JP2002542826A

JP2002542826A - 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）シグナル伝達経路のインヒビターとして働くＴＲＡＦ２の改変体

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Publication number: JP2002542826A
Application number: JP2000615761A
Authority: JP
Inventors: ジョージエイチ．ザサードシアーフォス，; マルコエフ．パグノニ，; ユリディー．イバシュチェンコ，; クングオ，; ケニスエル．クラーク，
Original assignee: アベンティス・ファーマスーティカルズ・プロダクツ・インコーポレイテツド
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2002-12-17
Also published as: AU4076800A; CN1353754A; CN1309830C; MXPA01011107A; IL146241A0; AU2005203749A1; WO2000066737A1; WO2000066737A9; EP1180140A1; HUP0200946A3; CA2372803A1; KR20020012194A; EP1180140A4; HUP0200946A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＴＮＦαシグナル伝達系路を阻害する能力を示すＴＲＡＦ２の改変体に関する。特に、出願人は、ＴＲＡＦ２のスプライス改変体（本明細書中以降、「ＴＲＡＦ２短縮型」または「ＴＲＡＦ２ＴＲ」という）およびドミナントネガティブ特性が増強されたＴＲＡＦ２発現構築物（本明細書中以降、「ＴＲＡＦ２短縮−欠失型」または「ＴＲＡＦ２ＴＤ」という）を単離した。ＴＲＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤは共に、ＴＮＦαシグナル伝達系路を阻害する能力を有し、そしてＴＲＡＦ２ＴＤにおいては、この能力は非常に増強されており、ＴＮＦα結合に対する応答が非常に減少している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、活性化マクロファージおよび単球を含む、種
々の細胞により生成される免疫応答の細胞内メディエーターである。ＴＮＦαに
より誘発される応答は、２つの異なるＴＮＦαの細胞表面レセプター（ＴＮＦα
Ｒ１およびＴＮＦαＲ２）との相互作用を通じて開始される。ＴＮＦαは、これ
らの細胞表面レセプターに結合し、そして転写因子（例えば、核因子κＢ（ＮＦ
κＢ））の活性化を誘発し、この転写因子は、種々の免疫および炎症応答遺伝子
の発現を調節する。

【０００２】ＴＮＦαの結合に際して、ＴＮＦαレセプターは、それらの細胞質ドメインを
通じて、種々の細胞内シグナル翻訳タンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）と相互作用する。Ｔ
ＮＦαレセプターと会合することが公知の細胞内シグナル翻訳タンパク質の１つ
の群は、「ＴＲＡＦ」ファミリーのレセプタータンパク質として公知の腫瘍壊死
因子レセプター会合因子である。ＴＲＡＦファミリーは、構造的特徴を共有し、
そしてＴＮＦαレセプタータンパク質と会合し、かつＴＮＦαからのシグナルを
伝達する多くの相同性タンパク質から構成される。ＴＲＡＦタンパク質は、酵素
活性モチーフを欠き、そして代わりに下流のシグナル伝達カスケードにレセプタ
ーを共役するアダプタータンパク質として機能するようである。このファミリー
の１つのメンバーであるＴＲＡＦ２は、多くのＴＮＦαレセプターファミリータ
ンパク質と会合する。このＴＮＦαレセプターファミリータンパク質としては、
ＴＮＦαＲ１、ＴＮＦαＲ２、ＣＤ４０およびＣＤ３０が挙げられる。ＴＲＡＦ
２に関しては、少なくとも８つの細胞内分子が直接結合することが同定されてい
る。ＴＲＡＦ２は、種々の転写因子、特にＮＦκβおよびＣ−ｊｕｎＮ末端キ
ナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）のＴＮＦα媒介活性化について重要であり、そして
これらの転写因子は、次いで、免疫／炎症応答の発現を担うことが示されている
。

【０００３】ＴＮＦα結合により制御される調節経路に関連した種々の疾患状態が存在する
。いくつかの例において、ＴＮＦα結合は、疾患状態を最終的に生じる炎症応答
を誘発する。従って、ＴＮＦαレセプター結合に関連した疾患を予防するための
手段を開発することは望ましい。そうでなければ、ＴＮＦα活性化により開始さ
れる炎症応答の活性化を予防する方法を見出すことは特に望ましい。本発明は、
ＴＮＦα結合に関連した疾患を処置および予防するために、ＴＲＡＦ２に基づき
、かつＴＮＦαシグナル伝達系路を阻害し得るポリペプチドを提供する。

【０００４】（報告された発展）ＴＲＡＦタンパク質の一般的構造は記載されており、そして図１に総体的に図
示され、ここでは図の形態で全長ＴＲＡＦ２（ＴＲＡＦ２−ＦＬ）が示される。
これらのタンパク質は、ジンク環状フィンガーモチーフを有するＮ末端領域を有
し、ジンクフィンガー様構造のアレイが続く。このジンクフィンガー領域に続い
て、保存性（ＴＲＡＦ）ドメインが存在し、これは、２つのサブドメイン（Ｎ末
端ドメインおよびＣ末端ドメイン）からなる。Ｃ末端ドメインは、レセプター結
合およびＴＲＡＦのホモオリゴマー化、ならびにＴＲＡＦのヘテロオリゴマー化
に関与し、そして種々の他のシグナル伝達タンパク質のためのドッキング部位と
して働く。

【０００５】ＴＲＡＦ２は、上記のＴＲＡＦタンパク質の一般的構造に従う。多数の研究が
、ＴＲＡＦ２タンパク質の構造的なサブドメインとタンパク質の機能とを相関さ
せるために試みられてきた。

【０００６】Ｔａｋｅｕｃｈｉらは、ＴＲＡＦ２の広範な変異分析を実行した（Ｔａｋｅｕ
ｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）１９９３５−４２（１９９
６））。これらの研究は、ＴＲＡＦ２が、別個の活性を媒介するモジュラードメ
インから構成されることを示唆する。この著者らは、ＴＲＡＦ２のＮ末端環状フ
ィンガーおよび２つの隣接するジンクフィンガーがＮＦκＢ活性化に必要とされ
ること、およびＴＲＡＦドメイン中の別個のＴＲＡＦ−ＮサブドメインおよびＴ
ＲＡＦ−Ｃサブドメインが独立して自己結合およびＴＲＡＦとの相互作用を媒介
するらしいことを決定した。

【０００７】Ｓｏｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４，９７９
２−９７９６（１９９７））は、続いて、ＴＮＦαによって誘導されたＮＦκＢ
およびｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）の活性化が、ＴＲＡＦ
２を必要とすることを示す研究である。この著者らは、ＴＲＡＦ２が、ＮＦκＢ
およびＪＮＫの活性化をもたらす２つのキナーゼカスケードの分岐点であること
を示した。この観察は、並行する下流の応答を開始するさらなるシグナル伝達タ
ンパク質についてのドッキング部位を有するアダプタータンパク質としてのＴＲ
ＡＦ２および他のＴＲＡＦファミリーのメンバーについての機能的モデルを支持
する。

【０００８】Ｍｉｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５９，３５０８−３５１８（１９９
７））は、ＴＲＡＦタンパク質の役割を分析するためのトランスフェクション／
過剰発現ストラテジーを使用した。ＴＲＡＦドメインを含むがアミノ末端残基１
−８０を欠くＴＲＡＦ２は、ＴＮＦα誘導されるＮＦκＢ活性化を阻害すること
が以前に示された。この著者らは、このＴＲＡＦ２改変体もまた、ＴＮＦαによ
るＪＮＫ活性化をブロックすることを実証した。

【０００９】Ｂｒｉｎｋら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、７、４１２９−４１３４（
１９９８））は、彼らが「ＴＲＡＦ２Ａ」と呼ぶＴＲＡＦ２のスプライシング改
変体を記載した。ＴＲＡＦ２ＡのｃＤＮＡは、ＴＲＡＦ２Ａ環状フィンガードメ
イン中の７アミノ酸インサートをコードする２１ｂｐの余分の配列を例外として
、ＴＲＡＦ２と同一である。この著者らは、ＴＲＡＦ２ＡｍＲＮＡ発現は、組
織特異的様式で調節され、そしてＴＲＡＦ２Ａタンパク質は、ＴＮＦαＲ２の細
胞質ドメインに結合し得ることを見出した。彼らはまた、ＴＲＡＦ２と対照的に
、ＴＲＡＦ２Ａは、２９３細胞中で過剰発現された場合に、ＮＦκＢ活性を刺激
し得ず、そしてＴＮＦαＲ２依存的ＮＦκＢ活性化の優勢なインヒビターとして
働く。

【００１０】多くの研究が、炎症性プロセスおよびＴＮＦαを、主要な心臓血管の疾患状態
と関連付けてきた（Ｂｒｙａｎｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９７（１４）：
１３７５−８１（１９９８）；Ｋｕｂｏｔａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８１（４
）：６２７−３５（１９９７）；ＭｕｌｌｅｒＷｅｒｄａｎら、Ｅｕｒ．Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅＮｅｔｗ．、９（４）６８９−９１（１９９８）；Ａｕｋｒｕｓ
ｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、８３（３）：３７６−８２（１９９９））
。過去５年間にわたって、局所的なＴＮＦαのレベルの上昇が：（ａ）心臓血管
の虚血性再灌流障害、これは、心筋梗塞、冠状動脈バイパス手術、心臓移植また
は発作後のＣＮＳにおける虚血性再灌流障害に続く；（ｂ）進行した冠動脈アテ
ローム硬化斑の進行および破裂；（ｃ）うっ血性心不全の発症および進行；およ
び（ｄ）バルーン血管形成術後の内皮細胞障害と関連することを示す証拠が蓄積
している。さらに、最近の知見は、アポトーシス性の細胞死が、心不全または梗
塞形成の間の心筋の細胞死の病態生理学において重要な因子であり得ることを示
す。ＴＮＦαは、筋細胞アポトーシスを誘導し得ることが知られている。

【００１１】上述の心臓血管疾患状態に加えて、その病因がＴＮＦαに連結している種々の
他の疾患状態が存在する。これらの疾患状態には、クローン病、乾癬、慢性関節
リウマチ、対宿主性移植片病、炎症性腸疾患、インスリン非依存性糖尿病、およ
び神経変性性疾患（例えば、パーキンソン病）が含まれる。

【００１２】ＴＮＦαと上記に議論したような種々の疾患との間に関連性があるならば、こ
れらの疾患状態を阻害および処置するための組成物および方法を提供することが
望ましい。

【００１３】（発明の要旨）本発明に従って、ＴＲＡＦ２の改変体、特に、天然に存在するスプライシング
のバリエーションを含む改変体（ＴＲＡＦ２ＴＲ）および天然に存在するスプラ
イシングのバリエーションおよびＴＲＡＦ２のＮ末端領域の欠失を含む改変体（
ＴＲＡＦ２ＴＤ）が、ＴＮＦαシグナル伝達および関連する免疫炎症応答の阻害
を提供することが見出された。

【００１４】本発明の１つの実施形態に従って、図２ａに示されるような配列を含むＴＲＡ
Ｆ２ＴＲをコードするＤＮＡ配列が提供される。

【００１５】本発明の別の実施形態に従って、図３ａに示されるような配列を含むＴＲＡＦ
２ＴＤをコードするＤＮＡ配列がまた、提供される。

【００１６】好ましい実施形態において、ＴＲＡＦ２ＴＲＤＮＡおよびＴＲＡＦ２ＴＤ
ＤＮＡは、ｃＤＮＡである。

【００１７】他の実施形態において、本発明は、図２ｂにおいて示されるようなアミノ酸配
列を含む、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）調節性経路を阻害し得るＴＲＡＦ２ＴＲ
ポリペプチド、および図３ｂにおいて示されるようなアミノ酸配列を含む、ＴＮ
Ｆα調節性経路を阻害し得るＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドを提供する。

【００１８】本発明の別の局面は、患者においてＴＮＦα調節性経路を阻害するための方法
を提供し、この方法は、患者の身体に組成物を導入する工程を包含し、この組成
物は、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得、そして、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドを
発現し得る発現ベクターを含む。この発現ベクターは、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプ
チド、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリア、または
ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを発現し得る。

【００１９】本発明のなお別の局面は、ＴＮＦαの過剰産生を含む疾患を阻害する方法を提
供し、この方法は、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得、そしてＴＲＡＦ２ＴＲを発
現し得る発現ベクターを含む組成物を患者に投与する工程を包含し、そしてこの
発現ベクターは、ＴＲＡＦ２ＴＤ、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的に
受容可能なキャリア、またはＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的に受容可
能なキャリアを発現し得る。

【００２０】本発明のなお別の局面は、核因子κＢ（ＮＦκＢ）依存性遺伝子の過剰活性化
を含むＴＮＦα病理を阻害する方法を提供し、この方法は、ＴＮＦα調節性経路
を阻害し得、そしてＴＲＡＦ２ＴＲを発現し得る発現ベクターを含む組成物を患
者に投与する工程を包含し、そしてこの発現ベクターは、ＴＲＡＦ２ＴＤ、ＴＲ
ＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリア、またはＴＲＡＦ２
ＴＤポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを発現し得る。

