JP2000516081A

JP2000516081A - 転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素

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Publication number: JP2000516081A
Application number: JP08535208A
Authority: JP
Inventors: デュエル，トーマス・エフ; シェンク，トーマス; ワン，ジャオ−イ
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2000-12-05
Also published as: EP0850250A1; AU720755B2; WO1997008195A1; CA2230689A1; AU7695196A

Abstract

(57)【要約】ｈＵＢＣ−９と称する、ヒトユビキチン結合酵素、その完全アミノ酸配列、およびｈＵＢＣ−９をコードする核酸ポリマーを開示する。機能的ユビキノン結合活性を有することに加えて、この酵素は、結合活性とは独立した転写リプレッサー活性を有する。ｈＵＢＣ−９の該結合活性は、ＷＴ１などの転写サプレッサータンパク質の分解、あるいはｈＵＢＣ−９それ自身の分解のために転写を増加させる。ｈＵＢＣ−９のリプレッサー活性は、おそらく、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）のＤＮＡ結合領域との特異的相互作用のために転写開始複合体を崩壊させることによって遺伝子転写を抑圧する。用途としては、ｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９および他のリプレッサー活性を有するユビキノン結合酵素を、Ｇａｌ４などのＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質に融合させることができるか、またはウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子産物であるＷＴ１などのリプレッサーとともに用いることができる。医薬的および非医薬的適用の両方において、このような酵素およびそれらをコードする核酸ポリマーを用いて標的遺伝子の転写を調節することができる。

Description

【発明の詳細な説明】転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素本発明は、同時継続の米国仮出願第６０／００２,９９５号および同時継続の米国仮出願第６０／０１８,０４０号に対して優先権を主張する。本発明は、国立衛生研究所からの認可（２ＰＯ１ＣＡ４９７１２）によって支持された研究によって発展した。合衆国政府は、本発明に権利を有することができる。発明の背景本発明は、新規な哺乳類ユビキチン結合(conjugating)酵素、さらに詳しくは、ヒトユビキチン結合酵素の同定、単離および精製、解明された完全アミノ酸配列、ならびに該酵素をコードするヌクレオチド配列に関する。さらに本発明は、ヒトおよび非ヒト宿主細胞において、遺伝子転写を調節するため、特に標的遺伝子の転写を抑圧するための該酵素および類似の酵素の新規な使用方法に関する。好ましい適用においては、本発明は、ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子産物であるＷＴ１のリプレッサー活性を増加する方法に関する。ユビキチンは、タンパク質に分解のための標識をつけ、それによって、それらの細胞中での寿命を調節することにおいて中心的役割を演じることが同定されている。たとえば、ユビキチネーションによって調節されていることが知られている核タンパク質には、ＮＦｘｂ、サイクリンＢ、ｃ−ｊｕｎ、ｐ５３およびヒストンが包含される。ユビキチン結合酵素（ＵＢＣ）は、ユビキチンを活性化し、活性化したユビキチンをチオエステル結合で移動させることによってタンパク質分解的プロテオサム(proteosome)経路において分解の標的となるタンパク質にユビキチンを結合させる。少なくとも１２種の別の酵母ユビキチン結合酵素が同定され、配列決定されている。しかっし、本発明の以前には、２種の哺乳類ＵＢＣが同定され、配列決定されているに過ぎず、ｙＵＢＣ−９および他の酵母ＵＢＣのヒト対応物は同定されていなかった。２種の酵母ユビキチン結合酵素が細胞周期の進行を媒介することが報告されている（ｙＵＢＣ３：Goeble,M.G.ら、1988 およびｙＵＢＣ９：Seufert,W.ら、1995）が、ユビキチン結合酵素が、その結合活性とは独立した他の活性を有することはこれまでに報告されていない。ｐ５３遺伝子、網膜芽腫瘍（Ｒｂ）およびウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子などの腫瘍サプレッサー遺伝子は、種々の方法で細胞の生殖および／または転写を阻害するタンパク質をコードする。たとえば、ｐ５３遺伝子タンパク質は、ＤＮＡに結合して他の調節遺伝子の転写を誘発し、その産物が正常な細胞周期の進行に重要なタンパク質のキナーゼ活性を遮断し、それによって細胞生殖が排除されると考えられている。Ｒｂ遺伝子タンパク質は、アクチベータータンパク質の活性化ドメインをマスキングすることによって作用すると考えられている。Ｒｂ遺伝子産物タンパク質およびその治療的使用方法が、米国特許第５,４９６,７３１号（Benedictら）に開示されている。遺伝子サプレッサータンパク質もまた、特異的ＤＮＡ結合部位に対してアクチベータータンパク質と競合すること、および／または一般的転写因子との直接的または間接的相互作用といったような他の方法で作用する。他の腫瘍サプレッサー遺伝子および遺伝子産物(ＨＴＳ−１遺伝子)が、米国特許第５,４９１,０６４号（Howleyら）に開示されている。ウィルムス腫瘍（ＷＴ）サプレッサー遺伝子産物（ＷＴ１）は、クルッペルジンクフィンガーファミリーをもつ二価性転写因子である。ＷＴ１遺伝子（１１ｐ１３）の両対立遺伝子の機能喪失は、ウィルムス腫瘍および関連症候群に関連性がある。ＷＴ１は、グルタミン／プロリンリッチなＮ末端領域およびＣ末端領域にサブクラスＣ２−Ｈ２の４個のジンクフィンガーを含む５２〜５７ｋｄの核タンパク質である。ＷＴ１は、ＴＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦＡ鎖、ＣＳＦ−１およびＩＧＦ−Ｒプロモーターといったような幾つかの成長関連遺伝子のプロモーター活性の強力なリプレッサーである。ＷＴ１は、ＷＴ１がジンクフィンガードメインを介してＤＮＡと相互作用するときに活性をもつ独立したリプレッサードメインを有する。ＷＴ１などのリプレッサー遺伝子産物の活性が転写に影響を及ぼすことは知られているが、転写抑制が有効であることによる生化学的メカニズムへのコントロールは、完全には理解されておらず、高レベルの抑制がなされることが、市販用には望ましい。発明の要約したがって、本発明の目的は、細胞内で転写を調節する方法、特に宿主細胞内標的遺伝子の転写を抑制する方法でを提供することである。本発明の他の目的は、ＷＴ１、ウィルムス腫瘍遺伝子産物といったような公知のリプレッサータンパク質のリプレッサー活性を増加することである。したがって、本発明は、分子量が約１６キロダルトン〜約１８キロダルトン、好ましくは約１７キロダルトンであり、配列長さ約１５０〜１６５アミノ酸残基、好ましくは１５８アミノ酸残基であり、結合活性および／または転写リプレッサー活性を有する、新規な、単離され、実質的に精製された哺乳類ユビキチン結合酵素、ｈＵＢＣ−９に関する。さらに本発明は、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。さらに本発明は、ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、少なくとも約１２アミノ酸残基の長さのｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の一部を包含するタンパク質に関する。ｈＵＢＣ−９の配列の包含された部分が、結合活性またはリプレッサー活性をタンパク質に授与する。本発明は、転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８５％および最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するタンパク質に関する。ユビキチン結合活性はないが、転写リプレッサー活性を保持するｈＵＢＣ−９のＣ⁹³突然変異体が、特に好ましいタンパク質である。さらに本発明は、ｈＵＢＣ−９をコードする実質的に単離された核酸ポリマーに関する。該核酸ポリマーは、好ましくは、(ａ)図１Ａのヌクレオチド配列番号１；(ｂ)図１Ａのヌクレオチド配列番号２；(ｃ)図１Ａの配列番号２の８８番から５６４番の位置の配列によって定義される核酸残基を包含する核酸配列；からなるグループから選ばれる核酸配列を有する。さらに本発明は、ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の一部を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、実質的に単離された核酸ポリマーに関する。包含される部分は、少なくとも約１２アミノ酸残基の長さであり、該タンパク質に結合活性またはリプレッサー活性を授与する。本発明は、少なくとも約３６核酸残基の長さであり、転写リプレッサー活性をもつタンパク質をコードする核酸ポリマーに関する。このような核酸フラグメントは、ｈＵＢＣ−９に対して少なくとも約６０％の配列同一性をもつタンパク質をコードすることができる。あるいは別の態様としては、本発明の一部を構成する上記核酸ポリマーに対して相補的な核酸ポリマーにハイブリダイズすることができる。また本発明は、上記本発明の核酸ポリマーに対して相補的である核酸ポリマーに関する。本発明は、ｈＵＢＣ−９またはその断片をコードするＤＮＡを有するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を用いてｈＵＢＣ−９またはその断片を産生する方法に関する。ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）を有するプラスミドベクターを産生することを特徴とする方法が好ましい。ＤＮＡは上記ｈＵＢＣ−９タンパク質またはその断片もしくは相同体をコードする。プラスミドベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、ｈＵＢＣ−９を宿主細胞内に発現させる。要すれば、発現したｈＵＢＣ−９を宿主細胞から精製する。また本発明は、該ベクターおよびそれにトランスフェクトされた宿主細胞に関する。さらに本発明は、それぞれＤＮＡを含む第１および第２プラスミドベクターで同時トランスフェクトされた宿主細胞に関する。第１プラスミドベクターのＤＮＡは、ＷＴ１といったようなＵＢＣ−９タンパク質以外の転写リプレッサータンパク質をコードする核酸ポリマーを含む。第２のプラスミドベクターのＤＮＡは、好ましくは、該転写リプレッサータンパク質の転写リプレッサー活性とは独立している転写リプレッサー活性を有するアダプタータンパク質をコードする核酸ポリマーを含む。アダプタータンパク質は、該転写リプレッサータンパク質と、両者が宿主細胞内で共に発現した後に、会合するかまたは相互作用する。アダプタータンパク質は、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列を有する。ユビキチン結合酵素として、たとえばｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９、ＵＢＣ−９ファミリーの他のメンバーおよび他のユビキチン結合酵素が挙げられる。アミノ酸配列の包含された部分は、少なくとも約１２アミノ酸残基の長さである。さらに本発明は、転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質に関する。転写リプレッサードメインは、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも１２個のアミノ酸残基からなる部分を包含するアミノ酸配列を有する。ＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子のプロモーター領域に十分近くに結合してユビキチン結合酵素の転写活性を抑制するドメインが好ましい。ＤＮＡ結合ドメインとして、たとえば、Ｇａｌ４、ＬｅｘＡおよびジンクフィンガードメインを有するものすべてが挙げられる。また本発明は、このような融合タンパク質をコードする核酸ポリマー、このような核酸ポリマーを含むプラスミドベクターおよび該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。本発明はさらに、転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質を産生する方法に関する。該方法は、上記融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターを産生し、該プラスミドベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞内で融合タンパク質を発現させ、次いで、要すれば、発現した融合タンパク質を宿主細胞から精製することを特徴とする。他の態様では、本発明は、転写リプレッサー活性を有するタンパク質、および許容しうる担体、希釈剤または標的細胞に該タンパク質を導入するのに適した生化学的デリバリー剤を含む組成物に関する。該タンパク質は、転写リプレッサー活性を有し、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素の少なくとも１２個のアミノ酸残基の長さの部分を包含するアミノ酸配列をもつ。該タンパク質は、その転写リプレッサー活性を、酵素の包含された部分から誘導する。組成物は、非医薬（すなわち、非ヒト）用途に用いることができるが、医薬組成物に用いることもでき、該組成物においては、上記タンパク質を医薬的に許容しうる担体、希釈剤および／または遺伝子治療デリバリー剤と組み合わせて使用する。さらに本発明は、細胞へ核酸ポリマーを導入し、それによって核酸ポリマーの発現産物を標的遺伝子に曝露および／または接触させるために使用するのに適した組成物に関する。該組成物は、転写を調節するための医薬的または非医薬的適用に用いることができる。該組成物は、核酸ポリマーおよび遺伝子治療デリバリー剤を含む。医薬的適用に用いる場合、核酸ポリマーまたは該核酸ポリマーを含む構築物の量は、宿主細胞における発現という点で、細胞内の標的遺伝子を調節するための医薬的有効量のタンパク質を発現するのに充分な量である。核酸ポリマーは、医薬的に許容しうる遺伝子治療デリバリー剤とともに用いる。核酸ポリマーは、転写リプレッサー活性を有し、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素の少なくとも１２個のアミノ酸残基の長さの部分を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。