JPH10191977A - チオレドキシン改変体及び該改変体を含むａｐ−１の転写活性能を増強する因子 - Google Patents
チオレドキシン改変体及び該改変体を含むａｐ−１の転写活性能を増強する因子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、非還元条件下において安定である
ことを特徴とするチオレドキシンの改変体、並びに前記
チオレドキシンとＲｅｆ−１とを含むＡＰ−１転写活性
増強因子を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のチオレドキシンの改変体は、活
性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基
を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に置換す
ることを特徴とする。さらに、本発明のＡＰ−１転写活
性増強因子は、前記チオレドキシンとＲｅｆ−１とがＳ
−Ｓ結合で結合してなる。
ことを特徴とするチオレドキシンの改変体、並びに前記
チオレドキシンとＲｅｆ−１とを含むＡＰ−１転写活性
増強因子を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のチオレドキシンの改変体は、活
性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基
を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に置換す
ることを特徴とする。さらに、本発明のＡＰ−１転写活
性増強因子は、前記チオレドキシンとＲｅｆ−１とがＳ
−Ｓ結合で結合してなる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、非還元条件下にお
いても酸化的条件下においても安定であるチオレドキシ
ン改変体に関する。
いても酸化的条件下においても安定であるチオレドキシ
ン改変体に関する。
【０００２】本発明は、さらに前記チオレドキシン改変
体を含む、ＡＰ−１の転写活性能を増強する因子に関す
る。
体を含む、ＡＰ−１の転写活性能を増強する因子に関す
る。
【０００３】
【従来の技術】近年、増殖及び細胞死を含む細胞内現象
は、細胞内酸化還元状態によって調節されるということ
を示唆する一連の証拠が次々と挙がっている（Ｐａｈ
ｌ，Ｈ.Ｌ．＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ.Ａ.(１９９４)
ＢｉｏＡｓｓａｙｓ １６，４９７−５０２）。特に、
チオール酸化還元調節機構によって制御される転写因子
が試験管内ゲルシフト試験によって、次々と挙げられて
いる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ.Ｒ.，Ｗａｋａｓｕｇｉ，
Ｎ.，Ｖｉｒｅｌｉｚｉｅｒ，Ｊ.Ｌ.，Ｙｏｄｏｉ，Ｊ.
＆ Ｈａｙ，Ｒ.Ｔ．(１９９２) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０， ３８２１−３０，；Ａｂａ
ｔｅ，Ｃ.，Ｐａｔｅｌ，Ｌ.，Ｒａｕｓｃｈｅｒ，Ｆ.
Ｊ.ｄ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．(１９９０) Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４９１１５７−１１６１）。これには、ＡＰ−
１、ＮＦ−κＢ、Ｄｏｒｓａｌ／Ｒｅｌファミリーの他
のメンバー、Ｍｙｂ及びＥｔｓ等の既知の転写因子が含
まれている。しかしながら、これらの転写因子の活性制
御については、２−ＭＥやＤＴＴのような化学試薬が転
写因子のＤＮＡ結合能を活性化することがわかっている
が、細胞内のどの分子が酸化還元制御因子として働くか
という問題は、まだ明らかにはされていない。
は、細胞内酸化還元状態によって調節されるということ
を示唆する一連の証拠が次々と挙がっている（Ｐａｈ
ｌ，Ｈ.Ｌ．＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ.Ａ.(１９９４)
ＢｉｏＡｓｓａｙｓ １６，４９７−５０２）。特に、
チオール酸化還元調節機構によって制御される転写因子
が試験管内ゲルシフト試験によって、次々と挙げられて
いる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ.Ｒ.，Ｗａｋａｓｕｇｉ，
Ｎ.，Ｖｉｒｅｌｉｚｉｅｒ，Ｊ.Ｌ.，Ｙｏｄｏｉ，Ｊ.
＆ Ｈａｙ，Ｒ.Ｔ．(１９９２) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０， ３８２１−３０，；Ａｂａ
ｔｅ，Ｃ.，Ｐａｔｅｌ，Ｌ.，Ｒａｕｓｃｈｅｒ，Ｆ.
Ｊ.ｄ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．(１９９０) Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４９１１５７−１１６１）。これには、ＡＰ−
１、ＮＦ−κＢ、Ｄｏｒｓａｌ／Ｒｅｌファミリーの他
のメンバー、Ｍｙｂ及びＥｔｓ等の既知の転写因子が含
まれている。しかしながら、これらの転写因子の活性制
御については、２−ＭＥやＤＴＴのような化学試薬が転
写因子のＤＮＡ結合能を活性化することがわかっている
が、細胞内のどの分子が酸化還元制御因子として働くか
という問題は、まだ明らかにはされていない。
【０００４】細胞内の酸化還元制御因子の有力な候補と
してチオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）が注目
されている。ＴＲＸは生体内に普遍的に存在する小さい
タンパク質で、２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を活性中心に有し（Ｌａｕ
ｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.，Ｍｏｏｒｅ，Ｅ.Ｃ.，＆Ｒｅｉｃｈ
ａｒｄ，Ｐ．(１９６４) Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ２３
９，３４３６−３４４４；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１
９８９）Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，２３７
−２７１；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ.Ｂ
ｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２６４，１３９６３−１３６６；Ｂ
ｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，
Ｐ．，Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ，Ｐ．＆Ｌｏｚａｎ
ｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９４） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１４，２５７−６０）、活性中
心にあるジチオールの可逆的な酸化を通して酸化還元反
応に関わる多面発現性の細胞性因子である。ＴＲＸは還
元型及び酸化型のどちらででも存在し、遺伝子発現を含
む細胞内現象の制御に重要な役割を果たしていると考え
られている。また、ＨＴＬＶ−Ｉ白血病発生に関与する
成熟Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）としても知られて
いる。ＴＲＸは細胞内（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ.Ｒ.ら、
１９９２，上述；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ.，Ｏｇｉｗａｒ
ａ，Ｈ.，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ.，Ｍｉｔｓｕｉ，Ａ.，
Ｋａｗａｂｅ，Ｔ.＆Ｙｏｄｏｉ，Ｊ.（１９９２）Ｉｎ
ｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ ４，８１１−９）及び細胞外で
機能する。細胞内での機能の１つは、タンパク質−ヌク
レオチド間相互作用を促進することが知られている。
してチオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）が注目
されている。ＴＲＸは生体内に普遍的に存在する小さい
タンパク質で、２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を活性中心に有し（Ｌａｕ
ｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.，Ｍｏｏｒｅ，Ｅ.Ｃ.，＆Ｒｅｉｃｈ
ａｒｄ，Ｐ．(１９６４) Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ２３
９，３４３６−３４４４；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１
９８９）Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，２３７
−２７１；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ.Ｂ
ｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２６４，１３９６３−１３６６；Ｂ
ｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，
Ｐ．，Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ，Ｐ．＆Ｌｏｚａｎ
ｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９４） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１４，２５７−６０）、活性中
心にあるジチオールの可逆的な酸化を通して酸化還元反
応に関わる多面発現性の細胞性因子である。ＴＲＸは還
元型及び酸化型のどちらででも存在し、遺伝子発現を含
む細胞内現象の制御に重要な役割を果たしていると考え
られている。また、ＨＴＬＶ−Ｉ白血病発生に関与する
成熟Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）としても知られて
いる。ＴＲＸは細胞内（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ.Ｒ.ら、
１９９２，上述；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ.，Ｏｇｉｗａｒ
ａ，Ｈ.，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ.，Ｍｉｔｓｕｉ，Ａ.，
Ｋａｗａｂｅ，Ｔ.＆Ｙｏｄｏｉ，Ｊ.（１９９２）Ｉｎ
ｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ ４，８１１−９）及び細胞外で
機能する。細胞内での機能の１つは、タンパク質−ヌク
レオチド間相互作用を促進することが知られている。
【０００５】ＮＦ−κＢはκＬ鎖遺伝子の転写の活性化
に関与していると考えられる転写因子である。ＮＦ−κ
Ｂのｐ５０サブユニットの６２位のＣｙｓ残基をＴＲＸ
が還元することによって、ｐ５０のＤＮＡ結合活性及び
転写活性が増大することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ
ｖｉｖｏの実験によって示されていた。最近、ＮＦ−
κＢ ｐ５０から得たオリゴペプチドとＴＲＸとが直接
的な物理的結合をすることがＮＭＲによる試験管内実験
によって明らかになった。しかしながら、これらの生体
内での直接的な結合はまだ検証されていない。
に関与していると考えられる転写因子である。ＮＦ−κ
Ｂのｐ５０サブユニットの６２位のＣｙｓ残基をＴＲＸ
が還元することによって、ｐ５０のＤＮＡ結合活性及び
転写活性が増大することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ
ｖｉｖｏの実験によって示されていた。最近、ＮＦ−
κＢ ｐ５０から得たオリゴペプチドとＴＲＸとが直接
的な物理的結合をすることがＮＭＲによる試験管内実験
によって明らかになった。しかしながら、これらの生体
内での直接的な結合はまだ検証されていない。
