JP2003529338A - 新規ヒト輸送体タンパク質及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 療法、診断及び薬理ゲノミクス適用に使用できる、新規ヒトポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年１１月２日に提出され、そして本明細書にその全体を援
用する、米国仮出願第６０／１６３,０１８号の優先権を請求する。１．序論 本発明は、哺乳動物輸送体タンパク質と配列相同性を共有するタンパク質をコ
ードする、新規ヒトポリヌクレオチドの発見、同定及び性質決定に関する。本発
明は、記載されるポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質
、融合タンパク質、ポリペプチド及びペプチド、コードされるタンパク質及びペ
プチドに対する抗体、並びに開示される遺伝子を欠失するか又は過剰発現する遺
伝的に操作された動物、該タンパク質のアンタゴニスト及びアゴニスト、並びに
診断、薬剤スクリーニング、臨床試験モニタリング、疾患及び障害の治療に使用
できる、又は別の方法で生活の質に貢献するのに使用できる、開示された遺伝子
にコードされるタンパク質の発現又は活性を調節する他の化合物を含む。２．発明の背景 輸送体タンパク質は、脂質二重層を横切る物質の通過を介在するか又は促進す
る、内在性膜タンパク質である。膜を横切る物質の輸送が、重要な生理学的役割
を果たす可能性があることを考慮すると、輸送体タンパク質は、優れた薬剤標的
である。さらに、薬剤耐性の機構の１つは、疾患細胞が、細胞から化学療法剤を
排出するのに細胞内輸送体系を用いることを伴う。こうした機構は、多数の薬剤
に対する耐性を発現する細胞に特に関連する。３．発明の概要 本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチドの発見、同定及び性
質決定、並びにこれらのタンパク質の対応するアミノ酸配列に関する。本明細書
に初めて記載される新規ヒトタンパク質（ＮＨＰ）は、哺乳動物多剤耐性（ＭＤ
Ｒ）タンパク質及び細胞内輸送体と構造的相同性を共有する。

【０００２】 本明細書に記載される新規ヒト核酸配列は、長さ６５９、７０５、１,０６３
、４９６、５４２、９００、９７８、１,０２４、１,３８２、８１５、８６１、
１,２１９アミノ酸（それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２及び２４を参照されたい）の代替タンパク質／オープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。

【０００３】 本発明はまた、記載されるＮＨＰのアゴニスト及びアンタゴニスト（天然ＮＨ
Ｐと競合する小型分子、大型分子、変異体ＮＨＰ、又はその一部を含む）、ペプ
チド及び抗体、並びに記載されるＮＨＰの発現を阻害するのに使用できるヌクレ
オチド配列（例えばアンチセンス及びリボザイム分子、並びに遺伝子又は制御配
列置換構築物）、又は記載されるＮＨＰ遺伝子の発現を促進させるのに使用でき
るヌクレオチド配列（例えば記載される遺伝子を強力なプロモーター系の制御下
に置く発現構築物）、並びにＮＨＰ導入遺伝子を発現するトランスジェニック動
物、又は機能するＮＨＰを発現しない「ノックアウト」（条件的であってもよい
）を含む。記載される遺伝子のネズミ相同分子種中にジーントラップ突然変異を
含む、ノックアウトＥＳ細胞株を産生した。

【０００４】 さらに、本発明はまた、記載されるＮＨＰ及び／又はＮＨＰ産物の精製された
調製物、あるいはＮＨＰを発現する細胞を利用して、ＮＨＰ発現及び／又はＮＨ
Ｐ活性を調節する化合物、すなわちアゴニスト又はアンタゴニストとして作用す
る化合物を同定するための方法にも関する。こうした化合物は、生物学的障害又
は平衡異常に関連する非常に多様な症状のいずれの治療用の療法剤としても使用
できる。４．配列表及び図面の説明 配列表は、記載されるＮＨＰアミノ酸配列をコードする、記載されるＮＨＰ
ＯＲＦの配列を提供する。配列番号２５は、ＮＨＰ ＯＲＦと共に隣接する５’
及び３’配列を記載する。５．発明の詳細な説明 本明細書に初めて記載されるＮＨＰは、とりわけヒト細胞株において、主にヒ
ト乳腺及びヒト胎児肝臓、前立腺、精巣、並びにジーントラップされたヒト細胞
で発現する新規タンパク質である。

