JP2023509462A - チオレドキシン活性を有する組成物および関連方法 - Google Patents

チオレドキシン活性を有する組成物および関連方法 Download PDF

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Abstract

疾患および／または状態を処置するための、還元状態にある場合にチオレドキシン作用を有するタンパク質またはペプチドの調製物、製剤および使用が開示される。本発明の一態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の粘弾性を低下させる方法である。方法は、患者の粘液または痰を、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物と接触させることを含み、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端位置の単一Ｃｙｓを除いてシステイン残基を全く含有しない。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月３日に出願された米国特許仮出願第６２／９５６，９９４号の利益を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂによってテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含有する。「７５７９－２－ＰＲＯＶ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ｖ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたテキストファイルは、２１ＫＢのバイトの大きさを有し、２０２０年１月２日に記録された。テキストファイル中に含有される情報は、３７ＣＦＲ §１．５２（ｅ）（５）に従って参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、疾患および／または状態を処置する、例えば、粘液または痰の粘弾性、炎症および高血圧症を低減するための還元状態の、チオレドキシンタンパク質またはチオレドキシン活性部位を含有するペプチドの調製、製剤化および使用に関する。
チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、肺、上部および下部ＧＩ、眼および生殖器系の粘膜上皮でも分泌される必須の細胞内ヒト遺伝子産物であり、そこで小さいトリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ）と一緒に、細胞外生物学的還元力の大部分をなす。局所還元環境によってほとんどのシステイン（Ｃｙｓ）残基が還元されたままである細胞内タンパク質とは対照的に、酸素曝露は、細胞外タンパク質のほとんどのＣｙｓに共有結合性ジスルフィド結合を形成させる。生物学的還元剤は、このジスルフィド結合を、ＧＳＨおよび他の小分子チオールの場合には非選択的に、しかし、その構造的および化学的特徴がある特定のジスルフィドコンホメーションのみに対して特異性を与えるチオレドキシンオキシドレダクターゼの場合には選択的に逆転させるように作用する。分泌されたチオレドキシンは、チオレドキシン－ファミリーオキシドレダクターゼによる可逆的調節制御と関連するアロステリック結合立体配置を含む特定のコンホメーションを有するタンパク質ジスルフィド、ならびに近接する、および他の高度に拘束されたジスルフィド、例えば、酸化された粘液タンパク質（ムチン）において分子内で形成されるものを標的とする独特な、効率的なチオール－ジスルフィド交換機序によってさまざまなホメオスタシス機能を果たすように進化し、チオレドキシンによる還元は、ＣＦ患者痰の著しい粘弾性正常化をもたらす。分泌されたチオレドキシンは、メディエーター放出の調節および炎症部位への好中球走化性の阻害（Tian, H., Matsuo, Y., Fukunaga, A., Ono, R., Nishigori, C., and Yodoi, J., 2013, Thioredoxin ameliorates cutaneous inflammation by regulating the epithelial production and release of pro-inflammatory cytokines. Frontiers in Immunology 4: 1-12）ならびに炎症性プロテアーゼ活性の阻害（Lee, R.L., Rancourt, R.C., del Val, G., Pack, K., Pardee, C., Accurso, F.J., and White, C.W., 2005, Thioredoxin and dihydrolipoic acid inhibit elastase activity in cystic fibrosis sputum. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289: L875-882)を介してさまざまな抗炎症性効果を果たす。チオレドキシンはまた、粘膜表面に分泌され、その中心ジスルフィド結合のチオレドキシン媒介性還元の際に著しく増強された効力および標的病原体範囲を示す、構成的に発現された内因性抗菌性タンパク質(デフェンシン)のクラスの特定の細胞外アクチベーターとして同定されている(Jaeger et al., 2013, Cell-mediated reduction of human β-defensin 1: a major role for mucosal thioredoxin. Mucosal immunology 6, 1179-90）。チオレドキシンはさらに、ペルオキシダーゼの選択的活性化およびある特定の酸化された基質へ電子を直接的に供与する能力のために抗酸化剤タンパク質と古典的に考えられている。
増粘された病的粘液、慢性感染症および慢性炎症を特徴とする疾患の患者の処置のための、安全な、耐容性良好である、効果的な薬物に対する大きな満たされていない医療ニーズが存在する。１つのこのような疾患として、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター、ＣＦＴＲ、塩素イオンおよび炭酸水素イオンの正常な上皮輸送の維持に関与している重要な膜貫通チャネルをコードする遺伝子の突然変異に起因する遺伝性障害である嚢胞性線維症（ＣＦ）がある。ほぼ２０００のｃｆｔｒ遺伝子突然変異に起因するＣＦＴＲの発現、蓄積または機能における欠陥は、塩素イオンのｃＡＭＰ媒介性放出および炭酸水素の輸送を減少させ、脱水および気道粘液の粘弾性の増大、繊毛周囲層の深度の減少および粘液線毛輸送（ＭＣＴ）障害につながる。気道における、結果として生じる不十分に除去された病的粘液の蓄積は、ＣＦに特徴的な慢性気管支内細菌感染および永続性の好中球性炎症の発生の中核をなす（Fahy, J.V., and Dickey, B.F., 2010, Airway Mucus Function and Dysfunction. NEJM 363: 2233-2247)。ＣＦは、主に北欧系の集団における最も一般的な遺伝性致死的疾患のままであり、米国では３０，０００人より多い個体に、世界では８０，０００人超が罹患している。慢性の咳、過剰の痰生成および呼吸性合併症は、罹患率および生活の質の低下の主な原因である。ＣＦ患者の平均余命は、１９８０年以前の１８歳から今日の４０歳超へと増大し続けているが、平均余命をさらに延長し、生活の質を増強するための改善された療法に対する差し迫ったニーズが依然としてある。ＣＦ遺伝子型とは独立した療法が特に望ましい。
粘液は、上皮表面上に保護バリアを形成する継続的に分泌される超分子ポリマーゲルであり、繊毛作用および咳を介して、吸入されたデブリおよび細菌を肺から運び出すことに関与している。したがって、効率的な繊毛駆動性輸送を可能にする粘液層の適切な粘弾性および水和は、粘液機能ならびに感染および炎症の予防にとって重大である。正常な粘液は、ほとんど水からなり（９７％）、残りの固形物は、ムチンタンパク質、非ムチンタンパク質、塩、脂質および細胞片を含む。高分子ムチン糖タンパク質ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂは、呼吸器粘液ゲルの粘弾性特性に主に関与している。Ｏ－結合型グリカンヒドロキシル基は水結合に寄与し、一方でムチン自体は、共有結合性および非共有結合性鎖間および鎖内連結にも関与するもつれたネットワークを形成する。高分子ムチンは、疾患ストレスおよび炎症に応じて過剰分泌され、その極端に高いシステイン含量－それぞれＭＵＣ５ＡＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｐ９８０８８）およびＭＵＣ５Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９ＨＣ８４）について成熟単量体あたり２９４および２７３のＣｙｓが顕著である。これらの豊富なムチンＣｙｓは、気道においてＯ２に曝露されると多数の鎖内ジスルフィドを形成する潜在能力を有し、正常個体に対してＣＦ患者においてムチンジスルフィド結合のほぼ７倍の増大が観察された（Yuan et al., 2015, Oxidation increases mucin polymer cross-links to stiffen airway mucus gels, Science Translational Medicine 7, 276ra227）。
緊密に巻かれたゴムバンドの短縮と同様に、病的粘液ゲルにおける鎖内ジスルフィド結合の増加は、ムチンフィラメントを収縮させ、高分子粘液ゲル構造を圧縮する。ＣＦムチンメッシュのこのジスルフィド媒介性引き締めは、ＣＦに罹患した個体に存在する、繊毛周囲層（ＰＣＬ）の脱水および粘液輸送の喪失を引き起こすことに関与する粘液濃度および浸透圧係数の観察された増大の機序を提供し得る。脱水自体よりも粘液粘弾性の増大のＣＦ病態生理における基本的重要性が、最近開発された高解像度非侵襲性イメージング技術を使用する、生きている気道の上皮表面でのＰＣＬ水和およびＭＣＴの直接測定によって支持されている（Birket, S.E., et al., 2014, A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 190, 421-432; Chu, K.K., et al., 2016, In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography, Biomed Opt Express 7, 2494-2505）。
自然に分泌されるＧＳＨおよびチオレドキシンは、細胞外粘液における過剰のムチンジスルフィド結合形成を防ぐことに関与する化合物である可能性が高い。正味の粘膜表面ジスルフィド結合の増大は、酸化駆動性ジスルフィド形成および還元剤駆動性ジスルフィド破壊の間の平衡を考慮すると、還元剤欠乏またはムチンタンパク質レベルの上昇のいずれかに起因する。ＣＦでは、粘液は過剰分泌されるとわかっており、正常な対象と比較してＣＦ患者では、グルタチオンの還元型および酸化型の両方において約７０％の減少があるということが観察されている（Wetmore, D.R., et al., 2010, Metabolomic profiling reveals biochemical pathways and biomarkers associated with pathogenesis in cystic fibrosis cells. JBC 285: 30516-22）。このＧＳＨの減少は、ＣＦ患者の細胞外肺液を調査する複数の公開された研究全体で一貫しており、気道ＧＳＨ流出の正常な速度の維持における機能的ＣＦＴＲの、おそらくは間接的な役割を示唆する。
さらにより顕著なことに、ＣＦ上皮におけるＣＦＴＲ媒介性炭酸水素流出の障害は、正常な個体における７．２からＣＦ患者における６．５未満に低下する異常に酸性の気道ｐＨと関連している（Garland AL, Walton WG, Coakley RD, et al., 2013, Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways, Proceedings of the National Academy of Sciences 110:15973-8）。
小分子チオール剤の固有に高い酸解離定数（ｐＫａ）のために、低ｐＨ環境は、内因性または外因性ＧＳＨ（ｐＫａ ９．１）の、求核性ジスルフィド結合攻撃に必要な脱プロトン化反応性遊離チオレートアニオンを形成する能力を大幅に減弱する。ＣＦ気道ｐＨでは自然なＧＳＨプールの０．２５％のみが、活性チオレート形態にあると算出されている。したがって、ＣＦでは分泌された粘液（ひいては、ジスルフィド結合を形成可能なムチンＣｙｓ）の増大があるだけでなく、ＧＳＨ分泌の減少もあり、残っているＧＳＨは、ＣＦ気道の低減したｐＨのために機能的に損なわれる。
同様に、ＮＡＣ、システアミンおよびメスナ（それぞれ、９．５、８．３および９．２のｐＫａ値）を含む、治験の、または承認された粘液溶解薬として使用される関連チオール化合物は、罹患気道における有意なジスルフィド還元活性の可能性を同様に欠く。さらに、これらの薬剤は、酵素治療薬に特徴的な選択性を有さない、任意の酸化された基質を無差別に標的とする単純な還元チオールからその機序を導き出す。
対照的に、チオレドキシン、その高度に保存された酵素活性部位における水素結合に起因する、６．２の異常に酸性のｐＫａを有する大きな分子は、酸性ｐＨに対して著しく感受性が少ない。最近のプロテオミクス研究は、チオレドキシンは、新規に形成された気道粘液とともにかなりの割合の分泌された粘膜下腺タンパク質を含むことを示し（Joo, N.S., Evans, I.A., Cho, H.J., Park, I.H., Engelhardt, J.F., and Wine, J.J. 2015. Proteomic analysis of pure human airway gland mucus reveals a large component of protective proteins. PLoS One 10, e0116756）、これは、気道ジスルフィド結合ホメオスタシスにおけるこの酸化還元酵素の、これまでに考えられていたものよりもより重要な機能的役割を示唆する。
病理学的粘液の処置：治療上、閉塞された気道からの粘液のクリアランスは、ＣＦのような閉塞性／炎症性疾患において進行中の慢性感染および炎症を軽減する重要な態様である。理学療法、機械的衝撃デバイスおよび吸入粘液液化性（粘液溶解薬）薬物療法はすべて、ＣＦ患者における痰の除去のための現在の処置レジメンの構成成分である。しかし、既存の処置は、大部分は対症的であり、メカニズム的に不十分なクリアランスにつながる根底にある粘液欠陥の軽減において効果的であると示されていない。
ＣＦにおける最も一般的に使用される粘液溶解性化合物は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによってプルモザイム（登録商標）として商標登録された組換えヒトＤＮアーゼＩ（ＤＮアーゼ；Ｄｏｒｎａｓｅ Ａｌｆａ）である。ＤＮアーゼは、粘性の蓄積された好中球由来核酸を加水分解することによって肺機能を改善するが、最近の研究によって、細胞外ＤＮＡ蓄積ではなく、粘液タンパク質における過剰のジスルフィド結合が疾患発症において主要な役割を果たす可能性があることが示された。
ＤＮアーゼは、その広範な利用にもかかわらず、多数の欠点を有する。ＤＮアーゼは、中程度に大きな単量体サイズのジスルフィド結合された、グリコシル化されたヒト酵素であり、これは製造のために哺乳動物細胞培養を必要とし、このために、生成するのにより費用の掛かるタイプの薬物のうちの１つになる。ＤＮアーゼの標的、過剰の遊離核酸は、重症の慢性感染の結果として存在するか、または早期／あまり重症ではないＣＦでは、認識できるレベルで見出されない可能性があり（ただし、早期段階の疾患を有する一部の患者は、利益を報告する）、またＤＮアーゼは他の閉塞性肺疾患について臨床的利益も実証していない。ＤＮアーゼ処置を用いた場合の肺機能の臨床的悪化は、小児患者の６～３０％において見られる。ＤＮアーゼはまた、ＤＮアーゼが標的とする核酸の存在によって阻害されるタンパク質分解酵素である好中球エラスターゼの活性を促進することによって炎症を増悪する場合がある。
ＤＮアーゼの積極的な使用に関わらず、応答は低く、ＣＦ疾患は通常、小児または成人早期において気管支拡張症、呼吸不全および死亡または移植に進行する。気道水和／咳誘導療法、例えば、マンニトールまたは高張食塩水吸入は、臨床試験において見込みを示し、一部は患者ケアにおいて現在使用されているが、効果的な粘液処置、特に、病的粘液を直接的に標的化するものが、依然として重大な不足がある。
残念ながら、粘液薬物として評価されてきた種々のチオール含有小分子の結果は、期待外れであった。これらの薬剤には、ＮＡＣおよびナシステリン（ナシステリン）（ＮＡＬ；ＮＡＣ＋Ｌ－リシン）ならびに還元ＧＳＨおよびシステアミンが含まれる。大部分は安全であるが、今日まで、これらの小分子剤は、経口または吸入形態のいずれでも明確な臨床的利益を示さなかった。
この不十分な有効性の一部は、吸入デリバリーの際の自動酸化によって引き起こされる効力喪失の結果ならびに肺の酵素の、ＧＳＨを不活性形態に迅速に変換する潜在能力である可能性があるが、上記のように、その極めて塩基性のチオールｐＫａによって引き起こされる酸性ＣＦ気道ｐＨでの非酵素チオール剤の固有の低活性が関与している可能性がより高い。
粘液過剰産生と同様に、炭酸水素分泌欠陥および気道酸性化は、ＣＦに制限されず、大きな集団に影響を及ぼす他の閉塞性肺疾患の根底にある可能性もある。したがって、真に効果的な、メカニズム的粘液モジュレート処置は、広範な医学的利益をもたらす可能性がある。ジスルフィド標的化を、チオレドキシンのような生物学的薬物の優れた効力、安定性および特異性と組み合わせることによってチオール剤を改善することが高度に望ましい。
残念ながら、還元形態のタンパク質を安全に安定化できるチオールベースの治療薬の製剤化戦略の開発は、限定されていた。これまでの試み（ＰＣＴ ＷＯ２００６／０９０１２７）は、固体形態での長期貯蔵の際およびデリバリーのために液体溶液に再構成された場合に、糖および化学的安定剤が還元されたままであることを可能にできる両組成物の組合せを見出すために多数の賦形剤の骨の折れるスクリーニングを必要とした。この戦略から得られた還元糖ベースの製剤は、著しく炎症性であると判明し、従って、吸入デリバリーにおける使用に適していない。このスクロース製剤を使用して生理食塩水で再構成された天然チオレドキシンは、気管内投与によってラットにデリバリーされた場合に 高レベルの好中球流入および炎症性サイトカイン放出をもたらした（Rancourt, R.C., et al., 2007, Reduced thioredoxin increases proinflammatory cytokines and neutrophil influx in rat airways: modulation by airway mucus. Free Radic Biol Med 42, 1441-53）。したがって、チオールベースのタンパク質治療薬の安全な効果的な製剤化アプローチが依然として必要である。
本発明の一態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液もしくは痰を有する患者の粘液もしくは痰の粘弾性を低下する方法である。方法は、患者の粘液または痰を、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物と接触させることを含み、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端位置の単一Ｃｙｓを除いて、システイン残基を全く含有しない。
本発明の別の態様では、医薬組成物が提供され、組成物は、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を有し、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端位置の単一Ｃｙｓを除いてシステイン残基を全く含有しないタンパク質またはペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
本発明のさらなる態様は、還元状態のチオレドキシン活性部位を有するタンパク質またはペプチドと、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒とを含む組成物である。
本発明のさらに別の態様では、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、水と、塩化ナトリウムとから本質的になる医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒とを含む水性組成物を提供することを含む乾燥組成物を調製する方法である。方法は、水性溶媒を揮発させて、タンパク質またはペプチドを含む乾燥組成物を生成することをさらに含む。
本発明のいっそうさらなる態様は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、通常の生理食塩水とから本質的になる、またはからなる組成物である。
本発明の別の態様は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドから本質的になる組成物であり、組成物は、乾燥粉末である。
本発明の別の方法は、対象において炎症を処置する方法であって、対象に、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む方法であり、対象は、炎症を有するか、それを発症するリスクにある。
本発明のいっそうさらなる態様は、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することによって対象において細菌感染症を処置する方法であり、対象は細菌感染症を有するか、またはそれを発症するリスクにある。
本発明のさらなる態様は、１つまたは複数の内因性抗菌ペプチドを活性化するように作動可能なチオレドキシンモノシステイン活性部位を含む組成物であり、活性化は、感染性疾患を処置または予防するための治療上効果的な試薬をもたらす。
本発明のさらなる方法は、対象の粘膜表面に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを含む組成物を局所的に投与することによって、対象のマイクロバイオーム組成をモジュレートする方法である。
いっそうさらなる方法は、チオレドキシンモノシステイン活性部位中の単一のＣｙｓを除いてシステイン残基を全く含有しない、モノシステインチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドを選択することと、タンパク質またはペプチドの全体的なシステインチオール還元状態を測定することとによって、モノシステインチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドのジスルフィド結合還元活性を決定するためのものである。
本発明のなお別の態様は、対象に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を投与することによって、ウイルス性呼吸器疾患を有するか、またはそれを発症するリスクにある対象においてウイルス性呼吸器疾患を処置する方法である。
本発明は、それを必要とする対象に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象においてウイルス感染と関連する肺炎症を低減する方法をさらに含む。
本発明の別の態様は、チオレドキシン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを含む組成物であり、組成物は、約４００ｎｍ波長より大きいＵＶ吸光度を有するチオレドキシンタンパク質画分を含まない。
本発明のさらなる態様は、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む溶解物を提供することと、溶解物中のタンパク質またはペプチドを濃縮することと、約４００ｎｍよりも大きい吸光度を有するチオレドキシンペプチドまたはタンパク質画分を除去して、組成物を生成することとによって、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を生成する方法である。
本発明の種々の実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ（配列番号２４）、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１７）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１９）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｘ（配列番号２１）、Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｋ（配列番号２３）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ－Ｘ（配列番号２５）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｘ（配列番号２６）およびＷ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｋ（配列番号２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むチオレドキシン活性部位は、チオレドキシンモノシステイン活性部位であり、Ｘ残基は、システイン以外の任意のアミノ酸残基である。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約８０％同一である配列を含み、チオレドキシン活性部位は、配列番号２８または配列番号２９の３２～３５位に対応する位置にあるチオレドキシンモノシステイン活性部位である。いっそうさらなる実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号２８または配列番号２９の配列を含む。他の実施形態では、タンパク質は、ヒトチオレドキシンを含む。
本発明の一部の実施形態では、患者は、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘性または粘着性が疾患の症状または原因である肺疾患を有する。患者は、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘性または粘着性が生物学的還元剤活性の欠乏と関連している肺疾患を有する場合もある。他の実施形態では、患者は、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、喘息、副鼻腔炎、特発性肺線維症、肺高血圧症、ドライアイ疾患および消化管疾患からなる群から選択される疾患を有する。別の実施形態では、患者は、嚢胞性線維症を有する。一部の実施形態では、患者はヒトである。
患者において過剰に粘性または粘着性の粘液または痰の粘弾性を低下する方法の実施形態では、患者の粘液または痰を、組成物と接触させる工程は、鼻腔、気管内、気管支、肺への直接設置、吸入、経口および眼からなる群から選択される経路によって組成物を患者に導入することによって実施される。他の実施形態では、接触されるべき粘液または痰は、患者の呼吸器中にあり、他の実施形態では、患者の粘液または痰を組成物と接触させる工程の後に、患者は、接触の工程の前と比較して、強制呼気量（ＦＥＶ）の少なくとも約２．５％の増大を有する。
さらなる実施形態では、チオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドは、粘液タンパク質がムチン、例えば、呼吸器粘液タンパク質である場合など、粘液タンパク質中のシステイン残基に共有結合的に結合する。
本発明の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む場合があり、このような医薬組成物では、タンパク質またはペプチドは、配列番号１のチオレドキシンモノシステイン活性部位配列を含み得る。本発明の医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔、吸入、気管内、気管支、直接滴下注入、局所および眼から選択される経路による患者への投与のために製剤化できる。
少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒を有する本発明の実施形態では、水性溶媒は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムおよび重炭酸トリエチルアンモニウムから選択され得る。水性溶媒は、酢酸アンモニウムであり得る。他の実施形態では、水性溶媒は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度である場合があり、および／または水性溶媒は、約４から約７の間のｐＨを有し得る。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、糖類または糖類誘導体を含まない。他の実施形態では、水性組成物は、約３ｍｍＨｇ未満の蒸気圧を有するタンパク質またはペプチド以外の化合物を全く含有しない。
本発明の他の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシン活性部位中の１つまたは２つのＣｙｓを除いてシステイン残基を全く含有しない。いっそう他の実施形態では、チオレドキシン活性部位は、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ（配列番号１６）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ－Ｘ（配列番号２０）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｘ（配列番号２２）、Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｋ（配列番号３）から選択されるアミノ酸配列を含む場合があり、Ｘ残基は、システイン以外の任意のアミノ酸残基である。さらなる実施形態では、チオレドキシン活性部位は、モノシステインチオレドキシン活性部位であり、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端の単一のＣｙｓを除いてシステイン残基を全く含有しない場合がある。
塩化ナトリウムを含む本発明の実施形態では、塩化ナトリウムは、水１リットルあたり約９グラムの塩化ナトリウムで存在し得る。
水性溶媒を揮発させる工程を含む実施形態では、揮発させる工程は、組成物を、減圧、高温およびそれらの組合せからなる群から選択される条件に付すことを含み得る。このような実施形態では、揮発させる工程は、非酸化雰囲気、例えば、窒素雰囲気下で行うことができる。他の実施形態では、揮発させる工程は、凍結乾燥を含み得る。
乾燥医薬組成物を形成することを含む本発明の実施形態では、方法は、乾燥組成物を希釈剤、例えば、約４から約７の間のｐＨを有する生理食塩水溶液中に可溶化することを含み得る。このような可溶化された医薬組成物は、約２５℃の温度で少なくとも約１日間還元形態で少なくとも８０％安定であり得る、または約２５℃の温度で少なくとも約１週間還元形態で少なくとも８０％安定であり得る。他のこのような実施形態では、チオレドキシンは、モノシステインチオレドキシン活性部位、またはより詳しくは、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含む場合があり、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない。
