JPH11187884A - 熱ショック転写因子結合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】精子形成に必須の役割を果たすＨＳＰ７０．２
の転写制御に関与可能な熱ショック転写因子（ＨＳＦ）
２結合因子、該結合因子をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転
換体、該形質転換体の培養工程を含む組換え蛋白質の製
造方法、該結合因子に特異的に結合する抗体又はその断
片、該ＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ
及び該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プローブ又はプライマーを提供すること。 【解決手段】ＨＳＦ２結合活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、該Ｄ
ＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形
質転換体、該形質転換体の培養工程を含む組換え蛋白質
の製造方法、該蛋白質に特異的に結合する抗体又はその
断片、該ＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮ
Ａ及び該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドプローブ又はプライマー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、熱ショック転写因
子結合蛋白質に関する。さらに詳しくは、熱ショック転
写因子２結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡからコードされる蛋白質、該ＤＮＡを含有する
発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換体、該蛋
白質の製造方法、該蛋白質に対する抗体、該ＤＮＡと相
補的なアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡお
よび該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドプローブまたはプライマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】熱ショック転写因子（heat shock facto
r;ＨＳＦ）は、種々のストレスに応答して熱ショック蛋
白質（ＨＳＰ）遺伝子のプロモーター上流に存在する熱
ショックエレメント（heat shock element; ＨＳＥ）に
結合し、かかるプロモーターからの転写を調節してい
る。

【０００３】高等真核生物のＨＳＦには、これまでにＨ
ＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ３およびＨＳＦ４の４種類が
存在することが知られている。このうちＨＳＦ１とＨＳ
Ｆ３は、熱、重金属、アミノ酸アナログなどのストレス
によって活性化されるが、ＨＳＦ２はこれらのストレス
には応答せず、発生分化に重要な役割を果たしていると
考えられている。また、ＨＳＦ４は転写活性化ドメイン
を持たず、他のＨＳＦのＤＮＡ結合に対して負の制御に
働いているとされている。

【０００４】ＨＳＦ２のＤＮＡ結合活性は、ヘミンで処
理したヒトＫ５６２赤白血病細胞ならびにマウス精巣の
精子細胞、マウスＦ９胚性癌腫細胞およびマウスの初期
発生過程で観察されている。しかし、ＨＳＦ１によるＨ
ＳＰ遺伝子の転写制御機構がよく研究され理解が進んで
いるのに対し、ＨＳＦ２による転写制御については不明
な点が多い。すなわち、ヘミンで処理したＫ５６２細胞
ではＨＳＦ２がＨＳＰ７０遺伝子上のＨＳＥに結合し
（Sistonen, L.ら、(1992) Mol. Cell. Biol. 12, 4104
-4144)、マウス精子形成細胞では精巣特異的なＨＳＰ７
０．２遺伝子上のＨＳＥに構成的に結合すること（Sarg
e, K. D.ら、(1994) Biol. Reprod. 50, 1334-1343) が
報告され、それぞれＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０．２の
発現にかかわっていることが予想されている。一方、Ｆ
９細胞中ではＨＳＰ７０プロモーター上流のＨＳＥへの
ＨＳＦ２の結合が認められておらず(Murphy, S. P.ら、
(1994) Mol. Cell. Biol. 14, 5309-5317)、さらにマウ
ス胚においても主要なＨＳＰとＨＳＦ２の発現パターン
に関連が見られていない（Rallu, M. ら、 (1997) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2392-2397）。

【０００５】Ｋ５６２細胞や精子形成細胞中で、ＨＳＦ
２が実際にＨＳＰ７０プロモーター上流のＨＳＥに結合
できることから、これらの細胞中にはＨＳＦ２の活性化
を制御する因子が存在する可能性が考えられる。しか
し、かかる制御因子は、現在までに知られていない。

【０００６】精子形成とは、未成熟な雄性生殖細胞であ
る精原細胞が有糸分裂により増殖して精母細胞となり、
これが減数分裂して精細胞を形成し、さらに複雑な形態
変化を経て精子に成熟するまでの過程をいう。この精子
形成過程の中で、ＨＳＰの発現は厳密に制御されてい
る。一般に、高温などの細胞にとって悪い環境（ストレ
ス）に曝されたとき、細胞内蛋白質の不可逆的な変性を
防ぎストレスによる障害から細胞を守るため、ＨＳＰが
速やかに誘導されるが、かかるストレスにより誘導され
るＨＳＰのほかに、平常時にも新生蛋白質の折畳みや会
合、細胞内輸送を助けるという機能を担っているＨＳＰ
（即ち、分子シャペロン）があり、これらは細胞内に構
成的に発現している。精子形成の過程で、生殖細胞の遺
伝子発現は大きく変化し、その結果、細胞内蛋白質が激
しく変動することから、これらの蛋白質の折畳みや局在
に必要なＨＳＰが必要な時期に正しく発現するように制
御されている（Sarge, K. D.と Cullen, K. E. (1997)
Cell. Mol. Life Sci. 53, 191-197）。