酵素の包含された部分が、該タンパク質にリプレッサー活性を授与する。別の態様として、該核酸ポリマーは、組成物中の上記核酸ポリマーに相補的な核酸配列を有することができる。核酸組成物は、標的遺伝子にデリバリーされている核酸ポリマーを包含するウイルスゲノムを有するウイルスであることができる。このような組成物において用いるユビキチン結合酵素は、ｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９−ｍといったようなＵＢＣ−９タンパク質が好ましい。別の医薬組成物は、医薬的活性量の上記融合タンパク質および医薬的に許容しうる担体を含む。本発明はまた、細胞内で標的遺伝子の転写を調節する方法に関する。該方法は、標的遺伝子を転写リプレッサー活性を有するタンパク質に曝露および／または接触させることを特徴とする。該タンパク質は、ＵＢＣ−９といったような転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素の少なくとも１２個のアミノ酸残基の長さの部分を包含するアミノ酸配列を有する。該タンパク質を含む組成物または該タンパク質をコードする核酸ポリマーを含む組成物は、標的細胞をウイルスなどの遺伝子治療デリバリー剤と接触、感染またはトランスフェクトさせるなどの多くの方法で細胞に導入することができる。遺伝子を曝露させるタンパク質の量は、細胞内に通常存在する内在性の量以上である。該細胞は、真菌細胞（酵母細胞など）などの真核細胞、植物細胞、非ヒト動物または哺乳類細胞あるいはヒト細胞でありうる。細胞は、ウイルスに感染した細胞であってもよく、その場合、該ウイルスのゲノムが転写調節タンパク質に曝露される。本発明はまた、新生組織の成長を調節する方法に関する。該方法では、新生組織細胞を、新生組織成長調節量の上記医薬組成物の１種に接触させ、それによって新生組織の成長を調節する。また本発明は、ウィルムス腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。該方法は、ウィルムス腫瘍細胞に、ウィルムス腫瘍阻害量の転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素またはその断片を導入すること、あるいは別の態様として、そのような量の酵素をコードする核酸ポリマーを、好ましくは同時発現しているＷＴ１とともに導入することを特徴とする。本明細書に記載されている発見は、転写リプレッサーまたはプロモーターが種々の細胞活性を所望の仕方で阻害または増強するようにするための方法の発展において、重要な分析的ツールおよび重大なつながりを提供する。たとえば、化学療法、遺伝子療法および薬物開発において、ｈＵＢＣ−９および他のメンバーまたはＵＢＣ−９ファミリーを用いることができる。本発明の他の用途としては、ウイルスによって起こる疾患などのヒト疾患に関連する遺伝子、または酵母感染に関連する遺伝子の異常発現のコントロールといったような、特定および一般の両遺伝子の転写速度および細胞周期の速度を調節するための使用が挙げられる。本発明には、パン焼きおよび醸造工業など、酵母に対する非医薬的適用、および必須アミノ酸といったような価値ある化学品を生産するための酵素転換法と組み合わせた非医薬的適用といった使用も含まれる。酵素、その活性および他の特徴、酵素発現方法、ならびにその使用方法を以下にさらに詳細に記載する。本発明の他の特徴および目的は、当業者には一部明らかであろうし、後記においても一部指摘されることとなろう。図面の簡単な説明本発明を添付の図面によってさらに開示し、説明する。本発明が優先権を主張する先の米国仮出願およびその図面においては、他の名称を用いて酵素ｈＵＢＣ −９を示した。特記すると、頭字語“ＴＲＡ”、“ヒトＵＢＣ”および／または “ｈＵＢＣ−ｈ”という名称で該酵素を示した。本発明で用いる語句ｈＵＢＣ− ９は、該文献の語句に匹敵するものである。しかし、これらの名称の各々は、図１Ｂおよび図１Ａに示す特定のヌクレオチド配列に対応するものとしてまた図１Ａに記載されているｈＵＢＣ−９と同じ酵素を意味するものである。図１Ａおよび１Ｂは、ｈＵＢＣ−９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ｈＵＢＣ−９をコードする２つのＤＮＡクローンに対する全長ヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示す。長い方の７９２番目の位置のシトシンと短い方の７３番目の位置のシトシンを連結する垂直線は、２つの別のスプライスされたｍＲＮＡの共通のヌクレオチド配列のスプライス部位および起点を示す。図２Ｂは、ｈＵＢＣ−９とｙＵＢＣ−９の予測されるアミノ酸配列の比較を示す。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれノーザンおよびサザンブロット分析の結果を示す。図２Ａは、異なるヒト組織中のｈＵＢＣ−９のノーザンブロットを示す。図２Ｂは、ｈＵＢＣ−９遺伝子のサザンブロットを示す。図３Ａおよび３Ｂは、会合したＷＴ１およびｈＵＢＣ−９のウエスタンブロットにおける、ＷＴ１とｈＵＢＣ−９のインビトロでの結合を示す。図３Ａは、マトリックス−カップリングしたＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９から得、次いで２９３細胞抽出物由来のＷＴ１とともにインキュベートした溶離液のブロットを示す。図３Ｂは、ＷＴ１およびＨＡ−標識ｈＵＢＣ−９発現ベクターで同時トランスフェクトされた２９３細胞由来のＷＴ１とｈＵＢＣ−９の共免疫沈降の結果を示す。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ増強温度および制限温度における温度感受性酵母細胞培養物を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ヒト胚腎臓細胞（２９３）においてｈＵＢＣ−９がどのようにＷＴ１の転写リプレッサー活性増強するかを示す。図５Ａは、ＷＴ１およびｈＵＢＣ−９発現ベクターを種々の量で同時トランスフェクトした場合の相対的ＣＡＴ活性を示す。図５Ｂは、それぞれ時間±標準偏差の異なる独立したアッセイの相対的ＣＡＴ活性を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ｈＵＢＣ−９／Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質の転写リプレッサー活性を示す。図６Ａは、発現およびレポーターベクター構築物を示す。図６Ｂは、相対的ＣＡＴ活性を示す。図７Ａ〜７Ｃは、ｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９およびｙＵＢＣ−９／Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質の転写リプレッサー活性を示す。図７Ａは、発現およびレポーターベクター構築物を示す。図７Ｂは、ｈＵＢＣ−９／Ｇａｌ４融合タンパク質に対する相対的ＣＡＴ活性を示す。図７Ｃは、ｙＵＢＣ−９／Ｇａｌ４およびｙＵＢＣ−９−ｍ／Ｇａｌ４融合タンパク質に対する相対的ＣＡＴ活性を示す。図８は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、転写因子ＩＩＢ（ＴＦＩＩＢ）およびウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子産物ＷＴ１に対するＧＳＴ／ｈＵＢＣ −９捕捉アッセイの結果を示す。図９Ａおよび９Ｂは、野生型ｈＴＢＰおよび数種の突然変異ＴＡＴＡ結合タンパク質ｍＴＢＰのＧＳＴ／ｈＵＢＣ−９捕捉アッセイに関する。図９Ａの図式的表現において、野生型ｈＴＢＰの黒塗りの部分は、種間で高度に保存された領域を表す。突然変異ＴＢＰの黒塗りの部分は、ＴＢＰ欠失部分を表す。語句“ｄｌｘ−ｙ”は、ｍＴＢＰにおいて、残基ｘ〜ｙが欠失していることを意味する。図９Ｂは、種々のＧＳＴ／ｈＵＢＣ−９捕捉アッセイから得られるブロットを示す。図１０Ａ〜１０Ｄは、ＷＴ１が単独で発現する場合（図１０Ａ）、ＷＴ１がｈＵＢＣ−９と同時発現する場合(図１０Ｂ)、ＷＴ１が、タンパク質分解的分解システムの公知のインヒビターであるラクトシステインの存在下で発現する場合（図１０Ｃ）、およびＷＴ１が、ｈＵＢＣ−９のＣ⁹³Ｓ変異体であるｍＵＢＣ−９と同時発現する場合(図１０Ｄ)に行ったＷＴ１の代謝回転実験の結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ｈＵＢＣ−９とＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の相互作用を示す、ゲル移動度シフトアッセイに関する。図１１Ａは、ｈＵＢＣ −９および（ａ）ＴＢＰの存在なし（カラムＡ１〜Ａ３）；（ｂ）ＴＢＰの存在あり、ＴＦＩＩＢの存在なし（カラムＢ１〜Ｂ３）；および（ｃ）ＴＢＰとＴＦＩＩＢの両方の存在あり（カラムＣ１〜Ｃ３）のいずれかの条件でＴＡＴＡボックスを含む末端標識ＤＮＡプローブを用いるアッセイの結果を示す。図１１Ｂは、種々の量のｈＵＢＣ−９の存在下にＴＢＰが存在する場合の同様のアッセイの結果を示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、５ｘＵＡＳｐＳＶＣＡＴレポーターベクターを用いる移行同時トランスフェクトアッセイの結果をを示す。図１２Ａは、ＧＡＬ４／ｈＵＢＣ−９融合タンパク質（ｐＳＧｈＵＢＣ−９）（０または１０μｇ）、ＴＢＰ（０、０.５または２.５μｇ）および／またはＴＦＩＩＢ（５μｇ）を種々の組み合わせで２９３細胞内で同時発現させた場合のアッセイにおける該レポーターベクターの発現の相対的濃度を示す。図１２Ｂは、突然変異ＴＢＰであるＴＢＰΔ１−１３８（０、２.５または５μｇ）およびｈＵＢＣ−９／Ｇａｌ４融合タンパク質（０、１０μｇ）を種々の組み合わせで同時発現させた場合のアッセイにおける該レポーターベクターの発現の相対的濃度を示す。図１３は、５ｘＵＡＳｐＳＶＣＡＴレポーターベクターを用い、ＴＢＰΔ１ −１３８（０、２.５または５μｇ）をＷＴ１（１０μｇ）と種々の組み合わせで同時発現させた場合の移行同時トランスフェクトアッセイの結果を示す。詳細な記載本明細書中で用いるアミノ酸に対する種々の記号を下記表１に記載する。表１：アミノ酸の略語ＡＡｌａアラニンＢＡｓｘアスパラギンまたはアスパラギン酸ＣＣｙｓシステインＤＡｓｐアスパラギン酸ＥＧｌｕグルタミン酸ＦＰｈｅフェニルアラニンＧＧｌｙグリシンＨＨｉｓヒスチジンＩＩｌｅイソロイシンＫＬｙｓリシンＬＬｅｕロイシンＭＭｅｔメチオニンＮＡｓｎアスパラギンＰＰｒｏプロリンＱＧｌｎグルタミンＲＡｒｇアルギニンＳＳｅｒセリンＴＴｈｒトレオニンＶＶａｌバリンＷＴｒｐトリプシンＹＴｙｒチロシンＺＧｌｘグルタミンまたはグルタミン酸本明細書で用いる“実質的に精製した”タンパク質とは、該タンパク質が、通常それに会合している大部分の宿主細胞タンパク質から分離されること、または該タンパク質が実質的に精製された形態で合成されることを意味し、このような合成は、いずれかの適当な遺伝子療法デリバリー手段によって宿主細胞へ内在的に導入された核酸ポリマーから、該細胞内でタンパク質を発現することである。 “実質的に単離された”核酸ポリマーとは、対象の核酸ポリマーを含む混合物が、通常それに会合している他の核酸ポリマーの大部分を実質的に含まないことを意味する。“核酸ポリマー”には、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、などのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類縁体が包含される。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよｍＤＮＡは、典型的な核酸ポリマーである。“転写を調節する”とは、転写の増強および／または抑制を意味する。“遺伝子”は、内在性および異種遺伝子の両方、特に、天然の細胞内の標的タンパク質をコードするゲノムＤＮＡおよび標的タンパク質をコードするｃＤＮＡの両方を意味する（ここで、ｃＤＮＡは、細胞に導入されたプラスミドベクターまたはウイルスといったような核酸構築物の一部である）。本明細書の参考文献の内容は、言及することによってここに完全に包含される。本発明は、機能的結合活性を有することに加えて、独立した転写リプレッサー活性を有する、ｈＵＢＣ−９と称する、新たに発見されたヒトユビキチン結合酵素関する。結合活性とリプレッサー活性の両方が、転写に影響を及ぼすことがわかっている。ｈＵＢＣ−９の結合活性は、ＷＴ１などの転写サプレッサータンパク質、あるいはｈＵＢＣ−９それ自体の分解によって転写を増強する。ｈＵＢＣ −９のリプレッサー性は、その結合活性とは独立して転写を抑制する。たとえば、ｈＵＢＣ−９は、遺伝子転写のリプレッサーとしてのＷＴ１の機能を著しく増強する。該酵素はまた、ＷＴ１とは独立して作用し、特に、Ｇａｌ４といったようなＤＮＡ結合ドメインをもつタンパク質に融合した場合に、遺伝子転写を抑圧する。特定の理論に結び付いているわけではないが、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）のＤＮＡ結合領域との特定の相互作用を介して転写開始複合体を崩壊させることによって、ＵＢＣ−９は強力なリプレッサーとして作用する。このような相互作用は、濃度依存性であり、この作用の結果としてＴＢＰ／ＤＮＡ相互作用が不安定化され、ＴＦＩＩＢ／ＴＢＰ転写開始複合体の形成が妨害される。さらに、ｈＵＢＣ−９は、ＷＴ１といったような他のリプレッサー効果を有するタンパク質とともに作動することができ、結果として、ＷＴ１単独またはｈＵＢＣ−９単独のリプレッサー効果と比べて増強された、組み合わせリプレッサー効果が得られる。したがって、ｈＵＢＣ−９と他のリプレッサータンパク質の会合は、ＷＴ１との関係のようにタンパク質−タンパク質相互作用を介するものであるか、またはｈＵＢＣ−９およびＧａｌ４、ＬｅｘＡ、シンクフィンガーなどのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質として、ｈＵＢＣ−９をプロモーターの近接に位置させることによるかのいずれかである。ｈＵＢＣ−９に融合しているＤＮＡ結合タンパク質またはｈＵＢＣ−９と特異的に相互作用しているリプレッサータンパク質は、ｈＵＢＣ−９がＴＢＰと相互作用し、それによって転写開始を減少しうるように、プロモーターＮＡに関して適当な部位にｈＵＢＣ−９位置させるようにみえる。さらに、組み合わせたＷＴ１／ｈＵＢＣ−９システムにおいて、ｈＵＢＣ−９の結合活性は、該システムに存在するＷＴ１の濃度を調節することによって、ｈＵＢＣ−９のリプレッサー活性とともに作動するようにみえる。このようなＷＴ１濃度の調節は、そのユビキチン結合活性および関連するユビキチン依存性タンパク質分解経路を通して遂行される。さらに、ｈＵＢＣ−９のユビキチン結合活性およびリプレッサー活性は、同時に作用することができ、ｈＵＢＣ−９はＷＴ１（その結合活性による）およびＴＢＰ（そのリプレッサー活性による）と同時に相互作用する。