【０００６】また、同じく転写因子の一種であるＡＰ−
１も酸化還元によって制御されるということが示唆され
ている。ＡＰ−１はニワトリ肉腫ウィルス（ｖ−ｊｕ
ｎ）の細胞内プロトタイプとしての癌原遺伝子（ｃ−ｊ
ｕｎ）の遺伝子産物であり、二量体を形成して特異的Ｄ
ＮＡ塩基配列（ＴＧＡＣＴＣＡ）に結合するほか、ある
種のｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；Ｃ
ＲＥにも結合してその転写制御活性を発現する。また、
ｆｏｓ関連遺伝子産物Ｆｏｓとロイシンジッパー構造を
介して安定な二量体を形成することにより、ＡＰ−１と
しての転写活性化能が著しく増強される（免疫学用語辞
典 第三版 多田富雄 他編、１９９３年１２月１日発
行）。当該ＡＰ−１の転写活性化能については、種々の
抗酸化剤が、そのＤＮＡ結合能及び活性化能を強く活性
化することが知られており（Ｐａｈｌ，Ｈ.Ｌ.ら (１
９９４)上述 等）、酸化還元によって制御されると考
えられている。
１も酸化還元によって制御されるということが示唆され
ている。ＡＰ−１はニワトリ肉腫ウィルス（ｖ−ｊｕ
ｎ）の細胞内プロトタイプとしての癌原遺伝子（ｃ−ｊ
ｕｎ）の遺伝子産物であり、二量体を形成して特異的Ｄ
ＮＡ塩基配列（ＴＧＡＣＴＣＡ）に結合するほか、ある
種のｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；Ｃ
ＲＥにも結合してその転写制御活性を発現する。また、
ｆｏｓ関連遺伝子産物Ｆｏｓとロイシンジッパー構造を
介して安定な二量体を形成することにより、ＡＰ−１と
しての転写活性化能が著しく増強される（免疫学用語辞
典 第三版 多田富雄 他編、１９９３年１２月１日発
行）。当該ＡＰ−１の転写活性化能については、種々の
抗酸化剤が、そのＤＮＡ結合能及び活性化能を強く活性
化することが知られており（Ｐａｈｌ，Ｈ.Ｌ.ら (１
９９４)上述 等）、酸化還元によって制御されると考
えられている。
【０００７】しかしながら、ＮＦ−κＢとは異なり、Ａ
Ｐ−１はＴＲＸの直接的な基質ではない（Ｘａｎｔｈｏ
ｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｍｉａｏ，Ｇ.，Ｗａｎｇ，Ｆ.，
Ｐａｎ，Ｙ.Ｃ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.（１９９２） Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１１，３３２３−３５）。さらにＡＰ−１
のシステインの周囲の配列は、ＮＦ−κＢとは全く異な
っている（Ｏｋｕｎｏ，Ｈ.，Ａｋａｈｏｒｉ，Ａ.，Ｓ
ａｔｏ，Ｈ.，Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｃｕｒ
ｒａｎ，Ｔ.＆Ｉｂａ，Ｈ．(１９９３) Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ ８，６９５−７０１；Ｎｇ，Ｌ.，Ｆｏｒｒｅｓ
ｔ，Ｄ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.（１９９３）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，５８３１−５８３
７）。よって、転写因子ＡＰ−１の酸化還元制御の機構
はＮＦ−κＢとは異なり、ＴＲＸ以外の分子の存在を必
要とすると考えられる。このような分子として酸化還元
因子１（以下、「Ｒｅｆ−１」という）が挙げられる
（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.
（１９９２）ＥＭＢＯ.Ｊ １１，６５３−６５；Ｘａｎ
ｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｍｉａｏ，Ｇ.Ｇ．＆Ｃｕｒ
ｒａｎ，Ｔ.(１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９１，２３−７）。Ｒｅｆ−１は
ＡＰ−１のＤＮＡ結合を回復させる因子の１つとして無
細胞系において同定されたタンパク質であり、ＡＰエン
ドヌクレアーゼと同一であることが分かっている。
Ｐ−１はＴＲＸの直接的な基質ではない（Ｘａｎｔｈｏ
ｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｍｉａｏ，Ｇ.，Ｗａｎｇ，Ｆ.，
Ｐａｎ，Ｙ.Ｃ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.（１９９２） Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１１，３３２３−３５）。さらにＡＰ−１
のシステインの周囲の配列は、ＮＦ−κＢとは全く異な
っている（Ｏｋｕｎｏ，Ｈ.，Ａｋａｈｏｒｉ，Ａ.，Ｓ
ａｔｏ，Ｈ.，Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｃｕｒ
ｒａｎ，Ｔ.＆Ｉｂａ，Ｈ．(１９９３) Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ ８，６９５−７０１；Ｎｇ，Ｌ.，Ｆｏｒｒｅｓ
ｔ，Ｄ．＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.（１９９３）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，５８３１−５８３
７）。よって、転写因子ＡＰ−１の酸化還元制御の機構
はＮＦ−κＢとは異なり、ＴＲＸ以外の分子の存在を必
要とすると考えられる。このような分子として酸化還元
因子１（以下、「Ｒｅｆ−１」という）が挙げられる
（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.＆Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ.
（１９９２）ＥＭＢＯ.Ｊ １１，６５３−６５；Ｘａｎ
ｔｈｏｕｄａｋｉｓ，Ｓ.，Ｍｉａｏ，Ｇ.Ｇ．＆Ｃｕｒ
ｒａｎ，Ｔ.(１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９１，２３−７）。Ｒｅｆ−１は
ＡＰ−１のＤＮＡ結合を回復させる因子の１つとして無
細胞系において同定されたタンパク質であり、ＡＰエン
ドヌクレアーゼと同一であることが分かっている。
【０００８】即ち、ＡＰ−１の酸化還元制御には、ＴＲ
ＸとＲｅｆ−１の２つの因子の存在が必要であることは
知られていた。しかしながら、ＡＰ−１の転写活性能促
進の詳細な機構は明らかにされておらず、ＴＲＸとＲｅ
ｆ−１とが直接的に結合するのか、それとも相互作用に
さらに別の介在因子が必要なのか等に関する報告も本発
明前にはなかった。さらに、ＴＲＸは分子内に複数のシ
ステイン残基を有するために、多量体を形成し沈殿しや
すいので取り扱いにくいという問題があった。従って、
その必要性が高かったにもかかわらず、有用なＡＰ−１
の転写活性能を増強する因子は得られていなかった。
ＸとＲｅｆ−１の２つの因子の存在が必要であることは
知られていた。しかしながら、ＡＰ−１の転写活性能促
進の詳細な機構は明らかにされておらず、ＴＲＸとＲｅ
ｆ−１とが直接的に結合するのか、それとも相互作用に
さらに別の介在因子が必要なのか等に関する報告も本発
明前にはなかった。さらに、ＴＲＸは分子内に複数のシ
ステイン残基を有するために、多量体を形成し沈殿しや
すいので取り扱いにくいという問題があった。従って、
その必要性が高かったにもかかわらず、有用なＡＰ−１
の転写活性能を増強する因子は得られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＴＲＸの有
する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙ
ｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に
置換することにより、非還元条件下において安定である
ＴＲＸを提供することを目的とする。
する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙ
ｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸残基に
置換することにより、非還元条件下において安定である
ＴＲＸを提供することを目的とする。
【００１０】本発明は、さらに前記ＴＲＸとＲｅｆ−１
とがＳ−Ｓ結合で結合させた、ＡＰ−１の転写活性能を
増強する因子を提供することを目的とする。
とがＳ−Ｓ結合で結合させた、ＡＰ−１の転写活性能を
増強する因子を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題解
決のため鋭意研究に努めた結果、ＴＲＸはＲｅｆ−１と
直接結合してＡＰ−１転写活性を促進すること、そして
前記結合にはＴＲＸ中の活性部位のＣｙｓ残基が重要で
あることを明らかにした。
決のため鋭意研究に努めた結果、ＴＲＸはＲｅｆ−１と
直接結合してＡＰ−１転写活性を促進すること、そして
前記結合にはＴＲＸ中の活性部位のＣｙｓ残基が重要で
あることを明らかにした。
【００１２】そして、活性中心となる当該Ｃｙｓ残基は
修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１つない
し全て他のアミノ酸残基に置換することにより、非還元
条件下において安定であるＴＲＸを提供した。さらに、
前記ＴＲＸをＲｅｆ−１とＳ−Ｓ結合で結合させた、Ａ
Ｐ−１の転写活性能を増強する因子の提供を可能とし
た。以下、本発明を詳細に説明する。
修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１つない
し全て他のアミノ酸残基に置換することにより、非還元
条件下において安定であるＴＲＸを提供した。さらに、
前記ＴＲＸをＲｅｆ−１とＳ−Ｓ結合で結合させた、Ａ
Ｐ−１の転写活性能を増強する因子の提供を可能とし
た。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴ
ＲＸおよび／またはＲｅｆ−１の過剰発現がＡＰ−１の
転写活性能に与える影響を調べた（実施例１）。その結
果、ＡＰ−１の転写活性誘導因子である１２−Ｏ−テト
ラデカノイル−ホルボール−１３−酢酸（ＰＭＡ）で処
理を行ったＨｅｌａ細胞において野生型ＴＲＸとＲｅｆ
−１を共発現させた場合、対照と比較し約４倍の転写活
性を示した（図２、レーン２）。野生型ＴＲＸまたはＲ
ｅｆ−１のみを発現させた場合、転写活性は対照の約
１.５−２.０倍となった（図２ レーン５および１）。
従って、ＴＲＸとＲｅｆ−１は共同してＡＰ−１の活性
を促進すると考えられる。
ＲＸおよび／またはＲｅｆ−１の過剰発現がＡＰ−１の
転写活性能に与える影響を調べた（実施例１）。その結
果、ＡＰ−１の転写活性誘導因子である１２−Ｏ−テト
ラデカノイル−ホルボール−１３−酢酸（ＰＭＡ）で処
理を行ったＨｅｌａ細胞において野生型ＴＲＸとＲｅｆ
−１を共発現させた場合、対照と比較し約４倍の転写活
性を示した（図２、レーン２）。野生型ＴＲＸまたはＲ
ｅｆ−１のみを発現させた場合、転写活性は対照の約
１.５−２.０倍となった（図２ レーン５および１）。
従って、ＴＲＸとＲｅｆ−１は共同してＡＰ−１の活性
を促進すると考えられる。
【００１４】このことは、ＴＲＸおよびＲｅｆ−１の細
胞内局在性によっても裏付けられる。細胞を転写活性誘
導因子、例えばＰＭＡで処理する場合、ＴＲＸは処理前
には細胞質内に存在するが、処理後は核内に移動する。
そして、Ｒｅｆ−１は処理の前後共に核内に存在する
（実施例２）。従って、細胞を転写活性誘導因子で処理
を行うとＴＲＸとＲｅｆ−１は共に核内に局在する。
胞内局在性によっても裏付けられる。細胞を転写活性誘
導因子、例えばＰＭＡで処理する場合、ＴＲＸは処理前
には細胞質内に存在するが、処理後は核内に移動する。
そして、Ｒｅｆ−１は処理の前後共に核内に存在する
（実施例２）。従って、細胞を転写活性誘導因子で処理
を行うとＴＲＸとＲｅｆ−１は共に核内に局在する。
【００１５】さらに、本発明者らはＡＰ−１の転写活性
促進に際し、ＴＲＸとＲｅｆ−１とが直接に結合してい
るのか、あるいは何らかの介在因子の存在が必要である
のかを調べた。ＴＲＸタンパク質は、その分子内に数個
のシステイン残基を有する。例えば、図１に示すように
ヒトＴＲＸの場合、３２位、３５位、６２位、６９位お
よび７３位の５箇所にシステイン残基がある。このう
ち、３２位と３５位の２つのシステインを有する部位−
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が酸化還元活性部位
であることが知られている（Ｌａｕｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.
