JP2000500962A

JP2000500962A - Ｆｍｒ１関連蛋白質

Info

Publication number: JP2000500962A
Application number: JP9513875A
Authority: JP
Inventors: プーストカ，アンネマリー; コイ，ヨハネス
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 2000-02-02
Also published as: WO1997012969A2; DE19534763C1; EP0851923A2; WO1997012969A3

Abstract

(57)【要約】ＦＭＲ１関連蛋白質ならびに該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の調製方法、該ＤＮＡおよび蛋白質の使用、ならびに該蛋白質に対する抗体が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ＦＭＲ１関連蛋白質本発明は、ＦＭＲ１関連蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよび該蛋白質の調製方法に関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡおよび蛋白質の使用、ならびに該蛋白質に対する抗体に関する。ＦＭＲ１は、例えば、ＦＭＲ１のｍＲＮＡおよび胎児脳のｍＲＮＡなどに結合するＲＮＡ結合蛋白質である。ＦＭＲ１は、しばしば精巣、胎児卵巣および大脳ニューロンにみられる。ＦＭＲ１の欠損およびその欠失は、それぞれ精神遅滞を患っている患者、具体的にはぜい弱Ｘ症候群を患っている患者にみられる。とりわけ多動を示す精神病は、遺伝的で、男性では約１：１５００および女性では約１：２５００の頻度で起き、男性におけるその重度は女性における重度より通常重い。しかしながら、ＦＭＲ１の欠損およびその欠失が、それぞれどのように精神遅滞、具体的にはぜい弱Ｘ症候群を起こすかという作用の正確な様式は、知られていない。しかし、このことは、精神遅滞の場合におけるよりよい診断上の介入および治療上の介入の目的に必要である。したがって、本発明の目的は、精神遅滞、具体的にはぜい弱Ｘ症候群をより検査し、必要に応じて治療する生成物を提供することである。本発明によると、このことは、請求の範囲の主題によって達成される。このように、本発明の主題は、図１のアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列とは１もしくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＦＭＲ１関連蛋白質に関する。かかる蛋白質を、以後「ＦＸＲ２」という。本発明は、ＦＭＲ１に関してホモロジーを有し、必要に応じてＦＭＲ１活性を有するが、ＤＮＡレベルにおいて通常の条件下でハイブリダイゼーションによってＦＭＲ１と異なる蛋白質が、動物、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトにおいて存在するという出願人の発見に基づいている。かかる蛋白質は、図１のアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列とは１もしくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる主題は、ＦＸＲ２をコードする核酸に関する。これは、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡであってもよい。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡであってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。好ましくは、下記：（ａ）図１のＤＮＡまたはそのＤＮＡとは１もしくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは（ｃ）縮重遺伝暗号を介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡを含むＤＮＡである。「ハイブリダイズするＤＮＡ」という用語は、通常の条件下、特に該ＤＮＡの融解温度の２０℃以下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。本発明のＤＮＡを、以後ｃＤＮＡ型で記載する。ｃＤＮＡは、本発明の範疇に属する全ＤＮＡの例示である。本発明のｃＤＮＡの調製について、ｃＤＮＡライブラリーλ−Ｚａｐ（Strata gene company、カタログ番号９３６２０６）などの胎児脳のｃＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーＨＬ３０１８ｂ（Clontech company）などの胎児心臓のｃＤＮＡライブラリーなどのヒトｃＤＮＡライブラリーを基礎として用いることが好ましい。かかるｃＤＮＡライブラリーのクローンを、フィルター膜に固定し、低下させたストリンジェンシー、具体的には該ＤＮＡの融解温度の２７℃以下で、標識ＦＭＲ１ｃＤＮＡ試料とハイブリダイズさせる。陽性クローンを配列決定し、それによってＦＸＲ２をコードするＤＮＡを含むクローンを同定する。本発明のｃＤＮＡは、べクターおよび発現べクターそれぞれに存在することができる。当業者であれば、それらの具体例に精通している。大腸菌の発現べクターの場合、これらは、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ派生物、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８などであり、後者が好ましい。酵母における発現については、例えば、ｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１などが挙げられ、一方、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４などが動物細胞における発現について示される。バキュロウイルス発現べクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが、昆虫細胞における発現に対して特に好適である。当業者であれば、発現べクターに存在する本発明のｃＤＮＡを発現するための好適な細胞に精通している。