【００２１】本発明はまた、腫瘍壊死因子αを含む炎症性プロセスを阻害する方法を提供し
、この方法は、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得、そしてＴＲＡＦ２ＴＲを発現し
得る発現ベクターを含む組成物を患者に投与する工程を包含し、そしてこの発現
ベクターは、ＴＲＡＦ２ＴＤ、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的に受容
可能なキャリア、またはＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的に受容可能な
キャリアを発現し得る。

【００２２】特定の実施形態において、その炎症性プロセスは、クローン病、乾癬、慢性関
節リウマチ、対宿主性移植片病、炎症性腸疾患、インスリン非依存性糖尿病、お
よび神経変性性疾患からなる群より選択される。

【００２３】なお別の実施形態において、その炎症性プロセスは、（ａ）心筋梗塞、冠状動
脈バイパス手術、心臓移植、または発作後のＣＮＳにおける虚血性再灌流障害後
の心臓血管の虚血性再灌流障害；（ｂ）進行した冠動脈アテローム硬化プラーク
の進行および破裂；（ｃ）うっ血性心不全の発症および進行；（ｄ）バルーン血
管形成術後の内皮細胞傷害；および（ｅ）心筋細胞のアポトーシス性細胞死から
なる群より選択される心臓血管疾患である。

【００２４】本発明のなお別の実施形態において、ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体をコード
するＤＮＡ配列が提供される。

【００２５】本発明の別の局面は、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得るＴＲＡＦ２ＴＲ／２Ｔ
Ｄ改変体ポリペプチドを提供する。

【００２６】本発明は、これらの疾患状態（すなわち、ＴＮＦαシグナル伝達）に一般的で
ある初期のイベントを妨害する天然に存在するタンパク質の改変体を使用して、
広範な種々の疾患状態を処置し得る利点を提供する。

【００２７】（発明の詳細な説明）本明細書以下では、本明細書において使用される用語の定義および本発明の好
ましい実施形態の説明を示す。

【００２８】（定義）「クローニングベクター」は、別のＤＮＡセグメントが、付着されたセグメン
トの複製を生じるように、付着され得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファ
ージまたはコスミド）である。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自己
ユニットとして機能する（すなわち、それ自身の制御下で複製し得る）任意の遺
伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。クローニン
グベクターは、１つの細胞型における複製および別の細胞において発現が可能で
あり得る（「シャトルベクター」）。本発明の好ましい実施形態において、クロ
ーニングベクターは、宿主細胞における発現が可能であり、そして「発現ベクタ
ー」は、ＴＲＡＦ２ＴＲまたはＴＲＡＦ２ＴＤを、細胞中でＴＮＦα調節性経路
を妨害するのに充分なレベルで発現し得る。

【００２９】「カセット」は、１つ以上の特異的制限部位でベクター中に挿入され得るＤＮ
Ａのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードし
、そしてカセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切なリーディン
グフレームにおけるそのカセットの挿入を確実にするために設計される。

【００３０】細胞は、外因性または異種のＤＮＡによって、そのようなＤＮＡがその細胞の
中に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。細胞は、トランス
フェクトされたＤＮＡが表現型変化をもたらす場合、外因性または異種のＤＮＡ
によって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、その細胞のゲノムを形成
している染色体ＤＮＡ中に（共有結合されて）組み込まれ得る。

【００３１】「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、
またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシ
アデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン
；「ＤＮＡ分子」）の、またはこれらの任意のリン酸エステルアナログ（例えば
、ホスホロチオエートおよびチオエステル）の、一本鎖形態または二本鎖へリッ
クスのいずれかのリン酸エステルポリマー形態をいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスが可能である。用語「核酸分
子」および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、その分子の一次および二次構造のみ
をいい、そしてそれは任意の特定の三次形態に限定されない。したがって、この
用語は、とりわけ、直線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）
、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の構造を議論するにおいて、配列は、本明細書において、ＤＮＡの転写
されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３
’の方向にのみ与えられるという通常の約束に従って、記載され得る。「組換え
ＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を経たＤＮＡ分子である。

【００３２】核酸分子は、一本鎖形態の核酸分子が、温度および溶液イオン強度の適切な条
件下で（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照）、他の核酸分子にアニールし得る場
合、別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）に「ハイ
ブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーシ
ョンの「ストリンジェンシー」を決定する。ハイブリダイゼーションは、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基間でミスマッチが可能で
あるが、２つの核酸が相補配列を含有することを必要とする。核酸をハイブリダ
イズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、
当該分野で公知の変数に依存する。

【００３３】本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一般に、少なくとも１８
ヌクレオチドであり、ＴＲＡＦ２をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子
、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる核酸をいう。オリゴヌ
クレオチドは、例えば、³²Ｐ−ヌクレオチドまたは標識（例えば、ビオチン）が
共有結合したヌクレオチドで標識され得る。１つの実施形態において、標識され
たオリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＦ２をコードする核酸の存在を検出するための
プローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは（
その１つまたは両方が標識され得る）は、ＴＲＡＦ２の全長またはフラグメント
をクローニングするため、またはＴＲＡＦ２をコードする核酸の存在を検出する
ためのいずれかのためのＰＣＲプライマーとして使用され得る。更なる実施形態
において、オリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＦ２ＤＮＡ分子を有する３重へリッ
クスを形成し得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、核酸合成機に
おいて合成的に調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、天然に生じな
いホスホエステルアナログ結合（例えば、チオエステル結合など）を有して調製
され得る。

【００３４】ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下におかれた場合、細胞にお
いて、インビトロまたはインビボで、転写され、そしてポリペプチドに翻訳され
る二重鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡコード配列および適切な調節配列は、好まし
くは、発現ベクターにおいて提供される。コード配列の境界は、５’（アミノ）
末端で開始コドンによって、および３’（カルボキシル）末端で翻訳終結コドン
によって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃ
ＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および
さらに合成ＤＮＡ配列を含み得るがこれらに限定されない。コード配列が、真核
生物細胞中で発現されることが意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび
転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置される。

【００３５】転写および翻訳の制御配列は、宿主においてコード配列の発現を提供するＤＮ
Ａ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター）で
ある。真核生物細胞において、原核生物シグナルは、調節配列である。

【００３６】「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そし
て下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本
発明を規定する目的で、そのプロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位
によって結合し、そして上流（５’方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて
検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメント
を包含する。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１
を用いてマップすることによって都合良く規定される）、さらにＲＮＡポリメラ
ーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。

【００３７】コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ中に転写する場合
、細胞中で転写および翻訳の調節配列の「制御下」にある。ｍＲＮＡは、次いで
、スプライスされ（もしコード配列がイントロンを包含する場合）、そしてその
コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される。

【００３８】本明細書において使用される場合、用語「相同な」は、「共通の進化の起源」
を有するタンパク質間の関係をいう。このようなタンパク質（およびそれらのコ
ード遺伝子）は、それらの高度の配列類似性によって反映されるように、配列相
同性を有する。用語「配列類似性」は、共通の進化の起源を有し得るか有さない
かもしれないタンパク質の核酸間またはアミノ酸配列間の同一性または対応性の
程度をいう。しかし、一般的に使用されそして本明細書にて使用されるように、
用語「相同な」は、「高度に」の様な副詞によって修飾された場合、配列の類似
性をいい、共通の進化的起源をいわないこともあり得る。

【００３９】用語「ＴＮＦα調節性経路」および関連する用語は、腫瘍壊死因子レセプター
ファミリー（ＴＮＦＲ）のメンバーに対するＴＮＦαの結合に関与するシグナル
伝達経路をいう。

【００４０】用語「対応する」は、本明細書中で使用される場合、正確な位置が、類似性ま
たは相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なる、類似または相同な配
列をいう。核酸またはアミノ酸配列アラインメントは、スペースを含み得る。し
たがって、用語「に対応する」は、配列類似性をいい、そしてアミノ酸残基また
はヌクレオチド塩基の番号付けをいわない。

【００４１】用語「スプライス改変体」とは、遺伝子の全長ｍＲＮＡに対して１つ以上の欠
失を含有するｍＲＮＡを生じる遺伝子によってコードされる全長ｍＲＮＡの選択
的プロセシングによって産生されるｍＲＮＡによってコードされるポリペプチド
をいう。

【００４２】（本発明の実施形態）本発明は、ＴＲＡＦ２の２つの改変体に関し、それらはＴＮＦαシグナル伝達
経路を阻害する。１つの実施形態は、ＴＲＡＲ２のＲＮＡプロセシングスプライ
ス改変体であり、本明細書中で「ＴＲＡＦ２短縮型」または「ＴＲＡＦ２ＴＲ」
と呼ばれる。別の実施形態は、ＴＲＡＦ２ＴＲに相対的なアミノ酸残基１〜８７
の欠失を有するＴＲＡＦ２基づき、そして「ＴＲＡＦ２短縮欠失型」または「Ｔ
ＲＡＦ２ＴＤ」と言われる。ＴＲＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤの両方は、Ｔ
ＮＦαシグナル伝達経路を阻害する能力を有する。ＴＲＡＦ２ＴＤは、特に好ま
しい実施形態である。ＴＮＦα結合に対する応答を劇的に減少するその能力のた
めにである。

【００４３】本明細書中で、これらの２つの実施形態に構造の記載があり、これらの実施形
態の調製方法の議論が続く。

【００４４】（ＴＲＡＦ２ＴＲ実施形態の構造および調製）このスプライス改変体についてのｃＤＮＡ配列は、図２ａに提示され、そして
アミノ酸配列は、図２ｂに提示される。ＴＲＡＦ２ＴＡを概略的に示す図１を参
照すると、欠失は、ＴＲＡＦ２ＦＬのアミノ酸残記載１２３〜２０１を除去する
ことが理解され得、Ｚｎフィンガードメイン１のＣ末端部分およびＺｎフィンガ
ー２および３のすべて、ならびにＺｎフィンガー４のＮ末端残基を含む。

【００４５】本発明のＴＲＡＦ２ＴＲ実施形態は、任意の適切な方法によって調製され得、
これらの方法は、当業者に公知の種々の方法を含む。ＤＮＡの単離、クローニン
グおよび配列決定の教示は、種々の出所において見出され得る。当業者にとって
、一般的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術は、文献に十分に説明
される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｓｔｓ，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９’’」）；ＤＮＡＣｌｏ
ｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ
．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ編（１９８５）］ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編（１９８４）］；
ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１
９８６）］；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ［Ｉ
ＲＬＰｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａ
ｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ
．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ
，Ｉｎｃ、（１９９４）を参照のこと。

【００４６】ＴＲＡＦ２ＴＲのＤＮＡ配列およびｃＤＮＡを得るための当該分野で公知の方
法についての本明細書中に記載される情報を考慮すると、ＴＲＡＦ２ＴＲおよび
ＴＲＡＦ２ＴＤをコードするヌクレオチド配列は、野生型ＴＲＡＦ２から容易に
クローン化され得るか、または調製され得、そしてこれらのタンパク質をインビ
トロまたはインビボで発現するための適切なベクターに挿入され得る。ｃＤＮＡ
のクローニングおよび発現ベクターに関する方法の記載については、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと。

【００４７】ＴＲＡＦ２をコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのどちらか）は
、ヒトゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーより単離され得る。本明
細書中に提示されるＤＮＡ配列を情報与えられた遺伝子を得るための方法は、当
該分野で周知である。ＴＲＡＦ２ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例えば
、ＤＮＡ「ライブラリー」）より、当該分野で公知の標準手順によって得られ得
る。好ましくは、タンパク質の高レベルの発現を有する組織から調製されるｃＤ
ＮＡライブラリーより得られる（例えば、リンパ由来の細胞、特にＢ細胞または
骨肉腫細胞株、例えばＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ２ＴＲの高レベルの発現を示す
ヒト骨肉腫ＳＡＯＳ−２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８５））。ＤＮＡはまた、所望
の細胞から精製されたゲノムＤＮＡ、またはそのフラグメントのクローニングに
よって（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら；１９８９、前出；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ
．（編）、１９８５、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐ
ｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬＰｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．第Ｉ、
ＩＩ巻を参照のこと）、または化学合成によって得られ得る。ゲノムＤＮＡに由
来するクローンは、コード領域に加えて、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含
み得る；ｃＤＮＡに由来するクローンは、イントロン配列を含まない。本発明が
、全長ＴＲＡＦ２のスプライス改変体（ＴＲＡＦ２ＴＲ）の単離に部分的に基づ
くことを考慮すると、ＴＲＡＦ２ＴＲ配列をコードするｃＤＮＡを得ることが望
ましい。

【００４８】ｃＤＮＡを得るための方法は、当該分野で周知である。簡単には、これらの方
法としては、真核生物細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の混合物を単
離し、そして一連の酵素学的反応を使用し、単離されたｍＲＮＡに相補的な２重
鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を合成することが挙げられる。

