CN115315292A - 具有硫氧还蛋白活性的组合物及相关方法 - Google Patents

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Abstract

公开了当处于还原状态时具有硫氧还蛋白作用的蛋白质或肽的制备物、制剂和其用于治疗疾病和/或病症用途。本发明的一个方面是一种降低具有过度粘稠或粘着的粘液或痰的患者中粘液或痰的粘弹性的方法。所述方法包括使患者的粘液或痰与包含蛋白质或肽的组合物接触，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N‑末端位置的单个Cys外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。

Description

具有硫氧还蛋白活性的组合物及相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月3日提交的美国临时专利申请62/956,994的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表的引用
本申请包含由EFS-Web以文本文件形式电子提交的序列表。该文本文件名为“7579-2-PROV_sequence_listing_v2_ST25.txt”，大小为21KB，记录于2020年1月2日。根据37CFR§1.52(e)(5)，文本文件中包含的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及硫氧还蛋白蛋白质或肽的制备物、制剂和用于治疗疾病和/或病症例如降低粘液或痰的粘弹性、炎症和高血压的用途，所述硫氧还蛋白蛋白质或肽含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
背景技术
硫氧还蛋白(Trx)是一种重要的细胞内人基因产物，它也在肺、上消化道和下消化道、眼睛和生殖道的粘膜上皮细胞上分泌，其与小三肽谷胱甘肽(GSH)一起构成了大部分的细胞外生物还原能力。与细胞内蛋白质(所述细胞内蛋白质中的大多数半胱氨酸(Cys)残基被局部还原环境保持还原)不同，氧气暴露导致大多数细胞外蛋白质的Cys形成共价二硫键。生物还原剂起到逆转这种二硫键的作用，在GSH和其他小分子硫醇的情况下是非选择性的，但在硫氧还蛋白氧化还原酶的情况下是选择性的，所述硫氧还蛋白氧化还原酶的结构和化学特征赋予了仅对某些二硫键构象的特异性。分泌的硫氧还蛋白通过独特而有效的硫醇-二硫化物交换机制进化而发挥一系列稳态功能，该机制靶向具有特定构象(包括与硫氧还蛋白家族氧化还原酶的可逆调节控制相关的变构键构型)的蛋白质二硫化物，以及邻位和其他高度受限的二硫化物，例如在氧化的粘液蛋白(粘蛋白)的分子内形成的二硫化物，其中硫氧还蛋白的还原导致CF患者痰的显著粘弹性正常化。分泌的硫氧还蛋白通过调节介质释放和抑制中性粒细胞向炎症部位的趋化性(Tian,H.,Matsuo,Y.,Fukunaga,A.,Ono,R.,Nishigori,C.,and Yodoi,J.,2013,Thioredoxin ameliorates cutaneousinflammation by regulating the epithelial production and release of pro-inflammatory cytokines.Frontiers in Immunology 4:1-12)、以及抑制促炎蛋白酶活性(Lee,R.L.,Rancourt,R.C.,del Val,G.,Pack,K.,Pardee,C.,Accurso,F.J.,and White,C.W.,2005,Thioredoxin and dihydrolipoic acid inhibit elastase activity incystic fibrosis sputum.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol289:L875-882)发挥一系列抗炎作用。硫氧还蛋白也被鉴定为一类组成型表达的内源性抗微生物蛋白(防御素)的特异性细胞外激活剂，所述抗微生物蛋白在粘膜表面分泌，在硫氧还蛋白介导其中心二硫键还原后，其表现出显著增强的效力和靶病原体范围(Jaeger等人,2013,Cell-mediatedreduction of humanβ-defensin 1:a major role for mucosal thioredoxin.Mucosalimmunology 6,1179-90)。由于过氧化物酶的选择性激活和直接向某些氧化底物提供电子的能力，硫氧还蛋白还被经典地认为是一种抗氧化蛋白。
