JP2003511073A - ヒトガラニンファミリータンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 療法、診断、および薬理ゲノミクス適用に用いることが可能な、新規ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年１０月１２日に提出され、そして本明細書に完全に援用
される、米国仮出願第６０／１５８，８４８号の優先権を主張する。１．序論 本発明は、哺乳動物ガラニンと配列類似性を共有するタンパク質をコードする
、新規ヒトポリヌクレオチドの発見、同定、および性質決定に関する。本発明は
、記載されるポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質、融
合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質およびペ
プチドに対する抗体、並びに開示される配列を欠くかまたは過剰発現する遺伝的
に操作された動物、該タンパク質のアンタゴニストおよびアゴニスト、並びに診
断、薬剤スクリーニング、臨床試験監視および生理学的障害の治療に用いること
が可能な、開示された配列にコードされるタンパク質の発現または活性を調節す
る他の化合物を含む。２．発明の背景 ガラニンは、中枢および末梢神経系に存在する、生物学的に活性があるペプチ
ドであり、そして脊髄損傷後、およびエストロゲンに反応し、上方制御される。
ガラニンはまた、多様な生物学的活性、例えば成長ホルモンの放出、インスリン
およびソマトスタチン放出の阻害、胃腸および尿生殖管の平滑筋収縮、および副
腎分泌を調節する、神経ペプチドも含む。ガラニンは、典型的には、より長い前
駆体タンパク質から切断され、そして長さ約２９−３０アミノ酸である。成熟ガ
ラニンタンパク質の最初の１４残基は、非常に保存されている。

【０００２】 これらの機能の重要性を前提に、ガラニンは、とりわけ、体重の制御、行動の
調節、痛み、炎症、神経修復、アルツハイマー痴呆、炎症性腸障害、および感染
性疾患の治療に関連付けられてきている。３．発明の概要 本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチドの発見、同定、およ
び性質決定、並びにこれらのタンパク質の対応するアミノ酸配列に関する。本明
細書に初めて記載される新規ヒトタンパク質（ＮＨＰ）は、動物ガラニンと構造
的類似性を共有する。他の既知のガラニンと異なり、本明細書で記載される配列
は、他のガラニンに共有されるコンセンサス配列のアミノ酸１４が異なる（配列
番号２の位４６で、コンセンサス配列のＨがＶに置換されている）。こうしたも
のとして、新規ガラニンタンパク質は、ガラニンファミリーの新規メンバーに相
当する。ファミリーは、門および種を超える、ある範囲の相同体（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｕｅ）および相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を有する。

【０００３】 本明細書に記載される新規ヒト核酸配列は、長さ１４１および１１６アミノ酸
のタンパク質／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（それぞれ配列番号２
および４を参照されたい）をコードする。

【０００４】 本発明はまた、前記ＮＨＰのアゴニストおよびアンタゴニスト（天然ＮＨＰと
競合する、小型分子、大型分子、変異ＮＨＰ、またはその一部が含まれる）、Ｎ
ＨＰペプチド、および抗体、ならびに、記載されるＮＨＰの発現を阻害するのに
（例えばアンチセンスおよびリボザイム分子、および遺伝子または制御配列置換
構築物）、または記載されるＮＨＰ配列の発現を増進するのに（例えば記載され
る配列を、強いプロモーター系の調節下に置く発現構築物）用いることが可能な
ヌクレオチド配列、およびＮＨＰ導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物
、または機能するＮＨＰを発現しない「ノックアウト」（条件的であってもよい
）を含む。