【００４９】本明細書中の実施例１に提示されるように、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）クローニングが、ＴＲＡＦ２ＴＲスプライス改変体を含むｃＤＮＡ
を単離するに有効な方法であることが見出されている。ＲＴ−ＰＣＲは、酵素逆
転写酵素を用いる細胞ｍＲＮＡの逆転写、続いて生じたＤＮＡ産物をＰＣＲを使
用する増幅に供することを含む。

【００５０】所望のｃＤＮＡを得るために使用される方法に関係なく、２重鎖ｃＤＮＡ混合
物は、多くの公知の技術の任意の１つによってクローニングビヒクルに挿入され
る。この技術は、使用される特定のビヒクルの少なくとも１部に依存する。Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，１６−１８（１９８０）、な
らびにＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出に、種々の挿入方法が、非常に詳細
に議論される。

【００５１】一旦、ＤＮＡセグメントが、クローニングビヒクルの挿入されると、クローニ
ングビヒクルは、適切な宿主の形質転換に使用される。通常、これらのクローニ
ングビヒクルは、宿主に抗生物質耐性形質を与える。このような宿主は、一般的
に、原核生物細胞であり、宿主細胞のほんのわずかが所望のＤＮＡを含む。トラ
ンスフェクトされた宿主細胞は、遺伝子「ライブラリー」を構成し、ｍＲＮＡが
単離された細胞内に存在するｍＲＮＡの代表的なサンプルを提供する。

【００５２】本明細書中に提供されるＴＲＡＦ２についての配列情報を考慮すると、適切な
オリゴヌクレオチド配列が調製され得、好ましくは上記のように合成され得、そ
してＴＲＡＦ２配列を含むクローンを同定するため使用され得る。ＴＲＡＦ２配
列を含むクローンを同定するために、形質転換された個体または形質転換された
細胞は、コロニーとして、ニトロセルロースフィルターペーパー上で増殖される
。コロニーは溶解され、そしてＤＮＡは、加熱することによってフィルターペー
パーに固く結合される。次いで、フィルターペーパーを、ＴＲＡＦ２に相補的な
標識されたオリゴヌクレオチドプローブとインキュベートした。ＴＲＡＦ２に実
質的に相同なＤＮＡフラグメントは、プローブにハイブリダイズする。相同性の
程度が高くなるにつれて、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
が使用され得る。

【００５３】プローブは、相補的なｃＤＮＡにハイブリダイズする。それは、プローブの存
在を同定するオートラジオグラフィーまたは化学反応によって同定され得る。対
応するクローンは特徴付けられ、クローンの１つまたは組み合わせを同定する。
それらのクローンは、所望のタンパク質についての構造的情報のすべてを含む。
目的のタンパク質をコードする核酸配列は単離され、そして発現ベクター内に再
び挿入される。発現ベクターは、ｄｓ−ｃＤＮＡの効率的な発現（転写および翻
訳）を可能にする特定の原核生物または真核生物コントロールエレメントの制御
コントロール下でクローン化された遺伝子を有する。

【００５４】さらなる選択が、遺伝子の特性に基礎について行われ得る。例えば、等電の、
電気泳動のアミノ酸組成物または本明細書中に開示されるＴＲＡＦ２タンパク質
の部分的なアミノ酸発現を有するタンパク質産物を、遺伝子がコードする場合、
従って、遺伝子の存在が検出され得る。その発現された産物の物理的、化学的、
または免疫学的特性に基づいたアッセイによって、検出され得る。例えば、ｃＤ
ＮＡクローン、またはＤＮＡクローンは、タンパク質を産生するクローンが選択
され得る。このタンパク質は、電気泳動移動、等電点電気泳動、非平衡ｐＨゲル
電気泳動、タンパク質分解消化、または抗原性に関してＴＲＡＦ２ＴＲと類似ま
たは同じ特性を有する。

【００５５】（ＴＲＡＦ２ＴＤ実施形態の構造および調製）ＴＲＡＦ２ＴＲに関連して、ＴＲＡＦ２ＴＤは、アミノ酸１〜８７およびこれ
らのアミノ酸をコードする対応するヌクレオチドの欠失を有する。ＴＲＡＦ２Ｔ
ＤについてのＤＮＡ配列は、図３ａに提示され、そしてアミノ酸配列は、図３ｂ
に提示される。

【００５６】任意の適切な方法が、ＴＲＡＦ２ＴＤ実施形態を調製するために使用され得、
例えば、上記の情報に基づく種々の方法を含む。特に、アミノ酸１〜８７の欠失
を含むＴＲＡＦ２ＴＲの短縮型バージョンを作製するための多くの方法が存在す
る。調製の好ましい方法において、ＴＲＡＦ２ＴＲｃＤＮＡは、ＴＲＡＦ２全
長コード配列（ＡＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴ、ここでＡＴＧコ
ドンは、翻訳開始部位を作製するために含まれた）のヌクレオチド２６２〜２８
０を含む５’プライマー；を使用するＰＣＲの鋳型として使用される；３’プラ
イマーは、ＴＴＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣであった
。生じた構築物は、全長ＴＲＡＦ２のアミノ酸８８で始まり、そしてＴＲＡＦ２
ＴＲの１２３〜２０１のアミノ酸欠損を有する。

【００５７】ＴＲＡＦ２ＴＲのさらなる改変体は、ＴＲＡＦ２ＴＤの調製について上記の方
法のような方法を使用して調製され得る。

【００５８】（ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体）本発明は、その範囲内に、対立形質改変体、置換体、付加および欠失変異改変
体、アナログ、およびＴＲＡＦ２ＴＲまたはＴＲＡＦ２ＴＤの誘導体（本明細書
で、「ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体」と呼ばれる）およびＴＲＡＦ２ＴＲと同
じかまたは相同な機能的活性を有する他の種由来の相同体を含む。好ましい実施
形態において、ＴＮＦαシグナル伝達経路を阻害する能力を増加する欠失または
置換を有する遺伝子は、本発明の実行において利用される。ＴＲＡＦ２ＴＲ／２
ＴＤ改変体の調製または単離は、本発明の範囲内である。従って、本発明の範囲
は、機能的に活性な（すなわち、ＴＲＡＦ２ＴＲと関連した１以上の機能的活性
を示し得る）ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体を含む。

【００５９】ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体は、機能的に等価な分子を提供する、置換、付
加または欠失による核酸配列のコード化を変化させることによって、作製され得
る。好ましくは、ＴＲＡＦ２ＴＲまたはＴＲＡＦ２ＴＤに関連して、増大したま
たは増加した機能的活性を有するＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ実施形態が形成される
。

【００６０】ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、ＴＲＡＦ２ＴＲと実質的に同じア
ミノ酸配列（１つのアミノ酸改変体を含むアミノ酸配列を含む）をコードする他
のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使用され得る。このような配列としては
、対立遺伝子、他の種由来の相同性遺伝子、および配列内で同じアミノ酸残基を
コードする異なるコドンの置換によって変化し、従って、サイレントな変化を生
じる、ＴＲＡＦ２ＴＲのすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列が挙げられる
が、これらに限定されない。同様に、本発明のＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体と
しては、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基を配列内の残基
について置換され、保存的アミノ酸置換を生じる変化した配列を含む、ＴＲＡＦ
２ＴＲタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む配列が挙げられるが
、これらに限定されない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、類似の
極性の別のアミノ酸で置換し得、この別のアミノ酸は、機能的等価物として作用
し、サイレントな変化を生じる。配列内のアミノ酸についての置換は、アミノ酸
が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）ア
ミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。芳香族環構造を
含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極
性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸
としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）
アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このよう
な変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点電気泳動によって決定
されるような、見かけの分子量に影響を及ぼすことは予期されない。

【００６１】特に好ましい置換は以下の通りである： −ＬｙｓをＡｒｇで置換、そして逆もまた同様である。その結果、正電荷が維
持され得る； −ＧｌｕをＡｓｐで置換、そして逆もまた同様である。その結果、負電荷が維
持され得る； −ＳｅｒをＴｈｒで置換。その結果、遊離の−ＯＨが維持され得る；および −ＧｌｎをＡｓｎで置換。その結果、遊離のＣＯＮＨ₂が維持され得る。

【００６２】アミノ酸置換がまた導入されて、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換し
得る。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとジスルフィド架橋する可能性のある部位
を導入され得る。Ｈｉｓは、特に、「触媒」部位として導入され得る（すなわち
、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用し得、そして生化学的触媒において最も共
通のアミノ酸である）。Ｐｒｏは、その特に平面構造のために、導入され得、こ
の構造は、タンパク質の構造にβターンを誘導する。

【００６３】本発明のＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体をコードする遺伝子は、当該分野で公
知の種々の方法によって産生され得る。その産生を生じる操作は、遺伝子レベル
またはタンパク質レベルで生じ得る。例えば、クローニングされたＴＲＡＦ２遺
伝子配列は、当該分野で公知の多数の戦略のいずれかによって改変され得る（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出）。この配列は、制限エンドヌクレアーゼを
用いて適切な部位で切断され得、その後、さらなる酵素的改変が行われ、所望で
あれば、インビトロで単離され、そして連結される。ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ実
施形態をコードする遺伝子の産生において、改変された遺伝子が、所望の活性が
コードされる場合の遺伝子領域において、翻訳停止シグナルによって遮断されな
いＴＲＡＦ２ＴＲ遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内に維持することを確
実にすることに注意するべきである。

【００６４】さらに、ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤをコードする核酸配列は、インビトロまたは
インビボで変異し得、翻訳配列、開始配列および／もしくは終結配列を作製およ
び／もしくは破壊するか、または、コード領域に変異を作製し、ならびに／ある
いは新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、または既存の制限エンド
ヌクレアーゼ部位を破壊し、インビトロでの改変をさらに容易にする。好ましく
は、このような変異は、変異したＴＲＡＦ２ＴＲ遺伝子産物の機能的活性を増大
する。当該分野で公知の変異誘発のための任意の技術（インビトロ部位特異的変
異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．，ら、１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５３：６５５１；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９８４，ＤＮＡ３：
４７９−４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６，Ｇｅｎｅ４４：１７７；Ｈ
ｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．８３：７１０）、「ＴＡＢ」リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用
などを含むが、これらに限定されない）が使用され得る。ＰＣＲ技術は、部位特
異的変異誘発に好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「ＵｓｉｎｇＰＣＲ
ｔｏＥｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡ」ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，第
６章、６１−７０頁を参照のこと）。

【００６５】続く議論は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡの操作および発現に関し
、ＴＲＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤの両方ならびにＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ
改変体に共通である。

【００６６】（クローニング／発現ベクターへのＴＲＡＦ２ＴＲ、ＴＲＡＦ２ＴＤおよびＴ
ＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体のクローニング）同定され、そして単離されたＤＮＡ配列は、適切なクローニング／発現ベクタ
ー（以下、「ベクター」）に挿入されて、タンパク質の配列または発現に対する
改変を容易にし得る。これらのベクターは、代表的に、マルチクローニング部位
（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）、プロモーター、宿主細胞に
おける複製を容易にする配列、および選択マーカーを含む。

【００６７】任意の適切なベクターが使用され得る。当該分野で公知の多くのベクターが存
在する。使用され得るベクターの例としては、プラスミドまたは改変ウイルスが
挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、代表的には、ベクターが導
入されて、ベクターの複製およびコードされたタンパク質の発現を容易にする所
定の宿主細胞に適合する。所定のベクターへのＤＮＡ配列の挿入は、例えば、相
補的付着末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡフラグメントの連結によ
って果たされ得る。しかし、ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部
位が、クローニングベクター内に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端が、酵素学
的に改変され得る。あるいは、所望される任意の部位が、ＤＮＡ末端上へのヌク
レオチド配列（リンカー）の連結によって生成され得る；これらの連結されたリ
ンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学的に合成
されたオリゴヌクレオチドを含み得る。有用なベクターは、染色体ＤＮＡ配列の
セグメント、非染色体ＤＮＡ配列のセグメントおよび合成ＤＮＡ配列のセグメン
トからなり得る。本発明の実施に有用な特定のベクターの例としては、以下が挙
げられるがこれらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージ（例えば、
ラムダ誘導体）またはプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣ
プラスミド誘導体（例えば、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ、ＳＶ４０の誘導体およ
び公知の細菌性プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドであるｃｏｌＥ１
、ｐＣＲ１、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、１９８８，Ｇ
ｅｎｅ６７：３１−４０）ｐＭＢ９およびそれらの誘導体）、ＲＰ４のような
プラスミド）））；ファージＤＮＡ（例えば、ファージ１の多数の誘導体（例え
ば、ＮＭ９８９および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および線維状一本鎖
ファージＤＮＡ）））；酵母ベクター（例えば、２μｍプラスミドまたはその誘
導体）；真核生物細胞に有用なベクター（例えば、バキュロウイルスベクターの
ような昆虫細胞に有用なベクター、哺乳動物細胞に有用なベクター）；プラスミ
ドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター；改変されて、ファー
ジＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するプラスミド；など。

