JPWO2002083730A1 - 新規タンパク質ＩＲＳＡＬおよび該タンパク質をコードする遺伝子ｉｒｓａｌ - Google Patents

Abstract

本発明は、インスリンの生理活性を修飾し、糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する新規タンパク質ＩＲＳＡＬ、該タンパク質をコードする遺伝子ｉｒｓａｌ、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を用いた前記タンパク質の製造方法、前記タンパク質に対する抗体、およびインスリンレセプター基質（ＩＲＳ）と前記タンパク質との結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明の課題は、インスリン生理活性発現機構の初期段階においてシグナル伝達の異常を引き起こす分子、特に、インスリンレセプターとＩＲＳのチロシンリン酸化を調節、またはＩＲＳのチロシンリン酸化以降のシグナル伝達を調節することである。

Description

技術分野
本発明は、インスリンの生理活性を修飾し、糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する新規タンパク質ＩＲＳＡＬ、該タンパク質をコードする遺伝子ｉｒｓａｌに関するものである。
背景技術
糖尿病は、今や有病率が全人口の約５％を占め、高齢化社会を迎える２１世紀においては更に患者数は増加し、深刻な社会問題になろうことが予想されている。
糖尿病は、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）とインスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）に大別され、いずれも遺伝素因を背景にして引き起こされると考えられており、これらの原因遺伝子に関する研究は鋭意進められてきている。また、２型糖尿病においては、遺伝素因の他に環境因子の関与も大きいことが明らかとなっている。より詳しくは、２型糖尿病は、遺伝素因とともに、肥満・過食・運動不足・ストレス・加齢などの環境因子により引き起こされるインスリン抵抗性と、やはり遺伝素因と血中インスリン濃度の異常な上昇により起こるインスリン分泌不全が相まって、インスリン生理活性が不足し、結果として高血糖が引き起こされる状態と考えられている。ここでインスリン抵抗性とは、血中に十分量のインスリンがあるにも関わらず、肝臓における糖取り込みが亢進しないうえ糖放出が抑えられず、一方で筋肉や脂肪などの末梢組織において糖取り込みが亢進しないために、血糖値が上昇する現象である。
一般に、血中に正常に分泌されたインスリン等のホルモンが、標的組織で生理作用を発現できない状態（すなわちホルモン抵抗性）の一部は、ホルモンレセプターの異常、あるいはレセプター以降のシグナル伝達の障害など情報伝達系の先天的異常を伴う機構によるものと想定されており、先にも述べたように、これらに関する研究は分子生物学的・細胞生物学的手法を用いて鋭意進められてきた。
近年インスリンの作用伝達に関与するポストレセプターのいくつかが明らかにされた。その中でもインスリンレセプター基質（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、以下「ＩＲＳ」と称する）はインスリンレセプター、インスリン様成長因子Ｉ（以下、「ＩＧＦ−Ｉ」と称する）レセプターに共通な基質と考えられ、ポストレセプターの伝達機構の中で最も上流に位置するものである。
ＩＲＳ１は、インスリンの刺激によって活性化されるインスリンレセプターキナーゼによりチロシンリン酸化を受ける分子質量１７０〜１８５ｋＤａのタンパク質として発見され、その１次構造の解析により、多数のチロシンリン酸化部位が存在し、ＳＨ２ドメインを持つシグナル伝達タンパク質が結合することが知られている。実際に、該ＩＲＳ１中に９個存在するＴｙｒ−ｘ−ｘ−Ｍｅｔモチーフによりシグナル伝達タンパク質であるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（以下、「ＰＩ３キナーゼ」と称する）を結合してＰＩ３キナーゼを活性化し、この活性化により糖輸送担体が細胞質から細胞膜に移動し、糖輸送の亢進が起こると考えられている。
従って、ＩＲＳと結合するタンパク質がインスリンレセプター又はＩＧＦ−ＩレセプターによるＩＲＳのチロシンリン酸化に及ぼす影響を解析することができれば、インスリン抵抗性発生の分子機構に新たな観点を与えるものと期待される。さらに、新たな分子機構が明らかとなれば、ＩＲＳ結合タンパク質とのインスリンシグナル抑制活性を特異的に阻害するような薬剤をスクリーニングする系を容易に構築できると考えられるが、未だその分子機構は明らかになっていない。
発明の開示
そこで本発明は、２型糖尿病におけるインスリン抵抗性の発生機構を解明するために、インスリン生理活性発現機構の初期段階においてシグナル伝達の異常を引き起こす分子、特に、インスリンレセプター又はＩＧＦ−ＩレセプターによるＩＲＳのチロシンリン酸化を調節するタンパク質、または、ＩＲＳのチロシンリン酸化以降のシグナル伝達を調節するタンパク質を見出すことを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究した結果、ＩＲＳ１をｂａｉｔとした酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、ＩＲＳ１と強く結合し、ＬＩＭドメインを分子内に有するタンパク質ＩＲＳＡＬ（ＩＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ）を見出し、さらに該タンパク質が糖の細胞内取り込みを制御することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
（１） すなわち本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸番号４９３〜６９４に示す領域に結合し、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有することを特徴とするタンパク質に関する。
（２） 本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質に関する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質。
（３） 本発明は、（２）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（４） 本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５） 本発明は、（３）または（４）の遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクターである。
（６） 本発明は、（５）の組換えベクターを保持する形質転換体である。
（７） 本発明は、（６）の形質転換体を培養し、当該培養物から（１）または（２）のタンパク質を回収することを特徴とする、（１）または（２）のタンパク質の製造方法である。
（８） 本発明は、（１）または（２）のタンパク質に対する抗体である。
（９） 本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と（１）または（２）のタンパク質を用いることを特徴とする、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と（１）または（２）のタンパク質との結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法である。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−１１１８６４号の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号１は、配列番号５の塩基配列に対応するアミノ酸配列である。
配列番号２は、配列番号３の塩基配列から推定されたアミノ酸配列である。
配列番号４は、配列決定に使用した合成プライマーである。
発明を実施するための形態
以下に本発明を詳細に説明する。
（本発明のタンパク質）
本発明のタンパク質は、以下のような酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより見出された、ＩＲＳ１と強く結合するタンパク質の知見に基づくものである。
すなわち、リン酸化チロシン残基を介さずにＩＲＳ１と結合して、ＩＧＦ−Ｉシグナルを修飾するタンパク質ＩＲＳＡＰ（ＩＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を同定するために、チロシンキナーゼ活性がほとんど検出されない酵母系を用いて酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。
ｂａｉｔとしてＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインにｒａｔ ＩＲＳ１を融合したタンパク質を用い、ｐｒｅｙとしてＧＡＬ４の転写活性化ドメインと融合したヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを用いて、Ｈｉｓ３をセレクションマーカーとした一次スクリーニングを行い、単離した陽性クローンについて、さらにＬａｃＺ活性を指標とした二次スクリーニングを行い、１８７個の陽性クローンを得た。これら陽性クローンからプラスミドを回収し、これを再び酵母に導入後、ＬａｃＺ活性を指標にｂａｉｔであるＩＲＳ１との結合を再検討し、強い結合が観察されたクローンについて、塩基配列の解析を行い、この遺伝子がコードするタンパク質を同定した。その結果、既にリン酸化チロシン残基を介さずにＩＲＳ１と結合することが報告されている１４−３−３タンパク質を含む、様々な遺伝子が単離され、その中から、ＢＬＡＳＴサーバーを用いたｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈの結果、タンパク質間相互作用に働くＬＩＭドメインを分子内に有する新規タンパク質ＩＲＳＡＬ（ＩＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ）を得たものである（実施例１参照）。
すなわち、本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸番号４９３〜６９４に示す領域に結合し、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有することを特徴とするタンパク質である。
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＩＲＳ１を表わす。従って、本発明のタンパク質は、ＩＲＳ１の特定の領域と結合（相互作用）するものである。
「糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する」とは、該タンパク質が細胞内に産生された細胞または組織において、該タンパク質の発現がインスリンあるいはＩＧＦ刺激依存の細胞の糖取り込み量の調節に関与することを意味する。さらに詳しくは、該タンパク質の発現が細胞の糖取り込み量を促進又は抑制する活性を有することを意味する。
本発明のタンパク質の１具体例としては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＲＳＡＬを挙げることができる。
したがって、本発明のタンパク質はまた、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であることを特徴とするタンパク質である。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質。
本発明のタンパク質のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質については、例えば、配列番号３記載の塩基配列における一連の３塩基を、当業者に公知の解析ソフトを用いて、その塩基の組合わせ（すなわち、コドン）によりコードされている１つのアミノ酸に置き換えることにより得ることができる。また、例えば配列番号２に示すように、一旦そのアミノ酸配列が決定された本発明のタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してタンパク質を合成する方法（ペプチド合成法）に従って調製することができる。さらに、本発明のタンパク質が後述の本発明の遺伝子によりコードされている場合には、例えば、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地に培養または飼育し、その培養物または飼育体から採取することによっても本発明のタンパク質を得ることができる。ここで使用する組換えベクター、宿主細胞、培地、各操作法および条件等については、当業者に公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。
配列番号２記載のアミノ酸配列における「１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加」は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０ ６４７８−６５００，１９８２）により、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の配列（例えば、配列番号３記載の塩基配列）を改変することにより実施することができる。
ここで、タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等のアミノ酸の間での置換が知られている。
従って、配列番号２に記載のアミノ酸配列において「１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加」が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号２に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬと同様に糖の細胞内取り込みを制御する活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質もまた本発明のタンパク質である。なお、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個である。
用語「糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する」については、上記と同様の意味を有する。
本発明のタンパク質のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＲＳＡＬは、全アミノ酸３３６残基からなる分子質量の（３８ｋＤａ）のタンパク質である（実施例３参照）。
また、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは、そのアミノ酸配列上に５つのＬＩＭドメインを有する（実施例３参照）。ＬＩＭドメインはタンパク質間の相互作用などに重要なＺｎフィンガーモチーフが２つ連なった構造のドメインであることから、該タンパク質はタンパク質間の相互作用によりＩＲＳ機能を調節する特性を有することがわかる。
さらに、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは、現在までに知られているＩＲＳファミリータンパク質（ＩＲＳ１〜ＩＲＳ４）のうち、ＩＲＳ１およびＩＲＳ２と結合する特性を有する。
また、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬを発現する細胞内におけるチロシンリン酸化に関する活性については、以下のような特徴を有する。２９３Ｔ細胞では、インスリンレセプターキナーゼによるＩＲＳ１のチロシンリン酸化を増強するものの、ＩＲＳ２のチロシンリン酸化は逆に抑制し（実施例４参照）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では、ＩＲＳ１のチロシンリン酸化の変化は確認されなかったが、ＩＲＳ２のチロシンリン酸化は著しく増強した。従って、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは、ＩＲＳ１およびＩＲＳ２のＩＧＦ−Ｉ誘導性チロシンリン酸化を変化させる活性を有するものである。
さらに、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは、ＩＲＳのチロシンリン酸化以降の（さらに下流の）シグナル伝達の調節に関して以下のような特性をも有する。すなわち、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応じてプロテインキナーゼＥｒｋやＡｋｔはリン酸化され活性化するが、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは、ＩＧＦ−Ｉ刺激によりＥｒｋを活性化するものの、Ａｋｔ活性化には関与しておらず、Ｅｒｋの活性化を増強し、Ａｋｔの活性化には影響を与えないことが明らかとなった（実施例４参照）。これらの結果は、ＩＲＳＡＬがＩＧＦ−ＩによるＰＩ ３−ｋｉｎａｓｅ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ経路の活性化は増強させることを示すものである。しかし驚くべきことに、ＩＲＳＡＬを細胞内で発現させると糖の該細胞内への取り込みは顕著に阻害されていた（実施例５参照）。このことは、本発明のタンパク質の糖細胞内取り込み制御機構が、従来知られたものとは全く異なるものであること強く示唆するものである。
また、ＩＲＳ１を安定的に高発現させるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、対照細胞と比較して増殖能に優れていた。
（本発明の遺伝子）
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードすることを特徴とする。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質。
用語「１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加」および「糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する」は、それぞれ本発明のタンパク質について説明した箇所と同様の意味を有するものとする。
本発明の遺伝子のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、配列番号３に記載の塩基配列（１００８ｂｐ）を有する遺伝子（ｉｒｓａｌ）を挙げることができる。
従って、本発明の遺伝子はまた、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子であることを特徴とする。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明の遺伝子のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、または配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子については、例えば、本明細書中の実施例１および３に記載した方法に従って得ることができる。
また、例えば配列番号３に示すように、一旦その塩基配列が決定された遺伝子については、例えば、これらの塩基配列をもとに適当なプライマーを設計・合成してＰＣＲを行なうことによっても得ることができる。
用語「糖の細胞内取り込みを制御する活性を有する」は、本発明のタンパク質について説明した箇所と同様の意味を有するものとする。
用語「ストリンジェントな条件」とは、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製カタログ番号１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を意味する。
上記ストリンジェントな条件下で配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明の遺伝子である。
すなわち、配列番号３に記載の塩基配列全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型ＤＮＡが配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号３に示した塩基配列との相違に関わらず、本発明の遺伝子に含まれる。
本発明の遺伝子は、心臓、骨格筋、大腸、脾臓、腎臓などインスリンやＩＧＦの標的組織の多くでその発現が認められ、特に心臓において強く発現される（実施例３参照）。
（本発明の組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を、一般的な遺伝子組み換え技術に従って適当なベクターに挿入することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入する適当なベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４他）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９他）、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用できる。
また、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。
使用する発現プロモーターは、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できるが、これらに限定されない。
本発明の組換えベクターには更に、所望により、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合部位等を挿入してもよい。
