WO1998018919A2 - Gabaa-rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes protein - Google Patents

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WO1998018919A2
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protein
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gaba
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Annemarie Poustka
Renate Gaul
Klaus Wilke
Petra Kioschis
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a GABA A receptor subunit epsilon-related protein, such a DNA coding such and a method for producing such.
  • the invention further relates to the use of the DNA and the protein and antibodies directed against the protein.
  • GABA A receptors These are membrane proteins that bind the neurotransmitter y-aminobutyric acid (GABA). This binding triggers a synaptic inhibition, whereby chloride channels are opened.
  • GABA A receptors consist of subunits, in particular those of the classes alpha, beta, gamma, delta, epsilon and rho.
  • the object of the present invention is therefore to provide a means with which the signal transmission in the brain can be examined and, if necessary, influenced.
  • the present invention thus relates to a GABA A receptor subunit epsilon-related protein, the protein comprising the amino acid sequence of FIG. 1 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that in animals, particularly mammals, very particularly humans, a protein exists which has homologies to a GABA A receptor subunit epsilon, where appropriate a GABA A receptor subunit epsiion activity but differs from a known GABA A receptor subunit epsilon at the DNA level by hybridization under normal conditions.
  • Such a protein has the amino acid sequence of FIG. 1 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.
  • the latter amino acid sequence is represented, for example, by that of FIG. 2.
  • GVP GABA A receptor subunit epsilon-related protein
  • Another object of the present invention is a nucleic acid coding for a (GVP).
  • GVP nucleic acid coding for a
  • This can be an RNA or a DNA.
  • the latter can e.g. be a genomic DNA or a cDNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • hybridizing DNA indicates a DNA that is commonly used
  • the DNA of FIG. 3 was deposited with the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) as Qc 1 1 C8 under DSM 1 1 1 96 on October 2, 996.
  • the DNA of FIGS. 1 and 2 is further preferred.
  • the DNA of FIG. 2 differs from that of FIG. 1 in that 96 bp are missing between positions 378-474.
  • the (GVPs) encoded by both DNAs differ accordingly, ie (GVP) of FIG. 2 is 32 amino acids shorter than that of FIG. 1.
  • a DNA according to the invention is described below in the form of a cDNA. This is an example of every DNA covered by the present invention.
  • This library is made up of a DNA fragment, e.g. B. 58g2B1 8, which is isolated from the cosmid clone Qc1 1 C8 by means of direct cDNA selection (cf. Korn, B. et al., Hum.Mol.Genet.4, (1 992), 235-242) .
  • the cosmid clone Qc1 1 C8 becomes an Xq28 specific
  • a cDNA according to the invention can be present in a vector or expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8, the latter being preferred.
  • yeast e.g. to call pY1 00 and Ycpad l
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • suitable cells in order to express a cDNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB1 01, DH 1, x1 776, JM 101, JM 109, BL21 and
  • yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells Ltk " , 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa as well as the insect cells sf9.
  • a cDNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in connection with a DNA coding for another protein or peptide, so that the cDNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above protein or fusion protein.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is expedient to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragments thereof. Further “boosters” of the animals can be carried out using the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • the present invention makes it possible to investigate signal transmission in the brain.
  • GVP antibody according to the invention
  • an antibody according to the invention (GVP) can be detected in the brain cells of people.
  • a relationship between (GVP) and the transmission of signals can be established.
  • an autoantibody directed against this protein can be detected with an inventive (GVP).
  • Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, an immunoprecipitation or by Immunofluorescence.
  • the expression of the gene coding for (GVP) can be detected with a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA and primers derived therefrom. This detection can be done in the usual way, especially in a Southern blot.
  • the present invention is suitable for regulatingly intervening in the transmission of signals in the brain of persons.
  • GVP antibody according to the invention
  • this can be achieved by means of a nucleic acid according to the invention, in particular DNA.
  • the nucleic acid e.g. as the basis for the creation of
  • Anti-sense oligonucleotides used to inhibit expression of the gene coding for (GVP).
  • the present invention is furthermore suitable for finding substances which bind specifically to (GVP) and influence it.
  • GVP GABA A receptor units
  • Such an expression can also take place in Xenopus oocytes.
  • benzodiazepines, barbiturates, beta-carbolines and neurosteroids are conceivable as substances that could have an influence on (GVP).
