DE19835910C1 - Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17 - Google Patents
Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17Info
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die die Information für ein menschliches Gen, das auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 isoliert worden ist, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthaltende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die die Information für ein
menschliches Gen, das auf dem kurzen Arm von Chromsom 17 isoliert worden
ist, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthal
tende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese
Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten
oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arznei
mittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-
Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses
Protein spezifisch erkennenden Antikörper.
Das Smith-Magenis-Syndrom (SMS) ist eine multiple kongenitale Anomalie. Die
davon betroffenen Patienten leiden an einer mentalen Retardierung, Größen
wachstumsstörungen, Abnormalitäten der REM-Schlafphase und einem ab
normalen Verhalten (Hamill et al., Ann. Gent. 31, S. 36-38 (1990)). Es wurde
inzwischen herausgefunden, daß SMS auf einer internen Deletion/Mutation in
der p11.2-Region von Chromsom 17 beruht. Generell wurde herausgefunden,
daß auch andere Mutationen in dieser Region zu neurodegenerativen Erkrankun
gen führen, die teilweise von den oben genannten Symptomen begleitet sind.
Da die Gene in dieser Region noch nicht vollständig bekannt sind, konnten die
molekularen Mechanismen, die zu obigen Smptomen, insbesondere in Verbin
dung mit Smith Magenis Syndrom führen, noch nicht aufgeklärt werden.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, die
molekularen Grundlagen zu schaffen, um neurodegenerative Erkrankungen, die
verglichen mit dem Smith Magenis Syndrom ähnliche oder gleiche Symptome
hervorrufen, aufzuklären sowie eine geeignete Diagnostik und/oder Therapie
dafür bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in
den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Es konnte
ein DNA-Molekül isoliert und identifiziert werden, das in Zusammenhang mit
SMS steht.
Die Identifizierung eines Gens (HSGT1), das bei seiner teilweisen oder vollständi
gen Deletion mit SMS in Verbindung steht, ist von Interesse, da dies einen
Beitrag zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der SMS und somit verbes
serter Therapien gewährleistet. Parallel dazu bildet die Klonierung des SMS-Gens
die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünftig eine zuver
lässigere und frühzeitige Diagnose bei Betroffenen zu gewährleisten. Darüberhin
aus werden funktionelle Analysen des Proteins zweifellos zum Verständnis der
Neuronenentwicklung beitragen, da das Gen in einer Region im Genom liegt
(humanes Chromosom 17p11.2; s. Fig. 4), die mit verschiedenen neurologischen
Erkrankungen assoziiert ist. Es ist somit als ein Kandidatengen für Untersuchun
gen der Pathomechanismen anzusehen, die neurodegenerativen Krankheiten und
entwicklungsbedingten Störungen der Differenzierung des Zentralnervensystems
zugrunde liegen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül (HSGT1), die folgendes
umfaßt:
- a) die Nukleinsäure von Fig. 1, oder eine hiervon durch ein oder meh rere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
- b) eine mit der Nucleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
- c) eine mit der Nucleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle codieren für Proteine,
Polypeptide oder Peptide, die mindestens noch eine der nachstehend beschrie
benen biologischen Aktivitäten des von der Nukleinsäure gemäß Fig. 1 codierten
Proteins aufweisen, beispielsweise als Differenzierungsfaktor bei der Neuronen
entwicklung und/oder Intermediärfilament in Neuronen, oder dessen Verände
rung oder Ausfall zu SMS führt oder führen kann.
Die unter (a) definierten DNA-Moleküle umfassen auch DNA-Moleküle, die sich
gegenüber der in Fig. 1 angegebenen Sequenz durch Deletion(en), Insertion(en),
Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen,
z. B. alternatives Splicing, unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen
Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Moleküle codierte
Protein noch eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen biologischen
Aktivitäten aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung
der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann
bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispiels
weise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fach
mann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten
Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über eine der biologischen Aktivitä
ten von HSGT1 verfügt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß unter
sucht wird, ob in Zellkulturmodellen das veränderte Protein die gleichen Funktio
nen übernimmt wie das Wildtyp-HSGT1-Protein.