ｈＵＢＣ−９はまた、同様の仕方でｐ５３およびＲｂといったような他のリプレッサーと相互作用することもできる。有利なことには、ＵＢＣ−９の結合活性の阻害により、転写開始の著しい減少という結果が得られる。さらに、酵母などの他の真核細胞の相同なユビキチン結合酵素（ｙＵＢＣ−９）は、ｈＵＢＣ−９のような、転写抑制およびユビキチン結合といったような、同様の２機能性活性を呈する。アミノ酸配列および機能の両方において、ＵＢＣ −９の性質が種間で高度に保存されていることは、このタンパク質ファミリーの普遍的な役割を示唆する。したがって、本発明の多くの態様は、ｈＵＢＣ−９に対して構造的に相同であり、機能的に等価なタンパク質ファミリーに関するものであり、このファミリーを集合的にＵＢＣ−９と称する。ＵＢＣ−９には、ここに同定されているタンパク質または将来発見されるタンパク質のいずれもが包含される。個々の種のタンパク質に対し、本発明では、ヒトについてはｈＵＢＣ− ９であり酵母についてはｙＵＢＣ−９と呼ぶ。さらに、ＵＢＣ−９酵素以外の他のユビキチン結合酵素であって、結合活性に加えて転写リプレッサー活性をもつならば、このようなユビキチン結合酵素は本発明の多くの態様に含まれる。ｈＵＢＣ−９タンパク質およびそれをコードする核酸ポリマー、ＵＢＣ−９酵素などのユビキチン結合酵素の転写リプレッサー活性、および他の転写リプレッサータンパク質、特にＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質、さらに詳しくはＷＴ１などの腫瘍サプレッサータンパク質、ヒトに関する医薬的適用および非医薬的使用などの可能な幾つかの実際の適用などが本発明の幾つかの態様に含まれる。ｈＵＢＣ−９酵母の２つのハイブリッドシステムを用いて、本発明のヒトユビキチン結合（ＵＢＣ）酵素をコードするクローンを同定した（実施例１）。図１Ａは、２つの別にスプライスされたｍＲＮＡから作られた、配列番号１および２と呼ぶヌクレオチドである、２つの独立したｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列を示す。ｃＤＮＡクローンは両方ともｈＵＢＣ−９をコードする。これらのｃＤＮＡクローンの転写および翻訳から得られるアミノ酸産物は、ＳＤＳ−含有ポリアクリルアミドゲルにおいて１７キロダルトンのタンパク質として独立して移動した。ｈＵＢＣ−９は、図１Ｂに示すアミノ酸配列を有する。ジーンバンクのデータとの比較に基づいて、ｈＵＢＣ−９は、ユビキチンタンパク質分解経路における中間体である、酵母ユビキチン結合酵素−９、すなわちｙＵＢＣ−９またはＥ２の活性ヒト（ｈ）相同体である。ヒトＵＢＣ−９の配列は、分離した領域での同一の９個のアミノ酸配列を含めて、ｙＵＢＣ−９と５６％のアミノ酸同一性を有する。ｈＵＢＣ−９の１５８個のアミノ酸配列もまた、酵母ＵＢＣ−９の活性部位システインと正確なアラインメントにあるシステイン残基を含む（図１Ｂのボックス）。ヒトＵＢＣは、心臓、脳、胎盤、肺、平滑筋、腎臓および膵臓組織といった試験したすべてのヒトの組織において発現した（実施例２）。しかし、図２Ａに示したノーザンブロット実験の結果からわかるように、発現濃度は、異なる組織では変化した。異なる組織におけるｈＵＢＣ−９のノーザンブロットにおいて、通常、強いハイブリッドシグナルが２．８ｋｂと１．３ｋｂにおいて見られた。しかし、心臓と平滑筋では、分析した他の組織と比べて、転写物が有意に高い濃度で発現しており、腎臓では２．８ｋｂのｍＲＮＡイソ体が相対的に少なく発現しているようにみえる。ヒトゲノムＤＮＡを異なる制限酵素で消化し、ｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡの１．１ｋｂのフラグメントでプローブするサザンブロット実験からわかるように、ｈＵＢＣ−９は単一の遺伝子によってコードされる（実施例３）。PstIおよびBamＨＩの消化において単一のハイブリッド形成シグナルが見られた（図２Ｂ）が、このことは、ヒトＵＢＣ遺伝子がヒトゲノムにおいて単一コピー遺伝子として存在することを示唆している。ｈＵＢＣ−９は、ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子産物ＷＴ１との会合によってさらに特徴づけられる。ヒトＵＢＣは、インビボおよびインビトロの両方においてＷＴ１に結合する。ｈＵＢＣ−９とＷＴ１のタンパク質−タンパク質相互作用は、実施例１の表２に示すように、高濃度のβ−ガラクトシダーゼ活性により、酵母の２つのハイブリッドシステムにおいて最初に明らかになった。さらに実験を行って、酵母に観察されるＷＴ１−ヒトＵＢＣタンパク質相互作用を確認した。ヒトＵＢＣは、大腸菌においてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴ−ヒトＵＢＣ）として発現し、グルタチオンマトリックスにカップリングした（実験例４）。図３Ａに示されるように、ＷＴ１発現プラスミドでトランスフェクトした２９３細胞からの抽出物をＧＳＴ−ヒトＵＢＣグルタチオンマトリックスとともにインキュベートし、抗ＷＴ１抗体でプローブしたウエスタンブロットによって溶離液を分析すると、ＧＳＴマトリックス単独では複合体を形成しないが、ＧＳＴ−ヒトＵＢＣマトリックスでは、ＷＴ１と複合体を形成することが明らかになった。他の実験では、ＷＴ１およびヘマグルチニン（ＨＡ）標識ヒトＵＢＣ（ＨＡ−ヒトＵＢＣ）発現ベクターでトランスフェクトした２９３細胞の抽出物を、抗ＷＴ１抗体とともに免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体をウエスタンブロットにて分析した（実施例５）。図３Ｂに示されるように、ヒトＵＢＣおよびＷＴ１発現ベクターの両方で共トランスフェクトした２９３細胞からはＨＡ標識ヒトＵＢＣがＷＴ１免疫複合体として同定されたが、ヒトＵＢＣ単独でトランスフェクトした２９３細胞からは、同定されなかった。ＧＳＴ捕捉アッセイから実証されるように、ｈＵＢＣ−９は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）とも直接的に相互作用する。全長アミノ酸配列を有するＧＳＴ融合タンパク質は、ＴＦＩＩＢよりもＴＢＰとＷＴ１を選択的に捕捉した（図８）。さらに行ったアッセイから、ｈＵＢＣ−９が、ＴＢＰの高度に保存されたＣ末端ドメインを介してＴＢＰと相互作用することが実証された。ｈＴＢＰの幾つかの突然変異体を構築した（図９Ａ）。ＧＳＴ捕捉アッセイでは、ＧＳＴ／ｈＵＢＣ−９は、野生型ＴＢＰならびに数種の突然変異体ＴＢＰを捕捉した；しかし、ＴＢＰのＣ末端領域が欠失（アミノ酸残基１９６〜３３５）すると、捕捉効率が有意に減少し、そのさらに大きい部分が欠失（アミノ酸残基１６３〜３３５）すると、該アッセイで検出しうる相互作用は起こらなかった（図９Ｂ）。したがって、ｈＵＢＣ−９は、ＴＡＴＡ結合タンパク質の１６３〜３３５アミノ酸を包含するＣ末端ドメインと相互作用する。後述するゲル移動度シフトアッセイにより、ＴＢＰとｈＵＢＣ−９間の相互作用の特異性をさらに確認した。ｈＵＢＣ−９酵素は活性な結合活性をもつｈＵＢＣ−９は、活性なユビキチン結合酵素であり、それ自体、ユビキチネーティング酵素ファミリーのメンバーである。哺乳類ユビキチン結合酵素の正確なアミノ酸配列中に幾つかのバリエーションが存在すると信じられているが、９３位置（図１Ｂ、ボックス）にある活性システイン残基は、これまでに発見されたすべてのユビキチン結合酵素に特徴的であり、ユビキチン結合活性にとって活性部位システインの存在が重要であることが決定されている。このシステインがチオエステル形成に関与する能力をもつ酵素を提供すると考えられる。したがって、酵母ＵＢＣ−９と５６％の配列同一性をもち、同じ活性システイン部位をもつ、ヒトＵＢＣ−９は、タンパク質分解的プロテオサム経路の不可欠なパートを構成する。ｈＵＢＣ−９の保存されたシステイン残基がモノユビキチンチオエステル形成に関係することを実証するために、タンパク質のユビキチネーションに必要な３つのカップリングした酵素［Ｅ₁Ｅ₂Ｅ₃］を含む、ウサギ網状赤血球系において、ヒトＵＢＣｃＤＮＡインビトロ転写／翻訳を使用した。生成物を１Ｍの中性ヒドロキシルアミンで試験すると、ヒトＵＢＣがヒドロキシルアミンによって加水分解されるチオエステルを含むことを示唆する、遅く移動するタンパク質バンドが検出された。他の実験では、抗ユビキチン抗体が、ウエスタンブロットにおいてヒドロキシルアミンに感受性をもつ遅く移動するバンドを認識した。さらに行った実験では、我々は、ｙＵＢＣ−９の温度感受性突然変異体を用いて酵母内で全長ｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡを発現させた（実施例６）。図４Ａおよび４Ｂに示すように、成長が、制限温度以外では温度感受性(ts)ｙＵＢＣ−９酵母に完全に復帰した。これらの実験の結果を、独立的および累計的に考慮することにより、ｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡが活性なユビキチン結合酵素をコードするという説が確立される。ｈＵＢＣ−９の結合活性は転写を調節する本発明のヒトユビキチン結合タンパク質は、細胞周期およびＤＮＡ複製を調節する機能をもつ酵素のファミリーのメンバーである。さらに、ユビキチン依存性プロテアーゼ分解システムが、転写調節に直接関与していることが、いまや決定されている。ｈＵＢＣ−９の結合活性は、ＷＴ１といったようなリプレッサータンパク質の分解にかかわることによって遺伝子転写を調節すると考えられる。ＷＴ１は、タンパク質分解経路を移行するのに必要な酵素を含むウサギ網状赤血球溶解液中で発現する場合、ユビキチンプロテオサムタンパク質分解経路によって急速に分解した。コントロール実験では、ＷＴ１のｃＤＮＡを、タンパク質のユビキチネーションおよび分解に必要なＥ₁Ｅ₂およびＥ₃酵素、ユビキチンおよび２６Ｓプロテオサム複合体を含むウサギ網状赤血球溶解液に加えた。ＳＤＳゲル分析においてＷＴ１と同様に移動する別のバンドが観察された。ＷＴ１とｈＵＢＣ−９の両方のｃＤＮＡをウサギ網状赤血球系に加える実験では、ひとつのタンパク質バンドの強度が、コントロール実験で観察されるバンドと比べて非常に減少した。さらに、比較的低分子量の免疫応答種が発見され、モノユビキチンＷＴ１に一致して移動する単一の比較的高いみかけの分子量の種が観察された。これらの結果から、ｈＵＢＣ−９とＷＴ１相互作用がさらに確認され、重要なことには、ＷＴ１がｈＵＢＣ−９依存的に分解されることが実証される。２６Ｓプロテオサム複合体と会合しているプロテアーゼ活性の特異的インヒビターである、ラクトシステインによるタンパク質分解経路の阻害によって、結合活性の効果も実証され、このような阻害によってＷＴ１の半減期が増加する。ＷＴ１を（ａ）２９３細胞単独で発現させる；（ｂ）ｈＵＢＣ−９と同時発現させる；（ｃ）タンパク質分解的分解系の公知のインヒビターであるラクトシステインの存在下に発現させる；または（ｄ）ｍＵＢＣ−９（ｈＵＢＣ−９のＣ⁹³変異体）と同時発現させる、という一連の実験において、ＷＴ１の代謝回転を試験した。それぞれのケースにおいて、タンパク質合成インヒビターであるシクロヘキシルアミンで処理した。異なる時点で採取した細胞を溶解し、抗ＷＴ１抗体を用い、ウエスタンブロットにて分析した。コントロール実験では（ＷＴ１単独）、シクロヘキシルアミンの添加によりＷＴ１の定常状態のレベルが劇的に減少し、ＷＴ１の半減期が約１.５時間であることが測定された（図１０Ａ）。ｈＵＢＣ −９を同時発現した場合は、ＷＴ１の半減期は減少した（図１０Ｂ）。しかし、ラクトシステインで共処理した細胞は、ファクター約５にＷＴ１の定常状態のレベルが上昇した。さらに、ＷＴ１を、活性部位システインがセリンで置換されているためにユビキチン結合活性をもたない変異体ｈＵＢＣ−９と同時発現させた場合に、多くのＷＴ１において同様の増加が観察された（図１０Ｄ）。ＷＴ１依存性転写抑制は、プロテオサム分解系によって影響を受ける。レポータープラスミドで同時トランスフェクトされている２９３細胞内でＷＴ１を発現させ、ラクトシステイン（５０μＭ）とともに培養した場合、２倍から３倍のリプレッサー活性の増加が観察された。さらに、ＷＴ１の発現のレベルが増加するので、ラクトシステインの増加効果は累進的に減少した。ラクトシステインはＷＴ１の上限レベルでは効果はなかった。結合活性を除去することによって、ｈＵＢＣ−９の結合活性およびその抑制効果を独立的に実証する。後記同時トランスフェクション実験では、活性システイン部位でｙＵＢＣ−９を変異体化することによってユビキチン結合活性を除去することにより、活性部位システインを有するｙＵＢＣ −９よりも大きな抑制活性が得られることが示される（実施例９）。これらの実験を独立的および累計的に考慮することにより、ｈＵＢＣ−９が、ＷＴ１（あるいは他のサプレッサータンパク質）に特異的な結合活性を有することが実証される。ｈＵＢＣ−９の結合活性は、ＷＴ１といったようなリプレッサーの分解、あるいはｈＵＢＣ−９それ自体の分解を介して、転写に正の影響を及ぼす。ＵＢＣ'は転写を抑圧するリプレッサー活性を有するｈＵＢＣ−９およびｙＵＢＣ−９などのユビキチン接合酵素は転写抑制活性を有する。ｈＵＢＣ−９の抑制活性は、ＷＴ１およびおそらく他のリプレッサー遺伝子産物のリプレッサー活性を増強する。さらに、ヒトおよび酵母ＵＢＣ'sそれ自体による遺伝子転写の抑圧は、これらの酵素がGal４またはＷＴ１などのＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を介して融合または会合する（associate）場合には重要である。ｈＵＢＣ−９酵素の抑制活性は著しくウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子（Wi lm's tumor supressor gene）産物、ＷＴ１のリプレッサー活性を増強する。ヒトＵＢＣのＷＴ１転写制御活性を調節する能力は同時トランスフェクション（co transfection）実験において分析した（実施例７）。図５Ａに示すように、ヒトＵＢＣが１５μｇのみで、ＷＴ１の添加もなくまたＤＮＡ結合ドメインに融合されることなく発現する場合、該ポーター遺伝子の発現は２倍よりわずかに多く減少する（４２％の相対活性）。ＷＴ１が単独で１０μｇで発現する場合、該リポーター遺伝子の発現を１０のうちの１要素程度で減少させた（８％の相対活性）。しかしながら、ヒトＵＢＣがＷＴ１と共に発現させた場合、ＷＴ１のリプレッサー活性はさらに４倍の要因によって増加させられ、その結果総転写抑制は、約５０倍となる（２％の相対活性）。さらなる実験で、本質的に同一の結果を得た（図５Ｂ）。ヒトＵＢＣは、両者が共に高レベルで発現する場合には、イン・ビボでＷＴ１のリプレッサー活性を増強する。さらに、hＵＢＣ−９は、適当なプロモーター要素によって認識された機能的なＤＮＡ結合ドメインに結合する場合、潜在的な転写リプレッサーである。ヒトＵＢＣはGal４ＤＮＡ結合ドメインに結合し、同時トランスフェクション実験においては５つの上流Gal１４ＤＮＡ結合配列（５×ＵＡＳ欠如）を含むプロモーターで試験する（実施例８）。