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、前記組換えベクターを、常法または各宿主に対して一般に用いられる形質転換方法に従って、本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターの宿主への導入は、限定するものではないが、例えばカルシウムイオン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法を用いて実施することができる。
宿主としては、限定するものではないが、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ６細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が利用できる。
（本発明のタンパク質の製造方法）
本発明のタンパク質は、前記形質転換体を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養物から本発明のタンパク質を回収することにより実施できる。
ここで「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。
本発明のタンパク質はまた、他のタンパク質（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合型タンパク質として発現させてもよい。このようにして発現させた融合型タンパク質は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことができる。
（本発明の抗体）
本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体である。
ここで「抗体」とは、抗原である本発明のタンパク質またはその断片に結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、当業者に公知の手法を用いて調製することができ、例えば、アジュバントと共に抗原で動物を一回あるいは数週間間隔で複数回追加免疫する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の方法、免疫細胞を分離して適当な培養系で感作させる生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の方法のいずれかによって調製できる。
また、抗原として使用する本発明のタンパク質は、必ずしも全体を使用する必要は無く、そのタンパク質の一部分を使用してもよい。アジュバントとしては、限定するものではないが、例えばフロイントの完全または不完全アジュバントを使用することができる。抗原を投与する動物としては、限定するものではないが、例えばラット等の実験動物を使用することができる。
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＩＲＳ１）を用いることを特徴とする、本発明のタンパク質とＩＲＳ１との結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法は、タンパク質とＩＲＳ１との結合の阻害または促進が確認できる方法であれば特に制限されないが、例えば、一例として以下のような方法が挙げられる。
（１）被検物質の存在下又は非存在下において、本発明のタンパク質とＩＲＳ１とを接触させ、本発明のタンパク質とＩＲＳ１との結合量を測定し、比較することによるスクリーニング方法。
（２）ツーハイブリッド系の技術を利用し、形質転換体でのレポーター遺伝子の発現量を測定することにより検出する、ツーハイブリッドスクリーニング方法。
上記（１）の方法における結合量の検出は、例えば、標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付したＩＲＳ１を、非標識の被検物質とともに混合して用いる通常の競合アッセイ法などにより実施できる。被検物質には特に制限はなく、低分子化合物、ペプチドなどが挙げられ、また、人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであっても良い。
また、タンパク質間相互作用をより効率よく高度に解析できる観点から、上記（２）のツーハイブリッドスクリーニングを用いるのが好ましい。ツーハイブリッドスクリーニングは、当該技術分野で公知の方法を用いて実施することができるが、具体的には、以下のように行うことができる。
本発明のタンパク質と転写制御因子のＤＮＡ結合ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターと、ＩＲＳ１と転写制御因子の転写活性化ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターとを導入した形質転換体内で、本発明のタンパク質とＩＲＳ１とが結合することによりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドスクリーニングにおいて、被験物質の添加によるレポーター遺伝子の発現量の増減を測定することにより、被験物質がタンパク質とＩＲＳ１との結合を阻害または促進するか否かを確認し、ＩＲＳＡＬの発現調節能を評価することができる。
レポーター遺伝子としては、転写活性化の状態を測定できるものであればよく、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、大腸菌等が使用可能であるが、特に、酵母ＣＧ−１９４５株（遺伝子型；ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ｃｙｈ^ｒ２，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１_ＵＡＳ−ＧＡＬ１_ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４_{１７−ｍｅｒ（ｘ３）}−ＣｙＣ１_ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ）を用いるのが好ましい。
本発明のタンパク質と転写制御因子のＤＮＡ結合ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターとしては、例えば、ｐＡＳ２−１等を用いることができ、また、ＩＲＳ１と転写制御因子の転写活性化ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターとしては、例えば、ｐＡＣＴ２等を用いることができる。
転写制御因子としては、ＧＡＬ４等を利用することができる。
レポーター遺伝子の発現強度は、レポーター酵素の発色物質、蛍光物質等により判定することが可能であるが、例えば、ＬａｃＺの場合、Ｘ−Ｇａｌプレート上のＬａｃＺレポーター遺伝子活性によるコロニーの青色強度により判定することができる。
スクリーニング方法に用いられる被検物質は特に制限はなく、例えば、タンパク質、細胞抽出液、合成ペプチド等のペプチド、発酵生産物等を挙げることができ、これらの物質は人工的に合成したものであっても、天然に存在するものであってもよい。
阻害または促進する物質の評価は、正常より２倍以上発現を増加させる被検物質を促進物質として単離または同定し、正常より２分の１以下に発現を減少させる物質を阻害物質として単離または同定することが好ましい。
さらには、細胞内または組織内のｍＲＮＡ量を測定することによって、本発明のタンパク質の発現の増減を検出し、本発明のタンパク質の発現を調節し得る物質をもスクリーニングすることができる。
前記スクリーニング方法により得られる化合物は、本発明のタンパク質とＩＲＳ１との結合を阻害または促進するものであるから、インスリン抵抗性を示す対象に投与する医薬組成物の有効成分として有用である。
実施例
以下に実施例を示すことにより本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いたＩＲＳ１と結合するタンパク質ＩＲＳＡＰ（ＩＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の単離および同定
［方法］大腸菌を用いた遺伝子操作
本研究で主に用いた大腸菌株はＤＨ５α［遺伝子型；ｓｕｐＥ４４ ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ１］で、通常の培養にはＴＹ培地（１％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ，０．５％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）を用いた。ベクターの持つ抗生物質耐性マーカーにより、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）またはカナマイシン（ｌｉｑｕｉｄ；５０μｇ／ｍＬ，ｐｌａｔｅ；１５μｇ／ｍＬ）を加えた。また固体培地は上記の培地にａｇａｒを１．５％加えて作成した。プラスミドベクターとしては、酵母ツーハイブリッド系にはｐＡＳ２−１およびｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、シークエンスにはｐＡＣＴ２もしくはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、目的のベクターを構築するためのＤＮＡの制限酵素による切断、結合、平滑末端化、アガロース電気泳動、大腸菌の形質転換などの操作は標準的なプロトコールに従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
出芽酵母の培養方法
