KR20010030862A - 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 뉴클레오타이드 및 펩타이드 서열, 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

Description

프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산{NUCLEIC ACIDS CODING FOR PROTEINS CAPABLE OF INTERACTING WITH PRESENILINS}

알츠하이머병은 가장 일반적인 치매이다. 이의 전체적인 빈도는 연령에 따라 증가하여; 65세 이후에는 5 내지 10%, 80세 이상에서는 20%이다.

현재로는, 구체적인 치료책이 없으며 단지 고식적인 간호만이 환자에 제공될 수 있을 뿐이다. 이 질환은 정확한 조기 진단의 부족으로 해서 사후 검시 중에 뇌의 조직학적 분석 후에야 정확히 확인될 따름이다.

알츠하이머병은 조직학적 징후를 구성하는 유기적인 뇌 병변:노인성 플라크, 뉴런의 뉴로피브릴 퇴행, 피질 수준에서 뉴런의 손실 및 위축과 연관되어 있다.

병인학은 복잡하고; 다수의 유전자가 여기에 관여되며 이들이 참여하는 상이한 생리병리학적 메커니즘은 완전하게 이해되고 있지 않다.

조로성 치매와 연관된, 65세 이하의 환자에서 관찰되는 뇌의 해부학적 손상이 기재되어 왔다. 현재, "알츠하이머형 치매"라는 용어는 동일한 특징을 보이는 조로성 치매(65세 이전)와 노인성 치매(65세 이후) 모두를 포괄한다.

두 형태의 질환; 즉 산재형, 즉 유전과 연관되지 않은 형태, 및 가족형이 존재한다.

산재형 질환이 가장 빈번하며; 환자의 60 내지 90%가 이에 걸리며 65세 이후에 가장 빈번하게 출현한다. 병리의 원인은 대부분의 사례에서 미지로 남아있다. 그러나, 두개골 외상, 염증, 정서적 충격 또는 높은 스트레스 상황이 질환 출현 확률을 증가시키는 것으로 확립되어 왔다(Seubert et al., 1992).

가족형 질환은 사례의 10 내지 40%를 나타낸다. 이들은 두 그룹, 즉 후기형(65세 이후)과 초기형(65세 전)으로 분류된다. 초기형의 경우, 증상은 우성 상염색체 형질에 따라 유전된다.

1992년에, AD3 좌의 존재가 14번 염색체에서 입증되었고 1995년에는 프리세닐린 1(PS-1) 유전자가 분리되었다(유전자는 초기에 S182로 명명되었다)(Sherrington et al., 1995). 프리세닐린 1 유전자에서의 돌연변이는 매우 초기 형태 질환(55세 이전)의 70%에 연루되어있다. 초기형의 매우 희소한 사례는 1번 염색체 상에 위치한 프리세닐린 2 유전자에서의 돌연변이와 연관되어 있다(Levy-Lehad et al., 1995). 이 유전자는 프리세닐린 1 유전자와 67%의 동일성을 보이고 있다.

유전자는 12개의 엑손으로 이루어져 있고; 3 내지 12번 엑손이 단백질을 암호화한다. 이 유전자는 편재적으로 발현되고 2.7 kb의 주 전사체와 7.5 kb의 부 전사체를 생성한다(Kovacs, 1996). 단백질은 467개의 아미노산을 포함하고 막 단백질의 구조를 보인다. 단백질은 적어도 8 곳의 잠재적 막횡단 도메인을 보인다. 보고된 돌연변이에 의해 영향받은 코돈에 상응하는 아미노산은 전 단백질에 걸쳐 분포되어 있다; 이들은 소수성 영역(TM) 및 친수성 루프(BL) 모두에 위치되어 있지만, 두 바람직한 영역은 TM2 및 BL6이다.

현재로는, 35 종 이상의 점 돌연변이가 보고되어 있고 현재까지 확인된 돌연변이는 거의 모두 "미스센스(missense)"형이다(즉, 이들은 단백질 서열 상에서 아미노산에 점 변화를 유도한다). 그러나, 스플라이싱에 영향을 미치는 다른 유형의 돌연변이가 최근에 와서 보고되었으며(Perez-Tur et al., 1995); 이 경우에 유전자는 9번 엑손의 손실에 의해 변형된다.

정상 세포에서 프리세닐린의 역할은 아직도 불충분하게 알려져 있다. 다수의 가설이 제시되었다. 이들 가설에서, 프리세닐린 1(PS-1)은 세포 교통에서 소정의 역할을 할 수 있다. 이러한 가설은 인체 신경교 세포내 소포체 및 골지 장치 수준에서 PS-1의 위치추정을 가능케 한 면역세포화학적 결과에 의해 확인된다(Kovacs et al., 1996). 더욱이, PS-1은 세포의 통신 및 음세포작용의 메커니즘과 APP의 단백질분해에서 일정 역할을 할 수 있다(Dewji and Singer, 1996). 제 3의 가설은 사이토스켈레튼, 특히 Tau 단백질과 회합된 마이크로튜불과의 상호작용에 PS-1을 관련시키고 있다(Lew and Wang, 1996). 최종적으로, 구조를 감안하면, PS-1은 시그널 형질도입에 참여하는 G 단백질에 커플링된 수용체의 역할 또는 이와 달리 수송자 또는 이온 채널 역할을 할 수 있다(Van Broeckhoven, 1995).

프리세닐린과 상호작용하는 파트너에 대한 조사는 프리세닐린의 정확한 역할을 이해할 수 있게 할 것이다.

본 발명은 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산의 본 출원인에 의한 동정 결과이다. 이러한 핵산의 동정은 약학적으로 사용될 수 있는 신 폴리펩타이드의 제조를 구상할 수 있게 한다.

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

특정 양태에 따라, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 프리세닐린 PS-1의 대형 루프 전부 또는 일부와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.

좀더 바람직하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부 또는 서열번호 2 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부를 포함한다.

본 발명의 목적상, 유도된 뉴클레오타이드 서열이란 용어는 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변성에 의해 수득되는 유전 암호의 축퇴성으로 해서 고려된 서열과는 상이한 임의 서열, 및 이들 서열 또는 이들의 단편과 하이브리드화하고 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 임의 서열을 나타낸다. 유전적 및/또는 화학적 성질의 변성은 1개 이상의 잔기의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 유도체란 용어는 또한, 다른 세포원, 특히 인체 기원의 세포로부터, 또는 기타 유기체로부터 유도되는, 고려된 서열과 상동성인 서열을 포함한다. 이러한 상동성 서열은 하이브리드화 실험에 의해 수득될 수 있다. 하이브리드화는 핵산 라이브러리를 사용하고, 탐침으로 천연 서열 또는 이의 단편을 사용하여, 변동하는 하이브리드화 조건하에서 수행될 수 있다(Maniatis et al., 1989).

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 인공기원일 수도 있고 아닐 수도 있다. 이들은 게놈, cDNA 또는 RNA 서열, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 이들 서열은 예를 들면, 앞서 제시된 서열을 토대로 하여 생성된 탐침을 이용하여 DNA 라이브러리(cDNA 라이브러리, 게놈 DNA 라이브러리)를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 이러한 라이브러리는 당업자에 공지된 통상의 분자생물학적 기술에 의해 상이한 기원의 세포로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 또한 화학적 합성에 의해 또는 라이브러리를 스크리닝하여 수득한 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 핵산은 당업자에 공지된 임의 기술에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 주제는 또한 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 프리세닐린 PS-1의 대형 루프 및/또는 프리세닐린 PS-2의 대형 루프와 상호작용할 수 있다. 좀더 바람직하게는, 이들은 프리세닐린 PS-1의 대형 루프의 아미노산 310-463의 서열과 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 목적상, 프리세닐린이란 명칭은 프리세닐린 PS-1과 PS-2 자체 및 특히 이들 단백질의 돌연변이형에 상응하는 이들의 상동형을 포함한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1이나 서열번호 2의 서열로부터 선택된 펩타이드 서열 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 목적상, 유도된 폴리펩타이드 서열이란 용어는 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변성에 의해 수득되고 프리세닐린과의 상호작용능을 보유하는, 서열번호 1이나 서열번호 2의 서열에 제시된 서열과는 상이한 임의 폴리펩타이드 서열을 나타낸다. 유전적 및/또는 화학적 성질의 변성은 1개 이상의 잔기의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

이러한 유도체는 특히, 이들의 치료 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키는 목적, 또는 이들에 새로운 약력학적 및/또는 생물학적 특성 부여 목적과 같이 상이한 목적에 따라 생성될 수 있다.

유도체란 용어는 또한, 기타 세포원, 특히 인체 기원의 세포, 또는 기타 유기체로부터 유도되고, 동일형의 활성을 보유하는, 고려된 서열과 상동성인 서열을 포함한다.

유도체는 또한 전술한 펩타이드 서열의 단편을 나타낼 수도 있다. 이러한 단편은 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 특히, 이들은 당업자에 공지된 펩타이드 합성기를 사용하여, 본 출원에 주어진 서열을 토대로 화학적 경로에 의해 합성될 수 있다. 이들은 또한, 목적하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 세포 숙주에서 발현시킴으로써 유전적 경로에 의해 합성될 수도 있다. 이 경우에, 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 주어진 펩타이드 서열 및 유전 암호를 토대로 올리코뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 화학적으로 제조될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 또한, 당업자에 공지된 기술에 따라 효소 절단, 연결, 클로닝 등에 의해, 또는 이러한 서열로부터 생성된 탐침을 사용하여 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 본 출원에 주어진 서열로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 주제는 또한, 프리세닐린의 활성 약화, 억제, 자극 또는 조절을 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도이다.

사실, 본 발명에 따른 단백질을 통한 프리세닐린의 기능 조절, 특히 돌연변이된 프리세닐린의 활성 억제 또는 약화를 구상할 수 있다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포를 서열 발현조건하에서 배양시키고 생성된 폴리펩타이드를 회수하는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 이 경우에, 폴리펩타이드를 암호화하는 부분은 일반적으로 세포 숙주에서 이의 발현을 허용하는 시그널의 조절하에 놓이게 된다. 이러한 시그널(프로모터, 터미네이터, 분비 리더 서열 등)의 선택은 사용된 세포 숙주에 따라 변할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 자가복제성 또는 통합성 벡터일 수 있는 벡터의 부분일 수 있다. 좀더 구체적으로는, 자가 복제성 벡터는 선택된 숙주에서 자가 복제성 서열을 사용하여 제조될 수 있다. 통합성 벡터의 경우, 이들은 상동성 재조합에 의해 벡터의 통합을 허용하는, 예를 들면, 숙주 게놈의 특정 영역과 상동성인 서열을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포이다. 재조합 경로에 의한 본 발명 펩타이드의 생산에 사용될 수 있는 세포 숙주는 진핵세포 및 원핵세포 숙주 모두이다. 적당한 진핵세포 숙주로는 동물 세포, 효모 또는 진균을 들 수 있다. 특히, 효모의 경우, 사카로마이시즈 속, 클루이베로마이시즈 속, 피치아 속, 슈바니오마이시즈 속 또는 한세뉼라 속의 효모를 들 수 있다. 동물 세포의 경우, COS, CHO, C127 또는 인체 신경아세포종 세포 등을 들 수 있다. 진균으로는, 특히 아스퍼질러스 종 또는 트리코더마 종을 들 수 있다. 원핵세포 숙주로는 이.콜라이, 바실러스 또는 스트렙토마이시즈 박테리아의 사용이 바람직하다.

