JP2002503952A

JP2002503952A - 多嚢胞性腎疾患遺伝子

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Publication number: JP2002503952A
Application number: JP54278497A
Authority: JP
Inventors: クリンガー，キャセリン; バーン，ティモシー; コナーズ，ティモシー; ダッコウスキ，ウィリアム; ジャーミノ，グレゴリー; キアン，フェン; ランデス，グレゴリー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2002-02-05
Also published as: AU3211997A; CA2254083A1; EP0918855A1; WO1997044457A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトＰＫＤ１をコードしている単離された核酸およびそれに由来する配列を包含する。本発明はまた、これら核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、およびＰＫＤ１タンパク質またはそのフラグメントを製造する方法を包含する。もう一つの態様において、本発明は、真の発現されたＰＫＤ１遺伝子に対してのみハイブリッド形成し且つＰＫＤ１相同染色体に対してハイブリッド形成しない単離されたオリゴヌクレオチドを包含する。更にもう一つの態様において、本発明は、単離された突然変異ＰＫＤ１遺伝子およびそれらのｃＤＮＡ同族体を包含する。更に、ＰＫＤ１遺伝子の正常型と突然変異型とを区別する単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。ＡＰＫＤまたはＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療する方法および組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】多嚢胞性腎疾患遺伝子本出願は、1995年１月31日出願の米国特許出願第08/381,520号の一部継続である。発明の分野本発明は、ヒトＰＫＤ１遺伝子に由来するＤＮＡ配列およびぞの遺伝子によってコードされる１種類または複数のタンパク質を用いるヒトの多嚢胞性腎疾患の診断および治療に関する。発明の背景成人発症多嚢胞性腎疾患とも称される常染色体優性多嚢胞性腎疾患（ＡＰＫＤ）は、約１０００人に一人が罹患する最も一般的なヒトの遺伝性疾患の一つである。米国における有病率は５００，０００を越え、毎年６，０００〜７，０００の新たな症例が検出されている（ストライカー（Striker）ら，Am.J.Nephrol.,6 :161-164,1986；イグレシアス（Iglesias）ら，Am.J.Kid.Dis.,2:630-639,1983 ）。その疾患は、腎、肝および膵などの管器官内での嚢胞形成、更には、大腸憩室炎、漿果状動脈瘤、ヘルニアおよび僧帽弁逸脱を含めた胃腸、心臓血管および筋骨格の異常を特徴とする全身性疾患であると考えられる（ガボウ（Gabow）ら，Adv.Nephrol.,18:19-32,1989；ガボウ，New Eng.J.Med.,329::332-342,1993）。しかしながら、ＡＰＫＤの最も流行する且つ明白な症状は腎嚢胞の形成であり、これは、著しく肥大した腎および腎の濃縮能の低下を引き起こす。高血圧症および内分泌異常もまた、ＡＰＫＤ患者において一般的であり、腎不全の症状の前でも見られる。ＡＰＫＤ患者の約半数において、その疾患は末期腎疾患まで進行し、したがって、ＡＰＫＤは、米国および欧州における腎臓透析および移植例の４〜８％の原因となっている（Proc.European Dialysis and Transplant Assn. ，ロビンソン（Robinson）およびホーキンス（Hawkins）監修，17:20,1981）。したがって、当該技術分野において、この疾患の発生数および重症度を減少させる診断および治療の手段が必要とされている。ＡＰＫＤは、常染色体優性遺伝に特有の伝播パターンを示す、すなわち、罹患した個体の子孫はそれぞれ、原因遺伝子を遺伝する５０％の可能性がある。連鎖実験は、原因遺伝子が、α−グロビンクラスターに近い染色体１６の短腕上に存在することを示しており、この遺伝子座はＰＫＤ１と称された（リーダーズ（Re eders）ら，Nature,317:542,1985）。他のＰＫＤ関連遺伝子、例えば、ＰＫＤ２などが存在するが、ＰＫＤ１の欠点は、罹患した家族の約８５〜９０％でＡＰＫＤを引き起こすことであると考えられる（パーフレー（Parfrey）ら，New Eng.J .Med.,323:1085-1090；ピーターズ（Peters）ら，Contrib.Nephrol.,97:128-139 ,1992）。ＰＫＤ１遺伝子は、染色体位置１６ｐ１３．３に局在していた。新規マーカーの識別および制限酵素分析と共に広範な連鎖分析を用いると、その遺伝子は、マーカーＡＴＰＬ（ＡＴＰ６Ｃ）とＣＭＭ６５（Ｄ１６Ｓ８４）との間の約７００ｋｂの間隔に更に局在していた。その部分は、転写された配列に隣接すると考えられるＣｐＧ島が多く、そしてこの間隔は少なくとも２０遺伝子を含むと推定された。ＰＫＤ１遺伝子の正確な位置は、推定上のＰＫＤ１ｃＤＮＡ配列の３’ 末端に対応するＤＮＡ配列の約５６３１ｂｐを記載している欧州ＰＫＤコンソーシアム（EPKDC），Cell,77:881,1994で報告されたように、罹患メンバーが、この部分に結合した１４ｋｂＲＮＡ転写物を破壊する転座を有するＰＫＤ家族の知見によって正確に位置をつきとめられた。部分ＰＫＤ１３’ｃＤＮＡ配列の情報にもかかわらず、いくつか重大な障害が、ＰＫＤ１遺伝子の完全な配列の確認の前に立ちはだかっている。たいていは、これら障害は、ＰＫＤ１遺伝子座の複雑な成り立ちに起因する。一つの重大な障害は、ＰＫＤ１転写物に関する配列が、ＰＫＤ１遺伝子座に近い染色体１６上で少なくとも３回重複してＰＫＤ１相同染色体を形成することである。もう一つの障害は、ＰＫＤ１ゲノムの間隔が、他のゲノム部分に存在する反復要素も含んでいることである。これらの種類の配列重複は両方とも、ゲノムＤＮＡの識別に広く用いられる「染色体歩行」技術の妨げになる。これは、これら技術が、ゲノムＤＮＡのオーバーラップフラグメントを含有するクローンを識別するのにハイブリダイゼーションに頼っているためであり、したがって、真のＰＫＤ１遺伝子に由来するクローンの代りにＰＫＤ１相同染色体に由来するクローン中に「歩行する」可能性が高い。同様に、ＰＫＤ１重複および染色体１６特異的反復体は、ＰＫＤ１タンパク質をコードする完全なｃＤＮＡ配列の確実な決定の妨げにもなる。したがって、当該技術分野において、真のＰＫＤ１遺伝子に対応するゲノムおよびｃＤＮＡ配列が必要とされている。これには、発現されたＰＫＤ１に特有であり且つ染色体１６上にも存在する重複相同配列中には存在しないこれら配列のセグメントの識別が含まれる。発明の概要本発明は、図１で示された配列を有する単離された正常ヒトＰＫＤ１遺伝子、図２で示された配列などのそれに由来する配列、図３で示されたＰＫＤ１ｃＤＮＡ配列を有する単離された核酸およびそれに由来する配列を包含する。ＰＫＤ１遺伝子は、その変更された、欠陥のあるまたは非機能性の発現が、成人発症多嚢胞性腎疾患をもたらすゲノムＤＮＡ配列である。本発明はまた、これら核酸を含むＤＮＡベクター、それらベクターで形質転換された細胞、およびＰＫＤ１タンパク質またはそのフラグメントを製造する方法を包含する。もう一つの態様において、本発明は、真の発現ＰＫＤ１遺伝子に対してのみハイブリッド形成し且つＰＫＤ１相同染色体に対してハイブリッド形成しない単離されたオリゴヌクレオチドを包含する。なおもう一つの態様において、本発明は、正常ＰＫＤ１遺伝子からの変更をヌクレオチド配列中に含み、そしてヒト個体のゲノム中におけるその１個またはそれ以上のコピーでの存在が成人発症多嚢胞性腎疾患に関係している単離された突然変異ＰＫＤ１遺伝子およびそれらのｃＤＮＡ同族体を包含する。なおもう一つの態様において、本発明は、ＰＫＤ１遺伝子の正常型と突然変異型とを区別する単離されたオリゴヌクレオチドを包含する。なおもう一つの態様において、本発明は、ヒト対象において突然変異ＰＫＤ１遺伝子を有するヒト対象を識別する方法であって、（ａ）その対象から生体材料の試料を得、そして（ｂ）突然変異遺伝子またはそのタンパク質産物の存在を検出することを含む上記方法を包含する。なおもう一つの態様において、本発明は、ＡＰＫＤまたはＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療するための方法および組成物を包含する。このような方法は、単離されたヒトＰＫＤ１遺伝子またはその遺伝子のフラグメントを、治療的有効量のＰＫＤ１タンパク質の全部または一部分の発現を引き起こす条件下で投与することを包含する。本発明はまた、図１、２および３のＰＫＤ１ＤＮＡの全部若しくは一部分、または図１、２若しくは３のＤＮＡによってコードされるＰＫＤ１タンパク質を含む、ＡＰＫＤを治療するための組成物を包含する。図面の簡単な説明図１Ａは、染色体マーカーＡＴＰＬ（ＡＴＰ６Ｃ）とＤ１６Ｓ８４との間のヒトＰＫＤ１遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。（配列番号：１）。図１Ｂは、正常ヒトＰＫＤ１遺伝子を含む５３，５２６塩基のＤＮＡ配列を示す。（配列番号：２）。図２は、正常ヒトＰＫＤ１ＤＮＡの５’領域内の８９４塩基の部分ＤＮＡ配列を示す。（配列番号：３）。図３は、正常ヒトＰＫＤ１ｃＤＮＡの完全長さ配列および対応するアミノ酸配列を示す。（配列番号：４〜５）。図４Ａは、真のＰＫＤ１遺伝子（配列番号：１９）およびＰＫＤ１相同染色体（配列番号：１８）に由来するＤＮＡの５’領域のＤＮＡ配列の比較を示す。二つの配列を並べて比較するには、２９塩基対ギャップを真の遺伝子の配列中に導入すべきである。更に、真のＰＫＤ１およびＰＫＤ１相同染色体は、この図の４１８位で異なる。図４Ｂは、真のＰＫＤ１配列とＰＫＤ１相同染色体とを区別するのに用いることができるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。星印は、重合遮断修飾を示す。（配列番号：１０）。図５は、ＰＫＤ１遺伝子座を含有する染色体１６の部分を示す。上段は、ＮｏｔＩ制限部位、更には、この部分において前に確認された遺伝マーカーを示す。下段は、この部分を包含するＰ１クローンを示す。図６は、ＰＫＤ１遺伝子および、示された適切な制限部位だけを含む隣接部分を含有する９１．８ＢＰ１クローンの制限地図を示す（Ｂ＝ＦｉａｍＨＩ，Ｃ＝ＳａｃＩ，Ｅ＝ＥｃｏＲＩ，Ｎ＝ＮｏｔＩ，Ｓ＝ＳａｌＩ，Ｘ＝ＸｈｏＩおよびＶ＝ＥｃｏＲＶ）。括弧内のＮｏｔＩ部位は、ゲノムＤＮＡにおいてメチル化されている。１．９ｋｂＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの位置は、影付き箱形で示され、縞模様箱形は、２．５ｋｂポリプリン／ポリピリミジン区域の位置を示す。矢印は、次の大部分の動原体転写物（ＮＣＴ）、ＴＳＣ−２およびＰＫＤ１遺伝子の位置および配向を示す。適切なコスミドクローンの位置は、空白の箱形で示される。配列決定用鋳型を作るのに用いられた制限フラグメントは、その部位がベクター由来であることを示す引用符と共に下部に示されている。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で用いられたプールは、下部に角括弧で示されている。図７は、前に報告された（EPKDC）部分ＰＫＤ１ｃＤＮＡ（配列番号：２０、２１、２４、２５、２８および２９）配列と、本明細書中で報告された配列（配列番号：２２、２３、２６、２７、３０および３１）との比較を示す。上の配列は、ｃＤＮＡ（EPKDC）について報告されたものであるが、下の配列は、本発明のゲノム配列である。不一致は、ｃＤＮＡ（EPKDC）配列において小文字で、そしてゲノム配列において箱形で強調され、対応するアミノ酸の変化はＸで示されている。フレームシフトから得られた変化したカルボキシ末端残基は、ゲノム配列の上に示され、そして前に予測された残基は小文字で示されている。インフレーム（in-frame）末端コドンは、ゲノム配列において下線で示されている。図８は、ＧＲＡＩＬ２によって予測されるＰＫＤ１ゲノム構造の図を示す。予測されたエクソンは、ゲノム配列に沿った箱形として示されている。報告されたｃＤＮＡは上部右側にある。２．５ｋｂ高ＧＣ領域の位置は、下方の縞模様箱形で示されている。遺伝子モデルのエクソン３および４の上の点模様箱形は、予測されたＬＲＲおよびカルボキシ隣接部分の位置を示す。公表されたｃＤＮＡの範囲は、空白（コード領域）および網状模様箱形（３’非翻訳領域）で示されている。黒塗り箱形は、予測の遺伝子モデルにおいて不存在であったエクソンの相対位置を示すが、星印は、スプライシングされていないイントロンを含有するエクソンを示す。２．５ｋｂ高ＧＣ領域の位置は、ＧＣ含量バーの下の縞模様箱形で示される。図９は、予測のＰＫＤ１タンパク質の模式的構造を示す。多数のドメインは、高システインクラスター（Ｆ）に隣接しているＮ末端に近い高ロイシン反復（ＬＲＲ）の二つのコピーを含めた配列相同性に基づいで示されている。未知の機能のドメイン（Ｐｍｅｌ−１７またはＩｇ様反復）の３つの完全なコピーおよび１２の関連コピーも示す。予測された７個（またはそれ以上）の膜スパニング（spanning）ドメインも示す。種々のドメインをコードしているエクソンも挙げられている。図１０は、ＰＫＤ１ｃＤＮＡを含むＲＴ−ＰＣＫおよびｃＤＮＡ産物を示す。EPKDC 3' ｃＤＮＡ配列は、縞模様箱形で示されている。完全長さｃＤＮＡは黒で示されている。影付き箱形は、個々のｃＤＮＡおよびＲＴ− ＰＣＲ産物を示す。網状模様箱形は、選択的にスプライシングされたエクソンおよびスプライシングされていない読み取り枠を維持しないエクソンを含有するＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。選択的にスプライシングされたエクソンおよび挿入物は、それぞれ、細い線および逆さの三角形で示されている。空白箱形は、読み取り枠の位置を示す。点模様箱形は５’非翻訳領域を示す。図１１は、pCMV-SPORTベクター中の完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡの模式的構造を示す。