出芽酵母株はＣＧ−１９４５（遺伝子型；ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ｃｙｈ^ｒ２，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１_ＵＡＳ−ＧＡＬ１_ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４_{１７−ｍｅｒ（ｘ３）}−ＣｙＣ１_ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ）を用い、培養にはＹＰＤ（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）、もしくは最小培地としてＳＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）を用いた。またマーカーとして適宜アミノ酸を加え、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ［０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ（ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ），１％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０３％ Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，０．１５％ Ｌ−Ｖａｌｉｎｅ，０．０２％ Ｌ−Ａｄｅｎｉｎｅ ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ ｓａｌｔ，０．０２％ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ＨＣｌ，０．０３％ Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ ＨＣｌ，０．０２％ Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｅ，０．０５％ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，０．２％ Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，０．０２％ Ｌ−Ｕｒａｃｉｌ］、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ（ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．０２％ Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ＨＣｌ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、またはＳＤ／−Ｔｒｐ（ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．１％ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ）を用いた。固体培地は上記の培地にａｇａｒを１．５％添加して作成した。
酵母の形質転換
Ｓｍａｌｌ ｓｃａｌｅでの形質転換は以下の方法に従った。酵母をＹＰＤ ４ｍＬでＯＤ_２６０＝０．２〜０．３となるまで培養した後、培養液を１．５ｍＬチューブに３本に分注し、１，０００×ｇで３０秒間遠心後、菌体を回収した。次に１×ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ７．５）を１ｍＬ加えて懸濁し、このうち０．１ｍＬを新しい１．５ｍＬチューブに移した。これにＰＡＳ−ＩＲＳ１ ０．１μｇ，１×ＰＥＧ／ＬｉＡｃ（１×ＴＥ／ＬｉＡｃ＋４０％ ＰＥＧ ６０００）０．６ｍＬを入れ攪拌した後、３０℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ ７０μＬを加え攪拌した後、４２℃で１５分間インキュベートした。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、沈殿を滅菌水に懸濁してＳＤ／−Ｔｒｐ（Ｔｒｐを含まないアミノ酸マーカー）を含むＳＤプレートに播種した。
Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅでの形質転換は以下の方法に従った。酵母をＳＤ／−Ｔｒｐ ５０ｍＬでＯＤ_２６０＝０．２〜０．３となるまで培養した後、培養液をＹＰＤ ３００ｍＬに移し、３０℃で３時間インキュベートした。この培養液を５０ｍＬの遠心管８本に分注し、１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を除去した。次に、酵母の沈殿を１本あたり５ｍＬの滅菌水に懸濁し、これらを２本に２０ｍＬずつ集めた。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を除去した。酵母の沈殿に１×ＴＥ／ＬｉＡｃ １ｍＬを加えて懸濁し、１５ｍＬの遠心管１本にまとめた。これにｃＤＮＡライブラリー１００μｇ，１×ＰＥＧ／ＬｉＡｃ ９ｍＬを入れ攪拌した後、３０℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ １ｍＬを加え攪拌した後、４２℃で１５分間インキュベートした。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、沈殿を滅菌水に懸濁して、ＳＤ／−Ｈｉｓ，−Ｔｒｐ，−Ｌｅｕ＋０．５ｍＭ ３ＡＴ（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕを含まず、３−ａｍｉｎｏ−１，２，４−Ｔｒｉａｚｏｌｅを０．５ｍＭ含むアミノ酸マーカー）を含むＳＤプレート２０枚に分けて播種した。
β−ガラクトシダーゼアッセイ
ＳＤ／−Ｔｒｐ，−Ｌｅｕを含むＳＤプレートの上にニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を置き、このフィルター上にコロニーを播種し培養した。２日後、フィルターを取り出し、液体窒素をかけて細胞を破壊した。新しい試験皿に濾紙を置き、３ｍＬのＺ ｂｕｆｆｅｒ／Ｘ−ｇａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １６．１ｍｇ／ｍＬ，ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ ５．５ｍｇ／ｍＬ，ＫＣｌ ０．７５ｍｇ／ｍＬ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２４６ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ７．０）３ｍＬにβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ８．１μＬ，Ｘ−ｇａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｘ−ｇａｌ；５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ３ｍｇをＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ３０μＬに溶解したもの）３０μＬを混合して作成］をしみこませ、この上に破壊した細胞の乗ったフィルターを置き、３０℃で２時間インキュベートした。
プラスミドの大腸菌への回収
ＳＤ／−Ｔｒｐ，−Ｌｅｕを含むＳＤ液体培地４ｍＬで陽性コロニーを培養し、この培養液を３本の１．５ｍＬチューブに移し、１，０００×ｇで３０秒間遠心後、上清を除去した。次に、ｙｅａｓｔ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１％ ＳＤＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）０．２ｍＬ、ｐｈｅｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（１：１）０．２ｍＬ、ａｃｉｄ−ｗａｓｈｅｄ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ（０．５ｍｍのｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓを一晩濃硝酸に浸した後、水で数回洗浄し、エタノールで１回洗浄し乾燥させた）０．３ｇを加え、５分間攪拌した後、１０，０００×ｇで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。エタノールによりＤＮＡを沈殿し、ＴＥ ２０μＬに溶解した。この溶液を用いて大腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性を賦与するプラスミドを回収した。
酵母ツーハイブリッド系を用いたＩＲＳ１と結合するタンパク質（ＩＲＳＡＰ）のクローニング
Ｂａｉｔとしてｒａｔ ＩＲＳ１ ｃＤＮＡ（東京大学医学部門脇孝博士から供与された。全長ｃＤＮＡ配列を配列番号５、対応するアミノ酸配列を配列番号１に示す）をｐＡＳ２−１ Ｎｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ部位に導入したものを、ＣＧ−１９４５にｓｍａｌｌ ｓｃａｌｅで形質転換し、ＳＤ／−Ｔｒｐプレートに播種した。このｓｍａｌｌ ｓｃａｌｅ形質転換によりプレートに生えてきたコロニーを再び液体培地ＳＤ／−Ｔｒｐで培養し、これにｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）がｐＡＣＴ２のＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ部位に導入されたものをｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅで形質転換し、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．５ｍＭ ３ＡＴ（３−ａｍｉｎｏ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ，ＳＩＧＭＡ）プレート２０枚に分けて播種した。この際、一部をＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐプレートに播種し、スクリーニングクローン数を計算した。以上２回の形質転換によりｂａｉｔおよびｃＤＮＡライブラリーが導入され、プレート上に生えてきたコロニーについてβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。このβ−ガラクトシダーゼアッセイにおいて陽性なコロニーは、さらにプラスミドの大腸菌への回収を行った。回収されたプラスミドについては、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７）に基づいたｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とシークエンスプライマーとして５’−ＴＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４）、およびＡＬＦ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて塩基配列を決定した。また、決定した塩基配列の解析は、コンピューター上で塩基配列解析用ソフトＤＮＡＳＩＳ（日立）およびＢＬＡＳＴサーバー（ＵＲＬ＝ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて行った。
［結果］
ＩＲＳ１をｂａｉｔとした酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、１４−３−３タンパク質を含む様々なタンパク質をコードする遺伝子が取得された
リン酸化チロシン残基を介さずにＩＲＳ１と結合して、ＩＧＦ−Ｉシグナルを修飾するタンパク質（ＩＲＳＡＰ）を同定するために、チロシンキナーゼ活性がほとんど検出されない酵母系を用いて酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。
ｂａｉｔとしてＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインにｒａｔ ＩＲＳ１を融合したタンパク質を用い、ｐｒｅｙとしてＧＡＬ４の転写活性化ドメインと融合したヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを用いて、Ｈｉｓ３をセレクションマーカーとした一次スクリーニングを行った。その結果、約７×１０^６個のコロニーから約１×１０^３個の陽性クローンが単離された。これらのクローンについて、さらにＬａｃＺ活性を指標とした二次スクリーニングを行ったところ、１８７個の陽性クローンを得た。これら陽性クローンからプラスミドを回収し、これを再び酵母に導入後、ＬａｃＺ活性を指標にｂａｉｔであるＩＲＳ１との結合を再検討した。ＩＲＳ１との結合の強さは、Ｘ−Ｇａｌプレート上のＬａｃＺレポーター遺伝子活性によるコロニーの青色の強度により判断した。
強い結合が観察されたクローンについて、塩基配列の解析を行い、この遺伝子がコードするタンパク質を同定した。その結果、下記表１に示すように、既にリン酸化チロシン残基を介さずにＩＲＳ１と結合することが報告されている１４−３−３タンパク質を含む、様々な遺伝子が単離された。配列解析の詳細については後述の実施例３を参照されたい。

これら単離された遺伝子のうち、クローン番号３はＢＬＡＳＴサーバーを用いたｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈの結果、新規タンパク質であることが明らかになったことから、このタンパク質をＩＲＳＡＰ３と命名した。しかし最近になり、ＶｏｇｅｌらのグループによりＴＳＰＹＬ（ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｙ−ｅｎｃｏｄｅｄ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が単離され、ＩＲＳＡＰ３は彼らが単離したＴＳＰＹＬと同一であることがわかった（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。またクローン番号８０は、ＢＬＡＳＴサーバーを用いたｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈの結果、タンパク質間相互作用に働くＬＩＭドメインを分子内に有する新規タンパク質であることが明らかになったことから、このタンパク質をＩＲＳＡＬ（ＩＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名した。これら２つのタンパク質は、機能については全く明らかにされていないことから、これらの分子に注目して研究を進めた。
このＩＲＳＡＬ（クローン番号８０）およびＴＳＰＹＬ（クローン番号３）は、ＩＲＳ１との結合が特に強く確認されたことから、まず、これらＴＳＰＹＬおよびＩＲＳＡＬと他のＩＲＳファミリータンパク質（ＩＲＳ２、ＩＲＳ３もしくはＩＲＳ４）が結合するかどうかを酵母ツーハイブリッドアッセイにより調べた。その結果、ＴＳＰＹＬ（クローン番号３）およびＩＲＳＡＬ（クローン番号８０）は共に、ＩＲＳファミリータンパク質のうち、ＩＲＳ１およびＩＲＳ２と結合することが明らかとなった（データは示さず）。
〔実施例２〕細胞内におけるＩＲＳＡＬとＩＲＳ１との結合の確認
［方法］
細胞培養
ＣＯＳ７細胞（東京大学大学院新領域創生科学研究科片岡宏誌博士から供与された）は、増殖用培地としてＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ニッスイ）に最終濃度１０％となるようにＣＳ（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ，ニチレイ）を加えたものを用い、これに、抗生物質を１００Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように加えた培地で、１５０ｃｍ^２フラスコ（ＩＷＡＫＩ）を用いて３７℃，ＣＯ_２濃度５％の条件で培養した。培地交換は３日おきに行い、植え継ぎはＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ニッスイ）＋０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．０２％ ＥＤＴＡで細胞を剥がし、全量の１／１０の割合で植え継ぎを行った。
プラスミドベクターの構築
ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬを発現するベクターは、ｐＡＣＴ−ＩＲＳＡＬのＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ断片をｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥｃｏＲ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ部位にフレームを合わせて導入し作成した。ＦＬＡＧ−ＩＲＳ１を発現するベクターは、ＩＲＳ１の全長ｃＤＮＡ断片をｐＣＭＶ／Ｆｌａｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ．Ｕ．Ｓ．Ａ．のＤｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏより供与された）のＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉ部位にフレームを合わせて導入し作成した。また酵母ツーハイブリッドアッセイに用いたＩＲＳ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを発現するベクターは、ＩＲＳ１の各ｃＤＮＡ断片（ＮＢ；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉ，ＮＮｃ；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｃｏ Ｉ，ＢｇＢ；Ｂｇｌ ＩＩ−ＢａｍＨ Ｉ，ＮｃＮｃ；Ｎｃｏ Ｉ−Ｎｃｏ Ｉ，ＢＢ；ＢａｍＨ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ）をｐＡＳ２−１にフレームを合わせて導入し作成した。
ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法によるＣＯＳ７細胞への遺伝子導入
ＣＯＳ７細胞を１００ｍｍ試験皿に１．０×１０^６個ずつ播種し、増殖用培地で２４時間培養した。ＨＢＳＳで３回洗浄後、４ｍＬのＤＮＡ−ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＭＥＭ＋５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）４ｍＬに２０ｍｇ／ｍＬ ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ ０．０６ｍＬ、ＤＮＡ ８μｇを混合したもの］を加えた。３７℃で６時間インキュベート後、培地を除き、ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ＋１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）４ｍＬを加えて２分間インキュベートした。ＨＢＳＳで３回洗浄後、増殖用培地を加えて３７℃で２日間インキュベートし、その後の実験に用いた。ただしｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎは、２種類のプラスミドを用いてＤＮＡ−ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４ｍＬずつ作成し、それらを混ぜ合わせ細胞に処理した。
共免疫沈降アッセイ
ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法によりｐＥＧＦＰもしくはｐＥＧＦＰ−ＩＲＳＡＬとｐＣＭＶ／Ｆｌａｇ−ＩＲＳ１を導入したＣＯＳ７細胞から、４００μＬ／１００ｍｍ試験皿のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４，１００ＫＩＵ／ｍＬ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２０μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，１０ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰ）を用いて細胞抽出液を２枚ずつ調製し、この細胞抽出液８００μＬに抗ＧＦＰ抗体を３μｇ加え、４℃で２時間インキュベートした。またこのとき、細胞抽出液を２０μＬ取り分けた。インキュベートしたサンプルに４０μＬのｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ［５０％（ｖ／ｖ），Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ］を加え、さらに４℃で２時間インキュベートした。その後、遠心によりｂｅａｄｓを集めて３回ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％ ＮＰ−４０）で洗浄し、ｂｅａｄｓに２０μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと１０μＬの３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて５分間煮沸した。その後、これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）によるｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔに用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ
１００ｍｍ試験皿に細胞を７．８５×１０^５個まき、上記の方法と同様に静止期に同調するまで培養した。２００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて免疫沈降と同様な手法で細胞を掻き取り、細胞抽出液を調製した。タンパク質濃度をそろえ、２００μＬの細胞抽出液に１００μＬの３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて５分間煮沸した。これらのサンプルを適当なゲル濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｌａｂ Ｇｅｌ Ｕｎｉｔｓ ＳＥ６００，Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて分離した。その後分離したタンパク質をニトロセルロース膜（ＢＡ−８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）へＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてトランスファーした。トランスファー終了後、ニトロセルロース膜をＲｉｎｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＲＢ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［ＲＢ＋３％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）＋０．０２５％ ＮａＮ_３］に浸し、４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング終了後、メンブレンを抗ホスホチロシン抗体（１：３，０００，癌研究会癌化学療法センター基礎研究部矢守隆夫博士より供与された）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体（１：１，０００，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体（１：１，０００，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）にて４℃で一晩インキュベートして一次抗体の結合を行った。インキュベート終了後、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間１回、５分間２回洗浄し、次に二次抗体としてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを結合した抗マウスＩｇＧ抗体（１：７，５００，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）もしくは抗ラビットＩｇＧ抗体（１：７，５００，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて室温で２時間インキュベートした。その後、ＴＢＳ−Ｔで同様にメンブレンを３回洗浄し、検出はＥＣＬ ｋｉｔ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて、キットのプロトコールに従って行い、Ｘ線フィルム（ＨＲ−Ｈ，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．）に露光した。
酵母ツーハイブリッドアッセイ
酵母の培養、形質転換およびβ−ガラクトシダーゼアッセイは、実施例１と同様にして実施した。
［結果］ＣＯＳ７細胞内で、ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬとＦＬＡＧ−ＩＲＳ１は結合する
ｐＥＧＦＰにＩＲＳＡＬ ｃＤＮＡをつなげたプラスミドを作成したところ、ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬは効率よくＣＯＳ７細胞内で発現した。次に、このＧＦＰ−ＩＲＳＡＬとＩＲＳ１との結合を調べるために、ＧＦＰとは別のタグであるＦＬＡＧタグを繋げたＦＬＡＧ−ＩＲＳ１を発現するプラスミドを作成、ＣＯＳ７細胞に導入したところ、ＦＬＡＧ−ＩＲＳ１も効率よく発現することが確認された。
そこで、ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬとＦＬＡＧ−ＩＲＳ１を高発現するＣＯＳ７細胞の細胞抽出液を用いて、共免疫沈降アッセイを行った。抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体でｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔした結果、ＩＲＳＡＬとＩＲＳ１の結合を示す、抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ−ＩＲＳ１のバンドが検出された。結果を図１に示す。図中、ＷＣＬは全細胞抽出液、ＭｏｃｋはｐＥＧＦＰを示す。
ＩＲＳＡＬは、ＩＲＳ１のアミノ酸配列中、アミノ酸番号４９３〜６９４位の領 域と結合する
次に、ＩＲＳＡＬがＩＲＳ１のどの領域に結合するかを調べた。上述のとおり、ＧＳＴ−ＩＲＳＡＬが作成できなかったため、酵母系を用いて解析を進めた。まず、ＩＲＳ１全長ｃＤＮＡ配列（配列番号５）を該配列内のいくつかの制限酵素部位で切断し、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいてｂａｉｔとなるｐＡＳ２−１ベクターにフレームを合わせてつなぎ、ｐＡＳ−ＩＲＳ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ（図２中、Ｍ１〜Ｍ５。ＦＬはＩＲＳ１ｃＤＮＡ全長を表わす）を作成した。
まず、ｆｉｒｓｔ ｃｏｄｏｎ（ＡＴＧ）の３塩基をＣＡＴに置き換えて、ＮｄｅＩ ｓｉｔｅを入れた。ＩＲＳ−ＦＬ＝ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ（配列番号５に示す配列中、塩基番号１〜３７０８の領域に該当する）、−Ｍ１＝ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ（同１〜２５７８）、−Ｍ２＝ＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ（同１〜１４８２）、−Ｍ３＝ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ（同１５３１〜２５７８）、−Ｍ４＝ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ（同１４８２〜２０７８）、−Ｍ５＝ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ（同２５７８〜３７０８）これらのｐＡＳ−ＩＲＳ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓとｐＡＣＴ−ＩＲＳＡＬを用いて、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った。結果を図２に示す。図中、Ｘ−Ｇａｌプレート上で白色コロニーを呈したものをマイナス（−）、青色コロニーを呈したものをプラス（＋）、ｂａｉｔのみで青色コロニーを呈したものをＮＤ（測定不可）で表す。
その結果、ＩＲＳ１−ＦＬ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ），Ｍ１，Ｍ３，Ｍ４は、ＩＲＳＡＬとの結合によりβ−ガラクトシダーゼ活性が検出されたが、ＩＲＳ１−Ｍ５はＩＲＳＡＬとの結合が確認できなかった。またＩＲＳ１−Ｍ２はｂａｉｔであるｐＡＳ−ＩＲＳ１−Ｍ２のみでβ−ガラクトシダーゼ活性が検出されてしまったため、ＩＲＳＡＬとの結合は確認できなかった［図２中、ＮＤ（ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）と表示］。これらの結果から、ＩＲＳＡＬは、配列番号１に示すＩＲＳ１アミノ酸配列中、アミノ酸番号４９３〜６９４位の領域と結合することが明らかとなった。
〔実施例３〕 ＩＲＳＡＬ ｃＤＮＡの塩基配列の決定および発現組織の同定
［方法］
塩基配列の決定
ＩＲＳＡＬ遺伝子（単離した全長ｃＤＮＡ）を含む約２．０ｋｂｐのＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に導入し、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩおよびＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅを用いてＤＮＡを段階的に削り、これらを鋳型ＤＮＡとした。ジデオキシ法に基づいたｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＡＬＦ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、５’側と３’側の両方向に塩基配列を決定した。また、決定した塩基配列の解析は、コンピューター上で塩基配列解析用ソフトＤＮＡＳＩＳ（日立）およびＢＬＡＳＴサーバーを用いて行った。
発現組織の同定
ヒト各組織から抽出・精製されたポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ １μｇから構成されるＨｕｍａｎ １２−Ｌａｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびプローブの鋳型としてＩＲＳＡＬ全長ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ断片とｋｉｔに添付されていたβ−ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡを用いてＮｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。すなわち、ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＯＶＥＮ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にてメンブレンをプレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ；０．７５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４，５ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ_２，ｐＨ７．４，５０％ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１％ ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ）１２ｍＬで４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行い、さらにプレハイブリダイゼーション溶液にプローブ液（＞２０×１０^４ｃ．ｐ．ｍ．／ｍＬ）１０ｍＬを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、塩濃度の違う２種類の洗浄液（１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳもしくは０．２×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）でメンブレンを洗い、充分にバックグラウンドを落とし、メンブレンをプラスチックパックしてイメージングアナライザー（ＦＵＪＩＸ ＢＡＳ ２０００ ＳＹＳＴＥＭ，富士写真フィルム）もしくはオートラジオグラフィーにて解析を行った。また、定量はＦＵＪＩＸ ＢＡＳ ２０００ ＳＹＳＴＥＭにて行った。プローブはＲａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）でラベルした。ラベルの手順はキットのプロトコールに従った。