对于治疗患有特征在于增稠的病理性粘液、慢性感染和慢性炎症的疾病的患者，在安全性、良好的耐受性和有效药物方面存在巨大未满足的医疗需求。一种这样的疾病是囊性纤维化(CF)，其是由编码囊性纤维化跨膜调节因子CFTR的基因突变引起的遗传性疾病，CFTR是一种关键的跨膜通道，负责维持氯离子和碳酸氢根离子的正常上皮转运。由近2000个cftr基因突变引起的CFTR表达、积累或功能缺陷降低了cAMP介导的氯的释放和碳酸氢根的转运，导致脱水和气道粘液的粘弹性增加，纤毛周围层深度降低和粘膜纤毛转运(MCT)受损。由此导致的气道中清除不良的病理性粘液的积累对于慢性支气管内细菌感染的形成和CF的永久性中性粒细胞炎症的特征是至关重要(Fahy,J.V.,和Dickey,B.F.,2010,Airway Mucus Function and Dysfunction.NEJM 363:2233-2247)。CF仍然是主要为北欧血统的人群中最常见的遗传性致命疾病，在美国影响超过30,000人，在全球影响超过80,000人。慢性咳嗽、过度痰产生和呼吸系统并发症是发病率和生活质量下降的主要原因。虽然CF患者的预期寿命从1980年之前的18年持续增加至今天的40多年，但仍迫切需要改善的疗法以进一步延长预期寿命并提高生活质量。不依赖于CF基因型的疗法是特别理想的。
粘液是一种持续分泌的超分子聚合物凝胶，在上皮表面形成保护屏障，负责通过纤毛作用和咳嗽将吸入的碎片和细菌运送出肺。因此，可实现有效纤毛驱动转运的粘液层的适当粘弹性和水合作用对于粘液功能以及预防感染和炎症至关重要。正常粘液主要由水(97％)组成，其余固体包括粘蛋白、非粘蛋白、盐、脂质和细胞碎片。聚合粘蛋白糖蛋白MUC5AC和MUC5B主要负责呼吸道粘液凝胶的粘弹特性。O-连接的聚糖羟基有助于水结合，而粘蛋白本身形成纠缠网络，该网络还涉及共价和非共价链间和链内连接。聚合粘蛋白响应疾病应激和炎症会过度分泌，并且因其极高的半胱氨酸含量而引人注目——MUC5AC(UniProt登录号P98088)和MUC5B(UniProt登录号Q9HC84)的每个成熟单体分别含有294和273个半胱氨酸。这些丰富的粘蛋白半胱氨酸在暴露于气道中的O2时，有可能形成大量链内二硫化物，与正常个体相比，在CF患者中观察到粘蛋白二硫键增加了近7倍(Yuan等人,2015,Oxidation increases mucin polymer cross-links to stiffen airway mucusgels,Science Translational Medicine 7,276ra227)。
类似于紧密缠绕的橡皮筋的缩短，病理性粘液凝胶中增加的链内二硫键使粘蛋白细丝收缩，并使聚合粘液凝胶结构紧凑。这种二硫化物介导的CF粘蛋白网的收紧可为观察到的增加的粘液浓度和渗透系数提供了机理，其参与引起受CF影响的个体中存在纤毛周围层(PCL)脱水和粘液转运损失。使用最近开发的高分辨率无创成像技术直接测量活气道上皮表面的PCL水合作用和MCT，支持了在CF病理生理学中粘液粘弹性增加而不是脱水本身的根本重要性(Birket,S.E.等人,2014,A functional anatomic defect of the cysticfibrosis airway,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine190,421-432；Chu,K.K.等人,2016,In vivo imaging of airway cilia and mucusclearance with micro-optical coherence tomography,Biomed Opt Express 7,2494-2505)。
天然分泌的GSH和硫氧还蛋白可能是负责防止细胞外粘液中过量粘蛋白二硫键形成的化合物。考虑到氧化驱动的二硫化物形成和还原剂驱动的二硫化物破坏之间的平衡，还原剂缺乏或粘蛋白水平升高将引起增加的净粘膜表面二硫键结合。已知在CF中粘液过度分泌，据观察，与正常受试者相比，CF患者中还原型和氧化型谷胱甘肽均降低约70％(Wetmore,D.R.等人,2010,Metabolomic profiling reveals biochemical pathways andbiomarkers associated with pathogenesis in cystic fibrosis cells.JBC 285:30516-22)。这种GSH的减少在多项已发表的研究中是一致的，这些研究调查了CF患者的细胞外肺液体，表明功能性CFTR可能在维持正常气道GSH流出率方面具有间接的作用。