바람직한 양태에 따라, 숙주 세포는 유리하게는, 본 발명의 핵산 발현 및 이로부터 유도된 단백질 생산을 위한 재조합 효모균으로 대표된다.

바람직하게는, 숙주 세포는 본 발명에 따른 단백질 생산을 위한, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 중에서 선택된 적어도 하나의 서열 또는 1개의 서열 단편을 포함한다.

본 발명에 따른 핵산서열의 다른 적용은 약제로 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 유전 안티센스의 생산이다. 안티센스 서열은 주어진 유전자의 암호화 본쇄에 상보적인 소형의 올리고뉴클레오타이드이며, 그 자체는 전사된 mRNA와 특이적으로 하이브리화할 수 있어, 단백질로의 해독이 억제된다. 본 발명의 주제는 또한, 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질의 발현을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 안티센스 서열이다. 이러한 서열은 전술한 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부로 이루어질 수 있으며 단편화 등에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

청구된 서열은 안티센스 서열의 생체내 전달과 생산 또는 프리세닐린의 활성을 조절할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 위한 유전자 요법에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 서열은 이의 생체내 투여를 허용하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 중으로 혼입시킬 수 있다. 벡터는 당업자에게 제조방법이 공지되어 있는 플라스미드일 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터용으로는, 특히 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스 또는 허피스 바이러스형의 벡터를 들 수 있다. 본 출원의 주제는 또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열을 포함하는 결손형 재조합 바이러스이다.

본 발명은 또한 유전자 요법에 사용될 수 있는, 전술한 뉴클레오타이드 서열 또는 상응하는 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 합성 또는 비합성 뉴클레오타이드 탐침의 생산을 허용한다. 이러한 탐침은 프리세닐린 검출용, 또는 유전적 이상(불량한 스플라이싱, 다형 현상, 점 돌연변이 등) 검출용 진단도구로서 시험관내에서 사용될 수 있다. 이들 탐침은 또한 다른 세포원, 바람직하게는 인체 기원의 세포로부터, 전술한 펩타이드를 암호화하는 상동성 핵산서열의 검출 및 분리용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 탐침은 일반적으로 적어도 10개의 염기를 포함하며, 이들은 예를 들면, 전술한 서열 중 하나의 전체 또는 이들의 상보 본쇄의 전체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 탐침은 사용에 앞서 표지된다. 이를 위해, 당업자에 공지된 다양한 기술이 사용될 수 있다(방사능 표지 또는 효소 표지 등).

본 발명의 다른 주제는 전술한 폴리펩타이드에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 단편에 있다. 이러한 항체는 당업자에 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 특히, 이들 항체는 서열이 서열번호 1이나 서열번호 2의 서열 또는 이들의 단편이나 유도체 중에서 선택되는 폴리펩타이드에 대해 동물을 면역시킨 다음 채혈하여 항체를 분리해냄으로써 제조될 수 있다. 이들 항체는 또한, 당업자에 공지된 기술에 따라 하이브리도마를 제조함으로써 생성될 수도 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편은 특히, 전술한 폴리펩타이드와 프리세닐린 간의 상호작용을 억제 및/또는 노출시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 주제는 프리세닐린과 본 발명에 따른 폴리펩타이드 간의 상호작용을 조절하거나 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있는 화합물의 동정방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 조절자 또는 리간드의 동정 및/또는 분리는 하기의 단계에 따라 수행된다:

- 임의로 미확인된, 분자 또는 각종 분자 함유 혼합물을 폴리펩타이드와 분자 간의 상호작용을 허용하는 조건하에서(분자가 폴리펩타이드에 대한 친화성이 있을 경우) 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 전술한 재조합 세포와 접촉시킨 다음,

- 본 발명의 폴리펩타이드와 결합된 분자를 검출 및/또는 분리해낸다.

특정 양태에서, 본 발명의 이러한 방법은 프리세닐린과 본 발명 폴리펩타이드간 상호작용의 효능제 및 길항제의 동정 및/또는 분리에 적용된다.

본 발명의 다른 주제는 전술한 방법에 따라 동정되고/되거나 수득된 리간드 또는 조절자의 약제로서의 용도에 관한 것이다. 이러한 리간드 또는 조절자는 사실 특정의 신경학적 증상의 치료를 가능케 할 수 있다.

본 발명의 주제는 또한, 활성성분으로서 전술한 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 주제는 또한, 활성성분으로서 전술한 적어도 하나의 항체 및/또는 하나의 항체 단편, 및/또는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물, 및 활성성분으로서 전술한 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약학 조성물이다.

또한, 본 발명의 주제는 전술한 펩타이드, 항체 및 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 단편이 상호 또는 다른 활성성분과 배합되는 약학 조성물이다.

본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열이 바이러스 또는 비바이러스 재조합 벡터 중으로 혼입되는 조성물이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 프리세닐린 활성의 조절에 사용될 수 있다. 좀더 바람직하게는, 이들 조성물은 프리세닐린, 특히 돌연변이형의 활성을 적어도 부분적으로 약화시키거나 억제시키기 위한 것이다. 이들은 좀더 바람직하게는, 예를 들면, 알츠하이머병 및 삼체성 21 같은 신경퇴행성 질환 치료용 약학 조성물이다.

본 발명은 신규 뉴클레오타이드와 펩타이드 서열, 및 이들의 약학적 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 단백질의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

도 1: 프리세닐린 I 및 이중 하이브리드 시험에 사용된 부분의 개략도.

도 2: 특히 클론 C(서열번호 1에 상응) 및 클론 D(서열번호 2에 상응)를 함유하는 각종 플라스미드를 운반하는 효모에서의 영양요구성 시험에 의한 yBM-C 및 yBM-D 균주의 분리.

도 3: 인체 조직에서 펩타이드 C 및 D에 상응하는 mRNA의 발현.

도 4: 사용된 포유동물 발현벡터의 개략도.

도 5: 포유동물에서 융합 단백질 C 및 D의 발현.

도 6(a,b,c): 주요 벡터의 지도.

재료와 방법

1) 사용된 효모균은 다음과 같다:

사카로마이시즈 세레비지애 YCM 79 (MATa, ade2, trp1, leu2, lys2, ura3, his3, gal4, gal80, met16 :: GAL1 10-URA3 lacZ, HIS3 :: GAL7-phleo^R).

사카로마이시즈 세레비지애 PCY 2 (MATa, Dga14, Dga180, ade2, trp1, leu2, lys2, his3 URA3 :: GAL1 10-lacZ.

사카로마이시즈 세레비지애 HF7 C (MATa, ura3, his3, ade2, trp1, leu2, lys2, gal4, gal80, can^R, URA3 :: GAL4 결합 부위-CYC1-lacZ, LYS2 :: GAL1-HIS3).

사카로마이시즈 세레비지애 L 40 (MATa, his3, ade2, trp1, leu2, lys2, URA3 :: LexA-lacZ, LYS2 :: LexA-HIS3).

2)사용된 박테리아균은 다음과 같다:

이.콜라이 TG1(F′[traD 36, lacI^q, lacZ D M15, proA⁺B⁺], supE, thi-1, D (lac-pro AB), D (hsdM-mcrB)5 (r_K-m_K-McrB-).

이.콜라이 BL21 (DE3) (F-, ompT, hsdS_B(r_B ^-m_B ^-), gal, dcm, (DE3).

3)각종 균주에 대해 사용된 배양배지는 다음과 같다:

효모를 위한 완전 YPD 배지:

- 박토-효모 추출물(10 g/l) (Difco)

- 박토-펩톤 (20 g/l) (Difco)

- 글루코스 (20 g/l) (Merk)

이러한 배지는 한천(20 g/l)을 가하여 응고시키고 오토클레이브에서 20분간 110℃에서 멸균시킬 수 있다.

효모를 위한 최소 YNB 배지

- 아미노산이 없는 박토-효모 질소 염기 (6.7 g/l) (Difco)

- 글루코스 (20 g/l) (Merk)

이러한 배지는 한천 (20 g/l)을 가하여 응고시키고 오토클레이빙에 의해 멸균시킬 수 있다. 이어서, 영양요구성 효모의 생장에 필수적인 아미노산 또는 질소 염기를 50 mg/l로 가한다. 이어서, 앰피실린을 100 ㎍/ml로 가하여 박테리아 오염을 피한다.

박테리아를 위한 완전 LB 배지

- 박토-효모 추출물 (5 g/l) (Difco)

- 박토-트립톤 (10 g/l) (Difco)

- NaCl (5 g/l) (Difco)

이러한 배지는 한천(12 g/l)를 가하여 응고시키고 오토클레이빙에 의해 멸균시킬 수 있다. 앰피실린 또는 카나마이신을 100 ㎍/ml로 가하여, 상응하는 내성 마커를 운반하는 플라스미드에 의해 형질전환된 박테리아를 선별해낸다.

4)사용된 플라스미드는 다음과 같다:

벡터 pGBT9(도 6(a))는 이.콜라이 균 및 효모에서 증식시키고 선별해낼 수 있는 5.5 kb 셔틀 플라스미드이다. 이 벡터는 ColE1 복제기원과 앰피실린 내성 유전자(이.콜라이에서 증식 및 선별) 및 2 mm 복제기원과 TRP1 유전자(trp1 효모- 트립토판 합성 결손형 에서 선별)를 보유한다. 이 플라스미드는 효모에서, GAL4의 DNA-결합 도메인(DBD)과 해당 펩타이드 간의 융합으로부터 생긴 단백질의 발현에 사용된다. 이 플라스미드는 GAL4의 DBD 영역 하류에 다중 클로닝 부위를 보유하며, 전부 알콜 디하이드로게나제 1을 암호화하는 ADH1 유전자의 프로모터와 터미네이터 사이에 위치한다. GAL4의 DBD는 핵 국재 시그널 서열을 함유한다.

PS-I의 다양한 부분에 상응하는 서열이 EcoRI/SalI 클로닝 부위에 삽입된다.

