JP2001521378A

JP2001521378A - アポトーシスを阻害するためのタンパク質

Info

Publication number: JP2001521378A
Application number: JP54106998A
Authority: JP
Inventors: クラメル，ペーテル; ペーテル，マルクス; スカフィーディ，カルシュテーン
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2001-11-06
Also published as: DE19713434C1; WO1998044103A3; EP0973903A2; WO1998044103A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アポトーシスの阻害に適するタンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ及び該タンパク質の製造法に関する。また本発明は、該ＤＮＡ及び該タンパク質の使用、並びに該タンパク質に対する抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アポトーシスを阻害するためのタンパク質本発明は、アポトーシスの阻害に適するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ及び該タンパク質の製造法に関する。本発明は、また、該ＤＮＡ及び該タンパク質の使用並びに該タンパク質に対する抗体に関する。アポトーシスは、計画された細胞死である。それは、例えばウイルス等の有害物質を避けるための免疫系により使用される。この目的のため、ウイルス特異的Ｔリンパ球はウイルスが感染した体のそれら細胞を攻撃し、そしてパーフォリン等のアポトーシス誘導性タンパク質を放出することによりそれらを殺傷する。Ｔリンパ球はＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）リガンドも発現でき、それにより細胞死がＣＤ９５経路を介して進行する。この経路は、次いでアダプタータンパク質ＦＡＤＤと相互作用するＣＤ９５レセプターへのＣＤ９５リガンドの結合を含んでなり、それによりプロテアーゼＦＬＩＣＥの動員及び活性化がＤＩＳＣ（「死誘導シグナリング複合体」）において誘導される。さらなる研究は、アポトーシスは、種々の疾病の発達の原因でもあるという事実に言及する。そのような疾病としては、例えばＡＩＤＳ、自己免疫疾患及び神経変性疾患がある。これら疾病に対抗する処置を採るためには、アポトーシスを阻害し得る物質を所有することが有効であろう。しかしながら、そのような物質はこれまでに不充分にしか知られていない。従って、本発明の目的は、アポトーシスを阻害し得る生成物（Ｍｉｔｔｅｌ）を提供することである。本発明によれば、このことは請求の範囲に規定される主題により達成される。従って、本発明の主題は、アポトーシスの阻害に適する、図１のアミノ酸配列又はそれとは１つ若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に関する。本発明は、動物、詳しくは哺乳動物、さらに詳しくはヒトに、アポトーシスを阻害し得るタンパク質が存在するという出願人の発見に基づくものである。このタンパク質は、図１のアミノ酸配列又はそれとは１つ若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含んでなる。さらに出願人は、該タンパク質がアダプタータンパク質ＦＡＤＤと相互作用し、それによりプロテアーゼＦＬＩＣＥの動員及ひ活性化がＤＩＳＣにおいて阻害されることを見出した。前記タンパク質は、本発明においてＦＬＩＰ（「ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質」）と称される。本発明のさらなる主題は、ＦＬＩＰをコードする核酸に関する。それはＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。後者は例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。下記を含有してなるＤＮＡが好ましい：（ａ）図１のＤＮＡ又はそれとは１つ若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）由来のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、又は（ｃ）縮重遺伝子コードを介して（ａ）又は（ｂ）由来のＤＮＡと関連するＤＮＡ。「ハイブリダイズするＤＮＡ」の語は、通常の条件下、特に、ＤＮＡの融解温度の２０℃以下において（ａ）に由来するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。