ら，１９６４ 上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ． Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ 上述；Ｈｏｌ
ｍｇｒｅｎ，Ａ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９８
９ 上述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら １９９４
上述）。本発明者らは、これらのシステイン残基を変異
させたＴＲＸ突然変異体を作成し、Ｃｙｓ酸化によって
−ＳＨ基を−Ｓ−Ｓ−結合に変える架橋試薬を用いてＴ
ＲＸとＲｅｆ−１とは直接に結合していること、さらに
ＴＲＸとＲｅｆ−１との結合には特に活性部位のＣｙｓ
３２残基が関与していることを明らかにした。
促進に際し、ＴＲＸとＲｅｆ−１とが直接に結合してい
るのか、あるいは何らかの介在因子の存在が必要である
のかを調べた。ＴＲＸタンパク質は、その分子内に数個
のシステイン残基を有する。例えば、図１に示すように
ヒトＴＲＸの場合、３２位、３５位、６２位、６９位お
よび７３位の５箇所にシステイン残基がある。このう
ち、３２位と３５位の２つのシステインを有する部位−
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が酸化還元活性部位
であることが知られている（Ｌａｕｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.
ら，１９６４ 上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ． Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ 上述；Ｈｏｌ
ｍｇｒｅｎ，Ａ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９８
９ 上述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら １９９４
上述）。本発明者らは、これらのシステイン残基を変異
させたＴＲＸ突然変異体を作成し、Ｃｙｓ酸化によって
−ＳＨ基を−Ｓ−Ｓ−結合に変える架橋試薬を用いてＴ
ＲＸとＲｅｆ−１とは直接に結合していること、さらに
ＴＲＸとＲｅｆ−１との結合には特に活性部位のＣｙｓ
３２残基が関与していることを明らかにした。
【００１６】具体的には、野生型のＴＲＸとＲｅｆ−１
とを酸化条件下で混合すると、野生型ＴＲＸ−Ｒｅｆ−
１複合体を形成し、ＴＲＸとＲｅｆ−１の合計分子量で
ある約５０ｋＤａに野生型ＴＲＸ抗体およびＲｅｆ−１
抗体で反応するバンドが生じる。さらに、ＴＲＸの突然
変異体として、ＴＲＸC35A（ヒトＴＲＸの３５位のシス
テイン残基をアラニンに変換させたもの）、ＴＲＸ
C32S/C35S（ヒトＴＲＸの３２および３５位のシステイ
ン残基をセリンに変換させたもの）、並びにＴＲＸ
C62S/C69S/C73S（ヒトＴＲＸの６２、６９および７３位
のシステイン残基をセリンに変換させたもの）を作成し
て、これらの突然変異体とＲｅｆ−１との結合を調べた
（実施例３）。ＴＲＸC35AおよびＴＲＸC62S/C69S/C73S
は野生型の場合と同様にＲｅｆ−１に結合した（図４
レーン４および８）。しかしながら、ＴＲＸC32S/C35S
の場合Ｒｅｆ−１との結合体は形成されなかった（図４
レーン６）。
とを酸化条件下で混合すると、野生型ＴＲＸ−Ｒｅｆ−
１複合体を形成し、ＴＲＸとＲｅｆ−１の合計分子量で
ある約５０ｋＤａに野生型ＴＲＸ抗体およびＲｅｆ−１
抗体で反応するバンドが生じる。さらに、ＴＲＸの突然
変異体として、ＴＲＸC35A（ヒトＴＲＸの３５位のシス
テイン残基をアラニンに変換させたもの）、ＴＲＸ
C32S/C35S（ヒトＴＲＸの３２および３５位のシステイ
ン残基をセリンに変換させたもの）、並びにＴＲＸ
C62S/C69S/C73S（ヒトＴＲＸの６２、６９および７３位
のシステイン残基をセリンに変換させたもの）を作成し
て、これらの突然変異体とＲｅｆ−１との結合を調べた
（実施例３）。ＴＲＸC35AおよびＴＲＸC62S/C69S/C73S
は野生型の場合と同様にＲｅｆ−１に結合した（図４
レーン４および８）。しかしながら、ＴＲＸC32S/C35S
の場合Ｒｅｆ−１との結合体は形成されなかった（図４
レーン６）。
【００１７】これらのことから、ＴＲＸはＲｅｆ−１と
直接的に結合することでＡＰ−１の転写活性を制御する
こと、即ち、ＴＲＸはＲｅｆ−１のプロトン供与体の１
つであることが明らかにされた。さらに、ＴＲＸとＲｅ
ｆ−１の結合には、ＴＲＸの活性中心を構成するＣｙｓ
３２およびＣｙｓ３５、特にＣｙｓ３２が関与している
ことがわかった。
直接的に結合することでＡＰ−１の転写活性を制御する
こと、即ち、ＴＲＸはＲｅｆ−１のプロトン供与体の１
つであることが明らかにされた。さらに、ＴＲＸとＲｅ
ｆ−１の結合には、ＴＲＸの活性中心を構成するＣｙｓ
３２およびＣｙｓ３５、特にＣｙｓ３２が関与している
ことがわかった。
【００１８】さらに本発明者らは、哺乳類ツーハイブリ
ッド法を利用してｉｎ ｖｉｖｏでのＴＲＸとＲｅｆ−
１との結合を検出することに成功した（実施例４）。ツ
ーハイブリッド検定法でレポーター遺伝子の発現が検出
されれば、２つの融合タンパク質は生きた細胞の核内で
互いに結合していることが示唆される。より具体的に
は、野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１を共発現させた場合、レ
ポーター遺伝子の発現はコントロールの１０倍に上昇し
た（図６ レーン５および６）。ＴＲＸC62S/C69 S/C73S
の場合も野生型とほぼ同程度にレポーター遺伝子が発現
した。それに対し、ＴＲＸC35Aでは、レポーター遺伝子
の発現は野生型の場合の半分弱になり（図７ レーン
４）、ＴＲＸC32S/C35Sでは発現は誘導されなかった
（レーン３）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＴＲ
ＸとＲｅｆ−１は、ＴＲＸの活性中心であるＣｙｓ３２
およびＣｙｓ３５、特にＣｙｓ３２を介して結合してい
ることが本発明により明らかにされた。
ッド法を利用してｉｎ ｖｉｖｏでのＴＲＸとＲｅｆ−
１との結合を検出することに成功した（実施例４）。ツ
ーハイブリッド検定法でレポーター遺伝子の発現が検出
されれば、２つの融合タンパク質は生きた細胞の核内で
互いに結合していることが示唆される。より具体的に
は、野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１を共発現させた場合、レ
ポーター遺伝子の発現はコントロールの１０倍に上昇し
た（図６ レーン５および６）。ＴＲＸC62S/C69 S/C73S
の場合も野生型とほぼ同程度にレポーター遺伝子が発現
した。それに対し、ＴＲＸC35Aでは、レポーター遺伝子
の発現は野生型の場合の半分弱になり（図７ レーン
４）、ＴＲＸC32S/C35Sでは発現は誘導されなかった
（レーン３）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＴＲ
ＸとＲｅｆ−１は、ＴＲＸの活性中心であるＣｙｓ３２
およびＣｙｓ３５、特にＣｙｓ３２を介して結合してい
ることが本発明により明らかにされた。
【００１９】また、出願人はＴＲＸのＣ末端を欠失させ
たＴＲＸ△８７（ヒトＴＲＸの８８位−１０４位を欠失
したもの）変異体を作成し、上述した哺乳類ツーハイブ
リッド法によりＲｅｆ−１との結合を調べた。その結
果、ＣＯＯＨ末端を欠いたＴＲＸ変異体及びＲｅｆ−１
融合構築物を同時発現させても、レポーター遺伝子の顕
著な誘導は観察されなかった（図７ レーン６）。この
結果は、ＴＲＸの還元活性とＴＲＸのＲｅｆ−１との相
互作用にＴＲＸのＣＯＯＨ末端が不可欠であることを示
唆している。
たＴＲＸ△８７（ヒトＴＲＸの８８位−１０４位を欠失
したもの）変異体を作成し、上述した哺乳類ツーハイブ
リッド法によりＲｅｆ−１との結合を調べた。その結
果、ＣＯＯＨ末端を欠いたＴＲＸ変異体及びＲｅｆ−１
融合構築物を同時発現させても、レポーター遺伝子の顕
著な誘導は観察されなかった（図７ レーン６）。この
結果は、ＴＲＸの還元活性とＴＲＸのＲｅｆ−１との相
互作用にＴＲＸのＣＯＯＨ末端が不可欠であることを示
唆している。
【００２０】以上に記載したとおり、ＴＲＸとＲｅｆ−
１は直接結合してＡＰ−１の転写活性能力を促進するこ
と、さらに、当該結合にはＴＲＸの活性部位のＣｙｓ残
基、例えばヒトＴＲＸではＣｙｓ３２およびＣｙｓ３
５、特にＣｙｓ３２が必要であることが初めて明らかに
された。これらのＴＲＸの活性中心であり、かつＲｅｆ
−１との直接結合に関与するＣｙｓ残基を保存し、その
他のＣｙｓ残基を他のアミノ酸残基に置換すれば、非還
元条件下においてＲｅｆ−１と結合し、かつ、不必要な
Ｓ−Ｓ結合をせず多量体を形成しない安定なＴＲＸを得
ることができる。よって、本発明のＴＲＸ改変体はＴＲ
Ｘの有する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外
のＣｙｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸
残基に置換することにより、非還元条件下において安定
であることを特徴とする。
１は直接結合してＡＰ−１の転写活性能力を促進するこ
と、さらに、当該結合にはＴＲＸの活性部位のＣｙｓ残
基、例えばヒトＴＲＸではＣｙｓ３２およびＣｙｓ３
５、特にＣｙｓ３２が必要であることが初めて明らかに
された。これらのＴＲＸの活性中心であり、かつＲｅｆ
−１との直接結合に関与するＣｙｓ残基を保存し、その
他のＣｙｓ残基を他のアミノ酸残基に置換すれば、非還
元条件下においてＲｅｆ−１と結合し、かつ、不必要な
Ｓ−Ｓ結合をせず多量体を形成しない安定なＴＲＸを得
ることができる。よって、本発明のＴＲＸ改変体はＴＲ
Ｘの有する活性中心のＣｙｓ残基は修飾せず、それ以外
のＣｙｓ残基を少なくとも１つないし全て他のアミノ酸
残基に置換することにより、非還元条件下において安定
であることを特徴とする。
【００２１】活性および結合に必要なＣｙｓ残基は、例
えばヒトのＴＲＸでは３２位と３５位のＣｙｓ残基であ
る。当業者は本明細書の記載に基づいて、ヒト以外のＴ
ＲＸについても、その活性および結合に必要なＣｙｓ残
基を容易に判断することができる。
えばヒトのＴＲＸでは３２位と３５位のＣｙｓ残基であ
る。当業者は本明細書の記載に基づいて、ヒト以外のＴ
ＲＸについても、その活性および結合に必要なＣｙｓ残
基を容易に判断することができる。
【００２２】本発明のＴＲＸの改変体は慣用された遺伝
