【発明の詳細な説明】
ＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロン関連タンパク質
本発明は、ＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロン関連タンパク質、か
かるタンパク質をコードするＤＮＡおよび該タンパク質を生産する方法に関する
。さらに、本発明は、該ＤＮＡおよびタンパク質の使用ならびに該タンパク質に
対する抗体に関する。
脳内のシナプスでのシグナル伝達は、ＧＡＢＡAレセプターの助けで起こる。
これらは、神経伝達物質γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を結合する膜タンパク質で
ある。この結合により、塩素チャネルが開かれ、シナプス阻害が誘発される。Ｇ
ＡＢＡAレセプターは、サブユニット、具体的には、アルファ、ベータ、ガンマ
、デルタ、イプシロンおよびローのクラスのサブユニットからなる。
よく計算された様式で脳内のシグナル伝達に干渉することが意図される。しか
しながら、このため、個々の因子およびシグナル伝達の過程を知り、理解されて
いることが必要である。現在まで、いずれもほとんど十分には行われていない。
したがって、本発明の目的は、それにより脳内シグナル伝達が調べられ、かつ
任意に影響を及ぼしうる産物を提供することにある。
本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。
したがって、本発明の主題は、図１のアミノ酸配列またはそれとは１もしくは
複数のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有するＧＡＢＡAレセプターサブユニ
ットイプシロン関連タンパク質に関する。
本発明は、ＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロンに対するホモロジー
、および任意にＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロン活性を含むが、慣
用の条件下でのハイブリダイゼーションによってＤＮＡレベル上は公知のＧＡＢ
ＡAレセプターサブユニットイプシロンと異なるタンパク質が、動物、具体的に
は哺乳類、さらに具体的には、ヒトに存在するという出願人の知見に基づく。か
かるタンパク質は、図１のアミノ酸配列またはそれとは１もしくは複数のアミノ
酸が異なるアミノ酸配列を含有する。後者のアミノ酸配列は、例えば、図２のア
ミノ酸配列に示される。
前記タンパク質は、本発明において、「ＧＡＢＡAレセプターサブユニットイ
プシロン関連タンパク質」（ＧＶＰ）という。
さらなる本発明の主題は、（ＧＶＰ）をコードする核酸に関する。これはＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってもよい。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
であることができる。下記を含有するＤＮＡが好ましい：
（ａ）図３のＤＮＡまたはそれとは１もしくは複数の塩基対が異なるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｃ）縮重遺伝子コードを介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ
。
「ハイブリダイズするＤＮＡ」の語は、慣用の条件下、具体的にはＤＮＡの融
解温度の２０℃以下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。
図３のＤＮＡは、ＤＳＭ １１１９６の下、１９９６年１０月２日にＱｃ １
１Ｃ８として、ＤＳＭ〔ドイチェ ザンムルング フォン ミクロオーガニズメ
ン ウント ツェルクルチューレン〕に寄託された。
また、図１および図２のＤＮＡも好ましい。図２のＤＮＡは、９６ｂｐが３７
８〜４７４位間で欠失している点で図１のＤＮＡとは異なる。両方のＤＮＡによ
りコードされた（ＧＶＰｓ）は、相応じて異なり、すなわち、図２の（ＧＶＰ）
は、図１のものより３２アミノ酸短い。
本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡの型で下記に記載される。それは、本発明の範疇
の各ＤＮＡに対する例示である。
本発明のｃＤＮＡの調製のために、基本として、成人ヒト大脳皮質ｃＤＮＡラ
イブラリー、例えば、注文番号ＨＬ１１６２ａ〔クローンテック〕を用いること
が好ましい。該ライブラリーを、ＤＮＡフラグメント、例えば、直接ｃＤＮＡ選
抜によってコスミドクローンＱｃ１１Ｃ８から単離される５８ｇ２Ｂ１８〔コー
ン（Ｋｏｒｎ），Ｂら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４，（１９９２），２３
５−２４２を参照のこと〕とハイブリダイズさせる。該コスミドクローンＱｃ１
１Ｃ８は、Ｘｑ２８−特異的コスミドライブラリー〔ログナー（Ｒｏｇｎｅｒ）
，Ｕ．Ｃ．ら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第３巻，
１２号（１９９４），２１３７−２１４６〕から得られる。
本発明のｃＤＮＡは、それぞれベクターおよび発現ベクター中に存在しうる。
当業者は、それらの例示に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合、これら