Der Begriff "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen
Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit
einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf
konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs
bedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung
verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C,
vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst
mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C
und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und
Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., supra). Besonders bevorzugt sind
stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al
., supra, beschrieben sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße
DNA-Molekül eine cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-
Molekül eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispiels
weise einem Menschen stammt. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende
Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genom
ischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischen
DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Fig. 1 angegebene
Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten. Anhand der genomischen
DNA, beispielsweise aus einem Menschen, können weitere Mutationen identifi
ziert werden, die an der Entstehung von neurodegnerativen Erkrankungen,
insbesondere SMS, beteiligt sind, beispielsweise Mutationen, die zu Aminosäu
renaustauschen, zur Hemmung das Spleißens oder zu fehlerhaftem Spleißen
führen.
Interessanterweise wurde im HSGT1-Gen ein Polymorphismus gefunden, der
sich in der Protein-kodierenden Region des Gens befindet und für eine Polygluta
minanhäufung codiert, d. h. es kommt eine variable Wiederholung der Sequenz
CAG (vgl. Fig. 1) vor. Polyglutaminanhäufungen sind bereits in verschiedenen
Genen in Zusammenhang mit neuropathologischen Erkrankungen, z. B. Chorea
Huntington, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Ex
pressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch
diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem
Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B.
pGEMEX, pUC-Derivate (z. B. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und
pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen,
während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und
pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich beson
ders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit
regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in
prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren
enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor,
typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phäno
typische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatori
schen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E. coli,
zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukary
onten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-
Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen.
Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der
Polyhedrin-Promotor.
Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch T7 basierende Expressions
vektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56(1987), 125)
oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem.
263 (1988), 3521).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen DNA-
Moleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-
Virus oder ein AAV-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders
bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV,
HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die
erfindungsgemäßen DNA-Moleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu
den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder
Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von
Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und geeignete
Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen
beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie
in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al.,
supra, beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren
enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten-
und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme
HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, der
Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A,
CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transforma
tion dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und
zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der
vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Ein Klon, der für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert, wurde am 31. Juli
1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Hinterlegungs
nummer DSM 12357 (= E. coli/PSB8.7-I13281) hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines
Proteins, das durch obige Nukleinsäure kodiert wird, umfassend die Kultivierung
der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression
des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des
Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des
Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Bio
chem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993),187; Wong,
Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527;
Williams et al., Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Bio
tech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präpa
rative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffini
tätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein von den
erfindungsgemäßen DNA-Molekülen (HSGT1) codiertes oder nach dem vor
stehenden Verfahren erhaltenes Protein. Die Aminosäuresequenz eines solchen
Proteins ist in Fig. 2 gezeigt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden,
daß das erfindungsgemäße Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekann
ten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austau
sche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Pro
teins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten
bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von
Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die
Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin)
gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren
Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäu
re gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen
führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise
Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Um noch die Funktion eines erfin
dungsgemäßen Proteins zu erfüllen, sollte auf Aminosäureebene zu der Sequenz
von Fig. 2 eine Homologie von mind. 50% vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die das vorstehend beschrie
bene Protein HSGT1 spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoclonale,
polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragments davon, beispiels
weise Fab-, Fv-oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um
monoclonale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere
Kaninchen oder Hühner für einen polyclonalen und Mäuse für einen monoclona
len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon
zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu
sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyclonale Antikörper kann
dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungs
gemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden,
wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein oder ein
synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper
können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975),
495) und Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren herge
stellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stam
menden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur
Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung
verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die
Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an
einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf ver
schiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsver
fahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und
RIA.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend be
schriebenen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper. Vorzugs
weise werden diese zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder
Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere SMS, ver
wendet. Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden,
wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung
der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle Anwendung finden können. Andererseits
kann das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein direkt
verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien des erfin
dungsgemäßen Gens mehr besitzen, ausreichende Mengen des biologisch
aktiven Proteins zur Verfügung zu stellen. Das erfindungsgemäße Arzneimittel
kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn in dem betreffenden Patienten
biologisch aktives Protein nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden. Es
gibt Hinweise darauf, daß dieses Gen bei der Entstehung von Autismus eine
Rolle spielt.
Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch
verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arznei
mittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise
Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der
Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parente
rale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, sub
kutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperito
neale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem
behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, bei
spielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem
Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine diagnostische Zusammensetzung,
die das vorstehend beschriebene DNA-Molekül oder den Antikörper enthält oder
Kombinationen davon, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Nach
weismittel.