炎症を処置するための本発明の方法では、タンパク質またはペプチドの放出は、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαから選択される炎症性サイトカインの放出を阻害し得る。
細菌感染を処置するための本発明の方法では、組成物は、タンパク質またはペプチドを発現する微生物細胞の粗または精製抽出物を含み得る。
１つまたは複数の内因性抗菌ペプチドを活性化する組成物を含む本発明の実施形態では、抗菌ペプチドは、デフェンシンであり得る。
対象のマイクロバイオーム組成をモジュレートするための実施形態では、粘膜表面は、肺表面、鼻咽頭表面または胃腸表面であり得る。
タンパク質またはペプチドのジスルフィド結合還元活性を決定するための実施形態では、システインチオール還元状態は、発色性アッセイ、蛍光定量的アッセイおよび比濁（ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイから選択される方法を使用して測定できる。例えば、発色性アッセイは、ＤＴＮＢアッセイであり得る。
ウイルス性呼吸器疾患を処置することに関連する実施形態では、疾患は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸窮迫症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９またはＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、喘息、肺炎、気管支炎、結核、反応性気道疾患症候群および間質性肺疾患と関連するウイルス感染症から選択され得る。このような実施形態では、ウイルス性呼吸器疾患は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸器アデノウイルスから選択されるウイルスによって引き起こされ得る。
本発明の種々の実施形態では、組成物は、噴霧形態もしくはエアロゾル化形態で、または吸入用乾燥粉末の形態で投与され得る。
チオレドキシン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを有し、約４００ｎｍ波長より大きいＵＶ吸光度を有するチオレドキシンタンパク質画分を含まない本発明の組成物では、このような組成物は、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒をさらに含み得る。または、組成物は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチド、水および塩化ナトリウムから本質的になる場合がある。さらに、このような組成物は、約３．０重量％未満の含水量に乾燥され得る。
チオレドキシン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを有し、組成物を生成するために約４００ｎｍ超で吸光度を有するチオレドキシンペプチドまたはタンパク質画分を除去する組成物を生成する本発明の方法では、組成物を、約３００ｎｍ未満のＵＶ光波長の吸光度を有するペプチドまたはタンパク質画分を有するとしてさらに特徴付けることができる。このような実施形態では、除去する工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または組成物を約３．０重量％未満の含水量に乾燥することを含み得る。
図１は、システイン３５のセリンへの突然変異（Ｃ３５Ｓ ＴＲＸ）の機序を示す。 図２は、チオレドキシンに対するチオール剤還元活性のｐＨ依存を示す。 図３は、モノチオールＣ３５Ｓチオレドキシンの凍結乾燥固体形態および溶液の安定性を示す。 図４は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって単離された、主チオレドキシン画分（上部）および吸光度＞４００ｎｍを有する赤色画分（下部）のＵＶスペクトルを示す。 図５は、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＯＲＰ１００Ｓ（０．０１、０．１および１．０ｍＭ濃度）を用いて３７℃で１時間還元された、４％固形物乾重粘液のＡ．弾性係数（Ｇ’）、Ｂ．粘性係数（Ｇ”）およびＣ．ムチン分子量（ＧＰＣ－ＭＡＬＬＳ）の低減を示す。 図６は、ＣＦ患者ドナー由来の一次ＨＢＥにおけるＯＲＰ１００Ｓ（「Ｔｈｅｒａｄｕｘ」）のμＯＣＴ分析を示す。 図７は、ＣＦ患者痰におけるＯＲＰ１００Ｓ（「Ｔｈｅｒａｄｕｘ」）のμＯＣＴ分析を示す。 図８は、非ＣＦおよびＣＦドナーの鼻腔上皮由来の一次ＨＢＥ培養物の基底外側ＡＬＩ培地における２４時間後に誘導されたＩＬ－６またはＴＮＦアルファのレベルに対する、チオレドキシンおよびＣ３５Ｓチオレドキシンの効果を示す。 図９は、ラットにおけるＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓの噴霧エアゾールデリバリーおよびインビボでの製剤誘導性好中球流入の減弱を示す。
本発明は、概して、異常な粘液、炎症、感染または高血圧のうち１つまたは複数を含む症状を特徴とする粘膜疾患を処置するための、還元状態のチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの使用に関する。より詳しくは、本発明者は、モノシステイン活性部位を含むチオレドキシンタンパク質またはペプチドを含む、チオレドキシン活性部位を有するタンパク質またはペプチドは、炎症または異常な痰もしくは粘液の粘弾性および／もしくは粘着性を減少させ、それによって、痰または粘液を正常化するための効果的な薬剤であるということを発見した。
したがって、上記のような還元状態のチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質もしくはペプチドまたはこのようなタンパク質をコードする核酸分子は、望ましくない粘液または粘り強い、粘性の痰と関連するさまざまな状態または疾患を処置するために、ならびに炎症、高血圧症および／または感染を処置するために、単独でまたは組成物中で使用できる。例えば、呼吸器疾患、例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、副鼻腔炎、特発性肺線維症、肺高血圧症および喘息発作重積状態を含む喘息は、本発明の生成物およびプロセスを使用して処置するのに特に適している。また、増粘したもしくは粘着性の粘液と関連する消化管疾患、例えば、コクシジウム症も、本発明の生成物およびプロセスを使用して処置するのに特に適している。異常に増粘された粘液分泌、炎症および／または感染を特徴とする他の粘膜表面の類似の疾患、例えば、ドライアイ疾患も、処置するのに適しており、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障および白内障を含む、酸化ストレスおよび炎症が関与する眼疾患も同様である。
したがって、本発明は、粘液または痰、特に異常にまたは過剰に粘性および／または粘着性である粘液または痰の粘弾性を低下させるための、チオレドキシンタンパク質またはペプチドがモノシステイン活性部位を含む場合を含む、還元状態のチオレドキシンの活性部位を含有するタンパク質またはペプチドの使用に関する。タンパク質は、このような異常なまたは過剰の粘液または痰に苦しんでいる、またはそれに冒されている患者に、粘液または痰の粘弾性を低下させるのに、好ましくは、患者に治療的利益を提供するのに効果的な方法および量で投与され得る。さらに、タンパク質は、暴走炎症反応、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および関連急性肺傷害、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有している、またはそのリスクにある患者を含む、炎症または感染に苦しんでいる患者に投与され得る。
チオレドキシン活性部位を有するタンパク質およびペプチド
チオレドキシン－１（Ｔｒｘ）は、小さい（１２ｋＤａ）、天然に存在する酸化還元タンパク質であり、タンパク質ジスルフィドが好ましい基質である。Ｔｒｘは、強力な、特異的なジスルフィド結合還元を介してタンパク質および酵素活性の調節において重要な生物学的役割を果たす必須のヒトタンパク質である。
Ｔｒｘは、その高度に保存されたＣｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号１）活性部位において酸化還元活性ジチオールを有し、これは、フラビン酵素チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）および補因子ＮＡＤＰＨによって酸化形態から還元される。これら３つの構成成分は一緒に、チオレドキシン系を形成し、その還元能力は、小分子還元剤より何倍も強力である。
哺乳動物Ｔｒｘは、可逆性ジスルフィド結合調節におけるその役割のために、メチオニンスルホキシドレダクターゼの補因子として働くこと、受容体および転写因子のＤＮＡ結合活性を修飾することおよびタンパク質フォールディングに加わることを含む、多数の細胞内および細胞外酸化還元シグナル伝達活性に関与する。さらに、Ｔｒｘは、フリーラジカルをスカベンジでき、細胞を酸化ストレスから保護でき、分泌されたＴｒｘは、重要な分泌抗菌ヒトβ－デフェンシン－１、ｈＢＤ－１の活性化（ジスルフィド結合還元による）のために粘膜表面で必要である。
本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、嚢胞性線維症などの状態の処置において使用するために、他の還元剤を上回る利点を有する。例えば、他の還元剤、例えば、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ナシステリン（Ｎａｃｙｓｔｅｌｙｎ）（ＮＡＬ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または還元型グルタチオン（ＧＳＨ）とは異なり、本明細書で開示される突然変異体チオレドキシンは、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルおよび他の毒性酸素代謝産物を生成する反応を含む、酵素または自己酸化機序による不活性化に対してあまり感受性ではない。さらに、天然または野生型チオレドキシンは、通常、気道表面上に細胞外分泌される天然に存在する化合物であり、従って、チオレドキシンの気道への導入は、非刺激性であり、不適当な免疫応答を誘導する可能性が低いはずである。チオレドキシンはまた、グリコシル化されず、そのようなものとして、より容易に製造され、天然または組換え形態のタンパク質の投与は、自然免疫応答を誘導しないはずである。おそらくはより重要なことに、還元型チオレドキシンは、他の還元剤とは対照的に、処置された粘液または痰を正常な粘性レベルに、より迅速に、強力に回復させ、この正常化は、より長期間持続する。ＮＡＣ、ＮＡＬ、ＤＴＴおよびＧＳＨは、例えば、時間の経過とともに「消費されたもの」または酸化されたものになり、この段階で、正常化された痰または粘液は、異常な粘性状態に戻る場合がある。対照的に、チオレドキシンによってもたらされた粘性または粘弾性の低下は、おそらくはその還元系による周期性の再還元によってより長く持ちこたえる。さらに、本明細書で開示されるモノシステイン活性部位チオレドキシンは、ムチンＣｙｓ残基に共有結合的に結合したままであることによって、天然チオレドキシンと比較していっそうより強力な、より長い持続期間の粘性の低減を作出する。最後に、チオレドキシンは、他の還元剤よりも、ジスルフィド結合還元についてより強力でより特異的の両方であり、従って、有益な効果を達成するために他の薬剤よりも有意に低い用量で使用できる。
上記で論じられたように、チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、多数のチオール依存性細胞還元プロセスを触媒するタンパク質ジスルフィドレダクターゼである。天然チオレドキシンは、種をまたいで高度に保存されている２つの酸化還元活性システインを含有する。これらのシステインは、その酸化形態では、タンパク質の三次元構造から突出するジスルフィド橋を形成する。タンパク質ジスルフィドは、Ｔｒｘ媒介性還元作用の好ましい基質である。２つのＴｒｘ活性部位システインのうち１つの、システイン以外の残基への修飾は、モノシステイン活性部位をもたらす。
本発明は、概して、還元状態のチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの使用に関する。「チオレドキシン活性部位」への言及は、アミノ酸配列Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１７）を含むチオレドキシンモノシステイン（すなわち、モノチオール）活性部位または配列番号１６を有するアミノ酸配列Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃを含む２つの酸化還元活性システイン（Ｎ末端システインおよびＣ末端システイン）を含有する天然（または野生型）チオレドキシンジチオール活性部位のいずれかを含む。本明細書で使用される場合、「Ｃ」と表されるアミノ酸残基は、システイン残基であり、「Ｘ」と表されるアミノ酸残基は、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基、特に、残りの標準の２０種のアミノ酸残基または合成、非天然もしくは修飾アミノ酸のいずれかであり得る。Ｘ残基の同一性は、他のＸ残基とは独立している。すなわち、任意のＸ残基の同一性は、他のＸ残基と同一である場合も異なっている場合もある。
本発明のチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ（配列番号１８）を含む場合があり、天然または野生型配列は、アミノ酸配列Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ（配列番号１）を含む。チオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１９）をさらに含む場合があり、天然または野生型配列は、アミノ酸配列Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ－Ｘ（配列番号２０）を含む。さらに、本発明のチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｘ（配列番号２１）を含み、「Ｇ」で表されるこのようなアミノ酸残基は、グリシン残基であり、「Ｐ」で表されるこのようなアミノ酸残基は、プロリン残基であり、天然または野生型配列は、アミノ酸配列Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｘ（配列番号２２）を含む。本発明の別のチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｋ（配列番号２３）を含み、「Ｗ」で表されるこのようなアミノ酸残基は、トリプトファン残基であり、「Ｋ」で表されるこのようなアミノ酸残基は、リシン残基であり、天然配列は、アミノ酸配列Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｋ（配列番号３）を含む。チオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ（配列番号２４）を含み得る。本発明のこのようなチオレドキシン活性部位は、好ましくはアミノ酸配列Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ（配列番号１）を含む。チオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ－Ｘ（配列番号２５）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｘ（配列番号２６）またはＷ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｋ（配列番号２７）をさらに含む場合があり、「Ｘ」で表されるアミノ酸残基は、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基であり得る。モノシステインチオレドキシン活性部位は、上記のように、天然活性部位のＣ末端システインを置換することによって対応する天然配列から変わり得る。さらに、チオレドキシン活性部位は、天然活性部位のＣ末端システインの欠失によって変わり得る。
チオレドキシンのさらなる変異体
チオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、チオレドキシン活性部位の外側の、非活性部位システイン残基で１つまたは複数のシステイン欠失、置換またはそれらの組合せをさらに含み得る。一態様では、チオレドキシン活性部位の外側の１つまたは複数のシステインが、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換される。一態様では、チオレドキシン活性部位の外側の１つまたは複数のシステインが、システインまたはアラニン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換される。一態様では、チオレドキシン活性部位の外側の１つまたは複数のシステインが、セリン残基で置換される。さらなる態様において、チオレドキシンタンパク質またはペプチド中のチオレドキシン活性部位の外側の非活性システインのすべてが欠失される、セリン残基で置換される、またはそれらの組合せである。いっそうさらなる態様では、チオレドキシンタンパク質または ペプチド中のチオレドキシン活性部位の外側の非活性システインのすべてが、欠失される、および／またはセリン残基で置換される、またはそれらの組合せであり、チオレドキシン活性部位中のＣ末端システインもセリン残基で置換される。
チオレドキシンの種類
本発明の一態様では、チオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質は、全長チオレドキシンタンパク質または上記で構造的および機能的に記載されるようなチオレドキシン活性部位を含有するその任意の断片である。活性部位を有する好ましいチオレドキシンタンパク質には、原核生物チオレドキシン、酵母チオレドキシン、植物チオレドキシンおよび動物チオレドキシンが含まれ、哺乳動物およびヒトチオレドキシンは、動物チオレドキシンのさらなる実施形態である。さまざまな生物由来のチオレドキシンタンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、本発明によって包含されるものとする。例えば、配列番号４～１５は、シリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）（配列番号４）、ジンジバリス菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（配列番号５）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（配列番号６）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号７）、ガルス属（Ｇａｌｌｕｓ）（配列番号８）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（配列番号９）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号１０）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（配列番号１１）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号１２）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（配列番号１３）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（配列番号１４）およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（配列番号１５）由来のチオレドキシンのアミノ酸配列を表す。これらの配列の各々を参照すると、配列番号１６を有するＣ－Ｘ－Ｘ－Ｃモチーフを以下のとおりに見出すことができる：配列番号４（３４～３７位）、配列番号５（２９～３２位）、配列番号６（２８～３１位）、配列番号７（３０～３３位）、配列番号８（３２～３５位）、配列番号９（３２～３５位）、配列番号１０（３２～３５位）、配列番号１１（３２～３５位）、配列番号１２（３２～３５位）、配列番号１３（６０～６３位）、配列番号１４（８９～９２位）および配列番号１５（９５～９８位）。
活性部位の外側の修飾
配列番号１２を参照すると、欠失および／または置換され得るチオレドキシン活性部位の外側の非活性システイン残基は、ヒトチオレドキシン－１配列の６２、６９および７３位に見出すことができる。配列番号１２を再度参照すると、活性部位Ｃｙｓは、３２および３５位に見出され、３２位のシステインは、Ｎ末端システインと呼ばれ、３５位のシステインは、Ｃ末端システインと呼ばれる。一態様では、配列番号１２の６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、欠失される、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換される、またはそれらの組合せである。いっそう別の態様では、配列番号１２の６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、システイン残基またはアラニン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換される。１つのさらなる態様では、配列番号１２の６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、セリンで置換される。なお別のさらなる態様では、配列番号１２の３５、６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、セリンで置換される。一態様では、配列番号１２の６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、欠失され、配列番号１２の３５位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換され、好ましくは、セリン残基で置換される。いっそう別の態様では、配列番号１２の６２、６９および７３位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、欠失される、および／またはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換される、および／またはそれらの組合せであり、配列番号１２の３５位のシステインまたは他のチオレドキシン中の対応する位置のシステインが、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基で置換され、好ましくは、セリン残基で置換される。
単一のシステインチオレドキシン
本発明の特定の実施形態では、チオレドキシンタンパク質は、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドであり、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位中の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、例えば、チオレドキシンタンパク質が、唯一のシステインが３２位に（またはより一般的には、チオレドキシン活性部位のＮ末端位置に）ある、配列番号１２の完全にモノシステインの変種である配列番号２８および配列番号２９として示される。本発明のこの実施形態はまた、置換および／または欠失されているアミノ酸を有し、依然として完全にモノシステインであり、３２位に（またはより一般的には、チオレドキシン活性部位のＮ末端位置に）唯一のシステインを有する配列番号２８および配列番号２９の変異体を含む。このような変異体は、配列番号２８または配列番号２９の配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のこのような置換および／または欠失を有し得る。代替実施形態では、変異体は、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約８０％の同一性、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約８５％の同一性、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約９０％の同一性、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約９５％の同一性、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約９９％の同一性または少なくとも８０％から９９％の間の任意の整数パーセント同一性を有することを特徴とし得る。
ヒトおよび細菌チオレドキシンを含む、いくつかのチオレドキシンタンパク質の三次元構造は解明されている。したがって、複数の生物由来のチオレドキシンの構造および活性部位は、当技術分野で公知であり、当業者ならば、本発明において使用できるチオレドキシン活性部位の外側の非活性システイン残基の欠失、置換またはそれらの組合せと組み合わせてモノシステイン活性部位を有するチオレドキシンを含む、全長チオレドキシンの断片または相同体を容易に同定し、生成できるであろう。チオレドキシンタンパク質の例として、３５位の第２の活性部位システイン（すなわち、Ｃ末端システイン）がセリン残基と置き換えられているモノチオール活性部位を有するチオレドキシンタンパク質であるＯＲＰ－１００が挙げられる。ＯＲＰ１００Ｓは、３５位の第２の活性部位システイン（すなわち、Ｃ末端システイン）がセリンで置換されており、チオレドキシン活性部位の外側の非活性システイン残基のすべて（６２、６９および７３位に見出される）がセリン残基で置換されている、モノチオール活性部位を有するチオレドキシンタンパク質（配列番号２９）である。
還元型システイン
「還元状態にある」という語句は、本発明のタンパク質またはペプチドの活性部位中のシステイン残基の状態を具体的に説明する。還元状態では、隣接するシステイン残基は、ジチオール（すなわち、２つの遊離スルフヒドリル基、－ＳＨ）を形成する。対照的に、酸化形態では、このようなシステイン残基は、分子内ジスルフィド橋を形成し、このような分子は、シスチンと呼ばれることもある。還元状態では、チオレドキシン活性部位は、その活性部位チオールのジスルフィドへの可逆性酸化を介して酸化還元反応に加わることが可能であり、標的ジスルフィドシステインのうちの１つへの共有結合連結をもたらすチオール－ジスルフィド交換反応を触媒する。チオレドキシンモノチオール活性部位を含有し、チオレドキシン活性部位の外側の１つまたは複数のシステイン残基の欠失、システイン以外の任意のアミノ酸残基との置換またはそれらの組合せをさらに含む本発明のタンパク質またはペプチドについて、活性部位中のＮ末端システインは、モノチオールとして還元状態にあり、従って、標的タンパク質上のシステインと、安定な混合ジスルフィドを形成できる。
タンパク質またはペプチドのサイズ
本明細書で使用される場合、チオレドキシン活性部位を含有する本発明のタンパク質またはペプチドは、チオレドキシン活性部位それ自体またはグリコシド結合によって他のアミノ酸に接合されたチオレドキシン活性部位であり得る。したがって、本発明のタンパク質またはペプチドの最小のサイズは、約４～約６個のアミノ酸長であり、好ましいサイズは、このようなタンパク質の全長、融合、多価または単に機能的部分が望まれるか否かに応じて異なる。好ましくは、本発明のタンパク質またはペプチドの長さは、約４～約１００個のアミノ酸残基またはそれより多くに及び、任意の中間の長さのペプチドが、整数で（すなわち、４、５、６、７．．．９９、１００、１０１．．．）、具体的に想定される。Bachnoff et al., Free Radical Biol Med 50:1355-67, 2011によって記載されたようなＮおよびＣ末端で遮断された短いチオレドキシンミメティックペプチドである場合もある。
相同体
さらに好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、全長タンパク質またはこのようなタンパク質の任意の相同体であり得る。本明細書で使用される場合、において、「相同体」という用語は、天然に存在するタンパク質またはペプチドへの修飾によって天然に存在するタンパク質またはペプチド（すなわち、「原型」または「野生型」タンパク質）とは異なるが、天然に存在する形態の基本的なタンパク質および側鎖構造を維持し、および／または天然タンパク質の少なくとも生物学的に活性な部分（例えば、チオレドキシン活性部位）の基本的三次元構造を維持するタンパク質またはペプチドを指すように使用される。このような変化として、それだけには限らないが、１個または数個のアミノ酸側鎖における変化、欠失（例えば、タンパク質またはペプチド（断片）の末端切断版）、挿入および／または置換を含む、１個または数個のアミノ酸における変化、１個または数個の原子の立体化学における変化ならびに／またはそれだけには限らないが、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を含む微小な誘導体化が挙げられる。本発明によれば、天然チオレドキシンタンパク質の相同体を含む、本発明において有用な任意のタンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノチオール活性部位を有し、その結果、タンパク質またはペプチドは、還元状態では、その活性部位チオールのジスルフィドへの酸化を介して酸化還元反応に加わることが可能であり、および／または粘液もしくは痰の粘弾性（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｉｔｙ）もしくは粘着性を低下させることまたは粘液もしくは痰の液化を増大することが可能である。
本明細書で使用される場合、チオレドキシン活性部位を含有し、チオレドキシン活性部位の外側の１個または複数のシステイン残基の欠失および／またはシステイン以外の任意のアミノ酸残基との置換および／またはそれらの組合せをさらに含むタンパク質またはペプチドは、チオレドキシンと同様の特徴を有する場合があり、好ましくは、原核生物チオレドキシン、真菌チオレドキシン（酵母を含む）、植物チオレドキシン、動物チオレドキシンまたは哺乳動物チオレドキシンの群から選択されるチオレドキシンである。特に好ましい実施形態では、タンパク質は、ヒトチオレドキシンである。
相同体は、天然対立遺伝子変異または天然突然変異の結果であり得る。タンパク質をコードする核酸の天然に存在する対立遺伝子変異体は、このようなタンパク質をコードする遺伝子としてゲノム中の本質的に同一の遺伝子座（単数または複数）に生じるが、例えば、突然変異または組換えによって引き起こされる自然な変異のために、同様であるが同一ではない配列を有する遺伝子である。対立遺伝子変異体は、通常、比較されている遺伝子によってコードされるタンパク質のものと同様の活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子変異体の１つのクラスは、遺伝暗号の縮重のために、同一タンパク質をコードするが、異なる核酸配列を有する場合がある。対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域において（例えば、調節制御領域において）変化を含む場合がある。対立遺伝子変異体は、当業者に公知である。