【０００５】 さらに、本発明はまた、記載されるＮＨＰおよび／またはＮＨＰ産物の精製さ
れた調製物、あるいはＮＨＰを発現する細胞を利用して、ＮＨＰ発現および／ま
たはＮＨＰ活性を調節する、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストとして作
用する化合物を同定するための方法にも関する。こうした化合物は、生物学的障
害または平衡異常に関連する非常に多様な症状のいずれの治療用の療法剤として
使用できる。４．配列表および図の説明 配列表は、記載されるＮＨＰアミノ酸配列をコードする２つのＮＨＰ ＯＲＦ
の配列を提供する。５．発明の詳細な説明 本明細書に初めて記載されるＮＨＰは、とりわけ、ジーントラップされたヒト
細胞株で発現される、新規タンパク質である。本発明は、配列表に提示されるヌ
クレオチド、こうしたヌクレオチドを発現する宿主細胞、こうしたヌクレオチド
の発現産物、および：（ａ）前記遺伝子の哺乳動物相同体（具体的に記載したＮ
ＨＰおよびＮＨＰ関連生成物を含む）をコードするヌクレオチド；（ｂ）ＮＨＰ
の機能性ドメイン（活性ドメインの新規領域が含まれるが、これらに限定されな
い）に対応する１以上の部分をコードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレ
オチド配列により特定されるポリペプチド生成物；（ｃ）前記ＮＨＰの少なくと
も１つのドメインの全部または一部が欠失または変化した遺伝子工学的に形成し
た変異体または天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌク
レオチド配列により特定されるポリペプチド生成物；シグナル配列の全部または
一部が欠失した可溶性タンパク質およびペプチドが含まれるが、これらに限定さ
れない；（ｄ）別のペプチドまたはポリペプチドに融合した、ＮＨＰのコード領
域のすべてまたは一部、あるいはそのドメインの１つ（例えば受容体またはリガ
ンド結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自己結合ドメインなど）を含む、
キメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド；または（ｅ）記載されるポリ
ヌクレオチドの療法的または診断的誘導体、例えば配列表に初めて開示された配
列を含むオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｄ
ｓＲＮＡ、または遺伝子治療構築物を含む。上に論じられるように、本発明は：
（ａ）配列表に提示されるヒトＤＮＡ配列（および該配列を含むベクター）を含
み、そしてさらに、配列表に提示されるＤＮＡ配列の相補体に、非常にストリン
ジェントな条件下、例えば、０．５ Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡ
へのハイブリダイゼーション、および０．１ ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中
、６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら監修， １９８９， Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ニュ
ーヨーク， ｐ．２．１０．３）でハイブリダイズし、そして機能的に同等な遺
伝子産物をコードする、隣接するＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）をコードするいかなるヌクレオチド配列も意図する。さらに意図されるのは、
配列表に提示されるアミノ酸配列をコードしそして発現するＤＮＡ配列の相補体
に、中程度にストリンジェントな条件下、例えば０．２ ｘ ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ中、４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）でハイブリ
ダイズし、それでもなお、機能的に同等なＮＨＰ産物をコードする、いかなるヌ
クレオチド配列でもよいものである。ＮＨＰの機能する同等物は、他の種に存在
する天然に存在するＮＨＰおよび天然に存在するかまたは操作されている（部位
特異的突然変異誘発、遺伝子シャッフリング、例えば米国特許第５，８３７，４
５８号に記載されるような指示発展（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
）かいずれかの突然変異ＮＨＰを含む。本発明はまた、開示されるＮＨＰポリヌ
クレオチド配列の縮重核酸変異体（ｖａｒｉａｎｔ）も含む。

【０００６】 さらに意図されるのは、ＮＨＰ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド、また
は配列表のヌクレオチド配列の対応する領域に約９９、９５、９０または約８５
パーセント類似または同一であるポリヌクレオチド配列（例えば標準的デフォル
ト設定を用いたＧＣＧ配列解析パッケージを用いた、ＢＬＡＳＴ配列比較解析で
測定されるようなもの）にコードされる、その機能的同等物である。

【０００７】 本発明はまた、記載されるＮＨＰヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そし
てしたがってその相補体である、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。こう
したハイブリダイゼーション条件は、上述のように、非常にストリンジェントで
あっても、またはそれほど非常にストリンジェントでなくてもよい。核酸分子が
デオキシオリゴヌクレオチド（”ＤＮＡオリゴ体”）である場合、それらの分子
は本明細書の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、一般に約１６〜約
１００塩基、約２０〜約８０塩基、または約３４〜約４５塩基の長さのもの、ま
たはそこに示すサイズの任意の変更または組合わせである。それらのオリゴヌク
レオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリ
ーのスクリーニング、クローンの単離、ならびにクローニング鋳型および配列決
定用鋳型の調製などを行うことができる。

【０００８】 あるいは、こうしたＮＨＰオリゴヌクレオチドは、ライブラリーをスクリーニ
ングし、そして（特に、マイクロアレイまたは高処理「チップ」形式を用いて）
遺伝子発現パターンを評価するためのハイブリダイゼーションプローブとして用
いてもよい。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド配列またはその相補
配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を提示することができる。一般
に長さ約１６〜約４０（またはこの範囲のうちの任意の自然数）ヌクレオチドの
オリゴヌクレオチドが互いに部分的にオーバーラップしてもよく、および／また
はオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用いてＮＨＰ配列を提示すること
もできる。したがって前記ＮＨＰポリヌクレオチド配列は一般に、それぞれ本明
細書の配列表に初めて開示した、少なくとも約１８、好ましくは少なくとも約２
５ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチド配列を少なくとも約２つまた
は３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、配列表中の配列
内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列に対してセンス（５
’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで進行してもよい。

【０００９】 オリゴヌクレオチドプローブに関しては、非常にストリンジェントな条件は、
例えば、６ ｘ ＳＳＣ／０．０５％ ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４
塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、および
６０℃（２３塩基オリゴ）での洗浄を指す。これらの核酸分子は、例えばＮＨＰ
配列制御に有用な、ＮＨＰ配列アンチセンス分子をコードしても、または該分子
として作用してもよい（ＮＨＰ核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライ
マーのため、および／または該プライマーとして）。ＮＨＰ配列制御に関しては
、生物学的機能を制御するのにこうした技術を用いてもよい。さらに、こうした
配列は、やはりＮＨＰ配列制御に有用であるリボザイムおよび／または三重らせ
ん配列の一部として使用できる。