反応後のｃＤＮＡプローブは、ｓｐｉｎ−ｃｏｌｕｍｎ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）によって、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ｍｉｄ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。再ハイブリダイゼーションは、解析後のメンブレンを１％ ＳＤＳ，０．１×ＳＳＣで３０分間煮沸してｃＤＮＡプローブを剥がして除去し、再びプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションを行った。
［結果］
ＩＲＳＡＬ ｃＤＮＡは１，００８塩基対、３３６アミノ酸からなるＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅ）をコードし、その分子構造はＰＩＮＣＨ（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ ｎｅｗ Ｃｙｓ−Ｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質と類似している
スクリーニングにより得られたプラスミド（クローン番号８０）は、約２．０ｋｂｐからなるインサートを含んでいた。そこで、この約２．０ｋｂｐからなるｃＤＮＡの全塩基配列を決定したところ、１，００８塩基対、３３６アミノ酸（推定）からなるＯＲＦが存在していることがわかった。これらの配列を図３に示す。また、塩基配列を配列番号３、推定アミノ酸配列を配列番号２とする。
塩基配列より予想されたアミノ酸配列から、ＩＲＳＡＬは分子内にＬＩＭドメインを５個有し、この分子がほとんどＬＩＭドメインのみで構成されているＬＩＭ−ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎであることが判明した。また、ＩＲＳＡＬと他のＬＩＭタンパク質は、ＬＩＭドメイン内で高い相同性を示し、特にヒト胎児期肝臓発現ライブラリーから単離されたＰＩＮＣＨ（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ ｎｅｗ Ｃｙｓ−Ｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質（Ｒｅａｒｄｅｎ，１９９４）は、ＩＲＳＡＬと分子構造が類似していることがわかった。
ＩＲＳＡＬはインスリンやＩＧＦ−Ｉの標的組織での発現が確認され、特に心臓において発現が強い
次に、ＩＲＳＡＬの様々な組織における発現様式を調べるため、ヒト各組織由来ｍＲＮＡから作られたメンブレン（Ｈｕｍａｎ １２−Ｌａｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ）および^３２Ｐで標識したＩＲＳＡＬ全長ｃＤＮＡプローブ（配列番号３）を用いてＮｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。結果を図４に示す。
その結果、約２．４ｋｂｐと約２．０ｋｂｐの位置にＩＲＳＡＬ ｍＲＮＡのバンドが確認された。また、ＩＲＳＡＬはインスリンやＩＧＦ−Ｉの標的組織である心臓、骨格筋、大腸、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺などで発現が確認され、特に心臓において発現が強いことが明らかとなった。
〔実施例４〕ＨＥＫ２９３細胞を用いたＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経路におけるＩＲＳＡＬの機能の解析
［方法］
細胞培養
ＨＥＫ（ヒト胚腎）２９３Ｔ細胞（東京大学大学院農学生命科学研究科塩田邦郎博士から供与された）は、増殖用培地としてＤＭＥＭに最終濃度１０％となるようにＦＣＳを加えたもの、無血清培地としてＤＭＥＭに最終濃度０．１％となるようにＢＳＡを加えたものを用いた。
リン酸カルシウム法による２９３Ｔ細胞への遺伝子導入
２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ試験皿に１．０×１０^６個ずつ播種し、増殖用培地で４８時間培養した。またｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行う１時間前に増殖用培地を新しいもの交換した。ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下のように調製した。滅菌水４４０μＬにＤＮＡを１０μｇ加え、さらに２×ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ），ｐＨ７．０５［２×Ｈｅｂｓ（４２ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２９０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０５）５００μＬに７０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４を１０μＬ加えたもの］を５１０μＬ入れよく混ぜ合わせた。この溶液に２．５Ｍ ＣａＣｌ_２ ５０μＬを徐々に滴下してよく混ぜ合わせた後、室温にて３０分放置した。インキュベート後、この溶液１ｍＬを攪拌してｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。先の新しく培地を交換した試験皿にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍＬを滴下しながら加え、３７℃で１２時間〜１８時間インキュベートした。その後、培地を新しい増殖用培地に換え、さらに２４時間培養後、実験に用いた。
ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬ高発現２９３Ｔ細胞の抽出液の免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ
ｐＥＧＦＰもしくはｐＥＧＦＰ−ＩＲＳＡＬを導入した２９３Ｔ細胞を無血清培地で１２時間〜１８時間インキュベートし、静止期に同調した。この細胞を１００ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ−Ｉで処理し、様々な時間でＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ ＮＰ−４０，１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４，１００ＫＩＵ／ｍＬ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２０μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，１０ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰ）８００μＬ／試験皿を用いて掻き取った。これを１４，０００×ｇ，４℃で２０分間遠心し、細胞抽出液を作成した。細胞抽出液のタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてキットのプロトコールに従って測定した。一方、免疫沈降をする場合には、タンパク質濃度の等しい細胞抽出液に抗ＩＲＳ１抗体（１０μＬ）、抗ＩＲＳ２抗体（１０μＬ）をそれぞれ加え、４℃で１２時間反応させた。この反応液に４０μＬのｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ［５０％（ｖ／ｖ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ］を加え、さらに４℃で２時間反応させた。遠心により免疫沈降物を集め、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＦ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％ ＮＰ−４０）を用いて３回洗浄した。この免疫沈降物に６０μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと３０μＬの３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（９％ ＳＤＳ，１５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８，０．０５％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ，６％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を加え、５分間煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔのサンプルとした。なお、抗ＩＲＳ１抗体および抗ＩＲＳ２抗体は、Ｏｇｉｈａｒａらが用いたペプチドと同様の配列を有するものを合成し（Ｏｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ）、ウサギに免疫して作成した。
細胞抽出液を用いた免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔは、前出の方法に従った。ただし、ブロッキング終了後、メンブレンを抗ホスホチロシン抗体（１：３，０００，癌研究会癌化学療法センター基礎研究部矢守隆夫博士より供与された）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体（１：１，０００，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体（１：１，０００，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）にて４℃で一晩インキュベートして一次抗体の結合を行った。
［結果］
２９３Ｔ細胞におけるＩＲＳＡＬの高発現は、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ１およびＩＲＳ２のチロシンリン酸化を変化させる
次に、ＩＲＳＡＬは、ＩＲＳファミリータンパク質のうちＩＲＳ１とＩＲＳ２に結合することが明らかとなっていることから、ＩＲＳＡＬがレセプターキナーゼによるＩＲＳ１およびＩＲＳ２のチロシンリン酸化に与える影響について、同様な実験系を用いて検討した。結果を図５に示す。
その結果、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応じて、ＩＲＳ１やＩＲＳ２がチロシンリン酸化されるが、ＧＦＰのみを高発現させた対照細胞と比較して、ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬを高発現させた細胞ではＩＧＦ−ＩによるＩＲＳ１のチロシンリン酸化が増強していることを発見した。これに対して、対照細胞と比較してＧＦＰ−ＩＲＳＡＬを高発現させた細胞では、ＩＧＦ−ＩによるＩＲＳ２のチロシンリン酸化は、抑制されていた。またこのとき、ＧＦＰ−ＩＲＳＡＬの発現は、細胞抽出液を用いたイムノブロットにより確認できたが、ＩＲＳ１やＩＲＳ２に結合しているＧＦＰ−ＩＲＳＡＬは、結合量が少ないためか、ＩＲＳ１やＩＲＳ２との共沈降実験により確認できなかった。今後の検討が必要である。これらの結果から、ＩＲＳＡＬはＩＲＳ１およびＩＲＳ２のＩＧＦ−Ｉ誘導性チロシンリン酸化を変化させることが明らかとなった。