  • the influence of substances can be examined by conventional methods, in particular pharmacological and electrophysiological methods. For example, reference is made to radioligand binding tests and the use of the patch clamp technique on whole cells (cf. Pritchett et al., Nature 338, (1 989), 582-585).
  • (GVP) can also be present in a GABA A receptor. Such is also the subject of the present invention.
  • the present invention thus makes a great contribution to the understanding of the Signal transmission in the brain and a possible regulatory intervention.
  • FIG. 1 shows the base sequence of a cDNA according to the invention and the amino acid sequence derived therefrom of a (GVP) according to the invention
  • FIG. 3 shows the base sequence of a genomic DNA coding for an inventive (GVP).
  • GVP inventive
  • Example 1 Production and cleaning of a (GVP) according to the invention
  • the DNA of FIG. 1 was used as a template for producing a (GVP) according to the invention.
  • a PCR procedure was carried out.
  • the DNA of FIG. 1 the following was used as the primer pair:
  • the amplified DNA was in each case cleaved with BamHI and inserted into the expression vector pQE-8 (Diagen) cleaved with BamHI.
  • the expression plasmid pQ / GVP-1 was obtained.
  • pQ / GVP-G-1 was used to transform E.coli SG 1 3009 (see Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 1 48, (1 981), 265-273).
  • the bacteria were in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 25 ⁇ g / ml kanamycin cultivated and induced for 4 h with 60 ⁇ M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside
  • the bacteria were lysed by adding 6 M guanidine hydrochloride, and then chromatography (Ni-NTA resin) was carried out with the lysate in the presence of 8 M urea in accordance with the manufacturer's (Diagen) instructions for the chromatography material.
  • the bound fusion protein was eluted in a pH 3.5 buffer.
  • the fusion protein was subjected to 1 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 1 49 (1 975), 709-733) .
  • Example 2 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 was subjected to 1 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 54 kD band was cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Gel pieces were sedimented before the protein concentration of the supernatant was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, which was followed by a Coomassie blue staining. Animals were immunized with the gel-purified fusion protein as follows:
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • nitrocellulose filter Subjected to gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1 984), 203-209). Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1 994), 21 5-229. For this purpose, the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was rabbit serum (1: 10000 in PBS). After several washes with PBS, the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody.
  • This antibody was a goat anti-rabbit IgG (Dianova) monoclonal monoclonal antibody coupled to alkaline phosphatase (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, several washing steps with PBS followed and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5 , 100 mM NaCl, 5 M MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5 , 100 mM NaCl, 5 M MgCl 2
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes Protein, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins sowie gegen das Protein gerichtete Antikörper.

Description

GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes Protein
Die vorliegende Erfindung betrifft ein GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon- verwandtes Protein, eine ein solches kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der DNA und des Proteins sowie gegen das Protein gerichtete Antikörper.
Die Signal-Transmission an Synapsen im Gehirm verläuft unter Mithilfe von GABAA-Rezeptoren. Dies sind Membranproteine, die den Neurotransmitter y- Aminobuttersäure (GABA) binden. Durch diese Bindung wird eine synaptische Inhibition ausgelöst, wobei Chlorid-Kanäle geöffnet werden. GABAA-Rezeptoren bestehen aus Untereinheiten, insbesondere solche der Klassen alpha, beta, gamma, delta, epsilon und rho.
Es wird angedacht, gezielt in die Signal-Transmission im Gehirn einzugreifen. Hierzu ist es allerdings notwendig, die einzelnen Faktoren und Vorgänge der Signal-Transmission zu kennen und verstanden zu haben. Beides ist bisher nur unzureichend erfolgt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Signal-Transmission im Gehirn untersucht und gegebenen- falls beeinflußt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß in Tieren, besonders Säugetieren, ganz besonders dem Menschen, ein Protein existiert, das Homologien zu einer GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon, gegebe- nenenfalls eine GABAA-Rezeptoruntereinheit epsiion-Aktivität aufweist, sich aber von einer bekannten GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon auf dem DNA-Level durch Hybridisierung unter üblichen Bedingungen unterscheidet. Ein solches Protein weist die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminsoäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz auf. Letztere Aminosäuresequenz wird z.B. durch jene von Fig. 2 dargestellt.