細い線は、個々のｃＤＮＡクローンを組立てるのに用いられた制限部位を含むＰＫＤ１ｃＤＮＡを示す。太い線は、in vitro翻訳用のＲＮＡを生じるためのＳＰ６およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０複製起点、および哺乳動物細胞での発現用のポリアデニル化シグナルを含有するpCMV-SPORTベクターを示す。図１２は、完全長さＰＫＤ１産物およびその切断された産物の図を示す。黒箱形は、シグナルペプチド（Ｓ）を示し、高ロイシン反復（ＬＲＲ）およびＩｇ様（Ｉｇ様）ドメインは、影付き箱形で示されている。１１個の予測された貫膜部分は、黒バーでも示され且つ番号を付されている。図１３は、ＧＲＡＩＬ２で予測されたエクソンによってコードされる配列と、 SwissProtおよびＰＩＲデータベース中に存在するタンパク質との間のＰＫＤ１遺伝子の相同部分を示す。（配列番号：３２〜５５）。ＰＫＤ１配列が共通配列と対合する位置に影を付けている。図１４は、ＰＫＤ１遺伝子座内のエクソントラッピング（trapping）の結果を示す。図１５は、ドメイン特異的多クローン性抗体の産生用に融合タンパク質として用いられたＰＫＤ１タンパク質の部分を示す。そのＰＫＤ１タンパク質の予測構造を上に示す。それぞれの融合タンパク質は、担体グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびＰＫＤ１ポリペプチドの指定部分から成る。それぞれの融合タンパク質のＰＫＤ１該当残基を示す。図１６は、免疫沈降に用いられた二つの構築物、すなわち、示されたようにＰＫＤ１タンパク質のＮ末端半分に該当するＳｒｆＩΔおよびＰＫＤ１タンパク質のＣ末端半分に該当するＢＲＡＳＨ７を示す。免疫沈降に用いられた抗融合タンパク質ＦＰ−ＬＲＲ、ＦＰ−４６−１ｃおよびＦＰ−４６−２多クローン性抗体のエピトープも示す。発明の詳細な説明本明細書中で引用された特許出願、特許および参考文献はいずれも、本明細書中にそのまま援用される。不一致すなわち矛盾する場合、定義を含めた本説明が優先する。定義：１．本明細書中で用いられる「ＡＰＫＤ」は、腎嚢胞の発生および最終的には腎不全を特徴とし、そして代りにまたは加えて、肝および膵を含めた他の器官における嚢胞、更には、胃腸、心臓血管および筋骨格の異常を含むことがありうる成人発症多嚢胞性腎疾患を示す。２．「ＰＫＤ１遺伝子」という用語は、染色体位置１６ｐ１３．３に地図化され且つＰＫＤ１タンパク質をコードしているメッセンジャーＲＮＡ分子を生じるゲノムＤＮＡ配列を意味する。ＰＫＤ１遺伝子は、図１および２で示された配列を包含し、これらは、イントロンおよび推定上の調節配列を含む。「真の」という用語は、本明細書中においてこの位置にあるゲノム配列、更にはそれに由来する配列を示すのに用いられ且つこれら真の配列を「ＰＫＤ１相同染色体」（下記を参照されたい）と区別するのに役立つ。３．「ＰＫＤ１相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、本明細書中において、真のＰＫＤ１遺伝子に由来し且つその配列またはその対配列が図３で示されるＰＫＤ１タンパク質をコードする図３で示された配列を包含する一本鎖または二本鎖のイントロン不含ＤＮＡ分子として定義される。４．「正常な」ＰＫＤ１遺伝子は、本明細書中において、ぞの変更された、欠陥のあるまたは非機能性の発現が成人発症多嚢胞性腎疾患をもたらすＰＫＤ１遺伝子として定義される。正常なＰＫＤ１遺伝子は、疾患に関係がなく、したがって、遺伝子の野生型種であると考えられる。正常ＰＫＤ１遺伝子の範囲には、対立遺伝子多形性とも称されるＰＫＤ１遺伝子の対立遺伝子変種、すなわち、集団において何等かの頻度で現われることがある疾患に関係がないＰＫＤ１遺伝子の代りの変種も含まれる。更には、組換え体であれ天然に存在ずるのであれ、ＰＫＤ１遺伝子産物の発現または機能に対して明白に作用しないＤＮＡ配列の変更も含まれる。５．「突然変異」ＰＫＤ１遺伝子は、本明細書中において、トランジション、トランスバージョン、欠失、挿入、または正常なＰＫＤ１遺伝子に関する他の修飾であって、疾患を引き起こすことを含めた、ＰＫＤ１遺伝子産物の発現または機能に検出可能な変化を引き起こす上記修飾によってその配列が修飾されたＰＫＤ１遺伝子として定義される。それら修飾は、１個〜数千程度までの多数のヌクレオチドに関与し、そして例えば、低下したまたは増加した発現率、または欠陥ＲＮＡ転写物またはタンパク質産物の発現などのＰＫＤ１遺伝子発現の様々な変化の一つまたはそれ以上を引き起こすことがありうる。突然変異ＰＫＤ１遺伝子は、ヒト個体のゲノム中においてその１個またはそれ以上のコピーの存在がＡＰＫＤに関係している遺伝子を包含する。６．「ＰＫＤ１相同染色体」は、ＰＫＤ１と近縁であるが、真の発現されたＰＫＤ１遺伝子産物をコードしていない配列である。染色体位置１６ｐ１３．１に地図化されているこのような相同染色体のいくつかの例は、本発明者によって同定され且つ配列決定された。７．「ＰＫＤ１保因者」は、本明細書中において、発病性突然変異ＰＫＤ１遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する個体として定義される。その疾患は、概して、常染色体優性の遺伝パターンを示すので、ＰＫＤ１保因者は、ＰＫＤの何等かの症状を発現させる可能性が高い。したがって、ＰＫＤ１保因者は「ＰＫＤ患者」になる可能性があると考えられる。８．本明細書中で論及される「コンティグ」は、ＤＮＡまたはＤＮＡ配列の連続伸長部分であり、これは、多数の重複クローンまたは配列によって示されうる。９．本明細書中で論及される「コスミド」は、細菌細胞中で複製することができ、しかも約３０〜約４５ｋｂ長さの大形ＤＮＡ挿入物を受け入れるＤＮＡプラスミドである。１０．「ＰＩクローン」という用語は、Ｐ１ファージ複製機序に基づいてベクター中にクローン化されたゲノムＤＮＡを意味する。これらベクターは、概して、約７０〜約１０５ｋｂのインサートに適合する（ピアス（Pierce）ら，Proc.N atl.Acad.Sci.,USA,89:2056-2060,1992）。１１．本明細書中で用いられる「エクソントラッピング」という用語は、ＲＮＡプロセッシングのドナーおよび受容体スプライス部位に隣接しているゲノムＤＮＡ配列を単離する方法を意味する。１２．「一本鎖立体配座多型解析」（ＳＳＣＰ）という用語は、ゲル電気泳動による引続きのミスマッチ検出を伴う二つの種のハイブリダイゼーションを含む、２本のＤＮＡ間の配列差を検出する方法を意味する。（ラヴニク（Ravnik）− グラバク（Glavac）ら，Hum.Mol.Genet.,3:801，1994）。１３．「ＨＯＴ切断」は、本明細書中において、化学切断による引続きのミスマッチ検出を伴う二つの種のハイブリダイゼーションを含む、２本のＤＮＡ間の配列差を検出する方法として定義される（コットン（Cotton）ら，Proc.Natl.Ac ad.Sci.,USA,85・4397,1988）。１４．「変性勾配ゲル電気泳動」（ＤＤＧＥ）は、種々の濃度の変性剤を含有するゲルによる電気泳動を用いる、ただ一つの塩基対変化と同程度に僅かな配列差に基づいて同一長さの二つのＤＮＡフラグメントを分離する方法を意味する（グルドバーグ（Guldberg）ら，Nuc.Acids Res.,22:880,1994）。１５．本明細書中で用いられる「配列特異的オリゴヌクレオチド」は、ＰＫＤ１遺伝子中の対立遺伝子の変化または突然変異を検出するのに用いることができる関連オリゴヌクレオチドセットを意味する。１６．本明細書中で用いられる「ＰＫＤ１特異的オリゴヌクレオチド」は、真の発現されたＰＫＤ１遺伝子中に存在する配列に対してハイブリッド形成し且つＰＫＤ１相同染色体または他の配列に対してハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドを意味する。１７．本明細書中で用いられるＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるのに役立つ反応を示す。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキ（Saiki）ら，Science,239:487,1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸特異的増幅（ＮＳＢＡ）または当該技術分野において知られている何等かの方法を用いて行うことができる。１８．本明細書中で用いられる「ＲＴ−ＰＣＲ」は、共役した逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を意味する。この増幅方法は、特定のオリゴヌクレオチド、オリゴｄＴまたはランダムプライマー混合物を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中へのＲＮＡの逆転写を開始する初期工程を用い、次に、標準的な増幅技術、例えば、ＰＣＲを用いてこのｃＤＮＡを増幅させる。１９．具体的な配列に対応するＰＫＤ１遺伝子またはＰＫＤ１ｃＤＮＡは、正常型であれ突然変異体であれ、その具体的な配列中においてぞの配列の固有の性質を変化させない変更を含むと考えられる。追加のヌクレオチドを、常套の組換えＤＮＡ操作の一部分として、図１Ｂで示されたＰＫＤ１遺伝子または図３で示されたＰＫＤ１ｃＤＮＡの５’および／または３’末端に対して加えうるということは理解されるであろう。更に、同類ＤＮＡ置換、すなわち、タンパク質コード領域の配列におけるコードされるアミノ酸配列を変化させない変化を適応することもできる。本発明は、ＰＫＤ１のヒト遺伝子を包含する。この遺伝子の突然変異は、成人発症多嚢胞性腎疾患の発症に関係している。ＰＫＤ１遺伝子の５３，５２６塩基に対応するゲノム配列の「正常」型を図１Ｂで示す。ＰＫＤ１遺伝子配列は、実施例１で記載された方策を用いて決定された。簡単にいうと、一連のコスミドおよびＰ１ＤＮＡクローンは、ＰＫＤ１遺伝子座を含むことが知られている染色体１６の７００キロベースセグメント全体にわたる重複ヒトゲノムＤＮＡ配列を含んで組立てられた。ＰＫＤ１をコードしている配列を含めたこの７００ｋｂセグメント内の転写された配列を識別するために、エクソントラッピングおよびｃＤＮＡ選択技術の両方を用いた。同時に、当該技術分野において周知である技術を用いて、ゲノムクローン中に含まれたヒトＤＮＡ配列の直接ＤＮＡシークエンス法を行った。これらには、特定のコスミドからのサブクローンまたはＰ１クローンの単離が含まれた。重なり欠失(nested deleti on)を、選択されたサブクローンから作り、そして次に、その重なり欠失は、ＡＬＦ^TM自動シークエンサー（ファーマシア（Pharmacia），ウプサラ，スウェーデン）を用いる直接ＤＮＡシークエンス法で分析した。ＰＫＤ１ｃＤＮＡの完全長さ配列を図３で示す。本発明は、真の発現されたＰＫＤ１遺伝子とＰＫＤ１相同染色体または他の繰返し配列とを区別するのに単独でまたは一緒に用いることができる、ＰＫＤ１遺伝子内またはＰＫＤ１ｃＤＮＡ内の配列に対応する単離されたオリゴヌクレオチドを包含する。これらオリゴヌクレオチドは、約１２〜約６０ヌクレオチド、好ましくは、約１８ヌクレオチド長さであってよいし、一本鎖若しくは２本鎖であってよいし、そして下記のように標識されるか若しくは修飾されていてよい。この方法で用いることができるオリゴヌクレオチドの例を図４Ｂで示す。このオリゴヌクレオチドの識別機能は、真のＰＫＤ１遺伝子に由来する配列とＰＫＤ１相同染色体に由来する３個のｃＤＮＡとの比較に基づき、この比較は、相同染色体ｃＤＮＡが、真のＰＫＤ１配列に対して２９ｂｐインサートを含有することを示した（図４Ａ）。図４Ｂで示されたオリゴヌクレオチドは、それが重合反応を支持しないようにその３’末端において修飾され、そして相同染色体配列に対して特異的にハイブリッド形成するが真のＰＫＤ１配列に対してハイブリッド形成しないように設計されている。このオリゴヌクレオチドが増幅反応中に含まれる場合、それは、ＰＫＤ１相同染色体配列の増幅を選択的に妨げる。この方法で、真のＰＫＤ１配列は選択的に増幅されるが、ＰＫＤ１相同染色体は増幅されない。したがって、これらオリゴヌクレオチドまたはそれらの機能的同等物は、ヒト患者における真のＰＫＤ１遺伝子の突然変異の存在について調べるための根拠を与える（下記の実施例５を参照されたい）。本発明は、図１、２および３で示された配列に由来するセンスおよびアンチセンス配列を含めた単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列を包含する。具体的な配列は、対立遺伝子変種を含めたＰＫＤ１の「正常な」対立遺伝子または疾患症状に関係している「突然変異」対立遺伝子であってよい。ＰＫＤ１由来配列は、プロモーター、エンハンサー、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列等を含めた異種配列と結合することもできる。更に、核酸は、修飾して、安定性、溶解性、結合親和性および特異性を変更することもできる。例えば、ＰＫＤ１由来配列は、選択的にメチル化されうる。ＤＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができるし、そして更に、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート誘導体、ホスホルアミデート誘導体およびメチルホスホネート誘導体、更には、ニールセン（Nielsen）ら，Science,2 54:1497,1991で記載のようにアミノ酸主鎖に対して塩基を共役させることによって形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含むことができる。そのＤＮＡは、α−アノマーヌクレオチドの結合によって、またはメチル若しくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミデート結合の形成によって誘導体化されうる。更に、本発明の核酸配列は、検出可能なシグナルを提供できる標識で直接的にかまたは間接的に修飾することもできる。典型的な標識には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン等が含まれる。