【００１０】 阻害アンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに、限定されるわ
けではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシ
ル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン
、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノ
メチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒ
ドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノ
シン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシ
ン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３
−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン
、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラ
シル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラ
シル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン
、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉ
ｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チ
オウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラ
シル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−
メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピ
ル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群より選
択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。

【００１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されるわけではないが、アラビ
ノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群
より選択される、少なくとも１つの修飾糖部分も含んでもよい。

【００１２】 さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデー
ト、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
、およびホルムアセタールあるいはそれらのいずれかの組み合わせまたは類似体
（ａｎａｌｏｇ）からなる群より選択される、少なくとも１つの修飾ホスフェー
ト主鎖を含むであろう。

【００１３】 さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマー
オリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ
と特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、該ハイブリッドにおいて、通常のβ−
単位とは対照的に、鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。オリゴヌク
レオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）またはキメ
ラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
２１５：３２７−３３０）である。あるいは、二本鎖ＲＮＡを用い、標的ＮＨ
Ｐの発現および機能を破壊することができる。

【００１４】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野に知られる標準的な方法によっ
て、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから商業的に入手可能なもの）の使用によって、合
成できる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（
１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）の方法によ
って合成でき、そしてメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラス
ポリマー支持体の使用（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：７４４８−７４５１）などによ
って調製できる。

【００１５】 低ストリンジェンシー条件は、当業者に公知であり、そして予測可能であるよ
うに、ライブラリーおよび標識される配列が由来する特定の生物に応じて異なる
であろう。こうした条件に関する手引きには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（およびその定期的な改訂版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌら， １９
８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ニューヨークを参照された
い。

【００１６】 あるいは、適切に標識されたＮＨＰヌクレオチドプローブを用いて、適切にス
トリンジェントな条件を用い、またはＰＣＲによって、ヒトゲノムライブラリー
をスクリーニングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定および性質決定
は、多型（限定されるわけではないが、ヌクレオチド反復、マイクロサテライト
対立遺伝子、単一ヌクレオチド多型、またはコード単一ヌクレオチド多型を含む
）を同定し、既定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造を決定し、そして診断試
験を設計するのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣
接する領域由来の配列を用い、診断法および薬理ゲノミクスに用いることが可能
な、エクソン、イントロン、スプライシング部位（例えばスプライシングアクセ
プターおよび／またはドナー部位）などの内部での突然変異を検出する増幅アッ
セイで用いるためのプライマーを設計することができる。

【００１７】 さらに、本明細書に開示されるＮＨＰ産物内のアミノ酸配列に基づいて設計さ
れた、２つの縮重または「よろめき（ｗｏｂｂｌｅ）」オリゴヌクレオチドプラ
イマープールを用いてＰＣＲを実行することにより、目的の生物由来の核酸から
ＮＨＰ配列相同体を単離できる。反応のためのテンプレートは、ＮＨＰ配列の対
立遺伝子を発現することが知られる、または発現すると推測される、ヒトまたは
非ヒト細胞株または組織から調製された、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および／または
ｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡであってもよい。ＰＣＲ産物は、サ
ブクローニングして、そして配列決定し、増幅された配列が、望ましいＮＨＰ配
列に相当することを確実にすることができる。その後、ＰＣＲ断片を用いて、多
様な方法によって、全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。例えば、増幅断片を標
識し、そしてバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーなどのｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは、標識断片を用いて、ゲ
ノムライブラリーのスクリーニングを介し、ゲノムクローンを単離することがで
きる。

【００１８】 ＰＣＲ技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに用いてもよい。例えば、
ＲＮＡは、標準的な方法にしたがい、適切な細胞または組織供給源（すなわち、
ＮＨＰ配列を発現することが知られる、または発現すると推測されるもの、例え
ば精巣組織）から単離できる。逆転写（ＲＴ）反応は、第一鎖合成のプライミン
グのための増幅断片の最５’端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い
、ＲＮＡに対して行うことが可能である。その後、生じたＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドは、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いて、「テール化」し、ハイ
ブリッドをＲＮアーゼＨで消化し、そしてその後、第二鎖合成を相補的プライマ
ーでプライミングすることができる。このように、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配
列を単離することが可能である。使用できるクローニング戦略の概説には、例え
ばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照されたい。

【００１９】 突然変異ＮＨＰ配列をコードするｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲを用いることに
よって単離することが可能である。この場合、第一のｃＤＮＡ鎖は、推定上、突
然変異ＮＨＰ対立遺伝子を持つ個体において、発現されることが知られるまたは
発現されることが推測される組織から単離されたｍＲＮＡに、オリゴｄＴオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、そして逆転写酵素で新規鎖
を伸長させることによって、合成することが可能である。その後、ｃＤＮＡの第
二鎖は、正常遺伝子の５’端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
を用いて、合成する。これらの２つのプライマーを用い、その後、ＰＣＲを介し
て産物を増幅し、所望により、適切なベクターにクローニングし、そして当業者
に公知の方法を通じて、ＤＮＡ配列解析に供する。突然変異ＮＨＰ対立遺伝子の
ＤＮＡ配列を、対応する正常ＮＨＰ対立遺伝子のものと比較することによって、
突然変異ＮＨＰ配列産物の機能の損失または改変に関与する、単数または複数の
突然変異を確かめることが可能である。