図１のＤＮＡは、ＤＳＭ１１４８８及びＤＳＭ１１４８７それぞれの下、Ｃ− ＦＬＩＰ／２／Ｗ２３７９５及びＣ−ＦＬＩＰ／１／ＡＡ１１５７９２として、ＤＳＭ（ドイチェザムルングフォンミクロオルガニスメンウントツェルクルツレン）に１９９７年３月２５日に寄託した。本発明のＤＮＡはｃＤＮＡの形で以下に記載されている。それは本発明下において産出した（ｆａｌｌｅｎｄｅ）全てのＤＮＡについての態様である。本発明のｃＤＮＡは、一般の方法により製造され得る。基礎としてヒト発現ライブラリーを使用し、そして図１のＤＮＡ、特に囲まれた（ｕｍｒａｎｄｅｔｅｎ）ＤＮＡ領域の５’領域及び３’領域それぞれに関するプライマーによりそれをスクリーニングすることが好ましい。一般の条件、特に前記の条件がハイブリダイゼーションの条件として選択され得る。次いで、陽性のクローンをそれらのアポトーシス阻害活性について一般の方法により試験し得る。本発明のｃＤＮＡは、ベクター及び発現ベクターそれぞれに存在し得る。当業者はその例に精通している。大腸菌についての発現ベクターの場合、これらは例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂ及びｐＱＥ−８である。酵母における発現については、例えばｐＹ１００及びＹｃｐａｄ１が言及されるべきであり、一方、例えばｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭＢ、ｐＣＥＶ４及びｐＥＦｒｓＦＬＡＧが動物細胞における発現について示されるべきである。バキュロウイルス発現ベクターであるｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは昆虫細胞における発現に特に適している。当業者は、発現ベクターの中に存在する本発明のｃＤＮＡの発現に適する細胞に精通している。そのような細胞の例は、大腸菌株であるＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１及びＳＧ１３００９、酵母株であるサッカロミセスセレビシエ、及び動物細胞であるＬ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ及びＢＪＡＢ並びに昆虫細胞であるｓｆ９を含む。当業者は、本発明のｃＤＮＡが発現ベクターに挿入されるべき方法を知っている。当業者は、このＤＮＡは他のタンパク質及びペプチドそれぞれをコードするＤＮＡと組み合わせて挿入され得、それにより本発明のｃＤＮＡは融合タンパク質の形で発現され得るという事実にも精通している。さらに、当業者は、形質転換した細胞及びトランスフェクトした細胞それぞれを培養する条件を知っている。当業者は、本発明のｃＤＮＡにより発現されるタンパク質の単離及び精製の方法にも精通している。したがって、そのようなタンパク質、それは融合タンパク質であってよいが、それもまた本発明の主題を表すものである。本発明のさらなる主題は、前記タンパク質及び融合タンパク質それぞれに対する抗体に関する。そのような抗体は、一般の方法により製造され得る。それはポリクローナル及びモノクローナルそれぞれであってよい。その製造のため、動物、−特にポリクローナル抗体についてはウサギ又はニワトリを、そしてモノクローナル抗体についてはマウス−を、前記（融合）タンパク質又はそのフラグメントにより免疫することが好ましい。さらなる動物の「追加抗原」は同じ（融合）タンパク質又はそのフラグメントにより行われ得る。次いで、ポリクローナル抗体が動物血清及び卵黄それぞれから得られ得る。モノクローナル抗体の製造のため、動物脾臓細胞をミエローマ細胞と融合する。図２のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する本発明の抗体はＮＦ６としてＤＳＭに１９９８年４月１日に寄託した。本発明により、特にＡＩＤＳ、自己免疫疾患及び神経変性疾患等の特定の疾病の症例におけるアポトーシス及びその作用の詳細な検査を行ない得る。本発明の核酸、特にＤＮＡ及びそれに由来するプライマーにより、前記趣旨内で、哺乳動物、特にヒトがＦＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子を含んでいるか及び／又は発現しているかを同定し得る。この目的のため、当業者は逆転写、ＰＣＲ反応ハイブリダイゼーション及び配列決定等の一般の方法を行うであろう。本発明によりキットもまた提供され、該キットは前記核酸、特にＤＮＡ、及び／又はそれに由来するプライマー並びに担体及び通常の補助剤を含んでいる。さらに、本発明は、アポトーシスの阻害に適する。これはＡＩＤＳ及び神経変性疾患等の疾病に特に重要である。本発明のＦＬＩＰタンパク質は哺乳動物、特にヒトに挿入され得る。