JP2001518294A

JP2001518294A - プレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質をコードする核酸

Info

Publication number: JP2001518294A
Application number: JP2000513944A
Authority: JP
Inventors: フルニエ，アラン; メルカン，リユツク; プラデイエ，ロラン; ポール，マリ−フランソワーズ
Original assignee: アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2001-10-16
Also published as: WO1999016874A1; NO20001680D0; CA2305781A1; IL135187A0; HUP0004739A3; CN1272139A; KR20010030862A; AU9354998A; HUP0004739A1; NO20001680L; EP1021533A1

Abstract

(57)【要約】本発明は新規ヌクレオチド及びペプチド配列とその医薬的使用に関する。より詳細には、本発明はプレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質をコードする核酸に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規ヌクレオチド及びペプチド配列とその医薬的使用に関する。より
詳細には、本発明はプレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質をコー
ドする核酸、前記タンパク質の製造方法及び前記タンパク質を含む組成物に関す
る。

【０００２】アルツハイマー病は最も一般的な痴呆症である。その総発生頻度は年齢と共に
増加し、６５歳以上では５〜１０％、８０歳以上では２０％である。

【０００３】現状では特別な治療法はなく、対処的処置しか患者に施すことができない。こ
の疾病は正確な早期診断法がなく、大脳の死後組織分析後にしか実際に確認され
ない。

【０００４】アルツハイマー病は老年斑、ニューロン神経原線維変性、皮質レベルのニュー
ロンの損失及び萎縮等の組織徴候を構成する器質的大脳病変に結び付けられてい
る。

【０００５】病因は複雑であり、多数の遺伝子が関係しているが、これらの遺伝子が関与す
る種々の病態生理機構は完全には分かっていない。

【０００６】初老痴呆については、６５歳未満の患者に観察される大脳の解剖学的変質との
関連が報告されている。現状では、同一特徴をもつ初老（６５歳未満）痴呆と老
年痴呆（６５歳以上）を「アルツハイマー型痴呆」と総称している。

【０００７】疾病の形態は遺伝に無関係な散発性形態と家族性形態の２種類が存在する。

【０００８】散発性疾病形態のほうが高頻度であり、患者の６０〜９０％を占め、６５歳以
上では更に高い。病理の原因は症例の大半で不明である。しかし、頭部外傷、炎
症、感情ショック又は大きなストレスの刺激が発病確率を増すことが立証されて
いる（Ｓｅｕｂｅｒｔら，１９９２）。

【０００９】家族性疾病形態は症例の１０〜４０％を占める。家族性形態は晩発形態（６５
歳以上）と早発形態（６５歳未満）の２種類に分類される。早発の場合には、疾
患は優性常染色体形質により伝達される。

【００１０】１９９２年に遺伝子座ＡＤ３の存在が染色体１４で明らかになり、１９９５年
にはプレセニリン１（ＰＳ−１）の遺伝子が単離された（遺伝子は最初はＳ１８
２と命名された）（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら，１９９５）。極早発性の疾病形
態（５５歳未満）の７０％にはプレセニリン１の遺伝子の突然変異が関与してい
る。早発形態の症例で染色体１に位置するプレセニリン２の遺伝子の突然変異に
結び付けられるものは非常に稀である（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら，１９９５）。
この遺伝子はプレセニリン１の遺伝子と６７％の相同度をもつ。

【００１１】遺伝子は１２個のエキソンから形成され、エキソン３〜１２がタンパク質をコ
ードする。遺伝子は偏在的に発現され、２．７ｋｂの主要転写産物と７．５ｋｂ
の副次的転写産物を生成する（Ｋｏｖａｃｓ，１９９６）。タンパク質は４６７
個のアミノ酸を含み、膜タンパク質の構造をもつ。タンパク質は少なくとも８個
の潜在的膜貫通ドメインをもつ。報告されている突然変異に関係するコドンに対
応するアミノ酸はタンパク質全体に分布しており、疎水性領域（ＴＭ）にも親水
性環（ＢＬ）にも位置するが、ＴＭ２とＢＬ６の２領域が特に重要である。

【００１２】現在、３５種を越える点突然変異が報告されており、現在までに同定されてい
る点突然変異はほぼ全てが「ミスセンス」型である（即ち、タンパク質の配列上
の１アミノ酸の点変異）。他方、スプライシングに影響する別の型の突然変異も
最近報告されており（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｕｒら，１９９５）、この場合には、遺伝
子はエキソン９の欠損により変異している。

【００１３】正常細胞におけるプレセニリンの役割はまだよく分かっていない。多数の仮説
が発表されている。これらの仮説の１つによると、プレセニリン１（ＰＳ−１）
は細胞トラフィックに役割を果たすとされる。この仮説は、ＰＳ−１がヒト神経
膠腫細胞で小胞体とゴルジ体のレベルに位置することを突き止めた免疫細胞化学
結果により裏付けられる（Ｋｏｖａｃｓら，１９９６）。更に、ＰＳ−１は細胞
交通とＡＰＰのエンドサイトーシス及びタンパク分解の機構に役割を果たすとも
考えられている（ＤｅｗｊｉとＳｉｎｇｅｒ，１９９６）。第３の仮説はＰＳ−
１が細胞骨格、特にタウタンパク質に結合した微小管との相互作用に関与すると
いうものである（ＬｅｗとＷａｎｇ，１９９６）。更に、その構造を考慮すると
、ＰＳ−１はシグナルの伝達に関与するＧタンパク質に結合した受容体又は輸送
体又はイオンチャンネルの役割をもつと考えられる（ＶａｎＢｒｏｅｃｋｈｏ
ｖｅｎ，１９９５）。

【００１４】プレセニリンと相互作用するパートナーを研究することにより、プレセニリン
の正確な役割を解明することができると思われる。

【００１５】本発明者らはプレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質をコードす
る核酸を見いだし、本発明を達成した。このような核酸の発見により、医薬とし
て使用可能な新規ポリペプチドの製造を予想することができる。

【００１６】従って、本発明の第１の目的はプレセニリンと相互作用することが可能なタン
パク質をコードするヌクレオチド配列に関する。

【００１７】特定態様によると、本発明のヌクレオチド配列はプレセニリンＰＳ−１のＨ鎖
の全部又は一部と相互作用することが可能なタンパク質又はポリペプチドをコー
ドする。

【００１８】より好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は配列番号１もしくはその誘導体
の全部もしくは一部又は配列番号２もしくはその誘導体の全部もしくは一部を含
む。

【００１９】本発明の意味では、誘導ヌクレオチド配列なる用語は、１個以上の遺伝的及び
／又は化学的修飾により得られ、遺伝コードの縮重により該当配列と異なる任意
配列と、これらの配列又はこれらの配列のフラグメントとハイブリダイズし、本
発明のポリペプチドをコードする任意配列を意味する。遺伝的及び／又は化学的
修飾とは、１個以上の残基の任意突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾を
意味する。誘導体なる用語は該当配列に相同でありながら、他の細胞源、特にヒ
ト又は他の生物起源の細胞に由来する配列も含む。このような相同配列はハイブ
リダイゼーション実験により得ることができる。ハイブリダイゼーションは可変
ハイブリダイゼーション条件下で核酸バンクから天然配列又はそのフラグメント
をプローブとして使用することにより実施することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら，１９８９）。

【００２０】本発明のヌクレオチド配列は人工起源でもよいし、そうでなくてもよい。例え
ば、ゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成
配列が挙げられる。これらの配列は例えば上記配列に基づいて作製したプローブ
でＤＮＡバンク（ｃＤＮＡバンク、ゲノムＤＮＡバンク）をスクリーニングする
ことにより得られる。このようなバンクは当業者に公知の慣用分子生物学技術に
より種々の起源の細胞から作製することができる。本発明のヌクレオチド配列は
化学的合成により作製することもできるし、バンクのスクリーニングにより得ら
れた配列を化学的又は酵素的に修飾する混合法により作製することもできる。一
般に、本発明の核酸は当業者に公知の任意技術により作製することができる。

【００２１】本発明はプレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質又はポリペプチ
ドにも関する。好ましくは、本発明のポリペプチドはプレセニリンＰＳ−１のＨ
鎖及び／又はプレセニリンＰＳ−２のＨ鎖と相互作用することが可能である。よ
り好ましくは、プレセニリンＰＳ−１のＨ鎖のアミノ酸配列３１０〜４６３と相
互作用することが可能なポリペプチドである。

【００２２】本発明の意味では、プレセニリンなる用語はプレセニリンＰＳ−１及びＰＳ−
２と、特にこれらのタンパク質の突然変異形態に対応するそれらの相同形態を意
味する。

【００２３】本発明は更に、配列番号１もしくは配列番号２の配列又はこれらの配列の誘導
体から選択されるペプチド配列の全部又は一部を含むポリペプチドにも関する。

【００２４】本発明の意味では、誘導ポリペプチド配列なる用語は、１個以上の遺伝的及び
／又は化学的修飾により得られ、配列番号１又は配列番号２に示す配列と異なる
が、プレセニリンと相互作用する能力をもつ任意ポリペプチド配列を意味する。
遺伝的及び／又は化学的修飾とは、１個以上の残基の任意突然変異、置換、欠失
、付加及び／又は修飾を意味する。

【００２５】このような誘導体は種々の目的で作製することができ、例えば、特に治療効力
を増したり、副作用を抑えたり、新規薬物動態学的及び／又は生物学的性質を与
える目的で作製することができる。

【００２６】誘導体なる用語は該当配列に相同でありながら、他の細胞源、特にヒト又は他
の生物起源の細胞に由来する配列も含む。

【００２７】更に、上記ペプチド配列のフラグメントでもよい。このようなフラグメントは
種々の方法で作製することができる。特に、当業者に公知のペプチド合成器を使
用することにより、本明細書に記載の配列に基づいて化学的に合成することがで
きる。所望ペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主で発現させること
により遺伝子工学的に合成することもできる。この場合には、ヌクレオチド配列
はオリゴヌクレオチド合成器を使用することにより本明細書に記載のペプチド配
列と遺伝子コードに基づいて化学的に作製することができる。ヌクレオチド配列
は更に本明細書に記載の配列から当業者に公知の技術により酵素切断、連結、ク
ローニング等により作製することもできるし、これらの配列から作製したプロー
ブでＤＮＡバンクをスクリーニングすることにより作製することもできる。

