DE19856882C1

DE19856882C1 - Spermatogenese-Protein

Info

Publication number: DE19856882C1
Application number: DE19856882A
Authority: DE
Inventors: Zdenek Sedlacek; Annemarie Poustka
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1998-12-10
Publication date: 2000-05-04
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: EP1137772A1; WO2000034472A1; AU2091800A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spermatogenese-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Untersuchung bzw. Beeinflussung der Spermatogenese.

Description

Mit Spermatogenese wird die Bildung von Spermien in Säugetieren bzw. dem Menschen bezeichnet. Diese Bildung erfolgt in den Hoden. Während der Sperma togenese, insbesondere dem Pachytän-Stadium der Meiose, lagern sich die X- und Y-Chromosomen aneinander und bilden einen sog. Sexkörper aus. In diesem liegen die X- und Y-Chromosomen inaktiv vor, d. h. sie werden nicht transkri biert.

Es hat sich nun gezeigt, daß von einigen Genen der X- und Y-Chromosomen Partner-Gene existieren, die autosomal lokalisiert sind. Diese werden u. a. in den Hoden exprimiert, wodurch ihre Genprodukte in der Spermatogenese kompensa torische Funktionen hinsichtlich der entsprechenden inaktivierten Gene der X- und Y-Chromosomen haben.

Ein Eingreifen in die Spermatogenese ist nachwievor ein großes Problem. Dies liegt insbesondere daran, daß die Spermatogenese nicht im Detail verstanden ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem die Spermatogenese untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in die Spermatogenese eingegriffen werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß das X-chromosomal lokalisierte Gen XAP-5 ein Partner-Gen aufweist, das autosomal lokalisiert ist und in vielen Geweben exprimiert wird. Beispielsweise ist die Expression in den Hoden zu finden, wobei sie hier besonders stark ist in der Spermatogenese, inbesondere in den Stadien der primären und sekundären Spermatocyten sowie der runden Spermatiden. Das Partner-Gen wird mit X5L bezeichnet und ist im humanen Genom auf Chromosom 6 in der Region 6pter lokalisiert. Der Anmelder hat X5L auf dem PAC-Klon LLNLp 704K12294Q13 isoliert und charakterisiert. Die DNA umfaßt eine kodierende Sequenz und ein Intron und führt zu einer etwa 1.6 kb großen cDNA. Diese kodiert für ein etwa 37 kD großes, 325 Aminosäuren umfassendes mit X5L-Protein bezeichnetes Spermatogenese-Protein (vgl. Fig. 1, 2 und 5, 6). Ferner hat der Anmelder erkannt, daß Mutationen im X5L-Protein die Spermatogenese beeinträchtigen können.

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Sperma togenese-Protein (X5L-Protein) bereitzustellen, umfassend die Aminosäurese quenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unter schiedliche Aminosäuresequenz, wobei zwischen letzterer Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80% vorliegt.

Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt jegliche für ein X5L-Protein kodierende Aminosäure sequenz, die zu jener von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80% aufweist. Die Aminosäuresequenz kann sich von jener von Fig. 1 durch Additionen, Dele tionen, Substitutionen und/oder Inversionen einzelner Aminosäuren unterschei den. Insbesondere kann die Aminosäuresequenz jene von Fig. 3 sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein X5L-Protein kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z. B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1 hybri disiert und für ein X5L-Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 80% zu jener von Fig. 1 aufweist, oder
b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code ver wandte DNA.

Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für ein X5L-Protein kodierende DNA-Sequenz, die mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und für ein X5L-Protein kodiert, dessen Aminosäurese quenz eine Homologie von mindestens 80% zu jener von Fig. 1 aufweist. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen einzelner Basenpaare unterscheiden. Ins besondere kann die DNA-Sequenz jene der Fig. 2-4 sein. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA-Sequenz hin.

Die DNAs der Fig. 1-4 wurden als h-X5L-c, h-X5L-g, m-X5L-c bzw. m-X5L-g bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12550, DSM 12553, DSM 12552 bzw. DSM 12551 am 26. Nov. 1998 hinterlegt.

Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, für ein X5L- Protein kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expres sion in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Ex pressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fu sionsproteins exprimiert werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfin dungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:

a) eine erfindungsgemäße DNA,
b) ein erfindungsgemäßes Spermatogenese-Protein (X5L-Protein)
c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.

Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführun gen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Spermatogenese zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann ein X5L-Protein nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung zwischen einem X5L-Protein und Vorgängen in der Spermatogenese hergestellt werden. Ferner kann mit einem X5L-Protein ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für ein X5L-Protein kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Southern Blot, über in situ Hybri disierung oder durch PCR, erfolgen.

Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen zur Inhibition oder Aktivitätssteigerung eines X5L-Proteins in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann ein X5L-Protein inhibiert werden. Anderer seits kann mit einem X5L-Protein, insbesondere nach Kopplung an ein vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, die Menge eines X5L-Proteins in Personen erhöht werden. Entsprechendes kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die Kontrolle eines konstitutiven bzw. in bestimmten Geweben, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstellung eines X5L-Proteins in den Personen bzw. in bestimmten Geweben, z. B. Hoden, dieser führt.

Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, die Spermatogenese zu unter suchen und in sie regulierend einzugreifen. Letzteres umfaßt sowohl ihre Akti vierung als auch ihre Inhibierung. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung Mittel, Störungen der Spermatogenese zu diagnostizieren und zu behandeln.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Fig. 1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen eines erfindungsgemä ßen, 325 Aminosäuren umfassenden Spermatogenese-Proteins (X5L-Protein). Die DNA-Sequenz ist eine humane cDNA.