相同体は、それだけには限らないが、例えば、無作為なまたは標的化された突然変異誘発を達成するための古典的または組換えＤＮＡ技術を使用する、単離された天然に存在するタンパク質への直接修飾、直接タンパク質合成またはタンパク質をコードする核酸配列への修飾を含む、タンパク質の生成のための当技術分野で公知の技術を使用して生成され得る。
野生型タンパク質と比較される相同体における修飾は、天然に存在するタンパク質と比較して、相同体の基本的な生物活性をアゴナイズする、アンタゴナイズする、または実質的に変更しないのいずれかである。一般に、タンパク質の生物活性または生物学的作用は、インビボ（すなわち、タンパク質の自然な生理学的環境において）またはインビトロ（すなわち、実験室状態下）で測定または観察されたタンパク質の天然に存在する形態に起因するタンパク質によって示されるまたは発揮される任意の機能（複数可）を指す。相同体またはミメティック（以下に論じられる）などにおけるタンパク質の修飾は、天然に存在するタンパク質と同一の生物活性を有するタンパク質または天然に存在するタンパク質と比較して生物活性が低下もしくは増大したタンパク質をもたらし得る。タンパク質発現の減少またはタンパク質の活性の低下をもたらす修飾は、不活性化（完全または部分）、下方制御またはタンパク質の作用の減少と呼ばれることがある。同様に、タンパク質発現の増大またはタンパク質の活性の増大をもたらす修飾は、増幅、過剰産生、活性化、増強、上方制御またはタンパク質の作用の増大と呼ばれることがある。
チオレドキシン組成物の調製
チオレドキシンに特徴的な構造的安定性および物理的堅牢性のために、主な製剤開発目標は、完全に還元された活性形態での貯蔵されたタンパク質の維持であった。最初のアプローチとして、ＤＴＴを使用して還元されたタンパク質をＰＢＳ中に交換し、酸素を除去するために窒素を用いて脱気し、連続的な凍結－解凍サイクルを避けるために単回使用アリコートで－８０℃で凍結した。この戦略には、貯蔵および使用の際にかなりの注意が払われることが必要であり、急速冷凍された場合であってもタンパク質が水溶液中で迅速に酸化したので最適ではなかった。乾燥貯蔵製剤中の天然Ｔｒｘの還元状態を安定化させようとして糖類および化学的賦形剤の種々の複雑な組合せを利用したＳｙｎｇｅｎｔａ ＣｏｒｐおよびＯｃｔｏｐｌｕｓ（製剤開発の専門家）で実施された広範な仕事に基づいて、他の製剤を評価した。これらの製剤のうち１つのみ（９％スクロース、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．２）が、凍結乾燥後にチオレドキシンに適した酸化還元安定性を与えると見出され、４０℃で６カ月間の加速貯蔵の際でさえ出発活性のほとんど完全な保持をもたらした。しかし、この複雑な製剤は、吸入された場合に炎症の可能性に関する懸念を引き起こし、高濃度のスクロースは、有害に溶液粘性を増大し、薬物デリバリーに必要なタンパク質濃度で適したバッファーでの等張性再構成を困難なものにした。大規模な実験法にもかかわらず、酸化、二量体化または多量体化なしにチオレドキシンを還元状態に適切に維持できる良性の製剤は報告されなかった。
本発明者らは、揮発性溶媒、例えば、２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）を利用する製剤化アプローチが、本発明のチオレドキシンタンパク質またはペプチドが還元形態で凍結される、および凍結乾燥されることを可能にする可能性があり、そのプロセスの間に、溶媒が完全に蒸発し、純粋なタンパク質のみが凍結乾燥物中に残るであろうという画期的な認識を得た。この反対のアプローチは、驚くべきことに、Ｓｙｎｇｅｎｔａの複雑なスクロース製剤よりもいっそう優れて、還元型チオレドキシンに有益な酸化還元安定化特性を与え、スクロースおよびＥＤＴＡの炎症促進効果を有さないと見出された。さらに、凍結乾燥材料中の残存する賦形剤を排除することによって、安定なチオレドキシンを、浸透圧の変更を配慮することなく、任意の所望のバッファーに再構成でき、５～１０ｍＭを超える安定な溶液濃度が可能になった。
本発明のさらなる実施形態は、本発明のチオレドキシンタンパク質およびペプチドの貯蔵および輸送にとって有用である組成物を調製する方法である。このような組成物は、患者への投与のために本発明のチオレドキシンタンパク質およびペプチドを含む医薬組成物を調製するために有用である。特に、本発明のチオレドキシンタンパク質およびペプチドは、複雑な安定剤または他の製剤化必要条件を有さない最小製剤中で還元状態で安定に貯蔵および輸送され得る。結果として、このような組成物から調製された本発明の再構成されたチオレドキシンタンパク質およびペプチドは、複雑な製剤化必要条件または何らかの賦形剤の必要性を有さない最小の裸の製剤中にある場合がある。本発明者らは、この方法によって、例えば、ＷＯ２００６／０９０１２７に記載されるようなスクロース－ＥＤＴＡ製剤を含む、導くためにかなりの実験法を必要とした、複雑な非揮発性賦形剤を使用して得られたものと同程度に良好であるか、またはそれよりも良好である、タンパク質および酸化還元安定性の保持が可能となるという驚くべき、予期しない結果を見出した。
方法は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒とを含む組成物を提供することを含む。次いで、方法は、水性溶媒を揮発させて、タンパク質またはペプチドを含む乾燥組成物を生成することを含む。このような組成物および得られた医薬組成物は、混入物、例えば、希釈剤、溶媒、他の溶液または液体、バッファー、塩、界面活性剤および他の化学物質を実質的に含まない。このような組成物は、タンパク質もしくはペプチドからなり得る、またはタンパク質またはペプチドから本質的になり得る。このような組成物の基本的および新規特性は、タンパク質もしくはペプチドのチオレドキシン活性部位が還元状態であり、自然酸化を起こすかなりの能力を欠き、もしくは自然二量体化を起こすかなりの能力を欠く、および／または等張性生理食塩水にひとたび再構成されると、タンパク質またはペプチドが還元形態で活性である（すなわち、標的と安定なジスルフィド結合を形成し得る）という特徴のうち１つまたは複数を含む。モノシステイン活性部位チオレドキシンの場合には、標的タンパク質ジスルフィドのＣｙｓ残基に共有結合的に結合することがさらに可能であり、これは、チオレドキシンの、活性形態で細胞内に取り込まれる能力を減弱する。
「溶媒」という用語は、本明細書で使用される場合、揮発によって、例えば、凍結乾燥によって溶媒を除去する前に、本発明のタンパク質またはペプチドが懸濁され、および／または溶解される液体または溶液を指す。「希釈剤」という用語は、本明細書で使用される場合、揮発による溶媒除去後に、本発明のタンパク質またはペプチドが再構成される液体または溶液を指す。このような再構成は、希釈剤中に懸濁または溶解されている本発明のタンパク質またはペプチドをもたらし得る。
本発明のタンパク質またはペプチドを生成するためのこの方法による組成物の調製は、溶媒に懸濁または溶解された本発明のタンパク質またはペプチドを用いて出発することによって達成できる。溶媒は、チオレドキシンの凍結乾燥に適した蒸気圧、例えば、少なくとも約３ｍｍＨｇを有し得る。蒸気圧はまた、少なくとも約１ｍｍＨｇ、２ｍｍＨｇ、３ｍｍＨｇ、４ｍｍＨｇ、５ｍｍＨｇ、６ｍｍＨｇまたは７ｍｍＨｇまたは少なくとも約１ｍｍＨｇから７ｍｍＨｇの間の任意の１０進数であり得る。他の実施形態では、水性溶媒の蒸気圧は、１ｍｍＨｇから１０ｍｍＨｇの間の任意の２つの値によって規定される範囲中であり得る。次いで、適した方法、例えば、標準プロトコールによる凍結乾燥に従って揮発を実施して、溶媒または他の液体を含まない還元状態の本発明のタンパク質またはペプチドを生成できる。このような得られたタンパク質またはペプチドは、実質的に純粋（例えば、少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９％または１００％純粋）であり得る。
一部の実施形態では、水性溶媒は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムおよび重炭酸トリエチルアンモニウムからなる群から選択され得る。水性溶媒は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間または１ｍＭから約５０ｍＭの間の任意の整数範囲の濃度であり得る、および／または約４から約７の間または約４から約７の間の任意の１０進数のｐＨを有する。一部の実施形態では、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒とを有する組成物は、糖類または糖類誘導体を含有せず、一部の実施形態では、約３ｍｍＨｇ未満の蒸気圧を有するタンパク質またはペプチド以外の化合物を全く含有しない。
この方法に従って提供される、溶媒および本発明のタンパク質またはペプチドの混合物は、実質的に単一溶媒および本発明のタンパク質またはペプチドのみからなり得る。混合物はまた、本発明のタンパク質またはペプチドおよびこの方法の蒸気圧制限を集合的に満たす複数の溶媒（すなわち、混合溶媒）からなる場合もある。混合物はまた、２つ以上の本発明のタンパク質またはペプチド、例えば、本明細書で開示されるチオレドキシンの変異体および／または他のタンパク質もしくはペプチドのうち２つ以上を含有する場合もある。
あるいは、本発明のタンパク質またはペプチドおよび溶媒の混合物は、本発明のタンパク質またはペプチドおよび溶媒から本質的になり得る。このような実施形態の基本的および新規特徴は、本発明のタンパク質またはペプチドが還元状態のままでありながら、本発明のタンパク質またはペプチド以外の混合物の構成成分は揮発され得るということである。この方法では、本発明のタンパク質またはペプチドは、還元状態で安定に保存することができ、貯蔵のために安定である状態に凍結乾燥され、医薬品および／または非医薬品使用のために還元状態で容易に再構成される。
凍結乾燥手順の重要な態様は、還元状態の安定な本発明のタンパク質またはペプチドを生成できるということである。凍結乾燥のための出発材料が還元型チオレドキシンである場合には、本明細書で記載されるプロセスは、還元状態のチオレドキシン活性部位システインを保存でき、還元状態の実質的に純粋な活性部位システインを有するチオレドキシンをもたらす。さらに、チオレドキシン中に他のシステインが存在するか否かに関わらず、チオレドキシン活性部位システインを還元状態で保存できる。
還元状態の実質的に純粋な活性部位システインを有する本発明のタンパク質またはペプチドは、次いで、貯蔵に適しており、他の方法によって調製されたタンパク質組成物よりも、種々の温度で種々の期間の貯蔵を行いやすい。例えば、この方法によって調製された本発明のタンパク質またはペプチドは、安定であり得る（例えば、還元状態の活性部位システインを有する）、例えば、約５０％超の活性、約６０％超の活性、約７０％超の活性、約８０％超の活性、約９０％超の活性または約９５％超の活性を有する。このような活性レベルは、少なくとも約３時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約２週間または少なくとも約１カ月の間達成され得る。したがって、得られた組成物は、－８０℃から４０℃の間で貯蔵でき、チオレドキシン還元活性を保持することができる。
この方法によって生成された組成物は、実質的に塩を含まない、例えば、約０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５または１０ｍＭ未満の塩を有する場合がある。さらに、凍結乾燥組成物は、重量で少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の本発明のタンパク質またはペプチドを含むとして、さらに特徴付けることができる。
上記のように調製された本発明のタンパク質またはペプチドは、次いで、医薬品および非医薬品使用を含む種々の使用のために再構成され得る。再構成は、本発明のタンパク質またはペプチドを適した希釈剤中に再懸濁または溶解することによって達成できる。例えば、本発明のタンパク質またはペプチドは、滅菌水、等張性生理食塩水、高張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、それらの組合せまたは再構成に適した他の希釈剤を用いて再構成できる。一部の実施形態では、希釈剤は、患者、例えば、ヒト患者への投与に適しているが、非ヒト哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類および両生類を含む他の動物も含む。
あるいは、上記のように調製された本発明のタンパク質またはペプチドは、再構成を伴わずに使用され得る。例えば、本発明のタンパク質またはペプチドは、食品または錠剤中で散剤として、または乾燥構成成分として投与され得る。非再構成型チオレドキシンの他の使用も可能である。
本明細書で記載される調製方法は、本明細書で記載されるチオレドキシンのチオレドキシン変異体、断片、活性部位、相同体または他のバージョンのいずれかのために使用され得る。
本発明者らによって開発された、この方法および得られた製剤は、揮発性溶媒を利用し、凍結乾燥後に純粋な乾燥タンパク質をもたらす。このプロセスによって、構成成分、例えば、等張性緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での再構成が可能となり、これは、製剤化およびデリバリープロセスを著しく単純化する。注目すべきことに、新規凍結乾燥タンパク質は、吸入スクロース／ＥＤＴＡの潜在的な炎症のリスクを排除しながら、スクロースベースの製剤と同様の同等の酸化還元安定性を有する。この新規製剤は、最終凍結乾燥材料においてすべての賦形剤の排除を可能にし、デバイス、例えば、電気振動メッシュネブライザーによるデリバリーのための単純な等張性生理食塩水バッファーでの再構成を容易にした。得られた製剤は、単純であり、スクロース含有吸入薬物製品の潜在的な安全性およびデリバリー／効率の課題に対して、塩／賦形剤を含まない製剤であるという説得力のある利点を有する。予備的安定性データは、元のスクロース製剤と同等であるか、それよりも優れている可能性があるということを示す。
さらなる実施形態では、本発明は、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物であって、約４００ｎｍ超で紫外（ＵＶ）吸光度を有するチオレドキシンタンパク質画分を含まない組成物と、それを作製する方法とを含む。驚くべきことに、本発明のタンパク質の生成後、約４００ｎｍより大きい光波長で吸光度を有するタンパク質画分の除去を含むチオレドキシン活性を有するタンパク質画分の精製は、乾燥（凍結乾燥）形態であるか、または乾燥形態から例えば、生理食塩水バッファーで再構成されている組成物であるかに関わらず、組成物中のペプチドまたはタンパク質の安定性を増大するということを見出した。このようなペプチドまたはタンパク質組成物はまた、より低い含水量、例えば、約５．０重量％、４．０重量％、３．０重量％未満、または約５．０重量％から１．０重量％の間の任意の０．１重量％増分未満に乾燥することができると見出された。
一部の実施形態では、組成物中の残存するペプチドまたはタンパク質画分は、約４００ｎｍ未満、約３９０ｎｍ未満、約３８０ｎｍ未満、約３７０ｎｍ未満、約３６０ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約３４０ｎｍ未満、約３３０ｎｍ未満、約３２０ｎｍ未満、約３１０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２９０ｎｍ未満または約２８０ｎｍ未満の光波長で吸光度を有する。
チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物であって、約４００ｎｍ超で吸光度を有する画分を含まない組成物を含む本発明の実施形態は、本明細書において別の場所に記載されるような種々の形式であり得る。例えば、このような組成物は、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドが、還元状態にあり、組成物が、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒をさらに含む、凍結乾燥に適した形態であり得る。あるいは、このような組成物は、上記のように低含水量を有する乾燥状態にあり得る。さらに、このような組成物は、再構成することができ、それらは、例えば、還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチド、水および塩化ナトリウムから本質的になる組成物中で投与に適している。
他の実施形態は、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を作製する方法を含み、組成物は、約４００ｎｍ超で吸光度を有する画分を含まない。このような方法は、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む溶解物を提供すること、組成物中のタンパク質またはペプチドを濃縮すること、および約４００ｎｍ超で吸光度を有するペプチドまたはタンパク質画分を除去することを含む。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質は、宿主細胞における組換え産生によって産生され得る。細胞は、溶解され、清澄化され得る。得られた清澄化された組成物は、イオン交換クロマトグラフィーなどのさらなる精製に付される場合もある。約４００ｎｍ超で吸光度を有する画分は、イオン交換クロマトグラフィー工程によってチオレドキシン活性および約４００ｎｍ未満の波長、例えば、約２８０ｎｍで吸光度を有する残りの主要タンパク質画分から分離されないことが見出された。しかし、この画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことは、主要タンパク質画分の、約４００ｎｍ超で吸光度を有する画分からの分離をもたらす。得られた主要タンパク質画分は、乾燥された場合の低い含水量および増大された安定性（例えば、遊離ＳＨ基および単量体パーセントによって測定されるような）を有することという上記の有益な性状を有する。
医薬組成物
本発明はまた、還元状態のチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドの溶液を含む医薬組成物に関する。一実施形態では、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位中の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない。このような医薬組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含む。種々の実施形態では、賦形剤は、酢酸アンモニウムバッファー、ギ酸、アンモニウムを含む酢酸、アンモニウムを含まない酢酸およびそれらの組合せから選択され得る。
一部の実施形態では、チオレドキシンモノシステイン活性部位は、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ（配列番号２４）、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１７）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１９）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｘ（配列番号２１）、Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｋ（配列番号２３）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ－Ｘ（配列番号２５）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｘ（配列番号２６）およびＷ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｋ（配列番号２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ残基は、システイン以外の任意のアミノ酸残基である。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号1のチオレドキシンモノシステイン活性部位配列を含む。さらなる実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号２８および配列番号２８に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列から選択される配列を含み、チオレドキシンモノシステイン活性部位は、配列番号２８の３２～３５位に対応する位置にある。さらなる実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号２９および配列番号２９に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列から選択される配列を含み、チオレドキシンモノシステイン活性部位は、配列番号２９の３２～３５位に対応する位置にある。
このような医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔、気管内、気管支、肺への直接設置、吸入、経口、局所および眼から選択される経路による患者への投与のために製剤化され得る。
投与
さらに、本発明の医薬組成物を含む組成物は、薬学的に許容される担体中で患者に投与できる。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体とは、適したインビボまたはエキソビボ部位に、本発明の方法において有用な治療用タンパク質、核酸または他の化合物を送達するのに適している任意の物質を指す。好ましい薬学的に許容される担体は、タンパク質、核酸分子または化合物が所望の部位（例えば、処置されるべき粘液または痰が分泌されるか、または流れ出る部位）に到着すると、タンパク質、核酸分子または化合物を、粘液もしくは痰と接触すること（タンパク質または化合物の場合）または細胞に入り、細胞によって発現され、分泌され（核酸分子の場合）、その結果、還元状態の発現されたタンパク質が粘液もしくは痰と接触できることが可能である形態で維持することが可能である
患者へ投与するための本明細書で開示されるようなチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの適したまたは効果的な量は、その活性部位チオールのジスルフィドへの可逆性酸化を介して酸化還元反応に加わること、チオール－ジスルフィド交換反応を触媒することおよび特に、患者に治療的利益を提供するのに十分に、患者において粘液もしくは痰の粘弾性もしくは粘着性を低下させることおよび／または粘液もしくは痰の液化を増大することが可能である量である。粘弾性もしくは粘着性の低下または粘液もしくは痰の液化の増大は、本明細書においてこれまでに記載したように、または当業者に公知の任意の適した方法によって測定、検出または決定できる。上記で論じられたように、このような測定は、チオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドの適したまたは効果的な量との接触の前後に、患者から得た粘液または痰のサンプル中の遊離チオールのパーセンテージを決定することおよび比較すること、ならびに還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドの適したまたは効果的な量との接触の前後に患者のＦＥＶレベルを決定することおよび比較することを含む。
本明細書で開示されるような還元状態のチオレドキシン活性部位を有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドはまた、粘液または痰の粘弾性を低下させることに加えて、治療的使用、例えば、炎症、高血圧症、酸化ストレスまたは感染の処置を有し、チオレドキシンタンパク質またはペプチドは、吸入、直接適用、滴下注入によって局所的に、または経口投与によって、あるいは、注入、注射または全身細胞外処置に適した他の投与経路によって投与される。
薬学的に許容される溶液中で製剤化された還元状態のチオレドキシンタンパク質の活性を決定する方法は、アッセイ、例えば、蛍光定量的アッセイおよび／または比色アッセイ、例えば、ＤＴＮＢアッセイ（５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸を使用する）によってチオレドキシンタンパク質中のシステインの酸化還元状態を決定することを含む。一態様では、チオレドキシンタンパク質は、単一のシステインアミノ酸を含む。一態様では、チオレドキシン活性部位中のＮ末端システインの酸化還元状態は、蛍光定量的アッセイおよび／または比色アッセイ、例えば、ＤＴＮＢアッセイによって決定される。
一実施形態では、患者に投与されるべき、本明細書で開示されるようなチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの適したまたは効果的な量は、約１０μモル／患者の体重１ｋｇ、１５μモル／ｋｇ、２０μモル／ｋｇ、２５μモル／ｋｇ、３０μモル／ｋｇ、３５μモル／ｋｇ、４０μモル／ｋｇ、４５μモル／ｋｇ、５０μモル／ｋｇ、５５μモル／ｋｇ、６０μモル／ｋｇ、６５μモル／ｋｇ、７０μモル／ｋｇ、７５μモル／ｋｇ、８０μモル／ｋｇ、８５μモル／ｋｇ、９０μモル／ｋｇ、９５μモル／ｋｇ、１００μモル／ｋｇ、１０５μモル／ｋｇ、１１０μモル／ｋｇ、１１５μモル／ｋｇ、１２０μモル／ｋｇ、１２５μモル／ｋｇ、１３０μモル／ｋｇ、１３５μモル／ｋｇ、１４０μモル／ｋｇ、１４５μモル／ｋｇ、１５０μモル／ｋｇ、１７５μモル／ｋｇ、２００μモル／ｋｇ、２２５μモル／ｋｇ、２５０μモル／ｋｇ、２７５μモル／ｋｇ、３００μモル／ｋｇ、３２５μモル／ｋｇ、３５０μモル／ｋｇ、３７５μモル／ｋｇ、４００μモル／ｋｇ、４２５μモル／ｋｇ、４５０μモル／ｋｇ、４７５μモル／ｋｇ、５００μモル／ｋｇ、５２５μモル／ｋｇ、５５０μモル／ｋｇ、５７５μモル／ｋｇ、６００μモル／ｋｇ、６２５μモル／ｋｇ、６５０μモル／ｋｇ、６７５μモル／ｋｇ、７００μモル／ｋｇ、７２５μモル／ｋｇ、７５０μモル／ｋｇ、７７５μモル／ｋｇ、８００μモル／ｋｇ、８２５μモル／ｋｇ、８５０μモル／ｋｇ、８７５μモル／ｋｇ、９００μモル／ｋｇ、９２５μモル／ｋｇ、９５０μモル／ｋｇ、９７５μモル／ｋｇ、１０００μモル／ｋｇ、１１００μモル／ｋｇ、１２００μモル／ｋｇ、１３００μモル／ｋｇ、１４００μモル／ｋｇ、１５００μモル／ｋｇ、１６００μモル／ｋｇ、１７００μモル／ｋｇ、１８００μモル／ｋｇ、１９００μモル／ｋｇ、２０００μモル／ｋｇ、２１００μモル／ｋｇ、２２００μモル／ｋｇ、２３００μモル／ｋｇ、２４００μモル／ｋｇまたは約２５００μモル／ｋｇの間を含む。
別の実施形態では、デリバリーの経路が肺へのエアゾールデリバリーまたは同様の経路である場合には、患者に投与されるべき、本明細書で開示されるようなチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの量は、標的部位で少なくとも１００μＭの効果的な濃度が達成されるように、投薬単位あたり約０．２５ｍｇ（例えば、ヒト用の投薬単位は、通常約２～３ｍｌである）～投薬単位あたり約１００ｍｇの間を含む。好ましくは、患者に投与されるべき、本明細書で開示されるようなチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドの量は、投薬単位あたり約０．２５ｍｇ、０．５０ｍｇ、１．０ｍｇ、５．０ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇまたは約１００ｍｇを含む。エアゾールデリバリーに使用されるデバイスに応じて、一部のエアゾールデリバリーデバイスのみが、エアゾール中の容量の約１０％が、肺に実際に送達されることを可能にする。しかし、デリバリーデバイスが振動メッシュネブライザーである場合には、エアゾール中の容量の約９０％が送達され得る。電気振動メッシュネブライザーは、ＣＦ患者によって非常に好まれる、薬物をはるかにより迅速に送達可能であり、より小さく、よりポータブルなデバイスである（Geller, D.E., Pediatric Pulmonology, 43(S9):S5-S17, 2008）。振動メッシュネブライザーはまた、薬物の送達でより効率的であり、エアジェットネブライザーに対して残存用量が少ない。治療的利益を達成するためにより少ない用量が必要とされるので、これは処置費用を低減するために特に重要である。これらなどのデバイスは、タンパク質の生物活性の低減をもたらさない（Kesser, K.C., et al. Resp Care, 54(6):754-768, 2009; Scherer, T., et al. J Pharm Sci, 100(1):98-109, 2011）。したがって、部位に送達される組成物の容量がより大きい他の投与投与について、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドのより少ない用量が使用され得ることは容易にわかる。
動物に投与されるべき本発明のタンパク質の最適量は、投与経路に応じて変わる。例えば、タンパク質が吸入（エアゾール）経路によって投与される場合には、投与されるべき最適量は、気管内マイクロスプレーによって投与されるべき最適量とは異なる場合がある。このような投与経路に応じて量を変えることは当業者の能力の範囲内である。本発明のタンパク質の適した量は、動物にとって毒性ではなく、所望の機能を有する量であるということに注意することは重要である。他の投与経路には、それだけには限らないが、特に、消化粘液の処置のための経口投与、または生殖性粘液の処置のための局所が含まれる。
本発明の一実施形態では、本明細書で開示されるようなチオレドキシン活性部位を含むチオレドキシンタンパク質を含有する本発明の医薬組成物を含む組成物は、還元剤を使用する最初の還元後に還元状態のチオレドキシン活性部位を維持する１つまたは複数の薬剤とともにデリバリーのためにさらに製剤化される。本発明において使用されるこのような還元剤として、それだけには限らないが、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）、リポ酸（ｌｉｐｉｏｃ ａｃｉｄ）、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、還元型グルタチオン、ジチオグリコール酸、２－メルカプトエタノール、トリス－（２－カルボキシエチル）ホスヘン（ｐｈｏｓｈｅｎｅ）、Ｎ－アセチルシステイン、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨおよび他の生物学的または化学的還元剤が挙げられる。本明細書において記載されるように、還元型チオレドキシンの好ましい凍結乾燥貯蔵製剤は、驚くべきことに、製剤化賦形剤を全く必要としないとわかった、ただし、ある特定の粘膜または上皮標的のための特定のデリバリー製剤は利益をもたらす場合がある。
治療的態様