【０００５】 本発明は、配列表に提示されるヌクレオチド、こうしたヌクレオチドを発現す
る宿主細胞、こうしたヌクレオチドの発現産物、及び：（ａ）前記遺伝子の哺乳
動物相同体（具体的に記載したＮＨＰ及びＮＨＰ関連産物を含む）をコードする
ヌクレオチド；（ｂ）ＮＨＰの機能性ドメイン（活性ドメインの新規領域が含ま
れるが、これらに限定されない）に相当する１以上の部分をコードするヌクレオ
チド、及びそれらのヌクレオチド配列に特定されるポリペプチド産物；（ｃ）前
記ＮＨＰの少なくとも１つのドメインの全部又は一部が欠失又は置換した遺伝子
工学的に操作した変異体又は天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、及びそ
れらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド産物、これらにはシグナ
ル配列の全部又は一部が欠失した可溶性タンパク質及びペプチドが含まれるが、
これらに限定されない；（ｄ）別のペプチド又はポリペプチドに融合した、ＮＨ
Ｐのコード領域の全部又は一部、あるいはそのドメインの１つ（例えば受容体又
はリガンド結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自己結合ドメインなど）を
含む、キメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド；又は（ｅ）記載される
ポリヌクレオチドの療法的又は診断的誘導体、例えば配列表に初めて開示された
配列を含むオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、
ｄｓＲＮＡ、又は遺伝子治療構築物を含む。上に論じられるように、本発明は：
（ａ）配列表に提示されるヒトＤＮＡ配列（及び該配列を含むベクター）を含み
、そしてさらに、配列表に提示されるＤＮＡ配列の相補体に、非常にストリンジ
ェントな条件下、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブ
リダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃での洗浄（
Ausubel F.M. et al. eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.，及びJohn Wiley & Sons, Inc.,
New York, p.2.10.3）という条件下でハイブリダイズし、そして機能的に同等な
遺伝子産物をコードする、隣接するＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）をコードするいかなるヌクレオチド配列も意図する。さらに意図されるのは
、配列表に提示されるアミノ酸配列をコードしそして発現するＤＮＡ配列の相補
体に、中程度にストリンジェントな条件下、例えば０．２×ＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳ中、４２℃での洗浄（Ausubel et al., 1989、上記）でハイブリダイズし、
しかも機能的に同等なＮＨＰ産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列であ
る。ＮＨＰの機能的同等物は、他の種に存在する天然ＮＨＰ及び天然に存在する
か又は操作されている（部位特異的突然変異誘発、遺伝子シャッフリング、例え
ば米国特許第５,８３７,４５８号に記載されるような定方向進化による）いずれ
かの突然変異ＮＨＰを含む。本発明はまた、開示されるＮＨＰポリヌクレオチド
配列の縮重核酸変異体も含む。

【０００６】 さらに意図されるのは、ＮＨＰ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド、又は
配列表のヌクレオチド配列の対応する領域に約９９、９５、９０又は約８５パー
セント相同又は同一であるポリヌクレオチド配列（例えば標準デフォルト設定を
用いたＧＣＧ配列解析パッケージを用いた、ＢＬＡＳＴ配列比較解析で測定され
るようなもの）にコードされる、その機能的同等物である。

【０００７】 本発明はまた、記載されるＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列にハイブリダイズし
、したがってその相補体である、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。こう
したハイブリダイゼーション条件は、上述のように、非常にストリンジェントで
あっても、又はそれほど非常にストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデ
オキシオリゴヌクレオチド（「ＤＮＡオリゴ体」）である場合、それらの分子は
本明細書の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、一般に約１６〜約１
００塩基、約２０〜約８０塩基、若しくは約３４〜約４５塩基の長さのもの、又
はここに示すサイズの任意の変更又は組み合わせである。それらのオリゴヌクレ
オチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリー
のスクリーニング、クローンの単離、並びにクローニングテンプレート及び配列
決定テンプレートの調製などを行うことができる。

【０００８】 あるいは、こうしたＮＨＰオリゴヌクレオチドは、ライブラリーをスクリーニ
ングし、そして（特に、マイクロアレイ又は高処理「チップ」形式を用いて）遺
伝子発現パターンを評価するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用
できる。さらに、一連の記載されるＮＨＰオリゴヌクレオチド配列、又はその相
補体を、記載されるＮＨＰ配列の全部又は一部を提示するのに使用できる。オリ
ゴヌクレオチド、典型的には長さ約１６〜約４０（又はこの範囲内のいかなる整
数でもよい）のヌクレオチドは、互いに部分的に重複してもよく、及び／又はＮ
ＨＰ配列は、重複しないオリゴヌクレオチドを用いて提示されてもよい。したが
って、記載されるＮＨＰポリヌクレオチド配列は、典型的には、各々、本明細書
の配列表に初めて開示された、少なくとも長さ約１８、好ましくは約２５ヌクレ
オチドのうち、少なくとも約２又は３の別個のオリゴヌクレオチド配列を含むは
ずである。こうしたオリゴヌクレオチド配列は、配列表の配列内に存在するいか
なるヌクレオチドで始まり、そして記載される配列に関して、センス（５’から
３’）方向、又はアンチセンス方向、いずれに進行してもよい。

【０００９】 オリゴヌクレオチドプローブに関しては、非常にストリンジェントな条件は、
例えば、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オ
リゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（
２３塩基オリゴ）での洗浄を指す。これらの核酸分子は、例えばＮＨＰ遺伝子制
御に有用な、ＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子をコードしていても、又はアンチセ
ンス分子として作用してもよい（ＮＨＰ遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアン
チセンスプライマーを得るため、及び／又は当該アンチセンスプライマーとして
）。ＮＨＰ遺伝子制御に関しては、生物学的機能を制御するのにこうした技術を
使用できる。さらに、こうした配列は、やはりＮＨＰ遺伝子制御に有用であるリ
ボザイム及び／又は三重らせん配列の一部として使用できる。