【００２８】本発明は更に、プレセニリンの活性を抑制、阻害、刺激又は調節するための本
発明のポリペプチドの使用にも関する。

【００２９】実際に、本発明のタンパク質によりプレセニリンの作用を調節し、特に突然変
異プレセニリンの活性を阻害又は抑制することが考えられる。

【００３０】本発明の別の目的は、本発明のヌクレオチド配列を含む細胞を前記配列の発現
条件下で培養し、生産されたポリペプチドを回収する本発明のポリペプチドの製
造方法に関する。この場合には、前記ポリペプチドをコードする部分を一般に細
胞宿主でその発現を可能にするシグナルの制御下におく。これらのシグナル（プ
ロモーター、ターミネーター、分泌リーダー配列等）の選択は使用する細胞宿主
により異なる。更に、本発明のヌクレオチド配列は自律又は組込み複製可能なベ
クターの一部を構成することができる。より詳細には、自律複製ベクターは選択
した宿主で自律複製配列を使用することにより作製することができる。組込みベ
クターについては、例えば相同組換えによりベクターの組込みを可能にする宿主
のゲノムの所定領域に相同の配列を使用することにより作製することができる。

【００３１】本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主細胞に
も関する。組換え経路により本発明のペプチドを生産するのに使用可能な細胞宿
主は真核宿主でも原核宿主でもよい。適当な真核宿主のうちでは、動物細胞、酵
母又は菌類を挙げることができる。特に、酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ属を挙げることができる。動物細胞としては、ＣＯ
Ｓ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ヒト神経芽腫細胞等を挙げることができる。菌類として
は、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ種又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を挙げることが
できる。原核宿主としては、大腸菌、バチルス又はストレプトミセス等の細菌を
使用することが好ましい。

【００３２】好適態様によると、宿主細胞は本発明の核酸を発現させ、これらの核酸から誘
導されるタンパク質を生産するための組換え酵母株が有利である。

【００３３】好ましくは、宿主細胞は本発明のタンパク質を生産するために、配列番号１又
は配列番号２の配列から選択される少なくとも１個の配列又は配列フラグメント
を含む。

【００３４】本発明の核酸配列の別の用途は薬剤として利用可能なアンチセンスオリゴヌク
レオチド又はアンチセンス遺伝子の使用である。アンチセンス配列は所与遺伝子
のコーディング鎖に相補的であり、従って、転写されたｍＲＮＡと特異的にハイ
ブリダイズしてそのタンパク質翻訳を阻害することが可能な小寸法のオリゴヌク
レオチドである。従って、本発明はプレセニリンと相互作用することが可能なタ
ンパク質の発現を少なくとも部分的に阻害することが可能なアンチセンス配列に
関する。このような配列は上記ヌクレオチド配列の全部又は一部により構成して
もよいし、断片化等又は化学的合成により得ることもできる。

【００３５】本発明の配列はアンチセンス配列をｉｎｖｉｖｏ導入及び生産するため又は
プレセニリンの活性を調節することが可能なタンパク質もしくはポリペプチドを
発現させるために遺伝子治療の範囲で利用することができる。この点では、ウイ
ルス又は非ウイルスベクターに配列を組み込むと、ｉｎｖｉｖｏ投与すること
ができる。ベクターは当業者に公知の方法で獲得可能なプラスミドを利用できる
。本発明に適したウイルスベクターとしては、特にアデノウイルス、レトロウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス又はヘルペスウイルス型のベクターを挙げることがで
きる。本発明は本発明のポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む欠損組換
えウイルスにも関する。

【００３６】本発明によると、遺伝子治療の範囲で利用可能な上記ヌクレオチド配列又は対
応するｍＲＮＡとハイブリダイズすることが可能な合成又は非合成ヌクレオチド
プローブを作製することもできる。このようなプローブはプレセニリンの検出又
は遺伝子異常（スプライシング不良、多型性、点突然変異等）の検出のための診
断ツールとしてｉｎｖｉｔｒｏ使用することができる。これらのプローブは他
の細胞源、好ましくはヒト起源の細胞から上記のようなペプチドをコードする同
種核酸配列を検出及び単離するために使用することもできる。本発明のプローブ
は一般に少なくとも１０塩基を含み、例えば上記配列又はその相補鎖の完全配列
までを含むことができる。これらのプローブは使用前に標識することが好ましい
。そのためには、当業者に公知の技術を利用することができる（放射性、酵素標
識等）。

【００３７】本発明の別の目的は上記のようなポリペプチドに対するポリクローナル又はモ
ノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。このような抗体は当業者に公知
の方法により作製することができる。特に、これらの抗体は配列番号１もしくは
２の配列又はその任意フラグメント又は誘導体から選択される配列をもつポリペ
プチドで動物を免疫した後、採血し、抗体を単離することにより作製することが
できる。これらの抗体は当業者に公知の技術によりハイブリドーマを作製して作
製することもできる。本発明の抗体又は抗体フラグメントは特にプレセニリンと
上記のようなポリペプチドの相互作用を阻害及び／又は検出するために使用する
ことができる。

【００３８】本発明の別の目的は、プレセニリンと本発明のポリペプチドの相互作用を完全
又は部分的に調節又は阻害することが可能な化合物の同定方法に関する。

【００３９】本発明のポリペプチドのモジュレーター又はリガンドの検出及び／又は単離は
、 −ある分子が本発明のポリペプチドに対して親和性をもつ場合に前記ポリペプチ
ドと前記分子の相互作用を可能にする条件下で前記分子又は場合により同定され
ていない種々の分子を含む混合物を前記ポリペプチドを発現する上記のような組
換え細胞と接触させる段階と、 −前記本発明のポリペプチドに結合した分子を検出及び／又は単離する段階によ
り実施される。

【００４０】特定態様では、本発明のこの方法はプレセニリンと本発明のポリペプチドの相
互作用のアゴニスト及びアンタゴニストの検出及び／又は単離に適している。

【００４１】本発明の別の目的は、上記方法により同定及び／又は獲得されたリガンド又は
モジュレーターの医薬としての使用に関する。このようなリガンド又はモジュレ
ーターは実際に所定の神経疾患を治療することができる。

【００４２】本発明は更に、少なくとも１種の上記ポリペプチドを有効成分として含む任意
医薬組成物に関する。

【００４３】本発明は少なくとも１種の上記抗体及び／又は抗体フラグメント及び／又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む任意医薬組成物と、少なく
とも１種の上記ヌクレオチド配列を有効成分として含む任意医薬組成物にも関す
る。

【００４４】更に、本発明は上記ペプチド、抗体及びヌクレオチド配列又はそのフラグメン
トを相互に又は他の有効成分と組み合わせた医薬組成物にも関する。

【００４５】本発明は更に、本発明のヌクレオチド配列をウイルス又は非ウイルス組換えベ
クターに組み込んだ組成物にも関する。

【００４６】本発明の医薬組成物はプレセニリンの活性を調節するために使用することがで
きる。より好ましくは、これらの組成物はプレセニリン、特にその突然変異形態
の活性を少なくとも部分的に抑制又は阻害することを目的とする。より好ましく
は、例えばアルツハイマー病やトリソミー２１等の神経変性疾患の治療用医薬組
成物である。

【００４７】材料と方法１）使用した酵母株は以下の通りである。

【００４８】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＣＭ７９（ＭＡＴａ，ａｄｅ２，ｔｒｐ１，ｌ
ｅｕ２，ｌｙｓ２，ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ｇａｌ４，ｇａｌ８０，ｍｅｔ１６：
：ＧＡＬ１／１０−ＵＲＡ３ｌａｃＺ，ＨＩＳ３：：Ｇａｌ７−ｐｈｌｅｏ^Ｒ）。

【００４９】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰＣＹ２（ＭＡＴａ，Ｄｇａｌ４，Ｄｇａｌ８０
，ａｄｅ２，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ｈｉｓ３ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１
／１０−ｌａｃＺ）。

【００５０】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＦ７Ｃ（ＭＡＴａ，ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ａｄ
ｅ２，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ｇａｌ４，ｇａｌ８０，ｃａｎ^Ｒ，ＵＲ
Ａ３：：ＧＡＬ４結合部位−ＣＹＣ１−ｌａｃＺ，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１−ＨＩ
Ｓ３）。

【００５１】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＬ４０（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３，ａｄｅ２，ｔｒｐ
１，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ＵＲＡ３：：ＬｅｘＡ−ｌａｃＺ，ＬＹＳ２：：Ｌｅ
ｘＡ−ＨＩＳ３）。

【００５２】２）使用した細菌株は以下の通りである。

【００５３】Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１（Ｆ’［ｔｒａＤ３６，ｌａｃＩ^ｑ，ｌａｃＺＤ
Ｍ１５，ｐｒｏＡ^＋Ｂ^＋］，ｓｕｐＥ，ｔｈｉ−１，Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ
），Ｄ（ｈｓｄＭ−ｍｃｒＢ）５（ｒＫ⁻ｍＫ⁻ＭｃｒＢ⁻）。

【００５４】Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−，ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳＢ（ｒＢ⁻ｍ
Ｂ⁻），ｇａｌ，ｄｃｍ，（ＤＥ３）。

【００５５】３）種々の株に使用した培地は以下の通りである。

【００５６】酵母の完全ＹＰＤ培地： −Ｂａｃｔｏ−酵母エキス（１０ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ） −Ｂａｃｔｏ−ペプトン（２０ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ） −グルコース（２０ｇ／ｌ）（Ｍｅｒｋ）。

【００５７】この培地は寒天（２０ｇ／ｌ）を加えて凝固させ、オートクレーブにて１１０
℃で２０分間滅菌することができる。

【００５８】酵母の最少ＹＮＢ培地： −アミノ酸を含まないＢａｃｔｏ−酵母窒素塩基（６．７ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃ
ｏ） −グルコース（２０ｇ／ｌ）（Ｍｅｒｋ）。

【００５９】この培地は寒天（２０ｇ／ｌ）を加えて凝固させ、オートクレーブで滅菌する
ことができる。その後、栄養要求性酵母の増殖に必要なアミノ酸又は窒素塩基５
０ｍｇ／ｌを加える。細菌汚染を避けるためにアンピシリン１００μｇ／ｍｌも
加える。

【００６０】細菌の完全ＬＢ培地： −Ｂａｃｔｏ−酵母エキス（５ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ） −Ｂａｃｔｏ−トリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ） −ＮａＣｌ（５ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）この培地は寒天（１２ｇ／ｌ）を加えて凝固させ、オートクレーブで滅菌する
ことができる。アンピシリン又はカナマイシン１００μｇ／ｍｌを加え、対応す
る耐性マーカーをもつプラスミドにより形質転換された細菌を選択する。

【００６１】４）使用したプラスミドは以下の通りである。

【００６２】ベクターｐＧＢＴ９（図６（ａ））は大腸菌と酵母で増殖及び選択可能な５．
５ｋｂのシャトルプラスミドである。このベクターはＣｏｌＥ１複製起点及びア
ンピシリン耐性遺伝子（大腸菌における増殖と選択）と、２ｍｍ複製起点及びＴ
ＲＰ１遺伝子（トリプトファンの合成を欠損するｔｒｐ１−酵母における選択）
をもつ。このプラスミドはＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と着目ペプ
チドの融合タンパク質を酵母で発現させるために使用する。このプラスミドは、
いずれもアルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ１遺伝子のプロモータ
ーとターミネーターの間に配置された多重クローニング部位をＧＡＬ４のＤＢＤ
領域の下流にもつ。ＧＡＬ４のＤＢＤは核局在シグナル配列を含む。