【００６８】本発明に従って使用され得る酵母ベクターとしては、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない：非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩクローニング部位、Ｓ
ｐｈＩクローニング部位、ＳｈｏＩクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング部
位、ＧｓｔＸＩクローニング部位、ＥｃｏＲＩクローニング部位、ＢｓｔＸＩク
ローニング部位、ＢａｍＨ１クローニング部位、ＳａｃＩクローニング部位、Ｋ
ｐｎ１クローニング部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩクローニング部位、
ＳｐｈＩクローニング部位、ＳｈｏＩクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング
部位、ＢｓｔＸＩクローニング部位、ＥｃｏＲＩクローニング部位、ＢａｍＨ１
クローニング部位、ＳａｃＩクローニング部位、ＫｐｎＩクローニング部位およ
びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製され、そ
してエンテロキナーゼを用いて切断された、Ｎ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）。

【００６９】本発明の実施において使用され得るバキュロウイルスベクターとしては、種々
のベクター（非融合伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ベクター（例えば、ｐＶＬ９４１
（ＢａｍＨ１クローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ
１クローニング部位、ＳｍａＩクローニング部位、ＸｂａＩクローニング部位、
ＥｃｏＲ１クローニング部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＸｍａＩＩＩクロー
ニング部位、ＢｇｌＩＩクローニング部位およびＰｓｔＩクローニング部位；Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩクローニング部位、Ｐｓｔ
Ｉクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＸｍａＩＩＩクローニング部
位、ＥｃｏＲＩクローニング部位、ＸｂａＩクローニング部位、ＳｍａＩクロー
ニング部位およびＢａｍＨ１クローニング部位；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨ１クローニング部位、
ＢｇｌＩＩクローニング部位、ＰｓｔＩクローニング部位、ＮｃｏＩクローニン
グ部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青色／白色組換えスクリーニン
グを有し得る；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ならびに融合移入ベクター（例えば
、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１クローニング部位およびＫｐｎＩクローニング部位
であって、ＢａｍＨ１認識部位が、開始コドンから始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、
ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じであり、異なるリーディ
ングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの３６塩基対
下流のＢａｍＨ１クローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））および
ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３つの異なるリーディングフレームであっ
て、ＢａｍＨ１クローニング部位、ＢｇｌＩＩクローニング部位、ＰｓｔＩクロ
ーニング部位、ＮｃｏＩクローニング部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部
位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、ならびにプラークの青色／白
色組換えスクリーニングを有する；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方を含む））が
挙げられ、使用され得る。

【００７０】本発明における使用が意図される哺乳動物ベクターとしては、例えば以下が挙
げられる：誘導性プロモーター（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ
）プロモーター）を有するベクター（例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターまたはＤＨ
ＦＲ／メトトレキサート同時増幅ベクター（例えば、ｐＥＤ（ＰｓｔＩクローニ
ング部位、ＳａｌＩクローニング部位、ＳｂａＩクローニング部位、ＳｍａＩク
ローニング部位およびＥｃｏＲＩクローニング部位であって、クローニングされ
た遺伝子およびＤＨＦＲの両方を発現するベクターを有する；Ｋａｕｆｍａｎ，
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ，１６．１２（１９９１）を参照のこと）を有する任意の発現ベクター））
を有するベクター。あるいは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシ
イミン同時増幅ベクター（例えば、ｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部
位、ＸｂａＩクローニング部位、ＳｍａＩクローニング部位、ＳｂａＩクローニ
ング部位、ＥｃｏＲＩクローニング部位およびＢｃｌＩクローニング部位であっ
て、ベクターが、グルタミンシンテターゼおよびクローニングされた遺伝子を発
現する；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）。別の実施形態において、ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒ
ｒＶｉｒｕｓ（ＥＢＶ）の制御下でエピソーム発現を指向するベクター（例え
ば、ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１クローニング部位、ＳｆｉＩクローニング部位、Ｘ
ｈｏＩクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＮｈｅＩクローニング部
位、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＮｈｅＩクローニング部位、ＰｖｕＩＩ
クローニング部位およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ラウス肉腫ウイルス
の長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、ハイグロマイシン選択マ
ーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨ１クローニング部位、
ＳｆｉＩクローニング部位、ＸｈｏＩクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング
部位、ＮｈｅＩクローニング部位、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＮｈｅＩ
クローニング部位、ＰｖｕＩＩクローニング部位およびＫｐｎＩクローニング部
位、構成的ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極初期遺伝子、ハイグロマイ
シン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩクローニン
グ部位、ＰｖｕＩクローニング部位、ＮｈｅＩクローニング部位、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉクローニング部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＸｈｏＩクローニング部位、
ＳｆｉＩクローニング部位、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導性メタロチオネ
インＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨ１クローニング部位、ＸｈｏＩクローニング
部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＮｈｅＩ
クローニング部位およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ
ー、ヒスチジノール選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐ
ｎＩクローニング部位、ＮｈｅＩクローニング部位、ＨｉｎｄＩＩＩクローニン
グ部位、ＮｏｔＩクローニング部位、ＸｈｏＩクローニング部位、ＳｆｉＩクロ
ーニング部位およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター
、Ｇ４１８選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳ
Ｖ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂
を介して精製可能であり、そしてエンテロキナーゼによって切断されるＮ末端ペ
プチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が使用され得る。本発明の使用のための選択
可能な哺乳動物発現ベクターはとしては以下が挙げられる：ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈ
ｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＢｓｔＸＩクローニング部位、ＮｏｔＩクロー
ニング部位、ＳｂａＩクローニング部位およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４
１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩクローニ
ング部位、ＳｐｅＩクローニング部位、ＢｓｔＸＩクローニング部位、ＮｏｔＩ
クローニング部位、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＫｐｎＩクローニ
ング部位、ＢａｍＨＩクローニング部位、ＢｓｔＸＩクローニング部位、Ｅｃｏ
ＲＩクローニング部位、ＥｃｏＲＶクローニング部位、ＢｓｔＸＩクローニング
部位（反復）、ＮｏｔＩクローニング部位、ＸｈｏＩクローニング部位、Ｘｂａ
Ｉクローニング部位、ＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８アンピシリン選択；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など。本発明に従う使用のためのワクシニアウイルス哺
乳動物発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１、前出を参照のこと）としては
、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニン
グ部位、ＴＫ−ｇａｌおよびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩクロー
ニング部位、ＳｍａＩクローニング部位、ＡｆｌＩクローニング部位、ＮａｒＩ
クローニング部位、ＢｓｐＭＩＩクローニング部位、ＢａｍＨＩクローニング部
位、ＡｐａＩクローニング部位、ＮｈｅＩクローニング部位、ＳａｃＩＩクロー
ニング部位、ＫｐｎＩクローニング部位およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位
；ＴＫ−ｇａｌおよびβ−ｇａｌ選択）ならびにｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲ
Ｉクローニング部位、ＰｓｔＩクローニング部位、ＳａｌＩクローニング部位、
ＡｃｃＩクローニング部位、ＨｉｎｄＩＩクローニング部位、ＳｂａＩクローニ
ング部位、ＢａｍＨＩクローニング部位およびＨｐａクローニング部位、ＴＫま
たはＸＰＲＴ選択）。

【００７１】種々の方法が使用されて、ＴＲＡＦ２ＴＲ、ＴＲＡＦ２ＴＤまたはＴＲＡＦ２
ＴＲ／２ＴＤ改変体をコードする所望のＤＮＡ配列が、ベクターにクローニング
されたことを確認し得る。一般的に、１つ以上の以下のアプローチが使用される
：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特定のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核
酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在または非存在
、（ｄ）適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた分析、および（ｅ）挿入配列の
発現。第一のアプローチにおいて、核酸がＰＣＲによって増幅されて、増幅産物
の検出を提供し得る。第二のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外
来遺伝子の存在が、挿入されたマーカー遺伝子に相同な配列を含むプローブを使
用して、核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第三のアプローチ
において、組換えベクター／宿主系が、ベクターへの外来遺伝子の挿入によって
引き起こされる特定の「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、βガラクトシダー
ゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗体への耐性、形質転換表現型、バキュロウイ
ルスにおける閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）形成など）の存在または
非存在に基づいて同定され得そして選択され得る。別の例において、ＴＲＡＦ２
ＴＲをコードする核酸が、ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入され
る場合、ＴＲＡＦ２ＴＲ挿入物を含む組換え体は、選択マーカーの遺伝子機能の
非存在によって同定され得る。第四のアプローチにおいて、組換え発現ベクター
は、適切な制限酵素を用いて消化することによって同定される。第四のアプロー
チにおいて、発現されたタンパク質が、機能的に活性な立体配座をとるならば、
組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される遺伝子産物の、活性、生化
学的特徴または免疫学的特徴についてのアッセイによって同定され得る。

【００７２】（プロモーター）ＴＲＡＦ２ＴＲまたはＴＲＡＦ２ＴＤあるいはそのＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改
変体をコードするヌクレオチド配列は、挿入されたタンパク質コード配列の転写
および翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクターに挿入され得る。このような
エレメントを、本明細書中で「プロモーター」と呼ぶ。従って、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸は、本発明の発現ベクターにおけるプロモーターと操作
上結合する。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が、このような調節配列の制御下
でクローニングされ得、そして発現され得る。発現ベクターはまた、好ましくは
、複製起点を含む。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベク
ター上に提供され得るか、あるいはこれらのシグナルは、ＴＲＡＦ２および／ま
たはその隣接領域をコードするネイティブ遺伝子によって供給され得る。クロー
ニングベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入について以前に記載された方法の
いずれかを使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルならびにタンパク質コード
配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、
インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビボ組換え（遺伝的組換
え）が挙げられ得る。

【００７３】発現は、当該分野において公知の任意のプロモーターエレメント／エンハンサ
ーエレメントによって制御され得る。しかし、これらの制御エレメントは、発現
のために選択された宿主において機能的でなければならない。ＴＲＡＦ２ＴＲ遺
伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、いかが挙げられ
るがそれらに限定されない：ｔＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓ
ｔａｎｄＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１
０）、ラウス肉腫ウイルスの３１長末端反復プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ、
ｅｔａｌ．、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）．、ヘルペスチミ
ジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、１９８１、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ．Ｓ，Ａ、７８：１４４１−１４４５）、メ
タロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒｅｔａｌ．、１９８２
、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（例えば、βラク
タマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ、ｅｔａｌ．、１９７
８、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．Ｕ，Ｓ，Ａ，、７５：３７２７−
３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ、ｅｔａｌ．、１９８
３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−５
２５）；以下もまた参照のこと：「Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍ
−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ，、ｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４；例えば以下のような酵母
または他の真菌からのプロモーターエレメント：Ｇａｌ４プロモーター、Ａ
ＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロキ
ナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および動物の転
写制御領域（これは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物におい
て利用されている）；エラスターゼＩ遺伝子制御領域（これは、膵臓細胞におい
て活性である）（Ｓｗｉｆｔｅｔａｌ．、１９８４、Ｃｅｌｌ３８：６３
９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚｅｔａｌ．、１９８６、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ．、５０：３９９−４０９；
ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５−５１５）
；インスリン遺伝子制御領域（これは、膵臓β細胞において活性である）（Ｈａ
ｎａｈａｎ，，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）、免疫グロ
ブリン遺伝子制御領域（これは、リンパ細胞において活性である）（Ｇｒｏｓｓ
ｃｈｅｄｌｅｔａｌ．、１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７−６５８；Ａｄ
ａｍｅｓｅｔａｌ．、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８；
Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，
、７：１４３６−１４４４）、マウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（これは、精巣
、乳房、リンパ細胞およびマスト細胞において活性である）（Ｌｅｄｅｒｅｔ
ａｌ．，１９８６ｆＣｅｌｌ４５：４８５−４９５）、アルブミン−遺伝
子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｐｉｎｋｅｒｔｅｔａｌ
．、１９８７、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ，１：２６８−２７６）、α−
フェトタンパク質遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｋｒｕ
ｍｌａｕｆｅｔａｌ．、１９８５、Ｍｏｌ、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１
６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒｅｔａｌ．、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３５：５３−５８）、αアンチトリプシン遺伝子制御領域（これは、肝臓にお
いて活性である）（Ｋｅｌｓｅｙｅｔａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅｓａｎ
ｄＤｅｖｅｌ，、１：１６１−１７１）、β−グロビン遺伝子制御領域（これ
は、骨髄細胞において活性である）（Ｍｏｇｒａｍｅｔａｌ．，、１９８５
，、Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓｅｔａｌ．、
１９８６、Ｃｅｌｌ４６：８９−９４）、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制
御領域（これは、脳内の希突起膠細胞において活性である）（Ｒｅａｄｈｅａｄ
ｅｔａｌ．、１９８７、Ｃｅｌｌ４８：７０３−７１２）、ミオシン軽鎖
−２遺伝子制御領域（これは、骨格筋において活性である）（Ｓａｎｉ、１９８
５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）、ならびに性腺刺激放出ホルモン
遺伝子制御領域（これは、視床下部において活性である）（Ｍａｓｏｎｅｔ
ａｌ．、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）。