図６Ｂに示すように、ヒトＵＢＣが結合できないコントロールプロモーター（５×ＵＡＳ）リポータープラスミドと試験される場合、ヒトＵＢＣの影響は最少となる（６６％相対活性）。しかしながら、ヒトＵＢＣはGal４結合ドメインを介してGal４ＤＮＡ結合配列を含むプロモーター／リポーター構築物に直接結合することができた場合に強力な転写リプレッサーとなる。この場合、約８倍（１２％相対活性）のヒトＵＢＣ抑制プロモーター活性は、それが適当なプロモーター要素に結合する場合、ヒトＵＢＣは単独で有効なリプレッサーであることが確立される。上記の実験が反復される場合（実施例９）、ｈ−ＵＢＣ−９／Gal４融合タンパク質は図７Ｂに示すように再度有意な抑制活性（１５％の相対活性）を示した。これらの結果はヒトＵＢＣが転写リプレッサー活性を有するという結諭を強く支持する。hＵＢＣのリプレッサー活性はhＵＢＣがプロモーター領域の近辺に位置している場合、ＷＴ１などの他のタンパク質とタンパク質−タンパク質結合することによってか、またはGal４などのＤＮＡ結合ドメインとの融合によって（両者は共にヒトＵＢＣを遺伝子特異的プロモーター部位に結合させる）、特に重要である。 yＵＢＣ−９などの他のユビキチン接合酵素もまたＤＮＡ結合ドメインに融合する場合、転写リプレッサーとして有効に機能する。酵母ＵＢＣ−９はGal４ＤＮＡ結合ドメインに結合し、ついで５つの上流のGal４ＤＮＡ結合配列を有するリポーターベクターとともに同時発現した（実施例９）。図７Ｃに示すように、単独で２０μｇによって同時発現した場合、ｙＵＢＣ−９／Gal１４融合タンパク質は約３倍（０.３５相対活性）で転写を抑制した。ＵＢＣ'sの転写抑制活性はその接合活性から独立している上記のように、ＵＢＣ'sはユビキチン接合活性に加えて、転写抑制活性を有する。ユビキチン接合活性を欠如しているyＵＢＣ−９Ｃ⁹³Ｓ変異であるyＵＢＣ− ９−mはＤＮＡ結合ドメインに融合させられた場合、転写リプレッサーとして有効に機能することを示したデータによって証明されているように、抑制活性は接合活性から独立している。簡単には、第９３位の活性部位システインを欠如しているyＵＢＣ−９の変異形態はGal４ＤＮＡ結合ドメインに結合し、５つの上流の Gal４ＤＮＡ結合配列を有するリポーターべクターと同時発現している（実施例９）。図７Ｃに示すように、２０μｇ単独で同時発現した場合、yＵＢＣ−９−m ／Ga４融合タンパク質は約５倍（２０％相対活性）で転写を抑制した。さらに、ＵＢＣの抑制活性の独立性はyＵＢＣ−９よりyＵＢＣ−９−m変異体の転写抑制が高程度であることを示すデータによって支持されている。図７Ｃを参照すると、ｙＵＢＣ−９の単独発現は３５％の相対活性を示すのに、yＵＢＣ −９−m単独発現は２０％の相対活性を示す・・・抑制活性における増加は１５％である。矛盾せず一致して、正常yＵＢＣ−９および変異体yＵＢＣ−９−mの両者が同量(１０μｇ)にてリポーターベクターと共に同時発現する場合、転写抑制の程度は正常または変異体株単独の値の間の中間値(２８％相対活性)であった。理論的には結合されないが、活性部位システインを欠如しているyＵＢＣ−９ −mはリプレッサーとして活性であり、さらに活性部位システインを有する正常y ＵＢＣ−９より一層活性があるので、ユビキチン接合酵素は転写抑制活性に必要ではないようである。それにもかかわらず、上記で諭じたように、ＵＢＣ−９の接合活性はリプレッサー活性のレベルに影響を及ぼし、制御するようである。ｈＵＢＣ−９の接合活性はＷＴ１のタンパク質加水分解およびそれにより、少なくとも部分的にはＷＴ１のリプレッサー効果を除去する。ｈＵＢＣ−９はＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）との相互作用によるリプレッサーとして機能する。記載のように、ｈＵＢＣ−９はＧＳＴ捕捉アッセイ（ＧＳＴ capture assay) においてＴＡＴＡ結合タンパク質のＣ−末端として相互作用する。ゲル移動度シフトアッセイはこの相互作用を確認し、さらに、ｈＵＢＣ−９はＴＢＰのＤＮＡへの結合を解くことによりまたは転写開始複合体の形成を解くことによって転写を抑圧するようであることをさらに示した。このモデルは、hＵＢＣ−９が相互作用するように示されるＴＢＰのＣ末端がＤＮＡの主要なくぼみ（groove）と接触する「面（face）」を含むという理解に一致する。行われるアッセイにおいて、ＴＡＴＡボックスを含むエンドラベリングしたＤＮＡプローブをＴＢＰ、ＴＦＩＩＢおよびｈＵＢＣ−９の多様な組合せにより複合体を形成する機会を提供する。ＴＢＰ不在のコントロール実験において、検出可能な複合体はｈＵＢＣ−９とＤＮＡプローブ間、ＴＦＩＩＢとプローブ間またはｈＵＢＣ−９、ＴＦIIＢおよび該プローブ間には形成されなかった（それぞれ図１１Ａ、カラムＡ１、Ａ２およびＡ３）。さらなるコントロール実験において、精製したＴＢＰとＴＡＴＡボックスを含むＤＮＡプローブの組合せは、単一の容易に検出可能な複合体となる（図１１Ａ、カラムＣ１）。ＴＦＩＩＢのＴＡＴＡ配列への結合を増強すると報告された能力に基づき期待されたように、ＴＦＩＩＢの付加はバンドの強度を増強した（図１１Ａ、カラムＣ１）。しかしながら、上記のアッセイが該系において精製したｈＵＢＣ−９（１０ｎｇ、５０ｎｇ）を用いて反復される場合、ｈＵＢＣ−９はＴＢＰとＤＮＡ間の複合体の形成能力のレベルを低減させ（図１１Ａ、カラムＢ２およびＢ３）、ついで続く実験においてはＴＦＩＩＢの存在下でＴＢＰとＤＮＡ間の該レベルを低減させた（図１１Ａ、カラムＣ２およびＣ３）。従って、ｈＵＢＣ−９はＴＢＰ／ＤＮＡ結合を脱安定化させる。ＴＢＰのＤＮＡ結合能力へのｈＵＢＣ−９の効果は濃度依存的である（図１１Ｂ）。ｈＵＢＣ−９はＴＢＰＤＮＡ結合ドメインの該領域において相互作用するということをさらに確認するため、外在性ＴＢＰの高レベルがｈＵＢＣ−９のリプレッサー活性を克服することを示した同時トランスフェクションアッセイを行った。ＧＡＬ４／ｈＵＢＣ−９融合タンパク質（ｐＳＧｈＵＢＣ−９）（０または１０μｇ）、ＴＢＰ（０、０.５または２.５μｇ）および／またはＴＦＩＩＢ（５μｇ）が多様な組合せにおいて２９３細胞中で同時発現する一時的なアッセイにおいて５×ＵＡＳｐＳＶＣＡＴリポーターベクターを使用した。ｈＵＢＣ− ９のリプレッサー活性はＴＢＰの存在下（ＴＦＩＩＢの不在下）で濃度依存的な方法において有意に減少した（図１２Ａ、カラムＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。該アッセイにおけるＴＦＩＩＢの存在はｈＵＢＣ−９の抑制に全く影響を及ぼさなかった（図１２Ａ、カラムＥおよびＦ）。さらなる実験は、ｈＵＢＣ−９のリプレッサー活性における観察された減少が実際、ＴＢＰの発現のための転写の本質的な活性化に関係しないことを確実にするために行った。変異体ＴＢＰは、ＧＳＴ捕捉アッセイでｈＵＢＣ−９と相互作用するＴＢＰドメインを含むアミノ酸配列を含まないもので構築されるが、アミノ酸残基１−１３８は含まなかった。変異体ＴＰＢ（０、０.５または２.５μｇ）は、本明細書ではＴＢＰΔ１−１３８と称され、ついでｈＵＢＣ−９／Gal４融合タンパク質（０、１０μｇ）は、直前に記したのと同様の一時的な同時トランスフェクションアッセイにおける多様な組合せにおいて同時発現する。ＴＢＰΔ１−１３８は実質的にプロモーターを活性化する能力を持たないが、ｈＵＢＣ−９のリプレッサー活性を野生型ＴＢＰよりも少ない程度ではあるが、有効に除去する（図１２Ｂ）。従って、ｈＵＢＣ−９は転写を抑制するＴＢＰと相互作用することを示している。さらに、ＴＢＰの付加は有効にｈＵＢＣ−９を滴定し、そのリプレッサー活性を和らげ、ついで事実上転写を増強する。類似の同時トランスフェクションアッセイにおいて、変異体ＴＢＰ、ＴＢＰΔ １−１３８は有効にＷＴ１のリプレッサー活性を除去する（図１３）。累積的に、これらの結果はＷＴ１が、ＴＦＩＩＤ転写因子のＴＢＰサブユニットと相互作用する直接のｈＵＢＣ−９のためのタンパク質−タンパク質相互作用をの通してｈＵＢＣ−９を位置づけることによってｈＵＢＣ−９との組合せにおいての抑制に影響し、それによってＴＢＰ／ＴＡＴＡ配列相互作用を脱安定化され、さらに一般的には転写開始複合体の形成を崩壊することになる。ｈＵＢＣ−９の産生哺乳動物または酵母または他のＵＢＣ酵素またはその活性のある一部をコードするヌクレオチド配列は公知の手段を用いて発現ベクターにクロ−ニングされる。簡単には、ベクター中の特異的なヌクレオチド配列をNcoＩおよびHindIIIなどの部位特異的制限酵素によって切断する。ついで、該ベクターを時にアルカリホスファターゼ処理した後、該ベクターおよび関心のあるヌクレオチド配列を含む標的断片を所望のコントロール配列および発現配列の近辺の標的コドンの挿入の結果とともにライゲーションする。特に使用したベクターは遺伝子発現における使用のために選択された宿主細胞の型に一部は依存している。典型的には、宿主変換可能なプラスミドはアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性などのマーカーの遺伝子を含み、また適当なプロモーターおよびターミネーター配列を含む。本発明の組換えＤＮＡ発現配列がライゲーションされる好ましいプラスミドはプラスミドｐＥＴである。ヒトＵＢＣ−９を産生するｐＥＴプラスミドはジーン・バンク（Gene Bank）、受託番号第μ６６８１８号およびμ６６８６７号に寄託されている。本発明のＵＢＣ酵素のＤＮＡ発現配列を含むプラスミドは、宿主細胞においてー発現した本発明の酵素の配列の存在を示唆している。細菌、例えば、大腸菌および酵母、および例えばベイカー酵母は、一層複雑な細胞を用いる技術が公知であるが、哺乳類ＵＢＣ酵素の発現のための宿主細胞として非常に頻繁に使用された。例えば、デピッカー（Depicker，Ａ.）ら、１９８２に記載された植物細胞を用いる方法を参照。大腸菌宿主株Ｘ７０２９は野生型Ｆであり、lacオペロンをカバーするＸ７４欠失を有するが、該株は本発明の好ましい態様において利用されている。宿主細胞は、特定の宿主細胞に特異的に設定されたプロトコールを用いて形質転換される。大腸菌に関しては、カルシウム処理が形質転換を生み出す（コーエン（Cohen，Ｓ.Ｎ.、１９７２）。別法および一層有効である無塩大腸菌のエレクトロポレーションがドゥーワー（Dower）ら、１９８８により行われた。形質転換後、形質転換された宿主が、アンピシリン耐性などの発現ベクターから得られた特徴に基づく他の細菌から選択され、ついで細菌の形質転換されたコロニーはさらにイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘発耐熱性大腸菌ポリメラーゼ活性の高レベルを産む能力をスクリーニングする。形質転換された大腸菌コロニーは大量に増殖し、ついで哺乳類ＵＢＣ酵素の発現は単離および精製のた誘発される。実施例４はＧＳＴ−融合タンパク質として細菌中のヒトＵＢＣの発現を詳細に示す。実施例６は酵母における温度感作酵母ＵＢＣ株の発現を詳細に示す。多様な精製技術が知られているが、すべては大腸菌細胞の崩壊工程、本来のタンパク質の不活性化および除去および核酸の沈殿にかかわる。該酵素は重量（遠心）、大きさ（投石、ゲル濾過クロマトグラフィー）、または帯電（イオン交換クロマトグラフィー）の利点を用いることにより分離される。一般的にこれらの技術の組合せは精製工程において共に使用される。哺乳類ＵＢＣ酵素を精製するための好ましい工程において、大腸菌細胞をリソチームを用いて弱化し、ついで細胞を溶解し、ついでほとんどそのままのタンパク質を、その細胞懸濁液を８０ ℃まで急速に加熱することによって変性させ、ついで８０−８１℃で２０分間インキュベートする。ついでその懸濁液を冷却し、遠心して変性タンパク質を沈殿させる。その上清（哺乳動物ＵＢＣ酵素を含む）を高塩ポリエチレン−イミン処理をして核酸を沈殿させる。抽出物の遠心により核酸を除去し、ついで哺乳動物ＵＢＣ酵素をクロマトグラフィー前に、好ましくはヘパリンアガロースカラム上で硫安沈殿を用いて結合させる。好ましくは、精製した酵素は調製タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）である。さらに好ましくは、該タンパク質は均一調製物として提供される。組成物本明細書に開示されるユビキチン接合酵素は、転写抑制活性（例えばｈＵＢＣ −９、ｙＵＢＣ−９およびｙ−ＵＢＣ９−ｍ）を有し、該酵素ならびに他のユビキチン接合酵素またはそのセグメントを有用な組成物を形成する許容し得る担体、希釈剤または運搬剤と組み合わせる。その組成物は製薬学的に（すなわちヒト）および製薬学的に指示書をかわす。いずれの場合も、該組成物中において使用されたタンパク質は転写リプレッサー活性を有する。該タンパク質のアミノ酸配列は転写抑制活性を有するＵＢＣ−９などのユビキチン接合タンパク質の少なくとも１２アミノ酸部位を含む。該タンパク質のアミノ酸配列は好ましくはｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９の少なくともセグメントを含む。ｈＵＢＣ−９のｃｙｓ⁹³変異体など、それによりユビキチン接合酵素活性を欠如している変異体またはそのセグメントはまた、該タンパク質として使用することもできる。セリン残基がシステイン残基を置換する変異体が好ましい。該組成物からユビキチン接合活性を除去するための別法において、該組成物はさらにユビキチン接合酵素の活性部位システインを抑制するのに適切な生化学的インヒビターを含む。模範的に適切なインヒビターはｎ−エチル−マレイミドである。該組成物中のタンパク質は転写リプレッサー活性のみを有するかまたはユビキチン接合活性同様の活性などを有する。使用において、該組成物はさらに１またはそれ以上の他のタンパク質を含み、例えば、ＷＴ１などの転写抑制活性を有する第２タンパク質を含む。該組成物はまた、ユビキチン接合酵素またはそのセグメントが相互作用するＤＮＡ結合ドメインを有する他のタンパク質をも含む。さらに、該組成物中のタンパク質はＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含むアミノ酸配列を有する融合タンパク質であり得る。該融合タンパク質のリプレッサードメインは好ましくは転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素の少なくとも１２アミノ酸セグメントを含む。該ＤＮＡ結合ドメインは好ましくは特に、プロモーター領域である、ＴＡＴＡ結合部位でＴＡＴＡ結合タンパク質と相互作用することがユビキチン接合酵素にとって可能であるプロモーター領域に十分近接する遺伝子領域に結合するかまたは該領域と相互作用するかまたはさもなければ連合するドメインである。そのようなドメインにはGal４ドメイン、LexＡドメインおよび多くのジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を含む。医薬組成物にとって該タンパク質製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または遺伝子療法運搬剤（gene therapy delivery agent）および該タンパク質の製薬学的に活性のある量が該組成物中に使用される。