【００１０】 阻害アンチセンス又は二本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに、５−フルオロウ
ラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポ
キサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシ
メチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５
−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガ
ラクトシルケオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、
１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メ
チルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン
、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５
−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン
、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチ
ルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワ
イブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシト
シン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、
５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５
−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−
Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミ
ノプリンを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことが
できるが、これらに限定されるわけではない。

【００１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビ
ノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群より選択される、少なくとも１
つの修飾糖部分も含むことができるが、これらに限定されるわけではない。

【００１２】 さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデー
ト、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
、及びホルムアセタール又はそれらの類似体からなる群より選択される、少なく
とも１つの修飾ホスフェート骨格を含むであろう。

【００１３】 さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマー
オリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ
と特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、該ハイブリッドでは、通常のβ−単位
とは対照的に、鎖は互いに平行に走る（Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Re
s. 15: 6625-6641）。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチ
ド（Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148）、又はキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330）である。
あるいは、二本鎖ＲＮＡを用い、標的ＮＨＰの発現及び機能を崩壊させることが
できる。

【００１４】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の標準的な方法に
よって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（例えばBiosearch、Applied Biosystems
などから市販のもの）の使用によって合成できる。例えば、ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドは、Stein et al.（1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209）の
方法によって合成でき、そしてメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御
孔ガラスポリマー支持体の使用（Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85: 7448-7451）などによって調製できる。

【００１５】 低ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そして予測可能であるよう
に、ライブラリー及び標識配列が由来する特定の生物に応じて異なるであろう。
こうした条件に関する手引きには、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual（及びその定期的な改訂版）， Cold Springs H
arbor Press, N.Y.；及びAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecu
lar Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を
参照されたい。

【００１６】 あるいは、適切に標識されたＮＨＰヌクレオチドプローブを用いて、適切にス
トリンジェントな条件を用い、又はＰＣＲによって、ヒトゲノムライブラリーを
スクリーニングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定及び性質決定は、
多型（限定されるわけではないが、ヌクレオチド反復、マイクロサテライト対立
遺伝子、一ヌクレオチド多型、又はコード一ヌクレオチド多型を含む）を同定し
、既定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造を決定し、そして診断試験を計画す
るのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する領域
由来の配列を用いて、エクソン、イントロン、スプライシング部位（例えばスプ
ライシングアクセプター及び／又はドナー部位）などの内部での突然変異を検出
する増幅アッセイで用いるためのプライマーを設計することができ、診断法及び
薬理ゲノミクスに使用できる。

【００１７】 さらに、本明細書に開示されるＮＨＰ産物内のアミノ酸配列に基づいて設計さ
れた、２つの縮重又は「ゆらぎ」オリゴヌクレオチドプライマープールを用いて
ＰＣＲを実行することにより、目的の生物由来の核酸からＮＨＰ遺伝子相同体を
単離できる。反応のためのテンプレートは、ＮＨＰ遺伝子の対立遺伝子を発現す
ることが知られる、又は発現すると推測される、ヒト又は非ヒト細胞株又は組織
から調製された、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／又はｍＲＮＡの逆転写によって得
られたｃＤＮＡであってもよい。

【００１８】 ＰＣＲ産物は、サブクローニングし、配列決定して、増幅された配列が、所望
のＮＨＰ遺伝子の配列に相当することを確実にすることができる。その後、ＰＣ
Ｒ断片を用いて、多様な方法によって、全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。例
えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーなどのｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用できる。あるいは、標識断片を
用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングを介し、ゲノムクローンを単離す
ることができる。

【００１９】 ＰＣＲ技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに使用できる。例えば、Ｒ
ＮＡは、標準的な方法にしたがい、適切な細胞又は組織供給源（すなわち、ＮＨ
Ｐ遺伝子を発現することが知られる、又は発現すると推測されるもの）から単離
できる。逆転写（ＲＴ）反応は、第一鎖合成のプライミングのために、増幅断片
の５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＲＮＡに対して
行うことが可能である。その後、生じたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準的
末端トランスフェラーゼ反応を用いて、「テール化」し、ハイブリッドをＲＮａ
ｓｅＨで消化し、そしてその後、第二鎖合成を相補的プライマーでプライミング
することができる。このように、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列を単離すること
が可能である。使用できるクローニング戦略の概説には、例えばSambrook et al
.,1989、上記を参照されたい。