概して、本発明による核酸操作は、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual（第２版，サムブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis），コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harb or））またはCurrent Protocols in Molecular Biology（オースベル（Ausbel）、ブレント（Brent）、キングストン（Kingston）、モア（More）、ファイドマン（Feidman）、スミス（Smith）およびストルール（Struhl）監修，グリーン・パブリッシャー・アソシエーション（Greene Publ.Assoc.），ウィリー・インターサイエンス（Wiley-Interscience），ＮＹ，ＮＹ，1992)で開示されたように、当該技術分野において周知である方法を用いる。本発明はまた、ＰＫＤ１またはＰＫＤ１関連配列を有する核酸を含むベクターを提供する。プラスミド、ファージ、ウイルスおよび真菌のベクターを含めた多数のベクターは、種々の真核性または原核性宿主における発現について記載されており、遺伝子療法にも簡単なタンパク質発現にも用いることができる。好都合にh、ベクターには、特に、ＰＫＤ１コード部分が図３で示されたｃＤＮＡまたはその誘導体若しくはフラグメントを含む場合、そのＰＫＤ１コード部分に対して機能的に結合したプロモーターが含まれうる。コードされるＰＫＤ１は、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ８またはｐＣＥＰ４（インビトロジェン（InVitrogen），サン・ディエゴ，ＣＡ）などの何等かの適当なベクターおよび何等かの適当な宿主細胞を用いることにより、本明細書中で開示された若しくは引用されたまたはそれ以外に適切な分野の業者に知られている方法を用いて発現されうる。ベクター／宿主の具体的な選択は、本発明の操作にとって厳密な要素ではない。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニング若しくは発現用の１種類若しくはそれ以上の複製系、宿主における選択用の１種類若しくはそれ以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性、および１種類若しくはそれ以上の発現カセットが含まれるであろう。挿入されたＰＫＤ１コード配列は、例えば、合成してもよく、天然源から単離してもよく、または雑種としても製造できる。転写調節要素に対するおよび／または他のアミノ酸コード配列に対するＰＫＤ１コード配列の連結は、既知の方法によって達成できる。適当な宿主細胞は、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ₂媒介ＤＮＡ取り込み、真菌感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティル（microprojectile）または他の確立された方法を含めた何等かの適当な方法によって形質転換／トランスフェクション／感染することができる。適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、並びに植物および動物の細胞、特に、哺乳動物細胞が含まれる。特に興味深いのは、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.Subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi siae）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ属（Neurospora ）およびＣＨＯ細胞、コス細胞、ヒーラ細胞、および不死化哺乳動物骨髄様およびリンパ様細胞系である。好ましい複製系には、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、λ、アデノウイルス、人工染色体等が含まれる。多数の転写開始および終結調節領域が単離され、そして様々な宿主での異種タンパク質の転写および翻訳において有効であることが示されている。これら領域、単離方法、操作法等の例は、当該技術分野において知られている。適当な発現条件下において、宿主細胞は、組換えによって製造されたＰＫＤ１源として用いることができる。本発明はまた、組換えによって製造されたＰＫＤ１タンパク質またはそれに由来するペプチドを得るための、任意の適当な方法によるＰＫＤ１コード配列の導入によってそのゲノムがトランスフェクションされたまたは形質転換された単細胞または多細胞生物の使用を包含する。ＰＫＤ１ポリペプチドをコードする核酸は、組換え現象によって受容細胞のゲノム中へ組み込ませることもできる。例えば、このような配列は、細胞中へマイクロインジェクションすることができ、そしてそれによって、ＰＫＤ１をコードする内因性遺伝子、その類似若しくは偽遺伝子またはＰＫＤ１コード遺伝子と実質的に同一の配列の部位において相同的組換えを行うことができる。他の組換えに基づく方法、例えば非相同的組換えまたは特に多能性細胞における相同的組換えによる内因性遺伝子の欠失なども用いることができる。本発明はまた、真のＰＫＤ１遺伝子によってコードされる配列を有する単離されたポリペプチド、更には、それに由来する６個またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを包含する。そのようなポリペプチドは、生検若しくは剖検によって得られたヒト組織から単離されうるし、または上記のような組換えＤＮＡ法によって異種細胞から製造されうる。デタージェント抽出、並びにモレギュラーシーブ、イオン交換および、例えば、ＰＫＤ１特異的抗体またはリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含めたクロマトグラフィー法を含めた標準的なタンパク質精製法を用いてＰＫＤ１関連ポリペプチドを単離するごとができるが、これらに制限されるわけではない。精製されるＰＫＤ１ポリペプチドが組換え系において製造される場合、その組換え発現ベクターは、追加のアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸をコードする追加の配列を含むことができ、これら余分のアミノ酸は、固定された抗体を用いるイムノアフィニティー精製のためのまたは固定されたリガンドを用いるアフィニティー精製のための「タグ」として作用する。上記の単離されたより大きいＰＫＤ１ポリペプチドから、例えば、当該技術分野において周知であるトリプシンなどのプロテアーゼおよび臭化シアンなどの化学的処理によるタンパク質分解切断を用いて、ＰＫＤ１特異的配列を含むペプチドを誘導できる。或いは、最大６０残基までの長さのペプチドは、商業的に入手可能なペプチド合成機を用いて常套手段によってミリグラム量で合成することもできる。本発明は、図１および２で示される遺伝子または図３で示されるｃＤＮＡによってコードされるＰＫＤ１ポリペプチドおよび／またはそのフラグメント若しくは一部分を特異的に認識する抗体を包含する。抗体は、多クローン性若しくは単クローン性であってよく、天然のＰＫＤ１ポリペプチドに対しでまたは上記のような合成ペプチドに対して応答して産生されうる。このような抗体は、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane），Antibodies,A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory），1 988年で開示された方法および組成物により、更には、本明細書中に引用された他の参考文献により当業者に知られている免疫学およびハイブリドーマ技術を用いて好都合に製造される。天然または合成のＰＫＤ１由来ペプチドを用いてＰＫＤ１特異的免疫応答を引き起こす場合、それらペプチドは、ＫＬＨなどの適当な担体に対して好都合に結合し且つフロイントなどの適当なアジュバント中で投与することができる。好ましくは、選択されたペプチドは、実質的に、タム（Tam ），Proc.Natl.Acad.Sci,USA 85:5409-5413,1988の方法によって、リシンコア担体に対して結合される。得られた抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ₂、ＦＡＢ’ またはＦＶなどの一価の形に修飾されうる。抗イディオタイプ抗体も、既知の方法を用いて製造されうる。一つの実施態様において、正常または突然変異のＰＫＤ１ポリペプチドは、マウスを免疫感作するのに用いられ、その後牌臓を取り出し、この脾臓細胞と骨髄腫細胞との細胞ハイブリッドを形成させ、そして当該技術分野において標準的である技法にしたがって抗体分泌細胞のクローンを得るのに用いられる。得られた単クローン性抗体は、ＰＫＤ１タンパク質またはＰＫＤ１関連ペプチドに対する特異的に結合についてスクリーニングされる。もう一つの実施態様において、抗体は、正常または突然変異のＰＫＤ１配列に対する選択的結合についてスクリーニングされる。ＰＫＤ１の正常型と突然変異型とを区別する抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＥＭＩＴ、ＣＥＤＩＡ、ＳＬＩＦＡ等を用いる診断試験（下記を参照されたい）において用いることができる。抗ＰＫＤ１抗体は、細胞内レベルのおよび組織化学的レベルの局在化実験を行うのに用いることもできる。最後に、抗体は、正常であれ突然変異体であれ、ＰＫＤ１ポリペプチドの機能を遮断するために、またはその機能の阻害剤を（例えば、抗イディオタイプ抗体アプローチを用いて）探索し且つ調べる合理的な薬物設計実験を行うのに用いることができる。ＰＫＤ１中の疾患の原因となる突然変異の確認本発明の実施の一つの態様において、単離され且つ配列決定されたＰＫＤ１遺伝子は、ＰＫＤ１遺伝子の従来知られていない変型または突然変異型を識別するのに用いられる。最初に、遺伝性多嚢胞性腎疾患のヒト患者を、臨床検査、家系分析および連鎖分析により、標準的な診断基準および面談法を用いて確認し、そしてＤＮＡまたはＲＮＡ試料をそれら患者から得る（下記を参照されたい）。次に、様々な技法を用いて、新規突然変異配列を正確につきとめる。最初に、ＰＫＤ１ＤＮＡに、当該技術分野において標準的である方法を用いる直接ＤＮＡシークエンス法を施すことができる。更に、ＰＣＲに基づく検定を用いて、オリゴヌクレオチド対を用いて増幅反応を開始し、そして増幅生成物の寸法を対照生成物の寸法と比較することによって、欠失を検出することができる。他の有用な技法には、一本鎖立体配座多型解析（ＳＳＣＰ）、ＨＯＴ切断、変性勾配ゲル電気泳動および二次元ゲル電気泳動が含まれる。ＰＫＤ１突然変異の検出において混乱させ且つ複雑にする因子は、転写される遺伝子に近い染色体１６上のいくつかの部位にＰＫＤ１相同染色体が存在することである。ＰＫＤ１中の突然変異の分析において、真のＰＫＤ１遺伝子に由来する配列と相同染色体のいずれかに由来する配列とを区別することは極めて重要である。したがって、本発明の重要な特徴は、真のＰＫＤ１と相同染色体とを区別するオリゴヌクレオチドプライマーの提供である。真のＰＫＤ１遺伝子および相同染色体の配列の詳細な比較は、真のＰＫＤ１遺伝子またはｃＤＮＡと相同染色体とを区別するプライマーの設計を可能にする。例えば、図４Ｂに開示されたような、この基準を確立するプライマーを、下記の分析方法のいずれかと一緒に用いることができる。ＳＳＣＰのためには、ＰＫＤ１遺伝子の非重複セグメントに沿った約２５０〜３００ｂｐ長さのＤＮＡ生成物を増幅するプライマーを設計する。それぞれの増幅生成物には、一つのゲル系および二つの泳動条件を用いる。それぞれの増幅生成物を、１０％グリセロールを含有する１０％ポリアクリルアミドゲルに対して加える。それぞれのアンプリマー（amplimer）の別々のアリコートについて、室温において８Ｗで１６時間および４℃において３０Ｗで５．４時間の電気泳動を施す。これら条件は、従来、ＣＦＴＲ遺伝子中の既知の突然変異の９８％を決定することが知られていた（ラヴニク−グラバクら，Hum.Mol.Genet.,3:801,1994 ）。「ＨＯＴ」切断のためには、放射性標識されたＰＫＤ１特異的プライマーを用いて増幅反応が行われる。次に、それぞれの放射性標識増幅生成物を、同一のプライマーおよびＡＰＫＤ罹患または非罹患患者からのＤＮＡを用いて製造された１０倍〜１００倍モル過剰の未標識増幅生成物と混合する。次に、ヘテロ二本鎖形成、化学切断およびゲル分析を文献記載のように行う（コットンら，Proc.Nat l.Acad.Sci.,USA,85:4397,1988）。ホモ二本鎖より小さいゲル上のバンドは、シチジンまたはチミジンに関する塩基対ミスマッチでのヘテロ二本鎖の化学切断に起因する。この手順によっていったん突然変異が確認されたら、その１種類または複数のミスマッチの正確な位置を、直接ＤＮＡシークエンス法によって決定する。突然変異は、「広域」ＤＤＧＥ（グルドバーグら，Nuc.Acids Res.,22:880,19 94）によっても確認される。ＧＣ固定ＰＣＲプライマーおよび極めて広範な変性勾配の使用は、突然変異配列の効果的な検出を可能にする。この方法は、二次元系での未変性サイズ分別と組合わせることもできる。自動二次元電気泳動を可能にする装置が用いられ、そして第二次元の泳動は突然変異の分離度をかなり増加させる。突然変異の存在を上の技法のいずれかによって検出した後、突然変異を含む具体的な核酸変化を、直接ＤＮＡ配列分析によって確認する。この方法によって、従来未確認のＰＫＤ１突然変異を決定することができる。従来未確認のＰＫＤ１突然変異がいったん決定されたら、当該技術分野において標準的である様々な方法を用いて、他の罹患した個体においで特定の突然変異を検出する方法を考案することができる。例えば、特定の突然変異の検出および区別を可能にするオリゴヌクレオチドプローブを製造することができる。このようなプローブは、突然変異配列自体を含んでいてもよいし、または代りに、突然変異配列に隣接していてもよいということは理解されるであろう。更に、オリゴヌクレオチド配列は、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド免疫原を設計するのに用いることができる。次に、これらペプチドを用いて、正常および突然変異のＰＫＤ１ポリペプチドを区別する抗体を作成する。ＰＫＤ１突然変異の診断試験突然変異ＰＫＤ１遺伝子は、上記の方法によって識別されようと他の手段によろうと、診断試験の計画および操作において有用である。