【０００７】精巣においても他の組織や細胞と同様に多
くのＨＳＰが同定されているが、マウス精巣で最も大量
に発現しているＨＳＰは、ＨＳＰ７０ファミリーに属す
るＨＳＰ７０．２であり、その発現は、精巣特異的かつ
構成的で熱ショックによっては誘導されない。ＨＳＰ７
０．２は、精子形成過程の減数分裂期すなわち精母細胞
から精細胞において大量に発現しており（Allen,ら、(1
988) Mol. Cell. Biol. 8, 828-832; Zakeri, Z. F.
ら、 (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 2925-2932 ）、ＨＳ
Ｐ７０．２遺伝子を破壊したマウスでは減数分裂が起こ
らず、その結果、精細胞が形成されず不妊になる（Dix,
D. J.ら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93, 32
64-3268 ）ことが報告されている。一方、ＨＳＦ２は、
精子形成過程の精母細胞から精細胞にかけて発現してお
り、イン・ビトロでＨＳＰ７０．２プロモーターに結合
できることから、分子シャペロンとして精子形成に必須
の役割を果たしているＨＳＰ７０．２の転写制御にＨＳ
Ｆ２が関与していることが示唆されている（Sarge, K.
D.ら、(1994) Biol. Reprod. 50, 1334-1343) 。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、精巣
特異的に発現して精子形成に必須の役割を果たすＨＳＰ
７０．２の転写制御に関与すると考えられているＨＳＦ
２の活性化制御因子として、ＨＳＦ２結合因子を提供す
ることにある。また、本発明の目的は、かかるＨＳＦ２
結合因子をコードするＤＮＡを提供することにある。さ
らに本発明の目的は、前記ＤＮＡまたはその一部を含有
する発現ベクターおよび該発現ベクターを含む形質転換
体を提供することにある。さらに本発明の目的は、前記
形質転換体を培養することによる組換え蛋白質の製造方
法を提供することにある。さらに本発明の目的は、かか
る制御因子に特異的に結合する抗体またはその断片を提
供することにある。さらに本発明の目的は、前記ＤＮＡ
と相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはアン
チセンスＲＮＡを提供することにある。さらに本発明の
目的は、前記ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを提供するこ
とにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、 〔１〕 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列から
なるペプチドをコードするＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１
個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された
アミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、 （ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列において、１個以
上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、および （ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から
なる群より選択されるＤＮＡであって、熱ショック転写
因子（ＨＳＦ）２結合活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡ、 〔２〕 前記〔１〕記載のＤＮＡによりコードされる蛋
白質、 〔３〕 前記〔１〕記載のＤＮＡの全部または一部を含
有してなる発現ベクター、 〔４〕 前記〔３〕記載の発現ベクターを含む形質転換
体、 〔５〕 前記〔４〕記載の形質転換体を、前記〔３〕記
載の発現ベクターからの蛋白質の発現が可能な条件下で
培養する工程を含む、組換えＨＳＦ２結合蛋白質の製造
方法、 〔６〕 前記〔２〕記載の蛋白質に特異的に結合する抗
体またはその断片、 〔７〕 前記〔１〕記載のＤＮＡと相補的な配列を有す
る、８塩基以上からなるアンチセンスＤＮＡまたはアン
チセンスＲＮＡ、 〔８〕 前記〔１〕記載のＤＮＡに特異的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマ
ー、に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明において、熱ショック転写
因子（ＨＳＦ）２とは、ヒトおよび哺乳動物を含む高等
真核生物由来のＨＳＦ２をいい、ヒト由来のＨＳＦ２が
好ましい。ヒトＨＳＦ２は、図１に示すように、ＤＮＡ
結合ドメイン（ＤＢＤ）、三量体形成のための疎水性の
繰り返し（ＨＲ−Ａ／Ｂ）および負の制御のためのＣ末
端疎水性の繰り返し（ＨＲ−Ｃ）を含む構造を有する。

【００１１】本発明のＨＳＦ２結合活性を有する蛋白質
は、ＨＳＦ２のいかなる領域に結合してもよいが、ＨＳ
Ｐ７０．２の転写制御に関与するＨＳＦ２の活性化を制
御するという観点から、ＨＳＦ２の転写活性化領域、転
写活性化抑制領域、三量体化領域のいずれかの領域に結
合することが好ましい。

【００１２】本発明のＨＳＦ２結合活性を有する蛋白質
（以下、ＨＳＦ２結合蛋白質；ＨＳＦ２ＢＰと略す場合
がある）とは、後記本発明のＤＮＡによりコードされる
蛋白質をいう。具体的には、配列番号：１に記載のアミ
ノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、これは、３３４
個のアミノ酸残基を有する分子量約３８ｋＤの精巣特異
的に発現している蛋白質であり、ヒトＨＳＦ２ＢＰと命
名されている。

【００１３】本発明のＨＳＦ２ＢＰのＨＳＦ２への結合
活性は、後述の実施例４に記載のグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイまたは実
施例５に記載のツーハイブリッドアッセイにより、それ
ぞれ、イン・ビトロまたはイン・ビボで測定することが
できる。

【００１４】本発明のＤＮＡは、 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプ
チドをコードするＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１
個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された
アミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、 （ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列において、１個以
上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列
からなるＤＮＡ、および （ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から
なる群より選択されるＤＮＡであって、熱ショック転写
因子（ＨＳＦ）２結合活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡである。

【００１５】本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番
号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコード
するＤＮＡ、より具体的には、配列番号：２に記載の塩
基配列からなるＤＮＡが挙げられ、これは、ヒトＨＳＦ
２ＢＰ遺伝子である。

【００１６】配列番号：１に記載のアミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加
されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮ
Ａも、該ペプチドがＨＳＦ２結合活性を有する限り、本
発明のＤＮＡに含まれる。本明細書における「１個以
上」とは、１個または数個またはそれ以上の個数をい
う。

【００１７】また、配列番号：２に記載の塩基配列にお
いて、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加さ
れた塩基配列からなるＤＮＡも、該ＤＮＡからコードさ
れるペプチドがＨＳＦ２結合活性を有する限り、本発明
のＤＮＡに含まれる。ここで「１個以上」とは、前記と
同じ意味である。

【００１８】前記アミノ酸および塩基の欠失、置換、挿
入または付加を行なう手法は、例えば、 Sambrook, J.
ら著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,
1989年発行に記載の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ
法等により、当業者ならば容易に行なうことができる。

【００１９】さらに、本発明のＤＮＡは、前記（ａ）〜
（ｄ）のいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるペプチ
ドがＨＳＦ２結合活性を有する限り、該ハイブリダイズ
するＤＮＡも包含する。

【００２０】本明細書において、「ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳ
Ｃ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム、３３３ｍＭ ＮａＣｌを示す）、0.５％ＳＤＳおよ
び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した
後、0.１×ＳＳＣ、0.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて
洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシ
グナルが観察されることをいう。

【００２１】本発明のＤＮＡは、ＨＳＦ２結合活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡをスクリーニングすると
いう観点から、ＧＡＬ４−ＢＤ（ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ド
メイン）−ＨＳＦ２融合蛋白質をベイト（ｂａｉｔ）と
して用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニング法によ
り、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーから単離されたもの
である。酵母ツーハイブリッドスクリーニング法（Fiel
ds, S. and Song, O.-K. (1989) Nature 340, 245-246;
Fields, S. and Sternglanz, R. (1994) Trends Geneti
cs 10, 286-292; Mendelsohn, A. R. and Brent, R. (1
994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 482-486)の詳細は、
後述の実施例１に記載されている。

【００２２】前記酵母ツーハイブリッドスクリーニング
法に用いるベイトを調製する際に、以下の点を考慮する
ことが本発明のＤＮＡのスクリーニングの成功にとって
重要である。即ち、ＨＳＦ２自身が転写活性因子であ
り、ＨＳＦ２自身の転写活性による妨害の可能性を除く
ために、ＨＳＦ２のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）また
はＤＢＤと転写活性化ドメイン（ＨＲ−ＣよりＣ末端
側）を除去したＨＳＦ２欠失変異体を構築し、前記ＧＡ
Ｌ４−ＢＤとＨＳＦ２欠失変異体との融合蛋白質を発現
するベクターを作製する。

【００２３】ベイト用ベクターとしては、市販のものが
好適に利用でき、例えば、ＧＡＬ４−ＢＤとの融合蛋白
質発現のためには、ｐＧＢＴ９(Clontech)、Ｈｙｂｒｉ
ＺＡＰII(Stratagene)等が挙げられる。

