. Als Hybridierungsprobe wurde ein RT-PCR-Pro­ dukt aus fötaler Hirn-RNA vom 5'-Ende einschließlich der polymor­ phen Repeats eingesetzt.
Fig. 4: Genomkarte mit der genauen Lokalisation des Gens HSGT1
Die Erfindung wird nun nachfolgend mit Bezug auf die Beispiele beschrieben.
Beispiel 1 Northern Blots
Northern-Blots mit RNAs aus verschiedenen Geweben wurden bei 42°C über Nacht in einem Hybridisierungspuffer mit 2 × SSC, Denhardt-Lösung, Formamid und Heringssperma-DNA sowie der spezifischen Sonde (RT-PCR-Produkt aus fötaler Hirn-RNA aus dem 5'-Ende einschl. des polymorphen Repeats) hybri­ disiert. Die Filter wurden zweimal bis dreimal bei 65°C in 2 × SSC/0,1% SDS gewaschen und mit diesen bei -70°C ein Kodak-Film oder Fuji-Film 24 bis 48 Stunden belichtet.
Das Ergebnis des Northern Blots ist in Fig. 3 gezeigt. Es ist sichtbar, daß das HSGT1-Gen ein 8 kB großes Transkript besitzt und ubiquitär schwach exprimiert wird.
Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen HSGT1-Proteins
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen HSGT1-Proteins wird die DNA von Fig. 1 mit Bam HI-Linkern versehen, mit Bam HI nachgeschnitten und in den mit Bam HI gespaltenen Expressionsvektor pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wird das Ex­ pressionsplasmid pQ/HSGT1 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen HSGT1- Protein von Fig. 2 (C-Terminuspartner). pQ/HSGT1 wird zur Transformation von E. coli SG 13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-­ 273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 10 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D- Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydro­ chlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff ent­ sprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 wird einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 200 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimen­ tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsportein werden Tiere wie folgt immuni­ siert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin­ dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek­ trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen), J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wird wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter 1 h bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kanin­ chens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µm 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml kompletten bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkompletten Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs­ gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Claims (14)

1. Nukleinsäure, die für das Protein HSGT1 codiert, wobei die Nukleinsäure umfaßt:
  • a) die Nukleinsäure von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Nukleinsäure bzw. ein Fragment davon,
  • b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende Nukleinsäure oder
  • c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte Nukleinsäure,
wobei die unter (a) bis (c) definierten Nucleinsäuremoleküle für Proteine oder (Poly)peptide codieren, die mindestens noch eine biologische Aktivität von HSGT1 aufweisen.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei sie eine cDNA oder genomische DNA ist.
3. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1.
4. Vektor nach Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure mit regulatorischen Elemen­ ten funktionell verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
5. Vektor nach Anspruch 3 oder 4, der ein RNA-Virus oder Retrovirus ist.
6. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.
7. Transformante nach Anspruch 6, die ein Bakterium, eine Hefe-, Insekten-, Tier- oder Säugerzelle ist.
8. Protein umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein hiervon durch ein oder mehrere Aminosäurenaustausche unterschiedliches Protein bzw. ein Fragment dieser Proteine, wobei die beiden letztgenannten Alternativen minde­ stens noch eine biologische Aktivität von HSGT 1 aufweisen.
9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 8, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 oder 7 unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben, und Gewinnung des Proteins aus der Kultur.
10. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 8.
11. Verwendung des Proteins nach Anspruch 8 als Reagens zur Diagnose und/od­ er Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
12. Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
13. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 10 als Reagenz zur Diagnose und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
14. Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die neurodegenerative Erkrankung das Smith Magenis Syndrom ist.
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