【００２０】 突然変異体ＮＨＰ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲを用いるこ
とによって単離することが可能である。この場合、第一のｃＤＮＡ鎖は、突然変
異体ＮＨＰ対立遺伝子を有すると推定される個体において、発現されることが知
られる又は発現されることが推測される組織から単離されたｍＲＮＡに、オリゴ
ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、そして逆転写酵
素で新規鎖を伸長させることによって、合成することが可能である。その後、ｃ
ＤＮＡの第二鎖は、正常遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを用いて合成する。これらの２つのプライマーを用い、その後、Ｐ
ＣＲを介して産物を増幅し、所望により、適切なベクターにクローニングし、そ
して当業者に周知の方法を通してＤＮＡ配列解析に供する。突然変異体ＮＨＰ対
立遺伝子のＤＮＡ配列を、対応する正常ＮＨＰ対立遺伝子と比較することによっ
て、突然変異体ＮＨＰ遺伝子産物の機能の損失又は改変に関与する、単数又は複
数の突然変異を確かめることが可能である。

【００２１】 あるいは、突然変異体ＮＨＰ対立遺伝子を有すると推測される、又は有するこ
とが知られる個体（例えば、肥満、高血圧、結合組織障害、不妊などのＮＨＰ関
連表現型を発現している個人）から得たＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリーを
構築することができるし、あるいは突然変異体ＮＨＰ対立遺伝子を発現すること
が知られる、又は発現すると推測される組織由来のＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築することができる。その後、正常ＮＨＰ遺伝子、又はいかなる
ものでもよい適切なその断片を標識して、こうしたライブラリーにおいて、対応
する突然変異体ＮＨＰ対立遺伝子を同定するプローブとして用いることもできる
。その後、突然変異体ＮＨＰ遺伝子配列を含むクローンを精製して、当業者に周
知の方法にしたがい配列解析に供することができる。

【００２２】 さらに、例えば、突然変異体ＮＨＰ対立遺伝子を有すると推測される、又は有
することが知られる個体における、こうした突然変異対立遺伝子を発現すること
が知られる、又は発現すると推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃ
ＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築することができる。この方式では、
推定上の突然変異組織によって作製される遺伝子産物を発現させ、そして以下に
記載されるように、正常ＮＨＰ産物に対して作製された抗体と組み合わせた標準
的抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングすることが可能である。（ス
クリーニング技術に関しては、例えば、Harlow E. and Lane, eds.， 1988, “A
ntibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harborを参照されたい。） さらに、スクリーニングは、例えばアルカリホスファターゼ−ＮＨＰ融合タン
パク質又はＮＨＰ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質などの標識ＮＨＰ融
合タンパク質でスクリーニングすることによって、達成することができる。ＮＨ
Ｐ突然変異が、改変された機能の発現遺伝子産物を生じる（例えばミスセンス又
はフレームシフト突然変異の結果として）場合、ＮＨＰに対するポリクローナル
抗体は、対応する突然変異体ＮＨＰ遺伝子産物と交差反応する可能性がある。こ
うした標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンは、当該技術
分野に周知の方法にしたがって精製し、そして配列解析に供することができる。

【００２３】 本発明はまた、（ａ）前述のＮＨＰコード配列及び／又はその相補体（すなわ
ちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現を
指示する制御配列と機能的に結合した前述のＮＨＰコード配列のいずれかを含む
ＤＮＡ発現ベクター（例えば、本明細書に援用する米国特許第５,８６９,３３６
号に記載されるようなバキュロウイルス）；（ｃ）宿主細胞において、コード配
列の発現を指示する制御配列と機能的に結合した前述のＮＨＰコード配列のいず
れかを含む、遺伝的に操作された宿主細胞；及び（ｄ）外因的に導入された制御
配列の制御下に内因性ＮＨＰ遺伝子を発現する（すなわち遺伝子活性化）、遺伝
的に操作された宿主細胞、を含む。本明細書において、制御配列には、誘導性及
び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び発現をドライブし
、制御することが当業者に公知の他の配列が含まれるが、これらに限定されるわ
けではない。こうした制御配列には、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極
初期遺伝子、制御可能ウイルス配列（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター）
、ＳＶ４０アデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、
ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモーター領域
、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ
）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α−接合因子
のプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【００２４】 本発明はまた、抗体及び抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ断片を含む）、ＮＨＰ
のアンタゴニスト及びアゴニスト、並びにＮＨＰ遺伝子の発現を阻害する化合物
若しくはヌクレオチド構築物（転写因子阻害剤、アンチセンス及びリボザイム分
子、又は遺伝子若しくは制御配列置換構築物）、又はＮＨＰの発現を促進させる
化合物若しくはヌクレオチド構築物（例えばＮＨＰコード配列が、プロモーター
、プロモーター／エンハンサーなどの発現調節配列と機能的に結合した発現構築
物）を含む。

【００２５】 ＮＨＰ又はＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列
、抗体、アンタゴニスト及びアゴニストは、疾患の診断のため、突然変異体ＮＨ
Ｐ又は不適切に発現されたＮＨＰを検出するのに有用である可能性がある。ＮＨ
Ｐタンパク質又はペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列、
宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、並びに遺伝的に操作され
た細胞及び動物は、体内で、ＮＨＰの正常機能を混乱させる症候的発現又は表現
型発現の治療に効果的な薬剤のスクリーニング（又はコンビナトリアルライブラ
リーの高処理スクリーニング）に使用できる。操作された宿主細胞及び／又は動
物の使用は、こうした系がＮＨＰの内因性受容体に結合する化合物を同定できる
だけでなく、ＮＨＰ介在活性又は経路を誘発する化合物もまた同定できるという
点で有利である。