は、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよび
ｐＱＥ−８などであり、後者が好ましい。酵母における発現に関しては、例えば
、ｐＹ１００、Ｙｃｐａｄ１を挙げるべきであり、一方、例えば、ｐＫＣＲ、ｐ
ＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などが動物細胞における発現に関して示され
るべきである。バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆
虫細胞における発現に特に好適である。
当業者は、発現ベクター中に存在する本発明のｃＤＮＡを発現するための適切
な細胞に精通している。かかる細胞の例示としては、大腸菌株であるＨＢ１０１
、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００
９、後者が好ましく、酵母株であるサッカロミセス・セルビジエ、動物細胞であ
るＬｔｋ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならび
昆虫細胞であるｓｆ９が挙げられる。
当業者は、本発明のｃＤＮＡが、どのようにして発現ベクターに挿入されなけ
ればならないかを知っている。さらに当業者は、該ＤＮＡを、他のタンパク質お
よびペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡと組み合わせて、本発明のｃＤＮＡ
が融合タンパク質の形態で発現されうるように挿入できるという事実に精通して
いる。
さらに、当業者は、形質転換細胞およびトランスフェクト細胞を培養する条件
を知っている。また、当業者は、本発明のｃＤＮＡにより発現されたタンパク質
を単離し、精製する方法にも精通している。したがって、融合タンパク質であっ
てもよいかかるタンパク質も本発明の主題を表す。
本発明のさらなる主題は、それぞれ、前記タンパク質および融合タンパク質に
対する抗体に関する。かかる抗体は、常法により調製されうる。それは、ポリク
ローナルおよびモノクローナルのそれぞれであってもよい。その調製のために、
動物−具体的にはポリクローナル抗体のためにはウサギまたはニワトリを、モノ
クローナル抗体のためにはマウス−を、前記（融合）タンパク質でまたはその断
片で免疫させることが好ましい。さらに、動物の「ブースター」は、同じ（融合
）タンパク質またはその断片によりもたらされうる。ついで、該ポリクローナル
抗体を、動物血清および卵黄のそれぞれから得てもよい。モノクローナル抗体の
調製のために、動物脾臓細胞をミエローマ細胞と融合する。
本発明は脳内シグナル伝達の検査を可能とする。本発明の抗体により、（ＧＶ
Ｐ）はヒトの脳細胞に検出されうる。相関関係が（ＧＶＰ）とシグナルの伝達と
の間に成立しうる。さらに、本発明の（ＧＶＰ）により、このタンパク質に対す
る自己抗体を検出することが可能である。両方の検出は、常法、具体的にはウエ
スタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降または免疫蛍光によりなされうる。さら
に、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡおよびそれから得られるプライマーにより
、（ＧＶＰ）をコードする遺伝子の発現を検出することも可能である。この検出
は、通常、特にサザンブロットでなされうる。
さらに、本発明はヒトの脳内のシグナルの伝達を調節するのに適する。本発明
の抗体によれば、ヒトの（ＧＶＰ）を阻害することが可能である。さらに、これ
は、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡにより達成されうる。このため、例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製を基礎として、該核酸は（ＧＶＰ）をコ
ードする遺伝子の発現阻害に使用される。
さらに、本発明は、（ＧＶＰ）に特異的に結合し、それに影響を及ぼす物質を
発見するのに適する。このために、本発明は、（ＧＶＰ）に加えてさらなるＧＡ
ＢＡAレセプターサブユニットをも発現する細胞株を確立するのに好適でありう
る。さらに、かかる発現は、アフリカツメカエルの卵母細胞において成されうる
。具体的には、ベンゾジアゼピン類、バルビツレート類、ベータカルボリン類お
よび神経ステロイド類が（ＧＶＰ）への影響を発揮しうる物質として考慮される
。物質の影響は、常法、具体的には薬理学的、電気生理学的方法により調べられ
うる。実施例の方法による、放射性リガンド結合試験および全細胞におけるパッ
チクランプ技術の応用が参照される〔プリットシェット（Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ）
ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８，（１９８９），５８２−５８５〕。
補遺により、、（ＧＶＰ）もＧＡＢＡAレセプターに存在するかもしれないと
いう事実が参照される。かかるレセプターも、本発明の主題を表す。該（ＧＶＰ
）の応用、とりわけ、それに影響する物質を探索するのに役に立つ応用も（ＧＶ
Ｐ）含有ＧＡＢＡAレセプターに関する。
したがって、本発明は、脳内シグナル伝達の理解への多大なる貢献および可能
な影響の調節を表す。