更重要的是，CF上皮细胞中CFTR介导的碳酸氢根流出受损与异常的酸性气道pH相关，该pH从正常个体中的7.2降至CF患者的6.5以下(Garland AL,Walton WG,Coakley RD等人,2013,Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cysticfibrosis airways,Proceedings of the National Academy of Sciences 110:15973-8)。
由于小分子硫醇试剂固有的高的酸解离常数(pKa)，低pH环境大大削弱了内源性或外源性GSH(pKa 9.1)形成亲核二硫键攻击所必需的去质子化、反应性游离硫醇根阴离子的能力。据计算，在CF气道pH下只有0.25％的天然GSH池呈活性、硫醇根形式。因此，不仅在CF中分泌的粘液(以及因此能够形成二硫键的粘蛋白Cys)增加并且GSH分泌减少，而且由于CF气道的pH降低，剩余的GSH功能受损。
同样，用作研究或批准的粘液溶解剂，包括NAC、半胱胺和美司钠(Mesna)(pKa值分别为9.5、8.3和9.2)的相关硫醇化合物同样缺乏在患病气道中显著的二硫化物还原活性的潜力。此外，这些试剂的机制源自简单的还原硫醇，其混杂地靶向任何氧化底物，而没有酶治疗剂的选择性特征。
相反，硫氧还蛋白是一种由其高度保守的酶活性位点中的氢键键合产生的具有异常酸性pKa 6.2的大分子，它对酸性pH的敏感性显著降低。最近的蛋白质组学研究表明，硫氧还蛋白在与新形成的气道粘液一起分泌的粘膜下腺蛋白中占很大比例(Joo,N.S.,Evans,I.A.,Cho,H.J.,Park,I.H.,Engelhardt,J.F.,and Wine,J.J.2015，Proteomicanalysis of pure human airway gland mucus reveals a large component ofprotective proteins.PLoS One 10,e0116756)，表明这种氧化还原酶在气道二硫键稳态中的功能性作用比以前考虑的更重要。
治疗病理性粘液：在治疗上，从阻塞的气道中清除粘液是减轻阻塞性/炎症性疾病(如CF)中持续的慢性感染和炎症的关键方面。物理治疗、机械冲击装置和吸入粘液液化(粘液溶解)药物都是目前CF患者中去痰治疗方案的组成部分。然而，现有的治疗主要是对症的，并且没有被证明有效减轻潜在的粘液缺陷，这些粘液缺陷在机理上导致清除不良。
CF中最常用的粘液溶解化合物是重组人DNase I(DNase；Dornase Alfa)，商标为Genentech公司的
Figure BDA0003829764700000041
DNase通过水解粘稠的、积累的中性粒细胞衍生的核酸来改善肺功能，尽管最近的研究表明粘液蛋白中过量的二硫键，而不是细胞外的DNA积累，可能在疾病发展中起主导作用。
尽管DNA酶广泛应用，但其仍有许多缺点。DNase是一种二硫键合的糖基化人酶，是大小适中的单体，需要哺乳动物细胞培养制造，使其成为生产成本更高的药物类型之一。DNase的靶标，即过量的游离核酸，是严重和慢性感染的结果，在早期/不太严重的CF中可能不会以可评估的水平存在(尽管一些早期疾病患者报告受益)，也没有证明DNase对其他阻塞性肺疾病的临床益处。在6-30％的儿科患者中，用DNase治疗的肺功能出现临床恶化。DNase还可以通过促进中性粒细胞弹性蛋白酶的活性加剧炎症，中性粒细胞弹性蛋白酶是一种蛋白水解酶，被DNase靶向的核酸的存在所抑制。
尽管积极使用DNase，但反应很低，CF疾病通常会在儿童期或成年早期发展为支气管扩张、呼吸衰竭和死亡或移植。虽然气道水合作用/咳嗽诱导疗法(例如甘露醇或高渗盐水吸入)在临床试验中显示出前景，并且一些现在用于患者护理，但仍然严重缺乏有效的粘液治疗，尤其是那些直接靶向病理粘液的治疗。
不幸的是，已被评估为粘液药物的各种含硫醇小分子的结果令人失望。这些试剂包括NAC和Nacystelyn(NAL；NAC+L-赖氨酸)以及还原的GSH和半胱胺。虽然在很大程度上是安全的，但迄今为止，这些小分子试剂在口服或吸入形式下都没有表现出明显的临床益处。
这种低效部分可能是由于吸入递送过程中自氧化导致的效力丧失，以及肺酶潜在地将GSH快速转化为无活性形式，但是更有可能的原因是非酶硫醇剂在酸性CF气道pH中固有的低活性，如上所述，这种低活性由其极碱性硫醇pKa引起。
与粘液过量产生一样，碳酸氢根分泌缺陷和气道酸化不仅限于CF，还可能是影响大量人群的其他阻塞性肺疾病的基础。因此，真正有效和机械的粘液调节治疗可能会带来广泛的医疗益处。通过将二硫化物靶向与生物药物(如硫氧还蛋白)的优越效力、稳定性和特异性组合来改善硫醇剂是非常可取的。