子工学技術によって得ることができる。例えば、ＴＲＸ
のアミノ配列および塩基配列は公知であり、複数の文献
にも記載されているので（Ｌａｕｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.ら，
１９６４ 上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ． Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ 上述；Ｈｏｌｍｇｒ
ｅｎ，Ａ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９８９ 上
述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら １９９４ 上
述）、これらの文献に基づき、適切なｃＤＮＡライブラ
リーから天然のＴＲＸをコードするｃＤＮＡを得ること
ができる。これに例えば、周知技術である部位特異的変
異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈ， Ｖｏｌ.１０， Ｎｏ.２０，ｐ．６４８７−
６５００，１９８２）を施すことにより、本発明の改変
体を得ることができる。
子工学技術によって得ることができる。例えば、ＴＲＸ
のアミノ配列および塩基配列は公知であり、複数の文献
にも記載されているので（Ｌａｕｒｅｎｔ,Ｔ.Ｃ.ら，
１９６４ 上述；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ． Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ 上述；Ｈｏｌｍｇｒ
ｅｎ，Ａ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９８９ 上
述；Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．ら １９９４ 上
述）、これらの文献に基づき、適切なｃＤＮＡライブラ
リーから天然のＴＲＸをコードするｃＤＮＡを得ること
ができる。これに例えば、周知技術である部位特異的変
異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈ， Ｖｏｌ.１０， Ｎｏ.２０，ｐ．６４８７−
６５００，１９８２）を施すことにより、本発明の改変
体を得ることができる。
【００２３】部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の
変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本
鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＤ
ＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の
培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細
胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５
０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージ
を含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望
の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブ
リダイズするが、元の鎖を有する不一致のものとはハイ
ブリダイズしない温度において、得られたプラークをラ
ジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブ
リダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズする
プローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本
鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＤ
ＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の
培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細
胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５
０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージ
を含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望
の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブ
リダイズするが、元の鎖を有する不一致のものとはハイ
ブリダイズしない温度において、得られたプラークをラ
ジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブ
リダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズする
プローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００２４】本発明のＴＲＸ改変体は活性中心のＣｙｓ
残基は置換せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１
つないし全て他のアミノ酸残基に置換することを特徴と
する。従って、それ以外のアミノ酸残基について天然の
ＴＲＸのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が欠
失、付加、または置換された場合であっても、ＴＲＸの
ＡＰ−１生理活性促進能、およびＲｅｆ−１への結合能
力を有するものであれば、本発明の範囲に含まれること
は明らかである。これらのアミノ酸が欠失、付加、また
は置換は、例えば、上述した部位特異的変異誘発法によ
って行うことができる。
残基は置換せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも１
つないし全て他のアミノ酸残基に置換することを特徴と
する。従って、それ以外のアミノ酸残基について天然の
ＴＲＸのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が欠
失、付加、または置換された場合であっても、ＴＲＸの
ＡＰ−１生理活性促進能、およびＲｅｆ−１への結合能
力を有するものであれば、本発明の範囲に含まれること
は明らかである。これらのアミノ酸が欠失、付加、また
は置換は、例えば、上述した部位特異的変異誘発法によ
って行うことができる。
【００２５】本発明はさらに上述したＴＲＸ改変体とＲ
ｅｆ−１とがＳ−Ｓで結合してなるＡＰ−１転写活性促
進因子を提供する。本発明のＡＰ−１転写活性促進因子
中のＴＲＸ改変体は、活性部位以外のＣｙｓ残基はＳ−
Ｓ結合を形成しないように他のアミノ酸残基に置換され
てるため、多量体を形成せず非還元条件下で安定であ
る。
ｅｆ−１とがＳ−Ｓで結合してなるＡＰ−１転写活性促
進因子を提供する。本発明のＡＰ−１転写活性促進因子
中のＴＲＸ改変体は、活性部位以外のＣｙｓ残基はＳ−
Ｓ結合を形成しないように他のアミノ酸残基に置換され
てるため、多量体を形成せず非還元条件下で安定であ
る。
【００２６】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２７】
【実施例】後述する実施例では、以下の材料および方法
を採用した。
を採用した。
【００２８】細胞及び細胞培養 １０％ウシ胎児血清及び抗生物質を加えたＤＭＥＭ（Ｇ
ｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＵＳＡ）
中で、湿度９５％、空気中ＣＯ２濃度５％、３７℃の条
件でＨｅｌａ細胞及びＣＯＳ７細胞を培養した。
ｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＵＳＡ）
中で、湿度９５％、空気中ＣＯ２濃度５％、３７℃の条
件でＨｅｌａ細胞及びＣＯＳ７細胞を培養した。
【００２９】試薬 １２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−１３−酢酸
（ＰＭＡ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃ
ｏ.，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。抗ＴＲ
Ｘ単クローン抗体、１１−ｍＡｂ及び２１−ｍＡｂは、
ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＩｎｃ.， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａ
ｎによって製造され、提供された。抗Ｒｅｆ−１ポリク
ローン抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｔｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＩｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡか
ら購入した。
（ＰＭＡ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃ
ｏ.，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。抗ＴＲ
Ｘ単クローン抗体、１１−ｍＡｂ及び２１−ｍＡｂは、
ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＩｎｃ.， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａ
ｎによって製造され、提供された。抗Ｒｅｆ−１ポリク
ローン抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｔｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＩｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡか
ら購入した。
【００３０】ＴＲＸの突然変異誘発及びトランスフェク
ション ヒトＴＲＸの突然変異誘発はＰＣＲに基づく方法で行