【００７４】（宿主細胞へのベクターの導入）ベクターを宿主細胞へ、以下を含む任意の適切な方法によって導入し得る：例
えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクシ
ョン、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リ
ポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタート
ランスポーター（例えば、以下を参照のこと：Ｗｕｅｔａｌ．、１９９２、
ＬＴ．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ．２６７．９６３−９６７；ＷｕａｎｄＷｕ、１
９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔ
ｍｕｔｅｔａｌ．、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号（１９９０年３
月１日出願）。その結果、多くのコピー数の遺伝子配列が生成される。好ましく
は、クローニングされた遺伝子は、シャトルベクタープラスミドに含まれる。こ
れは、クローニング細胞において拡張される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）。そして
、これは、適切な発現細胞株への次の挿入のための精製を容易にする。例えば、
シャトルベクター（これは、１つ超える型の生物において複製し得るベクターで
ある）は、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドからの配列を酵母２μｍプラスミドからの配
列と連結することによって、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方における複製のために調製され得る。

【００７５】（宿主細胞系）潜在的な宿主細胞系としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ウイ
ルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物
宿主細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫宿主細胞系
；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；またはバクテリオファージＤＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌。ベクターの発
現エレメントは、その強度および特異性を変動する。利用される宿主系に依存し
て、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれかが使用され得
る。

【００７６】さらに、挿入される配列の発現を調節するか、または所望の特性の様式で遺伝
子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。異なる宿主細
胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変についての特徴
および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現される
外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にし得る。酵母における
発現は、生物学的に活性な産物を生成し得る。真核生物における発現は、「ネイ
ティブ」の折り畳みの確立を増加させ得る。さらに、哺乳動物細胞における発現
は、ＴＲＡＦ２ＴＲインヒビター活性の再構成または構成のためのツールを提供
し得る。さらに、異なるベクター／宿主の発現系は、プロセシング反応に影響を
与え得る（例えば、異なる程度でのタンパク質加水分解の開裂）。本発明の発現
ベクターは、ともに、上記に指摘するように使用されて、ＴＲＡＦ２ＴＲ活性の
調節因子のスクリーニングまたは生物学的試験のための細胞をトランスフェクト
させ得る。

【００７７】本発明の組換えＴＲＡＦ２ＴＲ、ＴＲＡＦ２ＴＤまたはＴＲＡＦ２ＴＲ／２Ｔ
Ｄの改変体は、コード配列の組換えによる組込みの後に染色体で発現され得る。
この点において、多数の増殖系のいずれかを用いて高レベルの安定な遺伝子発現
を達成し得る（以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、１９８９
、前出）。

【００７８】ＴＲＡＦ２ＴＲをコードする核酸を含む組換えベクターが導入される細胞は、
適切な細胞培養培地中で、細胞によるＴＲＡＦ２ＴＲの発現を提供する条件下で
培養される。

【００７９】一旦適切な宿主細胞および増殖条件が樹立されると、組換え発現ベクターは、
増殖され得そして多量に調製され得る。そのタンパク質の可溶性形態は、上記の
ように、培養流体を収集することによって、または封入体を可溶化する（例えば
、界面活性剤および所望の場合、超音波処理または他の機械的プロセスでの処理
による）ことによって得られ得る。可溶化されたタンパク質または可溶性タンパ
ク質は、種々の技術を用いて単離され得る（ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＰＡＧＥ），等電点フォーカシング、二次元ゲル電気泳動クロマトグラフィー（
例えば、イオン交換アフィニティー、イムノアフィニティー、およびサイズ排除
カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差可溶性、免疫沈降、またはタンパ
ク質の精製のための任意の他の標準的な技術）。

【００８０】上記のように、「ベクター」とは、本発明に従う核酸の宿主細胞への移入のた
めの任意の手段である。好ましいベクターは、ウイルスベクター（例えば、レト
ロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）
である。従って、本発明のタンパク質またはそのポリペプチドドメインをコード
する遺伝子は、インビボ、エキソビボまたはインビトロでウイルスベクターを介
して、またはＤＮＡの直接導入を介して導入される。標的化された組織における
発現は、特定の細胞へトランスジェニックベクターを標的化すること（例えば、
ウイルスベクターまたはレセプターリガンドを用いる）、または組織特異的プロ
モーターを用いることあるいはその両方によって行われ得る。

【００８１】（ウイルスベクター系のエキソビボおよびインビボでの処置方法のための使用
）インビボおよびエキソビボでの標的化および治療手順のために一般に使用され
るウイルスベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクター
である。ウイルスベクターを構築および用いるための方法は、当該分野において
公知である（例えば、以下を参照のこと：ＭｉｌｌｅｒａｎｄＲｏｓｍａｎ
，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０（１９９２））。好ましく
は、ウイルスベクターは、複製欠損である。つまり、それらは、標的細胞におい
て自立的に複製し得ない。一般に、本発明の範囲内に使用される複製欠損ウイル
スベクターのゲノムは、感染された細胞におけるウイルスの複製のために必要な
少なくとも１つの領域を欠如する。これらの領域は、除去（全部または部分的）
されてい得るか、または当業者に公知の任意の技術によって非機能的にされてい
得るかのいずれかであり得る。これらの技術としては、全部の除去、置換（他の
配列、特に挿入された核酸による）、必須（複製のために）領域の部分的欠損ま
たは１つ以上の塩基の付加が挙げられる。そのような技術は、インビトロ（単離
されたＤＮＡ上で）またはインサイチュで、遺伝子操作の技術を用いるかまたは
変異誘発薬剤での処理によって行われ得る。好ましくは、その複製欠損ウイルス
は、ウイルス粒子をカプセル化するために必要であるそのゲノムの配列を保持す
る。

【００８２】ＤＮＡウイルスベクターとしては以下が挙げられる：減弱化されたＤＮＡウイ
ルスまたは欠損ＤＮＡウイルス（例えば、非限定的な例として以下：単純ヘルペ
ス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルスなど。ウイ
ルス遺伝子の全体または殆ど全体を欠如する欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイ
ルスは、細胞への導入後には複製能を有しない。従って、それは、増殖性ウイル
ス感染を引き起こさない。欠損性ウイルスベクターの使用は、特異的であるが局
所化された領域において、そのベクターが他の細胞に感染する心配をせずに細胞
へと投与することを可能にする。従って、特異的組織は、特異的に標的化され得
る。特定のベクターの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：
欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔｅｔａｌ．
、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２：３２０−３３０（１９９１）
）、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠如する欠損ヘルペスウイルスベクター（特許公報
ＲＤ３７１００５Ａ）、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター（国際特
許公開ＷＯ９４／２１８０７，１９９４年９月２９日公開；国際特許公開ＷＯ
９２／０５２６３、１９９４年４月２日公開）；減弱化されたアデノウイルスベ
クター（例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔらによって記載
されるベクター）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｘｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０（１９
９２）；以下もまた参照のこと：Ｌａ−Ｓａｌｌｅｅｔａｌ．．、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２５９：９８８−９９０（１９９３））；ならびに欠損アデノ随伴ウイ
ルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ．６１：３０
９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．、Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．
、Ｍｏｌ、Ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６（１９８８））。

【００８３】好ましくは、インビボ投与のために、適切な免疫抑制処置がウイルスベクター
（例えば、アデノウイルスベクター）と共に用いられて、ウイルスベクターおよ
びトランスフェクトされた細胞の免疫脱活性化を回避し得る。例えば、免疫抑制
サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェ
ロン−γ（ＩＦＮ−γ）、または抗ＣＤ４抗体）は、ウイルスベクターに対する
体液性または細胞性の目ね気応答をブロックするように投与され得る（例えば、
以下を参照のこと：Ｗｉｌｓｏｎ、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５
））。さらに、最小限数の抗原を発現するように走査されたウイルスベクターを
使用することが有利である。

【００８４】当然、本発明は、遺伝子両方適用のためにＴＲＡＦ２ＴＲの治療有効量を発現
するベクターの送達を企図する。用語「治療有効量」とは、本明細書において用
いられて、ＴＮＦα結合に関連する疾患の臨床的に顕著な症状を生じる免疫応答
を減少または最も好ましくは予防するに充分な量を意味する。あるいは、治療有
効量は、その宿主における臨床的に顕著な状態における改善を生じるに充分であ
る。

【００８５】（エキソビボおよびインビボの処置方法で使用される好ましいウイルスベクタ
ー）特定のウイルスベクター系は、当該分野において充分に開発されており、そし
て本発明の処置方法に適合されている。

【００８６】（ａ．アデノウイルスベクター系）好ましい実施形態において、そのベクターは、アデノウイルスベクターである
。アデノウイルスベクターは、本発明の核酸を種々の細胞型へと効率的に送達す
るように改変され得る真核生物ＤＮＡウイルスである。種々の血清型のアデノウ
イルスが存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲内で、２型または５型
のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）あるいは動物起源のアデノウイル
ス（ＷＯ０９４／２６９１４を参照のこと）を用いることについて優先性が与え
られる。本発明の範囲内において使用され得る動物起源のこれらのアデノウイル
スとしては、以下が挙げられる：イヌ、ウシ、マウスのアデノウイルス（例：Ｍ
ａｖｌ、Ｂｅａｒｄｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８
１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例：ＳＡＶ）の起源のもの。好ましくは
、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルスであり、より好ましくは、
ＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、Ｍａｎｈａｔｔａｎ株またはＡ２６／６１株
（ＡＴＣＣＶＲ−８００））。

【００８７】好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、ＩＴＲ、キャプシ
ド化配列および目的の核酸を含む。なおより好ましくは、少なくともアデノウイ
ルスベクターのＥ１領域が非機能性である。Ｅ１領域における欠損は、好ましく
は、Ａｄ５アデノウイルスの配列においてヌクレオチド４５５−３３２９（Ｐｖ
ｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント）または３８２から３４４６（Ｈｉｎｆ
Ｉｉ−Ｓａｕ３Ａフラグメント）からのびる。他の領域もまた、特にＥ３領域（
ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ
９４／２８１５２、Ｗ０９４／１２６４９およびＷＯ９５／０２６９７）におい
てあるいは後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５のいずれかにおいて改変され得る。

【００８８】好ましい実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ１領域において欠損を有す
る（Ａｄ１．０）。Ｅ１欠損アデノウイルスの例は、ＥＰ１８５，５７３におい
て開示されている。その内容は、本明細書において参考として援用される。別の
好ましい実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域において欠
損を有する（Ａｄ３．０）。Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスの例は、Ｗ０９５／
０２６９７およびＷＯ９６／２２３７８に開示されている。その内容は、本明細
書において参考として援用される。なお別の好ましい実施形態において、そのア
デノウイルスは、Ｅ１領域において欠損を有し、その中にＥ４領域および核酸配
列が挿入されている（以下を参照のこと：ＦＲ９４１３３５５、その内容は、
本明細書において参考として援用される）。

【００８９】本発明に従う複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術に
よって調製され得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５
、ＥＰ１８５，５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）２９１７
）。特に、これらは、アデノウイルスとプラスミド（特に、目的のＤＮＡを保持
する）との間の相同組換えによって調製され得る。相同組換えは、適切な細胞株
へのアデノウイルスおよびプラスミドの同時トランスフェクション後にもたらさ
れる。使用される細胞株は、好ましくは、（ｉ）前記エレメントによって形質転
換可能であり、そして（ｉｉ）複製欠損アデノウイルスのゲノムのその部分を相
補し得る配列を、好ましくは、組換えの危険性を回避するために、組み込まれた
形態で含むべきである。使用され得る細胞株の例は、ヒト胚性腎臓細胞株２９３
（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）（これは
、そのゲノム内に組み込まれた、Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（１
２％）を含む）、およびＥ１およびＥ４機能を相補し得る細胞株（特許出願ＷＯ
９４／２６９１４およびＷＯ９５／０２６９７に記載されるような）である。組
換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的な生物学的技術を使用して、回収
および精製される。

【００９０】（ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター系）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスであ
り、これは、安定かつ部位特異的な様式で、それらが感染する細胞のゲノム内に
組み込まれ得る。これらは、細胞の増殖、形態または分化にいかなる影響も誘導
することなく、広範な種の細胞を感染し得、そしてこれらは、ヒト病理に関連す
ることはないようである。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、配列決定され、
そして特徴付けられている。それは、約４７００塩基を含み、そして各末端に約
１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含み、これらは、このウイルスの
複製起点として作用する。ゲノムの残りの部分は、以下の、カプセル化機能を保
持する２つの必須領域に分けられる：ゲノムの左側部分。これは、ウイルス複製
およびウイルス遺伝子の発現に関するｒｅｐ遺伝子を含む；およびゲノムの右側
部分。これは、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含
む。