かかる細胞の具体例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９などが含まれ、後者が好ましく、また、酵母株サッカロミセスセレビシエおよび動物細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ９などが含まれる。当業者であれば、本発明のｃＤＮＡを発現べクターに挿入する方法を知っている。また、当業者であれば、該ＤＮＡを他の蛋白質およびぺプチドをそれぞれコードするＤＮＡとの組み合わせで挿入することができ、それにより、本発明のｃＤＮＡが融合蛋白質の型で発現されうることに精通している。また、当業者であれば、形質転換細胞およびトランスフェクトされた細胞を、それぞれ培養する条件を知っている。また、当業者であれば、本発明のｃＤＮＡによって発現された蛋白質を単離し、精製する方法に精通している。したがって、融合蛋白質であってもよいかかる蛋白質もまた、本発明の主題を表す。本発明のさらなる主題は、前記蛋白質および融合蛋白質それぞれに対する抗体に関する。かかる抗体は、通常の方法によって調製し得る。それは、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。その調製については、動物、具体的には、ポリクローナル抗体に対してはウサギまたはニワトリ、モノクローナル抗体に対してはマウスを、前記（融合）蛋白質またはその断片で免疫することが好ましい。同一の（融合）蛋白質またはその断片での該動物のさらなる「ブースター」は効果的であり得る。次に、ポリクローナル抗体は、動物血清および卵黄それぞれから得てもよい。モノクローナル抗体に関しては、動物脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。本発明は、精神遅滞、具体的にはぜい弱Ｘ症候群をより良く検査することを可能にする。ＦＸＲ２は、本発明の抗体によってヒトの体液において検出され得る。ＦＸＲ２と前記疾患の進行および形成との間の関連を、確立することができる。また、該蛋白質に対する自己抗体は、本発明のＦＸＲ２によって検出され得る。しかしながら、他の蛋白質、具体的には精神遅滞に関連する蛋白質との相互作用は、本発明のＦＸＲ２によって検出することができるので、これらの蛋白質の機能を明らかにすることが可能であり、必要に応じて該蛋白質のための治療上の測定または該蛋白質に対する治療上の測定が行われ得る。前記検出は、通常の方法、具体的にはウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法または免疫蛍光法によってなし得る。また、ＦＸＲ２をコードする遺伝子の発現を、本発明の核酸、具体的にはそれ由来のＤＮＡおよびプライマーにより検出できる。この検出は、常法、具体的にはサザンブロットで行われ得る。他にも、本発明は、ヒトのＦＸＲ２の存在のための測定およびヒトのＦＸＲ２の存在に対する測定を行うのに好適である。ＦＸＲ２は、ヒトにおいて本発明の抗体によって阻害され得る。一方、ヒトにおけるＦＸＲ２の量は、本発明のＦＸＲ２によって増加し、具体的には、トランスフェリンまたはＢＳＡなどの体によって外来性であるとみなされない蛋白質への結合後に増加する。同じことは、本発明の核酸、具体的には、例えば脳、心臓などの特定の組織において誘導可能なプロモーターによってコントロールされ、それに関してその発現がこれらの組織におけるＦＸＲ２の提供という結果を生じるＤＮＡによって同様に達成され得る。さらに、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡは、ＦＸＲ２を阻害するために用いることもできる。この目的のため、該核酸を、例えば、ＦＸＲ２をコードする遺伝子の発現阻害のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製するための基礎として用いる。したがって、本発明は、精神遅滞、具体的にはぜい弱Ｘ症候群の診断上の検出および治療上の検出への主要な寄与を示す。図面の簡単な説明図１は、本発明のＦＸＲ２蛋白質の塩基配列およびそれから得られたアミノ酸配列を示す。本発明を、以下の実施例によって説明する。実施例１：本発明のＦＸＲ２蛋白質の調製および精製本発明のＦＸＲ２蛋白質を調製するために、図１のＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣＲ法を行った。用いたプライマー対は、以下のものであった： 5'-CAGAGATCTATGCTGGCAATTGGGACTCACGGTGC-3' および 5'-GGGAAGCTTTTAAGATTTATCCACAATCTCCTGGA-3' 。ＰＣＲバッチおよびＰＣＲ条件は、それぞれ下記の通りである：ＰＣＲバッチ鋳型ＤＮＡ（図１）：１μｌ＝１ｎｇＰｆｕポリメラーゼ１０×緩衝液：１０μｌ＝１× ＤＭＳＯ：１０μｌ＝１０％ｄＮＴＰｓ：１μｌ=各２００μＭオリゴヌクレオチド、各１．５μｌ：３μｌ=各１５０ｎｇ再蒸留Ｈ₂Ｏ：９９μｌに調節ＰＣＲ条件 − ９２℃５分間 − １μｌのＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene company）＝２．５ユニットの添加 − パラフィンの添加ＰＣＲ９２℃ １分間５８℃ １分間１サイクル７２℃ １０分間９２℃ １分間５８℃ １分間３９サイクル７２℃ ２分間７２℃ １０分間１サイクル増幅されたＤＮＡを、Ｂｇ１II・およびＨｉｎｄIIIそれぞれで切断し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断した発現ベクタ−ｐＱＥ−８（Diagen company ）に挿入した。発現プラスミドｐＱ／ＦＸＲ２を得た。かかるプラスミドは、６個のヒスチジン残基（Ｎ末端部分）および本発明の図１のＦＸＲ２蛋白質（Ｃ末端部分）からなる融合蛋白質をコードする。ｐＱ／ＦＸＲ２を用いて大腸菌ＳＧ１３００９（Gottesman，S．et al.，J．Bacteriol，148，(1981)，265-273参照）を形質転換した。該細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢブロス中で培養し、６０μＭのイソプロピル− β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。該細菌の溶解を、６Ｍ塩酸グアニジンの添加によって達成した。次に、クロマトグラフィー材料の製造業者（Diagen company）の使用説明書に従って、８Ｍ尿素の存在下で溶解物でクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を行った。結合した融合蛋白質を、ｐＨが３．５である緩衝液に溶出させた。