【００２０】 あるいは、突然変異ＮＨＰ対立遺伝子を持つと推測される、または持つことが
知られる個体（例えば、ＮＨＰ関連表現型、例えば肥満、高血圧、炎症性障害な
どを発現している個人）から得たＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリーを構築し
てもよいし、または突然変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが知られる、また
は発現すると推測される組織由来のＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構
築することができる。その後、正常ＮＨＰ配列、またはいかなるものでもよい適
切なその断片を標識し、そしてこうしたライブラリーにおいて、対応する突然変
異ＮＨＰ対立遺伝子を同定するプローブとして用いてもよい。その後、突然変異
ＮＨＰ配列を含むクローンを精製し、そして当業者に公知の方法にしたがい、配
列解析に供してもよい。

【００２１】 さらに、例えば、突然変異ＮＨＰ対立遺伝子を持つと推測される、または持つ
ことが知られる個体において、こうした突然変異対立遺伝子を発現することが知
られる、または発現すると推測される組織から単離したＲＮＡから合成したｃＤ
ＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築できる。この方式では、推定上の突然
変異組織によって作成される遺伝子産物を発現させ、以下に記載されるように、
正常ＮＨＰ産物に対して作成された抗体と共に、標準的抗体スクリーニング技術
を用いて、スクリーニングすることが可能である（スクリーニング技術に関して
は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．およびＬａｎｅ監修， １９８８， “Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバーを参
照されたい）。

【００２２】 さらに、スクリーニングは、例えばアルカリホスファターゼ−ＮＨＰ融合タン
パク質またはＮＨＰ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質などの標識ＮＨＰ
融合タンパク質でスクリーニングすることによって、達成できる。ＮＨＰ突然変
異が、改変された機能の発現遺伝子産物を生じる（例えばミスセンスまたはフレ
ームシフト突然変異の結果として）場合、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体は
、対応する突然変異ＮＨＰ配列産物と交差反応する可能性がある。こうした標識
抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンは、当該技術分野に公知
の方法にしたがって精製し、そして配列解析に供することができる。

【００２３】 本発明はまた、（ａ）前述のＮＨＰコード配列および／またはその相補体（す
なわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発
現を指示する制御要素と機能的に関連した前述のＮＨＰコード配列のいずれかを
含むＤＮＡ発現ベクター（例えば、本明細書に援用する米国特許第５，８６９，
３３６号に記載されるようなバキュロウイルス）；（ｃ）宿主細胞において、コ
ード配列の発現を指示する制御要素と機能的に関連した前述のＮＨＰコード配列
のいずれかを含む、遺伝的に操作された宿主細胞；および（ｄ）外因的に導入さ
れた制御要素の調節下に内因性ＮＨＰ配列を発現する（すなわち遺伝子活性化）
、遺伝的に操作された宿主細胞も含む。本明細書において、制御要素には、限定
されるわけではないが、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オ
ペレーター、および発現をドライブし、そして制御することが当業者に知られる
他の要素が含まれる。こうした制御要素には、限定されるわけではないが、ヒト
サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極初期遺伝子、制御可能ウイルス要素（特に
レトロウイルスＬＴＲプロモーター）、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後
期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージラムダの
主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、
３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファター
ゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモーターが含まれる。

【００２４】 本発明はまた、抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ断片を含む）、ＮＨ
Ｐのアンタゴニストおよびアゴニスト、並びにＮＨＰ配列の発現を阻害する（転
写因子阻害剤、アンチセンスおよびリボザイム分子、あるいは遺伝子または制御
配列置換構築物）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物またはヌクレオチド構
築物（例えばＮＨＰコード配列が、プロモーター、プロモーター／エンハンサー
などの発現調節要素と機能的に関連している発現構築物）も含む。

【００２５】 ＮＨＰまたはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配
列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾患の診断のため、突然変異Ｎ
ＨＰまたは不適切に発現されたＮＨＰを検出するのに有用である可能性がある。
ＮＨＰタンパク質またはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド
配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、並びに遺伝的に操
作された細胞および動物は、体内で、ＮＨＰの通常の機能を混乱させる症候的ま
たは表現型的徴候の治療に効果的な薬剤のスクリーニング（またはコンビナトリ
アルライブラリーの高処理スクリーニング）にも使用できる。操作された宿主細
胞および／または動物の使用は、こうした系がＮＨＰの内因性受容体に結合する
化合物の同定を可能にするだけでなく、ＮＨＰ仲介活性または経路を誘発する化
合物を同定することもまた可能であるという利点を提供することが可能である。