Fig. 2 zeigt die Sequenzen einer genomischen für ein X5L-Protein kodie renden DNA. Die DNA entstammt dem humanen Genom. Die cDNA von Fig. 1 beginnt am Basenpaar 739. Zwischen den Basenpaaren 828 und 1129 liegt ein Intron vor. Eine Polyadenylierungsstelle befindet sich am Basenpaar 2658.

Fig. 3 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen eines 334 Aminosäuren umfassenden X5L-Proteins. Die DNA-Sequenz ist eine Maus cDNA.

Fig. 4 zeigt die Sequenz einer genomischen für ein X5L-Protein kodieren den DNA. Die DNA entstammt dem Maus Genom. Die cDNA von Fig. 3 beginnt am Basenpaar 445 von Fig. 4(A). Zwischen den Basenpaaren 492-1232 von Fig. 4(A) liegt ein Intron vor. Zwischen den Basenpaaren 1-1136 von Fig. 4(B) liegt ein Intron vor. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich am Basenpaar 2306 von Fig. 4(B).

Fig. 5 zeigt den Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in Geweben.

Fig. 6 zeigt den Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in Hoden. Das Vorliegen solcher mRNA ist auf Tubuli begrenzt (Fig. 6(A)). Auf zellulärer Ebene liegt mRNA eines X5L-Proteins in den Stadien der primären und sekundären Spermatoyten (Sterne) sowieder runden Spermatiden (RS) vor. Reife Spermien sind mit (MS) und Spermato gonien mit (Pfeilspitzen) gekennzeichnet. Sertoli-Zellen (Pfeile) und Leydig-Zellen (L) weisen keine mRNA eines X5L-Proteins auf.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in Geweben

A) RNA-Blots von humanen Geweben, wie Pankreas, Nebennierenmark, Schild drüse, Nebennierenrinde, Hoden, Thymus, Dünndarm, Magen, fötales Gehirn, fötale Lunge, fötale Leber und fötale Niere, erhalten von Clontech, werden einer Hybridisierung unterzogen. Als Hybridisierungsprobe wird eine [α³²P]dCTP markierte X5L-Protein spezifische DNA verwendet, die zwischen den Basenpaa ren 1073-1409 der DNA von Fig. 1 liegt. Die Hybridisierung erfolgt übernacht mit anschließenden Waschschritten unter üblichen Bedingungen. Zur Kontrolle werden die Blots ebenfalls mit einer radioaktiven β-actin-Probe hybridisiert (vgl. Fig. 5).
Es zeigt sich, daß mRNA eines X5L-Proteins in den verschiedensten Geweben exprimiert wird. Die Größe der exprimierten mRNA ist 1,7 bzw. 4,3 kb, was auf unterschiedliche Polyadenylierungssignale der DNA von Fig. 1 zurückzuführen ist. Ferner zeigt es sich, daß die Expression von mRNA eines X5L-Proteins in Hoden am stärksten ist.
B) Es wird eine RNA in situ Hybridisierung an Maus-Hoden-Gewebe durchgeführt. Hierzu wird auf das Verfahren von Wilkinson, D. G. (1992), Oxford University Press, New York verwiesen. Es werden "antisense"- bzw. "sense" RNA Proben verweden, die den Basenpaaren 5-1169 der DNA von Fig. 1 entsprechen.
Es zeigt sich, daß in Hoden-Gewebe eine starke Expression von mRNA eines X5L-Proteins stattfindet. Ferner zeigt sich, daß die Expression auf Tubuli be schränkt ist. Auf zellulärer Ebene zeigt sich eine Expression von mRNA eines X5L-Proteins in den Stadien der primären und sekundären Spermatocyten sowie der runden Spermatiden. Spermatogonien, reife Sertoli-Zellen und Leyding-Zellen zeigen dagegen keine Expression von mRNA eines X5L-Proteins.

Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Spermatoge nese-Proteins (X5L-Protein)

Die DNA von Fig. 1 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/X5L erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungs gemäßen X5L-Protein von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/X5L wird zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Iso propyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guani dinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materi als durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.

Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 37 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5'Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Claims

1. Spermatogenese-Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei zwischen letzterer Aminosäuresequenz und jener von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80% vorliegt.

2. Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäurese quenz von Fig. 3.

3. DNA, kodierend für das Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1, um fassend:

a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Ba senpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und für ein Spermatogenese-Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 80% zu jener von Fig. 1 aufweist, oder
b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

4. DNA nach Anspruch 3, wobei die DNA jene von Fig. 2, Fig. 3 oder Fig. 4 ist.

5. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 3 oder 4.

6. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 5.

7. Verfahren zur Herstellung eines Spermatogenese-Proteins, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedin gungen.

8. Antikörper, gerichtet gegen das Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1 oder 2.

9. Verwendung des Spermatogenese-Proteins nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA nach Anspruch 3 oder 4 zur Untersuchung bzw. Beeinflussung von Spermatogenese.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Beeinflussung der Spermatoge nese ihre Aktivierung bzw. Inhibierung umfaßt.

11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Untersuchung bzw. Beeinflus sung der Spermatogenese eine Diagnose bzw. Behandlung von Störungen der Spermatogenese umfaßt.