この目的のため、例えばトランスフェリン又はＢＳＡ等の個々の体により異質（ｆｒｅｍｄ）とみなされないタンパク質とＦＬＩＰを結合することが好ましくあり得る。本発明の核酸、特にＤＮＡは、また、哺乳動物、特にヒトに挿入され得、そこで発現する。この目的のため、本発明の核酸の発現を組織特異的プロモーターにより制御することが好ましくあり得る。当業者は哺乳動物における核酸の発現に適するベクターに精通している。さらに、ＦＬＩＰの発現は、本発明の抗体により制御又は調節され得る。抗体も、前記キットに存在し得る。従って、本発明は、アポトーシス過程の診断及び治療における理解に多大な寄与を示すものである。この点について、診断調査は出産後だけでなく既に出産前に成され得る。図面の簡単な説明：図１は、塩基配列及びそれに由来し、かつ本発明のＦＬＩＰタンパク質により含有されるアミノ酸配列を示す。囲まれた配列はＤＥＤ（デスエフェクタードメイン）領域を示す。図１の配列はＤＳＭ１１４８８に見出される。図２は、塩基配列及びそれに由来し、かつ本発明のＦＬＩＰタンパク質により含有されるアミノ酸配列を示す。図２の配列はＤＳＭ１１４８７に見出される。図３は、（Ａ）において、細胞における本発明のＦＬＩＰタンパク質の発現を示す。ＦＬＡＧ−Ｔａｇ部分のため、本発明のＦＬＩＰタンパク質（ＦＬＩＰ− ＦＬＡＧ）は、細胞により内在的に発現されたＦＬＩＰタンパク質よりも遅い泳動様式を示す。（Ｂ）では、本発明のＦＬＩＰタンパク質の阻害作用gaＣＤ９５で仲介されるアポトーシスにおいて示されており、（Ｃ）では、その阻害作用がプロテアーゼＦＬＩＣＥの活性化において示されている。本発明を以下の実施例により説明する。実施例１：本発明のＦＬＩＰタンパク質の調製及び精製本発明のＦＬＩＰタンパク質の調製のため、図１のＤＮＡにＢａｍＨＩリンカーを付し（ｖｅｒｓｅｈｅｎ）、次いでＢａｍＨＩを用いて切り出し、そしてＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＱＥ８（ダイアジェンカンパニー）に挿入する。発現プラスミドｐＱ／ＦＬＩＰを得る。そのようなプラスミドは、６つのヒスチジン残基（Ｎ末端パートナー）と本発明の図１のＦＬＩＰタンパク質（Ｃ末端パートナー）とを含有してなる融合タンパク質をコードする。ｐＱ／ＦＬＩＰを使って、大腸菌ＳＧ１３００９（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｉｏｌ．１４８、（１９８１）、２６５−２７３参照）を形質転換する。細菌を１０μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌカナマイシンとを含むＬＢブロスで培養し、そして６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導する。細菌の溶解を６Ｍグアニジン塩酸塩の添加より行う。その後、クロマトグラフィー材料の製造者（ダイアジェンカンパニー）の指示に従って、８Ｍ尿素の存在下に溶解物によりクロマトグラフィー（Ｎｉ− ＮＴＡ樹脂）を行う。ｐＨ３．５を有するバッファー中に結合した融合タンパク質を溶出する。その中和の後、融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてクーマシーブルーで染色する（Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｏ．とＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９（１９７５）、７０９−７３３）。本発明の（融合）タンパク質が高度に精製された形で調製され得ることを示す。実施例２：本発明の抗体の調製及び検出本発明の実施例１の融合タンパク質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。４Ｍ酢酸ナトリウムでゲルを染色後、約２０−６０ｋＤのバンドをゲルから切り出し、そしてリン酸塩で緩衝化された一般の塩溶液中でインキュベートする。ゲル片を沈降させ、クーマシーブルー染色が後に続くＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により上清のタンパク質濃度を測定する。動物を以下のようにしてゲル精製融合タンパク質により免疫する：ウサギにおけるポリクローナル抗体についての免疫プロトコル０．７ｍｌＰＢＳ中の３５μｇゲル精製融合タンパク質並びに０．７ｍｌ完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントそれぞれを１回の免疫当たりに使用する：０日：１次免疫（完全フロイントアジュバント）１４日：２次免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）２８日：３次免疫（ｉｃＦＡ）５６日：４次免疫（ｉｃＦＡ）８０日：出血多量死ウサギ血清をイムノブロットで試験する。