【００２６】 最後に、ＮＨＰ産物は、療法剤として用いることが可能である。例えば、ＮＨ
Ｐに対応するＮＨＰペプチド／ドメインのような可溶性誘導体、ＮＨＰ融合タン
パク質産物（特に、ＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰ
、またはＮＨＰのドメインの融合体）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体
（Ｆａｂ断片を含む）、アンタゴニストまたはアゴニスト（ＮＨＰ仲介経路中の
下流標的を調節するまたは該標的に作用する化合物を含む）を用い、疾患または
障害を直接治療することが可能である。例えば、有効量の可溶性ＮＨＰ、または
ＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タンパク質またはＮＨＰを模倣する抗イディオタイプ抗体
（またはそのＦａｂ）の投与は、内因性ＮＨＰ受容体を活性化するか、または効
果的にアンタゴナイズする可能性がある。可溶性ＮＨＰはまた、タンパク質分解
切断によって、活性ペプチド産物（例えば、配列表に提示されるアミノ酸のいず
れか１つで開始し、そして下流アミノ酸のいずれかで終了する、新規ペプチド配
列いずれか）へと修飾することも可能である。こうした産物またはペプチドは、
さらに、ＮＨＰ融合タンパク質の構築などの修飾に供してもよいし、そして／ま
たは、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの薬
学的に許容しうる剤と組み合わせることによって、誘導体化してもよい。

【００２７】 こうしたＮＨＰ産物をコードするヌクレオチド構築物を用いて、宿主細胞がこ
うした産物をｉｎ ｖｉｖｏで発現するように遺伝的に操作することができ；こ
れらの遺伝的に操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、
ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド、またはＮＨＰ融合タンパク質を、連続した供給で、体
に搬送する。機能するＮＨＰ、突然変異ＮＨＰ、並びにアンチセンスおよびリボ
ザイム分子をコードするヌクレオチド構築物はまた、ＮＨＰ発現の調節のための
「遺伝子治療」アプローチでも使用できる。したがって、本発明はまた、生物学
的障害を治療するための薬剤処方および方法も含む。

【００２８】 本発明の多様な側面は、以下のサブセクションに、より詳細に記載される。 ５．１．ＮＨＰ配列 記載されるＮＨＰのｃＤＮＡ配列（配列番号１および３）および対応する推論
上のアミノ酸配列（配列番号２および４）を配列表に示す。ＮＨＰヌクレオチド
は、ジーントラップされたヒト配列タグから得られた。ガラニンは、典型的には
より長い前駆体タンパク質として産生され、続いて成熟または活性型に（一方の
端または両端で）切断される。ガラニン様コンセンサス配列は、配列番号２およ
び４のアミノ酸番号３３で始まり、そしてこの位は、一般的に、開示されるＮＨ
Ｐの成熟型のアミノ末端を定義するであろう。ガラニンは、典型的には、長さ約
２９−３０アミノ酸である。したがって、本発明のさらなる側面は、配列番号２
または４のアミノ酸位３３より始まるＮ末端を有し、そして少なくとも長さ約１
４アミノ酸伸長し、そして配列表に開示されるアミノ酸位のいずれかにカルボキ
シ末端を有するＮＨＰペプチド、および該ペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列を含む。

【００２９】 神経ペプチドとして、ガラニンは、熱心な科学的精査の対象となっている。記
載されるＮＨＰ、またはその（Ｇ−タンパク質カップリング）受容体が、どのよ
うに産生され、アンタゴナイズされ、プロセシングされ、適用され、そして搬送
されることが可能であるかの例には、例えば、その開示が本明細書に完全に援用
される、米国特許第５，５７６，２９６号および第５，７５６，４６０号、およ
び米国特許出願第６０／０３３，８５１号および０８／７２１，８３７号を参照
されたい。ガラニンへのその構造的関連性を考慮すると、記載されるＮＨＰは、
他のガラニンに関して意図されるように、使用および修飾に適している。

【００３０】 ５．２．ＮＨＰおよびＮＨＰポリペプチド ＮＨＰ、ポリペプチド、ペプチド断片、ＮＨＰの突然変異、一部切除（ｔｒｕ
ｎｃａｔｅｄ）、または欠失型、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様
な使用のために調製することができる。これらの用途には、抗体産生、診断アッ
セイにおける試薬としての用途、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定
のための用途、精神的、生物学的または医学的な障害および疾病の療法処置に有
用な医薬として使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試
薬としての用途が含まれるが、これらに限定されない。

【００３１】 配列表は、記載されるＮＨＰ配列にコードされるアミノ酸配列を開示する。該
ＮＨＰは、翻訳開始部位と一致するＤＮＡ配列背景において、開始メチオニンを
有し、そしてさらに、分泌されるタンパク質に特徴的な疎水性リーダー配列を取
り込む。