【００２４】酵母ツーハイブリッドスクリーニング法に
使用される酵母株としては、市販のものが好適に利用で
き、例えば、サッカロミセスセレビシエＨＦ７ｃ株（Ｍ
ＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２
−８０１，ｔｒｐ１−９０１，ａｄｅ２−１０１，ｌｅ
ｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５
３８，ＬＹＳ：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：
（ＧＡＬ４ １７マー）３−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）、サ
ッカロミセスセレビシエＣＧ１９４５株（ＭＡＴα，ｕ
ｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２−８０１，
ｔｒｐ１−９０１，ａｄｅ２−１０１，ｌｅｕ２−３，
１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ＬＹ
Ｓ：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３，ｃｙｈｒ２，ＵＲＡ３：：
（ＧＡＬ４１７マー）３−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ）（両方
ともClontech社より入手可能) 等が挙げられる。前記酵
母株は、染色体上でＧＡＬ４応答因子の制御下に発現可
能な２つのレポーター遺伝子（ＨＩＳ３およびｌａｃ
Ｚ）を保持している。

【００２５】ベイト用ベクターとしてｐＧＢＴ９、酵母
株としてＨＦ７ｃ株を用いて、後述の実施例１（４）に
記載のように、Ｈｉｓ⁺ かつβＧａｌ⁺ 形質転換体の数
を調べる。本発明においては、ＤＮＡ結合型ＨＳＦ２と
相互作用するが転写不活性型ＨＳＦ２と相互作用する分
子を釣ることができると思われるＨＳＦ２Ｎ９６（アミ
ノ酸残基９６〜Ｃ末端を有する）欠失変異体、および活
性型ＨＳＦ２と相互作用する別の分子を単離するために
適するＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８（アミノ酸残基９６〜３
２８を有する）欠失変異体それぞれとＧＡＬ４−ＢＤと
の融合蛋白質をベイトとして用いる。これらの模式図を
図１に示す。

【００２６】本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡの全
部または一部を含有するものであり、本発明に用いられ
る発現ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３、ｐＥＴ、ｐ
ＧＥＸ、ｐＢａｃＰＡＫ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＣＡＧ
ＧＳ等の市販の発現ベクターや公知の発現ベクターが挙
げられるが、本発明のＤＮＡが挿入でき発現可能なベク
ターであれば特に限定されない。

【００２７】本発明のＤＮＡをベクターに挿入する方法
としては、前述のMolecular Cloning 等に記載の方法に
より行なうことができる。

【００２８】本発明の形質転換体は、前記発現ベクター
を所望の宿主細胞に導入することにより得られるもので
ある。宿主細胞としては、大腸菌等の原核生物細胞また
は酵母、動物細胞、昆虫細胞等の真核生物細胞のいずれ
でもよく、用いる発現ベクターに応じて選ばれる。

【００２９】発現ベクターを導入する方法としては、例
えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥ
ＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法（F.M.
Ausubel らの編纂によるCurrent Protocols in Molecul
ar Biology, John Wiley & Sons (1987)）等の公知の方
法を用いればよい。

【００３０】本発明は、前記形質転換体を、前記発現ベ
クターから本発明の蛋白質が発現可能な条件下で培養す
る工程を含む組換えＨＳＦ２ＢＰの製造方法を提供す
る。以下、宿主細胞として大腸菌を選択し、発現ベクタ
ーとしてｐＧＥＸ５Ｘ−１を使用した場合について説明
する。

【００３１】大腸菌内でＨＳＦ２ＢＰをＧＳＴとの融合
蛋白質として発現させるため、ＨＳＦ２ＢＰのｃＤＮＡ
を発現プラスミドｐＧＥＸ５Ｘ−１に挿入し、ＧＳＴ−
ＨＳＦ２ＢＰ発現プラスミドを作製する。次いで、該発
現プラスミドで大腸菌を形質転換し、通常の条件で培養
した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）を添加することにより、ＧＳＴ−ＨＳＦ２ＢＰ
融合蛋白質の発現を誘導する。該融合蛋白質は、菌体破
砕液中において主として不溶性画分に回収することがで
き、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することにより精製
することが可能である。

【００３２】また、製造された組換えＨＳＦ２ＢＰは、
通常のカラムクロマトグラフィーまたは本発明の抗体を
用いたアフィニティー精製等の方法により容易に精製す
ることができる。

【００３３】さらに、本発明は、本発明の蛋白質に特異
的に結合する抗体またはその断片を提供する。抗体は、
ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または
キメラ抗体であってもよい。

【００３４】本発明の抗体は、例えば、Antibodies; A
Laboratory Manual, Lane,H,D.ら編,Cold Spring Harbe
r Laboratory Press出版 New York 1989年などに記載の
方法により、本発明の蛋白質の全部または一部を用いて
適宜動物を免疫することにより、本発明の蛋白質に特異
的に結合する抗体またはその活性を中和する抗体を容易
に作製することができる。また、得られた抗体をプロテ
アーゼ等により切断することにより、抗体断片を調製す
ることができる。

【００３５】抗体またはその断片の用途としては、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング、免疫学的診断法、医薬等が挙げられ
る。免疫学的診断法は、イムノブロット法、放射免疫測
定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光
あるいは発光測定法等より適宜選択できる。

【００３６】本発明は、本発明のＤＮＡと相補的な配列
を有する、８塩基以上からなるアンチセンスＤＮＡまた
はアンチセンスＲＮＡを提供する。アンチセンスＤＮＡ
またはアンチセンスＲＮＡは、合成機を用いて人工的に
合成したり、通常と逆の向き（すなわちアンチセンスの
向き）にＤＮＡを転写させることなどによって得ること
ができる。

【００３７】前記アンチセンスＤＮＡまたはアンチセン
スＲＮＡは、細胞内に導入されて本発明の蛋白質の発現
を抑制することが可能である。かかる観点より、アンチ
センスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの長さは、通常
８〜２０００塩基であり、１５〜１９１６塩基が好まし
い。通常の遺伝子の転写によって生産されるｍＲＮＡは
センス鎖であるが、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセ
ンスＲＮＡは、細胞内でセンス鎖ｍＲＮＡに結合し、該
ｍＲＮＡからの翻訳を抑制することにより、本発明の蛋
白質であるＨＳＦ２ＢＰの産生を制御することができ
る。このような作用を有することにより、アンチセンス
ＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、例えばＨＳＦ２活
性の調節剤として用いられ、精子形成の調節作用をもつ
ことが期待される。また、アンチセンスＤＮＡまたはア
ンチセンスＲＮＡは、in situ ハイブリダイゼーション
等の研究用試薬としても利用できる。