天然または野生型チオレドキシンに対して、本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質またはペプチドのいくつかの利点および利益がある。Ｃ末端システインをシステイン以外の任意のアミノ酸残基で置換する活性部位修飾は、チオレドキシン活性部位の外側の１個または複数のシステイン残基の欠失および／またはシステイン以外の任意のアミノ酸残基での置換またはそれらの組合せとともに、細胞内シグナル伝達またはRancourt et al.(Free Radical Biol & Med 42:1441-43, 2007）によって記載されるものなどの全身曝露と関連するチオレドキシンの潜在的副作用を最小にするように設計される。これらの修飾は、Ｎ末端チオレドキシン活性部位システイン（例えば、ヒトチオレドキシン、配列番号１２中の３２位に位置する）によって触媒される、チオレドキシンおよび標的タンパク質ジスルフィドの間で形成される混合ジスルフィドに対する求核性攻撃を防ぐ。
驚くべきことに、本発明者は、このようなチオレドキシンが、罹患ヒト粘液の粘弾性を低下させる（液化に傾いた）および正常化する野生型チオレドキシンよりも大きな効力を有することを決定した。本発明者らは、モノチオール活性部位を含有するチオレドキシンが、チオレドキシン活性部位の外側の１個または複数のシステイン残基の欠失および／またはシステイン以外の任意のアミノ酸残基での置換またはそれらの組合せとともに、野生型チオレドキシンと比較して活性の障害を示さないだけでなく、６２、６９および７３位に３つの非活性部位Ｃｙｓ残基を依然として保持するチオレドキシンと比較して、特にレオロジー的アッセイにおいて、より大きな安定性およびヒトＣＦ粘液粘性を低減する定量的能力を示すことを見出した。
気道の粘液閉塞は、ＣＦの患者においてかなりの罹患率および死亡率を引き起こし得る。本発明者は、気道内でのこれらの分泌の持続を促進する粘弾性特性が、本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質またはペプチドによって著しく減少することをおよびラットにおいて４０ｍｇ／ｋｇほどの高い投薬でさえ有害作用を引き起こさないことを実証した。
したがって、本発明の一実施形態は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者において、粘液または痰の粘弾性を正常化し、低下させる方法に関する。方法は、患者の粘液または痰を、接触する工程の前と比較して粘液または痰の粘弾性を低下させるのに効果的な還元状態のチオレドキシン活性部位を有するチオレドキシンタンパク質またはペプチドを含む組成物と接触させる工程を含み、チオレドキシンタンパク質またはペプチドは、チオレドキシン活性部位の外側の１個または複数のシステイン残基の欠失および／またはシステイン以外の任意のアミノ酸残基での置換および／またはそれらの組合せを含み、すべての非活性部位システインが他の非システインアミノ酸に修飾される場合が好ましい。
本発明によれば、「粘液」という用語は、一般に、呼吸器、胃腸および生殖器系を含む、身体の種々の組織における粘膜によって分泌される普通は透明の粘着性の流体を指す。粘液は、分泌される組織を湿らせ、潤滑化し、保護する。粘液のゲル形成性成分であるムチン高分子（粘液タンパク質、核酸および炭水化物を含む）を含む。粘液タンパク質には、それだけには限らないが、呼吸器粘液タンパク質、消化管粘液タンパク質、生殖器系粘液タンパク質および眼の粘液タンパク質が含まれる。正常な粘液の粘弾性特性は、ムチンポリマーの濃度、分子量およびその間の絡み合いの程度に応じて変わる。「痰」という用語は、一般に、唾液および粘液を含む呼吸経路からの分泌物の混合物を指す。痰は、通常、唾液および粘液（および呼吸器組織からの他の分泌物）の喀痰された混合物である。したがって、粘液は、痰の主成分であり、そのようなものとして、過剰に粘弾性の粘液の存在は、それ自体が過剰に粘弾性である痰をもたらす。本発明は、異常に粘弾性の粘液または痰の粘性および／または硬化度を低下させることに関する。
「液化」という用語は、より液体になる作用を指す。したがって、粘液または痰の液化の増大とは、より固形のまたは粘性の相と比較した、粘液または痰の液相または液体状態の増大を指す。疾患と関連する異常に粘性または過剰の粘液の場合には、目的は、粘液粘性の正常なレベルを回復させることである。したがって、液化（または「正常化」）はまた、粘液粘性の低減と考えることができる。過剰の液化は、それ自体有害であり、そのため、粘液が完全に液化されるのではなく正常化されるように、その活性を自然に制限する液化剤が特に望まれる。
酸化され得るシステインに対して適切な割合の生物学的還元剤を有することによって、正常な粘液機能が達成されるということは理解される。したがって、生物学的還元剤活性の欠乏は、過剰の酸化されたシステインまたは生物学的還元剤の不足のいずれかによって引き起こされる。したがって、生物学的還元活性の適切なレベルの回復は、酸化ストレスが増大する、および／または粘液レベルが上昇する、もしくは天然の還元剤活性レベルが低下するいずれかの場合に、酸化（ジスルフィド結合形成）と還元（ジスルフィド結合切断）の間の正しいバランスを確実にする手段である。
身体における粘液および痰の一般的な機能は、粘液（したがって、痰の粘液成分）が粘弾性特性を有することを必要とする。正常な粘液および痰を有する個体（すなわち、健常な個体、またはより詳しくは、粘液または痰の粘性または粘着性によって引き起こされた、または増悪した症状もしくは状態に苦しんでいない個体）では、粘弾性は、ムチンポリマーの濃度、分子量およびその間の絡み合いに応じて変わる（Verdugo et al., Biorheology 20:223-230, 1983）。特にＣＦでは、粘液中のムチンが、瀕死の炎症細胞から放出されたＤＮＡおよびｆ－アクチンと相互作用する場合、粘液（したがって、痰）は、さらにいっそうより高密度に粘性になることがある。咳または粘液線毛クリアランスによって異常な増粘された粘液を排除できないことは、日和見病原性菌による肺の定着を促進する。
したがって、異常にまたは過剰に粘性および／または粘着性の粘液は、正常なまたは健常な患者（好ましくは、年齢および性別がマッチしている患者）から得た粘液よりも測定可能にまたは検出可能により粘性または粘着性である粘液として、ならびに／あるいは、その粘性および／または粘着性のレベルのために、患者に不快感もしくは疼痛を引き起こす、または状態もしくは疾患を引き起こすもしくは増悪する、患者における少なくとも１つの症状を引き起こすまたはその一因となる粘液として特徴づけられる。言い換えれば、異常にまたは過剰に粘性および／または粘着性の痰は、正常な粘液または痰からの逸脱であり、患者を処置して状態からの幾分かの軽減または他の治療的利益を提供することが望ましい。異常な粘液は、気道表面の場合におけるように移動性分泌粘液である場合も、消化管、頬側および鼻咽頭腔、生殖器系または眼におけるように静止分泌粘液である場合もある。
本発明の方法および組成物は、粘液または痰の粘弾性を低下することが望ましい任意の患者を処置するために、ならびに炎症、高血圧症、線維症、酸化ストレスまたは感染の処置のために使用でき、より好ましくは、チオレドキシンタンパク質またはペプチドが注入または注射によって投与される。ある特定の肺、副鼻腔、鼻腔、眼、消化器もしくは胃腸または生殖器の疾患または状態を有する患者は、本発明の方法および組成物を使用する処置から恩恵を受けることができる。
本発明は、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘弾性および／または粘着性によって引き起こされる、または増悪する状態または疾患の少なくとも１つの症状を寛解または低減するために最も有用であり、これには、もちろん、肺関連疾患、例えば、嚢胞性線維症ならびに消化器疾患、例えば、コクシジウム症または異常に粘弾性の粘液が炎症および病原体に対する応答の障害と組み合わされる場合がある炎症性腸疾患が含まれ得る。
他の疾患は、少なくとも時には、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘弾性および／または粘着性と関連する場合があり、このような症状が生じる場合には、本発明の方法は、粘液または痰の粘弾性を低下させるために、および患者に少なくとも幾分かの軽減または治療的利益を提供するために使用できる。このような疾患の例として、それだけには限らないが、嚢胞性線維症、慢性または急性気管支炎、気管支拡張症（非ＣＦおよびＣＦ気管支拡張症）、ＣＯＰＤ／肺気腫、急性気管炎（細菌性、ウイルス性、マイコプラズマ性または他の生物によって引き起こされる）、急性または慢性副鼻腔炎、気道の急性または慢性粘液閉塞（喘息発作重積状態を含む喘息などのさまざまな疾患において時折見られる）に起因する無気肺（肺または肺葉虚脱）、細気管支炎（ウイルス性またはその他）、それだけには限らないが、胎便性イレウスまたはＣＦにおける同等な胎便性イレウスまたは同様の障害を含む粘液乾固による急性、亜急性または慢性腸閉塞、他の消化器疾患および子宮頸部、精管または他の重要な生殖器構造の閉塞（それだけには限らないが）による不妊症ならびに異常に増粘された粘液分泌が炎症およびさらなる異常な分泌の悪循環を促進するドライアイ疾患が挙げられる。さらに、粘液線毛クリアランスの障害は、肺からの細菌および他の病原体のクリアランスと関連するので、本発明の組成物および方法は、ウイルス性および細菌性感染症の両方を含むさまざまな呼吸器感染症の患者における粘液または痰の過剰の粘弾性および／または粘着性と関連する症状を低減するために有用であり得る。
チオレドキシンは、暴走炎症反応および急性肺傷害をモジュレートすることにおいて役割を有する。細胞外チオレドキシンは、進行中の炎症プロセスにさらされる動物において炎症を低下させるように広く作用する。これは、好中球炎症がチオレドキシンによって阻害されたＣＯＰＤのマウスモデルにおいて、およびチオレドキシンの外因性デリバリーまたはトランスジェニック過剰発現がマウスにおいてウイルス性肺炎を防いだ、インフルエンザＡウイルス感染によって誘導された急性肺傷害のモデルにおいて観察された。チオレドキシンは、インビボでマウスにおいて洗浄液および肺組織において、およびインビトロでマウス肺上皮細胞において炎症促進性メディエーターＴＮＦ－ａおよびＣＸＣＬ１の誘導を抑制すると見出された。マウスでは、チオレドキシンは、ヒトマクロファージにおいてリポ多糖誘導性好中球走化性およびＬＰＳ誘導性ＩＬ－１ｂ発現を阻害した。チオレドキシンの抗炎症性および免疫モジュレート効果は、サイトカインメディエーター放出の管理、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）発現の抑制およびインフラマソーム活性の阻害を含むと提唱されてきた。重要なことに、チオレドキシンはまた、気道ＡＴ２幹細胞を炎症性損傷から保護するように作用する。これらの効果は、アロステリック制御機序を介して、ならびに炎症性標的に対する直接活性によって発揮される可能性が高い。しかし、迅速なクリアランスおよび不十分な薬理学が、外因性天然チオレドキシンの治療的使用にとってかなりの機能的制限であると見出された。また、細胞核における高濃度のチオレドキシンは、刺激に応じて炎症性サイトカイン放出を逆説的にもたらす。
したがって、本発明の一実施形態は、肺炎症、暴走炎症反応および急性肺傷害、例えば、ウイルス性呼吸器疾患と関連するものを処置する方法に関する。このような方法は、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を、このような状態および／またはウイルス性呼吸器疾患を有するか、またはそれを発症するリスクにある対象に投与することを含む。モノシステイン活性部位を有するタンパク質またはペプチドは、吸入される、局所抗炎症性、粘液正常化治療薬である本明細書で記載される任意のものであり得る。このような治療用組成物は、細胞内／核還元ストレスを防ぎ、天然チオレドキシンと比較して薬物動態を改善するために活性を区画化すること（ｃｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）を提供すると考えられる。
この実施形態では、肺炎症、暴走炎症反応および急性肺傷害は、ウイルスによって引き起こされ、気道に影響を及ぼす疾病であるウイルス性呼吸器疾患と関連している場合がある。このようなウイルス性呼吸器疾患として、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸窮迫症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９またはＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、喘息、肺炎、気管支炎、結核、反応性気道疾患症候群および間質性肺疾患と関連するウイルス感染症を挙げることができる。ウイルスは、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸器アデノウイルスを含む、１つまたは複数のウイルス性呼吸器疾患を引き起こし得るものを含んでいた。
新たに出現した証拠は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した呼吸器上皮を、重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患につながり得る事象のカスケードの開始と強く関連付ける。これらの重症に罹患した個体では、感染後の気道サイトカイン放出の調節不全が、免疫系反応性亢進が感染に対する暴走応答の引き金となり、病原体自体よりも多くの損傷を引き起こすサイトカイン放出 症候群（ＣＲＳ）をもたらす場合がある。肺胞上皮ＩＩ型（ＡＴ２）細胞、成体肺の幹細胞およびまた気道サーファクタントを産生する細胞は、サイトカインを分泌して、マクロファージを動員し、その活性化を開始するシグナルを出し、肺胞を防御することによって病原体および肺胞損傷に応答する。この応答が異常に活性化されたものになると、ＣＲＳにつながる場合があり、重症に罹患した患者では、全身性になり、圧倒的な致死的病理につながる。しかし、ウイルス感染の直接的細胞傷害性効果によるＡＴ２細胞の喪失はまた、死滅細胞の蓄積は、効率的な粘液線毛クリアランスを妨げ、肺体液貯留および肺炎を増強し、増え続ける炎症反応の悪循環をもたらすので、呼吸器機能の障害につながる場合がある。
ＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９および重症インフルエンザの最も恐ろしい合併症の１つであり、肺における広範な炎症と関連している。ＡＲＤＳの根底にある機序は、肺の微視的気嚢（肺胞）のバリアを形成する細胞へのびまん性傷害、サーファクタント機能不全および免疫系の活性化を含む。ＡＲＤＳと関連する肺における流体蓄積は、炎症による血管漏出によって部分的に説明される。感染が引き金となるＡＲＤＳの重要な態様は、肺上皮および内皮細胞によって分泌される化学的シグナルおよび他の炎症性メディエーターの最初の放出である。好中球および一部のＴ－リンパ球は、炎症肺組織中に遊走し、ＡＲＤＳの増幅／悪化の一因となる。炎症の脂質性メディエーター（プロスタグランジン）の産生の減少は、ＡＲＤＳと関連する炎症の消散を損なう場合がある（Fukunaga, et. al., Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology 2005; 174:5033-5039.; Gao et al J Immunol 2017; 199:2043-2054）。
本発明の方法を使用できるさらなる疾患または状態は、炎症、高血圧症、酸化ストレス、感染または線維症を処置するためのものである。したがって、一部の実施形態では、本発明は、対象において細菌性または他の感染症を処置するための方法を含む。この実施形態では、方法は、経口、直腸、鼻腔、吸入、気管内、気管支、直接設置、局所および眼への注射を含む眼からなる群から選択される経路による患者への投与のために製剤化された組成物を含み得る。感染症の処置のための一部の実施形態では、組成物は、タンパク質またはペプチドを発現する微生物細胞の、精製された医薬組成物、栄養補助食品または粗もしくは精製抽出物であり得る。このような抽出物は、例えば、動物飼料組成物において使用するために有用である。一部の実施形態では、本発明は、抗菌ペプチドを活性化するように作動可能なチオレドキシンモノシステイン活性部位を含む組成物を含み、活性化は、感染性疾患を処置または予防するための治療上効果的な試薬をもたらす。このような抗菌ペプチドは、デフェンシンであり得る。
本発明の他の実施形態は、対象の粘膜表面に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を有するタンパク質またはペプチドを含む組成物を局所的に投与することを含む、対象のマイクロバイオーム組成をモジュレートする方法を含む。このような粘膜表面は、肺表面、鼻咽頭表面または胃腸表面であり得る。このような実施形態では、マイクロバイオームのモジュレーションは、１つまたは複数の抗菌ペプチドを活性化する本発明のタンパク質またはペプチドによって達成され得る。
治療的利益は、必ずしも特定の疾患または状態の治癒ではなく、むしろ好ましくは、最も通常は、疾患もしくは状態の緩和、疾患もしくは状態の排除、疾患もしくは状態と関連する症状の低減もしくは排除、原発性疾患もしくは状態（例えば、呼吸器における過剰に粘性の粘液をうまく利用する日和見病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患）の発生に起因する続発性疾患もしくは状態の予防もしくは緩和および／または根底にある疾患もしくは状態または疾患もしくは状態と関連する症状の予防を含む結果を包含する。
本明細書で使用される場合、「疾患から保護された」という語句は、疾患の症状を低減すること、対症療法（治癒を達成することなく疾患の症状を軽減することまたは和らげること）、疾患の発生を低減することおよび／または疾患の重症度を低減すること、または疾患、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状、徴候または原因を緩和することを指す。予防することとは、患者に投与された場合に、疾患が発生することを防ぐ本発明の組成物の能力を指す。治癒すること（または疾患修飾すること）とは、患者に投与された場合に、疾患を治癒する本発明の組成物の能力を指す。患者を疾患から保護することは、疾患を有する患者を処置すること（治療的処置）を含む。疾患／状態を予防することは、疾患発生を予防すること（予防的処置）を含む。特に、患者を疾患から保護すること（または疾患を予防すること）は、有益な効果が得られるように、粘液または痰を、還元状態のチオレドキシン活性部位を含む本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドと接触させることによって、患者において異常に粘性の粘液または痰の液化を増大すること（正常化すること）によって達成される。有益な効果は、当業者によって、および／または患者を処置している熟練の臨床医によって容易に評価することができる。
「疾患」という用語は、患者の正常な健康からの任意の逸脱を指し、疾患症状が存在する状態ならびに逸脱（例えば、感染、遺伝子突然変異、遺伝子欠陥など）が生じているが、症状がまだ顕在化していない状態を含む。
患者の粘液および／または痰の、本明細書で開示されるような還元状態のチオレドキシンタンパク質またはペプチド（またはこのようなタンパク質を含む組成物）との接触は、組成物との接触の前と比較して、粘液または痰の粘弾性の低下／液化の増大をもたらすように意図される。本発明によれば、粘液または痰の正常化は、以前の液化のレベルと比較した、粘液または痰の液化のレベルの任意の測定可能なまたは検出可能な増大である場合があり、好ましくは、統計的に有意な増大である（すなわち、患者サンプルとベースライン対照の間の液化の測定可能なレベルの相違が、統計的に有意であり、少なくともｐ＜０．０５の信頼度を有する）。
正常な健常な個体は、一般に、対照として役立つのに十分な痰の量を産生できないので、通常「ベースライン対照」は、処置の投与の前の患者サンプルである、ただし、正常な健常な個体から得た痰はベースライン対照として除外されない。さらに、粘性の低下は、肺機能の改善をもたらす。この改善は、患者の報告されたアウトカム、入院までの増悪の平均時間および／または強制呼気量（ＦＥＶ）の増大を含む種々の手段によって決定できる。
本発明の一態様では、ＦＥＶの増大は、本発明の組成物またはタンパク質との接触の前に患者から得たサンプルと比較した、少なくとも約２．５％、約３．０％、約３．５ ％、約４．０％、約４．５％、約５．０％、約５．５％、約６．０％、約６．５％、約７．０％、約７．５％、約８．０％、約８．５％、約９．０％および９．５％および約１０％の増大として記載される。好ましくは、本発明の組成物またはタンパク質の、患者サンプルの粘液または痰との接触は、本発明の組成物またはタンパク質との接触の前に患者から得たサンプルと比較して約２．５％の増大をもたらす。
粘液もしくは痰の液化および／または粘弾性の低下は、それだけには限らないが、実施例の節に記載されるような圧縮アッセイを含む、当技術分野で公知の任意の適した技術を使用して測定できる。このようなアッセイでは、固相（ゲル）対水相（液体）中の粘液または痰の量が測定される。
本発明の他の態様では、粘液または痰の相対的粘性または粘着性は、それだけには限らないが、粘弾性（例えば、レオメトリーまたは磁気マイクロレオメトリーによって測定された）、糖タンパク質含量またはＤＮＡ含量を含む他のパラメータまたは指標を使用して測定できる。本発明の別の態様では、粘液タンパク質ジスルフィド結合の変化を、ジスルフィド結合の破壊によって作出される結合していない（遊離の）Ｃｙｓ残基チオール基と優先的に反応するＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）などの試薬の使用によって推定できる（Rancourt, R. et al., Free Radic Biol Med, 42(9):1441-1453, 2007）。
本発明の一態様では、液化のレベルは、粘液または痰サンプルの総容量のパーセンテージとして、水性（液体）相中にある所与の粘液または痰サンプルの量として記載される。嚢胞性線維症の患者では、例えば、粘液または痰の液化のレベルは、総容量の１０％未満まで、またはさらに５％未満まで低いものであり得る。好ましくは、本発明のタンパク質または組成物の、粘液または痰との接触は、総容量の少なくとも約１５％が液相中にある、より好ましくは、少なくとも約２０％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約２５％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約３０％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約３５％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約４０％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約４５％が液相中にある、より好ましくは、総容量の少なくとも約５０％が液相中にあるように、または粘液によって引き起こされた機能の遮断または阻害が解消されるまで（例えば、患者の気道が十分にきれいにされて、流体を喀痰し始めるまで）、粘液または痰の液化の変化をもたらす。ムチン脱重合をもたらす完全な液化は、繊毛作用による粘液輸送に必要な有益な粘弾性を破壊するので、８０または９０％を超える増大は、一般に、望ましくない。粘液または痰の過剰の液化はまた、患者にとって有害である場合がある（例えば、患者によって痰が除去され得る前に、液化された痰が、逆流し、小さい気道に、感染している可能性がある濃度の低い液体が溢れる可能性がある）。この関連で、標的選択的天然還元剤、例えば、チオレドキシンは、これらが、粘液の重合体構造を作出するために必須の分子間結合を形成する平面のジスルフィドよりも高度に構造化されたジスルフィド結合を好む（例えば、Passam, F.J., and Chiu, J., Allosteric disulphide bonds as reversible mechano-sensitive switches that control protein functions in the vasculature, Biophys Rev 11, 419-430, 2019に記載されるような）ので非常に好ましい。小分子還元剤は、標的優先度を欠き、従って、過剰液化による有害作用をもたらす場合がある。一部の実施形態では、本発明のタンパク質または組成物の、粘液または痰との接触は、総容量の約１５％から約９０％の間または１５％と９０％の間の任意の整数範囲が液相中にあるような、粘液または痰の液化の変化をもたらす。
従って、一般に、痰または粘液の液化は、痰を過剰に液化することなく、気道または経路（例えば、胃腸または生殖器系における）がきれいにされるまで、小さい段階的な増分で増大されることが好ましい。好ましくは、本発明のタンパク質、ペプチドまたは組成物の、粘液または痰との接触は、患者の気道または他の詰まった経路が解消されるまで、処置の前と比較して、１％の増分で、粘液または痰の液化の容量で少なくとも約１％の増大、より好ましくは、少なくとも約２％の増大などをもたらす。例えば、いわゆる「粘液プラグ」の除去によってひとたびこのような解消が達成されて、薬物の小気道および肺胞への接近を改善すると、新規に分泌されるムチンタンパク質をジスルフィド結合の正常な状態で維持するために、より低用量の維持療法を行うことができる。チオレドキシン、特に、標的結合性モノチオールチオレドキシンは、非選択的還元剤よりも過剰液化を引き起こす可能性がはるかに低く、有効用量と毒性用量の間の治療濃度域を大きく増大する。
一態様では、療法は、患者の罹患組織（気道、消化管、生殖器系）から濃度が下がった材料を除去する方法とともに実施される。例えば、呼吸器系の場合には、本発明の方法を、体位ドレナージ、ハフ咳および他の呼吸運動または液化された粘液または痰を喀痰するための任意の適した方法とともに使用できる。
本発明によれば、処置されるべき患者における粘液または痰を、システイン以外の任意のアミノ酸残基での、チオレドキシン活性部位の外側の１個または複数のシステイン残基の置換を含有する、本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質（またはタンパク質を含む組成物）と接触させる。タンパク質は、接触させる工程の前と比較して、痰もしくは粘液の粘弾性および粘着性を低減するのに、および／または痰もしくは粘液の液化を増大するのに効果的である。以前に記載されたように、チオレドキシンは、ほとんどの生物において見出されるタンパク質ジスルフィドレダクターゼであり、多数のチオール依存性細胞還元プロセスに加わる。ヒトでは、チオレドキシンはまた、成人Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）と呼ばれる。細胞内では、この遍在性の低分子量（１１，７００）タンパク質のほとんどは、還元されたままである。還元型または酸化型チオレドキシンは、無傷の細胞に入ることまたは細胞膜に吸収（ａｂｓｏｒｂ）することができ、そこで少量が、時間の経過とともに徐々に内部移行される。天然チオレドキシンは、活性部位に２つの近接するシステイン残基を有し、酸化型タンパク質では、タンパク質の三次元構造からの突出中に位置するジスルフィド橋を形成する。フラボタンパク質チオレドキシンレダクターゼは、このジスルフィドのＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する。さらに、変更された補因子特異性のために修飾されたチオレドキシンレダクターゼの操作されたバージョンは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７１，３０７号に記載されるようにＮＡＤＰＨの代わりに、またはそれに加えてＮＡＤＨを利用する場合もある。チオレドキシンのわずかな増加が、タンパク質においてスルフヒドリル－ジスルフィド酸化還元状態の著しい変化を引き起こし得る。酸化型チオレドキシン、特に、分泌形態はまた、分泌型酵素グルタレドキシンとともにグルタチオンの作用によって還元され得る（Du, Y., Zhang, H., Lu, J., and Holmgren, A., Glutathione and glutaredoxin act as a backup of human thioredoxin reductase 1 to reduce thioredoxin 1 preventing cell death by aurothioglucose, Journal of Biological Chemistry 287, 38210-38219, 2012）。ＧＳＨおよびグルタレドキシンの両方とも、気道中に豊富にある。
チオレドキシンは、細胞タンパク質の還元を達成するその能力に加えて、抗酸化剤として（例えば、反応性酸素種をスカベンジすることによって、酸化され得る基質の酸化を防ぐことによって）ならびにペルオキシダーゼ酵素の活性によって直接的に作用できる、ただし、チオレドキシンは、他のチオールとは異なり、一般に、自動酸化による（例えば、自動酸化によってスーパーオキシドラジカルを生成する）細胞における酸化ストレスに寄与しないということが認識されている。White et al.の米国特許第５，９８５，２６１号、前掲は、チオレドキシンがＭｎＳＯＤの生成を直接的に誘導することおよびこのような誘導が還元状態のチオレドキシンによって達成されるということを示した。
さらなる治療用変異体
一実施形態では、チオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、薬物設計または選択の生成物である場合があり、当技術分野で公知の種々の方法を使用して生成することができる。このようなタンパク質またはペプチドは、ミメティクスと呼ばれることもある。ミメティックとは、天然に存在するペプチドの生物学的作用を模倣できる任意のペプチドまたは非ペプチド化合物を指すが、これは、ミメティックが、しばしば天然に存在するペプチドの基本構造を模倣する基本構造を有する、および／または天然に存在するペプチドのサイレントな生物学的特性を有するからである。ミメティクスとして、それだけには限らないが、天然に存在するペプチドとの側鎖類似性がない（このような修飾は、例えば、分解に対するその感受性を低下させ得る）などの、原型からの実質的な修飾を有するペプチド、抗イディオタイプおよび／または触媒抗体またはその断片、単離されたタンパク質の非タンパク質性部分（例えば、炭水化物構造）または例えば、コンビナトリアルケミストリーによって同定された核酸および薬物を含む合成もしくは天然有機分子を挙げることができる。
このようなミメティクスは、当技術分野で公知のさまざまな方法を使用して設計、選択および／またはそうでなければ同定できる。本発明において有用なミメティクスまたは他の治療用化合物を設計または選択するために有用な薬物設計の種々の方法は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc.に開示されている。強力な、選択的な酸化還元活性を可能なチオレドキシンミメティックペプチドは、Bachnoff et al., Free Radical Biol Med 50:1355-67 (2011)によって記載されており、参照によりその全体で組み込まれる。ミメティックは、例えば、分子多様性戦略（大きな化学的に多様な分子ライブラリーの迅速な構築を可能にする関連戦略の組合せ）、天然または合成化合物のライブラリーから、特に、化学的またはコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列またはサイズが異なるが、同様のビルディングブロックを有する化合物のライブラリー）から、または合理的な、指向性もしくはランダムな薬物設計によって得ることができる。例えば、Maulik et al.、前掲を参照されたい。