【００３２】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列は、配列表に提示されるアミノ酸配列と共に、そ
の類似体および誘導体を含む。さらに、他の種由来の対応するＮＨＰ相同体が本
発明に含まれる。実際、上述のＮＨＰヌクレオチド配列にコードされるいかなる
ＮＨＰタンパク質も本発明の範囲内であり、配列表に提示されるアミノ酸配列の
すべてまたはいかなる新規部分をコードする、いかなる新規ポリヌクレオチド配
列も同様である。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示し
た各アミノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン
（または多くの場合、コドン類）の一般的代表例である。こうしたものとして、
本明細書において意図されるように、配列表に提示されるアミノ酸配列は、遺伝
暗号と一まとめにして考えた場合（例えば、本明細書に援用する“Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， １９８６， Ｊ． Ｄａｒｎｅｌｌら
監修， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， ニューヨー
ク州ニューヨークの１０９ページの表４−１を参照されたい）、一般的に、こう
したアミノ酸配列をコードすることが可能な核酸配列の多様な置換および組み合
わせのすべてのうちの代表である。

【００３３】 本発明はまた、限定されるわけではないが、ＮＨＰの基質に結合しそして切断
する能力、または同一のまたは相補的下流経路を達成する能力、または細胞代謝
（例えばタンパク質分解活性、イオン流動、チロシンリン酸化など）の変化を含
む、いくつかの規準のいずれかにより判断して、本明細書に記載されるヌクレオ
チド配列にコードされるＮＨＰに機能的に同等であるタンパク質も含む。こうし
た機能的に同等なＮＨＰタンパク質は、限定されるわけではないが、上述のＮＨ
Ｐヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または
置換であるが、サイレント変化を生じ、したがって、機能的に同等な遺伝子産物
を産生するものを含む。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、可溶性、
疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行う
ことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および
メチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、
システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；陽性荷電（
塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そし
て陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ
る。

【００３４】 多様な宿主発現ベクター系を用いて、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発現
することが可能である。本発明の例におけるように、ＮＨＰペプチドまたはポリ
ペプチドが、可溶性または分泌分子であると考えられる場合、該ペプチドまたは
ポリペプチドは、培地から回収することが可能である。こうした発現系はまた、
ＮＨＰ、または機能的同等物をｉｎ ｓｉｔｕで発現する、操作された宿主細胞
も含む。こうした発現系からのＮＨＰの精製または濃縮は、適切な界面活性剤お
よび脂質ミセル、並びに当業者に公知の方法を用いて、達成することが可能であ
る。しかし、こうした操作された宿主細胞自体は、ＮＨＰの構造および機能的特
性を保持するだけでなく、生物学的活性を評価することが重要である状況、例え
ば薬剤スクリーニングアッセイで用いることが可能である。

【００３５】 本発明の目的のため、用いてもよい発現系には、限定されるわけではないが、
ＮＨＰヌクレオチド配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミド
ＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌
（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ＮＨ
Ｐヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例え
ばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ
））；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス
）に感染した昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベ
クター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏ
ｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＴＭＶ）に感染した、または組換えプラスミド
発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；哺乳動物
細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）また
は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓ）後期プロモーター；ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒ
ｕｓ）７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を宿する哺乳動物細胞系
（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれる。

【００３６】 細菌系において、発現されるＮＨＰ産物に意図される使用に応じ、いくつかの
発現ベクターを好適に選択することが可能である。例えば、多量のこうしたタン
パク質が、ＮＨＰのまたはＮＨＰを含む薬剤組成物の生成のために、あるいはＮ
ＨＰに対する抗体を作成するために産生される場合、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいことがある。こうし
たベクターには、限定されるわけではないが、融合タンパク質が産生されるよう
に、ＮＨＰコード配列が、個々に、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクタ
ー内に連結されることが可能である、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔ
ｈｅｒら， １９８３， ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１）；ｐＩＮベクター（
Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， １９８５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １３：３１０１−３１０９； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕ
ｓｔｅｒ， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−
５５０９）；およびそれらに匹敵するものが含まれる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａまたはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）もまた
、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、
異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）ポリペプチドを発現するのに用いることもできる。一
般的に、こうした融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロ
ースビーズへの吸着によって、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によっ
て、溶解された細胞から容易に精製することが可能である。ｐＧＥＸベクターは
、クローニングされた標的遺伝子産物が、ＧＳＴ部分から遊離することを可能に
するように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むよう設計さ
れる。

【００３７】 昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｉｄ
ｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、異質の配列
を発現する。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖する。ＮＨＰコード配列は、個々に、
ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、そして
ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の調節下に置くこ
とが可能である。ＮＨＰコード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子の
不活性化および非閉塞性組換えウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子にコード
されるタンパク質性コートを欠くウイルス）の産生が生じるであろう。これらの
組換えウイルスを、その後、スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させるのに
用い、該細胞において、挿入配列が発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈら， １９
８３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６：５８４； Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２
１５，０５１号を参照されたい）。