【００２６】 最後に、ＮＨＰ産物は、療法剤として用いることが可能である。例えば、ＮＨ
Ｐに対応するＮＨＰペプチド／ドメインのような可溶性誘導体、ＮＨＰ融合タン
パク質産物（特に、ＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰ
、又はＮＨＰのドメインの融合体）、ＮＨＰ抗体及び抗イディオタイプ抗体（Ｆ
ａｂ断片を含む）、アンタゴニスト又はアゴニスト（ＮＨＰ介在経路中の下流標
的を調節する又は該標的に作用する化合物を含む）を用い、疾患又は障害を直接
治療することが可能である。例えば、有効量の可溶性ＮＨＰ、又はＮＨＰ−Ｉｇ
Ｆｃ融合タンパク質又はＮＨＰを模倣する抗イディオタイプ抗体（又はそのＦａ
ｂ）の投与は、内因性ＮＨＰ受容体を活性化するか、又は効果的に中和すること
ができる。こうしたＮＨＰ産物をコードするヌクレオチド構築物を用いて、宿主
細胞がこうした産物をｉｎ ｖｉｖｏで発現するように遺伝的に操作することが
でき；これらの遺伝的に操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として
機能し、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド、又はＮＨＰ融合タンパク質を、連続した供給
で、体に搬送する。機能するＮＨＰ、突然変異体ＮＨＰ、並びにアンチセンス及
びリボザイム分子をコードするヌクレオチド構築物はまた、ＮＨＰ発現を調節す
るための「遺伝子治療」アプローチに使用することもできる。したがって、本発
明はまた、生物学的障害を治療するための医薬製剤及び方法も含む。

【００２７】 本発明の多様な態様は、以下のサブセクションにより詳細に記載される。 ５．１．ＮＨＰ配列 記載されるＮＨＰのｃＤＮＡ配列及び対応する推定アミノ酸配列を、配列表に
示す。ＮＨＰヌクレオチドは、クラスター・ヒト・ジーントラップ配列、ＥＳＴ
、並びにヒト精巣及び乳腺ｃＤＮＡライブラリー（Edge Biosystems、メリーラ
ンド州ゲーサーズバーグ）から得られた。記載される配列はまた、いくつかのコ
ード領域一ヌクレオチド多型（ｃＳＮＰ）も含む可能性がある。第１の多型は、
例えば配列番号２３の７０４位での、ＡからＧへの転移であり、これは例えば配
列番号２４の２３５位で、ｇｌｎからａｒｇへの対応する変化を生じ；第２のも
のは、例えば配列番号２３の２１８４位で発生する可能性があり、これは、例え
ば配列番号２４の７２８位で、ｇｌｎをｈｉｓに変化させ；そして第３のｃＳＮ
Ｐは、例えば配列番号２３の２,４３６位でのＴからＣへのサイレント転移を伴
う。

【００２８】 記載されるＮＨＰに関連した、類似のＭＤＲコード配列、使用及び適用は、本
明細書にその全体を援用する、米国特許第５,１９８,３４４号及び第５,８６６,
６９９号に記載される。

【００２９】 ５．２．ＮＨＰ及びＮＨＰポリペプチド ＮＨＰ、ポリペプチド、ペプチド断片、ＮＨＰの突然変異体、短鎖型、又は欠
失型、及び／又はＮＨＰ融合タンパク質を、多様な使用のために調製することが
できる。これらの使用には、抗体の生成、診断アッセイの試薬としての使用、Ｎ
ＨＰに関連する他の細胞内遺伝子産物の同定のための使用、精神的、生物学的又
は医学的障害及び疾患の療法措置に有用な医薬的試薬として使用できる化合物に
関してスクリーニングするためのアッセイ試薬としての使用が含まれるが、これ
らに限定されるわけではない。類似性情報及び発現データを考慮すると、記載さ
れるＮＨＰは、疾患を治療するため、あるいは、例えば乳癌又は前立腺癌の治療
に用いる化学療法剤の有効性を療法的に増強させるため、（薬剤、オリゴ、抗体
などによって）標的とすることが可能である。

【００３０】 配列表は、記載されるＮＨＰ遺伝子にコードされるアミノ酸配列を開示する。
該ＮＨＰは、典型的には、翻訳開始部位と一致するＤＮＡ配列背景において、イ
ニシエーターメチオニンを有する。