벡터 pGAD10(도 6(a))는 6.6 kb 셔틀 플라스미드이다. 이 플라스미드는 이.콜라이에서 자신의 증식 및 자신의 선별을 허용하는 ColE1 복제기원 및 앰피실린 내성 유전자를 보유한다. 이 플라스미드는 또한 효모 복제기원(2 mm) 및 형질전환된 효모 분리를 위한 선별가능한 유전자 LEU2를 함유한다. 이 플라스미드는 프로모터와 터미네이터 ADH1 간의 GAL4의 활성화 도메인(AD)을 암호화하는 서열의 하류에 다중 클로닝 부위를 보유한다. GAL4의 AD는 핵 국재화 시그널 서열을 함유한다.

이러한 플라스미드는 상업적인 인간의 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech) 생산에 사용된다. cDNA 서열은 EcoRI 클로닝 부위 중으로 삽입된다.

벡터 pLex 9(도 6(b))는 5 kb 셔틀 플라스미드이다. pGBT9과 마찬가지로, 이 플라스미드도 ColE1 기원, Amp^R유전자, 및 2 mm 복제기원과 TRP1 유전자를 보유한다. 그러나, DNA-결합 도메인을 암호화하는 서열은 박테리아 리프레서 Lex A의 서열이다. 융합 단백질의 발현에 사용된 프로모터와 터미네이터 또한 ADH1 유전자의 것들이다. Lex A의 DBD는 SV40 핵 국재 시그널 서열을 함유한다.

PS-I의 대형 루프에 상응하는 서열이 EcoRI/SalI 클로닝 부위에 삽입된다.

벡터 pGEX-4T1(도 6(b))는 4.9 kb 박테리아 플라스미드이다. 이 플라스미드는 pBR322 복제기원, 앰피실린 내성 유전자, β-갈락토시다제 시스템 억제를 위한 lacIq 유전자를 보유한다. 이 플라스미드는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 단백질과 해당 펩타이드 간의 융합으로부터 생긴 단백질의 박테리아내 발현에 사용된다. 이 플라스미드는 GST 유전자 하류에 펩타이드 암호화 서열 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 보유한다. 전체는 IPTG에 의해 유도가능한 고 발현 수준을 지닌 tac 프로모터에 의해 조절된다. 단백질 생성 후, 해당 펩타이드는 트롬빈 절단에 의해 GST로부터 분리시킬 수 있는 데, 이유는 이 효소에 의해 인지되고 절단된 서열이 이들 두 영역 사이에 도입되기 때문이다.

벡터 pET-29a(도 6(c))는 5.4 kb 박테리아 플라스미드이다. 이 플라스미드는 pBR322 복제기원, f1 파지의 복제기원, 카나마이신 내성 유전자, lacIq 유전자를 보유한다. 이 플라스미드는 융합 단백질의 검출 및 정제를 촉진하는 S-Tag 서열(S 리보뉴클레아제 단백질의 촉매 부위) 및 His-Tag 서열(10개의 히스티딘으로 이루어진 펩타이드)과 융합된 해당 펩타이드의 박테리아내 발현에 사용된다. T7 전사 프로모터는 IPTG에 의한 유도 후 고 발현을 허용한다. 트롬빈에 의해 인지되고 절단된 서열이 S-Tag와 His-Tag 서열 사이에 도입된다.

5)사용된 합성 올리고뉴클레오타이드:

PS-I 서열(Sherrington et al., 1995)로부터, PS-I의 친수성 영역에 상응하는 DNA 단편을 수득하기 위하여 올리고뉴클레오타이드의 다양한 쌍을 규정한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 PCR 증폭 후 서열의 5′에 EcoRI 부위 및 3′에 SalI 부위를 도입시킬 수 있게 한다.

올리고 A CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT (서열번호 3)

올리고 B CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC (서열번호 4)

올리고뉴클레오타이드 A 및 B를 사용하여 대형 루프로부터 유도된 단편 BL6 및 BM을 수득한다.

올리고 C CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG (서열번호 5)

올리고 D CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC (서열번호 6)

올리고뉴클레오타이드 C 및 D를 사용하여 대형 루프의 짧은 영역으로부터 유도된 단편 BR을 수득한다.

올리고 E CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC (서열번호 7)

올리고 F CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA (서열번호 8)

올리고뉴클레오타이드 E 및 F를 사용하여 PSI의 C-말단부로부터 유도된 단편 Ct를 수득한다.

올리고 G CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA (서열번호 9)

올리고 H AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT (서열번호 10)

올리고뉴클레오타이드 G 및 H를 사용하여 PSI의 N-말단부로부터 유도된 단편 Nt를 수득한다.

올리고뉴클레오타이드 I, J 및 K를 사용하여 플라스미드 pGBT9 및 pGAD10의 삽입체를 증폭시키고 서열분석한다. 이들은 각각 GAL4의 DBD, GAL4의 AD 및 ADH1 터미네이터의 서열에 상보적이다.

올리고 I GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG (서열번호 11)

올리고 J CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC (서열번호 12)

올리고 K GGC GAA GAA GTC CAA AGC (서열번호 13)

6) 분자생물학법

플라스미드 DNA의 제조

플라스미드 DNA의 소량 및 대량 제조는 Maniatis 등(1989)에 기재된 프로토콜에 따라 수행된다.

열안정성 Taq 폴리머라제 연쇄 증폭(또는 PCR)

PCR은 열안정성 폴리머라제에 대한 프라이머로 사용될 올리고뉴클레오타이드(약 20 bp로 이루어짐)가 결합할 수 있는 두 공지 영역 간의 DNA 서열을 증폭시킬 수 있다. 반응은 DNA 주형(50 ng), dNTP(0.2 mM), PCR 완충액(10 mM 트리스 HCl pH 8.5, 1 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 0.01% 젤라틴), 두 올리고뉴클레오타이드(각각 500 ng) 및 Ampli Taq DNA 폴리머라제 2.5 IU의 존재하에 100 ㎕의 최종 용적에서 수행된다. 혼합물을 파라핀 오일 2 방울로 덮어 샘플의 증발을 제한한다.

사용된 프로그램은 32 사이클을 포함한다: 주형의 변성을 위한 1 사이클(95℃에서 5분), 30 사이클(95℃에서 변성 1 분, 50℃에서 DNA 주형에 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 1분, 72℃에서 Taq 폴리머라제에 의한 연장 1분), 최종적으로 1번의 최종 연장 사이클(72℃에서 5분).

PCR은 대수 생장기에 있는 박테리아 또는 효모의 배양액에서 직접 수행될 수 있다.

형광에 의한 서열분석

사용된 서열분석 시스템은 Sanger 등(1977)의 방법에서 유도되고 Applied Biosystems에 의해 개발된 형광 서열분석에 대해 적응된다. 사용된 프로토콜은 시스템 고안자에 의해 기술된 것이다(Perkin Elmer, 1995).

연결에 의한 플라스미드 중으로 DNA 단편의 삽입

플라스미드 DNA로부터 또는 PCR 반응으로부터 수득된 삽입체 및 벡터 플라스미드를 이들의 각 완충액(Biolabs) 중 DNA 1 ㎍당 제한효소 1 U로 1 시간 분해시킨다. 효소는 벡터의 타 도메인과 동위상으로 삽입체를 도입하도록 클로닝 부위에 따라 선택된다.

분해로부터 유도된 단편을, BET 1 ml당 0.5 ㎍로 TBE(90 mM 트리스, 90 mM 보레이트, 2 mM EDTA, pH 8)에 만든 0.8% "예비" 아가로스 겔 상에서의 전기영동에 의해 크기별로 분리시킨다. 로딩 블루(용적의 1/10)를 이들이 분자량 마커(1 Kb 래더, Gibco BRL)와 함께 겔에 로딩되기 전에 샘플에 가한다. TBE에서 일정한 90 볼트/cm로 이동시킨다.

DNA를 염기 사이에 개재되는 BET의 형광에 의해 UV하에 노출시킨다. 목적하는 크기의 DNA 단편(벡터 및 삽입체)을 함유하는 겔 조각을 메스로 절단하여 TBE와 함께 투석관에 도입한 다음 100 볼트에서 15분간 전기영동시킨다. 이어서, 겔로부터 추출된 DNA를 회수하고, 1 용적의 페놀/클로로포름/이소아밀레이트(25/24/1)로 처리하며, 0.25 M NaCl의 존재하에 3 용적의 무수 에탄올로 침전시키며, 70% 에탄올로 1회 세척하고 건조시킨 다음 최종적으로 물 20 ㎕에 취한다.

겔 상에서 벡터 및 삽입체 각각의 양을 평가한 후, 삽입체를 총 용적 20 ㎕로 40 I.U.의 T4 DNA 리가제, 1X 최종 연결 완충액(50 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP)의 존재하에 1/1비로 혼합시킨다. 20℃에서 적어도 1 시간 동안 연결시킨다.

플라스미드에 의한 박테리아의 형질전환

1)소위 "TSB"법(Chung and Miller, N.A.R. vol. 16, 1988)은 DNA가 세포 중으로 유입되도록 DMSO 처리에 의해 박테리아 벽을 취약하게 만드는 데 있다. 이의 효율은 DNA 1 ㎍당 10⁶형질전환체이다. 박테리아를 액체 LB 배지에서 교반하에 약 3 시간 배양시킨다(A₆₀₀= 0.6까지). 배양액을 3000 rpm으로 10분간 원심분리시키고 펠릿을 TSB(LB 배지, 10% PEG₄₀₀₀, 5% DMSO, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄)로 초기 용적의 1/10에 취한 다음, 4℃에서 15분간 배양한다. DNA(연결산물에 대해 10 ㎕) 약 50 ng를 감응성 박테리아 100 ㎕에 가한 다음 혼합물을 4℃에서 30분간 배양시킨다. TSBglu(TSB, 20 mM 글루코스)를 가하고 37℃에서 45분간 배양한 후, 박테리아를 플라스미드에 의해 운반된 내성 유전자에 상응하는 항생물질이 들어있는 LB 배지에 플레이팅한다.

2)전기투공은 TSB법보다 1000배 더 효율적인 기술이다; 이러한 기술은 극소량의 DNA가 이용될 수 있을 때(효모에 함유된 플라스미드의 추출 후와 같이) 사용된다. 이 기술은 DNA를 세포 중으로 도입하기 위해서 전기 충격에 의해 박테리아 벽을 취약하게 만드는 데 있다.