い、配列が正しいことをＤＮＡシークエンスによって確
認した（図１）。発現プラスミドの細胞への導入は、リ
ポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）によって、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ
（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて製造社の手引に従って
行った。
ション ヒトＴＲＸの突然変異誘発はＰＣＲに基づく方法で行
い、配列が正しいことをＤＮＡシークエンスによって確
認した（図１）。発現プラスミドの細胞への導入は、リ
ポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）によって、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ
（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて製造社の手引に従って
行った。
【００３１】−７３／＋６３ Ｃｏｌ（ヒト コラゲナー
ゼ Ｉ）−ＬＵＣを用いたルシフェラーゼ検定 ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＢＬＣ
ＡＴ３に入った−７３／＋６３ Ｃｏｌ（Ａｎｇｅｌ，
Ｐ.，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｉ.，Ｓｔｅｉｎ，Ｂ.，Ｄｅｌ
ｉｕｓ，Ｈ．，Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ，Ｈ.Ｊ．＆Ｈｅｒ
ｒｌｉｃｈ，Ｐ．（１９８７） Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．７，２２５６−２２６６）から−７３／＋６３
Ｃｏｌ−ＬＵＣを作製した。Ｈｅｌａ細胞を６穴プレー
トに１穴当たり４×１０５細胞になるようにまいた。発
現プラスミドを、リポフェクトアミン試薬を用いて細胞
に導入した。それぞれの導入に当たっては、１μｇの野
生型ｐＣＤＳＲα−ＴＲＸまたは−ＴＲＸC32S/C35S発
現プラスミド（Ｔａｇａｙａ，Ｙ.，Ｍａｅｄａ，Ｙ.，
Ｍｉｔｕｉ，Ａ.，Ｋｏｎｄｏ，Ｎ.，Ｍａｓｕｔａｎ
ｉ，Ｈ.，Ｍａｍｕｒｏ，Ｊ.，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ.，Ａｒ
ａｉ，Ｋ.，Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ.，Ｗａｋａｓｕｇｉ，
Ｈ．＆Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．
８，７５７−７６４）、及び／または１μｇのｐＲＣ／
ＣＭＶ−Ｒｅｆ−１発現ベクターを、１μｇの−７３／
＋６３ Ｃｏｌ−ＬＵＣと共に用いた。ＤＮＡの全量
は、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えて３μｇになるように調整し
た。１６時間培養した後、ＰＭＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）を
加え、細胞を２４時間培養した。３０時間後に細胞を回
収し、市販の検定法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ）を用いて、蛍光光度計でルシフェラーゼ活性
を決定した。誘導されたルシフェラーゼ活性の相対比を
計算した。
ゼ Ｉ）−ＬＵＣを用いたルシフェラーゼ検定 ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＢＬＣ
ＡＴ３に入った−７３／＋６３ Ｃｏｌ（Ａｎｇｅｌ，
Ｐ.，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｉ.，Ｓｔｅｉｎ，Ｂ.，Ｄｅｌ
ｉｕｓ，Ｈ．，Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ，Ｈ.Ｊ．＆Ｈｅｒ
ｒｌｉｃｈ，Ｐ．（１９８７） Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．７，２２５６−２２６６）から−７３／＋６３
Ｃｏｌ−ＬＵＣを作製した。Ｈｅｌａ細胞を６穴プレー
トに１穴当たり４×１０５細胞になるようにまいた。発
現プラスミドを、リポフェクトアミン試薬を用いて細胞
に導入した。それぞれの導入に当たっては、１μｇの野
生型ｐＣＤＳＲα−ＴＲＸまたは−ＴＲＸC32S/C35S発
現プラスミド（Ｔａｇａｙａ，Ｙ.，Ｍａｅｄａ，Ｙ.，
Ｍｉｔｕｉ，Ａ.，Ｋｏｎｄｏ，Ｎ.，Ｍａｓｕｔａｎ
ｉ，Ｈ.，Ｍａｍｕｒｏ，Ｊ.，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ.，Ａｒ
ａｉ，Ｋ.，Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ.，Ｗａｋａｓｕｇｉ，
Ｈ．＆Ｙｏｄｏｉ，Ｊ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．
８，７５７−７６４）、及び／または１μｇのｐＲＣ／
ＣＭＶ−Ｒｅｆ−１発現ベクターを、１μｇの−７３／
＋６３ Ｃｏｌ−ＬＵＣと共に用いた。ＤＮＡの全量
は、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えて３μｇになるように調整し
た。１６時間培養した後、ＰＭＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）を
加え、細胞を２４時間培養した。３０時間後に細胞を回
収し、市販の検定法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ）を用いて、蛍光光度計でルシフェラーゼ活性
を決定した。誘導されたルシフェラーゼ活性の相対比を
計算した。
【００３２】組み換えタンパク質の細菌内での発現 ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）標識と融合した種々の
ＴＲＸ組み換えタンパク質を、ｐＱＥ３０発現プラスミ
ド（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用
いて大腸菌内で発現させた。大腸菌株のＭ１５［ｐＲｅ
ｐ４］にそれぞれのｐＱＥ−ＴＲＸ発現ベクターを形質
転換した。Ａ６００が０．７になるまで大腸菌を３７℃
で激しく振とう培養し、１ｍＭＩＰＴＧで３時間処理し
た。ペレットにした細胞を１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、５０μＭ ＴＬＣＫ、及び０．８ｍＭイミダゾール
を含むＰＢＳ（−）中で溶解させ、超音波処理して破砕
した。溶解液を遠心して不純物を除いた。６×Ｈｉｓ−
ＴＲＸを含む粗製溶解液をＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカ
ラムに通した。カラムを洗い、８０ｍＭイミダゾールを
含むＰＢＳで融合タンパク質を溶出させた。溶出したタ
ンパク質を２ｍＭＤＴＴを含むＰＢＳに対して透析し
た。ヒトＲｅｆ−１は、６×Ｈｉｓ標識タンパク質とし
て、ｐＤＳ５６ｒｅｆ−１（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉ
ｓ，Ｓ.ら、１９９４、上述）（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋ
ｉｓ，Ｓ．より供与）によって発現させた。ここでは、
Ｒｅｆ−１溶出液を保存用緩衝液［５０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７.３／５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２／１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グ
リセロール］に対して透析した以外は、ＴＲＸと同じ方
法に従った。
ＴＲＸ組み換えタンパク質を、ｐＱＥ３０発現プラスミ
ド（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用
いて大腸菌内で発現させた。大腸菌株のＭ１５［ｐＲｅ
ｐ４］にそれぞれのｐＱＥ−ＴＲＸ発現ベクターを形質
転換した。Ａ６００が０．７になるまで大腸菌を３７℃
で激しく振とう培養し、１ｍＭＩＰＴＧで３時間処理し
た。ペレットにした細胞を１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、５０μＭ ＴＬＣＫ、及び０．８ｍＭイミダゾール
を含むＰＢＳ（−）中で溶解させ、超音波処理して破砕
した。溶解液を遠心して不純物を除いた。６×Ｈｉｓ−
ＴＲＸを含む粗製溶解液をＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカ
ラムに通した。カラムを洗い、８０ｍＭイミダゾールを
含むＰＢＳで融合タンパク質を溶出させた。溶出したタ
ンパク質を２ｍＭＤＴＴを含むＰＢＳに対して透析し
た。ヒトＲｅｆ−１は、６×Ｈｉｓ標識タンパク質とし
て、ｐＤＳ５６ｒｅｆ−１（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉ
ｓ，Ｓ.ら、１９９４、上述）（Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋ
ｉｓ，Ｓ．より供与）によって発現させた。ここでは、
Ｒｅｆ−１溶出液を保存用緩衝液［５０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７.３／５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２／１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グ
リセロール］に対して透析した以外は、ＴＲＸと同じ方
法に従った。
【００３３】試験管内ジスルフィド架橋相互作用検定 ６×Ｈｉｓ−ＴＲＸ（２００ｎｇ）及び６×Ｈｉｓ−Ｒ
ｅｆ−１（２００ｎｇ）を、１ｍＭＤＴＴと室温（Ｒ
Ｔ）で３０分間保温した。保温した後、２−ＭＥ（１
％）を含む分離緩衝液または含まない分離緩衝液中で反
応混合液を９０℃５分間おいて変性させた。それぞれの
複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤ
Ｆ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に