【００３１】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列は、配列表に提示されるアミノ酸配列と共に、そ
の類似体及び誘導体を含む。さらに、他の種由来の対応するＮＨＰ相同体が本発
明に含まれる。実際、上述のＮＨＰヌクレオチド配列にコードされるいかなるＮ
ＨＰタンパク質も本発明の範囲内であり、配列表に提示されるアミノ酸配列のす
べて又はいかなる新規部分をコードする、いかなる新規ポリヌクレオチド配列も
同様である。遺伝暗号の縮重性が周知であり、したがって、配列表に提示される
各アミノ酸は、該アミノ酸をコードすることが可能な周知の核酸「トリプレット
」コドン、又は多くの場合、コドン類の一般的代表例である。こうしたものとし
て、本明細書において意図されるように、配列表に提示されるアミノ酸配列は、
遺伝暗号と併せて考えた場合（例えば、本明細書に援用する“Molecular Cell B
iology”, 1986, J. Darnell et al. eds.， Scientific American Books, New
York, NYの第１０９頁の表４−１を参照されたい）、こうしたアミノ酸配列をコ
ードすることが可能な核酸配列の多様な順列及び組み合わせのすべてのうちの一
般的代表例である。

【００３２】 本発明はまた、いくつかの規準のうちのいずれかにより判断して、本明細書に
記載されるヌクレオチド配列にコードされるＮＨＰと機能的に同等であるタンパ
ク質も包含し、これらの規準はＮＨＰの基質に結合し該基質を切断する能力、あ
るいは同一の又は相補的下流経路を達成する能力、あるいは細胞内代謝（例えば
タンパク質分解活性、イオン流動、チロシンリン酸化など）の変化を含むが、こ
れらに限定されるわけではない。こうした機能的に同等なＮＨＰタンパク質は、
上述のＮＨＰヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の
付加物又は置換物であるが、サイレント変化を生じ、したがって、機能的に同等
な遺伝子産物を産生するものを含むが、これらに限定されるわけではない。アミ
ノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性及び／又は両
親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎
水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、
フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ
酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン
及びグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジ
ン及びヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギ
ン酸及びグルタミン酸が含まれる。

【００３３】 多様な宿主発現ベクター系を用いて、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発現
させることが可能である。本発明の例におけるように、ＮＨＰペプチド又はポリ
ペプチドが膜タンパク質であると考えられる場合、タンパク質の疎水性領域を切
除することが可能であり、そして生じた可溶性ペプチド又はポリペプチドを培地
から回収することが可能である。こうした発現系はまた、ＮＨＰ、又は機能的同
等物をｉｎ ｓｉｔｕで発現する、操作された宿主細胞も含む。こうした発現系
からのＮＨＰの精製又は濃縮は、適切な界面活性剤及び脂質ミセル、並びに当業
者に周知の方法を用いて達成することが可能である。しかしながら、こうした操
作された宿主細胞自体は、ＮＨＰの構造的機能的特性を保持するだけでなく、生
物学的活性を評価することが重要である状況、例えば薬剤スクリーニングアッセ
イで用いることが可能である。

【００３４】 本発明の目的のため使用できる発現系には、ＮＨＰヌクレオチド配列を含む、
組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベ
クターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌）などの微生物；ＮＨＰヌ
クレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサ
ッカロミセス属、ピヒア属）；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（
例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含
む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭ
Ｖ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、又は組換えプラスミド発現
ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳
動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）
又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有
する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含ま
れるが、これらに限定されるわけではない。

【００３５】 細菌系において、発現されるＮＨＰ産物に意図される使用に応じ、いくつかの
発現ベクターを好適に選択することが可能である。例えば、ＮＨＰの医薬組成物
又はＮＨＰを含む医薬組成物の生成のために、あるいはＮＨＰに対する抗体を作
製するために、多量のこうしたタンパク質を産生しようとする場合、容易に精製
される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいこと
がある。こうしたベクターには、融合タンパク質が産生されるように、ＮＨＰコ
ード配列を、個々に、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター内に連結す
ることが可能である、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983,
EMBO J. 2: 1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids
Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 550
3-5509）などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ｐＧＥＸベクタ
ー（Pharmacia又はAmerican Type Cuture Collection）もまた、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、異種ポリペプチド
を発現するのに使用できる。一般的に、こうした融合タンパク質は可溶性であり
、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオン
の存在下で溶出させることによって、溶解された細胞から容易に精製することが
可能である。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物が、ＧＳ
Ｔ部分から遊離できるように、トロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むよう設計されている。

【００３６】 昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体ウイルス（Ａｃ
ＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するのにベクターとして用いられる。該ウイルス
は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する
。ＮＨＰ遺伝子コード配列は、個々に、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘド
リン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリン
プロモーター）の制御下に置くことが可能である。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿
入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化及び非閉塞性組換えウイルス（
すなわちポリヘドリン遺伝子にコードされるタンパク質性コートを欠失するウイ
ルス）の産生が生じるであろう。これらの組換えウイルスを、その後、スポドプ
テラ・フルギペルダ細胞を感染させるのに用い、該細胞において、挿入遺伝子が
発現される（例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith、米国特
許第４,２１５,０５１号を参照されたい）。