【００６３】ＰＳ−１の種々の部分に対応する配列をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩクローニング部
位に挿入した。

【００６４】ベクターｐＧＡＤ１０（図６（ａ））は６．６ｋｂのシャトルプラスミドであ
る。このプラスミドは大腸菌で増殖及び選択できるようにＣｏｌＥ１複製起点と
アンピシリン耐性遺伝子をもつ。このプラスミドは形質転換酵母を単離するため
に酵母（２ｍｍ）の複製起点と選択遺伝子ＬＥＵ２も含む。このプラスミドはＧ
ＡＬ４の活性化ドメイン（ＡＤ）をコードする配列の下流でＡＤＨ１のプロモー
ターとターミネーターの間に多重クローニング部位をもつ。ＧＡＬ４のＡＤは核
局在シグナル配列を含む。

【００６５】このプラスミドは市販ヒト大脳ｃＤＮＡバンク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を作製す
るために使用されている。ｃＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩクローニング部位に挿入し
た。

【００６６】ベクターｐＬｅｘ９（図６（ｂ））は５ｋｂのシャトルプラスミドである。ｐ
ＧＢＴ９と同様に、このプラスミドはＣｏｌＥ１起点及びＡｍｐ^Ｒ遺伝子と、２
ｍｍ複製起点及びＴＲＰ１遺伝子をもつ。他方、ＤＮＡ結合ドメインをコードす
る配列は細菌リプレッサーＬｅｘＡの配列である。融合タンパク質の発現に有用
なプロモーターとターミネーターも遺伝子ＡＤＨ１と同様である。ＬｅｘＡのＤ
ＢＤはＳＶ４０の核局在シグナル配列を含む。

【００６７】ＰＳ−１のＨ鎖に対応する配列をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩクローニング部位に挿
入した。

【００６８】ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１（図６（ｂ））は４．９ｋｂの細菌プラスミドであ
る。このプラスミドはｐＢＲ３２２複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、β
−ガラクトシダーゼ系を抑制するためのｌａｃＩｑ遺伝子をもつ。このプラスミ
ドはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質と着目ペプチド
の融合タンパク質を細菌で発現させるために使用する。このプラスミドはペプチ
ドをコードする配列を挿入するための多重クローニング部位をＧＳＴの遺伝子の
下流にもつ。全体はＩＰＴＧにより誘導可能な高い発現レベルでｔａｃプロモー
ターにより制御される。タンパク質の生産後、トロンビンで切断すると、トロン
ビンにより認識及び切断された配列が着目ペプチドとＧＳＴの間に導入されるの
で、着目ペプチドをＧＳＴから分離することができる。

【００６９】ベクターｐＥＴ−２９ａ（図６（ｃ））は５．４ｋｂの細菌プラスミドである
。このプラスミドはｐＢＲ３２２複製起点と、ファージｆ１の複製起点と、カナ
マイシン耐性遺伝子と、ｌａｃＩｑ遺伝子をもつ。このプラスミドは、融合タン
パク質の検出と精製を容易にするＳ−Ｔａｇ配列（プロテインＳリボヌクレアー
ゼの触媒部分）とＨｉｓ−Ｔａｇ配列（１０ヒスチジンのペプチド）に融合した
着目ペプチドを細菌で発現させるために使用する。Ｔ７転写プロモーターはＩＰ
ＴＧ誘導後に強力な発現を可能にする。トロンビンにより認識及び切断される配
列をＳ−Ｔａｇ配列とＨｉｓ−Ｔａｇ配列の間に導入した。

【００７０】５）使用した合成オリゴヌクレオチド：ＰＳ−１の親水性領域に対応するＤＮＡフラグメントを得るために、ＰＳ−１
の配列（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら，１９９５）から種々のオリゴヌクレオチド
対を選択した。これらのオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅後に配列の５’
にＥｃｏＲＩ部位、３’にＳａｌＩ部位を導入することができる。

【００７１】オリゴＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＣＣ
ＡＣＴＴ（配列番号３）オリゴＢＣＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＣ
ＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号４）。

【００７２】オリゴヌクレオチドＡ及びＢはＨ鎖に由来するフラグメントＢＬ６及びＢＭを
得るために使用した。

【００７３】オリゴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＧ
ＧＴＴＧ（配列番号５）オリゴＤＣＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＧＴ
ＣＴＴＣＡＣＣ（配列番号６）。

【００７４】オリゴヌクレオチドＣ及びＤはＨ鎖の短い領域に由来するフラグメントＢＲを
得るために使用した。

【００７５】オリゴＥＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴ
ＴＧＣＣ（配列番号７）オリゴＦＣＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴ
ＧＡＴＧＣＡＡ（配列番号８）。

【００７６】オリゴヌクレオチドＥ及びＦはＰＳ−１のＣ末端部分に由来するフラグメント
Ｃｔを得るために使用した。

【００７７】オリゴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣ
ＴＧＣＡ（配列番号９）オリゴＨＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＡＴＴＴ（配列番号１０）。

【００７８】オリゴヌクレオチドＧ及びＨはＰＳ−１のＮ末端部分に由来するフラグメント
Ｎｔを得るために使用した。

【００７９】オリゴヌクレオチドＩ、Ｊ及びＫを使用してプラスミドｐＧＢＴ９及びｐＧＡ
Ｄ１０のインサートを増幅及び配列決定した。これらのオリゴヌクレオチドは夫
々ＧＡＬ４のＤＢＤ、ＧＡＬ４のＡＤ及びＡＤＨ１ターミネーターの配列に相補
的である。

【００８０】オリゴＩＧＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧ
（配列番号１１）オリゴＪＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣ
（配列番号１２）オリゴＫＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＧＣ（配列番号１３
）。

【００８１】６）分子生物学法プラスミドＤＮＡの調製Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）に記載されているプロトコールに従って、プ
ラスミドＤＮＡの少量及び大量調製を実施した。

【００８２】熱安定Ｔａｑポリメラーゼによる連鎖増幅（又はＰＣＲ）ＰＣＲは熱安定ポリメラーゼ用プライマーとして用いるオリゴヌクレオチド（
約２０ｂｐ）が固定可能な２つの既知領域間でＤＮＡ配列を増幅することができ
る。反応はＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＰＣＲ緩衝液（
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１ｍＭＭｇＣｌ_２，５ｍＭＫＣ
ｌ，０．０１％ゼラチン）、２種のオリゴヌクレオチド（各５００ｎｇ）及びＡ
ｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ＩＵの存在下に最終容量１００μ
ｌ中で実施する。混合物をパラフィン油２滴で覆い、試料の蒸発を制限する。

【００８３】使用したプログラムは３２サイクルであり、鋳型変性１サイクル（９５℃、５
分）と、３０サイクル（９５℃で１分変性、５０℃で１分ＤＮＡ鋳型にオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション、７２℃で１分Ｔａｑポリメラーゼによる
伸長）と、最後に最終伸長１サイクル（７２℃、５分）とした。

【００８４】ＰＣＲは指数増殖期に細菌又は酵母培養物で直接実施することができる。

【００８５】蛍光配列決定使用した配列決定法はＳａｎｇｅｒら（１９７７）の方法をＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発された蛍光配列決定に応用した。使用したプロ
トコールはシステムの設計者（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，１９９５）により記
載されている通りである。

【００８６】連結によるＤＮＡフラグメントのプラスミド挿入プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ反応に由来するインサートとプラスミドベクター
を夫々の緩衝液（Ｂｉｏｌａｂｓ）中でＤＮＡ１μｇ当たり１Ｕの制限酵素で１
時間消化する。酵素はインサートをベクターの他のドメインとインフレーム導入
するようにクローニング部位に応じて選択する。

【００８７】ＢＥＴ０．５μｇ／ｍｌを加えたＴＢＥ（９０ｍＭＴｒｉｓ，９０ｍＭ硼酸
，２ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８）中で作製した０．８％アガロース「調製用」ゲル
上で電気泳動により消化フラグメントをサイズに従って分離する。青色試薬（１
／１０容量）を試料に加えた後、分子量マーカー（１Ｋｂラダー、Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）の側でゲルにロードする。ＴＢＥ中９０Ｖ／ｃｍの定電圧で泳動させる
。

【００８８】塩基間に挿入されたＢＥＴの蛍光によりＤＮＡを紫外線検出する。所望サイズ
のＤＮＡフラグメント（ベクターとインサート）を含むゲルフラクションをメス
で切断し、ＴＢＥを収容する透析チューブに導入し、１５分間１００Ｖで電気泳
動させる。その後、ゲルから抽出したＤＮＡを回収し、フェノール／クロロホル
ム／イソアミレート（２５／２４／１）１容量で処理し、０．２５ＭＮａＣｌ
の存在下に無水エタノール３容量で沈殿させ、７０％エタノールで１回洗浄し、
乾燥し、最後にＨ_２Ｏ２０μｌに取る。

【００８９】ゲル上でベクターとインサートの夫々の量を算定後、総容量２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４０ＩＵ、最終１Ｘ連結用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＡＴＰ）
の存在下にベクターとインサートを１／１比で混合する。２０℃で少なくとも１
時間連結させる。

【００９０】プラスミドによる細菌の形質転換１）所謂「ＴＳＢ」法（ＣｈｕｎｇとＭｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ａ．Ｒ．ｖｏｌ１
６，１９８８による）はＤＭＳＯ処理により細胞壁を脆化させて細胞にＤＮＡを
導入する。その効率はＤＮＡ１μｇ当たり形質転換細胞１０^６個である。細菌を
液体ＬＢ培地で撹拌下に約３時間培養する（Ａ_６００＝０．６まで）。培養液を
３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレットをＴＳＢ（ＬＢ培地、１０％ＰＥＧ _４０００，５％ＤＭＳＯ，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＭｇＳＯ_４）によ
り初期容量の１／１０にとり、１５分間４℃でインキュベートする。ＤＮＡ約５
０ｎｇ（連結産物１０μｌ）をコンピテント細菌１００μｌに加えた後、混合物
を３０分間４℃でインキュベートする。ＴＳＢｇｌｕ（ＴＳＢ，２０ｍＭグルコ
ース）の添加と３７℃で４５分間インキュベーション後、プラスミドに担持した
耐性遺伝子に対応する抗生物質を加えたＬＢ培地に細菌を播く。

【００９１】２）エレクトロポレーションはＴＳＢ法よりも１０００倍有効な方法であり、
（例えば酵母に含まれるプラスミドの抽出後のように）ＤＮＡが非常に少量の場
合に使用される。この方法は電気ショックにより細胞壁を脆化させてＤＮＡを細
胞に導入する。