転写させた後、膜をブロッキングし、抗体を加えて反応
させ、次にペルオキシダーゼの付加した抗マウスＩｇＧ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で
反応させた。膜上の抗原を、ＥＣＬ ウエスタンブロッ
ト検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
ｅｆ−１（２００ｎｇ）を、１ｍＭＤＴＴと室温（Ｒ
Ｔ）で３０分間保温した。保温した後、２−ＭＥ（１
％）を含む分離緩衝液または含まない分離緩衝液中で反
応混合液を９０℃５分間おいて変性させた。それぞれの
複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤ
Ｆ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に
転写させた後、膜をブロッキングし、抗体を加えて反応
させ、次にペルオキシダーゼの付加した抗マウスＩｇＧ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で
反応させた。膜上の抗原を、ＥＣＬ ウエスタンブロッ
ト検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
【００３４】間接蛍光抗体細胞染色 細胞を３.７％パラホルムアルデヒドと１０％ウシ胎児
血清を含むＰＢＳ中で室温（ＲＴ）に２０分間おいてス
ライドに固定化し、続いて（０.２％Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて１０分間の透過
化処理を行った。一次抗体（ＴＲＸに対しては単クロー
ン性１１−ｍＡｂまたは２１−ｍＡｂ、Ｒｅｆ−１に対
しては前述のポリクローン抗体）と室温で１時間反応さ
せ、スライドを二次抗体（ＴＲＸに対してはＦＩＴＣ結
合抗マウスヒツジＩｇＧ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．)、Ｒｅｆ−１に対しては
ＴＲＩＴＣ結合抗ウサギヤギＩｇＧ(Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ＣＯ．)）と１時間反応させた。染色し
た細胞のスライドに、１ｍｇ／ｍｌ ｐ−フェニレンジ
アミンを含む９０％グリセロールを載せ、共焦点顕微鏡
ＭＲＣ６００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂ．，Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ，ＣＡ）を用いて細胞を観察した。
血清を含むＰＢＳ中で室温（ＲＴ）に２０分間おいてス
ライドに固定化し、続いて（０.２％Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて１０分間の透過
化処理を行った。一次抗体（ＴＲＸに対しては単クロー
ン性１１−ｍＡｂまたは２１−ｍＡｂ、Ｒｅｆ−１に対
しては前述のポリクローン抗体）と室温で１時間反応さ
せ、スライドを二次抗体（ＴＲＸに対してはＦＩＴＣ結
合抗マウスヒツジＩｇＧ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．)、Ｒｅｆ−１に対しては
ＴＲＩＴＣ結合抗ウサギヤギＩｇＧ(Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ＣＯ．)）と１時間反応させた。染色し
た細胞のスライドに、１ｍｇ／ｍｌ ｐ−フェニレンジ
アミンを含む９０％グリセロールを載せ、共焦点顕微鏡
ＭＲＣ６００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂ．，Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ，ＣＡ）を用いて細胞を観察した。
【００３５】哺乳類ツーハイブリッド検定 哺乳類ツーハイブリッド検定は、Ｎｅｒｌｏｖ,Ｃ．＆
Ｚｉｆｆ，Ｅ.Ｂ.（１９９５） ＥＭＢＯ Ｊ．１４，
４３１８−４３２８に記載された方法に従って行った。
ＴＲＸ、その変異型、またはＲｅｆ−１のｃＤＮＡを、
ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．＆Ｐｔａ
ｓｈｎｅ，Ｍ．(１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１７，７５３９）またはｐＣＭＸ−ＶＰ１６
（Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｔ.，Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，
Ｐ．Ｎ.，Ｕｍｅｓｏｎｏ，Ｋ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｒ.Ｍ．
(１９９３) Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
７，１４１１−１４２２）（Ｕｍｅｓｏｎｏ，Ｋ．から
供与）と読み枠が合うように融合させた。１穴当たり２
×１０５細胞になるようにＣＯＳ７細胞を６穴プレート
にまいた。リポフェクトアミン試薬によって、発現プラ
スミドを細胞に導入した。それぞれのトランスフェクシ
ョンに際しては、１μｇのレポーター構築物ｐｔｋ−Ｇ
ＡＬｐｘ３−ＬＵＣ（Ｋ．Ｕ．供与）及び内部対照とし
ての１μｇのβ−ｇａｌ発現構築物と、１μｇのＧＡＬ
４融合プラスミド及び１μｇのＶＰ１６融合プラスミド
を同時に用いた。ｐｔｋ−ＧＡＬｐｘ３−ＬＵＣには、
チミジンキナーゼ最小プロモーターの前に３コピーのＧ
ＡＬ４結合部位が存在する。３０時間後に細胞を回収
し、ルシフェラーゼ活性を決定した。β−ｇａｌ活性で
標準化することによって、ルシフェラーゼの誘導の相対
比を算出した。
Ｚｉｆｆ，Ｅ.Ｂ.（１９９５） ＥＭＢＯ Ｊ．１４，
４３１８−４３２８に記載された方法に従って行った。
ＴＲＸ、その変異型、またはＲｅｆ−１のｃＤＮＡを、
ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．＆Ｐｔａ
ｓｈｎｅ，Ｍ．(１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１７，７５３９）またはｐＣＭＸ−ＶＰ１６
（Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｔ.，Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，
Ｐ．Ｎ.，Ｕｍｅｓｏｎｏ，Ｋ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｒ.Ｍ．
(１９９３) Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
７，１４１１−１４２２）（Ｕｍｅｓｏｎｏ，Ｋ．から
供与）と読み枠が合うように融合させた。１穴当たり２
×１０５細胞になるようにＣＯＳ７細胞を６穴プレート
にまいた。リポフェクトアミン試薬によって、発現プラ
スミドを細胞に導入した。それぞれのトランスフェクシ
ョンに際しては、１μｇのレポーター構築物ｐｔｋ−Ｇ
ＡＬｐｘ３−ＬＵＣ（Ｋ．Ｕ．供与）及び内部対照とし
ての１μｇのβ−ｇａｌ発現構築物と、１μｇのＧＡＬ
４融合プラスミド及び１μｇのＶＰ１６融合プラスミド
を同時に用いた。ｐｔｋ−ＧＡＬｐｘ３−ＬＵＣには、
チミジンキナーゼ最小プロモーターの前に３コピーのＧ
ＡＬ４結合部位が存在する。３０時間後に細胞を回収
し、ルシフェラーゼ活性を決定した。β−ｇａｌ活性で
標準化することによって、ルシフェラーゼの誘導の相対
比を算出した。
【００３６】実施例１ ＰＭＡ刺激したＨｅｌａ細胞でのＴＲＸ及び／またはＲ
ｅｆ−１の発現 生体内でＴＲＸ及び／またはＲｅｆ−１を過剰発現する
結果ＡＰ−１の転写が活性化されるかどうかを観察し
た。ＡＰ−１結合部位を持つヒト コラゲナーゼＩのプ
ロモーターの活性を、ルシフェラーゼ活性を決定するこ
とで検定した。
ｅｆ−１の発現 生体内でＴＲＸ及び／またはＲｅｆ−１を過剰発現する
結果ＡＰ−１の転写が活性化されるかどうかを観察し
た。ＡＰ−１結合部位を持つヒト コラゲナーゼＩのプ
ロモーターの活性を、ルシフェラーゼ活性を決定するこ
とで検定した。
【００３７】それぞれの形質転換に際して、１μｇのｐ
ＣＤＳＲα−野生型ＴＲＸ（図２レーン２、４）または
−ＴＲＸC32S/C35S（レーン３、６）発現プラスミド及
び／または１μｇのｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｒｅｆ−１（レー
ン１、２、３）発現ベクターと、１μｇの−７３／＋６
３ Ｃｏｌ−ＬＵＣを用いた。ＤＮＡの全量は、ｐＲＣ
／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）を加えて３μｇになるように調整した。１６
時間培養した後、ＰＭＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）を加えて細
胞を２４時間培養した。３０時間後に細胞を回収し、ル
シフェラーゼ活性を決定した。
ＣＤＳＲα−野生型ＴＲＸ（図２レーン２、４）または
−ＴＲＸC32S/C35S（レーン３、６）発現プラスミド及
び／または１μｇのｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｒｅｆ−１（レー
ン１、２、３）発現ベクターと、１μｇの−７３／＋６
３ Ｃｏｌ−ＬＵＣを用いた。ＤＮＡの全量は、ｐＲＣ
／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）を加えて３μｇになるように調整した。１６
時間培養した後、ＰＭＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）を加えて細
胞を２４時間培養した。３０時間後に細胞を回収し、ル
シフェラーゼ活性を決定した。
【００３８】結果を図２に示す。結果は３つの実験（そ
れぞれ２回行った）の平均であり、ルシフェラーゼ活性
の相対比を、レーン４のＰＭＡ未処理（ＰＭＡ−）を１
として示す。
れぞれ２回行った）の平均であり、ルシフェラーゼ活性
の相対比を、レーン４のＰＭＡ未処理（ＰＭＡ−）を１
として示す。
【００３９】ＰＭＡ処理したＨｅｌａ細胞内で一時的に
野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１（図２レーン２）を同時発現
させると、偽トランスフェクション（レーン４）に比べ