それの中和後、融合蛋白質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クーマシーブルーで染色した（Thom as，J．O．and Kornberg，R．D.，J．Mol．Biol．149(1975)，709-733参照）。本発明の融合蛋白質が高純度の形で調製され得ることが示された。実施例２：本発明の抗体の調製および検出本発明の実施例１の融合蛋白質を、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。４Ｍ酢酸ナトリウムを用いてゲルを染色したのち、約８．８ｋＤのバンドをゲルから切り出し、リン酸緩衝化塩溶液中でインキュベートした。ゲル片を沈殿させたのち、上清の蛋白質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ののちクーマシーブルーで染色して決定した。ゲル精製した融合蛋白質を用いて、以下のように動物を免疫した。ウサギにおけるポリクローナル抗体用免疫プロトコール免疫あたり、０．７ｍｌのＰＢＳ中３５μｇのゲル精製した融合蛋白質と０．７ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントのそれぞれとを用いた。０日目：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）１４日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント：ｉｃＦＡ）２８日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）５６日目：４回目の免疫（ｉｃＦＡ）８０日目：採血して死亡。ウサギ血清をイムノブロットで試験した。この目的のため、本発明の実施例１の融合蛋白質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした（Khyse-Andersen，J.，J．Biochem．Biop hys．Meth．10，(1984)，203-209参照）。ウエスタンブロット分析を、Bock，C. -T．et al.，Virus Genes 8，(1994)，215-229に記載のように行った。この目的のため、ニトロセルロースフィルターを一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした。この抗体は、ウサギ血清（ＰＢＳ中１：１００００）であった。ＰＢＳを用いた数回の洗浄工程ののち、ニトロセルロースフィルターを、二次抗体とインキュベートした。この抗体は、ＰＢＳ中のアルカリ性ホスファターゼ結合モノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Dianova company）（１：５０００）であった。３７℃での３０分間のインキュベーションののち、ＰＢＳを用いた数回の洗浄工程、続いて発色溶液（３６μＭ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４００μＭニトロプルーテトラゾリウム、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ９．５、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂）でのアルカリ性ホスファターゼ検出反応を、室温でバンドか見えるまで行った。本発明のポリクローナル抗体が調製され得ることが示された。ニワトリにおけるポリクローナル抗体用免疫プロトコール免疫あたり、０．８ｍｌのＰＢＳ中４０μｇのゲル精製した融合蛋白質と０．８ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントのそれぞれとを用いた。０日目：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）２８日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ）５０日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）抗体を卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリクローナル抗体が検出された。マウスでのモノクローナル抗体用免疫プロトコール免疫あたり、０．２５ｍｌのＰＢＳ中１２μｇのゲル精製した融合蛋白質と０．２５ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントのそれぞれとを用いた。４回目の免疫では、融合蛋白質を０．５ｍｌ（アジュバントなし）に溶解させた。０日目：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）２８日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ）５６日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）８４日目：４回目の免疫（ＰＢＳ）８７日目：融合ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクローナル抗体が検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．図１のアミノ酸配列または該アミノ酸配列とは１以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有してなるＦＭＲ１関連蛋白質。２．請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。３．下記：（ａ）図１のＤＮＡまたは該ＤＮＡとは１もしくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、あるいは（ｃ）縮重遺伝暗号を介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに関連するＤＮＡを含有してなる請求項２記載のＤＮＡ。４．請求項２または３記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。５．請求項４記載の発現プラスミドを含有してなる形質転換体。６．好適な条件下での請求項５記載の形質転換体の培養工程を含む請求項１記載の蛋白質の調製方法。７．請求項１記載の蛋白質に対する抗体。８．診断薬および／または治療薬としての請求項１記載の蛋白質の使用。９．診断薬および／または治療薬としての請求項２または３記載のＤＮＡの使用。１０．診断薬および／または治療薬としての請求項７記載の抗体の使用。