【００９２】細菌を液体ＬＢ培地で撹拌下にＡ_６００＝０．６まで培養する。培養液を予め
１５分間４℃でインキュベートし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレット
を氷水１容量、氷水１／２容量及び１０％氷グリセロール１／５容量で順次洗浄
する。各洗浄間に細菌を１０分間３０００ｒｐｍで遠心し、最終的に１０％氷グ
リセロール１／１０００容量に取る。この細菌懸濁液４０μｌをエレクトロポレ
ーション槽でＤＮＡ１μｌと混合する。槽をＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＢｉｏＲ
ａｄに入れ、細菌に電気ショック（２５ｍＦ，２．５ｋＶ，２００Ｗ）を与える
。３７℃で４５分間インキュベーション後、選択用抗生物質を加えたＬＢ培地に
細菌を播く。

【００９３】膜転写（又はノーザンブロット）後のｍＲＮＡのハイブリダイゼーション使用した膜は、種々のヒト組織に由来するｍＲＮＡが既に転写及び固定されて
いる市販Ｃｌｏｎｔｅｃｈニトロセルロース膜である。

【００９４】Ａｍｅｒｓｈａｍの「ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＳ
ｙｓｔｅｍ」プロトコールに従って放射性ＤＮＡプローブを作製する。このプロ
トコールによると、１０分間３７℃でインキュベーション後にＤＮＡフラグメン
ト中に５５％を上回る［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（５０ｍＣｉ）取り込み率が得られ、
２時間ハイブリダイゼーションと一晩オートラジオグラフィー後に０．５ｐｇに
等価のＲＮＡバンドを検出することができる。

【００９５】膜をハイブリダイゼーション溶液（１ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ _４，ｐＨ７．４，１０ｍｇ／ｍｌＦｉｃｏｌｌ，１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピ
ロリドン，１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，１００ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，２％Ｓ
ＤＳ）８ｍｌと約２時間４２℃で撹拌下にプレインキュベートした後、ハイブリ
ダイゼーション溶液８ｍｌと混合したプローブ２．１０^６ｃｐｍ／ｍｌと２４時
間４２℃で撹拌下にハイブリダイズし、その後、洗浄溶液１（０．３ＭＮａＣ
ｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７，０．０５％ＳＤＳ）で数回濯ぎ、こ
の同一溶液で４０分間洗浄し、洗浄溶液２（１５ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍＭク
エン酸ナトリウム，ｐＨ７，０．１％ＳＤＳ）中、４０分間５０℃でインキュベ
ートし、最後にオートラジオグラフィーにかける。

【００９６】７）二重ハイブリッドシステムの方法システムの原理二重ハイブリッドシステムは１９８９年以来ＳｏｎｇとＦｉｅｌｄｓにより開
発され、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｉｎ
ｖｉｖｏ相互作用によるクローニング法である。このシステムは所定の真核ト
ランスアクチベーターが特異的配列に固定するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と
転写機構（ｐｏｌＩＩＲＮＡ）を強化する活性化ドメイン（ＡＤ）の２領域し
かその機能に必要としないという事実に基づく。２領域が分離していると、ＡＤ
は正しく配置できず、転写は誘導されない。

【００９７】このシステムでは、ＤＢＤをタンパク質Ｘに融合し、ＡＤをタンパク質Ｙに融
合する。タンパク質Ｘとタンパク質Ｙが相互作用するならば、機能的トランスア
クチベーター複合体が形成され、ＤＢＤにより認識される配列の下流に配置され
たレポーター遺伝子の発現を誘導する。遺伝子の発現により、２種のタンパク質
間の相互作用を間接的に検出することができる。

【００９８】１又は２種の異なるプラスミドによる酵母の形質転換Ｇｉｅｔｚ（Ｇｉｅｔｚら，１９９５）により記載されている方法に従い、Ｌ
ｉＡｃ／ＰＥＧ処理により酵母をコンピテントにする。

【００９９】酵母をＹＰＤ固体培地で２８℃で一晩培養する。次に、滅菌溶液Ｉ（０．１ＭＬｉＡｃ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）１
ｍｌに再懸濁し、１分間３０００ｒｐｍで遠心し、再び溶液Ｉ１ｍｌにとる。
次に、懸濁液５０μｌをサケ精子ＤＮＡ（キャリヤーＤＮＡ）５μｇ、プラスミ
ドＤＮＡ１〜５μｇ及び滅菌溶液ＩＩ（０．１ＭＬｉＡｃ，１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５，５０％ＰＥＧ_４０００）３００μ
ｌと混合する。混合物を３０分間２８℃でインキュベートした後、２０分間４２
℃で熱ショックを与える。１分間３０００ｒｐｍで遠心後、細胞を滅菌水で１回
洗浄し、滅菌水１００μｌにとる。次に、その増殖に必要なアミノ酸と窒素塩基
を加えたＹＮＢ寒天培地に酵母を播く。形質転換酵母株を選択できるように、プ
ラスミドに担持した選択マーカーに対応するアミノ酸と窒素塩基は加えない。容
器を２８℃のインキュベーターに３日間入れる。

【０１００】ｃＤＮＡバンクによる酵母の形質転換使用したｃＤＮＡバンクは正常ヒト（大脳外傷後に死亡した３７歳男子）大脳
のｍＲＮＡから構成される市販バンク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。ｃＤＮＡを
ＧＡＬ４のＡＤ領域の下流のＥｃｏＲＩ部位でプラスミドｐＧＡＤ１０にクロー
ニングした。インサートの平均寸法は１．４ｋｂ±標準偏差１ｋｂである。バン
クを大腸菌ＤＨ５ａで１回増幅すると、８０％にインサートを含む独立クローン
１．２×１０^６個が得られた。

【０１０１】バンクの良好な適確性を維持するためには、形質転換細胞数をバンクの構築時
に得られる独立クローン数の２〜１０倍にする必要がある。従って、良好な形質
転換効率（ＤＮＡ１００μｇ当たり形質転換細胞約１０^７個）が得られるプロト
コールを使用する。

【０１０２】ＰＳ−１の１領域に対応する配列を含むプラスミドｐＧＢＴ９により予め形質
転換した酵母ＹＣＭ７９をＹＮＢ培地５０ｍｌ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｍｅ
ｔ＋Ｌｅｕ＋Ｕｒａ中２８℃で撹拌下に一晩培養する。この予備培養物の光学密
度を測定し、１ｍｌ当たりの細胞数を算定すると、ＹＰＤ培地２５０ｍｌに接種
すべき容量を計算することができ、２８℃で一晩撹拌後に細胞１０^７個／ｍｌ（
約Ａ_６００＝０．８）の培養物が得られる。

【０１０３】次に、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を回収し、滅菌水１００ｍｌで
２回洗浄し、形質転換溶液Ｉ１０ｍｌに取る。懸濁液を１０分間３０００ｒｐ
ｍで遠心し、細胞をこの同一溶液２．５ｍｌに再懸濁する。懸濁液の一部を分取
し（２００μｌ）、半量を非形質転換対照とし、残りの半量を形質転換効率が分
かっている対照プラスミドにより形質転換する。残りの懸濁液を１ｍｇ／ｍｌの
ｃＤＮＡプラスミドバンク１００μｌ及び溶液ＩＩ２０ｍｌと混合する。混合
液を撹拌下に２８℃で１時間、次いで４２℃で２０分間インキュベートした後、
１５分間３０００ｒｐｍで遠心する。細胞ペレットを１回水洗し、ＰＢＳで２回
洗浄し、酵母に毒性作用をもつＰＥＧを完全に除去した後、滅菌ＰＢＳ（５０ｍ
ＭＮａ_２ＨＰＯ_４，１０ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＭｇＳＯ_４，ｐＨ７）２．５
ｍｌに取る。

【０１０４】ＹＮＢ培地２５０ｍｌ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｍｅｔ＋Ｕｒａにこの懸濁
液を播き、４時間２８℃で撹拌下にインキュベートし、ハイブリッドタンパク質
を発現させ、場合により相互作用させ、レポーター遺伝子ＵＲＡ３を発現させる
。他方、この段階は結果的に陽性クローン数を増幅する。コロニー数の増幅率を
調べるために、このインキュベーション前後に培養液１ｍｌを分取し、希釈率を
変えてＹＮＢ寒天培地＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｍｅｔ＋Ｕｒａに播く。増殖
後、Ｌｅｕ＋Ｔｒｐ＋クローン数を測定し、インキュベーション期間前後の形質
転換頻度を評価し、増幅率を推算する。

【０１０５】次に、細胞を１０分間３０００ｒｐｍで遠心し、滅菌水で２回洗浄し、ＮＹＢ
１０ｍｌにとり、ＹＮＢ選択培地２００ｍｌ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ＋Ｍｅｔ
を各々入れた４３５ｃｍ^２容器１０個に播く。容器を２８℃のインキュベーター
に３日間入れる。

【０１０６】酵母からプラスミドＤＮＡの抽出本方法はプラスミドと酵母に含まれるゲノムＤＮＡを抽出する。プラスミドを
単離するためには、プラスミドＤＮＡのみが増幅できる細菌を形質転換し、ミニ
調製後に各クローンを分析すればよい。プラスミドを含む酵母を選択ＮＹＢ固体
培地で２８℃で一晩培養する。次に、ガラスビーズ（直径４５０μｍ）とフェノ
ール／クロロホルム２００ｍｌの存在下に破砕溶液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ１０
０，１％ＳＤＳ，１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡ）２００ｍｌに再懸濁する。混合物を１５分間ボルテックスで撹拌し
た後、２分間１４０００ｒｐｍで遠心する。水相を１時間膜透析する。この溶液
をエレクトロポレーションによる細菌の形質転換に利用することができる。

【０１０７】 β−ガラクトシダーゼ活性の検出本試験はβ−ガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝子ＬａｃＺの形質
転換酵母における発現を確認する。

【０１０８】ニトロセルロースシートを個々の酵母クローンに被せる。レプリカを液体窒素
に３０秒ずつ３回浸し、酵母を破砕し、基質をβ−ガラクトシダーゼに接触でき
るようにする。次に、現場調製したＰＢＳ／Ｘｇａｌ溶液（ＰＢＳ５ｍｌ中ジメ
チルホルムアミド４０ｍｇ／ｍｌを含むＸｇａｌ基質溶液１００μｌ）を染み込
ませたＷｈａｔｍａｎ濾紙にコロニーを上にしてシートを重ね、試験する酵素活
性に最適な温度である３７℃にする。

【０１０９】 β−ｇａｌ活性を検出する青色の出現時間は数分から数時間まで非常に幅があ
る。試験はすぐに青変する相互作用陽性対照と白色のまま変わらない陰性対照の
存在下に実施する。