てルシフェラーゼ活性が４倍に上昇した。野生型ＴＲＸ
（レーン５）またはＲｅｆ−１（レーン１）の１つのみ
を発現させると、それぞれ１．５倍または２倍の活性化
が起こった。還元活性を欠くＴＲＸC32S/C35Sを発現さ
せても、誘導は微少であった（レーン６）。
野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１（図２レーン２）を同時発現
させると、偽トランスフェクション（レーン４）に比べ
てルシフェラーゼ活性が４倍に上昇した。野生型ＴＲＸ
（レーン５）またはＲｅｆ−１（レーン１）の１つのみ
を発現させると、それぞれ１．５倍または２倍の活性化
が起こった。還元活性を欠くＴＲＸC32S/C35Sを発現さ
せても、誘導は微少であった（レーン６）。
【００４０】以上、過剰発現したＴＲＸ及びＲｅｆ−１
は、ＡＰ−１の転写活性を共同的に高める。
は、ＡＰ−１の転写活性を共同的に高める。
【００４１】実施例２ ＰＭＡ処理によるＴＲＸの細胞内局在の移行 細胞内でのＴＲＸ及びＲｅｆ−１の局在を観察した。Ｔ
ＲＸまたはＲｅｆ−１に対する抗体を用いた間接蛍光法
によってＡＰ−１の転写の活性化が誘導されたＨｅｌａ
細胞を、ＰＭＡ処理した状態、またはＰＭＡ処理しない
状態で解析した（Ｍｅｙｅｒ，Ｍ.，Ｓｃｈｒｅｃｋ，
Ｒ.＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ.Ａ．（１９９３） ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．１２，２００５−２０１５）。Ｒｅｆ−１は核
内に局在し、ＰＭＡ刺激の後も核に留まる。対照的に、
ＴＲＸはＰＭＡ刺激前は主に細胞質に局在し、ＰＭＡ処
理によって効率的に核に移行し、この過程は２４時間以
内にほとんど完了した（データ示さず）。
ＲＸまたはＲｅｆ−１に対する抗体を用いた間接蛍光法
によってＡＰ−１の転写の活性化が誘導されたＨｅｌａ
細胞を、ＰＭＡ処理した状態、またはＰＭＡ処理しない
状態で解析した（Ｍｅｙｅｒ，Ｍ.，Ｓｃｈｒｅｃｋ，
Ｒ.＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ.Ａ．（１９９３） ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．１２，２００５−２０１５）。Ｒｅｆ−１は核
内に局在し、ＰＭＡ刺激の後も核に留まる。対照的に、
ＴＲＸはＰＭＡ刺激前は主に細胞質に局在し、ＰＭＡ処
理によって効率的に核に移行し、この過程は２４時間以
内にほとんど完了した（データ示さず）。
【００４２】実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＲＸとＲｅｆ−１との結合 酸化還元酵素が基質と直接相互作用する場合、これらの
分子はジスルフィド架橋を通して中間体を形成する。そ
のため本発明者らは、システインの酸化によって遊離の
メルカプト基をジスルフィドに換えるジアミドのような
架橋試薬を用いて、それらの一過的な結合を観察できる
のではないかと考えた。
分子はジスルフィド架橋を通して中間体を形成する。そ
のため本発明者らは、システインの酸化によって遊離の
メルカプト基をジスルフィドに換えるジアミドのような
架橋試薬を用いて、それらの一過的な結合を観察できる
のではないかと考えた。
【００４３】そこで、ＴＲＸの５つのシステインのどれ
が分子間ジスルフィド結合を形成するのか決定するた
め、システイン→セリンまたはシステイン→アラニンの
置換をした３つの変異型ＴＲＸをヘキサヒスチジン（６
×Ｈｉｓ）標識した状態で精製した。６×Ｈｉｓ標識し
たＲｅｆ−１及び種々の変異型ＴＲＸ（図１）を、Ｒｅ
ｆ−１存在下または非存在下でジアミドによって架橋処
理した。反応後、還元条件または酸化条件下で複合体を
電気泳動によって分離し、抗体で検出した。結果を、図
３−５に示す。
が分子間ジスルフィド結合を形成するのか決定するた
め、システイン→セリンまたはシステイン→アラニンの
置換をした３つの変異型ＴＲＸをヘキサヒスチジン（６
×Ｈｉｓ）標識した状態で精製した。６×Ｈｉｓ標識し
たＲｅｆ−１及び種々の変異型ＴＲＸ（図１）を、Ｒｅ
ｆ−１存在下または非存在下でジアミドによって架橋処
理した。反応後、還元条件または酸化条件下で複合体を
電気泳動によって分離し、抗体で検出した。結果を、図
３−５に示す。
【００４４】還元的な条件下では、野生型のＴＲＸ及び
全ての変異型ＴＲＸ（ＴＲＸC32S／ C35S、ＴＲＸC35S及
びＴＲＸC62S/C69S/C73S）はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
１３ｋＤａの１つのバンドとして移動する。野生型ＴＲ
ＸまたはＴＲＸC32S/C35Sをジアミドで処理すると複数
のバンドが現れることから、多量体を形成していること
が示唆される。しかしＴＲＸC62S/C69S/C73Sの場合、ジ
アミド処理後には単量体しか検出されなかった（図
３）。
全ての変異型ＴＲＸ（ＴＲＸC32S／ C35S、ＴＲＸC35S及
びＴＲＸC62S/C69S/C73S）はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
１３ｋＤａの１つのバンドとして移動する。野生型ＴＲ
ＸまたはＴＲＸC32S/C35Sをジアミドで処理すると複数
のバンドが現れることから、多量体を形成していること
が示唆される。しかしＴＲＸC62S/C69S/C73Sの場合、ジ
アミド処理後には単量体しか検出されなかった（図
３）。
【００４５】Ｒｅｆ−１には７つのシステインがあり、
還元的な条件下では単量体として泳動する（図４、レー
ン１、３、５、７）。酸化的な条件下では非還元状態よ
りも小さい新たなバンドが観察されるが、これは恐らく
分子内ジスルフィド結合したＲｅｆ−１の単量体の異な
った状態を示すものだと考えられる（レーン２、４、
６、８）。これ以外のさらに高分子量のものは見られな
かったことから、チオールを標的とした酸化的条件下で
はＲｅｆ−１はシステインを介した多量体を形成しない
ことが示唆された。
還元的な条件下では単量体として泳動する（図４、レー
ン１、３、５、７）。酸化的な条件下では非還元状態よ
りも小さい新たなバンドが観察されるが、これは恐らく
分子内ジスルフィド結合したＲｅｆ−１の単量体の異な
った状態を示すものだと考えられる（レーン２、４、
６、８）。これ以外のさらに高分子量のものは見られな
かったことから、チオールを標的とした酸化的条件下で
はＲｅｆ−１はシステインを介した多量体を形成しない
ことが示唆された。
【００４６】次に、野生型及び変異型ＴＲＸをＲｅｆ−
１と混合して保温し、泳動パターンを解析した。酸化的
条件で、野生型ＴＲＸ、ＴＲＸC35A及びＴＲＸ
C62S/C69S/C7 3Sのレーンにおいて、Ｒｅｆ−１（図４）
及びＴＲＸ（図５）に対する抗体の両方とも、約５０ｋ
Ｄａの泳動距離に同一の新たなバンドを検出した（図
４、レーン２、４、８；図５、レーン４のＴ＋Ｒ）が、
ＴＲＸC32S/C35Sに関するバンドは検出されなかった
（図４、レーン６）。これらの結果から、試験管内でＴ
ＲＸとＲｅｆ−１が共有結合によるヘテロ二量体を形成
することが示され、さらにこの結合にＴＲＸの活性中心
のＣｙｓ３２が関与することが示唆された。
１と混合して保温し、泳動パターンを解析した。酸化的
条件で、野生型ＴＲＸ、ＴＲＸC35A及びＴＲＸ
C62S/C69S/C7 3Sのレーンにおいて、Ｒｅｆ−１（図４）
及びＴＲＸ（図５）に対する抗体の両方とも、約５０ｋ
Ｄａの泳動距離に同一の新たなバンドを検出した（図
４、レーン２、４、８；図５、レーン４のＴ＋Ｒ）が、
ＴＲＸC32S/C35Sに関するバンドは検出されなかった
（図４、レーン６）。これらの結果から、試験管内でＴ
ＲＸとＲｅｆ−１が共有結合によるヘテロ二量体を形成
することが示され、さらにこの結合にＴＲＸの活性中心
のＣｙｓ３２が関与することが示唆された。
【００４７】実施例４ 哺乳類ツーハイブリッド検定法によるＴＲＸとＲｅｆ−
１との物理的な結合 哺乳類ツーハイブリッド検定法は、タンパク質間相互作
用を研究するために広く用いられており、酵母でのツー
ハイブリッドライブラリースクリーニングによって同定
された相互作用を検証するのに特に有用である。また、
この一過的な検定法を欠失変異誘発，部位特異的変異誘
発等と一緒に用いることで、既知の２つのタンパク質間
で相互作用するアミノ酸の位置を、迅速に決定すること
ができる。ツーハイブリッド検定法でレポーター遺伝子
の発現が検出されれば、２つの融合タンパク質は生きた
細胞の核内で互いに結合していることが示唆される。
１との物理的な結合 哺乳類ツーハイブリッド検定法は、タンパク質間相互作
用を研究するために広く用いられており、酵母でのツー
ハイブリッドライブラリースクリーニングによって同定
された相互作用を検証するのに特に有用である。また、
この一過的な検定法を欠失変異誘発，部位特異的変異誘
発等と一緒に用いることで、既知の２つのタンパク質間
で相互作用するアミノ酸の位置を、迅速に決定すること
ができる。ツーハイブリッド検定法でレポーター遺伝子
の発現が検出されれば、２つの融合タンパク質は生きた
細胞の核内で互いに結合していることが示唆される。
【００４８】本発明者らは、核内でのＴＲＸとＲｅｆ−
１との結合を生体内で検出するために、哺乳類ツーハイ
ブリッド法を利用した。ＴＲＸまたはＲｅｆ−１の相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン
（ＤＢＤ）またはＶＰ１６の活性化ドメインの下流にサ
ブクローン化した。これらの融合プラスミドを、レポー
ターのルシフェラーゼ遺伝子を持ったプラスミドとＣＯ
Ｓ７細胞内で同時発現させた。
１との結合を生体内で検出するために、哺乳類ツーハイ
ブリッド法を利用した。ＴＲＸまたはＲｅｆ−１の相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン
（ＤＢＤ）またはＶＰ１６の活性化ドメインの下流にサ
ブクローン化した。これらの融合プラスミドを、レポー
ターのルシフェラーゼ遺伝子を持ったプラスミドとＣＯ
Ｓ７細胞内で同時発現させた。
【００４９】図６で示すように、ＤＢＤ−ＴＲＸまたは
ＤＢＤ−Ｒｅｆ−１をＶＰ１６と共にＣＯＳ７細胞内で
発現させた時は、ルシフェラーゼ活性は観察されなかっ
た（レーン１、３）。ＶＰ１６−ＴＲＸまたはＶＰ１６
−Ｒｅｆ−１をＤＢＤと共に発現させた時は、微少な誘
導しか検出されなかった（レーン２、４）。対照的に、
野生型のＴＲＸ及びＲｅｆ−１融合構築物を同時発現さ
せると、ルシフェラーゼ活性が基底レベル（レーン７）
の１０倍以上も誘導された（レーン５、６）。
ＤＢＤ−Ｒｅｆ−１をＶＰ１６と共にＣＯＳ７細胞内で
発現させた時は、ルシフェラーゼ活性は観察されなかっ