好ましくは該量は、標的遺伝子の遺伝子転写の調整または制御または抑圧を行うのに有効である量である。一層少量または多量が本願において適切である場合、該製薬学的に活性のある該タンパク質の量は好ましくは、該細胞に内在性である該タンパク質の量に比較してやう１％から１０００％にまでわたる因子に制御される標的遺伝子の該細胞中の該タンパク質の濃度を増加させるのに十分な量である。濃度の増加はより好ましくは約１０％から約１００％までにわたる。該医薬組成物中の該タンパク質は転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素濃度セグメントであり、該量はその天然に存在する全配列状態中のユビキチン接合酵素の内在量に比較してとられる。特別な製薬適応のために投与される特定の用量は好ましくは上記量と一致するのだが、年齢、健康状態、受領者の体重、もしあれば現在の治療の型、治療の頻度、望ましい効果の性質および限局した組織または系広範な効果が追求されているか否かによる。ウィルムス腫瘍の治療に関しては、腫瘍抑制量が投与される。同様に、任意の悪性新生物の増殖を制御または調整または抑圧することに関しては、上記に概説した因子によって決定されるような制御、調整または抑圧を達成するのに有効な量が投与されるべきである。非製薬学的応用において使用されるタンパク質の量は医薬組成物に関しては類似の範囲にあるが、またこの範囲外にもある量を含む。転写リプレッサー活性を有するＵＢＣ−９などのユビキチン接合酵素をコードするかまたはそのセグメントをコードする核酸ポリマーは遺伝子療法運搬剤と組み合わせて核酸組成物において使用されることができる。本明細書で使用するように、遺伝子療法なる語はヒトおよび非ヒト遺伝子の療法に影響を及ぼす作用および／または操作に関し、そのような作用は、本来イン・ビボまたはエクス・ビボである。より詳しくは、該組成物は好ましくは転写リプレッサー活性を有するタンパク質をコードする核酸ポリマーを含む。該転写リプレッサータンパク質は転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素のアミノ酸配列の少なくとも一部を含ミ、長さ少なくとも約１２アミノ酸残基である含有部分であるアミノ酸配列を有する。別法として、該核酸ポリマーは直前に記載した核酸ポリマーの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有することができる。ユビキチン接合酵素はｈＵＢＣ−９などのＵＢＣ−９またはその断片、またはユビキチン接合活性を欠如している変異体であり得る。該組成物はさらに該ユビキチン接合酵素のユビキチン接合酵素活性の生化学的インヒビターと共に使用してよい。該核酸ポリマーはまた上記タンパク質組成物と共に記載した上記融合タンパク質などの融合タンパク質をもコードする。製薬学的使用に関して、該核酸組成物は医薬的組成物に有効な量の核酸および製薬学的に許容し得る遺伝子療法運搬手段を含む。必要とされる核酸の量は細胞の型に依存して多様であり、追求される効果は標的細胞に核酸ポリマーを導入するのに使用されるデリバリーシステムにおいて依存する。概して、核酸ポリマーの量は標的細胞内での発現に関して標的遺伝子の転写を制御または調整または抑制するのに十分なタンパク質の量となる。好ましくは、その量は、制御される遺伝子の細胞に内在するタンパク質の量に比較して約１％から１０００％にわたる因子によって制御される標的遺伝子の細胞内のタンパク質の濃度を増加させるのに十分である。より好ましくは、濃度増加は約１０％から約１００％にわたる。該試薬の核酸ポリマーが転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素のセグメントであるタンパク質をコードする場合、該量は本来の全配列状態におけるユビキチン接合酵素の内在量に比較してとられる。遺伝子療法デリバリー試薬は、標的細胞に核酸ポリマーを導入するかまたは標的細胞による核酸ポリマーの取込みを増強するのに使用される。核酸ポリマーを細胞に導入するおよびその発現に影響するいくつかの方法は公知であり、当業者によって行われる（ミュリガン（Mulligan,Ｒ.）、The Basic Science of Gene Thrapy 、ＳＣＩＥＮＣＥ、Vol．２６０、９２６−３２（１９９３））。１方法において、該組成物の核酸ポリマーを、イン・ビボでヒト細胞に導入する運搬剤と結合、複合、組合せまたは融合することができる。例えば、該核酸はリポソームの形態であり得る脂質親和性陽イオン化合物（lipophilic cation comp ound）と結合できる。遺伝子または他の製薬学的に活性な成分を細胞に導入するリポソームの使用は、例えば、米国特許第４,３９７,３５５号および４,３９４, ４４８号において教示される。代わりに、該核酸はコレステロール、コール酸塩、デオキシコール酸を含む複数のステロールのうちの任意の１つなどの脂質親和性担体と組み合わせてよい。好ましいステロールはコレステロールである。さらに、核酸は細胞によって摂取されるペプチドに接合することができる。有用なペプチドの例にはペプチドホルモンまたは抗体を含む。ウィルムスの腫瘍または他の悪性新生物によって選択的に取り込まれるペプチドの選択によって、核酸の特異的な運搬が影響を及ぼされる。核酸は該ペプチドに当該技術分野においてよく知られている方法によって共有結合する。ついで選択されたペプチドはアミノ酸およびスルフヒドリル反応性ヘテロ二価性試薬を介して活性化した酵素に結合してよい。後者は該ペプチド中に存在するシステイン残基に結合する。該ペプチドに結合した核酸に対して標的分子をさらすと、該核酸はエンドサイトーシスされ、遺伝子転写の調整に利用される。本発明の核酸ポリマーもまた、米国特許第５ ,４２８,１３２号において、ヒルシュ（Hirsch）らにおいて記載されているように、ＤＮＡ−抗体接合を用いて特異的な組織に運搬されることができる。ＤＮＡおよびＲＮＡなどのセンスまたはアンチセンス核酸ポリマーをヒト細胞に導入するために使用した他の遺伝子療法運搬剤は米国特許第５,４６０,８３１号、ジェルマン（Gelman）らおよび米国特許第５,４３３,９４６号、アレン（Allen）らに開示されている。別法において、該遺伝子療法運搬剤は核酸ポリマーを含むｃＤＮＡおよび宿主細胞中に発現されることができるｃＤＮＡを有する構築物である。そのような構築物は細胞に感染またはトランスフェクションされ、該細胞中で転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素を発現する。例えば、該組成物は該薬剤の核酸ポリマーを含むウイルスゲノムかまたは該剤の核酸ポリマーに複合体を形成するウイルスゲノムを有するウイルスであり得る。そのような方法は例えば、米国特許第５,２５２,４７９号、スリバスタバ（Srivastava）、米国特許第５,５２１,２９１号および第５,５４７,９３２号、バーンスチール（Birnstiel）ら、米国特許第５,５１２,４２１号、バーンズ（Burns）ら、米国特許第５,２４０,８４６号、コリンズ（Collins）ら、米国特許第５,１１２,７６７号、ロイーバーマン（Roy−Burman）らおよび米国特許第５,５４３,３２８号、マクレランド（M cClelland）ら中に教示される。さらに別の方法において、該遺伝子療法運搬剤はヒト細胞である。該組成物の核酸ポリマーはイン・ビトドでヒト細胞に挿入され、核酸ポリマーを含む細胞はついで体内に導入される。ついでコードされたユビキチン接合酵素はイン・ビボで該細胞によって発現される。そのような方法は、例えば米国特許第５,３９９, ３４６号、アンダーソン（Anderson）ら中に教示される。核酸ポリマーを含む組成物および本発明のタンパク質を含む医薬組成物は意図した目的を達成する任意の方法によって投与されることができる。例えば投与は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または経皮経路によって投与されることができる。非経口投与のための製剤は、水溶性形態において、例えば水溶性塩において組成物または医薬組成物の水溶液を含むことができる。さらに、油性注入懸濁液において活性化合物の懸濁液を投与する。適当な脂質親和性溶剤またはビヒクルは脂肪油、例えばゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む。時に、懸濁液はまた、安定化剤を含むことができる。本発明の組成物中で使用した遺伝子療法運搬剤および各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。本発明の医薬組成物は、多様な製薬学的および非製薬学的応用において使用することができる。概して、細胞中の遺伝子転写は標的遺伝子がさらされるかまたは標的遺伝子が接触するようになるＵＢＣ−９の濃度および／またはＴＢＰの濃度を制御することによって制御するか、増強するかまたは抑制することができる。特に、転写の抑制はＷＴ１、ＴＢＰまたは他のプロモーター領域または転写開始領域に関連したＵＢＣ−９とタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用によってかＵＢＣ−９リプレッサードメインと遺伝子特異的ＤＮＡ結合ドメインの融合によって多様な遺伝子のプロモーター領域の近辺にＵＢＣ酵素を位置づけることによって遺伝子特異的な方法によって行うことができる。多様な細胞は本発明において使用することができる。ＴＡＴＡボックスを含むプロモーター領域を有する遺伝子を含む天然に存在する真核生物細胞のような真核生物は特に好ましい。ｈＵＢＣ−９または少なくとも長さ約１２アミノ酸残基である転写リプレッサー活性を有する他のＵＢＣまたは他のユビキチン接合酵素またその断片はそのような遺伝子中で転写開始においてＴＡＴＡ結合タンパク質の役割を崩壊させることができる。例えば、該細胞は真菌細胞（例えば、酵母細胞）、植物細胞、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞およびヒト細胞であることができる。大腸菌などの非真核生物生物細胞はまた、細胞が転写開始のためのＴＢＰに関するプロモーター領域を含む遺伝的に操作可能な核酸ポリマー構築物を含むところで使用することができる。ＷＴ１などのリプレッサー遺伝子産物の機能は、ＩＧＦ−II、ＰＤＧＦＡ− 鎖、ＣＳＦ−１およびＩＧＦ−Ｒまたは後に発見されたその他のものなどのＷＴ１が作動することが知られている遺伝子プロモーターの転写制御を可能にするような方法によって厳密に増強され得る。転写の制御はまた、例えばそのような活性を欠如した⁹³ｃｙｓ変異体酵素により、または活性部位システインを抑制するまたは特定の方法においてのタンパク質加水分解経路をさもなくば邪魔する薬剤によりＵＢＣ−９の接合活性の限局した抑制によって制御されることができる。転写制御は特に医学的治療、診断および研究の応用において特に有用である。例えば、ＵＢＣ−９はそれ自体で新生物組織の増殖のための治療組成物において、ＷＴ１などの公知の腫瘍サプレッサータンパク質と組み合わせて使用することができる。それは特にウィルムス腫瘍を治療すること、例えば白血病および中皮腫を含むＷＴ１サプレッサー遺伝子が関係する他のタイプの腫瘍を治療するのに適している。それはまた、あるタンパク質の過剰に因果的に結合している任意の数のヒト疾患を制御することにも有用である。過剰にタンパク質が発現している遺伝子はＵＢＣ−９または他の過剰なタンパク質発現の量を減少させるリプレッサー活性を有する他のユビキチン接合酵素にさらされることができる。ある状況において、ＵＢＣ−９または他のユビキチン接合酵素のリプレッサー活性は、特定の関心のあるタンパク質の発現における増加に影響を及ぼすよう応用することができる。関心のあるタンパク質における増加は「再結合（rebound）メカニズムを通して影響され得、そこでの増加は該系に存在する第２のタンパク質の量において減少が引き続く天然の生化学的メカニズムの結果である。第２タンパク質の量の減少は、そのタンパク質をコードする遺伝子に指令する本発明の方法により達成される。本発明の他の有意義な応用はヒトウイルス感染の治療を含む。本願はヒトウイルスのウイルスゲノムを特に、ゲノムのプロモーター領域、転写リプレッサー活性を有するユビキチン接合酵素にさらすことを含む。ウイルスゲノムの転写を抑圧することにより、該ウイルスは殺害されるかまたは少なくとも制御されることができる。本発明はまた、酵母感染を静めるかまたは少なくとも制御することを助けるために使用されることができる。さらに、転写制御は多様な非ヒト、非製薬学的応用において有用である。例えば、本発明は動物の治療または特に上記に記載されただけの動物の疾患の治療に関して使用されることができる。本発明はまた、過剰発現による植物の疾患を治療するために有用であり、および同様の他の植物の応用を有することができる。非治療的応用の他の組合せにおいて、ｈＵＢＣ−９は動物に基づいたモデルまたイン・ビトロアッセイを開発するのに使用してよい。例えば、選択的なタンパク質欠損を有する動物は、本発明の医薬組成物または生化学的薬剤を動物に投与することによって関心のあるタンパク質をコードする標的遺伝子の転写がＵＢＣ −９またはリプレッサー活性を有する他のユビキチン接合酵素のリプレッサー活性によって抑制される。別の応用には、関心のある新生物の細胞または他の細胞の培養へのｈＵＢＣ−９の効果が他の潜在的な抗癌剤の効果を評価する標準として使用されるイン・ビトロ競合アッセイを含むことができる。酵素変換工程は、化学物質が細胞内で発現する酵素を用いて市販用に製造される工程であり、本発明を利用できる。模範的な生物変換工程には醸造およびパン製造と関連し、多様なカルボン酸の市販用製造にも関する酵母触媒工程を含み、不可欠アミノ酸またはその類似体、アミドまたはニトリル由来のものを含む。本発明はまた、環境浄化にも影響を及ぼすように行われる生物学的治療法測定（bi oremediation）に組み込まれる生物変換工程において使用することもできる。そのような酵素変換工程において使用される細胞は、真核細胞または遺伝的に操作される大腸菌細胞などの非真核生物細胞であることができる。本発明のいくつかの局面の他の使用および応用は当業者に明らかである。以下の実施例は本発明の原理および利点を説明する。実施例以下の実施例の根拠となる実験を実施するのに用いたすべての分子生物学的操作は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold S prings Harbor Laboratory Press，Cold Springs Harber，NY(1989)に記載の当該分野で知られた方法を用いて行われた。実施例１：ｈＵＢＣ−９の単離ＷＴ１の個別のスプライス変異体のそれぞれのＮ末端領域内のリプレッサードメイン（残基８５−１７９）は、あらかじめマッピングされ、Ｇａｌ４結合ドメインと融合するとき、有力なリプレッサーとして独立して機能するものとして確認された(Wang,Z-Yら、1993)。このリプレッサードメインは機能的ＤＮＡ結合ドメインなしに独立して発現したとき、ＷＴ１のリプレッサー機能をブロックすることも示され、このことは、ＤＮＡ結合活性を欠くリプレッサードメインが、ＷＴ１が転写リプレッサーとして機能するのに必要な相互作用核因子に対してＷＴ１と競合することを示唆している（Wang,Z-Y.