不幸的是，开发能够安全地将蛋白稳定在还原形式的基于硫醇疗法的制剂策略受到限制。先前的努力(PCT WO2006/090127)需要费力地筛选大量赋形剂以找到糖和化学稳定剂的组合，使得组合物能够在以固体形式长期储存期间以及在液体溶液中重构以用于递送时都能够保持是还原的。由这种策略产生的基于还原糖的制剂被证明具有显著的促炎性，因此不适合用于吸入递送。使用这种蔗糖制剂在盐水中重构的天然硫氧还蛋白在通过气管内施用递送到大鼠时导致高水平的中性粒细胞流入和炎性细胞因子释放(Rancourt,R.C.等人,2007,Reduced thioredoxin increases proinflammatory cytokines andneutrophil influx in rat airways:modulation by airway mucus.Free Radic BiolMed 42,1441-53)。因此，对于基于硫醇的蛋白疗法，仍然需要安全有效的制剂方法。
附图说明
图1：半胱氨酸35突变为丝氨酸(C35S TRX)的机制
图2.硫醇剂还原活性与硫氧还蛋白的pH依赖性
图3.单硫醇C35S硫氧还蛋白的冻干固体形式和溶液的稳定性
图4.通过疏水相互作用色谱法分离的主要硫氧还蛋白级分(顶部)和>400nm具有吸光度的红色级分(底部)的紫外光谱
图5.在37℃下，用DTT(1mM)和ORP100S(0.01、0.1和1.0mM浓度)还原1小时的4％固体干重粘液的A.弹性系数(G')、B.粘稠系数(G”)和C.粘蛋白分子量(GPC-MALLS)的降低。
图6.来自CF患者供体的原代HBE中ORP100S(“Theradux”)的μOCT分析
图7.CF患者痰中ORP100S(“Theradux”)的μOCT分析
图8.硫氧还蛋白和C35S硫氧还蛋白对来自非CF和CF供体鼻上皮的原代HBE培养物的基底外侧ALI培养基中，24小时后诱导的IL-6或TNFα水平的影响
图9.在大鼠中雾化气溶胶递送ORP-100和ORP100S，减轻制剂诱导的体内中性粒细胞的流入
发明内容
本发明的一个方面是一种降低具有过度粘稠或粘着的粘液或痰的患者中粘液或痰的粘弹性的方法。所述方法包括使患者的粘液或痰与包含蛋白质或肽的组合物接触，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端位置的单个Cys外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
在本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其中所述组合物包含蛋白质或肽和药学上可接受的赋形剂，所述蛋白质或肽具有还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端位置的单个Cys外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
本发明的另一方面是一种组合物，其包含蛋白质或肽和水性溶剂，所述蛋白质或肽具有还原状态的硫氧还蛋白活性位点，所述水性溶剂具有至少约3mmHg的蒸气压。
在本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，其基本上由蛋白质或肽、水和氯化钠组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
本发明的另一方面是制备干燥组合物的方法，其包括提供水性组合物，所述水性组合物包含蛋白质或肽和水性溶剂，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点，所述水性溶剂具有至少约3mmHg的蒸气压。所述方法还包括使水性溶剂挥发以产生包含蛋白质或肽的干燥组合物。
本发明的另一方面是一种组合物，其基本上由或由蛋白质或肽和生理盐水组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
本发明的另一方面是一种组合物，其基本上由蛋白质或肽组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物是干粉。
本发明的另一种方法是治疗受试者中炎症的方法，其包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中所述受试者具有炎症或处于发生炎症的风险。
本发明的又一方面是通过施用药物组合物来治疗受试者中细菌感染的方法，所述药物组合物包含蛋白质或肽，所述蛋白质或肽具有还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，并且其中所述受试者具有细菌感染或处于发生细菌感染的风险。