【００９１】インビトロおよびインビボで遺伝子を移入するためのＡＡＶ由来のベクターの
使用は、記載されている（ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国
特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、ＥＰ４８８
５２８を参照のこと）。これらの刊行物は、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ
遺伝子が欠失されており、そして目的の遺伝子によって置換されている、種々の
ＡＡＶ由来構築物、ならびにインビトロ（培養細胞内）またはインビボ（生物内
に直接的に）で、この目的の遺伝子を移入するためのこれらの構築物の使用を記
載する。本発明に従う複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（
ＩＴＲ）領域によって隣接されている目的の核酸配列を含むプラスミド、および
ＡＡＶカプセル化遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を保持するプラス
ミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を感染させている細
胞株内に同時トランスフェクトすることによって調製され得る。次いで、生成さ
れるこのＡＡＶ組換え体を、標準的な技術によって精製する。

【００９２】従って、本発明はまた、ＡＡＶ由来組換えウイルスに関連し、ここで、このウ
イルスのゲノムは、このＡＡＶＩＴＲによって隣接されている、ＴＲＡＦ２Ｔ
ＲまたはＴＲＡＦ２ＴＤをコードする核酸をコードする配列を含む。本発明はま
た、ＡＡＶ由来の２つのＩＴＲによって隣接されている、ＴＲＡＦ２ＴＲまたは
ＴＲＡＦ２ＴＤをコードする核酸をコードする配列を含む、プラスミドに関する
。このようなプラスミドは、このプラスミド（適切な場合、リポソームベクター
に取り込まれている（偽ウイルス））によって、この核酸配列を移入するために
使用されるように、使用され得る。

【００９３】（ｃ．レトロウイルスベクター系）別の実施形態において、この遺伝子は、レトロウイルスベクターに導入され得
る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ
ら、１９８３、Ｃｅｌｌ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０
，７６４；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔ
ｚら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第
５，１２４，２６３；ＥＰ４５３２４２、ＥＰ１７８２２０；Ｂｅｒｎｓｔｅ
ｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（１９８５）６８９；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによ
る、国際特許公開番号ＷＯ９５／０７３５８（１９９５年３月１６日公開）；お
よびＫｕｏら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ８２：８４５に記載されるように）。こ
れらのレトロウイルスは、分裂細胞を感染する組み込みウイルスである。このレ
トロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、１つのカプセル化配列および３つのコー
ド領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクター
において、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、一般に、全体または部分的に
欠失され、そして目的の異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、以下
のような異なる型のレトロウイルスから構築され得る：ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（
「マウスモロニー白血病ウイルス」、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」
）、ＨａＳＶ（「ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓
壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、およびフレンドウイル
ス。欠損性レトロウイルスベクターは、ＷＯ９５／０２６９７に開示される。

【００９４】一般に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、ＬＴＲ、カ
プセル化配列およびコード配列を含むプラスミドが、構築される。この構築物を
使用して、パッケージング細胞株をトランスフェクトし、この細胞株は、このプ
ラスミド中に欠損しているレトロウイルス機能をトランスで（ｉｎｔｒａｎｓ
）供給し得る。一般に、従って、パッケージング細胞株は、ｇａｇ、ｐｏｌおよ
びｅｎｖ遺伝子を発現し得る。このようなパッケージング細胞株は、先行技術に
おいて記載されている：特に、細胞株ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１
９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍ−１２細胞株（ＷＯ８９／０７１５０）。さらに、この組換えレトロウイルス
ベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の改変、およびｇａｇ遺伝子の
一部を含み得る広範なカプセル化配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者
に公知の標準的な技術によって精製される。

【００９５】レトロウイルスベクターは、感染性の粒子として機能するように、または一回
のトランスフェクションを受けるように構築され得る。前者の場合、このウイル
スは、腫瘍形成性の形質転換特性を担う部分を除く、この遺伝子の全ての部分を
保持するように、そして異種遺伝子を発現するように改変される。非感染性ウイ
ルスベクターは、このウイルスのパッケージングシグナルを破壊するように調製
されるが、異種遺伝子およびこのパッケージングシグナルを含むよう操作された
、同時導入されたウイルスをパッケージングするために必要とされる構造遺伝子
を保持する。従って、産生されるウイルス粒子は、さらなるウイルスを産生し得
ない。標的化された遺伝子送達は、国際特許公開ＷＯ９５／２８４９４（１９９
５年１０月公開）に記載される。

【００９６】（エキソビボおよびインビボ処置方法に使用される非ウイルス系）特定の非ウイルス系は、当該分野で使用されており、そして本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡの所望の標的細胞への導入を容易にし得る。

【００９７】（ａ．リポフェクチン送達系）ベクターは、リポフェクチンによってインビボで導入され得る。過去十年の間
、インビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのための、リポ
ソームの使用が増加してきた。リポソーム媒介トランスフェクションによって遭
遇される困難性および危険性を制限するように設計された合成カチオン性脂質は
、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソ
ームを調製するために使用され得る［Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１４（１９８７）；Ｍａ
ｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０
２７−８０３１（１９８８）；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４
５−１７４８（１９９３）を参照のこと］。カチオン性脂質の使用は、負に荷電
した核酸のカプセル化を促進し得、そしてまた、負に荷電した細胞膜との融合を
促進し得る［ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：
３８７−３８８（１９８９）］。核酸の移入のための特に有用な脂質化合物およ
び組成物は、国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、
ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載される。外因性遺伝子を特定の
器官にインビボで導入するためのリポフェクチンの使用は、特定の実用上の利点
を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は、利点の一面を表す。特定
の細胞型へトランスフェクションを指向することは、細胞異質性を有する組織（
例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳）において特に有利であることが明らかで
ある。脂質は、標的化の目的のために他の分子に化学的に結合され得る［Ｍａｃ
ｋｅｙら、前出を参照のこと］。標的化されるペプチド（例えば、ホルモンまた
は神経伝達物質）およびタンパク質（例えば、抗体）、または非ペプチド分子が
、リポソームに化学的に結合され得る。

【００９８】他の分子もまた、インビボでの核酸のトランスフェクションを容易にするため
に有用である：例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公開ＷＯ
９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来ペプチド（例えば、国際特許公
開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公開
ＷＯ９５／２１９３１）。

【００９９】（ｂ．裸のＤＮＡ送達系）ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入することもまた、可能
である（例えば、米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号
および同第５，５８０，８５９号を参照のこと）。遺伝子治療のための裸のＤＮ
Ａベクターは、例えば、以下の当該分野で公知の方法によって所望の宿主細胞内
に導入され得る：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロイ
ンジェンクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシ
ウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用［例
えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）
；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４
（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔら、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号（１
９９０年３月１５日出願）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２７２６−２７４０（１９９１）を参照のこと］。
レセプター媒介ＤＮＡ送達アプローチもまた、使用され得る［Ｃｕｒｉｅｌら、
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；ＷｕおよびＷ
ｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）］。

【０１００】（ＴＲＡＦ２ＴＲの治療的に有用な改変体を同定するための方法）ＴＮＦα調節性経路が疾患状態に関与するか否かを決定するため、および本発
明のポリペプチドのこれらの経路に対する効果を決定するために使用され得る種
々の方法がある。例えば、ＮＦκＢ調節におけるＴＲＡＦ２ＴＲの役割を研究す
るために、電気泳動易動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）分析は、プローブとして
ＮＦκＢＵＡＳを使用して実行された（図７）。ＦＬＴＲＡＦを過剰発現す
る細胞由来の核抽出物（レーン３および４）は、ＴＮＦα誘導シフトがコントロ
ールと比較して有意に大きいことを示す（レーン１および２）。ＴＲＡＦ２ＴＲ
過剰発現は、ＮＦκＢの形成を遮断し、そして結果として、ＴＮＦα刺激細胞に
おいてシフトは検出されなかった（レーン５および６）。これらの結果は、シフ
トバンドがＴＮＦα刺激細胞において見られなかったので、ＮＦκＢ形成の強力
な阻害を示唆した。ＮＦκＢ結合活性の量の増加は、ＴＮＦαを用いた刺激の後
に、全長ＴＲＡＦ２を過剰発現する細胞において提示される（レーン４）。

【０１０１】本明細書中上で議論されるタイプの実験は、疾患状態と関連した所与の経路が
、本発明の組成物を使用して処置され得るか否かを決定するために利用され得る
。一般的に、上記実験は、改変体がＴＮＦα調節性経路を阻害する能力を有する
か否かを決定するために、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ２ＴＤの代わりに、ＴＲＡ
Ｆ２の単離されたかまたは調製された改変体を用いて実施され得る。

【０１０２】（ＴＮＦα調節性経路に関連する疾患状態）上で議論されるように、本発明は、ＴＮＦα調節性経路を阻害するためのＴＲ
ＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤならびにそれらの改変体の使用に関する。特に
、本発明は、いくつかの転写因子（ＮＦκＢおよびＡＰ−１を含む）のＴＮＦα
誘導活性化を効果的に遮断するための前述のものを使用することに関する。ＴＲ
ＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤならびにそれらの改変体は、ＴＮＦαの過剰産
生およびＮＦκＢ依存性遺伝子の過剰活性化に関連する病理におけるＴＮＦαシ
グナル伝達経路を阻害する際に有用である。種々の疾患は、ＴＮＦα調節性経路
に関連することが明らかであり、これらの疾患に対する病理的基礎は、ＴＮＦα
の過剰産生またはＮＦκＢ依存性遺伝子の過剰活性化を含み得る。これらの疾患
は、ＴＲＡＦ２ＴＲタンパク質およびＴＲＡＦ２ＴＤタンパク質ならびにそれら
の改変体を使用して処置され得る。

【０１０３】炎症プロセスが全ての主要な心臓血管疾患状態の病理に非常に寄与するという
証拠を考え、上昇したＴＮＦαレベルがこれらの炎症のプロセスと関連すると考
えると、種々の主要な心臓血管疾患状態が、本発明の組成物および方法を使用し
て処置され得ると考えられ得る。これらの疾患には、心臓血管疾患状態（心筋梗
塞、冠状動脈バイパス手術、心臓移植に続く心臓虚血−再灌流障害、または発作
に続くＣＮＳにおける虚血−再還流障害；進行性冠動脈アテローム動脈硬化斑の
進行および破裂；うっ血性心不全の発生および進行；ならびにバルーン血管形成
術に続く内皮細胞損傷を含む）が挙げられるが、これには限定されない。さらに
、本発明は、心不全または梗塞の間の心筋細胞のアポトーシス細胞死を予防する
ために、そして筋細胞アポトーシスを避けるために使用され得る。

【０１０４】ＴＮＦαレセプターシグナル伝達を遮断することによって、ＴＲＡＦ２ＴＲま
たはＴＲＡＦ２ＴＤあるいはそれらの改変体を使用する遺伝子治療アプローチは
、これらの疾患を処置するために使用され得る。ＴＲＡＦ２ＴＤの使用は、ＴＮ
Ｆα調節性経路についてのその高い効率的な阻害を考えると、好ましい。

【０１０５】同様に、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達によって、ＴＲＡＦ２ＴＲまたはＴ
ＲＡＦ２ＴＤあるいはそれらの改変体を使用する遺伝子治療は、ＴＮＦαが病原
に関連する他の疾患状態を処置するために使用され得る。これらの疾患状態には
、クローン病、乾癬、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、炎症性腸疾患、非
インシュリン依存性糖尿病、および神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）が
挙げられるが、これらには限定されない。

【０１０６】さらに、ＴＲＡＦ２ＴＤは、ＴＲＡＦ２依存性シグナル伝達経路の機構を研究
するために種々のアッセイに使用され得る。

【０１０７】（治療組成物および投薬）使用において、本発明の任意のベクター（ウイルス性、または非ウイルス性）
は、好ましくは、薬学的に受容可能なビヒクルまたはキャリア中でインビボで導
入される。成句「薬学的に受容可能」は、分子性の実体および組成物を示し、こ
れらは、ヒトに投与される場合、生理学的に許容可能であり、典型的には有意な
アレルギー性または類似の好ましくない反応（例えば、胃の不調およびめまいな
ど）を作り出さない。好ましくは、本明細書中で使用される場合、用語「薬学的
に受容可能」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦政府また
は州政府の監督官庁、または米国薬局方または他の一般的に認識される薬局方に
列挙される監督官庁によって認証されていることを意味する。用語「キャリア」
は、化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを示す
。このような薬学的キャリアは、滅菌性液体（例えば、水および油（石油、動物
、植物または合成起源（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）
））であり得る。水および水性溶液生理食塩溶液ならびに水性ブドウ糖およびグ
リセロール溶液は、好ましくは、キャリアとして、特に注射可能溶液のために使
用される。適切な薬学的キャリアは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され
る。

【０１０８】本発明は、本発明の組成物の有効量のヒトまたは他の動物への投与を含む、治
療方法を提供する。

【０１０９】有効な量は、年齢、処置されるべき状態のタイプおよび重篤度、体重、処置の
望ましい期間、投与の方法、および他のパラメーターに依存して変わり得る。有
効な量は、医師または他の資格のある医療専門家によって決定される。