ら、1995）。現在ｈＵＢＣ−９であることが確認されている該相互作用因子は、酵母２ハイブリッドスクリーンを用いて単離された。ベクター、ＬｅｘＡＤＢ−ＷＴ−Ｎは、ヒトＷＴ１の残基８５−１７９をＬｅｘＤＮＡ結合ドメインと連結することにより構築された。ｐＬｅｘＡＤＢ／ＷＴ−Ｎを構築するために、ＷＴ１の負の制御を行うドメイン（残基８５−１７９）をコードするｃＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＳＧＷＴ−ＮをＸｂａＩで消化し、クレノーフラグメントで平滑末端とし、ＥｃｏＲＩで消化することにより得、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ処理ベクターｐＳＴｔｏｐ１１６中にクローンし、これをポリリンカー領域内の３つの読み取り枠にそれぞれ終止コドンを導入することによりプラスミドｐＢＴＭ１１６から改変した。該ベクターは、「ベート(bait)」としてＷＴ１の負の調節ドメイン（ＷＴＮ）およびＬｅｘＡＤＮＡ結合（ＤＢ）ドメインを持つ融合タンパク質を発現した。酵母Ｌ４０株をライブラリースクリーニングに用いた。Ｌ４０をｐＬｅｘＡＤＢ／ＷＴ−Ｎ、次いで製造業者の推奨するところに従ってヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(Clontech，CA)と融合させたＧａｌ４活性化ドメインを用いて形質転換した。酵母形質転換体２００万個をスクリーニングした。Ｈｉｓプレート上の陽性コロニーについて、さらにフィルターアッセイを用い、β−ガラクトシダーゼ活性を試験した。陽性コロニーはＬｅｘＡＤＢ／ｌａｍｉｎＣハイブリッド、ＬｅｘＡＤＢ／ＷＴ−ＩＮＳ（ＷＴ１の残基２５０−２６６を含む）、ＬｅｘＡＤＢ／ＷＴ−ＮおよびＬｅｘＡＤＢベクターのみを用いて特異性を試験した。ｐｌｅｘＡＤＢ／ＷＴ−Ｎのみと反応するプラスミドを酵母から回収し、これを用いてエレクトロポーレーションによりＨＢ１０１を形質転換し、ｌｅｕ^-、ａｍｐ⁺最少培地上で選択を行った。初期スクリーニングにおいて陽性クローン６５個を確認した。回収した陽性クローン６５個を酵母に再導入し、β−ｇａｌ活性の定量および特異性の再チェックを行った。ベクター単独、およびＧａｌ４活性化ドメインと融合したｈＵＢＣ−９と融合したベクターと連結したＤＮＡ結合ドメイン融合パートナーに対するβ−ガラクトシダーゼ活性単位を表２に示した。表２：２ハイブリッド経におけるｈＵＢＣ−９の結合特異性＊−ガラクトシダーゼ活性ＤＮＡ−結合ドメイン融合パートナーベクターｈＵＢＣ−９ベクター単独：Ｎ．Ｄ．０．２±０．１＋ＷＴ８５−１７９：０．３±０．２５７．９±１６．２＋ＷＴ２５０−２６６：０．２±０．２０．３±０．２＋ＬａｍｉｎＣ：０．３±０．１１．５±０．５ＷＴ１に依然として特異的な陽性クローン１１個は、製造業者の指示書に従って（U.S．Biochemical）ジデオキシＮＴＰｓおよびセクエナーゼ(sequenase)２．０を用いて配列決定した。配列分析および相同性検査はＧＣＧプログラム（GC G,Madison,WI)を用いて行った。各挿入物はＧａｌ４活性化ドメインとして同じ読み取り枠内にあった。これらプラスミドのうち７個は本発明者らがヒトＵＢＣと名付けた同じタンパク質をコードしていた。最長のｃＤＮＡクローンの挿入により、ノーザンブロット分析において約２．８および１．３ｋｂの転写物が検出された。完全長ｃＤＮＡを探すため、２ハイブリッドスクリーンを用いて得たプローブを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングし、第三スクリーニング後に独立したクローン８個を単離した。５クローンは１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを含み、１クローンは１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含み、また２クローンは小ＤＮＡフラグメントを含んでいたがさらに分析を行わなかった。１．８ｋｂｃＤＮＡおよび１．１ｋｂｃＤＮＡが完全に配列決定された。２つのクローンはコード領域と３’末端に同じ配列を持っていたが、別のスプライシングでは、より長いｃＤＮＡアイソフォームの翻訳開始部位の上流に長い５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）が導入されるようである。長い５’ＵＴＲ内の３つすべての読み取り枠内に複数の開始および終止コドンが確認され、より長い転写物のタンパク質産物は厳密な翻訳調節下にあるかも知れないことを示している。両ｍＲＮＡのin vitroにおける転写／翻訳により同じサイズのタンパク質が生じたが、より長いｃＤＮＡクローンは、より短いｍＲＮＡから発現したものに比べて２０％以下のタンパク質産物しか発現せず（データ示さず）、長い５’ＵＴＲは翻訳効率を明確に低下させることが確認された。長い型の５’ＵＴＲは３つの読み取り枠すべてに複数の介在する開始および終止コドンを含むため（図１Ａ）、これらコドンの存在は、おそらく、より長いｍＲＮＡアイソフォームの翻訳速度を負に調節するようである。コントロール実験において、ＬｅｘＡＤＢ−ＷＴ−Ｎは、分析のみでは酵母中のＬｅｘＡ結合部位を含むレポーター遺伝子の転写を活性化することができなかった。実施例２：ヒト組織のノーザンブロット分析ヒト組織ノーザンブロット（Clontech,CA)は、製造業者の推奨するところに従って１．１ｋｂｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡを用いて精査された。図２Ａは、種々のヒト組織におけるｈＵＢＣ−９のノーザンブロットを示す。各レーンは心臓（Ｈ）、脳（Ｂ）、胎盤（Ｐ１）、肺（Ｌｉ）、平滑筋（ＳＭ）、腎臓（Ｋ）、膵臓（Ｐａ）由来のポリＡ⁺ＲＮＡ２μｇを含んでいた。コントロールとして、β− アクチンｃＤＮＡを用いて同じブロットを精査した。実施例３：ｈＵＢＣ−９遺伝子に対するヒトゲノムＤＮＡの分析ヒトゲノムＤＮＡ(Promega,Madison WI)１０μｇをＨｉｎｄ III（Ｈ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＢｇｌII（Ｂｇ）またはＢａｍＨＩ（Ｂ）で消化した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分離し、完全長１．１ｋｂｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡをプローブに用いてサザンブロットを行った。図２Ｂは、ｈＵＢＣ−９遺伝子のサザンブロット分析を示す。実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９融合タンパク質の発現簡単に述べると、ＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９融合タンパク質として細菌中で発現させることにより、ｈＵＢＣ−９をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させた。ＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９およびＧＳＴを、独立して還元グルタチオンセファロースマトリックスと連結し、徹底的に洗浄した。次に、ＷＴ１および種々のＷＴ１ドメインを発現するベクターでトランスフェクトされた２９３細胞由来の抽出物をカラムに通し、インキュベーションおよび洗浄した後、溶出液を得た。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、イムノブロッティング用のニトロセルロースフィルターに移し、抗ＷＴ１（１：５００）およびパーオキシダーゼ結合抗ＩｇＧを用いるウエスタンブロットにより分析を行った。カラーフルオログラフィーによりブロットを可視化した。ＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９を構築するため、ｐＢＳ−ｈＵＢＣ−９をＥｃｏＲＩで消化し、１．１−ｋｂの挿入物を、ＧＳＴ含有ｐＧＥＸ−ＫＧベクターのＥｃｏＲＩ部位にインフレーム（in frame）にサブクローンした。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株をＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９で形質転換し、ＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９を抽出し、グルタチオン−セファロースビーズで精製した。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈＵＢＣ −９融合タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズと独立して結合させ、徹底的に洗浄した。ＷＴ１およびその種々のドメインを既述（Wangら、1993）のごとく、２９３細胞中で発現させた。ＷＴ１の完全長、ならびにＷＴ１△１−８４、ＷＴ１△１− ２９４およびＷＴ１△２９７−４２９ドメインをコードするＣＭＶプロモーター誘導発現ベクターでトランスフェクトした２９３（ヒト胚腎細胞）細胞２ｘ１０⁶ 個から抽出物を得た。抽出物を、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＰＭＳＦ、ロイペプチン（leupeptin）１μｇ／ｍＬ、アンチペイン（antipain）１μ ｇ／ｍＬ）中の、ＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９２〜３μｇを含むセファロースビーズと室温にて２−３時間インキュベーションすることによりin vitro 結合アッセイを行った。コンプレックスを溶解緩衝液および０．５ＭＮａＣｌ含有溶解緩衝液で徹底的に洗浄し、ＳＤＳＰＡＧＥ泳動用緩衝液（１％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール）中でボイルし、５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲルをニトロセルロース膜（ＳＯＳＮＣ）に移し、それぞれＷＴ１のＮ末端およびＣ末端ドメインを認識するポリクローナル抗ＷＴ１抗体ＳＣ０８９およびＳＣ１８９(Santa Cruz,CA)を用いてイムノブロットした。アルカリホスファターゼ結合第二抗体を加え、次いで結合したＷＴ１タンパク質を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジニウムおよびニトロブルーテトラゾリウム(BCIP,NBT; Promega,Madison,WI)を用いて可視化した。図３Ａはin vitroにおけるＷＴ１およびｈＵＢＣ−９の結合を示す。左欄は細胞溶解物コントロールの結果を示し、矢印は予測された推定分子量１４ｋｄのＷＴ１を示す。右欄はＧＳＴコントロールの結果を示す。真ん中の欄はＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９融合タンパク質の結果を示し、その中の矢印はＷＴ１とＧＳＴ−ｈＵＢＣ−９マトリックスとの結合を示す。ＷＴ１とＧＳＴコントロールマトリックスの間には同様の結合は観察されず、これらの結果はＷＴ１がｈＵＢＣ−９と結合しているかまたは密接に結びついていることを示している。実施例５：ＷＴ１およびＨＡ標識(tagged)ヒトＵＢＣによる細胞の同時トランスフェクションｈＵＢＣ−９の１．１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ＨＡペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメントとインフレームに、発現ベクターｐＧＣＮ（ＲＥＦ）のＥｃｏＲＩ部位にクローンすることによりインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）標識ｈＵＢＣ−９をコードする発現ベクターを構築した。２９３細胞をＷＴ１およびＨＡ標識ｈＵＢＣ−９発現プラスミドで同時トランスフェクトした。細胞溶解物を調製し、抽出物を抗ＷＴ１抗体または非特異的ウサギポリクローナル抗体（抗Ｇａｌ４ＤＢ）のいずれかを用いて免疫沈降させた。ＷＴ１結合タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ブロットした。次に、該プロットを、ＨＡ標識ｈＵＢＣ−９を認識する抗ＨＡモノクローナル抗体を用いて精査することにより分析した。図３ＢはＷＴ１およびｈＵＢＣ−９の同時免疫沈降の結果を示す。実施例６：ｈＵＢＣ−９とｔｓｙＵＢＣ−９の同時発現酵母Ｗ９４３２株(MATa,ubc9-△１::TRP1,pSE362[ARS1,CEN4,HIS3]-ubc9-1)は、ゲノミックｙＵＢＣ−９をコードしている配列が、プラスミドに保持されている温度感受性ｙＵＢＣ−９−１アレル（１．５ｋｂＸｂａｌ−Ｓｓｐ１フラグメント）のコピーおよびＴＲＰ１マーカーで置き換えられている以外はＷ３０３と同遺伝子型である。ｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡ（１．１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント）およびｙＵＢＣ−９遺伝子（０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメント）を、それぞれベクターｐ４１６ＧＡＬ１（ＡＲＳＨ４、ＣＥＮ６、ＵＲＡ３）およびpＳＥ９３６（ＡＲＳ１、ＣＥＮ４、ＵＲＡ３）中のＧＡＬ１プロモーターと融合させた。図４Ａおよび４Ｂにおいて、温度感受性酵母株（Ｗ９４３２）を、独立してｈＵＢＣ−９（第１列）およびｙＵＢＣ−９（第４列）コントロールベクター（それぞれｐ４１６ＧＡＬ１およびｐＳＥ９３６）、およびｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡ発現構築物（第２列）またはｙＵＢＣ−９遺伝子（第３列）で形質転換した。これらの株の増殖を比較するため、細胞を、ガラクトース含有プレート上の希釈系列中にスポットし、許容温度（２３℃）で３．５日間、または制限温度で（３４ ℃）で２日間インキュベーションした。実施例７：ｈＵＢＣ−９／ＷＴ１同時トランスフェクション実験２９３細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下、ＰＤＧＦＡ鎖プロモーター誘導ＣＡＴレポータープラスミドを用い、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿によりｈＵＢＣ−９およびＷＴ１発現構築物で同時トランスフェクションした。各トランスフェクションにおいて、各ディッシュ内でトランスフェクトされたＣＭＶプロモーター配列の全量は、ベクターＤＮＡを加えることにより等量化された。