【０１１０】滴注試験本試験は酵母株の表現型を分析する。僅かに濁った酵母懸濁液１滴（約５ｍｌ
）を種々の選択及び非選択寒天培地に滴注し、２８℃で２日間インキュベーショ
ン後に酵母の増殖を観察する。

【０１１１】プラスミドの分離本試験は形質転換した酵母の表現型がプラスミドの存在に十分に結び付けられ
るか否かをプラスミド分離により試験する。

【０１１２】酵母を完全ＹＰＤ培地にて２８℃で一晩培養する。この非選択培地は細胞分裂
後にプラスミドを維持するか否かに関係なく酵母を増殖させることができる。２
８℃で一晩インキュベーション後にＹＰＤ培地容器当たり５０〜１００クローン
を得るようにこの培養液を種々の希釈率で播く。その後、種々の選択培地でクロ
ーンの表現型を簡単にレプリカ試験し、２８℃で２日間インキュベーション後に
プラスミドを含まない細胞の頻度を算定することができる。

【０１１３】８）ｉｎｖｉｔｒｏ相互作用試験のための方法試験原理本試験は、アフィニティークロマトグラフィー生化学法を使用することにより
２種のタンパク質間の相互作用を確認する。デコイタンパク質を予め固定してお
いた支持体にタンパク質の予想パートナーの１個を含む細胞抽出液を加える。タ
ンパク質とその潜在的パートナーの間に相互作用が存在するならば、このパート
ナーも支持体に保持される。

【０１１４】大腸菌における融合タンパク質の発現ＩＰＴＧ（Ｓｔｕｄｉｅｒ，１９９１）により誘導可能な発現ベクターｐＥＴ
及びｐＧＥＸにより、融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で生産させる
。

【０１１５】選択用抗生物質（ｐＧＥＸにはアンピシリン、ｐＥＴにはカナマイシン１００
μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地で組換えプラスミドにより予め形質転換しておい
た細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を撹拌下に一晩培養する。この予備培養液５ｍｌをＬ
Ｂ培地４５ｍｌ＋抗生物質に接種し、３７℃で１時間撹拌後にＡ_６００＝０．６
の培養液を得る。次に０．１ｍＭＩＰＴＧを加えてタンパク質の生産を誘導し
、細菌を３７℃で１時間〜４時間再度撹拌する。６０００ｒｐｍで５分間遠心し
てタンパク質を発現する細胞を回収する。ペレットは−２０℃で保存できる。

【０１１６】細菌で生産されたタンパク質の抽出と分析融合タンパク質を含む細菌ペレットをＴＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８，２ｍＭＥＤＴＡ）５ｍｌに再懸濁する。細胞を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ
のリゾチームと１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解する。細胞溶解液を１５
分間３０℃でインキュベートした後、氷中に入れ、細菌懸濁液が流動性になるま
で超音波にかける。細菌溶解液を４℃、１００００ｒｐｍで１５分間遠心する。
可溶化融合タンパク質を含む上清は−２０℃で保存できる。

【０１１７】この段階では、得られた種々のフラクションを変性ゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）により分析する。遠心分離前の細菌懸濁液（全フラクション）６０μｌ
、上清（可溶性フラクション）６０μｌ及びＴＥ５ｍｌに再懸濁したペレット（
不溶性フラクション）６０μｌを分取する。各フラクションに含まれるタンパク
質を１／４容量の青色試薬４×Ｌ（０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，
５％ＳＤＳ，５％グリセロール，０．５％２−メルカプトエタノール、ブロモフ
ェノールブルー）の存在下に１０分間９５℃で変性させ、１２％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲルにロードし、電気泳動により分子量に従って分離する。１２５Ｖ
／ｃｍで泳動後、ゲルのクーマシーブルー着色によりタンパク質を検出する。

【０１１８】タンパク質の可溶化大腸菌で外来遺伝子を発現させる際には封入体を形成する外来タンパク質の凝
集体が出現することがある。その場合、組換えタンパク質は遠心分離により容易
に精製できるが、可溶化しにくいことが多い。

【０１１９】不溶性フラクション中に存在するタンパク質を６Ｍ尿素と１０ｍＭＤＴＴに
より１０分間３７℃で変性させた後、３種の連続緩衝液（５ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ８／２Ｍ尿素，５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８／１Ｍ尿素，５ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８）で少なくとも６時間ずつ透析して再生させる。
１００００ｒｐｍで１５分間遠心後、−２０℃で保存可能な上清中に約５〜１０
％のタンパク質が存在する。

【０１２０】アフィニティークロマトグラフィー良好な条件でタンパク質を保持するためには、試料のタンパク質濃度を４０ｍ
ｇ／ｍｌ以上にすべきである。この濃度は比色分析法（例えばＢｒａｄｆｏｒｄ
試薬）により計算することができる。

【０１２１】非融合ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＢＭ（プレセニリン１の突然変異鎖）を含む可溶性
フラクション２００μｌを「グルタチオン樹脂」３００μｌの存在下に２分間２
０℃でインキュベートする。ビーズに保持されなかったフラクションを分取する
。樹脂を洗浄用緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１５０ｍＭＮ
ａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で４回洗浄し、非特異的吸着によ
り固定したタンパク質を除去する。ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＢＭを結合した樹脂１５
０μｌを、ＳＴａｇ又はＳＴａｇ−Ｐｅｐ１２６を含む可溶性フラクション６０
０μｌと共に１時間４℃で撹拌下にインキュベートする。次に、アガロースビー
ズを１分間３０００ｒｐｍで遠心し、保持されなかったフラクションの分取後に
洗浄用緩衝液で４回洗浄する。

【０１２２】各フラクション（可溶性、非保持及びビーズに保持）のアリコートを青色試薬
の存在下に９５℃で変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、電気泳動により
分離する。次に、タンパク質をニトロセルロース膜に移した後、膜をポンソーレ
ッド（２０μｇ／ｍｌ）で着色し、タンパク質の転写が確かに行われたことを確
認する。

【０１２３】ＳＴａｇと融合したタンパク質を特異的に検出できるように、ニトロセルロー
ス膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＴＣｌ，ｐＨ８，１５０ｍＭＮａＣｌ
，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中１％ゼラチンで１５分間飽和し、アルカリホス
ファターゼに結合したプロテインＳと共に１５分間インキュベートする。ＴＢＳ
Ｔで４回洗浄後、Ｎｏｖａｇｅｎ法によりＮＢＴとＢＣＩＰを含む緩衝液ＰＡ
１Ｘを加えてアルカリホスファターゼの活性を検出する。

【０１２４】９）哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現方法哺乳動物細胞発現ベクターの構築哺乳動物細胞で発現させるために、配列番号１及び２を強力なウイルスプロモ
ーター（ＣＭＶ）の制御下に慣用方法によりベクターにサブクローニングした。

【０１２５】細胞のトランスフェクションＣＯＳ１細胞又はＣＨＯ細胞に確立されている方法は、ＤＮＡの圧縮とトラン
スフェクション効率を最適化するために、ＤＮＡに対して１：８（重量／重量）
の比のリポフェクタントと、同一比の合成ペプチド（Ｈ１）を使用している。こ
の方法は特にリポフェクタントの正電荷によりＤＮＡのリン酸の電荷を中和する
ものである。

【０１２６】３７℃、湿度９５％及びＣＯ_２５％のインキュベーターでグルコース（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ）４．５ｇ／ｌを加えたＤＭＥＭ培地（ダルベッコの変形イーグル
培地）にＬ−グルタミン３％、ペニシリン−ストレプトマイシン１％及びウシ胎
児血清１０％を補充してＣＯＳ１細胞を培養する。

【０１２７】トランスフェクションの前日に１００ｍｍ容器当たり細胞２．５ｘ１０^６個の
密度で細胞を播種する。トランスフェクションの当日に細胞をＰＢＳ（リン酸緩
衝塩類）で２回、ＯｐｔｉＭＥＭ（特許組成物，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で１回濯
ぎ、インキュベーターで少なくとも１５分間馴化する。

【０１２８】１００ｍｍ容器等量当たり、プラスミドＤＮＡ合計８μｇをＯｐｔｉＭＥＭ
３００μｌ及び合成ペプチド（Ｈ１）６４μｇに加える。１０秒間激しくボルテ
ックスした後、５分間の待機後にＯｐｔｉＭＥＭ３００μｌで希釈したリポフ
ェクトアミン（３２μｌ，即ち６４μｇ）を先の混合物に加える。全体を再び激
しくボルテックスした後、３０分間放置する。各チューブに５ｍｌのＯｐｔｉＭ
ＥＭを加え、ボルテックスした混合液を（予め培地を吸引しておいた）細胞に重
層する。次に、細胞をインキュベーターに４時間入れ、その後、混合物を完全培
地に交換する。

【０１２９】細胞溶解とタンパク質定量最も多くの場合には、細胞をトランスフェクションから４８時間後（通常発現
最大）に溶解させる。溶解用緩衝液は１０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％ＮＰ４０及びプロテアーゼ
インヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^Ｃ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）を含む。各プレートをＰＢＳで濯いだ後に冷緩衝液８００μｌを加え
る。次に、溶解液を音波処理した後、４℃で一晩磁気バーで撹拌する。３０分間
１５０００ｘｇで遠心し、上清からペレットを分離する。

【０１３０】次に、下記実験を標準化できるようにＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により可
溶性タンパク質を定量する。

【０１３１】免疫転写試料（細胞溶解液）を等容量のローディング緩衝液（１２５ｍＭＴｒｉｓ，
ｐＨ６．８，４％ｍ／ｖＳＤＳ，２０％グリセロール，０．０２％ブロモフェ
ノールブルー，５０ｍＭジチオトレイトール）中、９５℃で５分間変性させる。
プレセニリンの発現の分析に際しては、９５℃でプレセニリンに固有の凝集を避
けるために試料を８Ｍ尿素の存在下に３７℃で変性させる。

【０１３２】識別する分子量に応じてアクリルアミド百分率を変えながら、Ｔｒｉｓ−Ｇｌ
ｙｃｉｎｅ（Ｎｏｖｅｘ）ゲルに試料をロードする。分子量マーカー（Ｂｒｏａ
ｄＲａｎｇｅ，ＢｉｏＲａｄ）もロードする。最終１ＸＳＤＳ（Ｎｏｖｅｘ
）緩衝液中で１００Ｖの定電圧で約２時間泳動させる。次に、ゲルをニトロセル
ロース又はＰＶＤＦ膜（１０％メタノールを含む最終１Ｘ転写緩衝液（Ｎｏｖｅ
ｘ））に５０ｍＡの定電流で２時間転写する。

【０１３３】転写後、２％脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔ（０．５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）（
Ｍｅｒｃｋ）５０ｍｌで周囲温度で２時間膜をブロックする。一次抗体（２％脱
脂乳を含むか又は含まないＰＢＳ−Ｔで約１／１０００〜１／５０００の最適濃
度に希釈）を一晩４℃で放置する。ＰＢＳ−Ｔで短時間濯いだ後、膜を所謂「Ｅ
ＣＬ」緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ）で１／５０００に希釈した二次抗体（場合に応じて西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合した抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ）の存在下に４５分間インキュベー
トする。