この目的のため、本発明の実施例１の融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてニトロセルロース膜に転写する（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．１０（１９８４）、２０３−２０９参照）。ウエスタンブロット分析をＢｏｃｋ，Ｃ．−Ｔ．ら、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ８、（１９９４）、２１５−２２９に記載されるようにして行う。この目的のため、ニトロセルロース膜を３７℃で１時間１次抗体とインキュベートする。この抗体はウサギ血清である（ＰＢＳ中１：１００００）。ＰＢＳを用いた数回の洗浄工程の後、ニトロセルロース膜を２次抗体とインキュベートする。この抗体はＰＢＳ中のアルカリホスファターゼ結合モノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ディアノバカンパニー）（１：５０００）である。３７℃で３０分のインキュベーションに続きＰＢＳを用いる数回洗浄工程を経て、そして続いて発色液（３６μＭ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩、４００μ Ｍニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ９．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム）によりアルカリホスファターゼ検出反応をバンドが見えるまで室温で行う。本発明のポリクローナル抗体が調製され得ることが示される。ニワトリにおけるポリクローナル抗体についての免疫プロトコル０．８ｍｌＰＢＳ中の４０μｇゲル精製融合タンパク質並びに０．８ｍｌ完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントそれぞれを１回の免疫当たりに使用する：０日：１次免疫（完全フロイントアジュバント）２８日：２次免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）５０日：３次免疫（ｉｃＦＡ）抗体を卵黄から抽出し、そしてウエスタンブロットで試験する。本発明のポリクローナル抗体を検出する。マウスにおけるモノクローナル抗体についての免疫プロトコル０．２５ｍｌＰＢＳ中の１２μｇゲル精製融合タンパク質並びに０．２５ｍｌ完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントそれぞれを１回の免疫当たりに使用する。融合タンパク質を４次免疫において０．５ｍｌ（アジュバントなし）に溶解する。０日：１次免疫（完全フロイントアジュバント）２８日：２次免疫（不完全フロイントアジュバント；ｉｃＦＡ）５６日：３次免疫（ｉｃＦＡ）８４日：４次免疫（ＰＢＳ）８７日：融合ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験する。本発明のモノクローナル抗体を同定する。実施例３：細胞における本発明のＦＬＩＰタンパク質の発現及びその作用（ａ）図２のＤＮＡにＥｘｏＲ５−／ＸｂａＩリンカーを付し、次いでＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いて切り出し、そして同じ制限酵素で切断した発現ベクターｐＥＦｒｓＦＬＡＧに挿入する。発現プラスミドｐＥＦｒｓＦＬＡＧ−ＦＬＩＰを得る。それは、ＦＬＡＧ−Ｔａｇ（Ｎ末端パートナー）及び本発明の図２のＦＬＩＰタンパク質（Ｃ末端パートナー）に由来の融合タンパク質ＦＬＡＧ−ＦＬＩＰをコードする。ｐＥＦｒｓＦＬＡＧ−ＦＬＩＰを使って、ヒト細胞ＢＪＡＢをトランスフェクションする。抽出物をトランスフェクトした細胞から得、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離する。次いで、ウエスタンブロット法を行い、実施例２のモノクローナル抗体を使って、発現したＦＬＩＰタンパク質を検出する。抗マウス抗体を使って抗体結合を検出する（図３Ａ参照）。本発明のＦＬＩＰタンパク質が細胞において発現され得、本発明の抗体により検出され得ることを示す。（ｂ）ｐＥＦｒｓＦＬＡＧ−ＦＬＩＰによりトランスフェクトした前記ＢＪＡＢ細胞を３７℃で１６時間の１０ｎｇ／ｍｌ抗ＡＰＯ−１による処理あり又はなしでインキュベートする。抗ＡＰＯ−１を使った処理により、ＣＤ９５で仲介されるアポトーシスを誘導する。ＤＮＡ断片化を同定することによりアポトーシス細胞の量を測定する（図３Ｂ参照）。