【００３８】 哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用できる
。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のＮＨＰヌクレオチド
配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよび
三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に連結することができる。その後
、このキメラ配列を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって、
アデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ
１またはＥ３）における挿入は、生存可能であり、そして感染した宿主において
ＮＨＰ産物を発現することが可能な組換えウイルスを生じるであろう（例えばＬ
ｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９を参照されたい）。特定の開
始シグナルもまた、挿入されたＮＨＰヌクレオチド配列の効率的な翻訳に必要と
される可能性がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列
が含まれる。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む、全ＮＨＰ配列または
ｃＤＮＡが、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳調節シグナル
は必要とされない可能性がある。しかし、ＮＨＰコード配列の一部のみが挿入さ
れる場合、おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳調節シグナルが提供
されなければならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするた
め、望ましいコード配列のリーディングフレームと位相が同じでなければならな
い。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方
の、多様な起源のものであってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要
素、転写ターミネーターなどを含むことによって、増進することが可能である（
Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１５３：５１６−５４４を参照されたい）。

【００３９】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または特定の望ましい方式で遺
伝子産物を修飾し、そしてプロセシングする、宿主細胞株を選択することができ
る。タンパク質産物のこうした修飾（例えば糖鎖形成）およびプロセシング（例
えば切断）は、タンパク質の機能に重要である可能性がある。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的
でそして特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択し、発現され
る異質のタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にしてもよい。この
ため、一次転写物の適切なプロセシング、糖鎖形成、および遺伝子産物のリン酸
化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞を用いてもよい。こうした哺乳動物宿主
細胞には、限定されるわけではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および特にヒト細胞株が含まれ
る。

【００４０】 組換えタンパク質の長期の高収率産生のため、安定な発現が好ましい。例えば
、上述のＮＨＰ配列を安定して発現する細胞株を設計することができる。ウイル
ス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞を適切な発現調節
要素（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデ
ニル化部位など）によって調節されるＤＮＡ、および選択可能マーカーで形質転
換することができる。異質のＤＮＡの導入後、操作された細胞を、栄養強化培地
中で１−２日間、増殖させ、そしてその後、選択培地に移す。組換えプラスミド
中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が染色体にプラ
スミドを安定して組み込み、そして増殖巣を形成するよう増殖することを可能に
し、該増殖巣を続いて、クローニングし、そして細胞株へと発展させてもよい。
この方法は、ＮＨＰ産物を発現する細胞株を操作するのに、好適に用いることが
可能である。こうした操作細胞株は、ＮＨＰ産物の内因性活性に影響を与える化
合物をスクリーニングし、そして評価するのに、特に有用である可能性がある。

【００４１】 いくつかの選択系を用いてもよく、限定されるわけではないが、単純疱疹ウイ
ルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）チミジンキナーゼ（Ｗｉｇ
ｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａ
ｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ４８：２０２６）、およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を、それぞれ、
ｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-またはａｐｒｔ^-細胞で使用してもよい。また、代謝拮抗剤
耐性を、以下の遺伝子：メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉ
ｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７
：３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性
を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノ配糖
体Ｇ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ
ら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；およびハイグ
ロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４
， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）に関する選択の基礎として用いてもよい。

【００４２】 あるいは、いかなる融合タンパク質も、発現される融合タンパク質に特異的な
抗体を利用することによって、容易に精製することが可能である。例えば、Ｊａ
ｎｋｎｅｃｈｔらに記載される系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパ
ク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら， １９９１， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７６
）。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレームが、翻訳された際に、
６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合するように、目的の遺伝子
をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。組換えワクシニアウ
イルスに感染した細胞由来の抽出物を、Ｎｉ²⁺・ニトリロ酢酸−アガロースカラ
ム上に装填し、そしてヒスチジンタグ化タンパク質を、イミダゾール含有緩衝液
で、選択的に溶出する。

【００４３】 ５．３．ＮＨＰ産物に対する抗体 ＮＨＰの１つまたはそれ以上のエピトープ、またはＮＨＰの保存された変異体
のエピトープ、またはＮＨＰのペプチド断片を特異的に認識する抗体もまた、本
発明に含まれる。こうした抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体
、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生され
る断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ
結合断片が含まれる。

【００４４】 本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したがって
患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後判定法の一部として使
用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法と組み合わせて
、ＮＨＰ遺伝子生成物の発現および／または活性に対する被験化合物の作用を評
価するのにも利用できる。さらに、こうした抗体は、例えば、患者への導入前に
、正常および／または操作ＮＨＰ発現細胞を評価するため、遺伝子治療と共に用
いてもよい。こうした抗体は、さらに、異常なＮＨＰ活性の阻害のための方法と
して使用することができる。したがって、こうした抗体は、治療法の一部として
利用できる。