In der vorliegenden Erfindung wird ein vorstehendes Protein mit "GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes Protein" (GVP) bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein (GVP) kodie- rende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z.B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen
Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.
Die DNA von Fig. 3 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen) als Qc 1 1 C8 unter DSM 1 1 1 96 am 2. Oktober 1 996 hinterlegt. Weiterhin bevorzugt ist die DNA von Fig. 1 und Fig. 2. Die DNA von Fig. 2 unterscheidet sich von jener von Fig. 1 darin, daß 96 bp zwischen den Positionen 378-474 fehlen. Die von beiden DNAs kodierten (GVPs) unterscheiden sich entsprechend, d.h. (GVP) von Fig. 2 ist um 32 Aminosäuren kürzer als jenes von Fig. 1 .
Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen cDNA ist es günstig, von einer cDNA-
Bibliothek aus adulter, menschlicher cerebraler Cortex, z.B. von einer der Bestell- Nr. HL1 1 62a (Clontech) auszugeben. Diese Bibliothek wird mit einem DNA- Fragment, z. B. 58g2B1 8, hybridisiert, das aus dem Cosmid-Klon Qc1 1 C8 mittels direkter cDNA Selektion isoliert wird (vgl. Korn, B. et al. , Hum.Mol.Genet.4, ( 1 992), 235-242) . Der Cosmid-Klon Qc1 1 C8 wird aus einer Xq28 spezifischen
Cosmid-Bibliothek erhalten (vgl. Rogner, U.C. et al., Human Molecular Genetics, Band 3, Nr. 1 2 ( 1 994), 21 37-2146) .
Eine erfindunggemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY1 00 und Ycpad l zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expres- sion in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB1 01 , DH 1 , x1 776, JM 101 , JM 109, BL21 und
SG 1 3009, wobei letzterer bevorzugt ist, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen Ltk", 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans- fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonaleπ und Mäuse für einen monoklona- len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu- sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo- nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Signal-Transmission im Gehirn zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann (GVP) in Gehirnzellen von Personen nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von (GVP) zur Transmission von Signalen hergestellt werden. Ferner kann mit einem erfin- dungsgemäßen (GVP) ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Expression des für (GVP) kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher weise, insbesondere in einem Southern Blot, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, regulierend in die Transmission von Signalen im Gehirn von Personen einzugreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann (GVP) in Personen inhibiert werden. Ferner kann dies durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere DNA er- reicht werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z.B. als Basis für die Erstellung von
Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expressions-Inhibierung des für (GVP) kodierenden Gens verwendet.
Desweiteren eignet sich die vorliegende Erfindung, Substanzen zu finden, die spezifisch an (GVP) binden und es beeinflussen. Hierzu kann es günstig sein, eine Zellinie zu etablieren, die neben (GVP) auch weitere GABAA-Rezeptorunter- einheiten exprimiert. Ferner kann eine solche Expression in Xenopus Oocyten erfolgen. Als Substanzen, die einen Einfluß auf (GVP) haben könnten, sind insbesondere Benzodiazepine, Barbiturate, beta-Carboline und Neurosteroide denkbar. Der Einfluß von Substanzen kann durch übliche Verfahren, insbesondere pharmakologische und elektrophysiologische Verfahren, untersucht werden. Beispielhaft wird auf Radioliganden-Bindungstests und die Anwendung der Patch Clamp Technik an ganzen Zellen (vgl. Pritchett et al., Nature 338, ( 1 989), 582- 585) verwiesen.
Ergänzend wird darauf hingewiesen, daß (GVP) auch in einem GABAA-Rezeptor vorliegen kann. Ein solcher ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die genannten Anwendungen von (GVP), insbesondere die Anwendung zur Suche nach es beeinflussenden Substanzen, betrifft somit auch einen (GVP) enthaltenden GABAA-Rezeptor.
Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zum Verständnis der Signal-Transmission im Gehirn und zu einem möglichen regulierenden Eingreifen dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die Basensequenz einer erfindungsgemäßen cDNA sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen (GVP),
Fig. 2 zeigt die Basensequenz einer erfindungsgemäßen cDNA sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen (GVP) und
Fig. 3 zeigt die Basensequenz einer für ein erfindungsgemäßes (GVP) kodierenden, genomischen DNA. Die Angabe — weist auf einen nicht-sequenzierten DNA-Bereich hin. Ferner weist die Unterstreichung auf jene Sequenzen hin, die sich in der DNA von Fig. 1 wiederfinden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen (GVP)
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen (GVP) wurde die DNA von Fig. 1 als Template verwendet. Es wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt. Bezüglich der DNA von Fig. 1 wurde als Primer-Paar verwendet:
5'-TATTATAGGATCCAGAGCGTGAGCCGCGACCT-3'
5'-TTAATTTGGATCCAGGTTGCCCCACAGGGTAC-3' Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren jeweils wie folgt:
PCR-Ansatz
Template DNA (Fig. 1 ) λμ\ = 1 ng
Pfu-Polymerase 1 0x-Puffer 1 0 /I = 1 x
DMSO 10 /I = 10 % dNTP's 1μL = je 200/YM
Oligonukleotide, je 1 , 5μl 3μ\ = je 1 50 ng
H2O-bidest ad 99μl
PCR-Bedingungen
- 92°C - 5 min
- Zugabe von 1μl Pfu-Polymerase (Stratagene) 2,5 Einheiten
- Zugabe von Paraffin
PCR
92°C 1 min 60°C 1 min 1 Zyklus 72°C 1 0 min 92°C 1 min 60°C 1 min 39 Zyklen 72 °C 2 min 72°C 10 min 1 Zyklus
Die amplifizierte DNA wurde jeweils mit BamHI gespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wurde das Expres- sionsplasmid pQ/GVP-1 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen (GVP) von Fig. 1 (C-Terminuspartner) . pQ/GVP-G-1 wurde zur Transformation von E.coli SG 1 3009(vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 1 48, ( 1 981 ), 265-273) verwendet. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin und 25μg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyra- nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 1 8 % SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R. D., J.Mol.Biol. 1 49 ( 1 975), 709-733) .
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 2: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 wurde einer 1 8 % SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 54 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke wurden sedimen- tiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgte, bestimmt wurde. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein wurden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 35μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag O: 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 1 4: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA) Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, ( 1 984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, ( 1 994), 21 5-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37 °C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens ( 1 : 1 0000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (Dianova) ( 1 :5000) in PBS. Nach 30- minütiger Inkubation bei 37 °C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, 1 00mM Tris-HCI, pH 9.5, 1 00 mM NaCI, 5 M MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonaie Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 1 2μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonaie Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1 . GABAA-Rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminsosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt.
2. Protein nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz von Fig. 2 umfaßt.
3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem GABAA-Rezeptors umfaßt ist.
4. DNA nach Anspruch 1 , wobei die DNA umfaßt:
(a) die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Ba- senpaare unterschiedliche DNA,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
5. DNA nach Anspruch 4, nämlich die DNA von Fig. 3.
6. DNA nach Anspruch 4, nämlich die DNA von Fig. 2.
7. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
8. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 7.
9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 oder 2, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedingungen.
1 0. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
1 1 . Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.
12. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 6 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.
1 3. Verwendung nach Anspruch 1 1 oder 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie das Auffinden von das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 beeinflussenden Substanzen umfaßt.
14. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 10 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006862A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Human Genome Sciences, Inc. Gabaa receptor epsilon subunit

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006862A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Human Genome Sciences, Inc. Gabaa receptor epsilon subunit

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL NUCLEOTIDE SEQUENCES EMBL 1995 XP002061237 *
DATABASE EMBL NUCLEOTIDE SEQUENCES EMBL 4.Oktober 1996 XP002061238 *
DAVIES PA ET AL: "Insensitivity to anaesthetic agents conferred by a class of GABA(A) receptor subunit." NATURE, FEB 27 1997, 385 (6619) P820-3, ENGLAND, XP002061235 *
HARVEY R.J., KIM H.C., DARLISON M.G.: "Molecular cloning reveals the existence of a fourth gamma subunit of the vertebrate brain GABAA receptor" FEBS LETTERS, Bd. 331, Oktober 1993, AMSTERDAM NL, Seiten 211-216, XP002061236 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2778668A1 (fr) * 1998-05-15 1999-11-19 Centre Nat Rech Scient Sous-unite epsilon 2 du recepteur gaba a

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