分子多様性戦略では、生物学的、酵素的および／または化学的アプローチを使用して、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物および／または合成有機分子から大きな化合物ライブラリーが合成される。分子多様性戦略の開発における重大なパラメータとして、サブユニット多様性、分子サイズおよびライブラリー多様性が挙げられる。このようなライブラリーをスクリーニングする一般的な目的は、コンビナトリアル選択の逐次適用を利用して、所望の標的に対する高親和性リガンドを得ること、次いで、ランダムまたは指向性設計戦略のいずれかによってリード分子を最適化することである。分子多様性の方法は、Maulik, et al.、同書に詳細に記載されている。
Maulik et al.はまた、例えば、ユーザーが適切に選択された断片の断片ライブラリーから新規分子を作出するプロセスを指示する、指向性設計、ユーザーが遺伝的アルゴリズムまたは他のアルゴリズムを使用して、断片およびそれらの組合せを無作為に突然変異し、一方で、選択基準を同時に適用して、候補リガンドの適応度を評価する、ランダム設計、ならびにユーザーが、三次元受容体構造と小さい断片プローブの間の相互作用エネルギーを算出し、続いて、都合のよいプローブ部位を一緒に連結する、グリッドベースのアプローチの方法を開示している。
前述のものなどの多様性作出方法は、活性部位ミメティクスのような低減されたサイズの分子のために、機能または薬理学を改善するように設計された他の技術と組み合わせることができる。例えば、初期段階の研究において有望であった１つのアプローチは、炭化水素ステープルαヘリックスペプチド、化学的ブレースであるすべて炭化水素のステープルの部位特異的導入によって、その生物活性αヘリックスフォールドに固定された合成ミニタンパク質の新規クラスである。ステープリングは、ペプチドの薬理的性能を大きく改善し、その標的親和性およびタンパク質分解抵抗性を増大でき、一方で、化学合成に適しているより大きなタンパク質／酵素のより小さいペプチドバージョンを作出する（Verdine, G. L. and Hilinsky, G. J., Methods Enzymol, 503:3-33, 2012)。
本発明の一実施形態では、本発明において使用するのに適したチオレドキシンタンパク質は、チオレドキシンタンパク質の全長配列または本明細書で記載されるチオレドキシン活性部位を有するその任意の断片を含む、から本質的になる、またはからなるアミノ酸配列を有する。例えば、本明細書で記載されるようなチオレドキシン活性部位を含有する、配列番号４～１５の天然配列またはその断片または他の相同体のいずれか１つは、本発明によって包含される。このような相同体は、整数で１０％から１００％の間の任意のパーセンテージ（１０％、１１％、１２％，．．．９８％、９９％、１００％）を含む、全長チオレドキシンタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％同一である、または少なくとも２０％同一である、または少なくとも３０％同一である、または少なくとも４０％同一である、または少なくとも５０％同一である、または少なくとも６０％同一である、または少なくとも７０％同一である、または少なくとも８０％同一である、または少なくとも９０％同一である、または全長チオレドキシンタンパク質のアミノ酸配列に対して９５％超同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み得る。
本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、パーセント（％）同一性への言及は、（１）アミノ酸検索のためにｂｌａｓｔｐを、および核酸検索のためにｂｌａｓｔｎを標準デフォルトパラメータを用いて使用し、クエリー配列は、デフォルトによって低複雑度領域のためにフィルタリングされる、ＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検索（参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載される）、（２）ＢＬＡＳＴ２アラインメント（以下に記載されるパラメータを使用する）、（３）および／または標準デフォルトパラメータを用いるＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（位置特異的繰り返しＢＬＡＳＴを使用して実施される相同性の評価を指す。ＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２の間の標準パラメータの幾分かの相違のために、ＢＬＡＳＴ２プログラムを使用して２つの特定の配列が有意な相同性を有すると認識されることがあるが、クエリー配列として配列の一方を使用してＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴにおいて実施された検索がトップマッチに第２の配列を同定しない場合があるということは知られている。さらに、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴは、自動化された、使いやすいバージョンの「プロファイル」検索を提供し、これは、配列相同体を探すための感度の高い方法である。プログラムは、まず、ギャップ付きＢＬＡＳＴデータベース検索を実施する。ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムは、返された任意の重要なアラインメントからの情報を使用して、位置特異的スコアマトリックスをコンストラクトし、これがデータベース検索の次のラウンドのクエリー配列と置き換わる。したがって、パーセント同一性はこれらのプログラムのうちいずれか１つを使用することによって決定できるということは理解されるべきである。
参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250に記載されるように、２つの特定の配列を、ＢＬＡＳＴ２配列を使用して互いにアラインすることができる。ＢＬＡＳＴ２配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用してｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで実施され、結果として得られるアラインメント中にギャップ（欠失および挿入）の導入を可能にする２つの配列の間でのギャップ付きＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ２．０）が実施される。本明細書において明確にするために、ＢＬＡＳＴ２配列アラインメントが、以下のとおりに標準デフォルトパラメータを使用して実施される。
ｂｌａｓｔｎでは、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して：
マッチのリワード＝１
ミスマッチのペナルティー＝－２
オープンギャップ（５）および伸長ギャップ（２）ペナルティー
ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルター（オン）
ｂｌａｓｔｐでは、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して：
オープンギャップ（１１）および伸長ギャップ（１）ペナルティー
ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルター（オン）。
本発明において有用なタンパク質はまた、活性部位を含有する任意の全長チオレドキシンタンパク質の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基（配列番号４～１５によって表される天然配列、すなわち、参照配列の１０個の連続するアミノ酸と１００％の同一性を有する１０個の連続するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有し、活性部位の外側の非活性システイン残基の欠失および／または置換を有するチオレドキシンタンパク質を含み得る。他の実施形態では、チオレドキシンタンパク質の相同体は、天然に存在するチオレドキシンタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも１５個または少なくとも２０個または少なくとも２５個または少なくとも３０個または少なくとも３５個または少なくとも４０個または少なくとも４５個または少なくとも５０個または少なくとも５５個または少なくとも６０個または少なくとも６５個または少なくとも７０個または少なくとも７５個または少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基など、最大でタンパク質の全長を含み、整数で任意の介在する長さ（１０、１１、１２，．．）を含み、活性部位を含むアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、「連続する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）」または「連続的な（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）」という用語は、本明細書で記載される配列に関して、途切れのない配列で接続されていることを意味する。例えば、第１の配列について第２の配列の３０個の連続する（または連続的な）アミノ酸を含むとは、第１の配列が、第２の配列中の３０個のアミノ酸残基の途切れのない配列に対して１００％同一である３０個のアミノ酸残基の途切れのない配列を含むことを意味する。同様に、第１の配列について第２の配列と「１００％の同一性」を有するとは、第１の配列が第２の配列に正確にマッチし、ヌクレオチドまたはアミノ酸の間にギャップがないことを意味する。
別の実施形態では、本発明において有用なタンパク質は、相同体をコードする核酸配列が、中程度、高いまたは極めて高いストリンジェンシー条件（以下に記載される）下で、天然チオレドキシンタンパク質をコードする核酸分子に（すなわち、それと）（すなわち、天然チオレドキシンアミノ酸配列をコードする核酸鎖の相補体と）ハイブリダイズ可能である、天然チオレドキシンアミノ酸配列に対して十分に類似したアミノ酸配列を有するチオレドキシンタンパク質を含む。このようなハイブリダイゼーション条件は、以下に詳細に記載されている。
本発明のチオレドキシンタンパク質をコードする核酸配列の核酸配列相補体とは、チオレドキシンをコードする鎖に対して相補的である核酸鎖の核酸配列を指す。所与のアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、一本鎖ＤＮＡに対する相補体である配列を有するその相補鎖とを含むということは認められよう。そのようなものとして、本発明の核酸分子は、二本鎖または一本鎖のいずれかである場合があり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、チオレドキシンタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、および／またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補体と安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補配列を推定する方法は、当業者に公知である。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーション条件への言及は、類似の核酸分子を同定するために核酸分子が使用される標準ハイブリダイゼーション条件を指す。このような標準条件は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al.、同書に開示されており、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる（具体的には、９．３１～９．６２頁を参照されたい）。さらに、種々の程度のヌクレオチドのミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を算出するための式は、例えば、Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al.同書に開示されており、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
より詳しくは、本明細書において言及されるような中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と、少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容する条件（すなわち、ヌクレオチドの約３０％以下のミスマッチを許容する条件）を指す。本明細書において言及されるような、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容する条件（すなわち、ヌクレオチドの約２０％以下のミスマッチを許容する条件）を指す。本明細書において言及されるような、極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と、少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容する条件（すなわち、ヌクレオチドの約１０％以下のミスマッチを許容する条件）を指す。
上記で論じられたように、当業者は、これらの特定のレベルのヌクレオチドミスマッチを達成するために適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を算出するためにMeinkoth et al.、同書における式を使用できる。このような条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されているかに応じて変わる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの算出された融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてよりも１０℃低い。
特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）のイオン強度での、約２０℃から約３５℃の間（より低いストリンジェンシー）、より好ましくは、約２８℃から約４０℃の間（よりストリンジェント）、いっそうより好ましくは、約３５℃から約４５℃の間（いっそうよりストリンジェント）の温度でのハイブリダイゼーションを、適切な洗浄条件とともに含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）のイオン強度での、約３０℃から約４５℃の間、より好ましくは、約３８℃から約５０℃の間、いっそうより好ましくは、約４５℃から約５５℃の間の温度でのハイブリダイゼーションを、同様にストリンジェントな洗浄条件とともに含む。これらの値は、約１００個より多いヌクレオチドの分子の融解温度、０％のホルムアミドおよび約４０％のＧ＋Ｃ含量の算出に基づく。あるいは、Ｔｍは、Sambrook et al.、前掲、９．３１～９．６２頁に示されるように経験的に算出できる。一般に、洗浄条件は、できる限りストリンジェントであるべきであり、選択されたハイブリダイゼーション条件にとって適切であるべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、塩と、特定のハイブリッドの算出されたＴｍよりおよそ２０～２５℃低い温度条件の組合せを含むことができ、洗浄条件は、通常、塩と、特定のハイブリッドの算出されたＴｍよりおよそ１２～２０℃低い温度条件の組合せを含む。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドとともに使用するのに適したハイブリダイゼーション条件の一例は、約４２℃で６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中で２～２４時間のハイブリダイゼーションと、それに続く、室温で約２×ＳＳＣ中で１回または複数回の洗浄を含む洗浄工程と、それに続く、より高い温度およびより低いイオン強度での追加の洗浄（例えば、約３７℃で、約０．１×～０．５×ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄と、それに続く、約６８℃で、約０．１×～０．５×ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄を含む。
チオレドキシンの種々の配列との融合
本発明のチオレドキシンタンパク質はまた、チオレドキシン活性部位を含有するセグメントおよびさまざまな機能を有し得る融合セグメントを含む融合タンパク質であり得る。例えば、このような融合セグメントは、本発明のタンパク質の精製を単純化する、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを使用する得られた融合タンパク質の精製を可能にするツールとして機能し得る。適した融合セグメントは、所望の機能を有する（例えば、タンパク質に増大された安定性を付与する、タンパク質に増大された免疫原性を付与する、および／またはタンパク質の精製を単純化する）任意のサイズのドメインであり得る。１つまたは複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、チオレドキシン活性部位を含有するセグメントのアミノおよび／またはカルボキシル末端に接合され得る。融合タンパク質のセグメントとチオレドキシン活性部位含有ドメインとの間の連結は、このようなタンパク質のチオレドキシン活性部位含有ドメインの直接回収を可能にするための切断に対して感受性であり得る。融合タンパク質は、チオレドキシン活性部位含有ドメインのカルボキシルおよび／またはアミノ末端の末端のいずれかに付着された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子で形質転換された組換え細胞を培養することによって生成されることが好ましい。
本発明の一実施形態では、本明細書で記載されるアミノ酸配列のいずれか、例えば、天然に存在するチオレドキシンタンパク質またはチオレドキシン含有活性部位のアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端の末端の各々に隣接する少なくとも１つから、最大で約２０個の追加の異種アミノ酸を用いて生成できる。結果として生じるタンパク質またはポリペプチドは、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」と呼ばれることもある。本発明によれば、異種アミノ酸は、特定のアミノ酸配列に隣接する、天然に見出されない（すなわち、自然に、インビボで見出されない）、または特定のアミノ酸配列の機能と関連しない、または天然に存在する配列中のこのようなヌクレオチドが、所与のアミノ酸配列が由来する生物の標準コドン使用を使用して翻訳された場合は、遺伝子中に生じるように特定のアミノ酸配列をコードする天然に存在する核酸配列に隣接するヌクレオチドによってコードされないアミノ酸の配列である。同様に、「から本質的になる」という語句は、本明細書において核酸配列に関連して使用される場合、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端の各々で少なくとも１つ、最大で約６０の多数の追加の異種ヌクレオチドが隣接し得る特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、天然遺伝子中に生じるように特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接して天然に見出されない（すなわち、自然に、インビボで見出されない）、またはタンパク質に任意の追加の機能を付与する、もしくは特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変更するタンパク質をコードしない。
チオレドキシンの供給源
一実施形態では、本発明の方法をともに使用するのに適した、チオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、タンパク質が投与される動物の実質的に類似の種に由来するチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドを含む。別の実施形態では、多様な供給源、例えば、微生物、植物および真菌に由来するものを含む、チオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるような任意のチオレドキシンタンパク質またはペプチドを、所与の患者において使用できる。
別の実施形態では、本発明の方法とともに使用するのに適したチオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、単離された、または生物学的に純粋なタンパク質を含む。そのようなものとして、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、タンパク質が精製されている程度を必ずしも反映しない。本発明の単離されたタンパク質は、例えば、天然供給源から得ることができる、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）を使用して生成できる、または化学的に合成できる。
なお別の実施形態では、本発明のチオレドキシン活性部位を含有する化学合成チオレドキシンタンパク質またはペプチドはまた、安定化されたバージョン、例えば、ステープルペプチド技術によって、環化によって、またはＮもしくはＣ末端での拘束によって構造的に拘束された活性部位を含有するものを指す場合がある。好ましくは、本発明の方法において使用されるべきチオレドキシン活性部位を含有するチオレドキシンタンパク質は、患者における粘液もしくは痰の液化の測定可能なもしくは検出可能な増大（または粘性もしくは粘着性の低下）を引き起こす、およびまたは患者における粘液および痰と関連する、測定可能な、検出可能なまたは認知される患者への治療的利益をもたらすのに十分であるインビボ半減期を有する。このような半減期は、このようなタンパク質のデリバリーの方法によって達成できる。本発明のタンパク質は、好ましくは、動物において約５分を超える、より好ましくは、動物において約４時間を超える、いっそうより好ましくは、動物において約１６時間を超える半減期を有する。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、動物において約５分から約２４時間の間の、好ましくは、動物において約２時間から約１６時間の間の、より好ましくは、動物において約４時間から約１２時間の間の半減期を有する。
チオレドキシンと関連する核酸分子
本発明のさらなる実施形態は、チオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドをコードする核酸分子を含む。このような核酸分子を使用して、インビトロまたはインビボで本発明の方法において有用であるタンパク質を生成できる。本発明の核酸分子は、本明細書でこれまでに記載されたタンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる核酸分子を含む。本発明に従って、単離された核酸分子は、その自然環境から取り出された（すなわち、ヒトマニピュレーションに付されている）、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含み得る核酸分子（ポリヌクレオチド）である。そのようなものとして、「単離された」とは、核酸分子が精製されている程度を反映しない。「核酸分子」という語句は、主に、物理的な核酸分子を指すが、「核酸配列」という語句は、主に、核酸分子でのヌクレオチドの配列を指し、２つの語句は、特に、タンパク質をコード可能である核酸分子または核酸配列に関して同義的に使用できる。
本発明の単離された核酸分子は、その天然供給源から単離できる、または組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）もしくは化学合成を使用して生成できる。単離された核酸分子は、例えば、遺伝子、遺伝子の自然な対立遺伝子変異体、コーディング領域またはその部分ならびに修飾が核酸分子の本発明の所望のタンパク質をコードする能力またはストリンジェントな条件下で天然遺伝子単離物と安定なハイブリッドを形成する能力に実質的に干渉しないような方法でヌクレオチド挿入、欠失、置換および／または逆位によって修飾されたコーディングおよび／または調節領域を含み得る。単離された核酸分子は、縮重を含み得る。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド縮重とは、１個のアミノ酸が異なるヌクレオチドコドンによってコードされ得る現象を指す。 したがって、本発明において有用な所与のタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列は、縮重のために変わる場合がある。
本発明によれば、遺伝子への言及は、天然の（すなわち、野生型）遺伝子に関連するすべての核酸配列ならびにチオレドキシンモノシステイン活性部位と関連するもの、例えば、その遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を制御する調節領域（それだけには限らないが、転写、翻訳または翻訳後制御領域など）ならびにコーディング領域自体を含む。別の実施形態では、遺伝子は、所与のタンパク質をコードする核酸配列に対して類似であるが、同一ではない配列を含む天然に存在する対立遺伝子変異体であり得る。対立遺伝子変異体は、これまでに上記で記載されている。「核酸分子」および「遺伝子」という語句は、核酸分子が、上記の遺伝子を含む場合には同義的に使用できる。
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して生成される。単離された核酸分子は、天然核酸分子およびその相同体を含み、それだけには限らないが、天然対立遺伝子変異体およびこのような修飾がタンパク質生物活性に対して所望の効果を提供するような方法でヌクレオチドが挿入、欠失、置換および／または逆位されている修飾核酸分子を含む。対立遺伝子変異体およびタンパク質相同体（例えば、核酸相同体によってコードされるタンパク質）は上記で詳細に論じられている。
核酸分子相同体は、当業者に公知のいくつかの方法（例えば、Sambrook et al.、同書に記載されるような）を使用して生成できる。例えば、核酸分子は、それだけには限らないが、古典的な突然変異誘発および組換えＤＮＡ技術（位置指定突然変異誘発、化学的処置、制限酵素切断、核酸断片のライゲーションおよび／またはＰＣＲ増幅を含むがこれに限定されない）、またはオリゴヌクレオチド混合物の合成および化学的ライゲーションまたは遺伝子シャッフリングのプロセスによるその多様な組合せを含む核酸分子の再集合されたライブラリーを「構築する」ための分子群の混合物のインビトロもしくはインビボ組換え（すなわち、分子育種、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒの米国特許第５，６０５，７９３号、Minshull and Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290, 1999、Stemmer, P.N.A.S. USA 91:10747-10751, 1994を参照されたい、それらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によってを含むさまざまな技術を使用して修飾できる。当業者に公知のこれらおよび他の類似の技術を使用して、タンパク質に複数の同時変化を効率的に導入できる。核酸分子相同体を、その後、所与の遺伝子とのハイブリダイゼーションによって選択できる、またはこのような核酸分子によってコードされるタンパク質の機能および生物活性について、発現によって直接的にスクリーニングできる。
本発明の一実施形態は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。より詳しくは、本発明によれば、組換え核酸分子は、通常、組換えベクターおよび本明細書で記載されるような単離された核酸分子を含む。本発明によれば、組換えベクターは、選択した核酸配列をマニピュレートするための、および／またはこのような核酸配列を宿主細胞中に導入するためのツールとして使用される操作された（すなわち、人工的に生成された）核酸分子である。したがって、組換えベクターは、例えば、選択した核酸配列を発現させることおよび／または宿主細胞中に送達して、組換え細胞を形成することによって、選択した核酸配列のクローニング、シーケンシングおよび／またはそうではなくマニピュレーティングにおいて使用するのに適している。このようなベクターは、通常、異種核酸配列、すなわち、クローニングされる、または送達されるべき核酸配列に隣接して天然に見出されない核酸配列を含有するが、ベクターはまた、本発明の核酸配列に隣接して天然に見出される、または本発明の核酸分子の発現にとって有用である（以下で詳細に論じられる）調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含有する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかである場合があり、通常、プラスミドである。ベクターは、染色体外エレメント（例えば、複製性プラスミド）として維持される場合があり、または組換え宿主細胞の染色体中に組み込まれる場合があるが、本発明のほとんどの適用にとってベクターは、ゲノムから分離されたままである場合が好ましい。ベクター全体は、宿主細胞内で所定の位置に留まる場合もあり、またはある特定の条件下では、プラスミドＤＮＡが欠失されて、本発明の核酸分子が残る場合もある。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーター制御下にある場合も、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下にある場合も、またはいくつかのプロモーターの組合せの制御下にある場合もある。核酸分子の単一または複数のコピーが染色体中に組み込まれる場合がある。本発明の組換えベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含有し得る。
一実施形態では、本発明の組換え核酸分子において使用される組換えベクターは、発現ベクターである。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という語句は、コートされる生成物（例えば、目的のタンパク質）の生成に適しているベクターを指すために使用される。この実施形態では、生成されるべき生成物（例えば、チオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質）をコードする核酸配列が組換えベクター中に挿入されて、組換え核酸分子を生成する。生成されるべきタンパク質をコードする核酸配列は、核酸配列を、ベクター中の調節配列に作動可能に連結する方法でベクター中に挿入され、これによって、組換え宿主細胞内の核酸配列の転写および翻訳が可能になる。
本発明の別の実施形態では、組換え核酸分子は、ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムまたはその部分中に組み込まれた本発明の単離された核酸分子を含み、これでは、核酸分子は、ウイルスコート中にパッケージングされ、これによってＤＮＡが細胞に入ることが可能となる。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスをベースとするものを含むいくつかのウイルスベクターを使用できるが、それだけには限らない。