【００３７】 哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用できる
。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のＮＨＰヌクレオチド
配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三
分割（tripartite）リーダー配列に連結することができる。その後、このキメラ
遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって、アデノウイルス
ゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１又は
Ｅ３領域）における挿入は、生存可能であり、そして感染した宿主においてＮＨ
Ｐ産物を発現することが可能な組換えウイルスを生じるであろう（例えばLogan
& Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659を参照されたい）
。特定の開始シグナルもまた、挿入されたＮＨＰヌクレオチド配列の効率的な翻
訳に必要とされる可能性がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び
隣接配列が含まれる。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む、全ＮＨＰ遺伝
子又はｃＤＮＡが、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳調節シ
グナルは必要とされない可能性がある。しかしながら、ＮＨＰコード配列の一部
のみが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳調節シグ
ナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確
実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームと位相が同じでなけれ
ばならない。これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、多様な起源の
ものでもよく、天然でも合成でもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー配
列、転写ターミネーターなどを含むことによって、促進させることが可能である
（Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544を参照されたい）
。

【００３８】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、又は特定の望ましい方式で遺伝
子産物を修飾し、そしてプロセシングする、宿主細胞株を選択することができる
。タンパク質産物のこうした修飾（例えば糖鎖形成）及びプロセシング（例えば
切断）は、タンパク質の機能に重要である可能性がある。異なる宿主細胞は、タ
ンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的且つ特異
的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を選択し、発現される異質のタンパ
ク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にすることができる。このために、一
次転写物の適切なプロセシング、糖鎖形成及び遺伝子産物のリン酸化のための細
胞機構を有する真核宿主細胞を使用できる。こうした哺乳動物宿主細胞には、Ｃ
ＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ
３８及び特にヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【００３９】 組換えタンパク質の長期の高収率産生のため、安定な発現が好ましい。例えば
、上述のＮＨＰ配列を安定して発現する細胞株を設計することができる。ウイル
ス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりむしろ、適切な発現調節配列（例え
ばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位
など）によって調節されるＤＮＡ、及び選択可能マーカーで宿主細胞を形質転換
することができる。異種ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、栄養強化培地中で
１〜２日間増殖させ、その後選択培地に移すことができる。組換えプラスミド中
の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が染色体にプラス
ミドを安定して組み込み、そして増殖巣を形成するまで増殖することを可能にす
る。続いて該増殖巣を、クローニングし、そして細胞株へと発展させることがで
きる。この方法は、ＮＨＰ産物を発現する細胞株を操作するのに、好適に用いる
ことが可能である。こうした操作細胞株は、ＮＨＰ産物の内因性活性に影響を与
える化合物をスクリーニングし、評価するのに、特に有用である可能性がある。

【００４０】 いくつかの選択系を用いてもよく、選択系には単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチン−グアニン
・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22: 817）遺伝子が含まれるが、これらに限
定されるわけではない。これらの遺伝子はそれぞれ、ｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-又はａ
ｐｒｔ^-細胞で使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性を、以下の遺伝子
：メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Nat
l. Acad. Sci. USA 77: 3567; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78: 1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Mulligan &
Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノ配糖体Ｇ−４１
８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Bio
l. 150: 1）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerr
e et al., 1984, Gene 30: 147)に関する選択の基礎として使用することができ
る。

【００４１】 あるいは、いかなる融合タンパク質も、発現される融合タンパク質に特異的な
抗体を利用することによって、容易に精製することが可能である。例えば、Jank
necht et al.により記載される系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパ
ク質の容易な精製を可能にする（Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 8972-8976）。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレー
ムが、翻訳された際に、６つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグに融合す
るように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングす
る。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物を、Ｎｉ²⁺・ニトリ
ロ酢酸−アガロースカラム上に装填し、ヒスチジンタグ化タンパク質を、イミダ
ゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。

【００４２】 ５．３．ＮＨＰ産物に対する抗体 ＮＨＰの１以上のエピトープ、又はＮＨＰの保存された変異体のエピトープ、
又はＮＨＰのペプチド断片を特異的に認識する抗体もまた、本発明に含まれる。
こうした抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト
化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆａｂ
発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体及
び上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるわけ
ではない。

【００４３】 本発明の抗体は、例えば、生物学的試料におけるＮＨＰの検出に使用でき、し
たがって、診断又は予後技術の一部として利用でき、それにより異常な量のＮＨ
Ｐに関して患者を調べることができる。こうした抗体はまた、例えば、化合物ス
クリーニング計画と組み合わせて、ＮＨＰ遺伝子産物の発現及び／又は活性に対
する試験化合物の影響を評価するのに利用できる。さらに、こうした抗体は、遺
伝子治療と組み合わせて、例えば、患者への導入前に、正常及び／又は操作ＮＨ
Ｐ発現細胞を評価するのに使用できる。こうした抗体は、さらに、異常なＮＨＰ
活性を阻害するための方法として使用できる。したがって、こうした抗体は、治
療法の一部として利用できる。