本发明的另一方面是一种组合物，其包含可操作地激活一种或多种内源性抗微生物肽的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中所述激活产生治疗或预防感染性疾病的治疗有效试剂。
本发明的另一种方法是通过向受试者的粘膜表面局部施用组合物来调节受试者的微生物组组成的方法，所述组合物包含具有还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽。
又一方法是,通过选择含有单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽(该蛋白质或肽除了硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点内的单个Cys外不含有任何半胱氨酸残基)，确定含有单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽的二硫键还原活性；并测量蛋白质或肽的整体半胱氨酸硫醇还原状态。
本发明的又一方面是通过将包含蛋白质或肽的组合物施用于受试者，治疗患有病毒性呼吸道疾病或处于发生病毒性呼吸道疾病风险的受试者中病毒性呼吸道疾病的方法，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
本发明还包括通过将包含蛋白质或肽的药物组合物施用于有需要的受试者，减轻有需要的受试者中与病毒感染相关的肺炎症的方法，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
本发明的另一方面是包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽具有硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物不包含大于约400nm波长具有UV吸光度的硫氧还蛋白的蛋白质级分。
本发明的另一方面是产生包含蛋白质或肽的组合物的方法，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，所述方法通过以下进行：提供包含蛋白质或肽的裂解物，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点；浓缩裂解物中的蛋白质或肽；以及去除大于约400nM具有吸光度的硫氧还蛋白的肽或蛋白质级分，以产生组合物。
在本发明的各种实施方案中，硫氧还蛋白活性位点是硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其包含选自以下的氨基酸序列：C-X-X-S(SEQ ID NO:24),C-X-X-X(SEQ ID NO:17),X-C-X-X-X-X(SEQ ID NO:19),X-C-G-P-X-X(SEQ ID NO:21),W-C-G-P-X-K(SEQ ID NO:23),X-C-X-X-S-X(SEQ ID NO:25),X-C-G-P-S-X(SEQ ID NO:26),和W-C-G-P-S-K(SEQ IDNO:27)，其中X残基是除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基。在其他实施方案中，蛋白质或肽包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29至少约80％相同的序列，其中硫氧还蛋白活性位点是硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其位于对应于SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置32-35的位置。在更进一步的实施方案中，蛋白质或肽包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的序列。在其他实施方案中，蛋白质包含人硫氧还蛋白。
在本发明的一些实施方案中，患者患有肺疾病，其中粘液或痰的异常或过度粘度或粘性是疾病的症状或原因。患者可患有肺疾病，其中粘液或痰的异常或过度粘度或粘性与生物还原剂活性不足相关。在其他实施方案中，患者患有选自以下的疾病：囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、哮喘、鼻窦炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、干眼病和消化道疾病。在另一个实施方案中，患者患有囊性纤维化。在一些实施方案中，患者是人。