通常、組換え核酸分子は、１つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結された本発明の少なくとも１つの核酸分子を含む。本明細書で使用される場合、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は、主に、発現制御 配列に作動可能に連結された核酸分子または核酸配列を指すが、このような核酸分子が本明細書で論じられるような組換え分子である場合には「核酸分子」という語句と同義的に使用できる。本発明によれば、「作動可能に連結される」という語句は、宿主細胞中にトランスフェクトされる（すなわち、形質転換される、形質導入される、トランスフェクトされる、コンジュゲートまたは導かれた）場合に分子が発現され得るような方法で、核酸分子を発現制御配列に連結することを指す。
転写制御配列は、転写の開始、伸長または終結を制御する発現制御配列である。 特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列である。適した転写制御配列には、組換え核酸分子が導入されるべき宿主細胞または生物において機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。本発明の組換え核酸分子はまた、さらなる調節配列、例えば、翻訳調節配列、複製起点および組換え細胞と適合する他の調節配列を含有し得る。
一実施形態では、宿主細胞染色体中に組み込まれるものを含む本発明の組換え分子はまた、発現されたタンパク質が、タンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメントまたはシグナル配列核酸配列）を含有する。適したシグナルセグメントには、発現されるべきタンパク質と天然に関連するシグナルセグメントまたは本発明によるタンパク質の分泌を指示可能な任意の異種シグナルセグメントが含まれる。
別の実施形態では、本発明の組換え分子は、発現されたタンパク質が宿主細胞の膜に送達され、それに挿入されることを可能にするリーダー配列を含む。他のシグナル配列として、ペリプラズムもしくは細胞外分泌または所望のコンパートメント内での保持を指示可能なものが挙げられる。適したリーダー配列には、タンパク質と天然に関連しているリーダー配列またはタンパク質の細胞の膜へのデリバリーおよび挿入を指示可能な任意の異種リーダー配列が含まれる。
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）が細胞中に挿入され得る任意の方法を指すために使用される。「形質転換」という用語は、このような用語が微生物細胞または植物への核酸分子の導入を指すために使用される場合に「トランスフェクション」という用語と同義的に使用できる。微生物系では、「形質転換」という用語は、微生物による外因性核酸の獲得による遺伝性変化を説明するために使用され、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。しかし、動物細胞では、形質転換は、例えば、それらが癌性になった後の培養中の細胞の成長特性の変化（上記）を指す場合がある第２の意味を獲得した。したがって、混乱を避けるために、「トランスフェクション」という用語は、動物細胞への外因性核酸の導入に関して使用されることが好ましく、本明細書では一般に、これらの用語が細胞中への外因性核酸の導入に関係する限り、動物細胞のトランスフェクションならびに植物細胞および微生物細胞の形質転換を包含するように使用される。したがって、トランスフェクション技術には、それだけには限らないが、形質転換、微粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれる。
ヒトおよび非ヒト脊椎動物への投与
本発明の方法では、医薬組成物を含む組成物を、制限するものではないが，霊長類、げっ歯類、家畜、ニワトリ、シチメンチョウおよび飼育ペット、コンパニオンアニマルまたは競走馬を含む脊椎動物のクラスの任意のメンバーの患者に投与できる。
上記で論じられたように、本発明の医薬組成物を含む組成物を、標的部位（例えば、タンパク質および化合物については、処置されるべき粘液または痰、組換え核酸分子については、処置されるべき粘液もしくは痰となる標的宿主細胞または処置されるべき粘液もしくは痰の環境中にある標的宿主細胞）へ、組成物、特に、組成物中のチオレドキシン活性部位を含む本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質および／または任意の他の化合物を送達するのに効果的な方法で患者に投与する。適した投与プロトコールは、任意のインビボまたはエキソビボ投与プロトコールを含む。
本発明によれば、効果的な投与プロトコール（すなわち、効果的な方法で本発明の組成物を投与すること）は、組成物中にチオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質および／または他の化合物の、処置されるべき粘液または痰との接触をもたらす、好ましくは、患者が、このような投与から幾分かの測定可能な、観察可能なまたは認知される利益を得るような、適した用量パラメータおよび投与様式を含む。あるいは、効果的な用量パラメータは、インビトロサンプル、インビボ動物モデルおよび患者がヒトである場合には最終的に臨床試験を使用する実験法によって決定できる。効果的な用量パラメータは、特定の疾患または状態についての当技術分野で標準的な方法を使用して決定できる。このような方法は、例えば、生存率、副作用（すなわち、毒性）および疾患の進行または退縮ならびに関連する生理学的パラメータ、例えば、１秒での強制呼気量（ＦＥＶ、ＦＥＶ１）の決定を含む。
本発明によれば、本発明の組成物を患者に投与する適した方法は、組成物を患者中または患者上の所望の部位に送達するのに適している任意のインビボ投与経路を含む。好ましい投与経路は、化合物が、タンパク質であるか、他の化合物（例えば、薬物）であるか、組成物が投与されるべき身体の部分および患者が経験している疾患または状態に応じて、当業者には明らかであろう。一般に、本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドのインビボ投与の適した方法として、それだけには限らないが、経皮的デリバリー、気管内投与、吸入（例えば、エアゾール）、鼻腔、経口、肺投与およびカテーテルの注入が挙げられる。耳デリバリーは、点耳薬を含む場合があり、鼻腔内デリバリーは、点鼻薬または鼻腔内注射を含む場合があり、眼球内デリバリーは、点眼薬または強膜を横切っておよび／もしくは眼の後部へ薬物を通過させるための適したデバイスの使用を含む場合がある。エアゾール（吸入）デリバリーはまた、当技術分野で標準的な方法を使用して実施できる（例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992を参照されたい）。経口デリバリーは、例えば、錠剤またはカプセル剤として、ならびに食品および飲料製品または動物飼料または飼料ペレットに配合されている、口によって摂取され得る固体または液体を含む場合がある。粘膜組織にとって有用である他の投与経路として、気管支、鼻腔内、他の吸入、直腸、局所、経皮、経腟、経頸管的、子宮頸部周囲および尿道経路が挙げられる。さらに、投与プロトコールは、不妊症などの適用において使用するための、ペッサリー中の（例えば、子宮頸部への）タンパク質、ペプチドまたは組成物の適用などの前処置デバイスおよび副鼻腔への注射などの外科的補助される局所投与を含む場合がある。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のタンパク質または組成物が、呼吸管（気道）における過剰にまたは異常に粘性または粘着性の痰または粘液を処置するために投与される場合には、チオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質またはペプチド（または組成物）または他の化合物は、それだけには限らないが、吸入（すなわち、例えば、サーファクタント中のまたはサーファクタントとともにエアゾールを吸入することによる）、気管支鏡、気管内チューブによる、および／または任意の人工換気デバイスを介した肺への直接設置、鼻腔投与（鼻腔内または経鼻）、直接的または脂質カプセル化もしくはサーファクタントを介した、気管支または気管内（すなわち、気管中への直接的に注射または気管切開術による）を含む経路によって投与される。そこで粘液または痰と接触できるように、組成物またはタンパク質を気道中に導入する任意の想定できる方法が、本発明によって包含される。
飼料
本発明の別の実施形態は、還元状態のチオレドキシン活性部位を含有する本明細書で開示されるようなチオレドキシンタンパク質またはペプチドを含む動物飼料組成物に関する。
動物飼料を、任意の種類の家畜化された動物の栄養要求を満たすように使用する。動物飼料は、刈取茎葉飼料および茎葉飼料の両方を包含する。例えば、本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質またはペプチドは、刈取茎葉飼料および／もしくは茎葉飼料中またはその上に、任意の手段によって、中に混合することまたは一緒に混合すること、塗布することまたは組み入れることによって、刈取茎葉飼料および／もしくは茎葉飼料中またはその上で使用できる。動物飼料の例には、それだけには限らないが、乾草、麦わら、サイロに貯蔵した牧草、圧縮化、ペレット化飼料、オイルおよび混合飼料、発芽穀物、マメ科植物、作物残渣、穀物（ｇｒａｉｎ）、穀物（ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐ）およびトウモロコシが含まれる。
動物飼料は、栄養要求を満たすように望まれるコンパニオンアニマル、家畜および他の種類の動物の飼料を包含する。コンパニオンアニマルには、それだけには限らないが、イヌ、ネコ、他の動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類および他のコンパニオンアニマルが含まれる。家畜には、それだけには限らないが、ウシ、ウマ、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、ブタ、他の有蹄動物、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の鳥類、サケ、マス、コイ、テラピア、ナマズ、他の魚類または他の種類の家畜が含まれる。モノチオールチオレドキシンの熱安定性特徴のために、数分間の８０℃を超える加熱に耐えなければならないペレット化飼料への組み込みに特に適したものになる。
本明細書で論じられ、引用された刊行物および他の参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の様々な実施形態を詳細に説明してきたが、それらの実施形態の改変および適応が当業者に思い浮かぶことは明らかである。しかし、以下の特許請求の範囲に示されるように、そのような改変および適応は本発明の範囲内にあることを明確に理解されるべきである。
以下の実施例のために、例示的チオレドキシンタンパク質として「ＯＲＰ１００Ｓ」は提供され、本明細書で開示されるチオレドキシンタンパク質のいずれもＯＲＰ１００Ｓと置き換わることができる。
［実施例１］
ＯＲＰ１００Ｓ発現および特性決定
この実施例は、ＯＲＰ１００Ｓの構造、コンストラクション、発現および評価を実証する。Ｃ３５Ｓモノシステイン活性部位チオレドキシンＯＲＰ－１００と比較して、ＯＲＰ１００Ｓは、３つの残存する非活性部位チオレドキシン－１Ｃｙｓ残基のＳｅｒへの突然変異をさらに組み込んでおり、結果として、改善された安定性、活性およびより堅牢な分析を有する、完全なモノシステインチオレドキシンが得られる。
モノチオールＣ３５Ｓ活性部位チオレドキシンＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓ
天然Ｔｒｘ酵素の活性部位は、種をまたいで高度に保存されている２つの酸化還元活性Ｃｙｓ残基を含有する。その不活性の酸化形態では、これらのＣｙｓは、タンパク質の三次元構造から突出するジスルフィド橋に寄与する（Holmgren A., 1985, Thioredoxin, Annu Rev Biochem 54:237-71)。この活性中心の還元（ＴｒｘＲ酵素、ＧＳＨ／グルタロドキシン（ｇｌｕｔａｒｏｄｏｘｉｎ）による、または化学還元剤を用いる合成活性化を介した）によって、Ｔｒｘがジチオール／ジスルフィド交換能を有する電子伝達体として機能することが可能となる。タンパク質ジスルフィドは、Ｔｒｘ媒介性還元活性の好ましい基質である。最初に、Ｃｙｓ３２チオレートアニオンによる求核性攻撃後に、チオレドキシン活性部位のＮ末端Ｃｙｓ３２と、適合性の標的ジスルフィドのＣｙｓの間で一過性の混合ジスルフィドが形成される（Holmgren A., 1995, Thioredoxin structure and mechanism: conformational changes on oxidation of the active-site sulfhydryls to a disulfide. Structure 3:239-43）。天然Ｔｒｘでは、次いで、Ｃ末端活性部位システイン（Ｃｙｓ３５）が、活性部位におけるコンホメーション変化のために活性型となり、これは、Ｃｙｓ３５チオレートアニオンを安定化し、ｐＫａを低下させ、分子内混合ジスルフィド結合に対する攻撃を可能にし、その結果、酸化されたＴｒｘおよびここで十分に還元された標的が放出される（Wynn R, Cocco MJ, Richards FM., 1995, Mixed disulfide intermediates during the reduction of disulfides by Escherichia coli thioredoxin. Biochemistry 34:11807-13）。
ＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓは、活性部位Ｃｙｓ３５のＳｅｒへの突然変異によって操作されているＴｒｘの修飾されたバージョンである（Ｃ３５Ｓ Ｔｒｘ）。図１に例示されるように、これは、一次Ｃｙｓ３２反応によって形成された混合ジスルフィド中間体の分解を防ぐことによってＴｒｘ－ジスルフィド還元の第２の段階を排除し、結果として、このＣｙｓの、タンパク質標的への安定な共有結合的連結が生じる。ヒトＣＦ粘液の場合には、還元型Ｃ３５Ｓ Ｔｒｘを用いる処置が、過剰の凝縮されたムチンタンパク質中のジスルフィド結合を破壊して、粘液粘性を正常化し、一方でＴｒｘ－ムチン付加物が、新規ムチンＣｙｓジスルフィドの再形成する能力を遮断する。さらに、粘液への共有結合的連結によって、Ｃ３５Ｓ Ｔｒｘ酵素が細胞外に固定され、細胞内取り込みが妨げられる。この独特の遮断機序によって、修飾Ｔｒｘが、粘膜表面に対して適切に作用するが、細胞内でのＴｒｘシグナル伝達によって誘導される可能性がある炎症性経路または他のオフターゲット効果の活性化の機会を低減または排除することが可能になる。重要なことに、このモノチオール活性部位Ｃ３５Ｓ Ｔｒｘ戦略は、細胞内Ｔｒｘ活性に著しく影響を及ぼすことなく、分泌されたＴｒｘの活性の置換または補充を始めて可能にする。
ＯＲＰ１００Ｓ対ＯＲＰ－１００
ＯＲＰ－１００と比較して、ＯＲＰ１００Ｓは、６２、６９および７３位に位置する残存する非活性部位Ｔｒｘ Ｃｙｓ残基のＣｙｓからＳｅｒへの突然変異によってさらに修飾されている。この根拠は２要素からなるものであった：１）機能性タンパク質の入手可能性の低下および十分に還元された単量体Ｃ３５Ｓチオレドキシンの不安定性の増大をもたらす可能性がある、タンパク質：タンパク質相互作用およびホモ二量体化／多量体化を媒介可能な反応性Ｃｙｓを排除するため、ならびに２）全体的なタンパク質還元レベルおよび触媒活性の潜在力をモニタリングするために堅牢な、単純なインプロセスアッセイとして、Ｃｙｓ酸化還元状態定量化を使用することを可能にするため。３つの非活性部位Ｃｙｓは、天然Ｔｒｘでは構造的機能を果たさず、ジスルフィド結合還元活性を減弱する、Ｃｙｓ７３でのホモ二量体化を含む分子間連結の形成を介して、主に調節的な役割を果たすと考えられている（Weichsel, A., Gasdaska, J.R., Powis, G., and Montfort, W.R., 1996, Crystal structures of reduced, oxidized, and mutated human thioredoxins: evidence for a regulatory homodimer. Structure 4, 735-51）。非活性部位Ｔｒｘ Ｃｙｓはまた、ＧＳＮＯＲによるＳ－ニトロシル化の、および潜在的に他の翻訳後修飾の部位であると示されている（Wu C, Liu T, Chen W, et al. Redox regulatory mechanism of transnitrosylation by thioredoxin, 2010, Molecular & Cellular Proteomics 9:2262-75）。１つまたは複数の非活性部位Ｃｙｓも保持するＣ３５Ｓ Ｔｒｘ変異体における複数の二量体および高度多量体形態の可能性に対して、ＯＲＰ１００ＳではＣｙｓ３２での二量体化のみがあり得るので、ＯＲＰ１００Ｓ、完全モノシステインＴｒｘの酸化的安定性はまた、多量体化の可能性の排除によっても増大されている。
Ｔｒｘ Ｃｙｓのいずれの還元型チオールも、ＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）などの発色基質を還元して、定量化できる吸光度変化を誘導することが可能であるが、Ｃｙｓ３２のみが、インスリンなどの適切なタンパク質ジスルフィド基質と混合ジスルフィドを形成できるので、Ｃｙｓ３２を除くすべてのＣｙｓの除去はまた、ＯＲＰ１００Ｓ中の総Ｃｙｓの還元状態が、Ｃｙｓ３２の還元状態と同一であることを意味する。したがって、ＤＴＮＢを還元するＯＲＰ１００Ｓの活性は、タンパク質ジスルフィド結合を還元するその能力と同一である。これによって、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用するより複雑な時間のかかるインスリン還元状態の決定よりも、ＤＴＮＢ還元の分光光度的モニタリングがＯＲＰ１００Ｓタンパク質活性の直接尺度として使用されることが可能となる。
ＯＲＰ１００Ｓ設計およびコンストラクション
ＯＲＰ１００Ｓの配列は、ヒトチオレドキシン－１のアミノ酸配列に基づくカスタムアルゴリズムを用いて、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化された。これは、発現レベルを増大し、ヒトに対して細菌ではあまりよく見られないＲＮＡの枯渇に起因するアミノ酸誤取り込みを防ぐと仮説が立てられ、その両方とも、大腸菌における天然真核細胞チオレドキシン遺伝子配列の組換え発現の重大な課題である（Harris et a., 2012, Determination and control of low-level amino acid misincorporation in human thioredoxin protein produced in a recombinant Escherichia coli production system. Biotechnology and Bioengineering 109, 1987-95）。
ＯＲＰ１００Ｓを、好都合なマニピュレーションのためにＡｆｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接するＤＮＡ断片として合成し、ラムノース誘導性プロモーターの制御下に発現ベクターｐＤ８６１（ＤＮＡ２．０／Ａｔｕｍ）中にクローニングし、ＢＬ２１大腸菌に形質転換した。大腸菌のいくつかの系統では、ラムノース誘導を増強するために、ｒｈａＢ遺伝子を欠失させた。ラムノース誘導性発現を、２ｍｌ容量の培養ブロック中での小規模での増殖後にＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって検証した。
ＯＲＰ１００Ｓ発現、精製および分析
ＯＲＰ１００Ｓのベンチトップ規模の生成のための最初の戦略は、以下であった：１．５Ｌの発酵槽（Ｄａｓｇｉｐ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で流加条件下で細胞を増殖させ、遠心分離によって細胞ペーストを回収し、その後、破壊し、限外濾過によって一次回収した。ＯＲＰ１００Ｓタンパク質を、陰イオン交換 クロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＦＰＬＣ）および限外濾過／ダイアフィルトレーションによって＞９５％に精製した。活性化（還元）のために、ＯＲＰ１００Ｓを１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて処置し、次いで、エンドトキシンクリアランス工程を用いて凍結乾燥バッファーに交換して、ＤＴＴおよびエンドトキシンを除去した。還元型タンパク質を－８０℃で凍結し、２４～３６時間凍結乾燥した（Ｖｉｒｔｉｓ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるサイズ確認および純度決定後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦおよびＥＳＩ質量分析によって配列同一性および均一性を検証した。色はわずかに黄色であり、灰白色の凍結乾燥物をもたらした。
機能アッセイ
１．ＯＲＰ１００Ｓの還元状態を、遊離ＳＨ基と反応し、４１２ｎｍで黄色変化をもたらすＤＴＮＢを使用して定量化した。９６ウェルプレートに５０マイクロリットルの２．５ｍＭのｒｈＴｒｘを、続いて、１７５マイクロリットルのサンプルバッファーおよび２５ マイクロリットルの６ｍＭのＤＴＮＢを添加した。ＤＴＮＢの添加によって反応を開始した後、ＤＴＮＢ還元による４１２ｎｍでの動態学的吸光度の変化を３０℃で分光光度的にモニタリングした。ＯＲＰ１００Ｓ濃度は、ヒトＴｒｘ－１（７，０００）の吸光係数を使用してＡ２８０（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって決定した。遊離スルフヒドリル基の実際の濃度は、遊離スルフヒドリルのパーセンテージとして還元状態を決定するために、４１２ｎｍでの吸光度およびＤＴＮＢの吸光係数（１４，１５０）に基づいて算出した。ＯＲＰ１００Ｓについて、これは、１００％のタンパク質ジスルフィド還元能を表し、４つのＣｙｓのうち１つのみが標的還元可能であるＯＲＰ－１００について、２５％を表す。
２． 溶液中の遊離単量体ＯＲＰ１００Ｓのパーセントを、ＳＥＣを使用して決定した。サンプルをＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで実行されるＢｉｏＢａｓｉｃ Ｓ－３００ ２５０×４．６カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ移動相バッファーは、４０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）、２ｍＭのＥＤＴＡおよび４５０ｍＭのＮａＣｌからなっていた。低ｐＨは、二量体化を最小化し、４５０ｍＭのＮａＣｌ濃度は、分離を改善した。流速は、０．３５ｍＬ／分であり、吸光度は、２８０ｎｍでモニタリングした。各実行の長さは、２０分とした。ＯＲＰ１００Ｓ単量体パーセンテージは、クロマトグラムの総曲線下面積で除した、単量体画分のピーク下面積の積分によって決定した。
３．ヘテロ二量体形態で、２つの分子間および１つの分子内ジスルフィドを含有し、それらの３つすべてが適したチオレドキシン基質であるであると知られている、小さいタンパク質（ヒトインスリン）の還元状態をアッセイすることによって、ＯＲＰ１００Ｓのジスルフィド結合還元活性を定量化した。インスリン還元は、ＮＡＤＰＨおよびＴｒｘＲの添加後の吸光度変化によってチオレドキシン活性を定量化するために古典的に使用されてきた(Holmgren A., 1979， Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide, J Biol Chem 254:9627-32)。このようなアプローチは、１）ジスルフィド結合基質への化学量論的共有結合的連結に起因するサイクリングがないこと、および２）ＮＡＤＰＨおよびＴｒｘＲが、酸化されたモノチオールＴｒｘ活性部位のＣｙｓ３２を還元できないことのために、モノチオールＣ３５ＳチオレドキシンＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓには適していない。結果として、ジスルフィド結合型インスリンヘテロ二量体の単量体形態への変換の割合をモニタリングするために逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣの使用に基づいて新規アッセイが開発された。ヒトインスリンの２つの鎖は、合計６個のＣｙｓ残基を有し、これらは、その成熟構造において３つのジスルフィド結合を形成する。還元形態のＯＲＰ１００Ｓは、二量体インスリンとともにインキュベートされると、これらのジスルフィド結合と反応して、それらを破壊し、同時に、ＯＲＰ１００Ｓ Ｃｙｓ３２への共有結合的連結を形成する。これは、ＲＰ－ＨＰＬＣ分離を使用して検出できる、無傷のインスリンヘテロ二量体の移動度の変化をもたらし、タンパク質ジスルフィド還元活性の尺度としての、時間の経過ととものヘテロ二量体ピーク面積の変化の定量化を可能にした。ＯＲＰ１００Ｓサンプルを、１０ｍｇ／ｍＬのインスリンとともに種々の時点（０～９０分）の間インキュベートし、ヨード酢酸（ｉｏｄａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＩＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって反応を停止した。ＷＰ－ＲＰ ５０×３（Ｉｍｔａｋｔ）カラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）での分離後のインスリンヘテロ二量体ピーク下面積の変化から、各時点での相対活性を決定した。バッファーＡは０．１％のＴＦＡであり、バッファーＢはアセトニトリル中０．１％のＴＦＡであった。勾配は、５分の０～３％のＢと、それに続く、４５分の３０～６０％のＢ、次いで、追加の５分の６０～８０％のＢとした。流速は、０．２ｍＬ／分とし、吸光度は、２８０ｎｍで測定した。無傷のインスリン分子の変化を評価するために、１ＭのＩＡおよび０．１％のＴＦＡを使用し、ＯＲＰ１００Ｓを添加せずに、時間０ベースラインをまず確立した。次いで、無傷のインスリンヘテロ二量体ピーク下面積を決定し、１００％に相当するものとして設定した。ＯＲＰ１００Ｓとの反応後、無傷のインスリンピークの面積（保持時間に対応する）を測定した。次いで、時間０での面積によって除され、１００が乗じられた、還元後の面積の減少から、無傷のインスリンの還元パーセントを算出した。
［実施例２］
還元活性のｐＨ依存
この実施例は、チオレドキシン活性部位を有する本発明の分子が、より低いｐＫａ値のために従来のチオール還元剤よりも生理学的に適切なｐＨで有意に大きい活性を有することを例示する。
ヒトＣＦ気道表面液体は、プロトン分泌の炭酸水素媒介性緩衝作用の喪失のために、影響を受けていない個体のものよりもおよそ０．８ｐＨ単位より酸性である（Garland AL, Walton WG, Coakley RD, et al., 2013, Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. PNAS 110:15973-8、Shah VS, Meyerholz DK, Tang XX, et al., 2016, Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice, Science 351:503-7）。これは、凝縮された異常な粘液を処置するための還元剤の臨床的使用の結果を導く。承認された治験用チオール剤であるＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、システアミンおよび２－メルカプトエタンスルホネートＮａ（Ｍｅｓｎａ）はすべて、不活性化（プロトン化）形態と活性（脱プロトン化）形態の間の高度に塩基性の平衡点（ｐＫａ）のためにＣＦ気道ｐＨで低レベルのジスルフィド還元活性を示す。ＣｙｓチオールｐＫａ値は、ｐＨ８．５（システアミン）～ｐＨ９．５（ＮＡＣ）の範囲にわたる。これらの古典的なチオールとは著しく対照的に、Ｔｒｘ活性部位Ｃｙｓ３２の構造的に安定化されたｐＫａは、２～３対数低く（ｐＨ６．１～６．３）、酸性ＣＦ気道ｐＨでさえ高活性を可能にする（図２）。本発明者らは、ＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓは、天然Ｔｒｘと同一のｐＫａを共有することを実験的に検証し（示されていないデータ）、モノシステイン活性部位修飾は、Ｔｒｘ Ｃｙｓ３２で脱プロトン化チオレートアニオンを安定化する独特の水素結合に干渉しないということを実証した。
図２Ａは、４種の代表的な小分子チオール剤に対するチオレドキシン（およびＯＲＰ－１００／ＯＲＰ１００Ｓ）のｐＨ範囲６～９にわたる、脱プロトン化された活性形態にあると算出されたチオールのパーセントを示す。図２Ｂは、ｐＨ６（左、上）およびｐＨ８（左、下）の１．２５および１２．５ｍＭのＮＡＣを用いるインスリンヘテロ二量体ピークの変換を示す代表的なインスリン還元実験のＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。パネルＢ、右上は、ｐＨ６で０．０２５ｍＭのＯＲＰ－１００について得られたトレースを示す。時間０および６０分トレースを重ねることによって、６０分のインキュベーション時間にわたって還元がないことが示される：１．２５ｍＭのＮＡＣは、ｐＨ６または８でインスリン還元について不活性であり、ＮＡＣは、６０分でのインスリンヘテロ二量体の単量体への変換を示す影付きのピーク面積によって示されるように、１２．５ｍＭでｐＨ８でのみインスリンを還元できるが、ｐＨ６では還元できない。対照的に、酸性のｐＨ６ででさえ、ＯＲＰ－１００は、１／５００のＮＡＣの濃度でインスリンヘテロ二量体ピークを著しく還元できる（図２Ｂ、右パネル、上）。表：ｐＨ６～９でＮＡＣ対ＯＲＰ－１００の相対活性。天然ＴｒｘおよびＯＲＰ１００Ｓ対ＮＡＣまたはＧＳＨを用いて同様の結果が得られた。これらの結果は、モノチオール活性部位Ｃ３５Ｓチオレドキシン（ＯＲＰ－１００、ＯＲＰ１００Ｓ）が、外因性および内因性（例えば、ＧＳＨ）小チオールが、実質的に不活性である、中性から酸性ｐＨレベルを含む、ヒト気道において予測される全生理学的ｐＨ範囲にわたってチオレドキシンの注目すべき強力なジスルフィド還元活性を保持することを実証する。
［実施例３］
ＯＲＰ１００Ｓ還元状態の、活性との相関
この実施例は、完全モノチオールＯＲＰ１００Ｓが、全体的なタンパク質還元状態とジスルフィド結合還元活性の間の強力な相関を示すことを実証する。