박테리아를 교반하에 액체 LB 배지에서 A₆₀₀= 0.6까지 배양시킨다. 사전에 4℃에서 15분간 배양한 배양액을 3000 rpm으로 10분간 원심분리시키고 펠릿을 1 용적의 냉수, 1/2 용적의 냉수, 및 1/5 용적의 10% 냉 글리세롤로 연속적으로 세척한다. 각각의 세척 간에, 박테리아를 3000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 최종적으로 1/1000 용적의 10% 냉 글리세롤에 취한다. 이 박테리아 현탁액 40 ㎕를 전기투공 탱크 중 DNA 1 ㎕와 혼합시킨다. 박테리아에 전기 충격(25 mF, 2.5 kV, 200 W)을 가하기 위해 탱크를 BioRad Gene Pulser에 배치한다. 37℃에서 45분간 배양한 후, 박테리아를 선별용으로 사용된 항생물질을 함유하는 LB 배지에 플레이팅한다.

막으로 전이 후 mRNA의 하이브리드화(또는 노던 블롯팅)

사용된 막은 각종 인체 조직에서 유도된 mRNA가 이미 전이되고 고정된 시판 Clontech 니트로셀룰로스 막이다.

방사능 DNA 탐침을 Amersham "Rediprime DNA Labelling System" 프로토콜에 따라 제조한다. 이 프로토콜에 따라 37℃에서 10분 배양 후 DNA 단편 중으로 55% 이상의 [³²P]dCTP(50 mCi) 혼입율을 달성하고 2 시간 하이브리드화 및 밤새 방사선 사진 촬영 후 0.5 pg에 상당하는 RNA 밴드를 검출할 수 있다.

막을 교반하에 42℃에서 약 2 시간 동안 하이브리드화 용액(1 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄pH 7.4; 10 mg/ml Ficoll, 10 mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 10 mg/ml BSA, 100 mg/ml 연어 정충 DNA, 2% SDS) 8 ml로 예비하이브리드화시킨 다음, 이들을 교반하에 42℃에서 24 시간 동안 하이브리드화 용액 8 ml와 혼합한 탐침과 2 x 10⁶cpm/ml로 하이브리드화시킨다; 이어서, 이들을 세척 용액 1(0.3 M NaCl, 30 mM 나트륨 시트레이트 pH 7, 0.05% SDS)로 수 회 세정하고, 이 동일 용액에서 40분간 세척하며, 세척 용액 2(15 mM NaCl, 1.5 mM 나트륨 시트레이트 pH 7, 0.1% SDS) 중 50℃에서 40분간 배양한 다음 최종적으로 이들을 방사선 사진 촬영한다.

7) 이중 하이브리드 시스템에 대한 방법

시스템 원리

1989년 Song 및 Fields에 의해 개발된 이중 하이브리드 시스템은 효모 사카로마이시즈 세레비지애에서, 생체내 상호작용에 의한 클로닝을 위한 기술이다. 이 기술은 일부 진핵세포 트랜스액티베이터가 기능 발휘에 단지 두 도메인만을 요구한다는 사실에 기초한다: 특이적 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인(DBD) 및 전사 기구(RNA polII)를 보충하는 활성화 도메인(AD). 두 도메인이 분리될 때, AD는 정확하게 자리잡을 수 없고 전사는 유도되지 않는다.

이 시스템에서, DBD는 단백질 X에, AD는 단백질 Y에 융합된다. 단백질 X와 Y가 상호작용할 경우, 기능성 트랜스활성화 복합체가 형성되고 DBD에 의해 인지된 서열의 하류에 놓인 리포터 유전자의 발현을 유도한다. 유전자의 발현은 두 단백질 간의 상호작용을 간접적으로 규명할 수 있게 한다.

하나 또는 두 개의 상이한 플라스미드에 의한 효모의 형질전환

효모를 Gietz(Gietz et al., 1995)에 의해 기술된 방법에 따라 LiAc/PEG 처리로 감응성이 되게 만든다.

효모를 고체 YPD 배지상 28℃에서 밤새 배양한다. 이어서, 이들을 1 ml의 멸균 용액 I(0.1 M LiAc, 10 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA pH 7.5)에 재현탁시키고, 3000 rpm으로 1분간 원심분리한 다음 다시 1 ml의 용액 I에 취한다. 이어서, 현탁액 50 ㎕을 연어 정충 DNA(캐리어 DNA) 5 ㎍, 플라스미드 DNA 1 내지 5 ㎍ 및 멸균액 II(0.1 M LiAc, 10 mM 트리스 HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 50% PEG₄₀₀₀)와 혼합시킨다. 혼합물을 28℃에서 30분간 배양시킨 다음 42℃에서 20분간 열충격을 가한다. 3000 rpm으로 1분간 원심분리한 후, 세포를 멸균수로 1회 세척한 다음 멸균수 100 ㎕에 취한다. 이어서, 효모를 이의 생장에 필수적인 아미노산 및 질소 염기로 보충한 YNB 한천 배지에 플레이팅한다. 형질전환된 효모균의 선별을 허용하기 위해, 플라스미드에 의해 운반된 선별 마커에 상응하는 아미노산 및 질소 염기를 가하지 않는다. 플레이트를 오븐내 28℃에서 3일간 둔다.

cDNA 라이브러리에 의한 효모의 형질전환

사용된 cDNA 라이브러리는 정상인(뇌 외상 뒤에 사망한 37세 남성) 뇌로부터의 mRNA로 이루어진 시판 라이브러리(Clontech)이다. cDNA를 GAL4의 AD 영역 하류의 플라스미드 pGAD10 중으로 EcoRI 부위에 클로닝시킨다. 삽입체의 평균 크기는 표준편차가 1 kb인 1.4 kb이다. 클론의 80%가 삽입체를 함유하는 1.2 x 10⁶개의 독립 클론을 수득하기 위하여 라이브러리를 이.콜라이 DH5a에서 1회 증폭시킨다.

라이브러리의 양호한 대표성을 보존하기 위해서는, 라이브러리 작제 중 수득된 독립 클론의 수보다 2 내지 10배 더 많은 형질전환체 수를 구축하는 것이 필요하다. 따라서, 양호한 형질전환 효율(DNA 100㎍당 약 10⁷개의 형질전환체)을 달성케 하는 프로토콜이 사용된다.

PS-I 영역에 상응하는 서열을 함유하는 플라스미드 pGBT9에 의해 사전에 형질전환된 YCM79 효모를 50 ml의 YNB +His +Lys +Ade +Met +Leu +Ura 배지 중 28℃에서 교반하에 밤새 배양한다. 이 예비배양액의 광학 밀도를 측정하여 1 ml당 세포수를 평가하고 YPD 배지 250 ml 중으로 접종될 용량을 계산하여 교반하에 28℃에서 하룻밤 후 10⁷세포/ml(약 A₆₀₀= 0.8)의 배양액을 수득한다.

이어서, 세포를 3000 rpm으로 10분간 원심분리에 의해 수거하고, 멸균수 100 ml로 2회 세척하여 10 ml의 형질전환 용액 I에 취한다. 현탁액을 원심분리하고(3000 rpm으로 10분) 세포를 동일 용액 2.5 ml에 재현탁시킨다. 현탁액 일부를 제거한다(200 ㎕); 절반은 비형질전환 음성 대조군으로 사용되고, 나머지 절반은 형질전환 효율을 알고 있는 대조군 플라스미드로 형질전환될 것이다. 나머지 현탁액은 cDNA 플라스미드 라이브러리 100 ㎕와 1 mg/ml로 및 20 ml의 용액 II와 혼합시킨다. 3000 rpm으로 15분간 원심분리하기 전에 혼합물을 교반하에 28℃에서 1 시간, 이어서 42℃에서 20분간 배양시킨다. 세포 펠릿을 물로 1회 및 PBS로 2회 세척하여 효모에 유독한 효과를 미치는 PEG를 적절히 제거한 다음, 멸균 PBS(50 mM Na₂HPO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, pH 7) 2.5 ml에 취한다.

YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura 배지 250 ml를 이 현탁액으로 접종하고 교반하에 28℃에서 4 시간 배양하여 하이브리드 단백질의 발현, 이의 가능한 상호작용 및 URA3 리포터 유전자의 발현을 허용시킨다. 그러나, 이 단계는 양성 클론의 수를 증배시키는 효과가 있다. 콜로니 수의 증폭율을 평가하기 위하여, 배양액 1 ml를 배양 전후에 제거하고 다양한 희석액을 YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura 한천 배지 상에 플레이팅한다. 생장 후, Leu+, Trp+ 클론의 수를 측정하여 배양기 전후의 형질전환 빈도를 평가하고, 이로부터 증폭율을 추론해낸다.

이어서, 세포를 3000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 멸균수로 2회 세척하여 YNB 10 ml에 취한 다음 각각 YNB +His +Lys +Ade +Met 선별배지 200 ml를 함유하는 435 cm²의 플레이트 10개에 플레이팅한다. 플레이트를 오븐내 28℃에서 3일간 둔다.

효모로부터 플라스미드 DNA의 추출

이 기술은 효모에 함유된 플라스미드와 게놈 DNA 모두를 추출한다. 플라스미드를 분리해내기 위해서는, 플라스미드 DNA만이 복제할 수 있는 박테리아를 형질전환시키고 미니제조 후 각각의 클론을 분석하는 것으로 충분하다. 플라스미드를 함유하는 효모를 선별 고체 YNB 배지 중 28℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 이들을 글래스 비드(직경 450 ㎛) 및 페놀/클로로포름 200 ml의 존재하에 붕괴 용액(2% 트리톤 X100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA) 200 ml에 재현탁시킨다. 혼합물을 와동하에 15분간 교반시킨 다음 14,000 rpm으로 2분간 원심분리시킨다. 수성상을 막 위에서 1 시간 동안 투석시킨다. 이 용액은 전기 투공에 의한 박테리아의 형질전환용으로 사용될 수 있다.

β-갈락토시다제 활성의 규명

이 시험은 형질전환된 효모에서 β-갈락토시다제를 암호화하는 LacZ 리포터 유전자의 발현을 입증 가능케 한다.

니트로셀룰로스 시이트를 개별화된 효모 클론 위에 배치한다. 레플리카를 액체 질소에 30초간 3회 침지시켜 효모를 붕괴시키고 β-갈락토시다제 기질에 접근되도록 한다. 이어서, 시이트를 새로 제조한 PBS/Xgal 용액(PBS 5 ml 중의 디메틸포름아미드내 40 mg/ml의 Xgal 기질 용액 100 ㎕)으로 함침시킨 왓트만 페이퍼 상의 상부 콜로니에 배치한 다음, 시험된 효소 활성에 대한 최적온도인 37℃에 둔다.

β-gal 활성의 출현을 나타내는 청색에 대한 시간은 수 분에서 수 시간에 걸쳐 매우 가변적이다. 시험은 청색으로 급변하는 상호작용에 대한 양성 대조군 및 백색으로 잔류하는 음성 대조군의 존재하에 수행된다.