下記および実施例５で記載されたものを含めた、突然変異ＰＫＤ１遺伝子の存在を検出する試験は、次の方法で適用できる。（１）腎移植片のドナー適合性を確認すること。概して、移植片受容者の近縁者を用いることが望ましい。受容者が家族性ＡＰＫＤに罹患した患者である場合、ドナー縁者が、家族性突然変異ＰＫＤ１遺伝子を持っていないことを確かめることが重要である。（２）ＡＰＫＤに罹患した家族の危険個体についてスクリーニングすること。ＡＰＫＤを発症する可能性が高い前症状の個体を識別して、それらを監視し且つ予防療法を利用することを可能にすることができる。（３）抗高血圧治療のために高血圧患者を標的にすること。高血圧症もＡＰＫＤに関連している。突然変異ＰＫＤ１遺伝子の存在について高血圧患者をスクリーニングすることは、後に腎損傷が起こることを予め妨げる血圧調節を行うために患者を識別するのに用いることができる。（４）出生前スクリーニングを行うこと。大部分のＰＫＤ１関連ＰＫＤは、成人発症型である。しかしながら、ＰＫＤ１遺伝子中に突然変異を有する家族の小集団においては、未成年発症は一般的であり且つより重症状態の疾患を示す。これら家族において、出生前スクリーニングは、遺伝学カウンセリンク泪的に有用でありうる。概して、本発明による診断試験は、対象から生体試料を得、そしてその試料を、本発明のＰＫＤ１遺伝子の全部または一部分を用いて、ＰＫＤ１遺伝子の１種類若しくはそれ以上の突然変異型またはそのタンパク質産物の存在についてスクリーニングすることを含む。その対象は、子宮内の胎児であっでよいしまたはいずれの年齢のヒト患者であってもよい。一つの実施態様において、ゲノムＤＮＡの試料をヒト患者から得、そして１種類またはそれ以上の疾患関連ＰＫＤ１突然変異の存在について検定する。このＤＮＡは、いずれの細胞源または体液からも得ることができる。臨床診療において利用可能な細胞源の非制限例には、血球、頬細胞、頸腟細胞、尿からの上皮細胞、胎児細胞、または生検によって得られる組織中に存在する任意の細胞が含まれる。体液には、血液、尿、脳脊髄液、羊膜液、および感染または炎症の部位での組織滲出液が含まれる。ＤＮＡは、当該技術分野において標準的である多数の方法のいずれかを用いてその細胞源または体液から抽出される。ＤＮＡを抽出するのに用いられる具体的な方法はその源の性状に依るということは理解されるであろう。本発明において用いるために抽出されるＤＮＡの最小量は、約２５ｐｇである（３ｘ１０⁹塩基対のゲノム寸法の約５細胞相当に該当する）。この実施態様において、突然変異の存在を検出するのに用いられる検定は、制限酵素消化、直接ＤＮＡシークエンス法、配列特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、ＰＣＲによる増幅、一本鎖立体配座多型解析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）、二次元ゲル電気泳動、in situハイブリダイゼーションおよびそれらの組合わせを含むことができる。好ましい実施態様において、ＲＮＡは、ＰＫＤ１発現性細胞または組織、好ましくは、リンパ球から、アプライド・バイシステムズ・インコーポレーテッド（ Applied Biosystems,Inc.）（フォスター・シティー，ＣＡ）によって販売されているような自動システムを含めた標準的な技法を用いて単離される。次に、そのＲＮＡに、逆転写およびＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を組み合わせて施す。次に、得られたＤＮＡを、上で概説された方法のいずれかによって突然変異配列の存在についてスクリーニングすることができる（下記の実施例５を参照されたい）。上で論じられたように、ＰＫＤ１突然変異について核酸に基づくスクリーニング方法はいずれも、染色体位置１６ｐ１３．３に存在する真のＰＫＤ１遺伝子と、１６ｐ１３．１および他の位置に存在するＰＫＤ１相同染色体とを区別することができるにちがいない。オリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：１０および１３〜１５）は、真の配列と相同配列とを区別するプライマーの例であり、そしてこれらオリゴヌクレオチドまたはそれらの同等物は、このような診断試験のいずれにおいても重要な部分を構成する。更に、図１ＢのＰＫＤ１配列のヌクレオチド４３，８２３〜５２，８８７までは、真のＰＫＤ１遺伝子に特有であり且つ相同染色体中に存在しない配列である。したがって、この部分に由来するオリゴヌクレオチドは、真のＰＫＤ１遺伝子が検出されるが相同染色体が検出されないことを保証するスクリーニング方法において用いることができる。もう一つの実施態様において、突然変異ＰＫＤ１遺伝子の存在を検出するのに用いられる検定は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法等のような当該技術分野において知られている多数の方法の一つを用いる免疫学的検定によって突然変異遺伝子産物について調べることを含む。この実施態様において、生体試料は、好ましくは、腎などのＰＫＤ１発現性組織に由来する。ＰＫＤ１ポリペプチドは、その試料から抽出されうる。或いは、その試料を、例えば、凍結切断に続いて免疫蛍光染色を行うような、特異的に結合した抗体の現場での検出または可視化を可能にするように処理することができる。抗体は、単クローン性若しくは多クローン性であってよいし、自然のままのＰＫＤ１タンパク質、またはＰＫＤ１に由来する天然の若しくは合成のペプチドに対して生じさせることができる。好ましい実施態様において、それら抗体は、「正常な」ＰＫＤ１配列と「突然変異」ＰＫＤ１配列とを区別するので、それらを日常的な検定において用いることができる。用いられる具体的な方法または方法組合わせが、具体的な用途に依るということは理解されるであろう。例えば、高効率スクリーニング法は、好ましくは、容易に入手可能な組織からのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出に続いて、特定のＰＫＤ１配列の増幅およびその増幅生成物と特異的オリゴヌクレオチドの一団とのハイブリダイゼーションを含む。治療的用途本発明は、本明細書中で開示された方法および組成物を用いるＰＫＤの治療を包含する。上で開示された正常ＰＫＤ１遺伝子の全部または一部分は、例えば、リポソーム、ウイルスベクター、組換えウイルス等を含めた様々な既知の方法を用いて腎細胞または他の冒された細胞に対して供給されうる。遺伝子は、組織特異的調節要素を更に含むＤＮＡベクター中に包含されて、組織特異的方法においてＰＫＤ１発現を可能にすることができる。このアプローチは、特定の突然変異ＰＫＤ１対立遺伝子が、単コピーで存在する場合、ＰＫＤ１タンパク質のレベルを正常な機能に必要な限界レベル未満に減少させるだけならば実行可能であり、この場合、ＰＫＤ１遺伝子の追加の正常なコピーを補足することによって遺伝子用量を増加させることは、機能的欠損を補正するはずである。もう一つの実施態様において、例えば図２で示されたものと正常ＰＫＤ１遺伝子の少なくとも一部分との単離された核酸の混合物を、ＡＰＫＤを治療するために腎または他の冒された細胞に対して供給してもよい。或いは、突然変異ＰＫＤ１遺伝子の発現を、例えば、アンチセンス配列を用いて制限することは望ましいことがありうる。この実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、腎または他の細胞に対して供給されうる。治療的使用のために、ＰＫＤ１関連ＤＮＡは、任意の好都合な方法で、例えば、リン酸緩衝溶液、食塩水、脱イオン水または類似のものなどの生理学的に許容しうる担体中で非経口投与することができる。典型的には、それら組成物は、血液または滑液などの保有生理液に対して加えられる。投与される量は、常套実験を用いて経験的に決定されるであろう。安定剤、殺細菌剤等のような他の添加剤は、慣用的な量で含まれうる。本発明はまた、タンパク質置換によるＡＰＫＤの治療を包含する。一つの実施態様において、本発明のＰＫＤ１ポリペプチドをコードしているＤＮＡで形質転換されたまたはトランスフェクションされた宿主細胞によって生産されたタンパク質を、ＰＫＤ１遺伝子の変更された、欠陥のあるまたは非機能性の発現に苦しむ個体の細胞中に導入する。このアプローチは、機能性ＰＫＤ１タンパク質を加えることによって、ＰＫＤ１タンパク質の不存在または欠陥ＰＫＤ１タンパク質の存在を増加させる。増加において用いられるＰＫＤ１タンパク質は、細胞内フラグメントまたは画分を含んでいてよいしまたは部分的に若しくは実質的に精製されていてよい。いずれにせよ、ＰＫＤ１タンパク質は、慣用的な担体、賦形剤、安定剤等を更に含むことができる、例えば、リポソームなどの適当なビヒクル中で製剤化される。本発明の治療用組成物は、それら自体で有効量を構成する必要がないということは理解されるであろうが、これは、このような有効量が、多数のこのような治療用組成物を投与することによって達せられうるからである。次の実施例は、本発明を、その範囲を制限することなく更に詳しく説明するためのものである。実施例１：ヒトＰＫＤ１遺伝子のクローニングおよび配列決定Ａ．方法：順序付けられた配列決定アプローチを用いて、ｃＤＥＢ11およびｃＧＧG10.2 コスミドからの制限フラグメントを、pBLUESCRIPT（ストラタジーン（Stratagen e），ラホヤ，ＣＡ）またはｐＧＥＭ（プロメガ（Promega），マディソン，ＷＩ）中にサブクローン化した。プラスミドは、臭化エチジウムの存在下のＣｓＣｌ密度遠心分離によって精製された。重なり欠失(nested deletion)は、ＥｘｏIII （ヘニコフ（Henikoff）,S.，Methods Enzymol.155:156-165,1987）および、Era se-A-Baseキット（プロメガ，マディソン，ＷＩ）によって与えられた追加の酵素試薬を用いて、それぞれのプラスミドから作られた。得られた重なりクローン (nested clone)は、適当な制限酵素消化後に電気泳動によって分析され、そして配列決定用の重なった鋳型セット(nested set of templates)中に順に配置された。それぞれ約２５０ｂｐが隣接クローンと異なる一連の最小タイル（minimumt iling）プラスミドを識別し、そして配列決定用に用いた。プラスミドＤＮＡは、二つの方法の内の一つで配列決定用に製造された。最初に、目的のクローン全部を、スーパーブイヨン（Super Broth）（タートフ（Tar tof）ら，BRL Focus 9:12,1987）２ｍＬ中において３７℃で２０時間培養した。１２〜２４セットを、製造者（イージー・プレプ（Easy-Prep），ファーマシア（Pharmacia），ピスカタウェイ，ＮＪ）によって記載の通り、修飾アルカリＳＤＳ法に続いてイオン交換クロマトグラフィーを用いて同時に処理した。プラスミドＤＮＡ収量は２．５〜２５μｇであった。不十分に成長したクローン、またはそれらのプラスミドが許容できない品質の配列を生じたものを、ルリアブイヨン（Luria's Broth）１００ｍＬ中で再度培養し、そしてキアジェン（Quiagen）カラム（キアジェン，サン・ディエゴ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列決定反応は、オート・リード・シークエンシング・キット（Au to-Read Sequencing Kit）（ファーマシア，ピスカタウェイ，ＮＪ）およびフルオレセイン標識ベクタープライマー（ユニバーサルＭ１３、リバースＭ１３、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６）を用いて欠失クローンについて行われた。反応生成物は、６％変性アクリルアミドゲル上でＡＬＦ^TMＤＮＡシークエンサー（ファーマシア，ピスカタウェイ，ＮＪ）を用いて分離された。第二鎖配列決定は、重なり欠失の対向セットかまたはプライマーウォーキングを用いて行われた。プライマーウォーキングには、２５０ｂｐごとに食い違った特注の１７マーを、商品供給者（プロトジーン（Protogene），パロ・アルト，ＣＡ）から購入した。キアジェンまたはＣｓＣｌ密度勾配によって製造された鋳型ＤＮＡは、未標識１７マーを用いて、製造者（ファーマシア，ピスカタウェイ，ＮＪ）によって記載の通り、配列決定反応中に蛍光体−ｄＡＴＰ標識混合物を包含させることによって配列決定された。いずれの場合も、２．５ｋｂ高ＧＣ領域を除いて、一本鎖ＤＮＡは、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ストラタジーン）を製造者によって記載の通り用いて欠失クローンから解放（レスキュー）された。２．５ｋｂ高ＧＣ領域からの一本鎖鋳型は、フルオレセイン標識万能プライマーおよびシークイサーム・ロング・リード（Sequitherm Long Read）サイクルシークエンスキット（エピセンター・テクノロジーズ（Epicentre Technologies），マディソン，ＷＩ）（ツィンマーマン（Zimmerman）ら，Biotechniques 17:30 3-307,1994）を用いて配列決定された。処理された配列決定データは全て、クアドラ７００マッキントッシュ（Quadra 700 Macintosh）計算機に伝達され、そしてSEQUENCHER（ジーン・コーズ（Gene Codes），アン・アーバー，ＭＩ）配列決定アセンブリープログラムを用いて解析された。クロマトグラムを調べることでは解析されない相違については、鋳型を再度配列決定するかまたは、不明確なところに近いプライマーを設計し且つ配列差の解析に用いた。サイクルシークエンス法は、シークイサーム（Sequitherm）ザイクルシークエンスキットを製造者（エピセンター・テクノロジーズ，マディソン，ＷＩ）によって記載の通り用いて行われた。反応生成物は、変性アクリルアミドゲル上で分離された後、オートラジオグラフィーによって検出された。Ｂ．配列決定計画：ＰＫＤ１遺伝子座を含有する染色体１６の７００ｋｂ部分を図５（上段）で示す。この部分をカバーするコンティグは、オーバーラップするＰ１クローン（中段で示された）から組立てられた。そのコンティグは、その範囲（インターバル）の両端からの一方向染色体歩行（ＡＴＰＬおよびＤ１６Ｓ８４）およびいくつかの内部遺伝子座からの二方向歩行（Ｄ１６Ｓ１３９およびＫＧ８）によって組立てられた。クローンの一つ９１．８Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号980.56）はＰＫＤ１の長さ全体にわたり、そしてコスミドｃＤＥＢ11（ＡＴＣＣ受託番号98057）、ｃＧＧＧ10.2（ＡＴＣＣ受託番号98058）、並びにコスミド２Ｈ２および３２５Ａ１１の実質的な部分を含む（ストーリングス（Stallings）,R.L．ら，Genomic s 13:1031,1992）。Ｐ１クローン９１．８Ｂ（図６に示す）は、第二ゲノム鋳型として用いられて、公表されたｃＤＮＡ配列（EPKDC，Cell,1994，上記）とコスミド由来ゲノム配列との相違を確認した。予備実験は、ｃＧＧＧ10.2コスミド中の多数の反復要素の存在を示した。したがって、ランダムショットガンサブクローニングではなく、重なり欠失に基づく順序付けられたアプローチを用いて、ＰＫＤ１遺伝子を配列決定した。ｃＧＧＧ 10.2およびｃＤＥＢ11両方のインサートに由来する制限フラグメントは、重なり欠失の発生に対する予備段階として、高コピー数プラスミド中にサブクローン化された。一方向欠失を作成し、そしてＡＬＦ^TM自動配列決定システム（ファーマシア，ウプサラ，スウェーデン）を用いて配列決定した。Ｃ．ＰＫＤ１遺伝子座の一次構造：ＰＫＤ１遺伝子を包含する遺伝子座の一次配列は、５３，５７７ｂｐ長さである。この遺伝子座は高ＧＣ（６２．４％）であり、０．４８５のＣｐＧ／ＧｐＣジヌクレオチド比を有する。この遺伝子座内のＰＫＤ１遺伝子の一次配列は、５３，５２６ｂｐ長さである。本配列の転写要素およびＣｐＧ島について、GRAIL2 （ユーバーバッハー（Uberbacher）,E.C．ら，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:112 61,1991）およびXGrailクライアントサーバー（client server）（シャー（Shah ）ら，User's Guide to GRAIL and GENQUEST，クライアント・サーバーシステムズ，人名録pub/xgrailまたはpub/xgenquestから匿名ftp to arthur.epm.omi.gov （128.219.9.76）によってファイルマニュアルgrail-genquest,1994として入手可能）を用いて分析した。１０個のＣｐＧ島が識別された（図８）。GRAILプログラムによってコード鎖上に４８個のエクソンが予想された。４８個のエクソンの内３９個の品質は「優れている」であり、６個は「良好」と考えられ、そして３個は「限界」と考えられた。これらデータを、GRAIL2の遺伝子モデル特徴を用いて分析した。最終遺伝子モデルは４６個のエクソンを含んでいた。本ゲノム配列と前に報告された部分ｃＤＮＡ配列（EPKDC，Cell,1994，上記）との比較は、いくつかの違いを示した（図７）。最も有意の違いは、報告された配列の４５６６位に２個の追加のシトシン残基が存在することである。これら２個のシトシン残基の存在は、予想されたタンパク質コード配列中でフレームシフトを引き起こして、新規１２アミノ酸カルボキシ末端での９２個のカルボキシ末端アミノ酸の置換をもたらす。新規カルボキシ末端の１２個のアミノ酸の内７個は、帯電しているかまたは極性がある。追加の配列差は、公表されたEPKDC配列の３６３９〜３６４０位および３７０８〜３７０９位に位置している。ＧＣジヌクレオチド対は、本配列中のこれらの位置にそれぞれ存在するが、ＣＧ対は報告された配列中で見出される。それぞれの場合において、ヒスチジンおよびバリン残基は、それぞれ、前に予想されたグルタミンおよびロイシン残基を置換すると考えられる。Ｄ．タンパク質コード領域の識別：「優れている」という評点のGRAIL2プログラムによって予想されたエクソンは、BLASTPプログラム（アルトシュール（Altschul）ら，J.Mol.Biol.215:403-410 ,1990）を用いてSwissProtおよびＰＩＲデータベース（ベイロッホ（Bairoch）およびベックマン（Boeckmann），Nuc.Acids Res.20:2019-2022,1992）を探索するのに用いられた。遺伝子モデルのエクソン３および４は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する多数の高ロイシン反復（ＬＲＲ）含有タンパク質に対して相同のペプチドをコードすると予測された（図１３）。ＬＲＲ自体に加えて、ＬＲＲに対するアミノ−およびカルボキシ隣接配列も、高ロイシン糖タンパク質（ＬＲＧ）系列のタンパク質中も単独または一緒に保存されうる。エクソン３は、フォンビルブラント因子受容体を含むＧＰ１ｂ．IX複合体のメンバーである高ロイシンα２糖タンパク質からのＬＲＲに対して、更には、ショウジョウバエ（Drosophila）タンパク質カオプチン（chaoptin）、トル（toll）およびスリット（slit）に対して相同の残基をコードする。後者は、それぞれ、接着性、背腹極性および形態形成に関与している。 GRAIL2によってエクソン４でコードされていると予想された配列は、カオプチンを除く上のタンパク質全部のＬＲＲに対してカルボキシ末端の保存部分に対して相同性を有することが見出されたが、カオプチンはこの保存部分を欠いている。相同性は、エクソン４でコードされる配列と、神経成長因子の受容体をコードするｔｒｋ癌原遺伝子とのあいだでも見られた。予想されたＰＫＤ１ペプチドの更に別の試験は、ｔｒｋチロシンキナーゼドメインの保存部分どのやや弱い相同性を有する追加の部分を示した。遺伝子モデル中のより近位のエクソンには、ＬＲＲ含有タンパク質サブセット中で見られるよをな、保存アミノ隣接部分に対して相同のペプチドをコードすると考えられるものはなかった。エクソントラッピング、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析は、GRAIL2 で予想されたエクソン３および４が、発現された配列中に存在することを示した。ＰＫＤ１遺伝子座からのゲノムＰ１およびコスミドクローンを用いる最初のエクソントラッピング実験の際に、一つのエクソントラップが、これらエクソンを両方とも含むことが確認された。別々の実験において、胎児腎および成人脳からのＲＮＡを鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲによって、転写された配列中のＬＲＲーカルボキシ隣接モチーフの存在が確認された。ノーザンブロットで、このモチーフを含有するＲＴ−ＰＣＲフラグメントは、１４ｋｂＰＫＤ１転写物並びに２１ｋｂ、１７ｋｂおよび８．５ｋｂのいくつかの他の転写物を検出した。相同部分は、GRAIL2で予想されたペプチドとヒトｇｐ100／Ｐｍｅｌ17遺伝子産物との間でも、更には、ウシＲＰＥ１とでも見られた。Ｐｍｅｌ−17およびｇｐ100遺伝子産物中にも存在する３４アミノ酸セグメントの３コピーが、免疫グロブリン反復モチーフの大きな範囲内で推論された（クオン（Kwon）ら，Proc.N atl.Acad.Sci.,USA 88:9228-9232,1991；アデマ（Adema）ら，J.Biol.Chem.269: 20126-33,1994）。ＲＰＥ１遺伝子産物は、gp100に対して有意の相同性を有するので、ウシ相同染色体でありうる（キム（Kim）およびウィストウ（Wistow），E xp.Eye Res.55:657-662,1992）。３’ｃＤＮＡの上流の、GRAIL2で予想されたエクソン９、２２および２８は、ＥＳＴ T03080（８５％，２５５ｂｐ）、ＥＳＴ T04943（９８％，１８９ｂｐ）およびＥＳＴ T05931（９４％，２３３ｂｐ）に対して強い相同性を示した。更に、GRAILで予想されたイントロン１のヌクレオチド１０３７８〜１０６２５は、ＡｐｏＣII遺伝子の一部分（８１％，２６３ｂｐ）に対して強い相同性を示した。保存カルボキシ隣接部分を有する多数の貫膜ドメインおよび高ロイシン反復モチーフが同定されたことは、可能なタンパク質機能についての興味深い考察を喚起する。ＬＲＲモチーフは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与していることが判ったが、保存カルボキシ隣接部分は、細胞外マトリックスと相互作用するタンパク質に関係している。これらデータは、ＰＫＤ１遺伝子産物が、細胞マトリックス中でまたは細胞−細胞相互作用で機能する膜糖タンパク質でありうるということを示唆する。あまり一般的ではないが、ＬＲＲモチーフは、シグナル伝達に関与する受容体中で確認されている（マクファーランド（McFarland）ら，S cience 245:494-499,1989）。したがって、もう一つの仮説は、遺伝子産物が、１種類または複数の可溶性因子の受容体であるということである。どちらの場合も、ＰＫＤ１は、細胞外環境との相互作用を媒介するように機能すると考えられる。そうであるならば、遺伝子産物のリガンドも、下流の細胞内エフェクターも、染色体１６関連型でない疾患の明らかな候補である。Ｅ．反復配列：ＰＫＤ１遺伝子座は、ジュルカ（Jurka）ら，J.Mol.Evol.35:286-291,1992の反復データベースに対するＦＡＳＴＡ比較によって、既知のクラスの反復ＤＮＡについて探求された。この探索は、２３個のＡｌｕ反復を識別したが、他の反復要素は識別されなかった。Ａｌｕ反復は、４個またはそれ以上のＡｌｕが反復する３個のクラスター、２個のＡｌｕが反復する３個のクラスター、および単一Ａｌｕ反復２個で構成されている（図８）。ＰＫＤ１配列の範囲（インターバル）には、２個のジヌクレオチド反復（＞（ＴＧ）８）および１個のテトラヌクレオチド反復（（ＴＴＴＡ）６）が含まれていた。ＴＧジヌクレオチド反復は、２０９〜２２４位および５２，６９８〜５２，７１５位に存在する。テトラヌクレオチド反復は、７７９６〜７８１９位に位置している。トリヌクレオチド反復＞５は識別されなかった。最も３’のＴＧ８反復だけが、多形性であることが知られている。より普通の反復要素に加えて、ＰＫＤ１遺伝子は、既存のデータベース中に現われないかまたは、この遺伝子座で見られる極端な形で現われないいくつかの種類の反復配列を含有する。最も顕著な反復は、４ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフラグメント中の２．５ｋｂセグメントである。有意に短い高Ｃ−Ｔ部分も、隣接する１．８ｋｂＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメント中に見出される。これらの部分は、高ＧＣ含量（６５％）、それぞれの鎖に関するプリン非対称および反復の長さのために、確実に配列決定するのが極めて難しいことが判明した。この部分のコード鎖は、９６％Ｃ−Ｔという極端なピリミジン偏向を有するので、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはシークエナーゼ(Sequenase)を用いて配列決定することができないと考えられる。これは、鋳型種類（プラスミド、一本鎖ファージまたは鎖分離一本鎖ＤＮＡ）とは無関係に真実であった。どちらの場合も、Ｇ− Ａの多い非コード鎖は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびシークエナーゼ両方で首尾よく配列決定されたが、分析可能長さ（ランレングス）は、配列決定された他のどの部分と比較しても顕著に短かかった。非コード鎖での障害は、一本鎖鋳型を用いる慣用的なサイクルシークエンス法によって解決された。このセグメント中の鎖の極端なプリン非対称は、適当な条件（ｐＨ、二価陽イオン、超ラセン）下において局部的な三本鎖立体配置を促進することがあるので、このセグメントを配列決定する場合の難しさの主な原因でありうる。他の特殊な反復は、７．６ｋｂＸｈｏＩフラグメント中に位置した。この反復は、４５９ｂｐ長さであり且つ完全な２７ｂｐ反復の１７個のタンデムコピーから成る。実施例２：エクソントラッピングおよびｃＤＮＡ選択技術によって得られたＰＫＤ１ｃＤＮＡ配列ＰＫＤ１遺伝子を包含する染色体１６の７００ｋｂの範囲には、ＣｐＧ島が特に多いと考えられ、そして関連して、発現される配列も多い可能性が高い。発現されるＰＫＤ１配列を精製し且つ配列決定するために、エクソン解放（レスキュー）ベクターｐＳＰＬ３を用いて、スプライスアクセプターおよびスプライスドナー要素両方を含有するコスミドから配列を回収したが、この方法を「エクソントラッピング」と称する。エクソントラッピングは、ゲノムＤＮＡから発現された配列を単離する極めて有効な方法である。その手順は、ｐＳＰＬ３プラスミドを用いるが、これは、ＨＩＶ−ｔａｔ遺伝子の一部分によっで隔てられたウサギ β−グロビンコード配列、またはクリプティック（干渉性）スプライス部位を欠いたＳＰＬ３の改良された誘導体を含有している。クローン化ＰＫＤ１ゲノムＤＮＡのフラグメントは、ｔａｔ遺伝子のイントロン中にクローン化され、そして得られたサブクローンは、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションされた。ベクター中のＳＶ４０配列は、トランスフェクションされたベクターの緩和なエピソーム複製およびクローン化ゲノムＤＮＡの転写の双方を可能にする。グロビン／ｔａｔ転写物中にスプライシングされたサブクローン化ゲノムＤＮＡ中のエクソンは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｔａｔスプライスドナーおよびアクセプター配列を含有するプライマーを用いて回収された。エクソントラッピングの主な利点は、クローン化ＤＮＡの発現が、ウイルスプロモーターによって支配されることであり、したがって、遺伝子産物の発生上のまたは組織特異的な発現を考慮する必要がないことである。コスミドまたはＰ１ＤＮＡの形としてのＰＫＤ１含有ゲノムクローンは、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで二重消化されるかまたはＳａｕ３Ａで部分消化され、そしてＢａｍＨＩで消化され且つ脱リン酸化されたｐＳＰＬ３（GIBCO BRL，ベテスダ，ＭＤ）またはその誘導体中にショットガンクローン化された。プラスミドミニプレプを、ＣＯＳ−７細胞中にエレクトロポレーションで導入し、そしてトラッピンされたエクソンを、標準法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲに続いてサブクローン化によって回収した。ＰＫＤ１遺伝子座からのトラッピングされたエクソンを図１４（下部）で示す。