ＣＤ９５で仲介されるアポトーシスが本発明のＦＬＩＰタンパク質の発現により阻害され得ることを示す。（ｃ）ＢＪＡＢ細胞とｐＥＦｒｓＦＬＡＧ−ＦＬＩＰによりトランスフェクトしたＢＪＡＢ細胞とを１μｇ／ｍｌ抗ＡＰＯ−１により処理する。細胞抽出物を回収し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動により分離する。次いで、ウエスタンブロット法を行い、その際プロテアーゼＦＬＩＣＥに対する抗体を使用する（図３Ｃ参照）。本発明のＦＬＩＰタンパク質が発現する細胞において、ＦＬＩＣＥの活性化、すなわち活性なサブユニットｐ１８への分離（Ｓｐａｌｔｕｎｇ）が阻止されることを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年７月１２日（１９９９．７．１２）【補正内容】請求の範囲１．図１のアミノ酸配列又はそれとは１つ若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有してなるタンパク質であって、後者のアミノ酸配列のＤＮＡは通常の条件下で図１のＤＮＡとハイブリダイズするものである、アポトーシスの阻害に適するタンパク質。２．図２のアミノ酸配列を含有してなる、請求項１記載のタンパク質。３．請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡであって、（ａ）図１のＤＮＡ又はそれとは１つ若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）由来のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、又は（ｃ）縮重遺伝子コードを介して（ａ）又は（ｂ）由来のＤＮＡと関連するＤＮＡを含有してなるＤＮＡ。４．図２の塩基配列を含有してなる請求項３記載のＤＮＡ。５．請求項３又は４記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。６．請求項５記載の発現プラスミドを含有してなる形質転換体。７．適する条件下に請求項６記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質の製造法。８．請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。９．アポトーシスを阻害するための試薬としての請求項１又は２記載のタンパク質の使用。１０．アポトーシスを診断及び／又は阻害するための試薬としての請求項３又は４記載のＤＮＡの使用。１１．アポトーシス阻害がＡＩＤＳ又は神経変性疾患の症例に作用する、請求項９又は１０記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ペーテル，マルクスドイツ連邦共和国マンハイムデー― 68235 ズィンシャイマーシュトラーセ 52 (72)発明者スカフィーディ，カルシュテーンドイツ連邦共和国ハイデルベルクデー ―69126 クリスチャン―ビター―シュトラーセ 28

Claims

【特許請求の範囲】１．図１のアミノ酸配列又はそれとは１つ若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有してなる、アポトーシスの阻害に適するタンパク質。２．図２のアミノ酸配列を含有してなる、請求項１記載のタンパク質。３．請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡであって、（ａ）図１のＤＮＡ又はそれとは１つ若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）由来のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、又は（ｃ）縮重遺伝子コードを介して（ａ）又は（ｂ）由来のＤＮＡと関連するＤＮＡを含有してなるＤＮＡ。４．図２の塩基配列を含有してなる請求項３記載のＤＮＡ。５．請求項３又は４記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。６．請求項５記載の発現プラスミドを含有してなる形質転換体。７．適する条件下に請求項６記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質の製造法。８．請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。９．アポトーシスを阻害するための試薬としての請求項１又は２記載のタンパク質の使用。１０．アポトーシスを診断及び／又は阻害するための試薬としての請求項３又は４記載のＤＮＡの使用。１１．アポトーシス阻害がＡＩＤＳ又は神経変性疾患の症例に作用する、請求項９又は１０記載の使用。