낙하시험

본 시험은 효모균의 표현형 분석을 가능케 한다. 경미하게 혼탁한 효모 현탁액 1 방울(약 5 ml)을 각종 선별 및 비선별 한천 배지에 떨어뜨리고 28℃에서 2일간 배양한 후 효모의 생장을 관찰한다.

플라스미드의 분리

본 과정은 플라스미드 분리를 이용하는, 형질전환된 효모의 표현형이 확실히 플라스미드의 존재와 연관되어 있는 지 여부의 시험을 수반한다.

효모를 완전 YPD 배지 상 28℃에서 밤새 배양한다. 이 비선별 배지는 세포 분열 후 플라스미드를 보유하거나 보유하지 않는 효모의 생장을 허용한다. 이 배양액의 다양한 희석액을 플레이팅하여 28℃에서 밤새 배양 후 YPD 배지의 플레이트당 50 내지 100개의 클론을 수득한다. 이어서, 다양한 선별 배지 상 벨벳에서의 레플리카 플레이팅에 의해 클론의 표현형이 시험되며 28℃에서 2일간의 배양 후 플라스미드를 함유하지 않는 세포의 빈도를 평가할 수 있다.

8)시험관내 상호작용에 대한 시험방법

시험 원리

본 시험은 친화성 크로마토그래피의 생화학적 기술을 이용하여 두 단백질 간의 상호작용을 입증하는 과정을 수반한다. 단백질의 추정적인 파트너 중 하나를 함유하는 세포 추출물을 미끼(bait) 단백질을 사전에 부착시킨 지지체에 가한다. 단백질과 이의 가능한 파트너 간의 상호작용이 존재할 경우, 파트너 또한 지지체 상에 잔류하게 될 것이다.

이.콜라이내 융합 단백질의 발현

IPTG에 의해 유도가능한 발현벡터 pET 및 pGEX를 이용하여 이.콜라이 BL21(DE3)에서 융합 단백질을 생성시킨다.

재조합 플라스미드로 사전에 형질전환된 BL21(DE3) 박테리아를, 이의 선별에 사용된 항생물질(pGEX의 경우 앰피실린 또는 pET의 경우 카나마이신, 100 ㎍/ml)이 들어있는 LB 배지에서 교반하에 밤새 배양한다. 이 예비배양액 5 ml를 LB+항생물질 배지 45 ml에 접종하여, 37℃에서 1 시간 교반 후 A₆₀₀= 0.6의 배양액을 수득한다. 이어서, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 단백질 생성을 유도하고 박테리아를 1 내지 4 시간 교반하에 37℃에 둔다. 단백질 발현세포를 6000 rpm으로 5분간 원심분리하여 수거한다. 페릿을 -20℃에서 유지시킬 수 있다.

박테리아에서 생성된 단백질의 추출 및 분석

융합 단백질을 함유하는 박테리아 펠릿을 TE(50 mM 트리스 HCl pH 8, 2 mM EDTA) 5 ml에 재현탁시킨다. 세포를 라이소자임 0.1 mg/ml 최종 및 1% 트리톤 X-100으로 용해시킨다. 이들을 초음파처리하기 위해 얼음에 두기에 앞서 30℃에서 15분간 박테리아 현탁액이 유체가 될 때까지 배양한다. 박테리아 용해물을 4℃에서 10,000 rpm으로 15분간 원심분리시킨다. 가용화된 융합 단백질을 함유하는 상등액을 -20℃에서 보관할 수 있다.

이 단계에서, 수득된 각종 분획은 겔 전기영동(SDS PAGE)을 변성시켜 분석된다. 원심분리 전 박테리아 현탁액 60 ㎕(전체 분획), 상등액 60 ㎕(가용성 분획) 및 TE 5 ml에 재현탁된 펠릿 60 ㎕(불용성 분획)를 제거한다. 각종 분획에 함유된 단백질을 1/4 용적의 로딩 블루 4HL(0.2 M 트리스 HCl pH 6.8, 5% SDS, 5% 글리세롤, 0.5% 2-머캅토에탄올, 브로모페놀 블루)의 존재하에 95℃에서 10분간 변성시킨 다음 이들이 전기영동에 의해 이들의 분자량에 따라 분리되는 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩한다. 125 볼트/cm에서의 이동 후, 겔을 쿠마시 블루로 염색시킴으로써 단백질을 검출해낸다.

단백질의 가용화

이.콜라이내 외인성 유전자의 발현은 봉입체를 형성하는 외인성 단백질 응집체의 출현을 동반할 수 있다. 그래서, 재조합 단백질은 원심분리에 의한 정제가 용이하지만, 종종 가용화하기가 어렵다.

불용성 분획에 존재하는 단백질을 6 M 우레아 및 10 mM DTT로 10분간 37℃에서 변성시킨 다음 적어도 6 시간 동안 3 종의 연속 완충액 각각(5 mM 트리스 HCl, pH 8/2 M 우레아; 5 mM 트리스 HCl, pH 8 / 1 M 우레아; 5 mM 트리스 HCl, pH 8)에서 투석에 의해 재생시킨다. 10,000 rpm으로 15분간 원심분리 후, 단백질의 약 5 내지 10%가 -20℃에서 보관될 수 있는 상등액에 존재한다.

친화성 크로마토그래피

양호한 상태로 단백질이 보유되기 위해서는, 샘플내 단백질 농도가 40 mg/ml 이상이어야 한다. 이러한 농도는 측색법(예를 들면, Bradford 시약)에 의해 평가될 수 있다.

비융합 GST 또는 GST-ML(프리세닐린 1의 돌연변이 루프)을 함유하는 가용성 분획 200 ㎕를 "글루타치온 수지" 300 ㎕의 존재하에 20℃에서 2분간 배양한다. 비드에 의해 보유되지 않은 분획을 수집한다. 수지를 세척 완충액(20 mM 트리스 HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X100)으로 4회 세척하여 비특이적 흡착에 의해 결합된 단백질을 제거한다. GST 또는 GST-ML이 결합된 수지 150 ㎕를 교반하에 4℃에서 1 시간 동안, STag 또는 STag-Pep126을 함유하는 가용성 분획 600 ㎕와 배양한다. 이어서, 아가로스 비드를 3000 rpm으로 1분간 원심분리시키고, 비보유 분획을 수집한 후 세척 완충액으로 4회 세척한다.

각 분획(가용성, 비드에 의해 비보유 및 보유)의 분취량을 로딩 블루 존재하에 95℃에서 변성 후 SDS PAGE 겔 상에 침착시킨 다음, 전기영동에 의해 분리시킨다. 이어서, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 전이한 다음 막을 퐁소(Ponceau) 레드(20 ㎍/ml)로 염색시켜 단백질이 확실히 전이되었는 지를 입증한다.

S-Tag와 융합된 단백질을 특이적으로 검출할 수 있기 위해, 니트로셀룰로스 막을 TBST(10 mM 트리스 HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20) 중 1% 젤라틴으로 15분간 포화시킨 다음 알칼라인 포스파타제와 결합된 단백질 S와 15분간 배양한다. TBST로 4회 세척 후, Novagen법에 따라 NBT 및 BCIP를 함유하는 1X AP 완충액을 첨가하여 알칼라인 포스파타제 활성을 드러나게 한다.

9) 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현방법

포유동물 세포내 발현용 벡터의 작제

포유동물 세포에서의 발현을 위해, 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 통상적인 방법에 의해, 강력한 바이러스 프로모터(CMV)의 조절하에 있는 벡터 중으로 아클로닝한다.

세포의 형질감염

COS1 세포 또는 CHO 세포에 대해 확립된 방법은 DNA에 대해 1:8(중량/중량)의 비로 리포펙턴트 및 DNA의 압축 및 형질감염 효율의 최적화를 위해 동비의 합성 펩타이드(H1)를 사용함에 있다. 이 방법은 특히, 리포펙턴트의 양전하에 의한 DNA의 포스페이트 전하의 중화를 토대로 한다.

COS1 세포를 배양기내, 3% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 태 송아지 혈청으로 보충한 4.5 g/l 글루코스를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco 변형 이글 배지)(Gibco BRL) 중 37℃, 95% 습도 및 5% CO₂에서 배양한다.

형질감염 전날에 세포를 100 mm 플레이트당 2.5 x 10⁶세포의 밀도로 접종한다. 형질감염 전날에, 배양기내 적어도 15분간의 적응을 위해 세포를 PBS(포스페이트 완충 생리식염수)로 2회, OptiMEM(특허 조성물; Gibco-BRL)로 1회 세정한다.

플라스미드 DNA 총 8 ㎍을 100 mm 플레이트당, OptiMEM 300 ㎕ 및 합성 펩타이드(H1) 64 ㎍에 가한다. 10초간 격렬하게 와동시킨 후, 5분간 대기한 뒤에, OptiMEM 300 ㎕에 희석시킨 리포펙타민(32 ㎕, 즉 64 ㎍)을 선행 혼합물에 가한다. 전체를 다시 격렬하게 와동시킨 다음 30분간 정치시킨다. 튜브당 OptiMEM 5 ㎖를 가하고 와동 혼합물을 세포(이로부터 배지를 사전에 흡인함) 위에 배치한다. 이어서, 세포를 배양기 안에 4 시간 동안 두고, 이후 혼합물을 완전 배지로 대치한다.

세포 용해 및 단백질 분석

세포는 가장 통상적으로는 형질감염 48 시간 후(발현을 위한 통상적인 최대) 용해된다. 용해 완충액은 10 mM 트리스 pH 7.5, 1 mM EDTA, 1% 트리톤 X100, 1% NP40 및 프로테아제 억제제 칵테일(Complete8, Boehringer-Mannheim)을 함유한다. 각 플레이트에 대해, PBS로 세정한 후, 냉각 완충액 800 ㎕를 가한다. 이어서, 용해물을 음파처리한 다음 4℃에서 밤새 마그네틱 바로 교반시킨다. 15,000 x g로 30분간의 원심분리는 상등액으로부터 펠릿을 분리시킨다.

이어서, 가용성 단백질을 후속 실험을 표준화할 수 있도록 BCA 키트(Pierce)를 토대로 분석한다.

면역이동

샘플(세포 용해물)을 등용적의 로딩 완충액(125 mM 트리스 pH 6.8, 4% m/v SDS, 20% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루, 50 mM 디티오트레이톨) 중 95℃에서 5분간 변성시킨다. 프리세닐린 발현 분석을 위해, 샘플을 8 M 우레아의 존재하에 및 95℃에서 프리세닐린에 특이적인 응집을 피하기 위해 37℃에서 변성시킨다.