トランスフェクション効率は、ＣＭＶプロモーター誘導β−ガラクトシダーゼレポーター構築物の同時トランスフェクションにより標準化された。すべての実験は少なくとも３回繰り返した。図５Ａは、ＣＡＴアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果を示す。ＣＡＴ活性は、ＴＬＣプレートの切り出した断片をシンチレーションカウントすることにより定量された。図５Ｂは、種々の時間に種々のアッセイから得た相対ＣＡＴ活性値とそれぞれの標準偏差を示す。該実験は、ｈＵＢＣ−９がヒト胚腎細胞（２９３細胞）のＷＴ１の転写レプレッサー活性を増強することを示している。実施例８：ｈＵＢＣ−９−Ｇａｌ４同時トランスフェクションアッセイｈＵＢＣ−９をＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと連結し、レポーター系における転写に対するその効果を評価した。図６Ａにおいて、コントロール発現ベクター、ｐＳＧ４２４は、ＳＶ４０プロモーターによって誘導されるＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを用いて構築された。融合タンパク質発現ベクター、ｐＳＧ−ｈＵＢＣ−９は、ＳＶ４０プロモーターによって誘導されるＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと融合させたｈＵＢＣ−９の完全長ｃＤＮＡを用いて構築された。ｐＳＧ−ｈＵＢＣ−９は、完全長のｈＵＢＣ−９ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを、発現ベクターｐＳＧ４２４のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築された。レポータープラスミドｐＳＶＣＡＴおよび５ＸＵＡＳｐＳＶＣＡＴはS.Weintraub博士(Washingto n University,St.Louis)から提供された。ｐＳＶＣＡＴプラスミドは、ＣＡＴレポーター遺伝子(Promega，Madison，WI)と融合させたＳＶ４０プロモーターを含んでいた。５ｘＵＡＳｐＳＶＣＡＴプラスミドには、ＳＶ４０プロモーターの上流にＧａｌ４結合部位をさらに５コピー有するｐＳＶＣＡＴプラスミドが含まれた。各発現ベクターを各レポータープラスミドと同時トランスフェクトさせる同時トランスフェクション実験を実施した。レポータープラスミドＤＮＡ５μｇを、種々の量の発現プラスミドを用いる各トランスフェクションに用いた。図６Ｂは、示した種々の量の発現プラスミドについて、既述（実施例７）のごとく行った、ＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果を示す。ＣＡＴ活性は、コントロール単独と比較したＣＡＴ活性として示す。実施例９：ｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９およびｙＵＢＣ−９−ｍＧａｌ４融合タンパク質ｈＵＢＣ−９、ｙＵＢＣ−９およびｙＵＢＣ−９−ｍ（活性部位のシステインの代わりにセリンを有する突然変異体ｙＵＢＣ−９）を独立してＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと結合させ、レポーター系における転写に対する影響について評価した。図７Ａにおいて、コントロール発現ベクター、ｐＳＧ４２４およびｈＵＢＣ− ９／Ｇａｌ４融合タンパク質発現ベクター、ｐＳＧ−ｈＵＢＣ−９を既述（実施例８）のごとく構築した。ｙＵＢＣ−９／Ｇａｌ４発現ベクター、ｐＳＧ−ｙＵＢＣ−９は、完全長のｙＵＢＣ−９ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを、発現ベクターｐＳＧ４２４のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築された。ｙＵＢＣ−９−ｍ／Ｇａｌ４発現ベクター、ｐＳＧ−ｙＵＢＣ−９−ｍを、ｐＵＣ１９−ｙＵＢＣ９−ｍプラスミドをＨｉｎｄIIIで消化することにより構築し、クレノーフラグメントを用いて平滑にし、次いでＥｃｏＲＩで消化してＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ消化ｐＳＧ４２４プラスミド中にクローンした。図７Ａに示したレポータープラスミドは、既述（実施例８）のごとく得られた。同時トランスフェクション実験に関して、既述（実施例７）のごとく行ったＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果を、ヒトおよび酵母ＵＢＣについてそれぞれ図７Ｂおよび７Ｃに示す。示した種々の量の発現プラスミドを用いる各トランスフェクションにはレポータープラスミドＤＮＡ５μｇを用いた。上記の本発明の詳細な説明および実施例に照らして、本発明の種々の目的が達成されることを正しく認識することができる。本明細書に示した説明および例示は、本発明、その原理およびその実際的応用を当業者に熟知させることを意図するものである。当業者は、特定の使用の要求に最も適するように多くの形で本発明を適用および応用することができよう。したがって、示した本発明の特定の態様は、本発明を網羅または限定するものではない。参考文献 Cohen,S.N.,1972:Proc.Natl.Acad.Sci．69:2110(1972)。 Depicker,A.ら,1982:J.Mol.Appl.Gen.(1982)1:561。 Dowerら(1988),Nucleic Acids Research 16:6127-6145。 Goeble,M.G.ら,1988:「酵母細胞サイクル遺伝子CDC34はユビキチン結合酵素をコードしている」Science,1988．241(4871):p.1331-5。 Seufert,W.ら,1995:「Ｓ期およびＭ期のサイクリンの分解におけるユビキチン結合酵素の役割」Nature,1995．373(6509):p.78-81。 Wang,Z-Y.ら,1995:「WT1、ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子産物は、相互作用性核タンパク質を介する転写を抑制する」0ncogene,1995.10:p.1243-1247。 Wangl Z-Y.ら,1993:「血小板誘導成長因子Ａ鎖遺伝子プロモーターのＳ１ヌクレアーゼ感受性領域と相互作用する１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の確認」J.Biol .Chem.,1993a 268(N0.14，May 15),p.9172,p.10681-10685。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ｃ 9/00 Ａ６１Ｋ 37/48 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者デュエル，トーマス・エフアメリカ合衆国02138マサチューセッツ州ケンブリッジ、ヒラード・ストリート18 番 (72)発明者シェンク，トーマスアメリカ合衆国08540ニューヨーク州プリンストン、マコッシュ・サークル87番 (72)発明者ワン，ジャオ−イアメリカ合衆国06460コネティカット州ミルフォード、ジー−２、マーウィン・アベニュー 330番

Claims

【特許請求の範囲】１．(ａ)ｈＵＢＣ−９；および (ｂ)ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質からなるグループから選ばれる実質的に精製されたタンパク質。２．(ａ)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ− ９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、タンパク質；および (ｂ)転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９と少なくとも約６５％の配列同一性を有するタンパク質からなるグループから選ばれる実質的に精製されたタンパク質。３．タンパク質が、転写リプレッサー活性を有する請求項２に記載のタンパク質。４．タンパク質が転写リプレッサー活性を有し、ユビキチン結合活性をもたない請求項２に記載のタンパク質。５．タンパク質が転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９のＣ⁹³変異体であり、それゆえに該変異体ｈＵＢＣ−９タンパク質がユビキチン結合活性をもたない請求項２に記載のタンパク質。６．タンパク質が転写リプレッサー活性およびユビキチン結合活性を有する請求項２に記載のタンパク質。７．(ａ)ｈＵＢＣ−９をコードする核酸ポリマー；および (ｂ)ｈＵＢＣ−９をコードする核酸ポリマーの核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸ポリマーからなるグループから選ばれる実質的に単離された核酸ポリマー。８．核酸ポリマーが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列； (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列；および (ｄ)上記(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列を有する請求項７に記載の核酸ポリマー。９．実質的に単離された核酸ポリマーであって、 (ａ)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有するタンパク質をコードし、該コードされたタンパク質が、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、核酸ポリマー；および (ｂ)上記(ａ)に記載の核酸ポリマーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸ポリマーからなるグループから選ばれる核酸ポリマー。１０．核酸ポリマーが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列； (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列；および (ｄ)上記(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列の部分を包含するヌクレオチド配列を有し、該包含された部分が少なくとも３６ヌクレオチド残基の長さであり、コードされたタンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与するアミノ酸配列をコードする請求項９に記載の核酸ポリマー。１１．コードされたタンパク質が転写リプレッサー活性を有する請求項９に記載の核酸ポリマー。１２．コードされたタンパク質が転写リプレッサー活性を有し、ユビキチン結合活性をもたない請求項９に記載の核酸ポリマー。１３．コードされたタンパク質が転写リプレッサー活性およびユビキチン結合活性を有する請求項９に記載の核酸ポリマー。１４．実質的に単離され、少なくとも３６ヌクレオチド残基の長さであり、転写リプレッサー活性を有するタンパク質をコードする核酸ポリマーであって、 (ａ)該コードされたタンパク質が、ｈＵＢＣ−９またはｍＵＢＣ９と少なくとも６５％の配列同一性を有するか；または (ｂ)該核酸ポリマーが、 (i)ｈＵＢＣ−９をコードする核酸ポリマー； (ii)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (iii)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列； (iv)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列；および (v)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有するタンパク質をコードする核酸ポリマーであって、該コードされたタンパク質がｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、核酸ポリマーからなるグループから選ばれる核酸ポリマーに相補的な核酸ポリマーにハイブリダイズすることを特徴とする核酸ポリマー。１５．コードされたタンパク質が転写リプレッサー活性を有し、ユビキチン結合活性をもたない請求項１４に記載の核酸ポリマー。１６．ｈＵＢＣ−９、またはｈＵＢＣ−９またはその部分のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、タンパク質の産生方法であって、 (i)ｈＵＢＣ−９；(ii)ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質；および(iii)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、タンパク質からなるグループから選ばれるタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターを産生し、該プラスミドベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、次いで該宿主細胞内で該タンパクを発現することを特徴とする方法。１７．(ａ)ｈＵＢＣ−９； (ｂ)ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質； (ｃ)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、タンパク質； (ｄ)転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９と少なくとも６５％の配列同一性を有するタンパク質；および (ｅ)ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、該転写リプレッサードメインがユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該融合タンパク質にリプレッサー活性を授与する、転写リプレッサー活性を有する融合タンパク質からなるグループから選ばれるタンパク質をコードするデオキシリボ核酸ポリマーを特徴とするＤＮＡを含むプラスミドベクター。１８．デオキシリボ核酸ポリマーが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列；および (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列を有する請求項１７に記載のプラスミドベクター。１９．