【００３８】作製したアンチセンスＤＮＡまたはアンチ
センスＲＮＡが、目的の抑制効果を有しているか否か
は、例えば以下の二つの方法により容易に見出すことが
できる。一つは、本発明のＨＳＦ２ＢＰを発現する細胞
に、細胞外からアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンス
ＲＮＡそのものを直接導入した後、該ＨＳＦ２ＢＰの発
現量の変化を指標にする方法であり、もう一つは、該ア
ンチセンスＲＮＡを転写によって生成することが可能な
ベクターを前記ＨＳＦ２ＢＰ発現細胞に導入した後、該
ＨＳＦ２ＢＰの発現量の変化を指標にする方法である。

【００３９】本発明は、本発明のＤＮＡに特異的にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプラ
イマーを提供する。該オリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーの長さは、目的に応じて適宜選択できる
が、オリゴヌクレオチドプローブに対しては通常８〜２
０００塩基、好ましくは１５〜１９１６塩基であり、オ
リゴヌクレオチドプライマーに対しては通常８〜５０塩
基、好ましくは１５〜３０塩基である。該オリゴヌクレ
オチドプローブまたはプライマーは、通常、合成機を用
いて化学的に合成したり、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klen
ow断片）を用いて酵素的に合成したり、ＰＣＲ法により
作製することができる。

【００４０】本発明のオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーがハイブリダイズする条件は、例えば、 S
ambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 第２版 , Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, New York, 1989年発行に記載の方法に準じて、目的
に応じて容易に設定することができる。

【００４１】本発明のオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーは、ＨＳＦ２ＢＰの検出および定量に用い
られ、精子形成における診断または治療に役立つことが
期待される。また、該プローブまたはプライマーは、ハ
イブリダイゼーション、ＰＣＲ等に用いられる精子形成
不全の研究用試薬としても利用できる。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は、これらの実施例によりなんら限定
されるものではない。なお、特に明記しない限り、以下
の実施例は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor L
aboratory Press, New York, 1989 年発行、Current Pr
otocols in Protein Science(ed. Coligan, J. E. et a
l.), John Wiley and Sons, Inc.等に記載の方法で行な
った。

【００４３】実施例１ ツーハイブリッドスクリーニン
グ法 （１） プラスミドの構築 ヒトＨＳＦ２ｃＤＮＡを含むプラスミドｐｈＨＳＦ２−
１は、キングストン（R. E. Kingston) 博士より供与さ
れた。ヒトＨＳＦ１ｃＤＮＡを、ヒト脳ｍＲＮＡ(Clont
ech)を鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲ法により得て、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII(Stratagene)のＥｃｏＲＩ部位
にサブクローニングし、ｐｈＨＳＦ１と命名した。ｐｈ
ＨＳＦ１は、ヒトＨＳＦ１のｃＤＮＡ配列のヌクレオチ
ド−２１〜＋１７０４までを含む。

【００４４】（２） ベイトの構築 酵母ツーハイブリッドスクリーニング法によりＨＳＦ２
と相互作用する蛋白質をスクリーニングするために、前
記ｐｈＨＳＦ２−１からＨＳＦ２のＤＮＡ結合ドメイン
および／または転写活性化ドメインを除去してＨＳＦ２
自身の転写活性による妨害の可能性を除いたＨＳＦ２欠
失変異体を構築した。すなわち、ｐｈＨＳＦ２−１ＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、必要ならば、Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化
し、Ｎ末端欠失に対してはＮｃｏＩリンカー（８マー、
１０マーまたは１２マー）、Ｃ末端欠失に対してはマル
チ終止コドンを含むリンカーいずれかを用いて連結し
た。これらのＤＮＡ断片を、ｐＡＳ２のマルチクローニ
ングサイトに挿入した。また、対照として、前記ｐｈＨ
ＳＦ１から同様にして、ＨＳＦ１欠失変異体を構築し
た。

【００４５】酵母ツーハイブリッドスクリーニング法の
ベイトとして、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４
−ＢＤ）をコードする配列を含むｐＡＳ２またはｐＧＢ
Ｔ９(Clontech)と、前記ＨＳＦ２またはＨＳＦ１の欠失
変異体のｃＤＮＡを両者のオープンリーディングフレー
ムが合うように融合させた。

【００４６】本発明においては、後述の実施例１（４）
に記載のように、ＨＳＦ２Ｎ９６（アミノ酸残基９６〜
Ｃ末端を有する）またはＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８（アミ
ノ酸残基９６〜３２８を有する）欠失変異体をベイトと
して用いた。これらの模式図を、図１に示す。

【００４７】（３） ウエスタンブロッティングによる
ＨＳＦ２欠失変異体の酵母における発現の確認 前記（２）で得られたｐＧＢＴ９由来のＧＡＬ４−ＢＤ
と前記ＨＳＦ２Ｎ９６またはＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８Ｈ
ＳＦ２欠失変異体との融合発現プラスミドで、酢酸リチ
ウム法により酵母細胞ＣＧ１９４５を形質転換し、グラ
スビーズを用いて常法により、形質転換細胞から蛋白質
を抽出した。得られた蛋白質の濃度をＢｉｏ−Ｒａｄプ
ロテインアッセイキット(Bio-Rad) を用いて決定した。
かかる細胞抽出物（２０μｇの蛋白質）を、８％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、該蛋白質をニトロ
セルロースメンブレンフィルター(Amersham)に電気的に
ブロットした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（Ｐ
ＢＳＴ）中５％スキムミルクで、室温で１時間該フィル
ターをブロックし、ニワトリＨＳＦ２に対するポリクロ
ーナルウサギ抗体（αＨＳＦ２α、中井彰博士より供
与）の２％スキムミルクを含むＰＢＳＴ中１：２０００
希釈物と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで
洗浄後、該フィルターを、西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合ヤギＦ（ａｂ’）₂ 抗ラビット抗体(Biosource) の
１：２０００希釈物と室温で１時間インキュベートし
た。ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ試薬(Amersham)を用いて
シグナルを検出した（図２）。

【００４８】図２より、これらのＨＳＦ２欠失変異体
は、ＧＡＬ４−ＢＤとの融合蛋白質として酵母細胞で発
現することがわかった。

【００４９】（４） ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの
ツーハイブリッド法によるスクリーニング ツーハイブリッドスクリーニング法のためのサッカロミ
セスセレビシエＨＦ７ｃ株およびＧＡＬ４アクチベータ
（ＧＡＬ４−ＡＤ）をコードする配列を含むｐＧＡＤ１
０で構築したヒト精巣由来のｃＤＮＡライブラリーは、
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入した。ＨＦ７ｃ株は、染色
体上でＧＡＬ４応答因子の制御下に発現可能なＨＩＳ３
およびｌａｃＺの２つのレポーター遺伝子を保持してい
る。