샘플을 구별하고자 하는 분자량에 따라 아크릴아미드의 상이한 %로, 트리스-글라이신 겔(Novex) 상에 침착시킨다. 또한, 분자량 마커를 침착시킨다(Broad Range, BioRad). 이동은 1X 최종 SDS 완충액(Novex)내 일정한 100 볼트에서 약 2 시간 동안 일어난다. 이어서, 겔을 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로(10% 메탄올 함유 1X 최종 전이 완충액(Novex) 일정한 150 mA에서 2 시간 동안 전이한다.

전이 후, 막을 2% 탈지유를 함유하는 PBS-T(0.5% 트윈 함유 PBS)(Merck) 50 ml 중 실온에서 2 시간 동안 블로킹시킨다. 제 1 항체(2% 탈지유를 함유하거나 함유하지 않는 PBS-T 중 1/1000 내지 1/5000 정도의 최적 농도로 희석)를 4℃에서 밤새 방치한다. PBS-T에서 단기 세정 후, 막을 소위 "ECL" 완충액(20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈) 중에 1/5000으로 희석된 제 2 항체(호스래디쉬 퍼옥시다제에 커플링된, 사례에 따라 안티-마우스 또는 안티-토끼 Ig G)의 존재하에 45분간 배양한다.

이어서, 막을 "ECL" 완충액 중에서 15분간 4회 세정한다. 이는 등용적으로 새로 혼합시킬 두 완충액으로 이루어진 ECL 시약(Amersham)으로 드러나게 할 수 있다. 사진촬영 필름(Hyperfilm ECL; Amersham)의 다양한 노출을 실행한 다음, 현상한다.

실시예 1: 뇌 cDNA 융합 라이브러리 스크리닝에 의한 PS 1 특이성 파트너의 분리

PS 1 단백질 특이성 파트너 분리 목적에 따라, 인간의 뇌 cDNA 라이브러리를 이중-하이브리드 기술에 의해 스크리닝한다. GAL4의 AD와 융합된 cDNA의 라이브러리가 사용되며 PS-I의 친수성 영역과 GAL4의 DBD를 융합시켜 각종 미끼 단백질을 작제한다.

1.1 GAL4의 DBD와 PS 1의 친수성 영역 간 융합으로부터 생긴 단백질의 발현을 허용하는 벡터의 작제

PS 1의 상이한 친수성 영역에 상응하는 서열이 GAL4의 DBD 서열과 동일한 판독 프레임에 도입된 벡터 pGBT9을 사용하여 5 종의 융합 단백질을 생산한다. N-말단 영역(Nt, 코돈 1 내지 81), 대형 루프(BL6, 코돈 263 내지 407), L286V 돌연변이를 갖는 대형 루프(BM), 대형 루프의 짧은 영역(BR, 코돈 290 내지 376) 및 최종적으로 단백질의 C-말단부(Ct, 코돈 421 내지 467)와 상호작용하는 단백질이 동정되도록 선택한다.

이들 각종 영역에 상응하는 DNA 단편을 PS 1의 cDNA의 전체 서열로부터 PCR에 의해 수득한다. 사용된 각종 올리고뉴클레오타이드는 각각의 증폭된 서열 말단에 EcoRI 및 SalI 부위의 도입을 허용한다. 따라서, GAL4의 DBD 하류에 이와 동위상으로 pGBT9의 다중 클로닝 부위의 EcoRI 및 SalI 부위 사이에 PCR 단편을 삽입시킬 수 있다. 수득된 각종 작제물인 pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR 및 pGBT-Ct는 DNA를 서열분석함으로써 증명된다. 이러한 증명결과는 단편이 PCR에 의해 생성된 어떠한 돌연변이도 보이지 않으며 이들이 확실히 GAL4의 DBD의 서열의 것과 동일한 개방 판독 프레임에 있음을 보여준다.

1.2 GAL4의 DBD와 PS 1의 친수성 영역 간의 융합으로부터 생긴 단백질을 발현하는 효모균의 생산

두 상이한 플라스미드에 의한 효모의 동시형질전환이 단일 플라스미드에 의한 형질전환보다 덜 빈번한 사건이므로, cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 동안 최상의 가능한 효율을 구축하도록 미끼 단백질을 암호화하는 벡터에 의해 사전에 형질전환된 효모균이 사용된다.

이를 위해, 효모균 YCM 79를 플라스미드 pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR 및 pGBT-Ct 각각에 의해 형질전환시킨다. 이들 플라스미드를 함유하는 효모를 트립토판을 함유하지 않는 배지 상에서 이들의 Trp+ 표현형에 대해 선별하여 각각 yNt, yBL6, yBM, yBR 및 yCt로 명명한다. 각 균주내 이들 각종 플라스미드의 존재는, 삽입체의 5′ 및 3′에 위치한 DBD 및 tADH1 서열과 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 도움하에, 효모 상에서 직접 PCR을 수행함으로써 입증된다. 수득된 PCR 단편의 크기는 yBL6 및 yBM 균주를 제외하고는 각종 균주를 구별가능케 한다.

1.3 트랜스활성화 효율 및 PS 1의 친수성 영역을 함유하는 융합 단백질의 GAL4의 AD와의 상호작용에 대한 시험

융합 단백질 중 하나가 트랜스활성화 활성을 보유하거나, GAL4의 AD와 상호작용하면, 단백질-단백질 상호작용의 부재하에 양성 반응을 체계적으로 생성하기 때문에 이중-하이브리드 시스템에서 미끼로 사용될 수 없다.

따라서, 제 1 시험은 PS-I의 친수성 영역이 이들이 GAL4의 DBD와 융합될 때 트랜스활성화 활성을 보유하지 않음, 즉, 이들 자신이 리포터 유전자의 전사를 유도할 수 있음을 체크함에 있다. 이러한 유형의 활성은 예를 들면, 융합 단백질에서 산성 도메인의 존재와 연관될 수 있다.

이러한 시험을 위하여, LacZ 및 URA3 리포터 유전자의 발현을 균주 yNt, yBL6, yBM, yBR 및 yCt 상에서 직접 조절한다.

융합 단백질과 GAL4의 AD 간의 상호작용의 부재를 조절함에 있는 제 2 시험의 경우, Trp+ Leu- 표현형의 균주 yNt, yBL6, yBM, yBR 및 yCt를 GAL4의 AD를 암호화하는 플라스미드 pGAD424(pGAD10에 상당)에 의해 형질전환시킨다. 효모를 트립토판 또는 루이신이 없는 배지에서 선별해내고 상호작용의 조절을 허용하는 LacZ 및 URA3 리포터 유전자의 발현을 수득된 클론에서 시험한다.

모든 경우에, β-갈락토시다제 활성에 대한 시험 결과 및 우라실이 없는 선별 배지에서의 낙하 시험 결과는 음성인 것으로 입증되었다.

따라서, PS-I의 친수성 부분을 함유하는 융합 단백질은 고유 트랜스활성화 특성을 지니지 않으며 GAL4의 활성화 도메인과 상호작용하지 않는다. 따라서, 이들은 라이브러리 스크린용 미끼 단백질로서 사용될 수 있다.

1.4 cDNA 융합 라이브러리에 의한 각종 효모균의 형질전환

융합 라이브러리의 스크리닝은 미끼 단백질과 상호작용하는 GAL4의 AD와 융합된 펩타이드를 발현하는 클론의 동정을 가능케 한다. 이러한 상호작용이 존재하면, 미끼 단백질을 함유하는 균주에서 URA3 및 LacZ 리포터 유전자의 발현을 유도할 수 있는 기능성 트랜스액티베이터의 재구성을 허용하여야 한다.

스크리닝이 대표성을 갖기 위해서는, 라이브러리를 구성하는 각각의 독립 플라스미드가 형질전환 후 적어도 하나의 효모 클론에 존재하는 것이 필수이다. 이를 위해, 이론적으로 라이브러리내 독립 플라스미드의 수보다 큰 형질전환체 수를 수득 가능케 하는 프로토콜이 사용된다(재료와 방법 참조).

His-, Lys-, Ade-, Met-, Ura-, Leu- 표현형의 5 종의 균주 yNt, yBL6, yBM, yBR 및 yCt를 융합 라이브러리로부터의 플라스미드 DNA 100 ㎍으로 연속적으로 형질전환시킨 다음, 형질전환된 세포를 YNB +His +Lys +Ade +Met 배지에서 선별해낸다.

1차 선별 말미에, 균주 yNt를 갖는 Ura+ 표현형의 32개의 클론, yBL6를 갖는 450개의 Ura+ 클론, yBM을 갖는 128의 클론, yBR을 갖는 250개의 클론 및 yCt를 갖는 67개의 클론을 수득하였다. β-갈락토시다제 활성에 대한 시험을 이들 형질전환체에서 수행하여 제 2 LacZ 리포터 유전자의 발현을 증명한다. 총 6개의 클론이 Ura+, β-gal+ 이중 표현형을 지녔다: 균주 yNt에 대해 1 클론, yBL6에 대해 1 클론, 균주 yBM 및 yBR 각각에 대해 2 클론, yCt에 대해 0 클론. 클론을 각각 yNT.A, yBL6.B, yBM.C, yBM.D로 명명한다.

실시예 2: 라이브러리로부터 플라스미드의 분리

PS 1의 돌연변이 루프 또는 감축된 루프와 상호작용할 수 있는 단백질을 동정하기 위하여, 효모 yBM.C 및 yBM.D에 함유된 플라스미드를 추출한다. DNA 제제에 존재하는 플라스미드를 사용하여 전기투공에 의해 박테리아를 형질전환시킨다.

수득된 박테리아 클론으로부터 추출된 플라스미드를 각종 효소로 분해시킨다. 이러한 분석으로 5 종의 상이한 제한 프로필이 확인된다.

효모 yBM.C 및 yBM.D로부터 추출된 플라스미드의 분해는 플라스미드 pGBT-BM에 상응하는 공통 프로필 및 서열번호 1의 서열에 상응하는 2900 bp 삽입체(균주 yBM.C로부터 유도되는 pGAD-C) 및 서열번호 2의 서열에 상응하는 1400 bp 삽입체(균주 yBM.D로부터 유도되는 pGAD-D)를 함유하는 플라스미드 pGAD10에 상응하는 두 상이한 프로필을 보인다.

2.1 각종 효모균의 형질전환에 의한 분리된 플라스미드의 조절

뇌 라이브러리로부터의 플라스미드로 효모를 형질전환시키는 동안, 수 종의 상이한 플라스미드를 동일세포에 도입시키는 것이 가능하다. 상호작용의 결과가 확실히 분리된 플라스미드의 존재에 기인하는 것이지 여분의 플라스미드에 기인하는 것이 아님을 입증하기 위하여, 라이브러리의 스크리닝으로부터 유도된 융합 단백질을 PS-I의 각종 친수성 영역에 대해 효모 YCM 79에서 뿐만 아니라 균주 HF7 C 및 PCY 2에서도 다시 시험하였다.