【００４５】 抗体の産生のため、多様な宿主動物を、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（例えばＮＨ
Ｐの機能するドメインに対応するもの）、一部切除ＮＨＰポリペプチド（１つま
たはそれ以上のドメインが欠失しているＮＨＰ）、ＮＨＰの機能的同等物または
ＮＨＰの突然変異変異体を用いた注射によって、免疫感作してもよい。こうした
宿主動物には、限定されるわけではないが、いくつかのみを挙げると、ブタ、ウ
サギ、マウス、ヤギ、およびラットが含まれる。宿主種に応じ、限定されるわけ
ではないが、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニ
ウムまたはリン酸アルミニウムなどのミネラル塩、リゾレシチン、プルロニック
ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）などの界面活性物質、ポリアニ
オン、ペプチド、油エマルジョン、並びにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌（ｂ
ａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））および、ざ瘡プロピオンバ
クテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的
に有用なヒトアジュバントを含む、多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応
を増加させることができる。あるいは、テンガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅ
ｔ）ヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン
、コレラ毒素またはそれらの断片などの分子と組み合わせおよび／またはカップ
リングすることによって、免疫反応を増進することが可能である。ポリクローナ
ル抗体は、免疫感作動物の血清由来の抗体分子の不均一な集団である。

【００４６】 特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、連続して
培養される細胞株による抗体分子の産生を提供するいかなる技術によって、得る
ことができる。これらには、限定されるわけではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ ４：７２； Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉ
ｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）が含まれる。こうした抗体は、ＩｇＧ
、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのいかなるサブクラスも含む、
いかなる免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイ
ブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる
。ｉｎ ｖｉｖｏでｍＡｂが高力価で産生されるため、この方法は現在好ましい
産生法である。

【００４７】 さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、適切な抗原
特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる、「キメラ抗体」
の産生のため開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６０４−６０８；
Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４）を
用いてもよい。キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来する分子、例
えばネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するも
のである。こうした技術は、本明細書にその全体を援用する、米国特許第６，０
７５，１８１号および第５，８７７，３９７号、並びにそれらのそれぞれの開示
に記載される。

【００４８】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載される技術（米国特許４，９４６，
７７８； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６
； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら， １９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）を適応させ、ＮＨＰ配列産物に対す
る一本鎖抗体を産生させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ
鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させて一本鎖ポリペプチドにすることに
より形成される。

【００４９】 特定のエピトープを認識する抗体断片を、既知の技術によって形成できる。例
えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化
によって産生することが可能であるＦ（ａｂ’）₂断片、およびＦ（ａｂ’）₂断
片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することが可能であるＦａｂ
断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，
１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１）、望ましい特異
性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易に同定することができる
。

【００５０】 ＮＨＰに対する抗体は、続いて、当業者に公知の技術を用いて、既定のＮＨＰ
を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するのに利用できる（例えばＧｒｅ
ｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ， １９９３， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３
７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ
． １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。例えば、ＮＨＰドメ
インに結合し、そしてその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体へのＮＨＰの結合を競
合的に阻害する抗体を用いて、ＮＨＰを「模倣する」、そしてしたがって、受容
体に結合してそして該受容体を活性化するかまたは中和する抗イディオタイプを
産生することができる。こうした抗イディオタイプ抗体またはこうした抗イディ
オタイプのＦａｂ断片を、ＮＨＰシグナル伝達経路に関与する療法措置に使用で
きる。

【００５１】 本発明は、本発明の個々の態様の例示として示したに過ぎず、本明細書に記載
される特定の態様による範囲に限定されるものではなく、そして機能的に同等の
方法および構成要素が、本発明の範囲内である。実際、本明細書に示されそして
記載されるものに加え、当業者には、前述の説明から、本発明の多様な修飾が明
らかになるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に含まれる。す
べての引用される刊行物、特許、および特許出願が、本明細書にその全体を援用
する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/00 Ａ６１Ｐ 5/30 5/06 5/38 5/30 21/00 5/38 25/00 21/00 25/04 25/00 25/14 25/04 25/28 25/14 29/00 25/28 31/04 29/00 43/00 １０５ 31/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドノホー，グレゴリー アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，フォーレンストーン・ドライ ブ 41 (72)発明者 ワァン，シャオーミン アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ゴスリング・ロード 7575， ナンバー 823 (72)発明者 ヒルバン，エリン アメリカ合衆国テキサス州77379，スプリ ング，スツゥーブナー・エアライン 16222 (72)発明者 ザンブロウィックズ，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアーソーン・プレイス 18 (72)発明者 サンズ，アーサー・ティー アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ブリストール・ベンド・サー クル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 4C084 AA07 AA13 BA01 BA08 BA19 BA22 BA23 CA18 DB10 DB12 DB14 DB59 ZA011 ZA081 ZA161 ZA221 ZA681 ZA941 ZB111 ZB211 ZB351 ZC031 ZC041 ZC111 ZC412 4C086 AA03 EA16 ZA01 ZA08 ZA16 ZA22 ZA68 ZA94 ZB11 ZB21 ZB35 ZC03 ZC04 ZC11 ZC41 4H045 AA10 BA10 CA40 EA20 EA50

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載されるＮＨＰポリヌクレオチドに初めて
   開示されたヌクレオチド配列の少なくとも２４の隣接する塩基を含む、単離核酸
   分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードし；か
   つ （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列またはその
   相補体にハイブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオ
   チド配列を含む、単離核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号２のアミノ酸番号３３で始まる、少なくとも長さ
   約２９アミノ酸の新規アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離
   核酸分子。