２９３Ｔ細胞におけるＩＲＳＡＬの高発現は、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＡｋｔ の活性化に影響しないが、Ｅｒｋの活性化を増強する
さらに、ＩＲＳＡＬがＩＲＳよりもさらに下流のシグナルに与える影響について検討した。ＩＧＦ−ＩによるＩＲＳ１やＩＲＳ２のチロシンリン酸化に対するＩＲＳＡＬの影響が、下流のＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ経路およびＰＩ ３−ｋｉｎａｓｅ経路の活性化にどのように反映されているかについて、同様な実験系を用いて調べた。結果を図６に示す。
ＩＧＦ−Ｉ刺激に応じてＥｒｋやＡｋｔはリン酸化され活性化するが、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体および抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体を用いたｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔの結果、ＩＲＳＡＬはＩＧＦ−Ｉ刺激によるＥｒｋの活性化を増強し、Ａｋｔの活性化には影響を与えないことが明らかとなった。これらの結果から、ＩＲＳＡＬはＩＧＦ−ＩによるＰＩ ３−ｋｉｎａｓｅ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ経路の活性化は増強させることが明らかとなった。
〔実施例５〕 ＩＲＳＡＬの発現が糖の細胞内取り込みに与える影響
［方法］
Ｌ６筋芽細胞の培養および筋管細胞への分化
本研究で用いたラット骨格筋由来筋芽細胞Ｌ６ ｍｙｏｂｌａｓｔ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １４５８ 東京農工大学農学部、矢ケ崎一三教授より供与された）は以下の方法で培養を行い、以後の実験に用いた。Ｌ６細胞の培養は、１５０ｃｍ^２のフラスコ（ＩＷＡＫＩ）に、培養培地としてＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｉｓｓｕｉ））＋１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎ ｓｅｒｕｍ）を２０ｍＬ加え３７℃のＣＯ_２インキュベーター中（Ａｉｒ：ＣＯ_２，１００％ ｈｕｍｉｄｉｔｙ）で行った。細胞の継代は以下の方法で行った。Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった細胞に０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．０２％ＥＤＴＡを４ｍＬ加え、３７℃のＣＯ_２インキュベーター中で数分間静置し、細胞を剥離させた。この溶液にＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを６ｍＬ加えて数回ピペッティングした後、１５ｍＬ遠沈管に移し入れ、６００×ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を吸い取り、あらたにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを５ｍＬ加え、よくピペッティングし細胞を均一にした後、細胞数を計測した。新しい１５０ｃｍ^２フラスコに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２０ｍＬ／フラスコの濃度になるように細胞を播き、継代用とした。
遺伝子導入
Ｌ６筋芽細胞を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに６．０×１０^３個ずつ播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ培地で２４時間培養した。培養後、ＴｒａｎｓＦａｓｔ^ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．７５μＬを用いて、０．２５μｇのｐＣＭＶ／ＨｉｓもしくはｐＣＭＶ／Ｈｉｓ−ＩＲＳＡＬを細胞に導入した。遺伝子導入の方法はキットのプロトコールに従った。遺伝子導入から４８時間後に培地をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳに換え、２日毎に培地交換を行い、約８０〜９０％の細胞が筋管細胞に分化するまで培養した。分化後、培地をＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡに換えて２４時間培養し、細胞を静止期に同調した後に、各因子で処理を行い、糖取り込みを測定した。
糖の取り込み
細胞を終濃度１０^−８Ｍのインスリンで３０分間処理をした。Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，２．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄後、次いで５００μＬの０．５μＣｉ／ｍＬ ２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ［２，６−^３Ｈ］ｇｌｕｃｏｓｅ，１０μＭ ２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを含むＨｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒで３７℃で１０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。そしてｂｕｆｆｅｒを吸引・除去後、１ｍＬのｉｃｅ ｃｏｌｄ ＰＢＳ（−）で３回洗浄して、その後２００μＬの０．０５ Ｎ ＮａＯＨを加えて、ピペッティングする事により細胞を溶解し、５ｍＬの液体シンチレーションカクテル（クリアゾル）を加えた後、液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ）で細胞に取り込まれた２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ［２，６−^３Ｈ］ｇｌｕｃｏｓｅの放射活性を測定した。結果を図７に示す。
結果に示すように、ＩＲＳＡＬの強制発現によって、インスリン刺激に依存して増加する糖の取り込みが抑制された。
産業上の利用性
本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬは糖の細胞内取り込みを制御する活性を有することから、該タンパク質をコードする本発明の遺伝子ｉｒｓａｌの発現異常は、糖の細胞内取り込み上重大な障害となることが推測される。
従って、本発明のタンパク質ＩＲＳＡＬを利用して、糖の細胞内取り込みを促進または阻害する化合物をスクリーニングすることができ、これらの化合物は２型糖尿病の治療薬として期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔにより、ＩＲＳＡＬとＩＲＳ１の結合を調べた結果を示す図である。
図２は、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いてＩＲＳＡＬとＩＲＳ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔとの結合を調べた結果を示す図である。ＩＲＳ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔの模式的な図を左に、アッセイの結果を右に示す。
図３は、単離されたＩＲＳＡＬ ｃＤＮＡ塩基配列と、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列を示す図である。
図４は、各種ヒト組織におけるＩＲＳＡＬ ｍＲＮＡの発現をノーザンブロットにより調べた結果を示す図である。
図５は、ＩＲＳＡＬの発現がＩＧＦ−Ｉ刺激によるＩＲＳ１およびＩＲＳ２のチロシン残基リン酸化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
図６は、ＩＲＳＡＬの発現がＩＧＦ−Ｉ刺激によるＥｒｋおよびＡｋｔの活性化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
図７は、ＩＲＳＡＬの発現が、ラット骨格筋由来筋芽細胞Ｌ６において糖の細胞内取り込みに及ぼす影響を調べた結果を示す図である。

Claims (9)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸番号４９３〜６９４で示す領域に結合し、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有することを特徴とするタンパク質。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質。
3. 請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
4. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
   （ａ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖の細胞内取り込みを制御する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
5. 請求項３または４に記載の遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
6. 請求項５に記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
7. 請求項６に記載の形質転換体を培養し、当該培養物から請求項１または２に記載のタンパク質を回収することを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
8. 請求項１または２に記載のタンパク質に対する抗体。
9. 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と請求項１または２に記載のタンパク質を用いることを特徴とする、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と請求項１または２に記載のタンパク質との結合を阻害または促進する化合物のスクリーニング方法。

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