(ａ)ｈＵＢＣ−９； (ｂ)ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質； (ｃ)ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、タンパク質； (ｄ)転写リプレッサー活性を有し、ｈＵＢＣ−９と少なくとも６５％の配列同一性を有するタンパク質；および (ｅ)ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、該転写リプレッサードメインがユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該融合タンパク質にリプレッサー活性を授与する、転写リプレッサー活性を有する融合タンパク質からなるグループから選ばれるタンパク質をコードするデオキシリボ核酸ポリマーを特徴とするＤＮＡを含むプラスミドベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。２０．デオキシリボ核酸ポリマーが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列；および (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列を有する請求項１９に記載の宿主細胞。２１．第１ベクターのＤＮＡが転写リプレッサータンパク質をコードするデオキシリボ核酸ポリマーを含み、第２ベクターのＤＮＡがアダプタータンパク質をコードするデオキシリボ核酸ポリマーを含み、該アダプタータンパク質が、転写リプレッサー活性および転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該アダプタータンパク質にリプレッサー活性を授与することを特徴とするＤＮＡをそれぞれ含む第１および第２プラスミドベクターで同時トランスフェクトされた宿主細胞。２２．ユビキチン結合酵素が転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたない請求項２１に記載の宿主細胞。２３．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項２１に記載の宿主細胞。２４．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９である請求項２１に記載の宿主細胞。２５．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９である請求項２１に記載の宿主細胞。２６．転写リプレッサータンパク質がＷＴ１である請求項２１に記載の宿主細胞。２７．転写リプレッサータンパク質がＷＴ１であり、アダプタータンパク質がＵＢＣ−９である請求項２１に記載の宿主細胞。２８．アダプタータンパク質が(ａ)転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素または(ｂ)転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素である請求項２１に記載の宿主細胞。２９．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項２８に記載の宿主細胞。３０．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９である請求項２８に記載の宿主細胞。３１．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９である請求項２８に記載の宿主細胞。３２．転写リプレッサータンパク質がＷＴ１である請求項２８に記載の宿主細胞。３３．転写リプレッサータンパク質がＷＴ１であり、アダプタータンパク質がＵＢＣ−９である請求項２８に記載の宿主細胞。３４．ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、該転写リプレッサードメインが転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該融合タンパク質にリプレッサー活性を授与する、転写リプレッサー活性を有する融合タンパク質。３５．ユビキチン結合酵素が転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システインを有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたない請求項３４に記載の融合タンパク質。３６．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項３４に記載の融合タンパク質。３７．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９である請求項３４に記載の融合タンパク質。３８．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９である請求項３４に記載の融合タンパク質。３９．転写リプレッサードメインのアミノ酸配列が(ａ)転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素または(ｂ)転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素のアミノ酸配列を包含する請求項３４に記載の融合タンパク質。４０．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項３９に記載の融合タンパク質。４１．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９である請求項３９に記載の融合タンパク質。４２．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９である請求項３９に記載の融合タンパク質。４３．ＤＮＡ結合ドメインが、Ｇａｌ４、ＬｅｘＡまたはジンクフィンガードメインからなるグループから選ばれるドメインのアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列を有する請求項３４に記載の融合タンパク質。４４．請求項３４に記載の融合タンパク質をコードする核酸ポリマー。４５．転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与する、転写リプレッサー活性を有するタンパク質、および担体、希釈剤またはデリバリー剤を含む組成物。４６．組成物が、細胞内の標的遺伝子の転写を調節するために有効な量のタンパク質および医薬的に許容しうる担体、希釈剤または遺伝子治療デリバリー剤を含む医薬組成物である請求項４５に記載の組成物。４７．ユビキチン結合酵素が、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたない請求項４５に記載の組成物。４８．さらに、タンパク質の活性部位システインを阻害するのに適した生化学的インヒビター含むことによってユビキチン結合活性をもたない請求項４５に記載の組成物。４９．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項４５に記載の組成物。５０．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９またはｙＵＢＣ−９である請求項４５に記載の組成物。５１．ユビキチン結合酵素がｈＵＢＣ−９である請求項４５に記載の組成物。５２．転写リプレッサータンパク質のアミノ酸配列が、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列を包含する請求項４５に記載の組成物。５３．さらに、転写リプレッサー活性を有する第２タンパク質を含む請求項４５に記載の組成物。５４．さらに、ＷＴ１を含む請求項４５に記載の組成物。５５．転写リプレッサータンパク質が融合タンパク質であり、該融合タンパク質がＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、該転写リプレッサードメインが(ａ)転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素または (ｂ)転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与する、請求項４５に記載の組成物。５６．(ａ)転写リプレッサー活性を有するタンパク質をコードし、該コードされたタンパク質が、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質に結合またはリプレッサー活性を授与する、核酸ポリマー；および (ｂ)上記(ａ)に記載の核酸ポリマーの核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸ポリマーからなるグループから選ばれる核酸ポリマー、および遺伝子治療デリバリー剤を含む遺伝子治療における使用に適した組成物。５７．組成物が、医薬組成物であり、細胞内の標的遺伝子の転写を調節するために有効な量の転写リプレッサータンパク質を発現するのに充分な量の核酸ポリマーを宿主細胞内に導入することを特徴とする請求項５６に記載の組成物。５８．ユビキチン結合酵素が、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素である請求項５６に記載の組成物。５９．さらに、タンパク質の活性部位システインを阻害するのに適した生化学的インヒビター含むことによって該タンパク質がユビキチン結合活性をもたない請求項５６に記載の組成物。６０．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項５６に記載の組成物。６１．核酸ポリマーが、転写リプレッサー活性を有する融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質がＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、該転写リプレッサードメインが(ａ)転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素または(ｂ)転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与する、請求項５６に記載の組成物。６２．核酸ポリマーが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列； (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列；および (ｄ)上記(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列を有する請求項５６に記載の組成物。６３．組成物が、該核酸ポリマーを含むウイルスゲノムを有するウイルスを含む請求項５６に記載の組成物。６４．ウイルスゲノムが、 (ａ)図１Ａの配列番号１のヌクレオチド配列； (ｂ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列； (ｃ)図１Ａの配列番号２のヌクレオチド配列の第８８〜５６４番の配列を包含するヌクレオチド配列；および (ｄ)上記(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるグループから選ばれるヌクレオチド配列を有する核酸ポリマーを含む請求項６３に記載の組成物。６５．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項６３に記載の組成物。６６．遺伝子を実質的に精製されたタンパク質に曝露することを含む細胞内の遺伝子転写の抑制方法であって、該タンパク質が転写リプレッサー活性を有し、転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与することを特徴とする方法。６７．ユビキチン結合酵素が、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたない請求項６６に記載の組成物。６８．ユビキチン結合酵素がＵＢＣ−９である請求項６６に記載の組成物。６９．タンパク質を細胞に導入することによって、遺伝子を該タンパク質に曝露する請求項６６に記載の方法。７０．タンパク質をコードする核酸ポリマーを細胞に導入することによって、遺伝子を該タンパク質に曝露する請求項６６に記載の方法。７１．タンパク質をコードするデオキシリボ核酸を含むＤＮＡを有するプラスミドベクターで細胞をトランスフェクトさせる請求項６６に記載の方法。７２．(ａ)タンパク質をコードする；かまたは(ｂ)前記(ａ)の核酸ポリマーの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸ポリマーを含むゲノムを有するウイルスに細胞を感染させる請求項６６に記載の方法。７３．第１ＤＮＡを有する第１プラスミドベクターおよび第２ＤＮＡを有する第２プラスミドベクターで細胞を同時トランスフェクトさせる請求項６６に記載の方法であって、該第１ＤＮＡがタンパク質をコードするデオキシリボ核酸ポリマーを含み、該第２ＤＮＡがＷＴ１をコードする核酸ポリマーを含み、これらのＤＮＡを細胞内で発現させることを特徴とする方法。７４．タンパク質が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であり、該転写リプレッサードメインが(ａ)転写リプレッサー活性を有するユビキチン結合酵素または(ｂ)転写リプレッサー活性を有し、変異した活性部位システイン残基を有することによって変異した酵素がユビキチン結合活性をもたないユビキチン結合酵素のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与する、請求項６６に記載の方法。７５．細胞をウイルスゲノムを有するウイルスに感染させ、タンパク質に曝露される遺伝子がウイルスゲノムであり、それによってウイルスゲノムの転写を抑制する請求項６６に記載の方法。７６．細胞が真核細胞である請求項６６に記載の方法。７７．細胞が真菌細胞である請求項６６に記載の方法。７８．細胞が酵母細胞である請求項６６に記載の方法。７９．細胞が植物細胞である請求項６６に記載の方法。８０．細胞が非ヒト動物細胞である請求項６６に記載の方法。８１．細胞が非ヒト哺乳類細胞である請求項６６に記載の方法。８２．細胞がヒト細胞である請求項６６に記載の方法。８３．タンパク質をコードする核酸ポリマーおよび医薬的に許容しうる担体、希釈剤または遺伝子治療デリバリー剤を含む組成物に、細胞を接触、感染またはトランスフェクトさせることによってヒト細胞をタンパク質に曝露する請求項８２に記載の方法。８４．ヒト細胞が新生組織細胞である請求項８２に記載の方法。８５．ヒト細胞がウィルムス腫瘍細胞であり、組成物を投与することによって該腫瘍細胞の増殖を阻害する請求項８２に記載の方法。８６．細胞内における遺伝子の転写を調節する方法であって、ユビキチン結合活性または転写リプレッサー活性を有する実質的に精製したタンパク質に遺伝子を曝露し、該タンパク質がｈＵＢＣ−９のアミノ酸配列の少なくとも部分を包含するアミノ酸配列を有し、該包含された部分が少なくとも１２アミノ酸残基の長さであり、該部分が該タンパク質にリプレッサー活性を授与することを特徴とする方法。