トラッピングされたエクソンに、上記のように自動ＤＮＡシークエンス法を施して、それらをゲノムＰＫＤ１ＤＮＡとの比較して並べた。実施例３：完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡの構築ＰＫＤ１の場合、ＰＫＤ１遺伝子座の５’末端に特異的であるｃＤＮＡの度別は、相同配列の多数の転写コピーも１６ｐ１３．１のところに存在するので、特に難しい（EPKDC，Cell,1994上記）。相同染色体に由来するゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ両方の種々の部分を配列決定し、そして本ＰＫＤ１配列と比較した。このデータセットにおいて、ＰＫＤ１および相同配列は、ヌクレオチドレベルにおいて９７％を越えて一致した。したがって、ＰＫＤ１遺伝子座に対してｃＤＮＡを明確に地図で示すために、および正確な配列がそのｃＤＮＡによってコードされていることを確かめるためには、可能なＰＫＤ１ｃＤＮＡおよびゲノム配列の直接比較が必要である。完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡを組立てるには、多数のアプローチが必要とされた。７個のｃＤＮＡを用いて、完全長さｃＤＮＡを構築した。これらｃＤＮＡの内５個は、ｃＤＮＡライブラリー、すなわち、ＢＲＬジーン・トラッパー（Gene -Trapper）脳ライブラリー並びに胎児脳から構築されたおよび体細胞雑種１４５．１９から構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることから回収された。１４５．１９細胞系は、ＰＫＤ１遺伝子座を含有するが、そのヒト成分中にＰＫＤ１相同染色体を含んでいない。Ａ．ｃＤＮＡライブラリー構築およびスクリーニング体細胞雑種ライブラリーを、オリゴ（ｄＴ）およびランダム六量体プライマーの両方および１４５．１９細胞系からのポリ（Ａ）を含有するＲＮＡを用いて構築した。二重らせんｃＤＮＡを結合させた後、λ ZAP EXPRESS（ストラタジーン，ラホヤ，ＣＡ）中に連結させて、数１００万の独立したプラークから成るライブラリーを生じた。１４個のクローンは、ＰＫＤ１特異的プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションによって陽性であり、それらのインサートは２．６〜９ｋｂの大きさであった。１４５．１９細胞系に由来するＲＴ−ＰＣＲ生成物と一致して、実質的な選択的スプライシング(alternative splicing)または不完全なスプライシングが明らかであった。興味深いことに、失われたエクソンは、１種類またはそれ以上の別のタンパク質ドメインを含むように見えた。２種類の追加のライブラリーを、λ ZAP EXPRESS中にクローン化された胎児脳ｃＤＮＡおよび置換ベクターλ DASH（ストラタジーン，ラホヤ，ＣＡ）を用いて構築した。更に、ｃＤＮＡ選択法の変法を用いて、オリゴ（ｄＴ）開始一方向ｃＤＮＡライブラリー（ファージミド中）をスクリーニングした。簡単にいうと、一本鎖ライブラリーＤＮＡを、成人脳ｃＤＮＡライブラリーの培養物から製造した。予想されたＰＫＤ１ｃＤＮＡの遺伝子特異的部分からのセンス鎖に由来する一つのビオチニル化１７マーを、ハイブリッド選択に用いた。変性によって放出されたハイブリッド結合ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーと同じオリゴヌクレオチドおよびクレノウを用いて二本鎖にした後、エレクトロポレーションによって大腸菌中に導入した。コロニーハイブリダイゼーションを用いて、豊富な脳ｃＤＮＡ集団からＰＫＤ１クローンを同定した。クローン化脳インサートは、０．７〜２．５ｋｂの大きさであった。二つの最大ｃＤＮＡの配列は、互いにも、ゲノム配列とも、事実上一致した。実施例４：完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡの発現完全長さｃＤＮＡを、３種類の発現ベクター、pCMV-SPORT、pcDNA3およびpCEP 4中にクローン化した（１８〜２４．２ｋｂの全構築物寸法）。pCMV-SPORT中の完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡの模式的構造を図１１で示す。 pCMV-SPORTおよびpcDNA3は、クローニング部位および若干の他の小さな特徴に僅かな相違を有するが、隣接するＴ７およびＳＰ６プロモーターの基本的特徴、高レベル転写のためのＣＭＶエンハンサー−プロモーター配列、およびＲＮＡ安定性を増大させる真核性ポリアデニル化および転写配列を共有している。ＳＶ４０複製起点は、真核性細胞における成長を可能にするが、ＣｏｌＥ１起点は、大腸菌における成長を可能にする。ベクターpcDNA3は、真核生物においてネオマイシン耐性を与えるが、アンピシリン耐性は大腸菌における選択に用いられる。 pCEP4は、霊長類細胞中の染色体外で維持される、ＥＢＶを基礎とするベクターである。pCMV-SPORTおよびpcDNA3と同様、pCEP4は、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターを含有し、そしてＣｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性は、維持のために用いられる。しかしながら、真核性細胞における選択には、ハイグロマイシン耐性が用いられる。ＥＢＶ複製起点およびハイグロマイシン耐性の使用は、形質転換法の機能としてそれらがＳＶ４０ラージＴ抗原を既に含有し且つＧ４１８耐性であるので、ＰＫＤ１形質転換細胞系の研究のための重要な特徴である。Ａ．in vitro発現 pcDNA3のＴ７プロモーター特徴は、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解液系（TNT Coup led Reticulocyte Lysate System）（プロメガ，マディソン，ＷＩ）を用いて、ＰＫＤ１ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質産物を分析するのに用いられた。この系は、多量のＲＮＡをＴ７プロモーターから合成させ、そしてウサギ網状赤血球溶解液中においてＲＮＡをタンパク質に翻訳させる。慣用的な分子量基準品は最大約２１６ｋＤまでしか達しないので、in vitro合成されたポリシスチンの寸法の推定値約４６２ｋＤ（グリコシル化されていない）は、おおよその推定である。この理由のため、推定寸法の短縮されたタンパク質をコードする一連の３’欠失ＰＫＤ１ｃＤＮＡプラスミド鋳型を構築した（図１０）。これら欠失クローンのタンパク質産物および完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡを、ＴＮＴ系を用いて分析した。新たに合成されたタンパク質を、放射性アミノ酸、最初は³⁵Ｓ−メチオニンの包含によって標識した。次に、その合成されたタンパク質を、３〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動によって分離した。切断されたクローンそれぞれから製造されたタンパク質産物の移動度は、その予想分子寸法と一致した。これら結果は、ポリシスチンのin vitro合成を支配する組立てられたＰＫＤ１ｃＤＮＡ発現ベクターと一致する。Ｂ．in vivo発現：ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞中でのＰＫＤ１ｃＤＮＡトランスフェクション完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡ構築物またはそれらの一部分を、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションし、そしてトランスフェクション後４８時間に、ノーザン分析を用いてＰＫＤ１発現について検定した。インサート不含ベクターpcDNA3は、トランスフェクションの対照として平行して用いられた。ノーザンブロットをＰＫＤ１特異的プローブでプローブした後、β−アクチンｃＤＮＡで引続き再度プローブして、それぞれの列を規格化した。それら結果は、ＰＫＤ１ｃＤＮＡ構築物を与えられたＨＥＫ２９３中においてＰＫＤ１ｍＲＮＡが少なくとも２倍増加することを示した。実施例５：ＰＫＤ１突然変異の診断試験高グルコースACD Vacutainers^TM（黄色キャップ）中に集められた全血試料を遠心分離し、そしてバフィーコートを集めた。白血球を、１４ｍＭＮＨ₄Ｃｌおよび１ｍＭＮａＨＣＯ₃の１０：１（ｖ／ｖ）混合物で２回洗浄して溶解させ、それらの核を核溶解緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ８．０，０．４ＭＮａＣｌ，２ｍＭＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ，５００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に再懸濁させ、そして３７℃で一晩中インキュベートした。次に、試料を４分の１容量の飽和ＮａＣｌで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール中で沈澱させた。次に、ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ）中に溶解させた。Ａ．試験Ｉ長時間ＰＣＲ条件を、４部反応混合物と一緒に用いた。次の成分を含有するパート１：３．３ＸＸＬ緩衝液１２μｌｄＮＴＰ（各２ｍＭ）８μｌ前進プライマー（２０μＭ）１〜５μｌ逆プライマー（２０μＭ）１〜５μｌ遮断用オリゴ（２ｍＭ）１．５μｌＭｇ（ＯＡｃ）２，（２５ｍＭ）４．４μｌ水４０μｌまでパート１は、単一反応成分としてまたはバッチ（１０、５０、１００反応当量）で組立てられた後、４０μｌアリコートとして個々の反応試験管中に分配することができる。パート２は、１AmpliWaxPCR Gem 100（またはそれぞれのパート１反応試験管に匹敵しうる生成物）を慎重に加えることを含む。それら試験管を７５〜８０℃ で５分間インキュベートしてロウビーズを溶融させた。それら反応を冷却して、ロウを凝固させた。パート３において、次の成分を、パート２：３．３ＸＸＬ緩衝液１８μｌｔＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，ＸＬ２μｌの冷却反応混合物に対して加えた。パート４において、次の成分をパート３：ヒトＤＮＡ０．２〜１μｇ水４０μｌまでの反応混合物に対して加える。上記の反応において用いられた前進プライマーは、真のＰＫＤ１およびＰＫＤ１相同配列両方に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む。このようなプライマーの例は、 5'-CACGACCTGTCCCAGGCAT-3’（配列番号：６）（配列番号：１のヌクレオチド４７０２〜４７２０に該当する）である。逆プライマーは、ＰＫＤ１相同染色体中に存在していてよいしまたはしていなくてよい、真のＰＫＤ１遺伝子の３’部分に由来する配列を含む。このような３ ’部分および対応する逆プライマーの例は、次の通りである。遮断用オリゴヌクレオチドは、を含む。重要なことに、このオリゴヌクレオチドは、重合を支持することができてはならない。一つの例は、３’末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドである。この作用を達成するいずれの修飾も、本発明の実施において用いることができるということは理解されるであろう。適当な条件下において、遮断用オリゴヌクレオチドは、ＰＫＤ１相同染色体に対して効率よくハイブリッド形成するが、真のＰＫＤ１配列に対しては効率が悪い。したがって、この診断試験における増幅生成物は、真のＰＫＤ１遺伝子のみに由来する。２５〜３８サイクルの増幅を、標準ＤＮＡ熱循環器を用いて、各サイクルについて次のプライマー依存性条件を実施した。配列番号：５６：９４℃、３０秒間；６２℃、３０秒間；および７２℃、３４分間。配列番号：５７：９４℃、３０秒間；５６℃、３０秒間；および７２℃、３７分間。配列番号：５８：９４℃、３０秒間；５８℃、３０秒間；および７２℃、４５分間。７２℃伸長サイクルは、次のサイクルに各５秒間延長された。一次ＰＣＲ産物は、突然変異について直ちに分析されうるし、または他に、対のアンプリマーの集合を用いる二次ＰＣＲの鋳型として用いられて、より小さいアンプリコンの重複セットを生じることができる。次に、より小さいアンプリコンの突然変異について分析することができる。Ｂ．試験II 長時間ＰＣＲ条件を、４部反応混合物と一緒に用いた。次の成分を含有するパート１：３．３ＸＸＬ緩衝液１２μｌｄＮＴＰ（各２ｍＭ）８μｌ前進プライマー（２０μＭ）１〜５μｌ逆プライマー（２０μＭ）１〜５μｌＭｇ（ＯＡｃ）２，（２５ｍＭ）４．４μｌ水４０μｌまでパート１は、単一反応成分としてまたはバッチ（１０、５０、１００応当量）で組立てられた後、４０μｌアリコートとして個々の反応試験管中に分配することができる。パート２は、１AmpliWaxPCR Gem 100（またはそれぞれのパート１反応試験管に匹敵しうる生成物）を慎重に加えることを含む。それら試験管を７５〜８０℃ で５分間インキュベートした。ロウビーズを溶融させること。それら反応を冷却して、ロウを凝固させた。パート３において、次の成分を、パート２：３．３ＸＸＬ緩衝液１８μｌｔＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，ＸＬ２μｌの冷却反応混合物に対して加えた。パート４において、次の成分をパート３：ヒトＤＮＡ０．２〜１μｇ水４０μｌまでの反応混合物に対して加える。２５〜３８サイクルの増幅を、標準ＤＮＡ熱循環器を用いて、各サイクルについて次のプロトコール、すなわち、９４℃、３０秒間；６１℃、３０秒間；および７２℃、１１分間を実施した。７２℃伸長サイクルは、次のサイクルに各５秒間延長された。一次ＰＣＲ産物は、突然変異について直ちに分析されうるし、または他に、対のアンプリマーの集合を用いる二次ＰＣＲの鋳型として用いられて、より小さいアンプリコンの重複セットを生じることができる。次に、より小さいアンプリコンの突然変異について分析することができる。上記の反応において用いられた前進プライマーは、真のＰＫＤ１およびＰＫＤ１相同配列両方に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む。