図面の簡単な説明：
図１は、本発明のｃＤＮＡの塩基配列とそれに由来する本発明の（ＧＶＰ）の
アミノ酸配列を示す、
図２は、本発明のｃＤＮＡの塩基配列とそれに由来する本発明の（ＧＶＰ）の
アミノ酸配列を示す、および
図３は、本発明の（ＧＶＰ）をコードするゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。・
・・の表示は、非シーケンスＤＮＡ領域を表す。また、下線は、図１のＤＮＡ中
に再現する配列を表す。
下記の実施例により本発明を説明する。実施例１： 本発明の（ＧＶＰ）の調製および精製
本発明の（ＧＶＰ）の調製のため、図１のＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣＲ
法を行った。図１のＤＮＡについて、以下のプライマー対を用いた：
５’−ＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴ−
３’
５’−ＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＴＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣ−
３’
ＰＣＲバッチおよびＰＣＲ条件を各々以下のようにした：ＰＣＲバッチ
鋳型ＤＮＡ（図１） ：１μＬ＝１ｎｇ
Ｐｆｕポリメラーゼ１０×緩衝液 ：１０μＬ＝１×
ＤＭＳＯ ：１０μＬ＝１０％
ｄＮＴＰ’ｓ ：１μＬ＝各２００μＭ
オリゴヌクレオチド、各１．５μＬ ：３μＬ＝各１５０ｎｇ
Ｈ2Ｏビッディスト(bidist) ：９９μＬまでＰＣＲ条件
− ９２℃− ５分間
− １μＬ Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）の添加＝２．５単位
− パラフィンの添加ＰＣＲ
９２℃１分間。
６０℃ １分間。 １サイクル
７２℃ １０分間。
９２℃ １分間。
６０℃ １分間。 ３９サイクル
７２℃ ２分間。
７２℃ １０分間。 １サイクル
増幅ＤＮＡを各々ＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐ
ＱＥ８（ダイアゲンカンパニー）中に挿入した。発現プラスミドｐＱ／ＧＶＰ−
１を得た。かかるプラスミドは、６ヒスチジン残基（Ｎ末端パートナー）と本発
明の図１の（ＧＶＰ）（Ｃ末端パートナー）を含有する融合タンパク質をコード
する。大腸菌ＳＧ１３００９を形質転換するためにｐＱ／ＧＶＰ−Ｇ−１を用い
た〔ゴッテスマン(Gottesman)，S．ら，J．Bacteriol．148，(1981)，265-273を
参照のこと〕。細菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２５μｇ／ｍＬのカナ
マイシンを含有するＬＢ培地中で培養し、６０μＭ イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。６Ｍ グアニジン塩酸塩
を添加して細菌の溶菌を達成した。その後、クロマトグラフィーマテリアルの製
造者（ダイアゲンカンパニー）による使用説明書に従って、８Ｍ 尿素の存在下
でライゼートを用いてクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を行った。結合
した融合タンパク質をｐＨ３．５の緩衝液で溶出した。それの中和後、融合タン
パク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クーマシーブル
ーで染色した〔トーマス(Thomas)，J.O．とコーンベルグ(Kornberg)，R.D.，J．
Mol．Biol．149(1975)，709-733〕。
本発明の（融合）タンパク質は、高い純度の型で調製され得ることが示された
。実施例２： 本発明の抗体の調製および検出
本発明の実施例１の融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動に供した。ゲルを４Ｍ酢酸ナトリウムで染色した後、約５４ｋＤのバンド
をゲルから切り出し、リン酸緩衝化した慣用の塩溶液中でインキュベートした。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ついでクーマシーブルー染色して上
清のタンパク質濃度を決定する前に、ゲル片を沈降させた。ゲル精製した融合タ
ンパク質を用いて以下のように動物を免疫した：ウサギ中でのポリクローナル抗体用免疫プロトコール
０．７ｍＬのＰＢＳ中３５μｇのゲル精製した融合タンパク質と０．７ｍＬの
完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントのそれぞれと
を免疫ごとに用いた：
０日目：１次免疫（完全フロイントアジュバント）
１４日目：２次免疫（不完全フロイントアジュバント：ｉｃＦＡ）
２８日目：３次免疫（ｉｃＦＡ）
５６日目：４次免疫（ｉｃＦＡ）
８０日目：出血により致死。
ウサギ血清を免疫ブロット中で試験した。この目的のために、本発明の実施例
１の融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセ
ルロースフィルターに移した（例えば、クイセ−アンダーセン（Khyse-Andersen
)，J.，J．Biochem．Biophys．Meth．10(1984)、203-209)。ボック(Bock，C.-T.