た（レーン１、３）。ＶＰ１６−ＴＲＸまたはＶＰ１６
−Ｒｅｆ−１をＤＢＤと共に発現させた時は、微少な誘
導しか検出されなかった（レーン２、４）。対照的に、
野生型のＴＲＸ及びＲｅｆ−１融合構築物を同時発現さ
せると、ルシフェラーゼ活性が基底レベル（レーン７）
の１０倍以上も誘導された（レーン５、６）。
【００５０】次に、変異型ＴＲＸを用いて、この相互作
用に関わるシステイン残基の同定を試みた（図７）。触
媒能を持たないシステインの三重変異体（ＴＲＸ
C62S/C69S/ C73S）では、ルシフェラーゼ活性はなくなら
なかった（レーン５）ことから、これらのシステインは
ＴＲＸがＲｅｆ−１と相互作用するための活性には必要
ないということが示された。ＴＲＸC35A及びＲｅｆ−１
融合構築物を同時発現させると、ルシフェラーゼの誘導
が観察された（レーン４）が、発現の程度は基底レベル
（レーン１）の６−７倍程度であった。一方、ＴＲＸ
C32S/C35SとＲｅｆ−１融合構築物を同時発現させて
も、ルシフェラーゼの誘導は起こらなかった（レーン
３）。
用に関わるシステイン残基の同定を試みた（図７）。触
媒能を持たないシステインの三重変異体（ＴＲＸ
C62S/C69S/ C73S）では、ルシフェラーゼ活性はなくなら
なかった（レーン５）ことから、これらのシステインは
ＴＲＸがＲｅｆ−１と相互作用するための活性には必要
ないということが示された。ＴＲＸC35A及びＲｅｆ−１
融合構築物を同時発現させると、ルシフェラーゼの誘導
が観察された（レーン４）が、発現の程度は基底レベル
（レーン１）の６−７倍程度であった。一方、ＴＲＸ
C32S/C35SとＲｅｆ−１融合構築物を同時発現させて
も、ルシフェラーゼの誘導は起こらなかった（レーン
３）。
【００５１】以上、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（実施例３）及び
ｉｎ ｖｉｖｏ（実施例３）のデータによって、ＴＲＸ
とＲｅｆ−１との直接的な相互作用は活性中心のＣｙｓ
３２およびＣｙｓ３５を介して起こることが示された。
ｉｎ ｖｉｖｏ（実施例３）のデータによって、ＴＲＸ
とＲｅｆ−１との直接的な相互作用は活性中心のＣｙｓ
３２およびＣｙｓ３５を介して起こることが示された。
【００５２】なお、図６および７では、β−ｇａｌ活性
で標準化することによって、ルシフェラーゼの誘導の相
対比を算出した。結果は３つの実験（それぞれ２回行っ
た）の平均であり、ルシフェラーゼ活性の相対比を、レ
ーン１を基底として示す。
で標準化することによって、ルシフェラーゼの誘導の相
対比を算出した。結果は３つの実験（それぞれ２回行っ
た）の平均であり、ルシフェラーゼ活性の相対比を、レ
ーン１を基底として示す。
【００５３】本発明者らはさらに、置換変異体に加え
て、ＴＲＸのアミノ酸残基８８以降のＣ端領域を除去し
た変異体ＴＲＸΔ８７（図１）を、作製した。ＴＲＸΔ
８７は５つのシステイン全てを保持しているが、ジチオ
ール還元活性は失っている。ＴＲＸΔ８７及びＲｅｆ−
１融合構築物を同時発現させても、ルシフェラーゼ活性
の顕著な誘導は見られなかった（図７ レーン６）。こ
の結果は、ＴＲＸの還元活性とＴＲＸのＲｅｆ−１との
相互作用には、活性部位のＣｙｓ残基のみでなく、ＴＲ
ＸのＣＯＯＨ末端も必要であることを示唆している。
て、ＴＲＸのアミノ酸残基８８以降のＣ端領域を除去し
た変異体ＴＲＸΔ８７（図１）を、作製した。ＴＲＸΔ
８７は５つのシステイン全てを保持しているが、ジチオ
ール還元活性は失っている。ＴＲＸΔ８７及びＲｅｆ−
１融合構築物を同時発現させても、ルシフェラーゼ活性
の顕著な誘導は見られなかった（図７ レーン６）。こ
の結果は、ＴＲＸの還元活性とＴＲＸのＲｅｆ−１との
相互作用には、活性部位のＣｙｓ残基のみでなく、ＴＲ
ＸのＣＯＯＨ末端も必要であることを示唆している。
【００５４】
【効果】本発明により、非還元条件下で安定にしたＴＲ
Ｘ、並びに前記ＴＲＸとＲｅｆ−１とがＳ−Ｓ結合して
なるＡＰ−１の転写活性能を増強する因子が提供され
た。本発明の因子は、ＴＲＸとＲｅｆ−１とがＴＲＸの
活性部位でＳ−Ｓ結合して、ＡＰ−１の転写活性能を促
進させるものである。
Ｘ、並びに前記ＴＲＸとＲｅｆ−１とがＳ−Ｓ結合して
なるＡＰ−１の転写活性能を増強する因子が提供され
た。本発明の因子は、ＴＲＸとＲｅｆ−１とがＴＲＸの
活性部位でＳ−Ｓ結合して、ＡＰ−１の転写活性能を促
進させるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、当実験で用いた変異型ＴＲＸ構築物
の模式図を示す。
の模式図を示す。
【図２】 図２は、ＰＭＡ処理したＨｅｌａ細胞で、Ｔ
ＲＸ及び／またはＲｅｆ−１の一時的な発現がＡＰ−１
の活性化に与える影響を示す。
ＲＸ及び／またはＲｅｆ−１の一時的な発現がＡＰ−１
の活性化に与える影響を示す。
【図３】 図３は、抗ＴＲＸ抗体を用いた、種々のＴＲ
Ｘ複合体のウエスタンブロット解析を示す。
Ｘ複合体のウエスタンブロット解析を示す。
【図４】 図４は、抗Ｒｅｆ−１抗体を用いた、種々の
ＴＲＸ及びＲｅｆ−１複合体のウエスタンブロット解析
を示す。
ＴＲＸ及びＲｅｆ−１複合体のウエスタンブロット解析
を示す。
【図５】 抗ＴＲＸ抗体を用いた、種々のＴＲＸ及びＲ
ｅｆ−１複合体のウエスタンブロット解析を示す。
ｅｆ−１複合体のウエスタンブロット解析を示す。
【図６】 図６は、ＣＯＳ７細胞での哺乳類ツーハイブ
リッド検定法による、野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１の物理
的相互作用を示す。
リッド検定法による、野生型ＴＲＸとＲｅｆ−１の物理
的相互作用を示す。
【図７】 図７は、ＣＯＳ７細胞での哺乳類ツーハイブ
リッド検定法による、変異型ＴＲＸとＲｅｆ−１の物理
的相互作用を示す。
リッド検定法による、変異型ＴＲＸとＲｅｆ−１の物理
的相互作用を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 チオレドキシンの有する活性中心のＣｙ
ｓ残基は修飾せず、それ以外のＣｙｓ残基を少なくとも
１つないし全て他のアミノ酸残基に置換することによ
り、非還元条件下において安定にしたことを特徴とする
チオレドキシン改変体。 - 【請求項２】 請求項１に記載のチオレドキシンとＲｅ
ｆ−１とがＳ−Ｓ結合で結合してなるＡＰ−１の転写活
性能を増強する因子。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP448997A JPH10191977A (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | チオレドキシン改変体及び該改変体を含むａｐ−１の転写活性能を増強する因子 |
| EP98100535A EP0853088A3 (en) | 1997-01-14 | 1998-01-14 | A thioredoxin variant and a factor comprising said variant to enhance AP-1 transcriptional activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP448997A JPH10191977A (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | チオレドキシン改変体及び該改変体を含むａｐ−１の転写活性能を増強する因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191977A true JPH10191977A (ja) | 1998-07-28 |
Family
ID=11585516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP448997A Pending JPH10191977A (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | チオレドキシン改変体及び該改変体を含むａｐ−１の転写活性能を増強する因子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0853088A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10191977A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004087917A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | チオレドキシン改変体 |
| WO2022196683A1 (ja) * | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 改変ヒト血清アルブミン－チオレドキシン融合体 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7009087B1 (en) | 2000-12-01 | 2006-03-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for altering the disulfide status of proteins |
| JP2023509462A (ja) * | 2020-01-03 | 2023-03-08 | オアプロ セラピューティクス インコーポレイテッド | チオレドキシン活性を有する組成物および関連方法 |
-
1997
- 1997-01-14 JP JP448997A patent/JPH10191977A/ja active Pending
-
1998
- 1998-01-14 EP EP98100535A patent/EP0853088A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004087917A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | チオレドキシン改変体 |
| WO2022196683A1 (ja) * | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 改変ヒト血清アルブミン－チオレドキシン融合体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0853088A3 (en) | 2001-03-28 |
| EP0853088A2 (en) | 1998-07-15 |
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