【０１１０】本発明に従うポリペプチドが、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜
約１００ｍｇの用量で非常に広く使用される。好ましい用量は、約０．１ｍｇ／
ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１０
０ｍｇの用量がより好ましい。

【０１１１】本発明に従う組換えウイルスは、一般的に、約１０⁴と約１０¹⁴ｐｆｕの間の
用量の形態で処方され投与される。ＡＡＶおよびアデノウイルスの場合、約１０ ⁶ 〜約１０¹¹ｐｆｕの用量が好ましくは使用される。用語「ｐｆｕ」（「プラー
ク形成単位」）は、ビリオンの懸濁液の感染能力に対応し、適切な細胞培養物を
感染することおよび形成されるプラークの数を測定することによって決定される
。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は、先行技術において十分記
載されている。

【０１１２】以下の実施例は、本発明の例示である。

【０１１３】（実施例）（実施例１−ｃＤＮＡコードＴＲＡＦ２ＴＲの単離）ＴＲＦ２スプライス改変体、ＴＲＡＦ２ＴＲは、ヒト骨肉腫細胞株（ＯＳＡ１
）由来のｍＲＮＡを使用して全長ＴＲＡＦ２のＲＴＰＣＲクローニング（Ｃｕ
ｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
、１９９６）の間に単離された。全長ＴＲＡＦ２ｃＤＮＡを産生するためのプ
ライマーを使用する間、より小さなＰＣＲ産物が観測される。フラグメントが切
り出され、独立してクローン化される。ＲＴＰＣＲに使用される５’プライマ
ーは、ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣＣでありそして３’プライマ
ーがＴＴＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣであった。

【０１１４】このより小さなクローン（ＴＲＡＦ２ＴＲ）の配列決定時に、アミノ酸残基１
２３〜２０１をコードするコドンのインフレーム欠失が同定された。図４ａおよ
び４ｂは、全長ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ２ＴＲの核酸配列およびアミノ酸配列
を比較する。

【０１１５】体内の種々の組織は、ＴＲＡＦ２ＴＲｍＲＮＡの供給源として同定されてお
り、上記プロトコルを使用してＴＲＡＦ２ＴＲｍＲＮＡを単離するために使用
され得る。ＴＲＡＦ２ＴＲの組織分布を決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを、スプ
ライスされた領域の外側の一対のプライマーを使用して行った。欠失の５’側鎖
上のプライマーは、ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧであり、そして
欠失の３’側鎖上のプライマーは、ＧＧＣＡＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＡＴ
ＣＴＧであり、そしてｃＤＮＡは、異なる組織由来の総ＲＮＡからのオリゴ−ｄ
Ｔを使用して生成された。ｃＤＮＡは、寒天電気泳動によって分離され、そして
ニトロセルロースに移された。ハイブリダイゼーションを、スプライスされた領
域の５’末端に隣接するＴＲＡＦ２配列（５’ＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧ
ＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＴ−３’）由来の特異的なプローブを使用して行った。
このプローブは、ＴＲＡＦ２のスプライシングされていない改変体とスプライシ
ングされた改変体との両方を認識する。スプライシングされていない改変体（Ｔ
ＲＡＦ２ＦＬ）についての期待されるサイズは、３７３ｂｐであり、スプライシ
ングされた改変体（ＴＲＡＦ２ＴＲ）については、１３６ｂｐである。ここで、
図５を参照する。レーン：１−コントロールＴＲＡＦ２−ＦＬｃＤＮＡ；２−
コントロールＴＲＡＦ２スプライシングされた改変体ｃＤＮＡ；３−ジャーカッ
ト；４−ＨｅＬａ細胞株；５−胸腺；６−胎盤；７−胸腺；８−脾臓；９−卵巣
。

【０１１６】種々の細胞供給源由来の溶解物のウェスタンブロット分析は、発現されたタン
パク質のレベルで短縮型のＴＲＡＦ２改変体の存在を明確には検出しない。タン
パク質の高レベル発現および産生が、細胞型依存性の様式で、発生的に、一時的
に、限定されるか、または定義されない機構によって制御される（例えば、Ｇｅ
ｒｍｉｎａｌセンターにおけるＢ細胞変異）。

【０１１７】スプライス改変体ＴＲＡＦ２ＴＲにおける欠失が、オープンリーディングフレ
ームを保持し、そして５’スプライス境界が標準的なスプライス供与配列と一致
する。欠失は、ＷＴＴＲＡＦ２のアミノ酸残基１２３〜２０１を除去し、これ
は、ジンクフィンガードメイン１のＣ末端部分およびジンクフィンガー２および
３の全てならびにジンクフィンガー４のＮ末端残基を含む（図１）。この欠失は
、おそらく、ジンクフィンガー領域の機能を破壊し、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）、１９９３５−１９９４２（１９９６）に
よって作製される欠失に類似し、彼らが報告するこれは、ＴＮＦα誘導ＮＦκＢ
活性化に対する優性なネガティブな効果を示す。

【０１１８】（実施例２−ＴＲＡＦ２ＴＤの調製）ＴＲＡＦ２のＮ−アミノ酸末端８７アミノ酸の欠失（環指ドメインを表す。図
１を参照のこと）が、ＴＮＦα依存性ＮＦκＢ活性化の優性なインヒビター（優
性なネガティブ）として作用するタンパク質を作製する（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）、１９９３５−１９９４２（１９９６
））。Ｎ末端欠失がＴＲＡＦ２ＴＲの活性に影響するか否かを決定するために、
タンパク質のＮ末端から８７アミノ酸（残基１〜８７）の欠失したＴＲＡＦ２Ｔ
Ｒを表す構築物を調製した。このＴＲＡＦ２ＴＲの改変体を調製するために、Ｔ
ＲＡＦ２ＴＲｃＤＮＡは、ＴＲＡＦ２全長コード配列のヌクレオチド２６２〜
２８０を含む５’プライマー（ＡＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴ）
を使用するＰＣＲのための鋳型として使用され、ここで、ＡＴＧコドンが、翻訳
開始部位を作製するために含まれ；３’プライマーは、ＴＴＡＴＡＧＣＣＣＴＧ
ＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣであった。得られた構築物は、全長ＴＲＡＦ２のアミノ酸
８８において開始し、そしてＴＲＡＦ２ＴＲの１２３〜２０１アミノ酸欠失を含
む（「二重欠失」構築物の場合）。構築物は、ＤＮＡ配列決定によって確認され
、哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化さ
れた。

【０１１９】（実施例３−ＴＲＡＦ２ＴＲでのＨｅＬａ細胞の形質転換）ＮＦκＢ活性化へのＴＲＡＦ２ＴＲの効果を決定するために、短縮型ＴＲＡＦ
２および全長（ＦＬ）ＴＲＡＦ２を、哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中にＮ−Ｍｙｃアフィニティータグを用いて構築した。Ｎ
−Ｍｙｃ融合構築物を調製するために、５’ＰＣＲプライマーを合成した。この
プライマーは、開始メチオニン（ＭｅｔＧｌｕＧｌｎＬｙｓＬｅｕＩｌｅＳｅｒ
ＧｌｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕＡｓｎ）とともに、Ｍｙｃタグの配列を含み、その後
に、以下のＴＲＡＦ２ｃＤＮＡの最初の２０ヌクレオチドを含む：５’−ＡＴ
ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡ
ＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣ −３−’。３’ＰＣＲプライマー配列は、以下であった：５’−ＴＴＡＧＡＧ
ＣＣＣＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡ−３’。ＰＣＲ産物を精製し、そして標準
的技術を用いてｐｃＤＮＡ３ベクター中にクローニングした。

【０１２０】ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ（ＢＲＬ，Ｇｉｂｃｏ）試薬を用いて、ｐｃＤＮ
Ａ３−ｍｙｃＴＲＡＦ２構築物により、ＨｅＬａ細胞を形質転換した。この形
質転換には、試薬の供給業者により提供されたプロトコールを用いた。簡略に言
えば、４ｍｌのＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅを、１ｍｇのＤＮＡを含有する無血
清ＤＭＥＭ（ＢＲＬ）培地と混合し、そしてその混合物とともに３×１０⁵細胞
を含有する６０ｍｍのペトリ皿を５％ＣＯ₂インキュベーターで３７℃で一晩、
インキュベートした。形質転換の２４時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で
洗浄し、そして２００ｍｌのＳＤＳ電気泳動サンプル緩衝液（ＳＩＧＭＡ）中で
リンスした。１０ｍｌの溶解液を電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロ
ースフィルターにウエスタンブロットした。抗体供給業者の推奨に従って、免疫
染色およびＥＣＬ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）検出を実行した。

【０１２１】抗Ｍｙｃ抗体（ＢＡＢＣＯ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）により、ｐｃＤＮＡ−ＴＲＡ
Ｆ２ＦＬおよびｐｃＤＮＡ−ＴＲＡＦ２ＴＲで形質転換したＨｅＬａ細胞におい
て、予期されたサイズのタンパク質を検出した（図６）。

【０１２２】図６に示す結果は、形質転換されたＨｅＬａ細胞におけるＭｙｃ−融合ＴＲＡ
Ｆ２ＦＬおよびＴＲＡＦ２ＴＲの免疫検出を示す。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
（ＧｉｂｃｏＢＦＬ）を用いて、ＴＲＡＦ−ＦＬおよびＴＲＡＦ−ＴＲの発現
構築物により、ＨｅＬａ細胞を形質転換した。その２４時間後、細胞をＳＤＳロ
ーディング緩衝液中で溶解した。抗ｍｙｃＡｂおよびＥＣＬ検出システムを用
いて、Ｍｙｃ融合タンパク質を検出した。各レーンは以下のとおり；１：ｐｃＤ
ＮＡ３ベクター；２：ｍｙｃ−ＴＲＡＦ２ＦＬ；３：ｍｙｃ−ＴＲＡＦ２ＴＲ。

【０１２３】（実施例４−ＮＦκＢレポーターシステム）ＮＦκＢ調節の遺伝子発現に対するＴＲＡＦ２ＴＲ、ＴＲＡＦ２ＴＤまたはこ
れらのポリペプチドの改変体の効果を決定するため、ＮＦκＢレポーターシステ
ムが用いられ得る。このシステムは、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈ
ｅｍ．２７１（３３）、１９９３５〜４２（１９９６）において利用され、そし
て記載されているようなシステムである。ＮＦκＢレポーター活性化システムは
、適切な細胞（例えば、２９３細胞、ＣＯＳ７細胞またはＨｅＬａ細胞）と結合
されて利用され得る。実施例３に考察したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅプロトコ
ールを用いて、この細胞を、異なるＴＲＡＦ２構築物（すなわち、全長ＴＲＡＦ
２、ＴＲＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤ）で形質転換する。次いで、同時トラ
ンスフェクトされたＮＦκＢレポーターの活性化に対する、異なるＴＲＡＦ２フ
ラグメントの効果を比較して、最も効果的なインヒビター種を同定し得る。例え
ば、ＴＲＡＦ２構築物（全長ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ２ＴＲ、およびＴＲＡＦ２Ｔ
Ｄ、ならびにＴＲＡＦ２ＴＲおよびＴＲＡＦ２ＴＤの改変体を含む）は、２９３
細胞中に形質転換され得、そしてＴＮＦαの存在下または非存在下においてＮＦ
κＢレポーター活性のレベルが、モニターされ得る。全長ＴＲＡＦ２は、同時形
質転換されたＮＦκＢレポーターを活性化することが期待されるが、他のＴＲＡ
Ｆ２構築物は、ＮＦκＢレポーターのＴＮＦα媒介活性化合物を、様々な程度ま
でブロックするとは思われない。

【０１２４】（実施例５−エキソビボ処置方法）エキソビボ遺伝子治療の方法は、当該分野で公知であり、そして一般に４つの
段階を含む。第１の段階においては、所定の型の細胞を、処置されるべき患者か
ら収集する。第２段階では、所望の遺伝子を単離された細胞中に形質転換する。
第３段階では、所望の遺伝子を取り込んだ細胞を選択し、そして増殖させる。第
４段階では、細胞を患者に導入するかまたは患者に移植して戻し、患者に、所望
の遺伝子を発現させ、そして疾患を処置する。

【０１２５】本発明を利用するエキソビボ処置方法の最初の段階では、患者から細胞を得る
。細胞の選択は、多くの要因（主に、処置されるべき特定の疾患）に基づく。こ
れらの標的細胞における活性化のブロックは、炎症促進型サイトカインおよび炎
症プロセスに関与する他のタンパク質（心血管系の疾患状態の徴候に関する）の
発現を阻害する。