【０１３４】次に、膜を「ＥＣＬ」緩衝液で４×１５分間濯ぐ。膜は２種の緩衝液を現場で
等容量混合することにより構成されるＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検
出することができる。写真フィルム（ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬ，Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）の種々の露光後に現像する。

【０１３５】実施例実施例１：大脳ｃＤＮＡ融合バンクのスクリーニングによるＰＳ−１の特異的
パートナーの単離タンパク質ＰＳ−１の特異的パートナーを単離する目的で、二重ハイブリッド
法によりヒト大脳ｃＤＮＡバンクをスクリーニングした。ＧＡＬ４のＡＤと融合
したｃＤＮＡバンクを使用し、ＰＳ−１の親水性領域をＧＡＬ４のＤＢＤと融合
することにより種々のデコイタンパク質を構築した。

【０１３６】１．１ＧＡＬ４のＤＢＤとＰＳ−１の親水性領域の融合タンパク質の発現を可能にするベクターの構築ＰＳ−１の種々の親水性領域に対応する配列をＧＡＬ４のＤＢＤの配列と同一
の読み枠に導入したベクターｐＧＢＴ９により５種の融合タンパク質を作製した
。Ｎ末端領域（Ｎｔ，コドン１〜８１）、Ｈ鎖（ＢＬ６，コドン２６３〜４０７
）、Ｌ２８６Ｖ突然変異をもつＨ鎖（ＢＭ）、Ｈ鎖の短い領域（ＢＲ，コドン２
９０〜３７６）及びタンパク質のＣ末端部分（Ｃｔ，コドン４２１〜４６７）と
相互作用するタンパク質を同定することにした。

【０１３７】ＰＳ−１のｃＤＮＡの完全配列からＰＣＲによりこれらの各領域に対応するＤ
ＮＡフラグメントを得た。使用した種々のオリゴヌクレオチドは各増幅配列の末
端にＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位を導入することができた。こうして、ＧＡＬ
４のＤＢＤの配列の下流でｐＧＢＴ９の多重クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位
とＳａｌＩ部位の間にＰＣＲフラグメントをインフレーム挿入することができた
。得られた各構築物ｐＧＢＴ−Ｎｔ、ｐＧＢＴ−ＢＬ６、ｐＧＢＴ−ＢＭ、ｐＧ
ＢＴ−ＢＲ及びｐＧＢＴ−ＣｔをＤＮＡ配列決定により確認した。この確認の結
果、フラグメントはＰＣＲにより生じた突然変異を含まず、確かにＧＡＬ４のＤ
ＢＤの配列と同一のオープンリーディングフレーム内にあることが分かった。

【０１３８】１．２ＧＡＬ４のＤＢＤとＰＳ−１の親水性領域の融合タンパク質を発現する酵母株の獲得２種の異なるプラスミドによる酵母の同時形質転換は単一プラスミドによる形
質転換よりも頻度の低い現象であるので、ｃＤＮＡバンクのスクリーニング時に
できるだけ最良の効率が得られるように、デコイタンパク質をコードするベクタ
ーで予め形質転換した酵母株を使用した。

【０１３９】このために、酵母株ＹＣＭ７９をプラスミドｐＧＢＴ−Ｎｔ、ｐＧＢＴ−ＢＬ
６、ｐＧＢＴ−ＢＭ、ｐＧＢＴ−ＢＲ及びｐＧＢＴ−Ｃｔの各々で形質転換した
。これらのプラスミドを含む酵母をトリプトファン欠失培地でＴｒｐ＋表現型に
ついて選択し、夫々ｙＮｔ、ｙＢＬ６、ｙＢＭ、ｙＢＲ及びｙＣｔと命名した。
各株におけるこれらの各プラスミドの存在は、インサートの５’及び３’に位置
するＤＢＤ及びｔＡＤＨ１配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて酵母で直
接ＰＣＲを実施することにより確認した。得られたＰＣＲフラグメントの寸法か
らｙＢＬ６及びｙＢＭ株以外の各株を識別することができる。

【０１４０】１．３ＰＳ−１の親水性領域を含む融合タンパク質のトランスアクチベーター活性及びＧＡＬ４のＡＤとの相互作用の試験融合タンパク質がトランスアクチベーター活性をもつか又はＧＡＬ４のＡＤと
相互作用する場合には、完全タンパク質−タンパク質間相互作用以外は常に陽性
応答を与えるので、二重ハイブリッドシステムでデコイとして使用することがで
きない。

【０１４１】そこで、第１の試験ではＰＳ−１の親水性領域がＧＡＬ４のＡＤと融合してい
る場合、即ち単独でレポーター遺伝子の転写を誘導できる場合にはトランスアク
チベーター活性をもたないことを確認する。この種の活性は、例えば融合タンパ
ク質における酸性ドメインの存在に結び付けることができる。

【０１４２】この試験では、レポーター遺伝子ＬａｃＺ及びＵＲＡ３の発現をｙＮｔ、ｙＢ
Ｌ６、ｙＢＭ、ｙＢＲ及びｙＣｔ株で直接試験した。

【０１４３】融合タンパク質とＧＡＬ４のＡＤの相互作用の不在を試験する第２の試験では
、ＧＡＬ４のＡＤをコードするプラスミドｐＧＡＤ４２４（ｐＧＡＤ１０と等価
）により表現型Ｔｒｐ＋Ｌｅｕ−のｙＮｔ、ｙＢＬ６、ｙＢＭ、ｙＢＲ及びｙＣ
ｔ株を形質転換した。トリプトファンもロイシンも含まない培地で酵母を選択し
、得られたクローンで相互作用を試験することが可能なレポーター遺伝子Ｌａｃ
Ｚ及びＵＲＡ３の発現を試験した。

【０１４４】全ての場合に、β−ガラクトシダーゼ活性試験の結果とウラシルを含まない選
択培地への滴注試験の結果は陰性であった。

【０１４５】従って、ＰＳ−１の親水性部分を含む融合タンパク質は固有トランスアクチベ
ーター性をもたず、ＧＡＬ４の活性化ドメインと相互作用しない。従って、バン
クのスクリーニングにデコイタンパク質として使用することができる。

【０１４６】１．４ｃＤＮＡ融合バンクによる種々の酵母株の形質転換融合バンクのスクリーニングにより、デコイタンパク質と相互作用するＧＡＬ
４のＡＤに融合したペプチドを発現するクローンを同定することができる。この
相互作用が存在する場合には、デコイタンパク質を含む株でレポーター遺伝子Ｕ
ＲＡ３及びＬａｃＺの発現を誘導することが可能な機能的トランスアクチベータ
ーを再構成できる筈である。

【０１４７】スクリーニングが適確であるためには、バンクを構成する各独立プラスミドが
形質転換後の少なくとも１個の酵母クローンに存在していることが必要である。
そこで、理論的にバンクの独立プラスミド数よりも多数の形質転換細胞が得られ
るようなプロトコールを使用した（材料と方法の項参照）。

【０１４８】表現型Ｈｉｓ−、Ｌｙｓ−、Ａｄｅ−、Ｍｅｔ−、Ｕｒａ−、Ｌｅｕ−のｙＮ
ｔ、ｙＢＬ６、ｙＢＭ、ｙＢＲ及びｙＣｔの５株を融合バンクのプラスミドＤＮ
Ａ１００μｇで順次形質転換し、形質転換細胞をＹＮＢ培地＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋
Ａｄｅ＋Ｍｅｔで選択した。

【０１４９】最初の選択後に、ｙＮｔ株で表現型Ｕｒａ＋をもつクローン３２個、ｙＢＬ６
でＵｒａ＋クローン４５０個、ｙＢＭで１２８個、ｙＢＲで２５０個、ｙＣｔで
６７個が得られた。これらの形質転換細胞でβ−ガラクトシダーゼ活性試験を実
施し、第２のレポーター遺伝子ＬａｃＺの発現を確認した。ｙＮｔ株で１クロー
ン、ｙＢＬ６株で１クローン、ｙＢＭ及びｙＢＲ株で各２クローンの合計６個の
クローンがＵｒａ＋，β−ｇａｌ＋の二重表現型を示し、ｙＣｔでは０であった
。これらのクローンを夫々ｙＮｔ．Ａ、ｙＢＬ６．Ｂ、ｙＢＭ．Ｃ、ｙＢＭ．Ｄ
と命名した。

【０１５０】実施例２：バンクからプラスミドの単離ＰＳ−１の突然変異鎖又は短縮鎖と相互作用することが可能なタンパク質を同
定するために、酵母ｙＢＭ．Ｃ及びｙＢＭ．Ｄに含まれるプラスミドを抽出した
。ＤＮＡ調製物中に存在するプラスミドを使用してエレクトロポレーションによ
り細菌を形質転換した。

【０１５１】得られた細菌クローンから抽出したプラスミドを種々の酵素で消化した。この
分析により５種の異なる制限プロフィルが判明した。

【０１５２】酵母ｙＢＭ．Ｃ及びｙＢＭ．Ｄから抽出したプラスミドの消化物はプラスミド
ｐＧＢＴ−ＢＭに対応する共通プロフィルと、配列番号１に対応する２９００ｂ
ｐのインサート（ｐＧＡＤ−ＣはｙＢＭ．Ｃ株に由来）及び配列番号２に対応す
る１４００ｂｐのインサート（ｐＧＡＤ−ＤはｙＢＭ．Ｄ株に由来）を含むプラ
スミドｐＧＡＤ１０に対応する２種の異なるプロフィルを示す。

【０１５３】２．１種々の酵母株の形質転換による単離プラスミドの試験大脳バンクプラスミドによる酵母の形質転換時には、数個の異なるプラスミド
が同一細胞に導入される場合がある。相互作用の結果が確かに単離プラスミドの
存在に起因し、余分なプラスミドに起因するものではないことを確認するために
、ＹＣＭ７９株とＨＦ７Ｃ及びＰＣＹ２株でＰＳ−１の種々の親水性領域に対し
てバンクスクリーニングからの融合タンパク質を更に試験した。

【０１５４】ＨＦ７Ｃは２個のレポーター遺伝子ＨＩＳ３及びＬａｃＺをもつ。遺伝子Ｌａ
ｃＺはＹＣＭ７９株に存在するプロモーター環境とは異なるプロモーター環境を
もつため、β−ｇａｌ＋クローンの獲得が特定プロモーター環境ではなく、試験
したタンパク質間の相互作用に結び付けられることを確認することができる。Ｐ
ＣＹ２はトランスアクチベーターＧＡＬ４が機能的である場合に他の２種の株よ
りも強く発現されるただ１個のレポーター遺伝子ＬａｃＺしかもたないという利
点がある。