このようなプライマーの例は、である。逆プライマーは、真のＰＫＤ１遺伝子に由来する配列を含み且つＰＫＤ１相同染色体中に存在しない。したがって、この診断試験における増幅生成物は、真のＰＫＤ１遺伝子のみに由来する。適当な逆プライマーの例は、である。Ｃ．試験III 長時間ＰＣＲ条件を、４部反応混合物と一緒に用いた。次の成分を含有するパート１：３．３ＸＸＬ緩衝液１２μｌｄＮＴＰ（各２ｍＭ）８μｌ前進プライマー（２０μＭ）１〜５μｌ逆プライマー（２０μＭ）１〜５μｌＭｇ（ＯＡｃ）２，（２５ｍＭ）４．４μｌ水４０μｌまでパート１は、単一反応成分としてまたはバッチ（１０、５０、１００反応当量）で組立てられた後、４０μｌアリコートとして個々の反応試験管中に分配することができる。パート２は、１AmpliWaxPCR Gem 100（またはそれぞれのパート１反応試験管に匹敵しうる生成物）を慎重に加えることを含む。それら試験管を７５〜８０℃ で５分間インキュベートした。ロウビーズを溶融させること。それら反応を冷却して、ロウを凝固させた。パート３において、次の成分を、パート２：３．３ＸＸＬ緩衝液１８μｌｔＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，ＸＬ２μｌの冷却反応混合物に対して加えた。パート４において、次の成分をパート３：ヒトＤＮＡ０．２〜１μｇ水４０μｌまでの反応混合物に対して加える。２５〜３８サイクルの増幅を、標準ＤＮＡ熱循環器を用いて、各サイクルについて次のプロトコール、すなわち、９４℃、３０秒間；６５℃、３０秒間；および７２℃、１１分間を実施した。７２℃伸長サイクルは、次のサイクルに各５秒間延長された。一次ＰＣＲ産物は、突然変異について直ちに分析されうるし、または他に、対のアンプリマーの集合を用いる二次ＰＣＲの鋳型として用いられて、より小さいアンプリコンの重複セットを生じることができる。次に、より小さいアンプリコンの突然変異について分析することができる。上記の反応において用いられた前進プライマーは、真のＰＫＤ１およびＰＫＤ１相同配列両方に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む。このようなプライマーの例は、である。逆プライマーは、真のＰＫＤ１遺伝子に由来する配列を含み且つＰＫＤ１相同染色体中に存在しない。したがって、この診断試験における増幅生成物は、真のＰＫＤ１遺伝子のみに由来する。適当な逆プライマーの例は、である。ＲＴ−ＰＣＲのために、第一鎖ｃＤＮＡ合成を、逆プライマー（配列番号：１４）およびSuperscriptII^TMを製造者の提示した条件（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Life Technologies,Inc.），ゲイサーズバーグ，ＭＤ）にしたがって用いて行う。次に、ＰＣＲを、上記の反応条件下において、伸長サイクルを（より小さい生成物寸法のために）７２℃で６分間だけ行うという変更を伴って、第一鎖反応の１〜５０％を用いて行う。Ｄ．試験IV ＰＫＤ１ｍＲＮＡの突然変異について分析するために、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに必要な鋳型として白血球から単離する。高グルコースACD Vacutainers^TM（黄色キャップ）中に集められた全血試料を遠心分離し、そしてバフィーコートを集めた（細胞４〜２０×１０⁶個／１０ｍｌ（血液））。ＲＮＡは、白血球から直接的に、またはフィトヘマグルチニンなどのマイトジェンの存在下における白血球の標準的な短時間培養（４８〜７２時間）後に単離するこどができる。ＲＮＡは、グアニジウムイソチオソアネート：酸性フェノール抽出などの標準的な条件を用いて記載のように単離される（チョムチンスキー（Chomczynski）およびサッキ（Sacchi），Anal.Biochem.162:156-159,1987）。ＲＴ−ＰＣＲのために、第一鎖ｃＤＮＡ合成を、逆プライマー（下記）および商業的に入手可能な逆転写酵素、例えば、SuperscriptII^TMなどを製造者の提示した条件（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）にしたがって用いて行う。次に、ＰＣＲを、下記の反応条件下において第一鎖反応の１〜５０％を用いて行う。逆プライマーは、真のＰＫＤ１遺伝子およびＰＫＤ１相同染色体両方に由来する配列を含む。対照的に、前進プライマーは、真のＰＫＤ１遺伝子座に特異的であり且つその相同染色体遺伝子座に由来するｃＤＮＡを増幅させないであろう。したがって、この診断試験において得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物は、真のＰＫＤ１遺伝子のみに由来する。この反応で用いられた前進プライマーは、真のＰＫＤ１に対してのみハイブリッド形成し且つ相同配列に対してハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドを含む。このようなプライマーの例は、である。適当な逆プライマーの例は、である。ＲＴ−ＰＣＲ反応の増幅態様は、「ホットスタート（hot-start）」工程を含めた下記のような標準条件を用いて行われた。１０ＸＴａｑ緩衝液８μｌｄＮＴＰ（各２ｍＭ）７μｌ前進プライマー（１００μＭ）０．４〜１．５μｌ逆プライマー（１００μＭ）０．４〜１．５μｌＤＮＡ０．２１．０μｇ水８０μｌまで増幅は、１回だけの「ホットスタート」工程を用いて開始した後、標準ＤＮＡ熱循環器を用いて２５〜３８サイクルの増幅を行った。その１回だけの「ホットスタート」工程はは、８０℃で３〜５分から成り、その後、Ｔａｑポリメラーゼ１μｌを各反応試験管に対して加えた。「ホットスタート」は、次の規格、すなわち、９４℃、２０秒間；６４℃、３０秒間；および７２℃、２分間から成る各サイクルで２５〜３８サイクルまで進行した。一次ＰＣＲ産物は、突然変異について直ちに分析されうるし、または他に、対のアンプリマーの集合を用いる二次ＰＣＲの鋳型として用いられて、より小さいアンプリコンの重複セットを生じることができる。次に、より小さいアンプリコンの突然変異について分析することができる。上で得られたＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ産物を、特異的ＰＫＤ１突然変異の存在について次の通り分析した。増幅生成物８μｌを、変性用溶液（０．５ｍＭＮａＯＨ，２．０ＭＮａＣｌ，２５ｍＭＥＤＴＡ）５０μｌに対して加え、そしてナイロン膜フィルター（ＩＮＣバイオトランス（Biotrans））上にスポットした。次に、それらフィルターを真空下において８０℃で１５分間焼くことにより、変性ＤＮＡをナイロンフィルターに固定した。ＰＫＤ１突然変異を検出するオリゴヌクレオチドは、自動合成機を用いて化学合成され、そして当該技術分野において標準的である方法を用いて、ポリヌクレオチドキナーゼと一緒にγ³²Ｐで放射性標識された。ハイブリダイゼーションは、上で調製されたフィルターが入っているプラスチックバッグ中で行われ、これには、１種類またはそれ以上の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション緩衝液（３．０Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ），０．６％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８，５Ｘデンハート溶液および４０μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ）中で加えられた。それらプール中のオリゴヌクレオチド濃度は、０．０３〜０．１５ピコモル／ｍｌ（ハイブリダイゼーション溶液）であった。ハイブリダイゼーションを、撹拌しながら５２℃で一晩中進行させた。次に、フィルターをバッグから取出し、そして洗浄緩衝液（３．０ＭＴＭＡＣ，０．６％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８）を用いて室温で２０分間洗浄した後、同緩衝液中での２回目の洗浄を５２℃で２０分間行った。フィルターを乾燥させ、そしてコダック（Kodak）X-OMAT^TMフィルムに暴露した。上の反応で用いられた酵素およびヌクレオチドは、ギブコ（GIBCO）−ＢＲＬ、プロメガ（Promega）、ニューイングランド・バイオラブズ（New England Bio labs）等のようないずれの製造業者からも入手できることは理解されるであろう。実施例６：抗ポリシスチン抗体Ａ．合成Ｃ末端ペプチドに対する多クローン性抗血清の製造および特性決定。予想されたＰＫＤ１遺伝子産物の最後の１６カルボキシ末端アミノ酸を表わすペプチド（Ｃ）SRTPLRAKNKVHPSST（配列番号：１７）を合成した。ＤＮＡ配列から予想されないシステイン残基をアミノ末端に対して付加して、ＫＬＨ担体タンパク質に対する共役を容易にした。２匹のウサギ（ＡおよびＢ）を、チェン（Ch eng）ら，EMBO J.7:3845-3855,1988で記載のようにペプチドで免疫感作した。多クローン性抗ペプチド抗血清を１：１０〜１：１０，０００まで希釈し、そして免疫反応性を、慣用法にしたがってＥＬＩＳＡによって測定した（チェンら，EMBO J.,1988上記）。両方のウサギによって生産された抗血清は、ＳＰＯＴ法（ブランケンマイヤー（Blankenmeyer）−メンゲ（Menge）およびフランク（Fra nk），INNOVATION AND PERSPECTIVES IN SOLID PHASE SYNTHESIS，エプトン（Ep ton）,R.監修，チャプマン・アンド・ホール・メディカル（Chapman and Hall M edical），ロンドン，1990，1-10頁中）によって地図で示されたエピトープであった。簡単にいうと、重複する８アミノ酸長さペプチドを、セルロース膜上で同時に合成し、そして免疫反応性について検定した。正のペプチドを一直線に並べ、そして配列相同性を確認することによってそのエピトープを識別した。興味深いことに、抗血清ＡおよびＢは、少なくとも２個の非重複エピトープをそれぞれ有していたので、これら抗体がＰＫＤ１遺伝子産物を認識する可能性は増大した。Ｂ．ドメイン特異的融合タンパク質図１５で示されたように、正しい読み取り枠が維持されるようにポリシスチンの異なったドメインを含有する４種類の融合クローンを構築した。発現構築物の３種類を、大腸菌中においてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として異種配列の発現のために設計されたｐＧＥＸベクター中にクローン化した。これらは、高ロイシン反復（ＬＲＲ）を含んでいたＦＰ−ＬＲＲ；８３個のＣ末端アミノ酸を含有するＦＰ−４６−１ｃ、およびＦＰ−４６−１ｃの内部に７７個のアミノ酸を有するＦＰ４６−２である。４種類の融合構築物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ベクター中にクローン化され、そしてカルボキシ末端の２０５アミノ酸を、したがって、ＧＳＴ融合タンパク質の重複する二つをコードした。重複するカルボキシ融合生成物は、抗体試薬確認の追加の段階を提供する。それらは、同一でないとしても類似した抗体反応性パターンが、これら重複タンパク質に対して生じた抗体で見られるはずであるので、正の抗体反応が人工産物ではないということを実証することを可能にする。２種類の異なった「担体」融合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして別の担体タンパク質を用いて、融合タンパク質に対して生じた抗体を精製ずることも可能にする。これは、担体タンパク質自体に対して生じた抗体を除去するのに役立つ。ＧＳＴ融合タンパク質は、スミス（Smith）およびジョンソン（Johnson），Ge ne 67:31-40,1988で記載のように、グルタチオン−セファロース（ファーマシア (Pharmaia)）を用いる形質転換細胞の抽出から精製された。ＭＢＰ融合タンパク質は、アミロース樹脂（ＮＥＢ，ビバリー，ＭＡ）上で精製された。Ｃ．ドメイン特異的ポリシスチン融合タンパク質に対する多クローン性抗体の生産および特性決定。融合タンパク質に対する抗体を、ウサギにおいてタンパク質２００μｇを用いる公開された方法（チェンら，EMBO J.,1988上記）を用いて生じさせた。これら個々の抗体は、免疫原として用いられた融合タンパク質構築物の一部分（すなわち、ＦＰ−ＬＲＲ、ＦＰ４６−１ｃ、ＦＰ４６−２およびＭＡＬ−ＢＤ−３）としてＰＫＤ１タンパク質を特異的に認識した。更に、これら抗体は、不適当な抗原ＧＳＴまたはＭＢＰに対して結合しなかったし、充分な抗体精製後に対照として包含された免疫原中に存在しないポリシスチンドメインに対して交差反応することもなかった。 in vitro合成されたポリシスチンタンパク質を用いて、ドメイン特異的抗体を調べた。完全長さＰＫＤ１ｃＤＮＡに加えて、ＰＫＤ１ドメインのサブセットだけをそれぞれ発現した２種類のより短いクローンを、図１６で示されたような発現ベクター中で構築した。BRASH７クローンは、カルボキシ末端エピトープも、貫膜ドメインも含有するが、ＳｒｆＩΔは、アミノ末端、ＬＲＲ、およびＩｇ様ドメインの大部分を含有する。両方とも、in vitro転写／翻訳系のＴＮＡ中で効率よく発現される。Ｄ．免疫沈降抗ポリシスチン抗体を、プロテインＡセファロースかまたはプロテインＧセファロースと一緒にインキュベートして、抗体結合ビーズを生成した。次に、これらビーズを、発現クローンからin vitro合成された³⁵Ｓ標識タンパク質と一緒にインキュベートした。空隙部分および保持部分を集め、そしでＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。セファロース単独は、人為的結合、すなわち、ポリシスチンの大きい寸法、多数のＩｇ様反復の存在、およびレクチンドメインのための関係に対する対照として包含された。不適当な抗原に対する抗体も対照として包含された。抗体が抗原を特異的に結合した場合、正しい分子質量のタンパク質種は、ゲル上においてビーズ画分で検出されるであろう。検出されない場合、発現されたタンパク質は、ゲル上の空隙率で現われるであろう。セファロースＡに対して結合した抗融合タンパク質抗体はそれぞれ、対合した抗原ドメインを含有したクローンによって発現されたタンパク質を特異的に免疫沈降した。