ＯＲＰ１００Ｓを、１００ｍＭ ＤＴＴを用いて還元し、残存する還元剤を、２０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５への交換のためにＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ－２５カラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＡＰ－５カラム）を使用してサンプルから除去した。果然に還元されたＯＲＰ１００Ｓ（「Ｒｅｄ」）を種々の割合で酸化されたＯＲＰ１００Ｓと混合し、ヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）（ＩＡ）を用いて処置し、酢酸アンモニウムバッファーに交換して、未反応のヨードアセトアミドを除去した（「Ｏｘ」）。結果は、表１に示されている。種々の割合の還元型：酸化型タンパク質を含有するＯＲＰ１００Ｓ溶液を、実施例１に記載されるようなＤＴＮＢ、ＳＥＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣインスリン還元アッセイによって分析した。完全に還元された材料を用いる最大のインスリンヘテロ二量体反応は、使用された時間および条件について４５％であった。インスリン還元値は、最大に対する相対還元として表される。１００％ ＩＡ処置：０％還元処置から、「完全酸化」サンプル中に残存する活性があることは明らかであるが、それにもかかわらず結果から、モノチオールＴｒｘ ＯＲＰ１００Ｓが、５個の還元され得るＣｙｓを有する天然Ｔｒｘまたは４個を有するＯＲＰ－１００（示されていない）とは異なり、全体的な還元状態とジスルフィド結合還元活性の間の極めて良好な直線的相関を示すということが確認される。例えば、合計４個のＣｙｓを有するＯＲＰ－１００は、７５％ほど還元され得るが、活性部位Ｃｙｓ３２が二量体化によって完全酸化された場合には、依然として０％のインスリン還元活性を有する。本発明者らは、酸化は主に分子間ジスルフィド形成を介して進行し、ＯＲＰ１００Ｓホモ二量体（ＴｒｘまたはＯＲＰ－１００の場合には、同様により高次の多量体）を作出することを検証した。
Figure 2023509462000002
［実施例４］
溶液中対凍結乾燥したものにおける安定性
この実施例は、実施例１に記載される最初の製造プロセスを使用して実験室規模で生成されたモノチオール活性部位チオレドキシンＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓが、遊離ＳＨ基および単量体パーセントによって測定されるように、揮発性溶媒から純粋なタンパク質として凍結乾燥された場合に、化合物の溶液として貯蔵された場合よりも有意により安定であることを実証する。安定性は、長期の貯蔵の間、以前はチオレドキシンを還元形態で維持できる唯一の製剤であった、複雑なスクロースおよびＥＤＴＡの製剤を使用して得られたものと匹敵していた。
以前の研究、例えば、ＷＯ２００６／０９０１２７は、チオレドキシンを還元状態で維持するための組成物を教示する。貯蔵の間、チオレドキシンを還元型に維持できる組成物を導き出すにはかなりの実験法が必要であり、これらの組成物は複雑であり、賦形剤として糖類類誘導体およびＥＤＴＡを必要とした。したがって、凍結乾燥の際に昇華する揮発性溶媒を組み込んでいる水溶液中に還元型チオレドキシンを可溶化することによってすべてを排除することは、匹敵する安定性をもたらすという本発明者らの発見は、予期しないものであった。このような製剤化戦略を使用する安定性分析の結果は、図３に示されている。ＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓタンパク質を１００ｍＭ ＤＴＴを用いて還元し、ＮＡＰ－５カラムでｐＨ５．５の揮発性の２０ｍＭの酢酸アンモニウムバッファーに交換して、残存する還元剤を除去した。材料の半量を－８０℃で凍結し、次いで、凍結乾燥し、残りは種々の時点の間５℃または４０℃のいずれかで溶液で維持した（「ＰＨ５．５」）。凍結乾燥したタンパク質を再構成して、２０ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ５．５に戻し、直後に、各時点で評価した（「凍結乾燥されたもの」）。遊離ＳＨ基（ＤＴＮＢ発色性アッセイ）および単量体パーセントの両方（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を測定することによって安定を評価した。図３に示されるように、４０℃で加速された安定性条件下で６カ月後でさえ、凍結乾燥された形態で優れた貯蔵安定性が得られた。ＯＲＰ－１００とほとんど類似しているが、ＯＲＰ１００Ｓは、特に、液体製剤中での貯蔵の最初の週の間にＳＥＣ－ＨＰＬＣによってわずかに良好な単量体安定性を示した、本発明者らの以前の結果に基づいて、単量体パーセントよりも高い、ＯＲＰ－１００に対するＤＴＮＢは、活性に寄与せず、ＯＲＰ１００Ｓ中には存在しない（実施例３を参照されたい）非活性部位Ｃｙｓの還元を反映する。
図３について：ＰＨ５．５：２０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５の液体製剤中に、０、３、７、１４、２１、２８、９０または１８０日間維持されたＯＲＰ－１００またはＯＲＰ１００Ｓタンパク質。凍結乾燥されたもの：２０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５での再構成後に、凍結乾燥形態で５℃または４０℃で、０、３、７、１４、２１、２８、９０または１８０日間貯蔵され、アッセイされたＯＲＰ－１００またはＯＲＰ１００Ｓタンパク質。一番上のパネル：５℃での遊離スルフヒドリル（還元状態）のパーセント。第２のパネル：５℃でＳＥＣアッセイによって決定された単量体パーセント。第３のパネル：４０℃での遊離スルフヒドリルのパーセント。第４のパネル：４０℃でのＳＥＣアッセイによって決定された単量体パーセント。
［実施例５］
大規模製造および高ＵＶ吸光度のチオレドキシンタンパク質画分の除去
この実施例は、４００ｎｍより高いＵＶ吸光度を有するチオレドキシンタンパク質画分が除去された本発明のチオレドキシンタンパク質組成物の生成を実証し、得られた組成物の安定性および水分吸収特徴を説明する。
ＯＲＰ１００Ｓを含む組成物を、１５０Ｌの発酵槽においてタンパク質を発現するように組換え操作されたｒｈａＢ大腸菌を培養することおよびラムノース添加を用いて発現を誘導することによって調製した。誘導後４８時間で得られた発酵培養液を回収し、ホモジナイズして細胞を溶解し、その後、さらなる処理のために溶解物を凍結した。１０５Ｌの発酵培養液中のＯＲＰ１００Ｓの最終力価は、１６ｇ／Ｌであった。凍結された溶解物を解凍し、標準技術によって清澄化した。清澄化された溶解物中のタンパク質組成物を、結合および溶出様式の第１の陰イオン交換クロマトグラフィー工程（Ｃａｐｔｏ Ｑ樹脂１５Ｌ－５Ｌ×３、カタログ１１７５３１６０４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびエンドトキシン除去のためのフロースルー様式の第２の陰イオン交換クロマトグラフィー工程（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ ＰＡクロマトグラフィー－Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に付した。得られたタンパク質組成物を結合および溶出様式の疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ １０Ｌ－５Ｌ×２、カタログ１７５４８４０４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付した。このＨＩＣ精製された組成物は、約２８０ｎｍに単一のＵＶ吸光度ピークを有する主なチオレドキシンタンパク質画分および約４２３ｎｍにさらに顕著なＵＶ吸光度ピークを有する第２のチオレドキシンタンパク質画分（チオレドキシン量の約１０％に相当する）ならびに５００～６００ｎｍの範囲中の微量なピークを含んでいた（図４）。微量な画分は黄色を帯びた桃色であり（「赤色画分」）、主画分は、実質的に透明であった。すべての精製工程は、ＤＴＴの存在下で行い、完全還元を維持した。
主画分および赤色画分の両方とも、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって酢酸アンモニウムバッファーｐＨ５．５に個別に交換し、５００ｍｌのボトル中で－８０℃で凍結した。ＤＴＴの完全除去は、ＨＰＬＣ－ＭＳによって検証した。組成物を、以下のとおりに凍結乾燥によって乾燥させた。凍結生成物を、－８０℃から２～８℃の冷蔵庫に６０時間移すことによって解凍した。０．２μＭのＰＥＳフィルター、５００ｍＬの滅菌フィルター／ボトルの組合せを使用して、解凍生成物を濾過した。濾過生成物を、Ｇｏｒｅ ＬｙｏＧｕａｒｄ凍結乾燥トレイ（１．５Ｌの生成物／トレイ、３×５００ｍＬの生成物ボトルに相当するもの）に移し、満たされたトレイを、トレイの上部に置いた温度プローブとともに凍結乾燥機棚に移した。凍結乾燥サイクルは、窒素ガスを用いてパージした後に開始した。
以下の凍結乾燥サイクルプログラムに従って生成物の５つのバッチを凍結乾燥した。
Figure 2023509462000003
凍結乾燥後、トレイを窒素でパージし、凍結乾燥ケーキを破壊して粉末にし、これを－２０℃での貯蔵のために滅菌貯蔵ボトルにパッケージングし（最終回収率８８．７％）。次いで、生成物を水分含量についてアッセイし、これは、５つのバッチ全体で主画分では、０．８１重量％～２．１８重量％の範囲であった。対照的に、赤色チオレドキシン画分は、約６．０重量％の最小含水量までにしか乾燥できなかった。
特性決定：乾燥および生理食塩水での再構成後、主画分は、ＨＩＣ精製工程において赤色画分を除去せずに精製されたチオレドキシン組成物に対して、ＤＴＮＢおよびＲＰ－ＨＰＬＣによって、同等のジスルフィド還元活性を示した。しかし、ＵＶ吸光度＞４００ｎｍを有する赤色画分を欠く主画分組成物は、生理食塩水に再構成され、室温で維持された場合に、着色画分を除去するには不十分な方法によって精製されたチオレドキシン組成物と比較して大幅に大きな安定性を実証した。赤色画分を有さないＯＲＰ１００Ｓの安定性は、以前の実施例に記載されるようにＳＥＣ分析によって室温で（２５℃）評価された。タンパク質溶液を、６．０、６．８、７．７、８．５および９．４ｍＭに相当する７０、８０、９０、１００および１１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（生理食塩水）で調製した。これらを室温で０、２０、４４、６８、１４０、１８８および２３２時間の間インキュベートした。各時点で、沈殿物について調べるために１０００ ＲＦＣでチューブを遠心分離し、単量体ＯＲＰ１００ＳパーセントをＳＥＣによって決定した。さらに、６８時間の時点で、ＤＴＮＢアッセイを実施して還元度を評価した。実質的に、すべての濃度レベルにまたがって単量体パーセントにおいて変化が観察されなかった、これは時間０から２３２時間で２％だけ低下した（以下の表を参照されたい）。比較によって、５ｍＭ（５９ｍｇ／ｍｌ）の同等の濃度でＰＢＳ（生理食塩水）で再構成された赤色画分の除去を伴わないＯＲＰ１００Ｓ 組成物は、時間０で９５％の出発単量体画分パーセントを有し、これは２５℃でインキュベートされた場合に７２時間で５５％に、１６８時間で２６％に低下した。
Figure 2023509462000004
全体的に、赤色画分が除去された記載されたように精製された材料は、より大きな純度を有しており、外観がより均一であり、極めて低いエンドトキシンレベルを有していた。
Figure 2023509462000005
［実施例６］
ＯＲＰ１００Ｓ粘液レオロジーおよびムチン分子量低減
この実施例は、モノシステインヒトチオレドキシン－１ ＯＲＰ１００Ｓの、ヒトＣＦ粘液の粘弾性特性ならびにムチン糖タンパク質の分子量（ＭＷ）を低減するための有効性を実証する。ＯＲＰ１００Ｓの、一次ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）からインビトロで培養された４％のＣＦ粘液の粘性および弾性係数を低減する能力を、ならびにゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）／多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）を使用して、ムチンポリマーサイズに対するＯＲＰ１００Ｓ処置の効果を評価した。まとめると、これらの結果は、ＯＲＰ１００ＳのＣＦ粘液および痰の粘弾性ならびに粘液輸送可能性を正常化する強力な能力を実証し、ＯＲＰ１００Ｓが、広範な気道ｐＨ微小環境全体で活性に対して最適化された有望なＣＦ処置である可能性があることを示唆する。
方法：
粘液調製：無菌粘液を、２０人の異なるＣＦドナーからの１００を超える個々のＨＢＥ培養物から回収し、４重量パーセント（４％）の固形分、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および軽度ＣＦの代表例となる濃度に調製した（Hill, D. B. et al., 2014, A biophysical basis for mucus solids concentration as a candidate biomarker for airways disease, PloS one 9, e87681、Anderson, W. H. et al., 2015, The relationship of mucus concentration (hydration) to mucus osmotic pressure and transport in chronic bronchitis., Am J Resp Crit Care Med 192: 182-90）。
レオロジー：ＨＢＥ細胞培養粘液を、以前に確立された方法に従って、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＯＲＰ１００Ｓのいくつかの濃度（０．０１、０．１および１．０ｍＭ）を用い、３７℃で１時間処置した（Hill, D.B., and Button, B., 2012, Establishment of respiratory air-liquid interface cultures and their use in studying mucin production, secretion, and function. In Mucins: Methods and Protocols, D.J. Thornton, ed., pp. 245-58、Youngren-Ortiz, S. et al., 2017, Development of optimized inhalable Gemcitabine- loaded gelatin nanocarriers for lung cancer, J Aerosol Med Pulm Drug Delivery 30:299-321、Seagrave, J., et al., 2012, Effects of guaifenesin, N-acetylcysteine, and ambroxol on MUC5AC and mucociliary transport in primary differentiated human 気管l-bronchial cells, Respir Res 13: 98）。濃度および経時的推移アッセイをＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ３レオメータを使用して実施して、ＨＢＥ粘液特性に対する被験物質および対照のバルクの巨視的な生物物理的効果を評価した。手短には、各処置条件について１Ｈｚ振幅（応力）スイープの線形レジームを同定した。１Ｈｚの周波数を選択したが、これは潮汐呼吸（約０．２５Ｈｚ）と粘液線毛クリアランス（１０～１５Ｈｚ）に関連する周波数の間であり、粘液線毛クリアランスと相関すると示されているからである（Tomkiewicz, R. et al., 1994, Mucolytic treatment with N-acetylcysteine L-lysinate metered dose inhaler in dogs: airway epithelial function changes. Eur Resp J 7: 81-87）。既知の応力（０．０５から約１００Ｐａの間）を処理された粘液または対照粘液に１０秒間加えるクリープ回復実験を実施し、流体のレオロジー回復をさらに５０秒間記録した。連続実行では、流体の降伏応力（すなわち、流体の粘性が急激かつ劇的に低下する応力）に達するまで、加えられる応力を対数的に増加させた。測定されたパラメータから、流体の粘性と弾性が、加えられた応力の関数として決定された。周波数スイープを、一定の応力と歪みの両方で実施し、粘液とその弾性構成成分と粘性構成成分（それぞれＧ’とＧ”）のベースラインの物理的特性を決定するために使用した。
ムチン分子量決定：被験物質処置後の分子量低減を、ゲル浸透クロマトグラフィーのＷｙａｔｔ Ｈｅｌｅｏｓ ＭＡＬＬＳシステムでの多角度レーザー光散乱との組合せを使用して決定した。ＭＡＬＬＳは、相対的標準の使用を必要とせず非破壊的方法で高ＭＷ生体分子の分子サイズおよび質量を決定する迅速で正確な手段である。手短には、４％ ＨＢＥ処置したサンプルを、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０１％のナトリウムアジドを有する０．９％ ＮａＣｌで１００倍希釈した。０．２ｍＬの希釈サンプルをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ２Ｂカラムを通して溶出して、高ＭＷムチンを他の粘液タンパク質から分離し、ムチン画分をＭＡＬＬＳシステムに入れた。ムチンＭＷは、Ｗｙａｔｔ Ａｓｔｒａソフトウェアを使用してＢｅｒｒｙモデルを１１の異なる角度からの光散乱にフィッティングすることによって決定した。
結果
粘弾性：ＯＲＰ１００Ｓは、４％ ＨＢＥ粘液の弾性（貯蔵、Ｇ’）および粘性（喪失、Ｇ”）係数の両方を低下させる濃度依存性の能力を実証した（図５、上部）。最低の試験されたＯＲＰ１００Ｓ濃度（１０μＭ）で、Ｇ’の有意な低減は明らかではなく、Ｇ”のほぼ２倍の低減が観察された。１００μＭのＯＲＰ１００Ｓでは、Ｇ’は、０．２８Ｐａのベースライン値から０．１９Ｐａに低下し、Ｇ”は、１０μＭを用いて観察されたものと同様の量だけ低減した。この濃度のＯＲＰ１００Ｓによって達成されたレオロジー低減の程度は、強力な粘液溶解薬特性を有する強力なジチオール還元剤である１ｍＭのＤＴＴを用いて観察されたものと同様であった。際立ったことに、１ｍＭのＯＲＰ１００Ｓは、ＤＴＴよりも著しく大きいレオロジー的還元特性を示し、Ｇ’およびＧ’’の両方をほぼ３倍低減した。
図５、ＡおよびＢ（上部）：３７℃で１時間ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＯＲＰ１００Ｓ（０．０１、０．１および１．０ｍＭ濃度）を用いて還元された４％固形分乾重粘液の弾性（Ｇ’）および粘性（Ｇ”）係数の低減。結果は、０．１ｍＭのＯＲＰ１００ＳがＧ’を１０倍高い濃度のＤＴＴと同程度に効率的に低減することを示す。すべてのデータは、線形レジームで実施された粘液の周波数スイープを調べることによって収集し、ＴＡ ＤＨＲ３レオメータで１ｒａｄ／ｓで分析した。
ムチンサイズ：ムチンの分子量の中程度の増大（１８０ＭＤａから２１０ＭＤａ）を実証した１ｍＭのＤＴＴとは異なり、ＯＲＰ１００Ｓの３つの濃度すべてが、ムチンの分子量を同等に約１５０ＭＤａに低減した（図５、Ｃ下部）。すべての化合物が屈折率測定システム中に存在するムチンの濃度を低減した（示されていないデータ）。１ｍＭのＤＴＴを用いた場合のムチンの平均分子量の軽度の増大は、反応性システイン残基を開く化合物のサインの可能性があり、これは、ムチン高分子がそれ自体と、ならびに他の粘液タンパク質と相互作用することを可能にする可能性がある。遊離ＣｙｓチオールをキャップするＯＲＰ１００Ｓのようなモノチオール還元剤は、この方法で反応するとは予測されず、ムチン高分子を単量体に完全に還元するより高濃度のＤＴＴも予測されない。
図５Ｃ。３７℃で１時間のＤＴＴ（１ｍＭ）およびＯＲＰ１００Ｓ（０．０１、０．１および１．０ｍＭ濃度）を用いて還元された４％固形分乾重粘液のムチン分子量低減（ＧＰＣ－ＭＡＬＬＳ）。
結論：
ＯＲＰ１００Ｓは、ＤＴＴよりも、モルあたりのモルで、異常に粘弾性のＣＦ粘液のレオロジーを低減する著しく大きな能力を実証した。重要なことに、ＯＲＰ１００Ｓの強力な粘弾性モジュレート効果は、ムチンの完全還元およびポリマー分解をもたらさず、これは、ムチン単量体を連結して機能性ゲルにする分子間ジスルフィドを超える、ポリマー密度を増大する分子内ムチンジスルフィドに対する酵素的選択性の程度を示唆した。粘液溶解とは対照的にこの粘液正常化は、チオレドキシン、グルタチオンおよびグルタレドキシン酸化還元サイクルに基づく天然気道粘液ジスルフィドホメオスタシス機序の予測される挙動と一致し、それらのうち３つの構成成分すべてが、インビボで気道表面液体中に存在する（Du, Y., Zhang, H., Lu, J. & Holmgren, A., 2012, Glutathione and glutaredoxin act as a backup of human Thioredoxin Reductase 1 to reduce Thioredoxin 1 preventing cell death by aurothioglucose, J Biol Chem 287, 38210-19; Bartlett, J. A. et al., 2013, Protein composition of bronchoalveolar lavage fluid and airway surface liquid from newborn pigs, Am J Physiol - Lung Cell Mol Physiol 305:L256-66）。
［実施例７］
ＯＲＰ１００Ｓを用いる処置後のＣＦ粘液および痰輸送可能性
この実施例は、ＯＲＰ１００Ｓが、培養一次ヒト気管支上皮細胞においてインビトロで、および摘出された成体ラット気管でインサイツでＣＦ粘液および痰輸送可能性を増大することを実証する。
方法
一次ヒト気管支上皮研究
一次ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞は、Ｆ５０８ｄｅｌ ＣＦＴＲについてホモ接合性の健常になり損ねたドナーおよびＣＦ患者からの肺外植片に由来した。細胞をコンフルエンシーに拡大、増殖させ、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞非コンディショニング培地でコーティングされた６．５ｍｍの直径の透過性支持体（０．５×１０６個細胞／フィルター、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し、最終分化するまで分化培地において少なくとも６～８週間増殖させた（Birket SE, Chu KK, Houser GH, Liu L, Fernandez CM, Solomon GM, Lin V, Shastry S, Mazur M, Sloane P, et al., 2016, Combination therapy with Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator modulators augment the airway functional microanatomy, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. ajplung 00395、Birket SE, Chu KK, Liu L, Houser GH, Diephuis BJ, Wilsterman EJ, Dierksen G, Mazur M, Shastry S, Li Y, et al., 2014, A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway, Am J Respir Crit Care Med. 190(4):421-32）。細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な粘液層を再確立するために４８時間増殖させ、その後、ＯＲＰ１００Ｓ（１～３ｍＭ）、媒体対照（ＰＢＳ、－ＭＧ＋＋、－Ｃａ＋＋）または陽性対照ＤＴＴ（１．６ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いる頂端処置（エアゾール沈着を模倣するため）を行った。マイクロ光コヒーレンストモグラフィー（μＯＣＴ）画像を、単層あたり４つの目的の領域で、条件ごとに３～４の単層のベースライン時および処理後３時間で取得した。第１または第２の継代細胞のみを使用した。
エキソビボでの痰輸送に対するＯＲＰ１００Ｓの効果
ＣＦ痰輸送可能性に対するＯＲＰ１００Ｓの効果を決定するために、肺の増悪のために入院した４人のＣＦ患者から自発的に喀痰された痰試料を収集し、４℃で貯蔵し、その後、２００μＬのアリコートにわけ、ＯＲＰ１００Ｓ（３ｍＭ）、ＰＢＳ、ＤＴＴ（１．６ｍＭ）またはＤＮアーゼ（１０または２５μｇ／ｍｌ）を用いて収集当日または収集翌日に処置した。処置の際、痰アリコートを３７℃の水浴に２時間入れ、次いで、成体非ＣＦラットから摘出された気管の遠位末端にμＯＣＴイメージングのために適用した（サンプルあたり３μｌ）。気管を５００μｌのＰＢＳを用いて２回洗浄し、その後痰添加した。サンプル条件は、別個の解剖学的位置でランダムな順序で３連で適用した－各サンプル添加の間に５００μｌのＰＢＳを使用する２回の洗浄を実施した－また、目的の各領域から少なくとも３画像を収集した。気管生存力の確認は、実験が完了した際にＰＢＳを用いるイメージングによって得た。
μＯＣＴイメージング
１ミクロン解像度スペクトルドメインμＯＣＴを使用して、ＨＢＥ単層における粘液線毛輸送（ＭＣＴ）速度および繊毛運動周波数（ＣＢＦ）の、ならびにエキソビボでの痰のＭＣＴ速度の測定値を取得した。この初の、高速（１秒あたり４０フレーム、フレームあたり５１２ライン）顕微鏡反射率イメージングモダリティーによって、細胞培養物および正常な上皮と比較して、ＣＦの特性を容易に区別する無傷の組織における同時の解剖学的イメージングが可能になる（Liu L, Chu KK, Houser GH, Diephuis BJ, Li Y, Wilsterman EJ, Shastry S, Dierksen G, Birket SE, Mazur M, et al., 2013, Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography, PLoS One 8(1):e54473、Tuggle KL, Birket SE, Cui X, Hong J, Warren J, Reid L, Chambers A, Ji D, Gamber K, Chu KK, et al., 2014, Characterization of defects in ion transport and tissue development in Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One 9(3):e91253)。ＭＣＴ速度およびＣＢＦに加えて、μＯＣＴはまた、気道表面液体の物理的特徴を評価する性能も有する。以前の参照文献に記載されたように、画像をキャプチャし、ＭＣＴ速度およびＣＢＦを算出した。
統計解析
推論統計（平均、ＳＤ、ＳＥ）は、ＡＮＯＶＡを使用して計算し、必要に応じて多重比較のためにチューキーの事後検定を使用した。統計は、平均±ＳＥとして示され、Ｐ値＜０．０５が有意と考えられた。すべての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０ａ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。
結果
ＯＲＰ１００Ｓは、非ＣＦおよびＣＦ一次ＨＢＥ細胞においてＭＣＴ速度を増強する
ＯＲＰ１００Ｓが粘液輸送を変更するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｆ５０８ｄｅｌ ＣＦＴＲについてホモ接合性の健常非ＣＦドナーおよびＣＦドナーに由来する一次ＨＢＥ細胞におけるＭＣＴ速度およびＣＢＦに対する効果を評価した。これらの研究のために、本発明者らは、外因性粒子または色素を使用せずに気道機能性微小解剖のこれらおよび他のパラメータの測定を可能にするμＯＣＴイメージングを使用した。結果は、ＯＲＰ１００Ｓ （「Ｔｈｅｒａｄｕｘ」）処置された（１～３ｍＭ）非ＣＦ細胞が、ＤＴＴ（１．６ｍＭ、１．４１±０．１ｍｍ／分）の効果を超えた、処置後３時間でＰＢＳ（０．０５±０．００７ｍｍ／分）に対して有意に高いＭＣＴ速度（２．１８±０．３ｍｍ／分、Ｐ＜０．０１）を示したことを実証する（図６Ａ）。この効果はＣＦ細胞において再現され、ＰＢＳ（７．３０±２．９ｍｍ／分）またはベースライン（１５．４±１５．３ｍｍ／分）から増大したＤＴＴ（３３．３３±１２．９ｍｍ／分）に対して、ＯＲＰ１００Ｓを用いて３時間で有意に高いＭＣＴ速度を示した（５４．７３±１５．３ｍｍ／分、Ｐ＜０．０５）（図６ＣおよびＤ）。ＯＲＰ１００Ｓは、ＭＣＴの改善を促進する機序としてのそのジスルフィド還元特性を支持して、非ＣＦまたはＣＦ細胞のいずれでもＣＢＦにおいて意味のある相違を誘発しなかった（図６Ｂ、ＥおよびＦ）。
図６。一次ＨＢＥ細胞（非ＣＦおよびＣＦ）におけるＯＲＰ１００Ｓ（Ｔｈｅｒａｄｕｘ）のμＯＣＴ解析。非ＣＦ細胞の処置後３時間での（Ａ）生の粘液線毛輸送（ＭＣＴ）速度および（Ｂ）繊毛運動周波数（ＣＢＦ）。ＣＦ細胞については、（Ｃ）３時間での生のＭＣＴ速度および（Ｄ）処置後３時間でのベースラインに対するＭＣＴ速度の変化。（Ｅ）生のＣＢＦおよび（Ｆ）ベースラインに対するＣＢＦの変化も測定した。Ｎ＝１人の非ＣＦおよび１人のＣＦドナー全体で条件あたり３～４の単層。各データ点は、単層あたりの平均処置効果を表す。Ｎ＝条件あたり３～４の単層。＊Ｐ＜０．０５＊＊Ｐ＜０．０１
ＯＲＰ１００Ｓは無傷の気管において粘液クリアランスを改善する
完全に分化した粘膜表面の腺発現などの気道表面の複雑性を含む、無傷のラット気管を使用する粘液クリアランスに対するＯＲＰ１００Ｓの効果を、さらに評価した。遺伝子型Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ、Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｓ５８９Ｎ（Ｎ＝２）およびＦ５０８ｄｅｌ／１９７３＿１９８５ｄｅｌ１３ＩｎｓＡＧＡＡＡを有する４人のＣＦ患者（平均年齢＝３１歳、平均ＦＥＶ１＝１．６２Ｌ）から、自発的に喀痰された痰を収集し、ＯＲＰ１００Ｓ（３ｍＭ）、ＰＢＳ、ＤＴＴ（１．６ｍＭ）またはＤＮアーゼ（１０または２５μｇ／ｍｌ）を用いて２時間処置した。次いで、生きている野生型ラット気管の表面に痰を添加し、生理学的条件下でμＯＣＴを使用してイメージングした。図７Ａ～Ｄは、各処置条件の粘液輸送を表す代表的な再スライスμＯＣＴ画像を示す。ＭＣＴは、速度を示す粒子軌道の勾配を用いて、時間とともに粘液を通る断面線を投影することによって測定された。図７ＥおよびＦに要約されるように、ＯＲＰ１００Ｓ処置細胞は、ＰＢＳ（０．９７±０．１７ｍｍ／分）に対してより高いＭＣＴ速度（４．６８±０．９）ｍｍ／分、Ｐ＜０．０００１）を示し、これは、標準治療ＤＮアーゼ（２．３０±０．２８ｍｍ／分）およびＤＴＴ（２．３１±０．３４ｍｍ／分）の効果を有意に超えた。ＰＢＳの効果に対して標準化されたＭＣＴ速度の変化は、３．８０±０．３５ｍｍ／分（Ｐ＜０．０００１）であり、ＤＮアーゼ（２．９５±０．４０ｍｍ／分、Ｐ＜０．０１）またはＤＴＴ（３．０１±０．６１ｍｍ／分、Ｐ＜０．０１）を用いた場合に観察されたものをやはり上回った。ＯＲＰ１００Ｓ対ＰＢＳ処置痰の代表的なμＯＣＴ画像において見られるように（図７ＧおよびＨ）、ＯＲＰ１００Ｓは、痰密度の低下において効果的であり、これまでに観察された粘弾性データと一致していた。
図７。ＣＦ痰におけるＯＲＰ１００Ｓ（「Ｔｈｅｒａｄｕｘ」）のμＯＣＴ分析。（Ａ～Ｄ）粘液輸送を表す各処置条件の代表的な再スライスμＯＣＴ画像。ＭＣＴは、時間とともに粘液を通る断面線を投影することによって測定された。粒子軌道の勾配は速度を示した。（Ｅ）生の粘液線毛輸送（ＭＣＴ）速度および（Ｆ）Ｎ＝４のＣＦドナーからのサンプル全体のＰＢＳに対して標準化されたＭＣＴ速度の変化。（Ｈ）ＰＢＳに対する、（Ｇ）粘液密度に対するＯＲＰ１００Ｓ効果を表す代表的な画像（粘液（ｍｕ）、上皮（ｅｐ）。平均＋／－ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