【０１２６】第２の段階では、ＴＲＡＦ２ＴＲもしくはＴＲＡＦ２ＴＤまたは改変ｃＤＮＡ
を、適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングする。リポフェクチン、発現ベ
クター（例えば、ｐｃＤＮＡ３）を含む形質転換プロトコールが用いられ得る。
好ましい実施形態において、ＴＲＡＦ２ＴＤがＴＮＦα結合効果を阻害する増強
された能力を考慮して、ｐｃＤＮＡ３、または別の適切な哺乳動物発現ベクター
にＴＲＡＦ２ＴＤをクローニングする。発現ベクターにおいて利用されるプロモ
ーターを、形質転換されるべき細胞の型、および発現のレベルを調節するための
望ましい方法に基いて選択する。適切なプロモーターは、上記で考察したプロモ
ーターの中から選択され得る。心臓疾患の遺伝子治療のために、以下のプロモー
ター、例えば、２ＭＨＣ（Ｐａｌｅｒｍｏら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７８（３）
，５０４〜９（１９９６）を参照のこと）、ＭＬＣ２（Ｓａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ
，３１４：２８３〜２８６（１９８５）を参照のこと）、ＣＡＲＰ（Ｊｅｙａｓ
ｅｅｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３６）、２２８００〜８（１
９９７）を参照のこと）をＴＲＡＦ２ＴＤのｃＤＮＡの上流に挿入する。発現ベ
クターを含有するＴＲＡＦ２ＴＤのｃＤＮＡを、次いで、供給業者のプロトコー
ルを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＢＲＬ，Ｇｉｂｃｏ）試薬を利用す
るリポソーム媒介トランスフェクションにおいて用いる。ウイルス形質導入を用
いるトランスフェクションプロトコールのためには、エキソビボ処理プロトコー
ルの第２段階で、組換えアデノウイルスベクターシステムを利用する。このプロ
トコールにおいては、ＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡを、アデノウイルス発現ベクタ
ー（例えば、アデノ−クエストｐＱＢＩ−ＡｄＢＮ／ＮＢ（ＱＵＡＮＴＵＭＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）にクローニングする。このアデノウ
イルス移入ベクター（ここではＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡを含有する）を、次い
で、アデノウイルスのウイルスＤＮＡとともに、２９３細胞中に同時トランスフ
ェクトする。プラーク単離および陽性クローン選択後、ＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮ
Ａを含有する組換えアデノウイルスを増幅し、次いで、従来のＣｓＣｌ段階勾配
精製を用い、その後適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を用いる
透析により精製する。次いで、組換えアデノウイルスを用い、エキソビボで標的
細胞をトランスフェクトする。

【０１２７】本発明による組換えウイルスは、約１０⁴ｐｆｕと約１０¹⁴ｐｆｕの間の用量
の形態で、処方され、投与される。ＡＡＶおよびアデノウイルスの場合、約１０ ⁶ ｐｆｕと約１０¹¹ｐｆｕの間の用量が好ましくは用いられる。用語「ｐｆｕ」
（「プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）」は、ビリオンの懸濁液の感染力価に対応し、そしてこれは、適切な細胞培養物を
感染することにより、および形成されたプラークの数を計数することにより決定
される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定する技術は、先行技術において十分に
立証されている。

【０１２８】第３段階では、リポフェクチンまたは組換えアデノウイルス感染のいずれかに
より得られた形質転換細胞を、培養液中で増殖させ、形質転換された細胞を選択
する。選択は、種々の方法で行われ得る。この方法は、発現ベクターを組み込ん
だ細胞のみを生存させ、増殖させる薬物マーカーを用いることを包含する。

【０１２９】第４段階では、処置されるべき組織の近位か、またはＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮ
Ａ産物が循環中に放出されることを可能にする位置のいずれかに、形質転換され
た細胞を患者に導入するか、または直接移植して、ＴＮＦα結合による活性化に
対して細胞被検体を相互作用させる。送達手段としては、直接注入、またはカテ
ーテル、インフュージョンポンプ、もしくはステントによる送達が挙げられるが
これらに限定されない。

【０１３０】（実施例６−インビボ処置方法）インビボ処置方法は、種々の異なるウイルスベクターを利用し得る。ウイルス
ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、お
よびレトロウイルスベクターが挙げられる。本発明の好ましいインビボ処置方法
においては、アデノウイルスシステムを用いて、宿主細胞にＴＲＡＦ２ＴＲまた
はＴＲＡＦ２ＴＤのｃＤＮＡを導入する。ＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡがＴＮＦα
結合活性を阻害する比較的大きい能力を考慮すれば、アデノウイルス発現ベクタ
ーにおいてＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡを用いることが好ましい。この方法では、
ＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡを、アデノウイルス移入ベクター、例えば、アデノ−
クエスト（Ｑｕｅｓｔ）ｐＱＢＩ−ＡｄＢＮ／ＮＢ（ＱＵＡＮＴＵＭＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）、または上記の別のアデノウイルスベクタ
ーにクローニングする。発現ベクターにおいて利用されるプロモーターを、形質
転換されるべき細胞の型、および発現のレベルを調節するための望ましい方法に
基いて選択する。適切なプロモーターは、上記で考察したプロモーターの中から
選択され得る。

【０１３１】所望のプロモーターおよびＴＲＡＦ２ＴＤｃＤＮＡを含有するアデノウイル
ス移入ベクターを、アデノウイルスのウイルスＤＮＡとともに、２９３細胞中に
同時トランスフェクトする。プラーク単離および陽性クローン選択後、ＴＲＡＦ
２ＴＤｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスを増幅し、次いで、従来のＣ
ｓＣｌ段階勾配精製を用い、その後適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食
塩水）を用いる透析により精製する。

【０１３２】インビボで細胞をトランスフェクトする前に、ウイルス粒子の力価を決定し、
そしてインビトロ実験を実行して、タンパク質発現のレベルおよび組織培養感染
用量（ＴＣＩＤ５０）を決定する。本発明による組換えウイルスは、約１０⁴ｐ
ｆｕと約１０¹⁴ｐｆｕの間の用量の形態で、処方され、投与される。ＡＡＶおよ
びアデノウイルスの場合、約１０⁶ｐｆｕと約１０¹¹ｐｆｕの間の用量が好まし
くは用いられる。用語「ｐｆｕ」（「プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒ
ｍｉｎｇｕｎｉｔ）」は、ビリオンの懸濁液の感染力価に対応し、そしてこれ
は、適切な細胞培養物を感染することにより、および形成されたプラークの数を
計数することにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定する技術は、
先行技術において十分に立証されている。

【０１３３】次いで、組換えアデノウイルスを用いて、約１０⁶ｐｆｕと約１０¹¹ｐｆｕの
間の用量で患者を感染させる。組換えアデノウイルスは、吸入、注入、外科的移
植、直接注入、またはカテーテル、注入ポンプもしくはステントによる送達によ
り導入され得る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、全長ＴＲＡＦ２（ＴＲＡＦ２−ＦＬ）およびオルタナティブスプライ
ス改変体ＴＲＡＦ２ＴＲの模式的構造である。

【図２】図２ａおよび図２ｂは、ＴＲＡＦ２ＴＲｃＤＮＡの核酸配列（２ａ）および
ＴＲＡＦ２ＴＲ（２ｂ）のアミノ酸配列である。

【図３】図３ａおよび３ｂは、ＴＲＡＦ２ＴＤ（３ａ）の核酸配列およびＴＲＡＦ２Ｔ
Ｄ（３ｂ）のアミノ酸配列である。

【図４ａ】図４ａおよび図４ｂは、スプライスされたＴＲＡＦ２（ＴＲＡＦ２ＴＲ）およ
び全長ＴＲＡＦ２の核酸（４ａ）およびアミノ酸（４ｂ）アラインメントである
。

【図４ｂ】図４ａおよび図４ｂは、スプライスされたＴＲＡＦ２（ＴＲＡＦ２ＴＲ）およ
び全長ＴＲＡＦ２の核酸（４ａ）およびアミノ酸（４ｂ）アラインメントである
。

【図５】図５は、ＴＲＡＦ２ＴＲ改変体ｍＲＮＡの組織分布を例示する。レーン：１−
コントロールＴＲＡＦ２ＦＬｃＤＮＡ；２−コントロールＴＲＡＦ２スプライ
ス改変体（ＴＲＡＦ２ＴＲ）ｃＤＮＡ；３−Ｊｕｒｋａｔ；４−ＨｅＬａ細胞株
；５−胸腺；６−胎盤；７−胸腺；８−脾臓；９−卵巣；１０−コントロールＴ
ＲＡＦ２ＦＬ。

【図６】図６は、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＭｙｃ融合ＴＲＡＦ２
ＦＬおよびＴＲＡＦ２ＴＲの免疫検出を例示する。レーン：１−ｐｃＤＮＡ３ベ
クター；２−ｍｙｃ−ＴＲＡＦ２ＦＬ；３−ｍｙｃ−ＴＲＡＦ２ＴＲ。

【図７】図７は、ＮＦＫＢＵＡＳプローブを使用して行われた電気泳動移動度のシフ
トアッセイ（ＥＭＳＡ）を例示する。ＦＬＴＲＡＦ２（レーン３および４）を
過剰発現する細胞からの核抽出物は、コントロール（レーン１および２）と比較
して優位により強力なＴＮＦ−αにより誘導されたシフトを示す。ＴＲＡＦ２−
ＴＲ過剰発現は、ＮＦ−κＢの形成をブロックし、その結果、シフトは、ＴＮＦ
α刺激細胞（レーン５および６）において検出されていない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/08 9/00 9/10 9/08 17/02 9/10 19/02 17/02 25/28 19/02 29/00 25/28 １０１ 29/00 37/02 １０１ 43/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パグノニ，マルコエフ．アメリカ合衆国ペンシルベニア 19403，ノリスタウン，ステリジアストリート 2029 (72)発明者イバシュチェンコ，ユリディー．アメリカ合衆国ペンシルベニア 19525，ノリスタウン，ハンプトンコート 11 (72)発明者グオ，クンアメリカ合衆国ペンシルベニア 19403，イーグルビル，アパートメントナンバー21，イーグルストリームドライブ 103 (72)発明者クラーク，ケニスエル．イギリス国エスジー１４エイエスハートフォードシェア，スティーブンエイジ，グランビーロード 34 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA17 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA08 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA35 BA44 CA53 CA56 DA01 DC50 MA66 NA01 NA13 NA14 ZA182 ZA362 ZA392 ZA402 ZA452 ZA662 ZA892 ZA962 ZB072 ZB112 ZB152 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA22 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図２ａに示される配列を含むＴＲＡＦ２ＴＲをコードするＤ
ＮＡ配列。
【請求項２】図３ａに示される配列を含むＴＲＡＦ２ＴＤをコードするＤ
ＮＡ配列。
【請求項３】前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項５】ＴＮＦα調節性経路を阻害し得、かつ図２ｂに示されるアミ
ノ酸配列を含む、単離され、そして精製されたＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチド。
【請求項６】ＴＮＦα調節性経路を阻害し得、かつ図３ｂに示されるアミ
ノ酸配列を含む、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチド。
【請求項７】患者におけるＴＮＦα調節性経路を阻害する方法であって、
該方法が、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得る組成物を該患者の身体に導入する工
程を包含する、方法。
【請求項８】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドを発現し得る発
現ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドを発現し得る発
現ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアを含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアを含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】ＴＮＦαの過剰生成が関与する疾患を阻害する方法であっ
て、該方法が、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得る組成物を患者の身体に導入する
工程を包含する、方法。
【請求項１３】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲを発現し得る発現ベクター
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤを発現し得る発現ベクター
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】核因子κβ（ＮＦＫＢ）依存性遺伝子の過剰活性化が関与
するＴＮＦα病理を阻害する方法であって、該方法は、ＴＮＦα調節性経路を阻
害し得る組成物を患者に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１８】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲを発現し得る発現ベクター
である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤを発現し得る発現ベクター
である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】ＴＮＦαが関与する炎症性プロセスを阻害する方法であっ
て、該方法は、ＴＮＦα調節性経路を阻害し得る組成物を患者の身体に導入する
工程を包含する、方法。
【請求項２３】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲを発現し得る発現ベクター
である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤを発現し得る発現ベクター
である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＲポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】前記組成物が、ＴＲＡＦ２ＴＤポリペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】前記ＴＮＦαが関与する炎症性プロセスが、クーロン病、
乾癬、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、炎症性腸疾患、非インスリン依存
性糖尿病および神経変性疾患からなる群より選択される、請求項２２に記載の方
法。
【請求項２８】前記ＴＮＦαが関与する炎症性プロセスが、心臓血管性疾
患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】前記心臓血管性疾患が、（ａ）心筋梗塞後の心臓虚血性再
灌流傷害、冠状動脈バイパス手術、心臓移植、または発作後のＣＮＳにおける虚
血性再灌流傷害；（ｂ）進行性冠動脈アテローム硬化斑の進行および破裂；（ｃ
）うっ血性心不全の発症および進行；（ｄ）バルーン血管形成術後の内皮細胞傷
害；ならびに（ｅ）心筋細胞のアポトーシス性細胞死からなる群より選択される
、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】ＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ改変体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３１】前記ＤＮＡ配列が、保存的アミノ酸置換を含む、請求項３
０に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３２】ＴＮＦα調節性経路を阻害し得るＴＲＡＦ２ＴＲ／２ＴＤ
改変体ポリペプチド。