それら抗体は、ポリシスチンの不適当なドメイン（すなわち、その特定の抗体を生じる免疫原として用いられなかったドメイン）から発現されたタンパク質を免疫沈降しなかったし、他の不適当な抗原（例えば、ルシフェラーゼ）を認識することもなかった。これらの結果は、これら多クローン性抗体が、カルボキシ末端およびポリシスチンのＬＲＲドメインを特異的に認識するということを確証する。実施例７：ＰＫＤ１と相互作用するタンパク質の識別ＰＫＤ１タンパク質の更に別の特性決定は、通常はＰＫＤ１タンパク質と相互作用する他のタンパク質の識別によって達成されうる。当業者は、制限されるわけではないが、抗ポリシスチン抗体を用いるタンパク質複合体の免疫沈降、標識されin vitro合成されたポリシスチンを用いる発現ライブラリーのスクリーニング、およびＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインの相互作用を利用する酵母系の使用を含めた、このような目的に有用な種々のアプローチに精通している。例えば、一つのこのようなアプローチは、ＰＫＤ１と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の識別を可能にする二雑種酵母系である（フィールズ（Fiel ds）およびソング（Song），Nature 340:245-6,1989；ファインリー（Finley）およびブレント（Brent），Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:12980-84,1994）。この技術は、ＧＡＬ４などの真核性転写活性化因子が、２種類の必須の且つ別個のドメイン、すなわち、アミノ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびカルボキシ末端転写活性化ドメインを利用して機能するということに頼っている（マー（Ma）およびプタシュネ（Ptashne），Cell 51:113-119,1987）。二雑種系は、２種類のドメインが異なったハイブリッドポリペプチドによってコードされでいる場合でも、それら２種類の必須ドメイン間の空間的関係が天然の転写活性化因子と類似している限り、機能性転写活性化因子が生じうるという知見を利用している。酵母二雑種系は、Yin-Yang-1（シュリバスタバ（Shrivastava）ら，Science 262:1889- 92,1993）、E12（シュタウディンガー（Staudinger）ら，J.Biol.Chem.268:4608 -11,1993）、H-Ras（ボイテク（Vojtek）ら，Cell 74:205-214,1993）、Pr55gag （ルーバン（Luban）ら，Cell 73:1067-78,1993）、p110RB（ダーフィー（Durfe e）ら，Genes Dev.7:555-69,1993）およびp53（イワブチ（Iwabuchi）ら，Oncog ene 8:1693-96,1993）と相互作用するタンパク質の探求においてｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするのに首尾よく用いられてきた。Ａ．ハイブリッド構築ＰＫＤ１部分のいくつかの構築物を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質として製造した。それら構築物は、pGBT9ベクターを用いるＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとＰＫＤ１タンパク質の細胞質尾部（アミノ酸残基４０９７〜４３０２）との間のＢＤ−３融合、ＤＮＡ結合ドメインおよびポリシスチンのＬＲＲ部分（アミノ酸残基２７〜３６０）を含有するＢＤ−１クローン、およびＤＮＡ結合ドメインおよびＩｇ様反復の部分（アミノ酸残基７１３〜２３２４）を含有するＢＤ−２クローンであった。Ｂ．酵母中への構築物の形質転換 laczリポーター遺伝子を含有するコンピテント酵母細胞ＨＦ７ｃは、ＬｉＡｃ法によって得られる。簡単にいうと、一晩培養物は、ＯＤ６００＝０．２まで希釈され、そして更に３時間成長し続ける。細胞を集め、Ｈ₂Ｏ中で洗浄し、そしてＴＥ中０．１ＭＬｉＡｃ中に再懸濁させる。コンピテント細胞（０．１ｍｌ）を、０．１ｍｇのプラスミド構築物ＤＮＡおよび１００ｍｇの担体ＤＮＡと混合する。５０％ＰＥＧ４００（０．６ｍｌ）を加え、そして３０℃で１時間インキュベートする。このインキュベーション後、それら細胞を４２℃まで１０分間加熱し、そして最少培地（栄養要求性必要条件を補足されたアミノ酸不含ディフコ（Difco）酵母窒素基剤）上にプレーティングする。酵母形質転換細胞は、培養から３日後に選択される。Ｂ．β−ガラトシダーゼのコロニーリフトフィルター検定ＶＭＲ等級４１０フィルターを、選択培地上に形質転換細胞を含有する寒天平板に上層し、そして液体窒素のプールに１０秒間入れる。コロニーサイドアップ（side up）フィルターを、Ｘ−ｇａｌ溶液中に予め浸漬されている別のフィルター上に置く。２時間後、フィルターを、β−ガラクトシダーゼ生産性コロニーである青色の存在について分析する（示されていない）。或いは、別々の形質転換細胞からの個々のコロニーを、同様の平板上に画線接種し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について処理することができる。本発明を、好ましい実施態様であると現在考えられていることに関して記載してきたが、本発明が、開示された実施態様に制限されないことを理解すべきである。逆に、本発明は、請求の範囲の精神および範囲に含まれる種々の変更および同等の配置を包含するためのものである。次の請求の範囲の範囲は、このような変更並びに同等の構造および機能を全て包含するように最も広い解釈を許すはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者バーン，ティモシーアメリカ合衆国マサチューセッツ州01532, ノースバーロウ，アダムズ・ロード３ (72)発明者コナーズ，ティモシーアメリカ合衆国マサチューセッツ州01748, ホプキントン，ヘイデン・ロウ・ストリート 304 (72)発明者ダッコウスキ，ウィリアムアメリカ合衆国マサチューセッツ州01748, ホプキントン，ヴァレンタイン・ロード４ (72)発明者ジャーミノ，グレゴリーアメリカ合衆国メリーランド州20815，チェヴィ・チェイス，ポマンデュ・ケーヴ 7310 (72)発明者キアン，フェンアメリカ合衆国メリーランド州21212，ボルティモア，ダンバートン・ロード 124 ―８ (72)発明者ランデス，グレゴリーアメリカ合衆国マサチューセッツ州01532, ノースボロ，インディアン・メドウ・ドライブ 19

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＰＫＤ１ポリペプチドをコードしている単離された核酸。２．前記核酸が、配列番号：２で示される配列を含むＤＮＡである請求項１に記載の単離された核酸。３．前記核酸がＲＮＡである請求項１に記載の単離された核酸。４．前記核酸が、配列番号：４で示される配列を含むｃＤＮＡである請求項１に記載の単離された核酸。５．請求項１に記載の核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する単離された核酸。６．配列番号：３で示される配列を含む請求項５に記載の単離された核酸。７．請求項１に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド。８．配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載の単離されたポリペプチド。９．請求項１に記載の単離された核酸を含むベクター。１０．前記核酸に対して機能的に結合した転写調節要素を更に含み、該要素は、原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子またはそれらの組合わせの発現を支配する能力を有する請求項９に記載のベクター。１１．請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。１２．ＰＫＤ１タンパク質を製造する方法であって、（ａ）請求項１１に記載の宿主細胞を培地中においておよび該タンパク質の発現に適した条件下で培養し、そして（ｂ）該発現されたタンパク質を単離することを含む上記方法。１３．トランジション、トランスバージョン、欠失および挿入から成る群より選択される修飾を有する配列番号：２で示されるＤＮＡ配列を含む単離されたヒトＰＫＤ１遺伝子。１４．対象者のゲノム中の１個またはそれ以上のコピーでのその存在が、該対象者における成人発症多嚢胞性腎疾患に関係しているＤＮＡ配列を含む請求項１３に記載の遺伝子。１５．請求項１３に記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。１６．前記ＤＮＡ配列に対して機能的に結合した転写調節要素を更に含み、該要素は、原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子またはそれらの組合わせの発現を支配する能力を有する請求項１５に記載のベクター。１７．請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。１８．突然変異ＰＫＤ１タンパク質を製造する方法であって、（ａ）請求項１７に記載の宿主細胞を培地中においておよび該タンパク質の発現に適した条件下で培養し、そして（ｂ）該発現されたタンパク質を単離することを含む上記方法。を含む単離された核酸。を含む単離された核酸。を含む単離された核酸。を含む単離された核酸。２３．ＰＫＤ１保因者を識別するためにヒト対象者をスクリーニングする診断方法であって、（１）該対象者から生体材料の試料を得；そして（２）該生体材料中の突然変異ＰＫＤ１遺伝子またはそれらのタンパク質産物の存在を検定する工程を含む上記方法。２４．前記生体材料が核酸を含み、そして前記検定が、（ａ）該生体材料から真のＰＫＤ１遺伝子またはそのフラグメントを選択的に増幅させ、そして（ｂ）正常および突然変異ＰＫＤ１遺伝子の存在を、制限酵素消化、直接ＤＮＡシークエンス法、配列特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、一本鎖立体配座多型解析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）、二次元ゲル電気泳動およびそれらの組合わせから成る群より選択される分析方法を用いて検出することを含む請求項２３に記載の方法。２５．前記増幅を、から成る群より選択される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの存在下で行う請求項２４に記載の方法。２６．前記検定工程が、前記ＰＫＤ１遺伝子産物に特異的な抗体を用いる免疫検定を含む請求項２３に記載の方法。２７．配列（Ｃ）SRTPLRAKNKVHPSST（配列番号：１５）を含むペプチドまたはその免疫原性フラグメントに対して向けられた単離された抗体。２８．配列番号：２で示される遺伝子配列によってコードされるポリペプチドと免疫反応性の請求項２７に記載の抗体。２９．配列番号：２で示される配列によってコードされるポリペプチドと免疫反応性の単離された抗体。３０．配列番号：５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと免疫反応性の単離された抗体。３１．ＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療する方法であって、ＰＫＤ１遺伝子機能の欠損を有する細胞に対して、正常ヒトＰＫＤ１遺伝子またはそのフラグメントを投与することを含み、該投与が、治療的有効量の正常ＰＫＤ１タンパク質またはそのフラグメントの発現を引き起こす上記方法。３２．前記正常ヒトＰＫＤ１遺伝子が、配列番号：２のＤＮＡ配列を含む請求項３１に記載の方法。３３．前記正常ヒトＰＫＤ１遺伝子が、配列番号：４のｃＤＮＡ配列を含む請求項３１に記載の方法。３４．ＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療する方法であって、ＰＫＤ１遺伝子機能の欠損を有する細胞に対して、治療的有効量の正常ＰＫＤ１タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含む上記方法。３５．前記ＰＫＤ１タンパク質が、配列番号：２で示されるＤＮＡ配列によってコードされている請求項３４に記載の方法。３６．前記ＰＫＤ１タンパク質が、配列番号：４で示されるｃＤＮＡ配列によってコードされている請求項３４に記載の方法。３７．配列番号：５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを投与することを更に含む請求項３５に記載の方法。３８．ＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療するための組成物であって、配列番号：２のＤＮＡ配列を有する単離されたヒトＰＫＤ１遺伝子またはそのフラグメントおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む上記組成物。３９．前記ＰＫＤ１遺伝子が組み込まれているベクターを含む請求項３８に記載の組成物。４０．配列番号：４のＤＮＡ配列を有する単離されたヒトＰＫＤ１遺伝子またはそのフラグメントを更に含む請求項３８に記載の組成物。４１．ＡＰＫＤの特徴を有する疾患状態を治療するための組成物であって、配列番号：２のＤＮＡ配列によってコードされる正常ＰＫＤ１タンパク質またはそのフラグメントおよび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む上記組成物。４２．配列番号：４のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを更に含む請求項４１に記載の組成物。４３．組換えＰＫＤ１遺伝子またはそのフラグメントをそのゲノムが含んでいる単細胞生物または多細胞生物。４４．前記ＰＫＤ１遺伝子が、配列番号：２のＤＮＡ配列またはそのフラグメントを有する請求項４３に記載の生物。４５．前記ＰＫＤ１遺伝子が、配列番号：４の配列またはそのフラグメントを有する請求項４３に記載の生物。