【００５０】酢酸リチウム法により、前記ヒト精巣由来
のｃＤＮＡライブラリーのプラスミドで、前記（３）で
得られたＨＳＦ２欠失変異体を発現するＨＦ７ｃを形質
転換した。該形質転換体を、１０ｍＭ ３−アミノトリ
アゾールを含むＬｅｕ^- 、Ｔｒｐ^- およびＨｉｓ^- プレ
ート上に播種し、Ｈｉｓ⁺ 細胞を選択した。次いで、Ｈ
ｉｓ⁺ 細胞形質転換体を、β−ガラクトシダーゼ（βＧ
ａｌ）活性に対するフィルターアッセイにより、第２の
レポーター遺伝子であるｌａｃＺの発現を調べた。βＧ
ａｌ陽性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｄ
ＮＡ自動シーケンサーＰＲＩＳＭ３７７(Perkin Elmer)
を使用して、各ｃＤＮＡの挿入物の５’末端の塩基配列
を決定した。

【００５１】

【表１】

【００５２】表１より、ＨＳＦ２Ｎ９６をベイトとして
用いた場合、６．８０×１０⁷ 形質転換体から７８６個
のＨｉｓ⁺ かつβＧａｌ⁺ クローンが得られた。他方、
ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８をベイトとして用いた場合、
４．９８×１０⁷ 形質転換体からわずか９個のＨｉｓ⁺
かつβＧａｌ⁺ クローンしか得られなかった。このこと
により、前記７８６個のクローンのほとんどは、真に陽
性であると思われる。

【００５３】前記７８６個のクローンからランダムに選
択した９３個のクローンおよび前記９個のクローンの
５’末端付近の塩基配列を決定した。ＨＳＦ２Ｎ９６の
ベイトに対する９３個中３９個、ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２
８のベイトに対する９個中２個という最も多数に見出さ
れるユニークなｃＤＮＡ配列に焦点を絞って、以下のク
ローニングを行なった。

【００５４】実施例２ ＨＳＦ２ＢＰの全長のｃＤＮＡ
のクローニング 全長のｃＤＮＡのクローンを単離するために、実施例１
（４）で得られたｃＤＮＡ断片を³²Ｐ標識プローブとし
て、プラークハイブリダイゼーションによりヒト精巣ｃ
ＤＮＡライブラリー（１×１０⁶ 個の独立したクローン
を含むλｇｔ１１、Clontech) をスクリーニングした。
最長のクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII(Stratagen
e)にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。

【００５５】得られた最長のｃＤＮＡクローンは、１９
１６ｂｐの長さを有し、親水性のアミノ末端領域と疎水
性のカルボシキル末端領域からなる３３４アミノ酸（分
子量３７，６４４ダルトン）をコードするオープンリー
ディングフレームを含んでおり、このｃＤＮＡがコード
する蛋白質をＨＳＦ２結合蛋白質（ＨＳＦ２ＢＰ）と命
名した（図３）。アミノ末端側半分は、αヘリックス構
造を形成し、２個のロイシンジッパーモチーフを含むと
予想された（図４）。

【００５６】実施例３ ノーザンブロット分析 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したヒト多組織のＲＮＡブ
ロット（ＭＴＮブロットとＭＴＮIIブロット）を、ＨＳ
Ｆ２ＢＰ、ＨＳＦ２およびグリセルアルデヒド−３−ホ
スフェート デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ、Clontec
h) に対する³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと５×ＳＳＰ
Ｅ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト、０．１％Ｓ
ＤＳ中で４２℃にて終夜ハイブリダイズさせ、０．１％
ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＰＥで４２℃、３０分間、２回
洗浄した後、オートラジオグラフィーを行なった（図
５）。

【００５７】図５より、ＨＳＦ２ＢＰのｍＲＮＡは、約
１．７ｋｂであり、精巣特異的に発現していることがわ
かる。ＨＳＦ２も既報のように、精巣で特異的に高発現
している。ＨＳＦ２のＨＳＥへの構成的な結合がマウス
の精巣で観察され、ＨＳＰ７０．２の精巣特異的発現と
相関している(Sarge, K. D. ら、Biol. Reprod. 50 (19
94) 1334-1343)ので、ＨＳＦ２ＢＰは、ＨＳＦ２と相互
作用することにより、ＨＳＰ７０．２発現の精巣特異的
制御に働いている可能性が示唆される。

【００５８】実施例４ ＧＳＴプルダウンアッセイ （１） プラスミドの構築 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダ
ウンアッセイに対しては、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１ベクター
（Pharmacia)を用いて、ＨＳＦ２またはＨＳＦ１の欠失
変異体のＧＳＴ融合構築物を作製し、ＧＳＴ蛋白質、Ｇ
ＳＴ−ＨＳＦ２欠失変異体融合蛋白質およびＧＳＴ−Ｈ
ＳＦ１欠失変異体融合蛋白質を大腸菌で発現させた。

【００５９】ＨＳＦ２ＢＰおよびその欠失変異体のイン
・ビトロ翻訳のために、実施例１（１）に記載の方法に
従って、ＨＳＦ２ＢＰｃＤＮＡの対応する領域をｐｃＤ
ＮＡ３．１ＨｉｓＡ、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＢまたは
ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ(Invitrogen)に挿入した発現
プラスミドを作製した。

【００６０】（２） ＨＳＦ２ＢＰのイン・ビトロ翻訳
およびＧＳＴプルダウンアッセイ 前記（１）で発現させたＧＳＴ蛋白質およびＧＳＴ−Ｈ
ＳＦ２欠失変異体融合蛋白質を、製造者の指示に従っ
て、グルタチオン−セファロース(Pharamacia)により精
製し、グルタチオン−セファロースに固定させ、ＧＳＴ
セファロースおよび種々のＧＳＴ−ＨＳＦ２セファロー
スを作製した。対照として、ＧＳＴ−ＨＳＦ１欠失変異
体融合蛋白質も精製し、同様に、種々のＧＳＴ−ＨＳＦ
１セファロースを作製した。実施例４（１）記載のＨＳ
Ｆ２ＢＰおよびその欠失変異体の発現プラスミドを鋳型
とし、ＴＮＴ翻訳キット(Promega) を使用して製造者の
指示に従ってイン・ビトロで翻訳し、³⁵Ｓ−メチオニン
で標識されたＨＳＦ２ＢＰおよびその欠失変異体のイン
・ビトロ翻訳物を得た。

【００６１】得られたイン・ビトロ翻訳物の５μｌを、
前記ＧＳＴセファロースおよび種々のＧＳＴ−ＨＳＦ２
欠失変異体融合蛋白質セファロースと４℃で一晩インキ
ュベートした。かかるセファロースビーズを、ＮＥＴＮ
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｎｏ
ｎｉｄｅｔＰ−４０）で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り結合蛋白質を分析し、オートラジオグラフィーのため
に処理し、イメージアナライザーＢＡＳ２０００(Fuji)
により定量した（図６）。