【００４４】 抗体の産生のため、多様な宿主動物を、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（例えばＮＨ
Ｐの機能ドメインに相当するもの）、短鎖型ＮＨＰポリペプチド（１以上のドメ
インが欠失しているＮＨＰ）、ＮＨＰの機能的同等物又はＮＨＰの突然変異体を
注入することによって、免疫することができる。こうした宿主動物には、いくつ
かのみを挙げると、ブタ、ウサギ、マウス、ヤギ及びラットが含まれるが、これ
らに限定されるわけではない。宿主種に応じ、多様なアジュバントを用いて免疫
応答を増加させることができる。アジュバントには、フロイントのアジュバント
（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどの無機塩
、リゾレシチン、プルロニックポリオール（pluronic polyol）などの界面活性
物質、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、並びにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルブムのような潜在的に有用なヒトア
ジュバントが含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボ
アルブミン、コレラ毒素又はそれらの断片などの分子と組み合わせて、及び／又
はカップリングすることによって、免疫反応を促進させることが可能である。ポ
リクローナル抗体は、免疫動物の血清由来の抗体分子の不均一な集団である。

【００４５】 特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、連続して
培養される細胞株による抗体分子の産生を提供するいかなる技術によっても得る
ことができる。これらには、Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ技術（1975,
Nature 256: 495-497；及び米国特許第４,３７６,１１０号）、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ技術（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72； Cole et al
., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therap
y, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれるが、これらに限定されるわけで
はない。こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれら
のいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスであってもよい。
本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖ
ｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでｍＡｂが高力価で産生されるため
、この方法は現在好ましい産生法である。

【００４６】 さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、適切な抗原
特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメ
ラ抗体」の産生のため開発された技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. A
cad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608;
Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454）を使用できる。キメラ抗体は、
異なる部分が、異なる動物種に由来する分子、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領
域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。こうした技術は、本明
細書にその全体を援用する、米国特許第６,０７５,１８１号及び第５,８７７,３
９７号、並びにそれらのそれぞれの開示に記載される。

【００４７】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載される技術（米国特許第４,９４６,
７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883;及びWard et al., 1989, Nature 334: 544
-546）を適応させ、ＮＨＰ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生することができ
る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖断片を連結し
、一本鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。

【００４８】 特定のエピトープを認識する抗体断片を、既知の技術によって生成することが
できる。例えば、こうした断片には：抗体分子のペプシン消化によって産生する
ことが可能であるＦ（ａｂ’）₂断片、及びＦ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド架
橋を還元することによって生成することが可能であるＦａｂ断片が含まれるが、
これらに限定されるわけではない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し
（Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281）、所望の特異性を有するモノ
クローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にすることができる。

【００４９】 ＮＨＰに対する抗体は、続いて、当業者に周知の技術を用いて、既定のＮＨＰ
を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するのに利用できる（例えばGreens
pan & Bona, 1993, FASEB J 7(5): 437-444;及びNissinoff, 1991, J. Immunol.
147(8): 2429-2438を参照されたい）。例えば、ＮＨＰドメインに結合し、コグ
ネイト受容体へのＮＨＰの結合を競合的に阻害する抗体を用いて、ＮＨＰを「模
倣する」、したがって、受容体に結合して該受容体を活性化するか又は中和する
抗イディオタイプ抗体を生成することができる。こうした抗イディオタイプ抗体
又はこうした抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片は、ＮＨＰ介在経路に関与する
療法措置で使用できる。

【００５０】 本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様による範囲に限定されるもの
ではなく、この範囲は本発明の個々の態様の単なる例示として示したにすぎない
のであって、機能的に同等の方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際
、当業者には、前述の説明から、本明細書に示されそして記載されるものに加え
、本発明の多様な修飾が明らかになるであろう。こうした修飾は、付随する請求
項の範囲内に含まれるものと意図される。すべての引用される刊行物、特許、及
び特許出願の全体を、本明細書に援用する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ターナー，シー・アレキサンダー，ジュニ ア アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ウインター・ウィート・プレ イス 67 (72)発明者 ネールズ，ミヒャエル ドイツ国82131 ストックドルフ，ポール −ケラー−シュトラーセ ６ (72)発明者 フリードリッヒ，グレン アメリカ合衆国テキサス州77004，ヒュー ストン，ハーマン・ドライブ 2207，ブレ ランド・アンド・ブレランド (72)発明者 ザンブロウィックズ，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアーソーン・プレイス 18 (72)発明者 サンズ，アーサー・ティー アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ブリストール・ベンド・サー クル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 CA12 4C084 AA02 AA13 AA17 BA35 BA44 NA14 ZB262 ZC412 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZB26 ZC41 4H045 AA10 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２３に記載されるＮＨＰ遺伝子に初めて開示された
   ヌクレオチド配列の少なくとも２４の隣接する塩基を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列をコードし；か
   つ （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２３のヌクレオチド配列又はその
   相補体にハイブリダイズする、 ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
3. 【請求項３】 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードし；かつ
   （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列又はその相
   補体にハイブリダイズする、 ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
4. 【請求項４】 （ａ）配列番号４８に示されるアミノ酸配列をコードし；か
   つ （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号４７のヌクレオチド配列又はその
   相補体にハイブリダイズする、 ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。