HF7 C는 두 리포터 유전자 HIS3와 LacZ를 지닌다. LacZ 유전자는 균주 YCM 79에 존재하는 것과는 상이한 프로모터 환경을 지니며, 이는 β-gal+ 클론의 생성이 특이적 프로모터 환경과 연관되어 있는 것이 아니라 시험된 단백질 간의 상호작용에 연관되어 있음을 입증가능케 한다. PCY 2는 GAL4 트랜스액티베이터가 기능성일 때 다른 두 균주에서보다 더 강력하게 발현되는 단 하나의 리포터 유전자 LacZ만을 보유하는 장점을 지닌다.

본 발명자는 세 종류의 효모균 YCM 79, HF7 C 및 PCY 2를 플라스미드 pGBT-X/gGAD-Y(X는 Nt, BL6, BM, BR 또는 Ct에 상응; Y는 C 또는 D에 상응), pGBT9/pGAD424(상호작용에 대한 음성 대조군) 및 pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(상호작용에 대한 양성 대조군)(Russo et al., 1995)의 상이한 쌍으로 형질전환시켰다. 본 발명자는 각각의 형질전환으로부터 유도된 3 내지 5개의 클론에 대해 영양요구성 및 β-gal 활성을 시험하였다. 플레이트에 대한 결과를 제 2 도에 나타내었다.

시험의 민감도 차이를 감안하면, 상호작용은 형질전환된 효모 YCM 79 및 HF7 C가 우라실이 없거나 히스티딘이 없는 선별 배지에서 발생할 때, 즉 이들이 확실히 이들의 리포터 유전자 중 적어도 하나를 발현할 때 확인된다.

반응의 강도(다소간에 청색을 띠거나, 다소간 발생된 콜로니)는 리포터 유전자의 발현율에 비례하는 것으로 추정된다. 이러한 비율의 변동은 다양한 방식으로 설명될 수 있다. 낮은 비율은 GAL4 트랜스액티베이터를 재구성하는 단백질 간의 미약한 상호작용에 연유할 수 있다. 이는 또한, 복합체의 형성을 탈안정화하게 되는 제 3 단백질의 개입, 또는 이와 달리 효모내 융합 단백질의 불안정성, 또는 효모의 상태에 기인할 수도 있다. 효모는 예를 들면, 외인성 단백질의 독성 문제와 연관된 낮은 전사 활성 상태에 있을 수 있다.

분리된 뇌 라이브러리로부터의 융합 단백질은 PS 1의 N-말단부와 및 C-말단부와 상호작용하지 않는다. 한편, 이들 모두는 친수성 BL6 영역, 돌연변이된 친수성 BL6 영역(BM) 및 이러한 영역의 축소형(BR)과 상호작용하는 것으로 보인다.

2.2 라이브러리로부터의 융합 단백질과 PS 1 루프를 함유하지 않는 단백질의 상호작용에 대한 시험

이 시험은 라이브러리로부터 유도된 융합 단백질이 이들의 구조, 이들의 전하, 이들의 소수성을 통해 미끼 단백질(III형 의-양성) 또는 GAL4의 DBD(II형 의-양성)과 비특이적으로 상호작용하는 지 여부를 측정가능케 한다.

본 발명자는 균주 YCM 79, HF7 C 및 PCY 2를 플라스미드 쌍: pGBT9/pGAD-Y(Y는 C 또는 D에 상응), pGBT-LAM/pGAD-Y, pGBT9/pGAD424(음성 대조군) 및 pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(양성 대조군)으로 형질전환시켰다. pGBT9는 GAL4의 DBD만을 암호화하는 반면에, Clontech에 의해 제공된 pGBT-LAM은 다른 단백질의 소수성 영역과 비특이적으로 상호작용하는 lamine와 GAL4의 DBD 간의 융합으로부터의 단백질을 암호화한다.

결과는 이렇게 형질전환된 효모의 어느 것도 이들의 리포터 유전자를 발현할 수 없었다는 점이다. 따라서, YCM 79 효모는 Ura-, β-gal- 표현형을 보였고, HF7 C 효모는 모두 His-, β-gal-였으며 PCY 2 효모는 β-gal-였다.

이러한 결과는 분리되는 라이브러리로부터의 융합 단백질이 PS-I의 친수성 BL6 영역과 특이적으로 상호작용하고 lamine 또는 GAL4의 DBD와는 결합하지 않음을 암시한다.

2.3 PS 1 루프 암호화 영역을 함유하는 벡터 pLex 9으로 형질전환된 효모에서의 상호작용에 대한 시험

본 시험은 단백질의 상호작용이, 이들이 GPL4의 DBD와 융합될 때만 BL6의 각종 단편에 의해 채택된 구조로 인한 것이 아님을 보장 가능케 한다.

이를 증명하기 위하여, BL6 및 BM 단편을 다른 DBD, 즉 박테리아 리프레서 LexA의 것과 융합시킨다. 친수성 BL6 루프의 서열 및 돌연변이형의 서열이 플라스미드 pLex9의 EcoRI/SalI 부위의 수준에서 LexA 유전자에 융합되는 추가적인 두 플라스미드 작제물(pLex-BS 및 pLex-BM)이 생성된다.

이어서, HIS3 및 LacZ 리포터 유전자의 발현이 LexA의 오퍼레이터 부위 상으로 DBD-LexA/AD-GAL4 복합체의 부착에 의해 유도되는 효모균 L40을 형질전환시킨다. 플라스미드 쌍과의 상호작용을 시험한다: pLex-BL6/pGAD-Y(C 또는 D에 대한 Y), pLex-BM/pGAD-Y, pLex-RAS/pGAD-RAF(상호작용에 대한 양성 대조군)(Vojtek et al., 1993) 및 pLex-RAS/pGAD424, pLex-BL6/pGAD424, pLex-BL6/pGAD-RAF, pLex-BM/pGAD424, pLex-BM/pGAD-RAF(상호작용에 대한 음성 대조군).

히스티딘이 없는 선별 배지에서의 낙하 시험 및 a-gal 활성에 대한 시험의 결과는 시험된 pGAD-Y 플라스미드와 무관하게 플라스미드 pLex-BL6를 함유하는 균주에 대해 양성임을 입증한다. 이와 동일한 결과가 시험된 pGAD-Y 플라스미드와 무관하게 pLex-BM을 함유하는 균주에도 적용된다. 이러한 시험은 수득된 상호작용이, GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합될 때 PS-I의 BL6 영역이 채택하게 되는 특정 형태와 연관되어 있지 않음을 보여준다.

실시예 3: 스크리닝으로부터 유도된 플라스미드 삽입체의 동정

3.1 플라스미드 pGAD-C 및 pGAD-D 삽입체의 서열분석

플라스미드 pGAD-C 및 pGAD-D 삽입체를 완전히 서열분석한다. 본 발명자는 GAL4의 AD 및 tADH1에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 서열분석을 개시하여 각 삽입체의 개시부 및 말단에서의 서열을 알아내었다. 이어서, 각 서열의 말단으로부터, 본 발명자는 두 본쇄 상의 서열에서 진행하도록 허용하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 구성하였다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 서열번호 2의 서열에 상응하는 삽입체 D의 1400 bp를 완전히 서열분석해 내었다. 한편, 2900 bp의 삽입체 C(서열번호 1의 서열)의 경우, 전체 서열을 수득하기 위해서는 제한지도를 확립한 다음 다양한 단편의 아클로닝을 수행하는 것이 필수이다.

삽입체 D는 자신의 서열(서열번호 2) 전체에 개방 판독 프레임을 지니고 있다. 한편, 삽입체 C는 서열(서열번호 1)의 말단에 종결 코돈을 함유한다.

이들의 펩타이드 서열은 다소 친수성 단백질에 적용되는 스크리닝법의 선택에 따르는 다소 친수성인 프로필을 보인다.

3.2 서열의 비교

본 비교는 삽입체가 기능이 알려져있는 펩타이드 도메인을 암호화하는지 여부를 알 수 있게 해준다.

삽입체의 핵산 및 펩타이드 서열을 "Gen Bank" 및 "EMBL"(European Molecular Biology Lab) 데이터 뱅크에 기록된 서열과 비교한다. 삽입체와 이들 뱅크에 기록된 유전자(또는 단백질) 간에 어떠한 유의할 만한 유사성도 발견되지 않았다.

삽입체의 서열을 상호간에도 비교한다. 이들은 어떠한 유사성도 보이지 않는다.

또한, 삽입체에 의해 암호화된 펩타이드의 기능에 대한 정보를 제공할 수 있는 펩타이드 모티프의 존재를 평가한다. 몇몇 잠재적인 글리코실화, 포스포릴화 및 미리스틸화 부위가 발견되었지만 펩타이드의 가능한 기능에 관한 가설을 공식화할 수 있게 하지는 못한다.

3.3 상이한 인체 조직에서 선별된 펩타이드에 상응하는 mRNA의 발현

이들 펩타이드와 PS 1 간의 상호작용이 생체내에서 확실히 존재한다는 개념을 확인하기 위하여, 라이브러리로부터 분리된 펩타이드의 mRNA의 발현이 PS 1의 mRNA의 발현과 동일한 조직에 위치하는 지를 체크한다. 분리된 서열을 함유하는 유전자의 특정 조직에서의 발현을 평가하고 상이한 인체 조직에서 삽입체 C 및 D에 상응하는 mRNA의 발현수준을 노던 블롯팅으로 분석한다.

삽입체 C(서열번호 1의 서열)로부터 제조된 방사능 탐침은 뇌, 좀더 구체적으로는 대뇌 피질, 전두엽 및 측두엽에서 특이적으로 발현된 9.5 kb mRNA를 하이브리드화시킬 수 있게 한다(도 3 참조). 이 mRNA의 크기는 해독된 단백질이 크기가 크다는 것을 암시한다.

실시예 4: 시험관내에서 상호작용에 대한 시험

본 시험은 상호작용이 효모 의존성이 아님을 알 수 있게 해준다. 기능성 트랜스액티베이터 GAL4의 재구성은 항상 두 단백질 간의 직접 상호작용에 기인하지는 않으며, 융합 단백질과 효모의 하나 이상의 내인성 단백질 간의 단백질 복합체 형성의 결과일 수도 있다. 따라서, 상호작용은 효모로부터 수득된 중간체 단백질의 존재하에서만 존재할 수 있고 이러한 상황 외에서는 현실성이 없다.