【００６２】図６より、イン・ビトロで翻訳したＨＳＦ
２ＢＰは、ＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ９６（入力量の７．９
％）およびＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８（入力量の
９．３％）の両方に有意に結合するが、三量体化ドメイ
ンを欠くＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ１９９Ｃ３２８への結合
は、ＧＳＴ単独と同様のレベルであった（レーン１〜
５）。かかる相互作用がＨＳＦ２の三量体化ドメインに
より仲介されることを示唆するこれらの結果は、実施例
１の酵母におけるツーハイブリッドスクリーニングの結
果と一致する。

【００６３】前記３つのＧＳＴ−ＨＳＦ２欠失変異体と
類似のＧＳＴ−ＨＳＦ１欠失変異体の構築物を用いて、
前記と同様に、ＨＳＦ２ＢＰとＨＳＦ１欠失変異体との
相互作用も試験した（図６、レーン６〜８）。ＧＳＴ−
ＨＳＦ１Ｎ１０１は、ＤＮＡ結合ドメイン以外の全ＨＳ
Ｆ１を有し、ＧＳＴ−ＨＳＦ１Ｎ１０１Ｃ３１８は、三
量体化ドメインと熱ショック応答ドメインを有し、ＧＳ
Ｔ−ＨＳＦ１Ｎ２０２Ｃ３１８は、熱ショック応答ドメ
インのみを有する。ＨＳＦ２ＢＰは、ＧＳＴ−ＨＳＦ１
Ｎ１０１（入力量の８．５％）に結合する（レーン６）
が、ＧＳＴ−ＨＳＦ１Ｎ１０１Ｃ３１８とＧＳＴ−ＨＳ
Ｆ１Ｎ２０２Ｃ３１８には結合しなかった（レーン７、
８）。これらの結果より、ＨＳＦ２ＢＰは、イン・ビト
ロでＨＳＦ１とも相互作用するが、結合のプロフィール
は、ＨＳＦ２で観察されるものとは異なることが示唆さ
れる。

【００６４】（３） ＨＳＦ２ＢＰの欠失変異体のイン
・ビトロ翻訳 ＨＳＦ２と相互作用するＨＳＦ２ＢＰの領域を決定する
ために、実施例１（２）に記載の方法に従って、ＨＳＦ
２ＢＰの４つの欠失変異体（ＢＰ−Ｃ１５０、ＢＰ−Ｃ
１１５、ＢＰ−Ｃ７３およびＢＰ−Ｎ１１５）を構築し
た（図７）。

【００６５】実施例４（２）と同様の方法により、イン
・ビトロ翻訳した³⁵Ｓ−メチオニン標識ＨＳＦ２ＢＰ欠
失変異蛋白質をウエスタンブロッティング法により確認
し（図８）、ＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８でのプル
ダウンアッセイに供した（図９）。

【００６６】図９より、インタクトなＨＳＦ２ＢＰ（入
力量に対して１２．９％結合）と比較して、より大量の
ＢＰ−Ｃ１５０（２２．３％結合）およびより少量のＢ
Ｐ−Ｃ１１５（５．７％結合）が、ＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ
９６Ｃ３２８に結合した（レーン１〜９）のに対して、
ＢＰ−Ｃ７３およびＢＰ−Ｎ１１５は結合しなかった
（レーン１０〜１５）。これらの結果より、ＨＳＦ２Ｂ
ＰのＮ末端側半分は、ＨＳＦ２との相互作用に必要十分
条件であることが示唆される。ＨＳＦ２ＢＰのＮ末端側
のαヘリックスドメインは、２個のロイシンジッパーモ
チーフを含み、かかる相互作用は、ＨＳＦ２のＨＲ−Ａ
／Ｂ領域とロイシンジッパーとの間で媒介されていると
考えられる。しかし、ＢＰ−Ｃ７３が２個のロイシンジ
ッパーを保持しているにもかかわらず、ＨＳＦ２へ結合
できなかったことは、αヘリックスドメインのロイシン
ジッパー以外の領域も、かかる相互作用に必要であるこ
とを示唆する。

【００６７】実施例５ ＨＳＦ２およびＨＳＦ２ＢＰの
哺乳類細胞におけるツーハイブリッドアッセイ ＨＳＦ２ＢＰが、イン・ビボでＨＳＦ２およびＨＳＦ１
双方と相互作用するかどうかを調べるために、ツーハイ
ブリッドアッセイを行なった。１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ₂ で培
養したＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）（１×
１０⁶ 個）を、ｐＭ(Clontech)由来の酵母ＧＡＬ４−Ｂ
Ｄと融合したＨＳＦ２またはＨＳＦ１欠失変異体の発現
プラスミド、ｐＶＰ１６(Clontech)由来のＶＰ１６転写
活性化ドメインと融合させたＨＳＦ２ＢＰの発現プラス
ミド（ｐＶＰ１６ＢＰ）およびルシフェラーゼ遺伝子を
含むｐＧＬＧ４Ｅ５レポータープラスミドで、Transfec
tam ^TM(Promega) を用いるリポフェクション法によりト
ランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ₂ で４８時間イ
ンキュベートした後、形質転換したＫ５６２細胞をＰＢ
Ｓで２回洗浄し、製造者の指示に従って二重ルシフェラ
ーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を用いてル
シフェラーゼ活性を測定した（図１０）。

【００６８】図１０より、ＧＡＬ４−ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ
２３８とＶＰ１６−ＨＳＦ２ＢＰとの共発現は、ＧＡＬ
４−ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ２３８と対照のＶＰ１６との共発
現よりも約１１倍ルシフェラーゼレポーターを活性化し
た。このことは、哺乳類培養細胞において、ＨＳＦ２が
ＨＳＦ２ＢＰと相互作用することを示唆する。他方、Ｈ
ＳＦ２Ｎ９６ベイトを用いる酵母ツーハイブリッドスク
リーニングから多くのＨＳＦ２ＢＰクローンが得られた
が、Ｋ５６２細胞でのツーハイブリッドアッセイではＨ
ＳＦ２Ｎ９６とＨＳＦ２ＢＰとの有為な相互作用は検出
されなかった。２種類のＨＳＦ１欠失変異体も、ＨＳＦ
２ＢＰと相互作用しなかった。

【００６９】実施例６ 組換えＨＳＦ２ＢＰの調製 （１）プラスミドの構築 組換えＨＳＦ２ＢＰをＧＳＴとの融合蛋白質として大腸
菌内で発現させるため、発現ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−
１のＮｏｔＩ部位にＨＳＦ２ＢＰの全翻訳領域を含んだ
ｃＤＮＡ断片を挿入した。得られたＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｂ
Ｐ発現プラスミドをｐＧＥＸＢＰとした。 （２）融合蛋白質の発現と精製 ｐＧＥＸＢＰで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）を２
％グルコースを含む２×ＹＴ培地で２７℃で培養し、６
００ｎｍの吸収が約０．８になったとき、終濃度０．１
ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド）を添加し、ＧＳＴ−融合蛋白質の発現
を誘導した。さらに２時間培養し、集菌した。菌体を１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで懸濁し、超音
波破砕し、遠心分離（１．５ｍｌチューブ用微量高速遠
心機で１００００回転、１５分間）により沈殿画分を回
収した。ＧＳＴ−ＨＳＦ２ＢＰ蛋白質は、細胞内封入体
を形成し、沈殿画分に回収される。得られた画分をさら
にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、目的蛋白質をゲルから切
り出して溶出することにより、ほぼ均一に精製されたＧ
ＳＴ−ＨＳＦ２ＢＰ蛋白質を得た。