【０１５５】３種の酵母株ＹＣＭ７９、ＨＦ７Ｃ及びＰＣＹ２を種々のプラスミド対ｐＧＢ
Ｔ−Ｘ／ｐＧＡＤ−Ｙ（ＸはＮｔ、ＢＬ６、ＢＭ、ＢＲ又はＣｔに対応し、Ｙは
Ｃ又はＤに対応する）、ｐＧＢＴ９／ｐＧＡＤ４２４（陰性相互作用対照）及び
ｐＧＢＴ−ＣｔＡＰＰ／ｐＧＡＤ−Ｆｅ６５（陽性相互作用対照）（Ｒｕｓｓｏ
ら，１９９５）で形質転換した。各形質転換から３〜５個のクローンで栄養要求
性とβ−ｇａｌ活性を試験した。容器の結果を図２に示す。

【０１５６】試験感度の差を考慮すると、形質転換酵母ＹＣＭ７９及びＨＦ７Ｃがウラシル
欠失又はヒスチジン欠失選択培地で発生する場合、即ちレポーター遺伝子の少な
くとも一方を確実に発現する場合に相互作用が確認される。

【０１５７】応答の強度（コロニーの青色の濃淡と発生の多少）はレポーター遺伝子の発現
率に比例するとみなされる。この率の変動は種々の方法で説明することができる
。低率はトランスアクチベーターＧＡＬ４を再構成するタンパク質間の相互作用
が弱いためであると思われる。また、複合体の形成を不安定にする第３のタンパ
ク質の介在、あるいは酵母中の融合タンパク質の不安定性、あるいは酵母の状態
にも起因すると思われる。酵母は低転写活性状態にあると思われ、これは例えば
外来タンパク質の毒性の問題に結び付けられる。

【０１５８】単離した大脳バンク融合タンパク質はＰＳ−１のＮ末端部分及びＣ末端とは相
互作用しない。他方、親水性領域ＢＬ６、突然変異親水性領域ＢＬ６（ＢＭ）及
びこの領域の短縮形（ＢＲ）とはいずれも相互作用すると思われる。

【０１５９】２．２ＰＳ−１鎖を含まないタンパク質とバンク融合タンパク質の相互作用試験本試験では、バンクからの融合タンパク質がその構造、その電荷、その疎水性
によりデコイタンパク質（タイプＩＩＩの偽陽性）又はＧＡＬ４のＤＢＤ（タイ
プＩＩの偽陽性）と非特異的に相互作用するか否かを調べる。

【０１６０】ＹＣＭ７９、ＨＦ７Ｃ及びＰＣＹ２株をプラスミド対ｐＧＢＴ９／ｐＧＡＤ−
Ｙ（ＹはＣ又はＤに対応）、ｐＧＢＴ−ＬＡＭ／ｐＧＡＤ−Ｙ、ｐＧＢＴ９／ｐ
ＧＡＤ４２４（陰性対照）及びｐＧＢＴ−ＣｔＡＰＰ／ｐＧＡＤ−Ｆｅ６５（陽
性対照）で形質転換した。ｐＧＢＴ９はＧＡＬ４のＤＢＤを単独でコードし、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ製品であるｐＧＢＴ−ＬＡＭは、他のタンパク質の疎水性領域と
非特異的に相互作用するラミンとＧＡＬ４のＤＢＤの融合タンパク質をコードす
る。

【０１６１】その結果、こうして形質転換した酵母のうち、そのレポーター遺伝子を発現で
きるものは皆無であった。即ち、酵母ＹＣＭ７９は表現型Ｕｒａ−，β−ｇａｌ
−をもち、酵母ＨＦ７ＣはいずれもＨｉｓ−，β−ｇａｌ−であり、酵母ＰＣＹ
２はβ−ｇａｌ−であった。

【０１６２】これらの結果は、こうして単離したバンク融合タンパク質がＰＳ−１の親水性
領域ＢＬ６と特異的に相互作用するが、ラミン又はＧＡＬ４のＤＢＤとは結合し
ないことを示唆している。

【０１６３】２．３ＰＳ−１鎖をコードする領域を含むベクターｐＬｅｘ９により形質転換した酵母の相互作用試験本試験では、タンパク質の相互作用はＢＬ６の種々のフラグメントがＧＡＬ４
のＤＢＤに融合している場合のみに示す構造に起因しないことを確認する。

【０１６４】これを確認するために、フラグメントＢＬ６及びＢＭを別のＤＢＤである細菌
リプレッサーＬｅｘＡのＤＢＤに融合した。親水性鎖ＢＬ６と突然変異形の配列
をプラスミドｐＬｅｘ９のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位のレベルでＬｅｘＡ遺伝子
に融合した２種の付加プラスミド構築物（ｐＬｅｘ−ＢＳ及びｐＬｅｘ−ＢＭ）
を作製した。

【０１６５】次に、ＬｅｘＡのオペレーター部位に複合体ＤＢＤ−ＬｅｘＡ／ＡＤ−ＧＡＬ
４を固定することによりレポーター遺伝子ＨＩＳ３及びＬａｃＺの発現を誘導す
る酵母株Ｌ４０を形質転換した。プラスミド対ｐＬｅｘ−ＢＬ６／ｐＧＡＤ−Ｙ
（ＹはＣ又はＤに対応）、ｐＬｅｘ−ＢＭ／ｐＧＡＤ−Ｙ、ｐＬｅｘ−ＲＡＳ／
ｐＧＡＤ−ＲＡＦ（陽性相互作用対照）（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）及びｐＬ
ｅｘ−ＲＡＳ／ｐＧＡＤ４２４、ｐＬｅｘ−ＢＬ６／ｐＧＡＤ４２４、ｐＬｅｘ
−ＢＬ６／ｐＧＡＤ−ＲＡＦ、ｐＬｅｘ−ＢＭ／ｐＧＡＤ４２４、ｐＬｅｘ−Ｂ
Ｍ／ｐＧＡＤ−ＲＡＦ（陰性相互作用対照）との相互作用を試験した。

【０１６６】ヒスチジンを欠失する選択培地への滴注試験とβ−ｇａｌ活性試験の結果は、
試験したプラスミドｐＧＡＤ−Ｙの種類に関係なくｐＬｅｘ−ＢＬ６を含む株で
は陽性であった。試験したプラスミドｐＧＡＤ−Ｙの種類に関係なくｐＬｅｘ−
ＢＭを含む株についても同様である。この試験の結果、得られる相互作用はＰＳ
−１のＢＬ６領域がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合している場合に示す特
定コンホメーションに結び付けられないことが判明した。

【０１６７】実施例３：スクリーニングからのプラスミドのインサートの同定３．１プラスミドｐＧＡＤ−Ｃ及びｐＧＡＤ−Ｄのインサートの配列決定プラスミドｐＧＡＤ−Ｃ及びｐＧＡＤ−Ｄのインサートを完全に配列決定した
。まず、各インサートの始点と終点の配列を知るために、ＧＡＬ４のＡＤとｔＡ
ＤＨ１の相補的オリゴヌクレオチドを使用して配列決定した。次に、各配列の末
端から合成オリゴヌクレオチドを構成し、両鎖で配列を伸ばしていった。こうし
て配列番号２に対応するインサートＤの１４００ｂｐを完全に配列決定した。他
方、２９００ｂｐのインサートＣ（配列番号１）については、制限地図を作製し
た後、種々のフラグメントのサブクローニングを実施して配列全体を得ることが
必要であった。

【０１６８】インサートＤはその配列全体にオープンリーディングフレームをもつ（配列番
号２）。他方、インサートＣは配列の最後にストップコドンを含む（配列番号１
）。

【０１６９】それらのペプチド配列は親水性傾向のプロフィルをもつので、親水性タンパク
質に適用される傾向のあるスクリーニング法の選択に一致する。

【０１７０】３．２配列の比較この比較により、インサートが既知機能をもつペプチドドメインをコードする
か否かを知ることができると思われる。

【０１７１】インサートの塩基及びペプチド配列をデータバンク「ＧｅｎＢａｎｋ」及び
「ＥＭＢＬ（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂ
）」に登録されている配列と比較した。インサートとこれらのバンクに登録され
ている遺伝子（又はタンパク質）との間に有意類似性は全く認められなかった。

【０１７２】更にインサートの配列を相互比較した。配列間にも類似性は全くなかった。

【０１７３】更に、インサートによりコードされるペプチドの機能に情報を提供することが
可能なペプチドモチーフが存在するか否かを調べた。多少の潜在グリコシル化、
リン酸化及びミリスチル化部位が認められたが、ペプチドの潜在機能について仮
説を立てるには至らなかった。

【０１７４】３．３種々のヒト組織における選択ペプチドに対応するｍＲＮＡの発現これらのペプチドとＰＳ−１の相互作用がｉｎｖｉｖｏで確かに存在すると
いう見解を裏付けるために、バンクから単離したペプチドのｍＲＮＡの発現がＰ
Ｓ−１のｍＲＮＡの発現と同一組織で生じることを確認した。単離配列を含む遺
伝子の特定組織における発現を調査し、種々のヒト組織におけるインサートＣ及
びＤに対応するｍＲＮＡの発現率をノーザンブロットにより分析した。

【０１７５】インサートＣ（配列番号１）から作製した放射性プローブは大脳、より詳細に
は大脳皮質、前頭葉及び側頭葉で特異的に発現される９．５ｋｂのｍＲＮＡとハ
イブリダイズすることができた（図３参照）。このｍＲＮＡの寸法は、翻訳され
たタンパク質が大きい寸法であることを示唆している。

【０１７６】実施例４：ｉｎｖｉｔｒｏ相互作用試験本試験では、相互作用が酵母コンテキストに依存していないことを確認する。
機能的トランスアクチベーターＧＡＬ４の再構成は必ずしも２種のタンパク質間
の直接相互作用に起因するのではなく、融合タンパク質と酵母の１種以上の外来
タンパク質とのタンパク質複合体の形成に起因する場合もある。従って、相互作
用は酵母に由来する中間タンパク質の存在下のみに存在すると思われ、このコン
テキスト以外では実在しないと思われる。

【０１７７】ＰＳ−１の親水性領域ＢＬ６と夫々ＰｅｐＣ及びＰｅｐＤと呼ぶ単離タンパク
質の相互作用を無細胞系で確認することにした。

【０１７８】タンパク質は大量に得られるように大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で生産した。２
種の単離ペプチドは、検出と支持体固定を可能にするｔａｇペプチドに融合した
。このために、グルタチオンに関連するタンパク質ＧＳＴをＢＬ６領域の種々の
形態に融合し、プロテインＳにより特異的に認識されるＳ−Ｔａｇペプチドを単
離ペプチドに融合することにした（試験原理については材料と方法の項参照）。