結論
ＯＲＰ１００Ｓ処置一次非ＣＦおよびＣＦ ＨＢＥ細胞は、ＤＴＴの効果を超えたＭＣＴの増大を示した。喀痰されたＣＦ痰において、陽性対照に対する粘液輸送可能性のＯＲＰ１００Ｓ増強も観察され、痰密度の低下も伴った。まとめると、これらの結果は、ＯＲＰ１００Ｓによってジスルフィド結合を還元することは、粘液輸送可能性が増大するということを示し、広範な気道ｐＨ微小環境全体で活性に対して最適化された有望なＣＦ処置である可能性があることを示唆する。
［実施例８］
還元形態のＯＲＰ１００Ｓは、インビトロで非炎症性である
空気－液体界面で培養された、正常なおよびＣＦのＨＢＥ（ＨＢＥ－ＡＬＩ）におけるインビトロ研究を実施して、モノチオールチオレドキシンが、細胞単層へのマイクロスプレー適用後に炎症性サイトカイン放出を誘導する可能性を評価した。
正常で健常なボランティアまたはＣＦ対象からの鼻腔気道上皮細胞を、Ｓｃｈｌｅｇｅｌと同僚のアプローチから適応された方法に基づいて、粘膜毛様体分化を伴う空気－液体界面で血清不含培地中で培養した(Suprynowicz, F.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012， 109(49): p. 20035-40; Becker, M.N., et al., AM J Respir Crit Care Med, 2004， 169(5): p. 645-53)。この技術を使用して、いくつかの独特のＣＦおよび健常対照飼料を収集し、拡大し、低温保存した。３人の独特な正常なまたはＣＦドナーの各々（Ｆ５０８ｄｅｌについてホモ接合性）から、３０ウェルを、ＡＬＩでの分化まで３０日にわたって培養した。３連の培養物を頂端表面でＰＢＳ、天然ＴｒｘまたはＯＲＰ－１００に対して曝露させ、負荷後４および２４時間で頂端および基底外側培地サンプルの両方を収集した。頂端収集は、２００μＬの無菌ＰＢＳを頂端表面に置くことおよび１５分のインキュベーション後にこれを回収することによって行った。各サンプルについてＩＬ－６のＥＬＩＳＡを２連で実施し、他のものはマルチプレックス化アッセイを使用して測定した。培地を遠心分離して、デブリを除去し、ＥＬＩＳＡ分析まで－８０℃で貯蔵した。
ＯＲＰ－１００またはチオレドキシンの存在下または不在下で生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した炎症促進性サイトカインＩＬ－６（左）およびＴＮＦ－アルファ（右）における変化の代表的なデータが、健常およびＣＦドナーに由来するＨＢＥ－ＡＬＩについて図８に示されている。これらのデータは、還元形態のＯＲＰ－１００は非炎症性であることを実証し、ＰＢＳ媒体単独の適用に対して、規定濃度の（等張性）ＰＢＳで製剤化された薬物について、１００μＭを上回る濃度で有意な抗炎症効果を示すが、これは、ＣＦ ＨＢＥ－ＡＬＩでは（ただし、健常ドナーに由来するものはそうではない）、等張性または高張食塩水の適用は、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－６の両方を誘導するのに十分であったということが観察されたからである。酸化型ＯＲＰ－１００ではなく還元型が生理食塩水の炎症効果を抑制した。これらの結果は、正常なラットにおける急性気管内滴下注入研究においてインビボで再現された。
図８：非ＣＦ（左の一連のバー）およびＣＦドナー（右の一連のバー）の鼻腔上皮からの一次ＨＢＥ培養の基底外側ＡＬＩ培地において２４時間後に誘導されたＩＬ－６またはＴＮＦαのレベル。デリバリー：２００μＬの容量の対照または被験物質溶液の１５分間の頂端表面ボーラス適用。ＰＢＳ：０．９％のリン酸緩衝生理食塩水、陰性媒体対照（黒色バー）；ＯＲＰ１００－１０００：ＰＢＳ中の１ｍＭのＯＲＰ－１００（暗い塗りつぶされたバー）；ＯＲＰ１００－１０００：ＰＢＳ中の１００μＭのＯＲＰ－１００（明るい塗りつぶされたバー）；Ｔｒｘ－１０００：ＰＢＳ中の１ｍＭの天然チオレドキシン－１（暗い斜線の入ったバー）；Ｔｒｘ－１００：ＰＢＳ中の１００μＭの天然チオレドキシン－１（明るい斜線の入ったバー）。すべての濃度は、ＨＢＥ頂端表面に送達される容積を反映する。
［実施例９］
還元形態のＯＲＰ１００Ｓは、インビボで抗炎症性である
この実施例は、ＰＣＴ ＷＯ２００６／０９０１２７に記載されたスクロース／ＥＤＴＡ製剤組成物に製剤化され、４および４０ｍｇ／ｋｇの用量で噴霧されたエアゾールとして正常なラットに送達された、Ｃ３５ＳモノチオールＴｒｘの３つの形態（酸化型ＯＲＰ－１００、還元型ＯＲＰ－１００および還元型ＯＲＰ１００Ｓ）の間でインビボでの炎症性の可能性を評価し、比較した。
ＯＲＰ－１００の３つの形態をすべて、ＤＴＴを用いて還元した後に凍結乾燥し、スクロースバッファー（９％スクロース１．１７ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．２）で製剤化した。すべての被験物質を、低（１０ｍｇ／ｋｇ）および高（４０ｍｇ／ｋｇ）の標的送達用量で評価した。被験物質は、エアゾールとして吸入によってＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。各被験物質のエアゾールは、市販の振動メッシュネブライザーによって生成し、その排出量は鼻のみの曝露システムに取り付けられた。
標的用量は、エアゾール濃度を一定に維持しながら、エアゾール曝露時間をモジュレートすることによって達成された。低用量群の動物は、１０ｍｇ／ｋｇの標的送達用量および１ｍｇ／ｋｇの沈着用量を達成するために２０分の曝露の間の単回用量の被験物質を受け取った。高用量群の動物は、４０ｍｇ／ｋｇの標的送達用量および４ｍｇ／ｋｇの標的沈着用量を達成するために７５分の曝露の間の単回用量の被験物質を受け取った。
エアゾール中の総ＯＲＰ－１００の濃度は、ＢＣＡ分析法によって決定し、低用量群について６０１．１～８６８．０μｇ／Ｌ、高用量群について７０８．７～７９８．０μｇ／Ｌの範囲であった。エアゾール粒子サイズは、カスケードインパクター分析によって決定されるように、３．０ミクロン未満のＭＭＡＤであった（図９、左）。達成された沈着用量は、１０％沈着画分を仮定して、それぞれ低用量の酸化型ＯＲＰ－１００および還元型ＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓについて、０．９、１．２および１．２ｍｇ／ｋｇであり、高用量群について、それぞれ３．８、３．８および４．２ｍｇ／ｋｇであった。すべての用量群について、実際に沈着した用量は標的の２５％以内であった。
臨床徴候、体重、臨床病理（ＢＡＬＦ細胞数、ＬＤＨおよびアルブミン測定値）、肺組織サイトカイン、肺重量、呼吸器標的組織の肉眼病理および微視的病理を含む、種々のパラメータを測定することによって、潜在的な毒性について各研究群の動物を評価した。さらに、各低用量群の３匹の動物は、免疫組織化学のために肺組織を採取された（Alizee Pathology、Thurmont、MD）。各低用量群の三（３）匹の動物は、血液と組織の収集のために、曝露後１時間と４時間で安楽死させた。各高用量群の四（４）匹の動物は、血液と組織の収集のために、曝露後４時間と２０時間で安楽死させた。
Figure 2023509462000006
還元型ＯＲＰ－１００およびＯＲＰ１００Ｓを酸化型ＯＲＰ－１００対照群と比較した場合、ＢＡＬＦ ＬＤＨ、アルブミン、細胞数および白血球百分率の相違は、種々の肺組織サイトカインの測定値と同様に平凡なものであった。ＬＤＨレベルは、低用量群ではわずかに高いものの、被験物質および用量群間で変動し、明らかな傾向はなかった。アルブミンレベルは、すべての用量群について１時間の時点で最も高かったが、曝露後４および２０時間ではすべての被験物質および用量群間で同様であった。
ＢＡＬＦ総細胞は、用量レベルまたは評価時間に関わらず、３つの被験物質間で全体的に同様であった。マクロファージは、ＢＡＬＦにおいて観察される最も一般的な細胞種であったが、３つの被験物質の間で明らかな傾向は示さなかった。ほとんどの群が、すべての時点で低いリンパ球、好中球および好酸球数を有していたが、２０時間で屠殺されたすべての高用量群においてわずかに高い細胞数が観察された。ＢＡＬＦのマクロファージ％は、１および４時間の時点ですべての低用量間ならびに４時間の高用量の動物で同様であった。ＢＡＬＦのマクロファージ％は、２０時間の時点で、他のサンプリング時間と比較してわずかに低かった。
主に、低用量群と比較したすべての高用量群におけるマクロファージ％の低下は、好中球％の増大によって説明された。しかし、変化は、酸化型ＯＲＰ－１００対照群において観察されたものと同様であった。リンパ球および好酸球の相違は、ＴＡおよび用量群間で変動し、明らかな傾向はなかった。
すべての動物は剖検まで生存した、肉眼病理所見は、全体的に少なく、重症度は最小であり、肺の最小の赤色変色から主になっていた。一般的な微視的所見は、まれから少数の単核細胞と好酸球の散在した浸潤からなっていた。これらの所見はすべての群の動物において観察され、バックグラウンドと考えられ、被験物質曝露の前に生じたと解釈されるか、屠殺手順の人為的結果であった。
全体的に、１０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇの標的送達用量で酸化型ＯＲＰ－１００および還元型ＯＲＰ－１００または還元型ＯＲＰ１００Ｓ被験物質に曝露され、曝露後１、４または２０時間で調べられたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける、臨床的観察、ＢＡＬＦ化学、細胞数、細胞分画、肺組織サイトカイン、巨視的所見または微視的肺変更において有害な被験物質効果の証拠はなかった。しかし、この研究は、還元形態で凍結乾燥された場合にチオレドキシンに最大程度の酸化還元安定性を与えるために開発されたスクロース／ＥＤＴＡ製剤を利用し（ＰＣＴ ＷＯ２００６／０９０１２７）、図９、右で示されるように、スクロース製剤効果は明らかであった。酸化型ＯＲＰ－１００対照（チオレドキシン活性を欠く）において、炎症を示す好中球流入が誘導された。還元型ＯＲＰ－１００は、還元型ＯＲＰ１００Ｓは、製剤効果を部分的に軽減できたが、好中球流入をほとんど完全に抑制した。
本研究デザインには媒体のみの群は含まれなかったので、スクロース／ＥＤＴＡ製剤自体のＢＡＬＦ細胞数およびサイトカインに対する効果を単離することは可能ではなかった。しかし、通常の生理食塩水で製剤化された酸化型チオレドキシン不活性タンパク質対照は、通常の生理食塩水単独と同一のＢＡＬＦ細胞数およびサイトカイン結果を有していたことを示した、気管内デリバリーとの関連で考えられると（Rancourt, R.C., et al., 2007, Reduced thioredoxin increases proinflammatory cytokines and neutrophil influx in rat airways: modulation by airway mucus, Free Radic Biol Med 42, 1441-53）、本研究の結果（酸化型ＯＲＰ１００不活性タンパク質対照群から最高の応答を示した）は、還元型ＯＲＰ１００Ｓによって抑制された観察された用量依存性炎症反応の一因であるスクロース／ＥＤＴＡ製剤と一致する。
本明細書に例示的に開示された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素がなくても適宜実施できる。しかし、本発明の多数の変法、変動、改変、他の使用および適用が可能であり、また、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない変法、変動、改変、他の使用および適用は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明によって対象とされると見なされることは当業者には明らかである。
本発明の前記の考察は、例示および説明の目的で提示された。前記は、本発明を本明細書に開示された形態（単数または複数）に限定することを意図するものではない。前記の発明の詳細な説明では、例えば、本発明の種々の特徴が、本開示を合理化する目的で１つまたは複数の実施形態にまとめられている。本発明の実施形態の特徴は、上記で論じられたもの以外の代替実施形態に組み合わされる場合がある。この開示の方法は、請求された本発明が、各請求項において明確に列挙されるものよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映すると解釈されてはならない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前記の開示される実施形態のすべての特徴よりも少ないものにある。したがって、以下の特許請求の範囲はこの発明の詳細な説明に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の好ましい実施形態として独立している。
さらに、本発明の説明は、１つまたは複数の実施形態の説明ならびにある特定の変法および改変を含んでいるが、他の変法、組合せおよび改変も、例えば、本開示を理解した後に当業者の知識の範囲内である場合があるように本発明の範囲内にある。特許請求されるものと代替の、交換可能なおよび／または同等の構造、機能、範囲または工程を含む、代替実施形態を、このような代替の、交換可能なおよび／または同等の構造、機能、範囲または工程が本明細書において開示されるか否かにかかわらず、任意の特許性のある対象を公的に献呈することを意図することなく、許可される範囲で含む権利を取得すると意図するものではない。

Claims (74)

  1. 過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の粘弾性を低下させる方法であって、患者の粘液または痰を、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物と接触させることを含み、タンパク質またはペプチドは、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端位置の単一システイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、方法。
  2. 還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含み、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端位置の単一システイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、タンパク質またはペプチドと、
    ｂ．薬学的に許容される賦形剤と
    を含む、医薬組成物。
  3. ａ．還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、
    ｂ．少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒と
    を含む、組成物。
  4. ａ．還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、
    ｂ．水と、
    ｃ．塩化ナトリウムと
    から本質的になる、医薬組成物。
  5. 乾燥組成物を調製する方法であって、
    ａ．還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒とを含む水性組成物を提供することと、
    ｂ．水性溶媒を揮発させて、タンパク質またはペプチドを含む乾燥組成物を生成することと
    を含む、方法。
  6. 還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、通常の生理食塩水とから本質的になる、組成物。
  7. 還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドから本質的になる組成物であり、乾燥粉末である、組成物。
  8. 対象において炎症を処置する方法であって、炎症を有するか、それを発症するリスクにある対象に、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
  9. 対象において細菌感染症を処置する方法であって、細菌感染症を有するか、それを発症するリスクにある対象に、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
  10. １つまたは複数の内因性抗菌ペプチドを活性化するように作動可能なチオレドキシンモノシステイン活性部位を含む組成物であって、活性化は、感染性疾患を処置または予防するための治療上効果的な試薬をもたらす、組成物。
  11. 対象のマイクロバイオーム組成をモジュレートする方法であって、対象の粘膜表面に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を局所的に投与することを含む、方法。
  12. モノシステインチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドのジスルフィド結合還元活性を決定する方法であって、チオレドキシンモノシステイン活性部位中の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、モノシステインチオレドキシン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドを選択することと、タンパク質またはペプチドの全体的なシステインチオール還元状態を測定することとを含む、方法。
  13. ウイルス性呼吸器疾患を処置する方法であって、ウイルス性呼吸器疾患を有するか、またはそれを発症するリスクにある対象に、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を投与することを含む、方法。
  14. それを必要とする対象においてウイルス感染と関連する肺炎症を低減する方法であって、それを必要とする対象に還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
  15. チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物であって、約４００ｎｍ波長より大きいＵＶ吸光度を有するチオレドキシンタンパク質画分を含まない、組成物。
  16. チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む組成物を生成する方法であって、チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含む溶解物を提供することと、溶解物中のタンパク質またはペプチドを濃縮することと、約４００ｎｍよりも大きい吸光度を有するチオレドキシンペプチドまたはタンパク質画分を除去して、組成物を生成することとを含む、方法。
  17. チオレドキシン活性部位が、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ（配列番号２４）、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１７）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ（配列番号１９）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｘ（配列番号２１）、Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｘ－Ｋ（配列番号２３）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｓ－Ｘ（配列番号２５）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｘ（配列番号２６）およびＷ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｓ－Ｋ（配列番号２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むチオレドキシンモノシステイン活性部位であり、Ｘ残基が、システイン以外の任意のアミノ酸残基である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法または組成物。
  18. タンパク質またはペプチドが、配列番号２８または配列番号２９に対して少なくとも約８０％同一である配列を含み、チオレドキシン活性部位が、配列番号２８または配列番号２９の３２～３５位に対応する位置にあるチオレドキシンモノシステイン活性部位である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法または組成物。
  19. タンパク質またはペプチドが、配列番号２８または配列番号２９の配列を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の方法または組成物。
  20. 患者が、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘性または粘着性が、疾患の症状または原因である肺疾患を有する、請求項１に記載の方法。
  21. 患者が、粘液または痰の異常なまたは過剰の粘性または粘着性が生物学的還元剤活性の欠乏と関連している肺疾患を有する、請求項１に記載の方法。
  22. 患者が、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、喘息、副鼻腔炎、特発性肺線維症、肺高血圧症、ドライアイ疾患および消化管疾患からなる群から選択される疾患を有する、請求項１に記載の方法。
  23. 患者が嚢胞性線維症を有する、請求項１に記載の方法。
  24. 患者の粘液または痰を、組成物と接触させる工程が、鼻腔、気管内、気管支、肺への直接設置、吸入、経口および眼からなる群から選択される経路によって組成物を患者に導入することによって実施される、請求項１に記載の方法。
  25. 接触されるべき粘液または痰が、患者の呼吸器中にある、請求項１に記載の方法。
  26. 組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  27. 患者の粘液または痰を組成物と接触させる工程の後に、患者が、接触の工程の前と比較して、強制呼気量（ＦＥＶ）の少なくとも約２．５％の増大を有する、請求項１に記載の方法。
  28. チオレドキシンモノシステイン活性部位を含有するタンパク質またはペプチドが、粘液タンパク質中のシステイン残基に共有結合的に結合する、請求項１に記載の方法。
  29. 粘液タンパク質が、ムチンである、請求項２８に記載の方法。
  30. 粘液タンパク質が、呼吸器粘液タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  31. タンパク質が、ヒトチオレドキシンを含む、請求項１に記載の方法。
  32. 患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
  33. タンパク質またはペプチドが、配列番号１のチオレドキシンモノシステイン活性部位配列を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  34. 医薬組成物が、経口、直腸、鼻腔、吸入、気管内、気管支、直接滴下注入、局所および眼から選択される経路による患者への投与のために製剤化される、請求項２、８または９のいずれかに記載の医薬組成物または方法。
  35. 水性溶媒が、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムおよび重炭酸トリエチルアンモニウムからなる群から選択される、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  36. 水性溶媒が、酢酸アンモニウムである、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  37. 水性溶媒が、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度である、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  38. 水性溶媒が、約４から約７の間のｐＨを有する、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  39. 組成物が、糖類または糖類誘導体を含まない、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  40. 水性組成物が、約３ｍｍＨｇ未満の蒸気圧を有するタンパク質またはペプチド以外の化合物を全く含有しない、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  41. タンパク質またはペプチドが、チオレドキシン活性部位中の１つまたは２つのシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、請求項３または４のいずれかに記載の組成物。
  42. チオレドキシン活性部位が、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ（配列番号１６）、Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ－Ｘ（配列番号２０）、Ｘ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｘ（配列番号２２）、Ｗ－Ｃ－Ｇ－Ｐ－Ｃ－Ｋ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ残基が、システイン以外の任意のアミノ酸残基である、請求項３、４、１４または１５のいずれかに記載の組成物。
  43. チオレドキシン活性部位が、モノシステインチオレドキシン活性部位である、請求項３または４のいずれかに記載の組成物。
  44. タンパク質またはペプチドが、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、請求項３または５のいずれかに記載の組成物または方法。
  45. 塩化ナトリウムが、水１リットルあたり約９グラムの塩化ナトリウムで存在する、請求項４に記載の医薬組成物。
  46. 揮発させる工程が、組成物を、減圧、高温およびそれらの組合せからなる群から選択される条件に付す工程を含む、請求項５に記載の方法。
  47. 揮発させる工程が、非酸化雰囲気下で行われる、請求項５に記載の方法。
  48. 揮発させる工程が、窒素雰囲気下で行われる、請求項５に記載の方法。
  49. 揮発させる工程が、凍結乾燥を含む、請求項５に記載の方法。
  50. 乾燥医薬組成物を希釈剤中に可溶化することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  51. 希釈剤が、約４から約７の間のｐＨを有する生理食塩水溶液である、請求項５０に記載の方法。
  52. 可溶化された医薬組成物が、約２５℃の温度で少なくとも約１日間還元形態で少なくとも８０％安定である、請求項５０に記載の方法。
  53. 可溶化された医薬組成物が、少なくとも約１週間還元形態で少なくとも８０％安定である、請求項５０に記載の方法。
  54. チオレドキシンが、モノシステインチオレドキシン活性部位を含む、請求項５に記載の方法。
  55. 組成物が、還元状態のチオレドキシンモノシステイン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含み、タンパク質またはペプチドが、チオレドキシンモノシステイン活性部位のＮ末端の単一のシステイン残基を除いてシステイン残基を全く含有しない、請求項５に記載の方法。
  56. 還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、通常の生理食塩水とからなる、請求項６に記載の組成物。
  57. タンパク質またはペプチドの投与が、炎症性サイトカインの放出を阻害する、請求項８に記載の方法。
  58. 炎症性サイトカインが、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  59. 組成物が、タンパク質またはペプチドを発現する微生物細胞の粗または精製抽出物を含む、請求項９に記載の方法。
  60. 抗菌ペプチドが、デフェンシンである、請求項１０に記載の組成物。
  61. 粘膜表面が肺表面である、請求項１１に記載の方法。
  62. 粘膜表面が鼻咽頭表面である、請求項１１に記載の方法。
  63. 粘膜表面が胃腸表面である、請求項１１に記載の方法。
  64. システインチオール還元状態が、発色性アッセイ、蛍光定量的アッセイおよび比濁アッセイの群から選択される方法を使用して測定される、請求項１２に記載の方法。
  65. 発色性アッセイがＤＴＮＢアッセイである、請求項１２に記載の方法。
  66. ウイルス性呼吸器疾患が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸窮迫症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９またはＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、喘息、肺炎、気管支炎、結核、反応性気道疾患症候群および間質性肺疾患と関連するウイルス感染症からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  67. ウイルス性呼吸器疾患が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸器アデノウイルスから選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
  68. 組成物が、噴霧形態およびエアロゾル化形態からなる群から選択される形態で投与される、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
  69. チオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドが、還元状態にあり、組成物が、少なくとも約３ｍｍＨｇの蒸気圧を有する水性溶媒をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  70. 還元状態のチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドと、水と、塩化ナトリウムとから本質的になる、請求項１５に記載の組成物。
  71. 約３．０重量％未満の含水量に乾燥される、請求項７または１５に記載の組成物。
  72. 組成物が、約３００ｎｍ未満の光波長の吸光度を有するペプチドまたはタンパク質画分を含む、請求項１６に記載の方法。
  73. 除去する工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項１６に記載の方法。
  74. 組成物を約３．０重量％未満の含水量に乾燥することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
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