【００７０】

【発明の効果】本発明の熱ショック転写因子結合蛋白質
であるＨＳＦ２ＢＰは、精巣特異的に発現している蛋白
質であり、分子シャペロンとして精子形成に必須の役割
を果たしているＨＳＰ７０．２の転写制御に関与してい
ることが示唆されているＨＳＦ２の活性化を制御するこ
とにより、精子形成不全の研究、診断および／または治
療に利用され得る。本発明のアンチセンスＤＮＡまたは
アンチセンスＲＮＡは、ＨＳＦ２活性の調節剤として用
いられ、精子形成の調節作用をもつことが期待される。
また、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ
は、in situ ハイブリダイゼーション等の研究用試薬と
しても利用できる。ＨＳＦ２ＢＰをコードするＤＮＡに
特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー
ブまたはプライマーは、ＨＳＦ２ＢＰの検出および定量
に用いられる。また、ＨＳＦ２ＢＰの抗体は、ＨＳＦ２
ＢＰの検出および定量に用いられる。さらに、ＨＳＦ２
ＢＰを用いて、ＨＳＦ２ＢＰのアゴニストおよびアンタ
ゴニストをスクリーニングすることが可能であり、かか
るアゴニストおよびアンタゴニストは、ＨＳＦ２活性の
調節剤として用いられ、精子形成の調節作用をもつこと
が期待される。

【００７１】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：334 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Gly Glu Ala Gly Ala Ala Glu Glu Ala Cys Arg His Met Gly Thr 5 10 15 Lys Glu Glu Phe Val Lys Val Arg Lys Lys Asp Leu Glu Arg Leu Thr 20 25 30 Thr Glu Val Met Gln Ile Arg Asp Phe Leu Pro Arg Ile Leu Asn Gly 35 40 45 Glu Val Leu Glu Ser Phe Gln Lys Leu Lys Ile Val Glu Lys Asn Leu 50 55 60 Glu Arg Lys Glu Gln Glu Leu Glu Gln Leu Lys Met Asp Cys Glu His 65 70 75 80 Phe Lys Ala Arg Leu Glu Thr Val Gln Ala Asp Asn Ile Arg Glu Lys 85 90 95 Lys Glu Lys Leu Ala Leu Arg Gln Gln Leu Asn Glu Ala Lys Gln Gln 100 105 110 Leu Leu Gln Gln Ala Glu Tyr Cys Thr Glu Met Gly Ala Ala Ala Cys 115 120 125 Thr Leu Leu Trp Gly Val Ser Ser Ser Glu Glu Val Val Lys Ala Ile 130 135 140 Leu Gly Gly Asp Lys Ala Leu Lys Phe Phe Ser Ile Thr Gly Gln Thr 145 150 155 160 Met Glu Ser Phe Val Lys Ser Leu Asp Gly Asp Val Gln Glu Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Glu Ser Gln Phe Val Phe Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn 180 185 190 Val Ala Ala Ile Ala Cys Gly Arg Glu Phe Leu Val Asn Ser Ser Arg 195 200 205 Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu Leu Gly Asp Leu Lys Pro Gly 210 215 220 Gln Cys Thr Lys Leu Lys Val Leu Met Leu Met Ser Leu Tyr Asn Val 225 230 235 240 Ser Ile Asn Leu Lys Gly Leu Lys Tyr Ile Ser Glu Ser Pro Gly Phe 245 250 255 Ile Pro Leu Leu Trp Trp Leu Leu Ser Asp Pro Asp Ala Glu Val Cys 260 265 270 Leu His Val Leu Arg Leu Val Gln Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Val 275 280 285 Phe Ser Lys Ser Ala Ser Glu Phe Arg Ser Ser Leu Pro Leu Gln Arg 290 295 300 Ile Leu Ala Met Ser Lys Ser Arg Asn Pro Arg Leu Gln Thr Ala Ala 305 310 315 320 Gln Glu Leu Leu Glu Asp Leu Arg Thr Leu Glu His Asn Val 325 330