Das erfindungsgemäße, wie vorstehend definierte DNA-Molekül kann auch als
Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von
einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein
codieren mit einer ebensolchen biologischen Aktivität. Vorzugsweise weist dazu
die Sonde eine Länge von mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 15
Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind
dem Fachmann bekannt. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem
Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit
Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern,
Metallchelaten, Enzymen etc..
Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods
Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder
"Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29
(1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen,
wobei die Primer von der Sequenz in Fig. 1 abgeleitet sind und wobei geeignete
Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizieren
den Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden
können.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren erlauben auch die Identifizierung
weiterer Mutationen, die in Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankun
gen stehen, wobei die Sequenz eines Patienten mit SMS oder dazu ähnlichen
Symptomen mit gesunden Patienten verglichen wird.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von
neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere SMS, in vitro, die folgenden
Schritte umfassend:
- - Isolierung von Nucleinsäure aus dem Patienten,
- - Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
- - Vergleich der Längen der amplifizierten bzw. hybridisieren den Fragmente mit den Längen von Kontrollfragmenten aus dem nichtmutierten HSGT1-Gen, oder
- - Sequenzierung der amplifizierten Fragmente und Vergleich mit der Sequenz von Kontrollfragmenten aus dem nichtmu tierten HSGT1-Gen, wobei Längenunterschiede oder Muta tionen, die zu Substitutionen, Deletionen oder Additionen von Aminosäuren oder zu vorzeitiger Termination der Trans lation führen, indikativ für neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere SMS, sind.
Alternativ kann die Diagnose auch dadurch erfolgen, daß Lymphoblasten isoliert
werden und Metaphase-Präparate hergestellt werden, die einer FISH-Analyse
unterworfen werden, um festzustellen, ob bestimmte Bereiche des Genoms
überhaupt vorhanden sind.
Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden
bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des
Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf
nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung
und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispiels
weise über "Southern-Blot"; angewandt werden.
Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR oder LCR durchgeführt werden.
Dabei werden Primer verwendet, die die erfindungsgemäße Sequenz oder ge
eignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Am
plifikationsprodukte von DNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich, beispiels
weise hinsichtlich ihrer Länge und/oder der Sequenz, von den Amplifikations
produkten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.
In einer alternativen Ausführungsform kann ein Verfahren angewendet werden,
das folgende Schritte umfaßt:
- - Isolierung von RNA aus dem Patienten,
- - Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehre ren geeigneten Sonden,
- - Vergleich der Konzentration und/oder Länge HSGT1-mRNA der Patientenprobe mit einer mRNA einer gesunden Person, wobei Längenunterschiede oder das Fehlen bzw. eine gerin gere Konzentration der HSGT1-mRNA (beispielsweise be dingt durch Mutationen in regulatorischen Sequenzen, die mit der Transkription in Zusammenhang stehen) im Vergleich zur Kontroll-mRNA indikativ für eine neurogenerative Erkran kungen, insbesondere für SMS, ist.
Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der
Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) + RNA aus biologischen Proben, dar
Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise
denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und
des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann eine mögliche Erkrankung
auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:
- - Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
- - Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem vorste hend beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper als Son de unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers erlau ben, wobei eine nichtstattgefundene oder schwache Bindung des Antikörpers auf eine mangelnde oder erniedrigte Expres sion von HSGT1 hinweist, was indikativ für eine Erkrankung ist.
Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekann
ten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschluß
verfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlau
ben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der
Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays,
beispielsweise Western-Blot, ELISA oder RIA.
Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können auch als pränatale Diagnose
verfahren gemäß dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der erfin
dungsgemäßen Diagnoseverfahren, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder
ein Fragment davon, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül als Sonde oder ein für
PCR oder LCR geeignetes, auf der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Mole
küls basierendes Primerpaar enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem
geeigneten Nachweismittel.
Je nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden
Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden DNA-Moleküle, Antikör
per oder Fragmente davon an einem geeigneten Träger immobilisiert sein.
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1: Nucleinsäuresequenz der cDNA des HSGT1-Gens
Der CAG-Trinukleotidrepeat ist fett dargestellt. Die Primer-Bin
dungsstellen für die PCR, die einen Polymorphismus amplifizieren,
sind unterstrichen.