무세포 시스템에서 PS 1의 친수성 BL6 영역과 각각 PepC 및 PepD로 불리는 분리된 펩타이드 간의 상호작용 확인을 선택한다.

단백질을 이.콜라이 BL21(DE3)에서 생성시켜 이로부터 다량을 수득한다. 분리된 두 펩타이드를 이들의 검출 및 이들의 지지체 상으로의 부착을 허용하는 태그 펩타이드와 융합시킨다. 이를 위해, 단백질 S에 의해 특이적으로 인지되는 글루타치온, 상이한 형태의 BL6 영역 및 S-Tag 펩타이드와 결합하는 GST 단백질이 분리된 펩타이드와 융합하도록 선택한다(시험 원리에 대해서는 재료와 방법 참조).

4.1 S-Tag와 cDNA 라이브러리의 스크리닝 중에 분리된 펩타이드 간의 융합 단백질의 생성

S-Tag와 두 펩타이드 PepC 및 PepD 간의 융합 단백질을 작제하기 위하여, 플라스미드 pGAD-C 및 pGAD-D로부터 유도된 각종 EcoRI/EcoRI 단편을 벡터 pET-29a의 S-Tag의 서열과 동일한 판독 프레임 중으로 삽입시킨다.

이 단계에서, PepD에 상응하는 삽입체를 함유하는 플라스미드(pET-D)가 수득된다. 이 플라스미드를 부분적으로 서열분석한 결과 목적하는 판독 프레임에서 삽입이 일어난 것으로 나타났다.

이 플라스미드는 융합 단백질 STag-PepD에 상응하는 52 kDa 단백질의 생성을 허용한다. 단백질 STag-PepD는 박테리아 BL21(DE3)에서 IPTG에 의한 유도 후 생성된다.

4.2 GST와 PS 1의 친수성 루프 간의 융합 단백질의 생성

GST를 PS 1의 친수성 BL6 영역의 3 형태 중 하나와 융합시키기 위해, 플라스미드 pGBT-BL6, pGBT-BM 및 pGBT-BR로부터 수득된 EcoRI/SalI 단편이 도입된 벡터 pGEX-4T1을 사용한다.

PS-I의 돌연변이 루프에 상응하는 플라스미드 pGEX-BM가 수득된다. 서열분석 결과 삽입이 확실히 GST 서열의 판독 프레임에서 실행된 것으로 나타났다.

이 플라스미드는 박테리아 BL21(DE3)에서 IPTG에 의한 유도 후 42 kDa GST-ML 융합 단백질의 생성을 허용한다.

4.3 융합 단백질 GST-ML의 가용화

박테리아의 용해 후, GST-ML 단백질은 불용성 분획에 완전히 잔류하는 반면에, STag 펩타이드 및 단백질 STag-PepD와 GST는 가용성 분획에서 부분적으로 발견된다.

융합 단백질의 가용화는 친화성 크로마토그래피 실행에 절대적으로 필요하다. 첫 번째 경우, GST-ML 단백질을 STag와 융합된 PS 1의 펩타이드 파트너와 GST-ML의 상호작용을 추후에 시험할 수 있도록, 아가로스 비드에 공유 커플링된 글루타치온 수지에 특이적으로 부착시킨다(재료와 방법 참조). 단백질이 가용화되지 않는 경우, 이들은 비드와의 특이적 결합 부재로 비드와 같이 침강한다.

융합 단백질 GST-BM의 가용화 후, 재료와 방법의 단락 8에 기술된 조건에 기초하여 시험을 수행한다.

실시예 5: 포유동물 세포에서 PS-1에 특이적인 파트너의 발현

5.1 적정 발현 벡터의 작제

본 시험은 효모에서 드러난 단백질 상호작용이 포유류 세포에서 및 이의 막 환경 중으로 삽입된 완전 PS1 단백질로도 검출가능함을 입증케 해준다. 파트너의 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 5′말단의 myc 에피토프에 상응하는 추가 서열 및 파트너 서열과 동위상으로 아클로닝을 허용하는 EcoRI 제한 부위를 운반하는 포유동물 세포 pCDNA3(도 4)에 대한 발현 벡터 중으로 아클로닝시킨다.

pGAD-D의 1400 bp EcoRI 제한 단편을 분리하여 발현 벡터의 EcoRI 부위에 동위상으로 아클로닝시킨다. 정확한 배향으로 cDNA를 운반하는 작제물을 효소 제한 분석에 의해 선택해낸다.

클론 C의 경우, pGAD-C의 EcoRI(1)-HindIII(391) 단편을 1차로 분리해낸다. 이어서, 제 2 HindIII(392)-MscI(2892) 단편(후자 평활 말단 부위는 클론 C의 암호화 영역 하류의 벡터 pGAD10에 존재한다)을 부분 분해에 의해 분리해낸다. EcoRI(1)-HindIII(391) 및 HindIII(392)-MscI(2892) 단편을 EcoRI 및 EcoRV로 분해한 발현 벡터와 함께 연결시키며, 후자 부위는 평활 말단이 된다. C의 전 암호화 서열을 운반하는 정확한 작제물을 제한 분석에 의해 동정한다.

이들 작제물은 myc 에피토프 및 각각 서열번호 1과 서열번호 2에 상응하는 펩타이드를 운반하는 융합 단백질을 생성할 수 있게 해준다.

5.2 포유 동물 세포에서의 발현

이들 작제물을 표준 방법에 의해 COS1 세포에 형질감염시킨다. 세포 용해 후, 샘플을 안티-myc 항체를 사용한 면역전이 및 노출에 의해 분석한다. 파트너의 발현은 안티-Myc 9E10 항체를 사용하여 면역전이에 의해 검출될 수 있다(도 5). 본 발명자는 PepC에 대해 예상된 바와 같이 120 kDa의 매우 강렬한 밴드를 검출할 수 있었고, 이는 고 발현을 입증한다(레인 C). D의 경우, 검출된 밴드의 강도가 항상 일정하지는 않았다. 한편, CHO 세포에서의 발현도 검출해낼 수 있었다. 이러한 세포형에서, D는 짐작컨대 약간 더 안정하고 약 80 kDa에서 이동하는 단백질로서 출현한다(레인 D).

따라서, 두 단백질을 포유류 세포에서 발현시키고 검출해낼 수 있다.

서열목록

(1)일반정보:

(i)출원인:

(A)명칭:로오느-푸우랜크 로레르

(B)거리:아브뉴 레이몽 아롱 20

(C)도시:앙토니

(E)국가:프랑스

(F)우편번호:92165

(G)전화:01.55.71.69.22

(H)팩시밀리:01.55.71.72.91

(ii)발명의 명칭:프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는

핵산

(iii)서열수:2개

(iv)컴퓨터 판독형태:

(A)매체형:플로피 디스크

(B)컴퓨터:IBM PC 호환기종

(C)운영체계:PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어:PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(2)서열번호 1에 대한 정보:

(i)서열 1의 특징:

(A)길이:2892 염기쌍

(B)유형:뉴클레오타이드

(C)본쇄형:일본쇄

(D)토폴로지:선형

(ii)분자형:cDNA

(iii)가설:없음

(iv)안티-센스:없음

(ix)특성:

(A)명칭/키:CDS

(B)위치:1..2736

(xi)서열배열:서열번호 1:

(2)서열번호 2에 대한 정보:

(i)서열의 특징:

(A)길이:1363 염기쌍

(B)유형:뉴클레오타이드

(C)본쇄형:일본쇄

(D)토폴로지:선형

(ii)분자형:cDNA

(iii)가설:없음

(iv)안티-센스:없음

(ix)특성:

(A)명칭/키:CDS

(B)위치:1..1363

(xi)서열배열:서열번호 2:

Claims (31)

1. 프리세닐린과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
2. 제 1 항에 있어서, 프리세닐린 PS-1의 대형 루프 전부 또는 일부와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 서열번호 1의 서열 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 서열번호 2의 서열 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
5. 프리세닐린과 상호작용할 수 있음을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
6. 제 5 항에 있어서, 프리세닐린 PS-1의 대형 루프와 상호작용할 수 있음을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
7. 제 6 항에 있어서, 프리세닐린 PS-1의 대형 루프의 아미노산 310-463의 서열과 상호작용할 수 있음을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
8. 제 5 항에 있어서, 프리세닐린 PS-2의 대형 루프와 상호작용할 수 있음을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
9. 제 5 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
10. 제 5 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 펩타이드 서열 또는 이로부터 유도된 서열의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
11. 프리세닐린 활성의 약화, 자극 또는 조절용 약제를 수득하기 위한, 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 용도.
12. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포를 서열 발현조건하에서 배양한 다음 생성된 폴리펩타이드를 회수함을 특징으로 하는, 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 제조방법.
13. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환시킴을 특징으로 하는, 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 제조용 숙주세포.
14. 제 3 항 또는 4 항에 따른 서열을 지닌 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
15. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 상응하는 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 탐침.
16. 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편.
17. 제 16 항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 펩타이드 서열 또는 이들의 유도체 중에서 선택된 서열에 대한 것임을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
18. 제 16 항 또는 17 항에 있어서, 프리세닐린과 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 간의 상호작용 억제능 및/또는 노출능을 보유함을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
19. a 임의로 미확인된, 분자 또는 각종 분자 함유 혼합물을 폴리펩타이드와 분자 간의 상호작용을 허용하는 조건하에서(분자가 폴리펩타이드에 대한 친화성이 있을 경우) 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 전술한 재조합 세포와 접촉시킨 다음,

    b 폴리펩타이드와 결합된 분자를 검출 및/또는 분리해냄을 특징으로 하는, 프리세닐린과 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 간의 상호작용을 조절 또는 억제할 수 있는 화합물의 동정 또는 분리방법.
20. 제 19 항의 방법에 따라 수득될 수 있는, 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 리간드.
21. 신경학적 증상 치료용 약제의 제조를 위한 제 20 항에 따른 리간드의 용도.
22. 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 결손형 재조합 바이러스.
23. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
24. 제 23 항에 있어서, 플라스미드 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
25. 제 23 항에 있어서, 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
26. 제 25 항에 있어서, 복제 결손형 바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
27. 제 23 항 내지 26 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 약학 조성물.
28. 활성성분으로 제 5 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 적어도 하나 포함하는 약학 조성물.
29. 활성성분으로, 제 16 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편 적어도 하나, 및/또는 제 14 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 하나 및/또는 제 19 항에 따라 제조된 화합물을 포함하는 약학 조성물.
30. 제 27 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 프리세닐린 또는 이의 돌연변이형의 활성 약화 또는 억제 조절용 조성물.
31. 제 27 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환 치료용 조성물.