【００７２】配列番号：２ 配列の長さ：1916 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：c ＤＮＡ 配列 GGAGTGAGCG CGGCAGTGGC CCTGGCAGCT GGCGGAGCGG CCCAGCCCGT GTGCACGTGG 60 CGCCGGCGCT GCCTTTCGGT TGCCAAAATT CAGGCTGTAG ACGGCGAGAT AACAAGTTTA 120 AAACCCCGGC TAAGCCAGAA GAGCCAAAGA GGGACCTCGC CAAGGCCACT CCTCGCTCTC 180 TAGGCCGAGA ATACTGCGCA AATTCTGGGA GGTTTGGGCC TGGCGGCTCT CCGTTCCCGA 240 CCCCCGGCGT GGATTCGTTC CCGCGCTTTC TGGCGTGAGG GGTCAGAGGG CGCGCCGACG 300 CTCAGGCGAA CGGAGCGGAG GCGGCAGCGG CCATGGGCGA AGCGGGCGCC GCTGAGGAGG 360 CCTGCCGGCA CATGGGAACT AAAGAGGAAT TTGTTAAAGT CAGAAAGAAG GATCTGGAAC 420 GGCTGACAAC TGAAGTGATG CAAATACGGG ACTTCTTACC CAGAATACTA AATGGGGAGG 480 TGCTGGAGAG CTTCCAGAAA TTAAAGATTG TAGAAAAAAA CCTGGAAAGG AAAGAGCAAG 540 AATTAGAGCA GCTGAAAATG GATTGTGAGC ACTTTAAAGC CCGCCTGGAA ACCGTGCAGG 600 CCGACAACAT AAGAGAGAAG AAGGAGAAAC TGGCTCTTCG ACAGCAGTTG AATGAAGCGA 660 AGCAGCAACT CCTGCAGCAG GCAGAGTATT GTACAGAAAT GGGAGCAGCA GCGTGTACCC 720 TCTTGTGGGG TGTCTCCAGC AGTGAGGAAG TCGTCAAGGC CATTTTGGGA GGAGATAAAG 780 CTTTGAAGTT TTTCAGCATC ACTGGTCAAA CAATGGAGAG TTTTGTGAAG TCGTTAGACG 840 GTGATGTCCA GGAGCTGGAT TCGGATGAAA GTCAGTTTGT TTTCGCTCTG GCTGGAATTG 900 TCACGAATGT TGCTGCTATA GCATGTGGTC GTGAATTCTT GGTTAATTCA AGCCGGGTGC 960 TCTTGGACAC CATATTGCAG CTTCTGGGAG ACTTGAAGCC AGGACAGTGT ACCAAACTCA 1020 AAGTGCTAAT GCTGATGTCC CTATACAATG TAAGCATCAA TTTGAAAGGC TTGAAATACA 1080 TCAGCGAGAG TCCAGGATTC ATCCCTTTGC TGTGGTGGCT TTTGAGTGAT CCAGATGCAG 1140 AGGTGTGCCT TCATGTACTG AGGCTTGTCC AGTCTGTGGT TCTGGAACCT GAAGTCTTCT 1200 CCAAGTCGGC CTCTGAGTTC CGGAGCTCCC TGCCCCTGCA ACGCATCCTG GCAATGTCCA 1260 AGAGCCGCAA CCCCCGCCTG CAAACCGCAG CCCAGGAGCT CCTGGAAGAT CTCCGCACTC 1320 TGGAGCATAA TGTGTAGGTG TGCTCGGCCA CCAGGGTTTT GGTGAAAATG CCGGTGTCCC 1380 TTCTCCCCAG ATCCCTCATT TGATACTCCA AAACCATCAC CATGTACCAT GTGTTAGAGT 1440 TGGCAAAATG TGATTGACTA GAGATGGACA TGAATTGATA TGTATCCCAC ATAACTTTGT 1500 CTTGGAAGTG AGAGTGCTTG TAGGTGGTTG GTTAAGCTTG CCAAAGGAGA GGCCATGAAA 1560 GAACCTGTCC TTCTGGAAAA GTGGTCCATG TCTGTGCTGG CTGGAAGAGG GCTTGCTTAG 1620 GGCAGCTTCT TGCTGCTCAG CAGACCATGA CCTGTAGGTT CACCTATAAA ACAGGGAAAT 1680 TGAATAACCA TCTACCCCAT TAGTCAGCAT TTTCTTGAGA TACATTTCTT TGAAAAGCAA 1740 TTCATTCTCT CTCTAGTAAT TGTAATTAAT CCCCCCAAAA TGCAAGTTTA CTTTTATAAC 1800 CTTTTGGTGA ACCTGCTATT TCGGATGACA TTGGGCATTT TAGTTCTATA TTTTTTGTGC 1860 CTCTTTTATT TTTGAATAAA GAAAATCAGA AGAGTTGTAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1916

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトＨＳＦ２蛋白質およびツーハイブ
リッドスクリーニングにベイトとして用いるＧＡＬ４−
ＢＤ−ＨＳＦ２融合蛋白質の模式図を示す。図中、ＤＢ
ＤはＤＮＡ結合ドメインを示し、ＨＲ−Ａ／Ｂは三量体
形成のための疎水性の繰り返しを示し、ＨＲ−Ｃは負の
制御のためのＣ末端疎水性の繰り返しを示す。

【図２】図２は、酵母で発現したＧＡＬ４−ＢＤ−ＨＳ
Ｆ２融合蛋白質のウエスタンブロット分析の電気泳動の
写真を示す。

【図３】図３は、ＨＳＦ２ＢＰのｃＤＮＡ配列および対
応するアミノ酸配列を示す。星印または四角で示したア
ミノ酸は、７残基ごとに繰り返す疎水性アミノ酸を示
す。

【図４】図４は、ＨＳＦ２ＢＰのChou-Fasman 法により
予想されるα−ヘリックス、β−シートおよびβ−ター
ン領域ならびにKyte-Doolittle法により予想される親水
性のプロットを示す。

【図５】図５は、³²Ｐで標識したＨＳＦ２ＢＰ、ＨＳＦ
２およびＧ３ＰＤＨｃＤＮＡをプローブとして用いた、
種々の組織由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析の電
気泳動の写真を示す。各写真の左端の数字は、サイズマ
ーカーの位置を示す。

【図６】図６は、ＧＳＴ−プルダウンアッセイによるイ
ン・ビトロでのＨＳＦ２ＢＰとＨＳＦ２またはＨＳＦ１
との相互作用を示す電気泳動の写真である。写真の下の
数字は、結合したＨＳＦ２ＢＰの割合（インプットに対
する％）を示す。

【図７】図７は、ＨＳＦ２ＢＰ蛋白質およびその欠失変
異体の模式図を示す。点を付けた部分は、α−ヘリック
ス構造をもつ領域を、黒く塗りつぶした部分は、ロイシ
ンジッパーモチーフの領域を示す。

【図８】図８は、³⁵Ｓメチオニンを用いてイン・ビトロ
翻訳した図７に示したＨＳＦ２ＢＰ蛋白質およびその欠
失変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による電気泳動の写真
である。写真の右端の数字は、サイズマーカーを示す。

【図９】図９は、ＧＳＴ−プルダウンアッセイによるイ
ン・ビトロでの図７に示したＨＳＦ２ＢＰおよびその欠
失変異体とＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８との相互作用を示す
電気泳動の写真である。レーン１、４、７、１０および
１３はインプット量を示し、レーン２、５、８、１１お
よび１４はＧＳＴへの結合を示し、レーン３、６、９、
１２および１５は、ＧＳＴ−ＨＳＦ２Ｎ９６Ｃ３２８へ
の結合を示す。写真の下の数字は、それぞれ、結合した
ＨＳＦ２ＢＰおよびその欠失変異体の割合を示す。

【図１０】図１０は、Ｋ５６２細胞におけるツーハイブ
リッドアッセイをルシフェラーゼ活性により測定し、各
ＨＳＦに対して、ｐＶＰ１６で得られた活性と比較した
ｐＶＰＢＰで得られた活性の誘導倍数を示すグラフであ
る。縦軸は、４つの独立した実験からの平均±ＳＤとし
て表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配
   列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１
   個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された
   アミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、 （ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列において、１個以
   上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列
   からなるＤＮＡ、および （ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡにストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、から
   なる群より選択されるＤＮＡであって、熱ショック転写
   因子（ＨＳＦ）２結合活性を有する蛋白質をコードする
   ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡによりコードされ
   る蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡの全部または一部
   を含有してなる発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の発現ベクターを含む形質
   転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を、請求項３
   記載の発現ベクターからの蛋白質の発現が可能な条件下
   で培養する工程を含む、組換えＨＳＦ２結合蛋白質の製
   造方法。
6. 【請求項６】 請求項２記載の蛋白質に特異的に結合す
   る抗体またはその断片。
7. 【請求項７】 請求項１記載のＤＮＡと相補的な配列を
   有する、８塩基以上からなるアンチセンスＤＮＡまたは
   アンチセンスＲＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１記載のＤＮＡに特異的にハイブ
   リダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライ
   マー。