【０１７９】４．１ｃＤＮＡバンクのスクリーニング時に単離したペプチドとＳ−Ｔａｇの融合タンパク質の生産Ｓ−Ｔａｇと２種のペプチドＰｅｐＣ及びＰｅｐＤの融合タンパク質を構築す
るために、プラスミドｐＧＡＤ−Ｃ及びｐＧＡＤ−Ｄからの種々のＥｃｏＲＩ／
ＥｃｏＲＩフラグメントをベクターｐＥＴ−２９ａのＳ−Ｔａｇの配列と同一読
み枠に挿入した。

【０１８０】この段階で、ＰｅｐＤに対応するインサートを含むプラスミド（ｐＥＴ−Ｄ）
が得られた。このプラスミドの部分配列決定の結果、所望読み枠に挿入が行われ
たことが判明した。

【０１８１】このプラスミドにより、融合タンパク質ＳＴａｇ−ＰｅｐＤに対応する５２ｋ
Ｄａタンパク質を得ることができた。タンパク質ＳＴａｇ−ＰｅｐＤはＩＰＴＧ
誘導後に細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で生産される。

【０１８２】４．２ＧＳＴとＰＳ−１の親水鎖の融合タンパク質の生産ＧＳＴをＰＳ−１の親水性領域ＢＬ６の３形態の１つと融合するために、プラ
スミドｐＧＢＴ−ＢＬ６、ｐＧＢＴ−ＢＭ及びｐＧＢＴ−ＢＲに由来するＥｃｏ
ＲＩ／ＳａｌＩフラグメントを導入したベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１を使用した。

【０１８３】ＰＳ−１の突然変異鎖に対応するプラスミドｐＧＥＸ−ＢＭが得られた。配列
決定の結果、確かに配列ＧＳＴの読み枠に挿入が行われたことが判明した。

【０１８４】このプラスミドにより、ＩＰＴＧ誘導後に細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で４２ｋＤ
ａの融合タンパク質ＧＳＴ−ＢＭを生産することができた。

【０１８５】４．３融合タンパク質ＧＳＴ−ＢＭの可溶化細菌の溶解後、ペプチドＳＴａｇとタンパク質ＳＴａｇ−ＰｅｐＤ及びＧＳＴ
は部分的に可溶性フラクション側にあるが、タンパク質ＧＳＴ−ＢＭは完全に不
溶性フラクション側に維持される。

【０１８６】アフィニティークロマトグラフィーを実施するためには融合タンパク質の可溶
化が絶対に必要である。まず、アガロースビーズに共有結合したグルタチオン樹
脂にタンパク質ＧＳＴ−ＢＭを特異的に固定し、ＳＴａｇに融合したＰＳ−１の
ペプチドパートナーとＧＳＴ−ＢＭの相互作用を試験できるようにした（材料と
方法の項参照）。タンパク質が可溶化されないならば、ビーズと特異的に結合せ
ずにビーズと共に沈殿する。

【０１８７】融合タンパク質ＧＳＴ−ＢＭの可溶化後に、材料と方法の項のパラグラフ８に
記載した条件に従って試験を行う。

【０１８８】実施例５：哺乳動物細胞におけるＰＳ−１の特異的パートナーの発現５．１適当な発現ベクターの構築本試験では、酵母で検出されたタンパク質相互作用が完全タンパク質ＰＳ−１
をその膜環境に挿入した状態で哺乳動物細胞のコンテキストでも検出できるか否
かを確認する。５’末端ｍｙｃエピトープに対応する付加配列とパートナー配列
のインフレームサブクローニングを可能にするＥｃｏＲＩ制限部位（図４）をも
つ哺乳動物細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３にパートナーである配列番号１及び配
列番号２をサブクローニングした。

【０１８９】１４００ｂｐのｐＧＡＤ−ＤのＥｃｏＲＩ制限フラグメントを単離し、発現ベ
クターのＥｃｏＲＩ部位にインフレームサブクローニングした。正しい向きにｃ
ＤＮＡをもつ構築物を酵素制限分析により選択した。

【０１９０】クローンＣについては、ｐＧＡＤ−ＣのＥｃｏＲＩ（１）−ＨｉｎｄＩＩＩ（
３９１）フラグメントをまず単離した。次に、部分消化により第２のＨｉｎｄＩ
ＩＩ（３９２）−ＭｓｃＩ（２８９２）フラグメント（後者部位はベクターｐＧ
ＡＤ１０でクローンＣのコーディング領域の下流に位置する平滑末端をもつ）を
単離した。ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶ（後者部位は平滑末端をもつ）で消化した発
現ベクターにＥｃｏＲＩ（１）−ＨｉｎｄＩＩＩ（３９１）及びＨｉｎｄＩＩＩ
（３９２）−ＭｓｃＩ（２８９２）フラグメントを一緒に連結した。Ｃのコーデ
ィング配列全体をもつ適正な構築物を制限分析により同定した。

【０１９１】これらの構築物からエピトープｍｙｃをもつ融合タンパク質と配列番号１及び
２に夫々対応するペプチドを生成することができる。

【０１９２】５．２哺乳動物細胞における発現これらの構築物を標準方法によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクトした。細胞
溶解後、試料を免疫転写と抗ｍｙｃ抗体による検出により分析した。抗Ｍｙｃ抗
体９Ｅ１０（図５）を使用することにより免疫転写によりパートナーの発現を検
出することができた。ｐｅｐＣに予想された通り、１２０ｋＤａの非常に強いバ
ンドを検出することができ、強い発現が実証された（レーンＣ）。Ｄについては
、検出されたバンドの強度は必ずしも一定ではなかった。他方、ＣＨＯ細胞では
発現を検出することができた。この細胞型では、Ｄは少し安定性が高いらしく、
約８０ｋＤａで泳動するタンパク質として出現する（レーンＤ）。

【０１９３】このように、２種のタンパク質を哺乳動物細胞で発現させ、検出することがで
きた。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】プレセニリン１と二重ハイブリッド試験に使用した部分の模式図である。

【図２】特にクローンＣ（配列番号１に対応）とクローンＤ（配列番号２に対応）を含
む種々のプラスミドをもつ酵母の栄養要求性試験によるｙＢＭ−Ｃ及びｙＢＭ−
Ｄ株の単離を示す。

【図３】ヒト組織におけるペプチドＣ及びＤに対応するｍＲＮＡの発現を示す。

【図４】使用した哺乳動物発現ベクターの模式図である。

【図５】哺乳動物細胞におけるＣ及びＤ融合タンパク質の発現を示す。

【図６ａ】主要ベクターのマップ。

【図６ｂ】主要ベクターのマップ。

【図６ｃ】主要ベクターのマップ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月３１日（２０００．３．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 25/28 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ポール，マリ−フランソワーズフランス国、94600・シヨワジ−ル−ロワ、リユ・ドウ・ランシユレクシヨン・パリジエンヌ・５

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プレセニリンと相互作用することが可能なタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列。
【請求項２】プレセニリンＰＳ−１のＨ鎖の全部又は一部と相互作用する
ことが可能なポリペプチド又はタンパク質をコードすることを特徴とする請求項
１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】配列番号１の配列又はその誘導体の全部又は一部を含むこと
を特徴とする請求項１又は２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】配列番号２の配列又はその誘導体の全部又は一部を含むこと
を特徴とする請求項１又は２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】プレセニリンと相互作用することが可能であることを特徴と
するポリペプチド。
【請求項６】プレセニリンＰＳ−１のＨ鎖と相互作用することが可能であ
ることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】プレセニリンＰＳ−１のＨ鎖のアミノ酸配列３１０〜４６３
と相互作用することが可能であることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチ
ド。
【請求項８】プレセニリンＰＳ−２のＨ鎖と相互作用することが可能であ
ることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】配列番号１のペプチド配列又は該配列から誘導される配列の
全部又は一部を含むことを特徴とする請求項５から８のいずれか一項に記載のポ
リペプチド。
【請求項１０】配列番号２のペプチド配列又は該配列から誘導される配列
の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項５から８のいずれか一項に記載の
ポリペプチド。
【請求項１１】プレセニリンの活性を抑制、刺激又は調節するための医薬
を獲得するための請求項５から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用
。
【請求項１２】請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列
を含む細胞を前記配列の発現条件下で培養し、生産されたポリペプチドを回収す
ることを特徴とする請求項５から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドの製
造方法。
【請求項１３】請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列
を含む核酸で形質転換されていることを特徴とする請求項５から１０のいずれか
一項に記載のポリペプチドを生産するための宿主細胞。
【請求項１４】請求項３又は４に記載の配列のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド。
【請求項１５】請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列
又は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブ
。
【請求項１６】請求項５から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドに
対する抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１７】配列番号１もしくは配列番号２に示すペプチド配列又はそ
れらの誘導体から選択される配列に対することを特徴とする請求項１６に記載の
抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１８】プレセニリンと請求項５から１０のいずれか一項に記載の
ポリペプチドの相互作用を阻害及び／又は検出する能力をもつことを特徴とする
請求項１６又は１７に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１９】プレセニリンと請求項５から１０のいずれか一項に記載の
ポリペプチドの相互作用を調節又は阻害することが可能な化合物の検出又は単離
方法であって、ａ−ある分子が本発明のポリペプチドに対して親和性をもつ場合に前記ポリペ
プチドと前記分子の相互作用を可能にする条件下で前記分子又は場合により同定
されていない種々の分子を含む混合物を前記ポリペプチドを発現する上記のよう
な組換え細胞と接触させる段階と、ｂ−前記ポリペプチドに結合した分子を検出及び／又は単離する段階を実施す
ることを特徴とする前記方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法により獲得することが可能な、請
求項５から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドのリガンド。
【請求項２１】神経疾患治療用医薬の製造のための請求項２０に記載のリ
ガンドの使用。
【請求項２２】請求項５から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む欠損組換えウイルス。
【請求項２３】請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列
を含むベクター。
【請求項２４】プラスミドベクターであることを特徴とする請求項２３に
記載のベクター。
【請求項２５】ウイルスベクターであることを特徴とする請求項２３に記
載のベクター。
【請求項２６】複製用欠損ウイルスであることを特徴とする請求項２５に
記載のベクター。
【請求項２７】請求項２３から２６のいずれか一項に記載の１種以上のベ
クターを含む医薬組成物。
【請求項２８】請求項５から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種
のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２９】請求項１６から１８のいずれか一項に記載の少なくとも１
種の抗体又は抗体フラグメント及び／又は請求項１４に記載のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド及び／又は請求項１９に記載の方法により製造された化合物を有
効成分として含む医薬組成物。
【請求項３０】プレセニリン又はその突然変異形態の活性を調節、抑制又
は阻害することを目的とする請求項２７から２９のいずれか一項に記載の組成物
。
【請求項３１】神経変性疾患の治療を目的とする請求項２７から２９のい
ずれか一項に記載の組成物。