)ら、Virus Genes 8，(1994)，215-229に記載のように、ウエスタンブロット分
析を行った。この目的のために、ニトロセルロースフィルターを１次抗体と３７
℃で１時間インキュベートした。この抗体はウサギ血清（ＰＢＳ中に１：１００
００）であった。ＰＢＳを用いて数回洗浄した後、ニトロセルロースフィルター
を２次抗体を用いてインキュベートした。この抗体は、ＰＢＳ中アルカリホスフ
ァターゼ共役したモノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ダイアノバカンパニ
ー）（１：５０００）であった。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓを用いて数回洗浄し、次いで、室温でバンドが見えるまで、顕色溶液（３６μ
Ｍ ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４００μＭ ニ
トロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）とのアルカリホスファターゼ検出反応
を行った。
本発明のポリクローナル抗体が調製できることが示された。ニワトリ中でのポリクローナル抗体用免疫プロトコール
０．８ｍＬのＰＢＳ中４０μｇのゲル精製した融合タンパク質と０．８ｍＬの
完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントのそれぞれと
を免疫ごとに用いた。
０日目：１次免疫（完全フロイントアジュバント）
２８日目：２次免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）
５０日目：３次免疫（ｉｃＦＡ）
抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリクロー
ナル抗体を検出した。マウス中でのモノクローナル抗体用免疫プロトコール
０．２５ｍＬのＰＢＳおよび０．２５ｍＬの完全フロイントアジュバントおよ
び不完全フロイントアジュバントそれぞれの中の１２μｇのゲル精製した融合タ
ンパク質を免疫ごとに用いた。４次免疫において融合タンパク質を０．５ｍＬ（
アジュバントなし）中に溶解した。
０日目：１次免疫（完全フロイントアジュバント）
２８日目：２次免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）
５６日目：３次免疫（ｉｃＦＡ）
８４日目：４次免疫（ｉｃＦＡ）
８７日目：融合。
ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクロー
ナル抗体を検出した。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１０年１０月７日（１９９８．１０．７）
【補正内容】
請求の範囲
１． 図１のアミノ酸配列または１もしくは複数のアミノ酸が該アミノ酸配列と
は異なるアミノ酸配列を含有し、後者のアミノ酸配列を有するタンパク質が公知
のＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロンと通常の条件下でのハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡレベル上は異なるものであるＧＡＢＡAレセプター
サブユニットイプシロン関連タンパク質。
２． 図２のアミノ酸配列を含有することを特徴とする、請求項１記載のタンパ
ク質。
３． ＧＡＢＡAレセプターにより含有されることを特徴とする、請求項１また
は２記載のタンパク質。
４． （ａ）図１のＤＮＡまたは該ＤＮＡとは１若しくは複数の塩基対が異なる
ＤＮＡであり、後者のＤＮＡが通常の条件下でのハイブリダイゼーションにより
公知のＧＡＢＡAレセプターサブユニットイプシロンのＤＮＡとは異なるもので
ある、
（ｂ）縮重遺伝子コードを介して、（ａ）のＤＮＡに関連するＤＮＡ、を含有し
てなる、請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
５． 請求項４記載のＤＮＡ、すなわち図３のＤＮＡ。
６． 請求項４記載のＤＮＡ、すなわち図２のＤＮＡ。
７． 請求項４〜６いずれか記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。
８． 請求項７記載の発現プラスミドを含む形質転換体。
９． 適切な条件下での請求項８記載の形質転換体の培養を含む、請求項１また
は２記載のタンパク質を生産する方法。
１０． 請求項１〜３いずれか記載のタンパク質に対する抗体。
１１． 診断および／または治療のための薬剤としての請求項１〜３いずれか記
載のタンパク質の使用。
１２． 脳内シグナル伝達の検査および／または治療のための薬剤としての請求
項４〜６いずれか記載のＤＮＡの使用。
１３． 治療が請求項１〜３いずれか記載のタンパク質に影響を及ぼす物質の検
出を含む、請求項１１または１２記載の使用。
１４． 脳内シグナル伝達の検査および／または治療のための薬剤としての請求
項１０記載の抗体の使用。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28
16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ヴィルケ，クラウス
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
―69118 シュロス―ヴォルフスブルンネ
ンヴェーク 60
(72)発明者 キオシス，ペトラ
ドイツ連邦共和国 ヘッデシャイム デー
―68542 ヴィーラントシュトラーセ ５