Fig. 2: von Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz
Fig. 3: Northern Blot-Analyse, bei der RNAs aus verschiedenen Geweben
verwendet wurde. Als Hybridierungsprobe wurde ein RT-PCR-Pro
dukt aus fötaler Hirn-RNA vom 5'-Ende einschließlich der polymor
phen Repeats eingesetzt.
Fig. 4: Genomkarte mit der genauen Lokalisation des Gens HSGT1
Die Erfindung wird nun nachfolgend mit Bezug auf die Beispiele beschrieben.
Northern-Blots mit RNAs aus verschiedenen Geweben wurden bei 42°C über
Nacht in einem Hybridisierungspuffer mit 2 × SSC, Denhardt-Lösung, Formamid
und Heringssperma-DNA sowie der spezifischen Sonde (RT-PCR-Produkt aus
fötaler Hirn-RNA aus dem 5'-Ende einschl. des polymorphen Repeats) hybri
disiert. Die Filter wurden zweimal bis dreimal bei 65°C in 2 × SSC/0,1% SDS
gewaschen und mit diesen bei -70°C ein Kodak-Film oder Fuji-Film 24 bis 48
Stunden belichtet.
Das Ergebnis des Northern Blots ist in Fig. 3 gezeigt. Es ist sichtbar, daß das
HSGT1-Gen ein 8 kB großes Transkript besitzt und ubiquitär schwach exprimiert
wird.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen HSGT1-Proteins wird die DNA von Fig.
1 mit Bam HI-Linkern versehen, mit Bam HI nachgeschnitten und in den mit Bam
HI gespaltenen Expressionsvektor pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wird das Ex
pressionsplasmid pQ/HSGT1 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein
aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen HSGT1-
Protein von Fig. 2 (C-Terminuspartner). pQ/HSGT1 wird zur Transformation von
E. coli SG 13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-
273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 10 µg/ml
Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-
Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydro
chlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat
eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff ent
sprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials
durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5
eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt
(vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form
hergestellt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 wird einer 18% SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M
Natriumacetat wird eine ca. 200 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und
in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimen
tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly
acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt
wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsportein werden Tiere wie folgt immuni
siert:
Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS
und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin
dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek
trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-
Andersen), J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western
Blot-Analyse wird wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229,
beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter 1 h bei 37°C mit
einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kanin
chens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das
Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist
ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-
IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei
37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische
Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µm 5' Bromo-4-chloro-
3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5,
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden
können.
Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS
und 0,8 ml kompletten bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es
werden erfindungsgemäße polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS
und 0,25 ml komplettem bzw. inkompletten Freund's Adjuvans eingesetzt; bei
der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs
gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.
Claims (14)
1. Nukleinsäure, die für das Protein HSGT1 codiert, wobei die Nukleinsäure
umfaßt:
- a) die Nukleinsäure von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Nukleinsäure bzw. ein Fragment davon,
- b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende Nukleinsäure oder
- c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte Nukleinsäure,
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei sie eine cDNA oder genomische DNA
ist.
3. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1.
4. Vektor nach Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure mit regulatorischen Elemen
ten funktionell verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder
eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
5. Vektor nach Anspruch 3 oder 4, der ein RNA-Virus oder Retrovirus ist.
6. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.
7. Transformante nach Anspruch 6, die ein Bakterium, eine Hefe-, Insekten-, Tier-
oder Säugerzelle ist.
8. Protein umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2 oder ein hiervon durch
ein oder mehrere Aminosäurenaustausche unterschiedliches Protein bzw. ein
Fragment dieser Proteine, wobei die beiden letztgenannten Alternativen minde
stens noch eine biologische Aktivität von HSGT 1 aufweisen.
9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 8, umfassend die
Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 oder 7 unter Bedingungen,
die die Expression des Proteins erlauben, und Gewinnung des Proteins aus
der Kultur.
10. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 8.
11. Verwendung des Proteins nach Anspruch 8 als Reagens zur Diagnose und/od
er Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
12. Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur
Diagnose und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
13. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 10 als Reagenz zur Diagnose
und/oder Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
14. Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß die neurodegenerative
Erkrankung das Smith Magenis Syndrom ist.
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|---|---|---|---|
| DE19835910A DE19835910C1 (de) | 1998-08-07 | 1998-08-07 | Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17 |
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