在降低患者中过度粘稠或粘性的粘液或痰的粘弹性的方法的实施方案中，通过选自以下的途径将组合物引入患者进行使患者的粘液或痰与组合物接触的步骤：鼻、气管内、支气管、直接设置到肺、吸入、口和眼。在其他实施方案中，待接触的粘液或痰在患者的呼吸道中。在其他实施方案中，在使患者的粘液或痰与组合物接触的步骤之后，与接触步骤之前相比，患者的用力呼气量(FEV)增加至少约2.5％。
在进一步的实施方案中，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽与粘液蛋白质中的半胱氨酸残基共价结合，例如，其中所述粘液蛋白质是粘蛋白，例如呼吸道的粘液蛋白质。
在本发明的实施方案中，组合物可包含药学上可接受的载体，并且在此类药物组合物中，蛋白质或肽可包含SEQ ID NO：1的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点序列。本发明的药物组合物可以配制用于通过选自以下的途径施用于患者：口、直肠、鼻、吸入、气管内、支气管、直接滴注、局部和眼。
在本发明的具有蒸汽压为至少约3mmHg的水性溶剂的实施方案中，水性溶剂可以选自乙酸铵、碳酸氢铵、甲酸铵、乙酸三乙铵和碳酸氢三乙铵。水性溶剂可以是乙酸铵。在其他实施方案中，水性溶剂的浓度可以在约1mM至约50mM之间和/或水性溶剂可以具有约4至约7之间的pH。
在一些实施方案中，本发明的组合物不包含糖或糖衍生物。在其他实施方案中，除蛋白质或肽以外，水性组合物不包含蒸汽压小于约3mmHg的任何化合物。
在本发明的其他实施方案中，除硫氧还蛋白活性位点中的一个或两个Cys以外，蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。在其他实施方案中，硫氧还蛋白活性位点可包含选自以下的氨基酸序列：C-X-X-C(SEQ ID NO:16),X-C-X-X-C-X(SEQ ID NO:20),X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO:22),W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO:3),其中X残基是除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基。在进一步的实施方案中，硫氧还蛋白活性位点是单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点，并且除在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端的单个Cys以外，蛋白质或肽可以不包含任何半胱氨酸残基。
在本发明的包含氯化钠的实施方案中，氯化钠可以以每1升水约9克氯化钠存在。
在包括使水性溶剂挥发的步骤的实施方案中，挥发步骤可包括使组合物经受选自以下的条件：减压、升高的温度及其组合。在这样的实施方案中，挥发步骤可以在非氧化气氛例如氮气气氛下进行。在其他实施方案中，挥发步骤可以包括冻干。
在涉及形成干燥的药物组合物的本发明的实施方案中，所述方法可以包括将干燥的组合物溶解在稀释剂中，例如溶解在pH约4至约7之间的盐水溶液。此类溶解的药物组合物在约25℃的温度下至少80％以还原形式稳定至少约1天，或在约25℃的温度下至少80％以还原形式稳定至少约1周。在其他此类实施方案中，硫氧还蛋白可包含单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点，或更具体地，包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端的单个半胱氨酸残基以外，蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
在用于治疗炎症的本发明的方法中，蛋白质或肽的施用可以抑制促炎细胞因子的释放，例如所述促炎细胞因子选自IL-8、IL-1β、IL-6和TNFα。
在用于治疗细菌感染的本发明的方法中，组合物可以包含表达蛋白质或肽的微生物细胞的粗提物或纯化提取物。
在包含激活一种或多种内源性抗微生物肽的组合物的本发明的实施方案中，抗微生物肽可以是防御素。
在用于调节受试者的微生物组组成的实施方案中，粘膜表面可以是肺表面、鼻咽表面或胃肠道表面。
在用于确定蛋白质或肽的二硫键还原活性的实施方案中，可以使用选自显色测定法、荧光测定法和浊度测定法的方法测量半胱氨酸硫醇还原状态。例如，显色测定法可以是DTNB测定法。
在与治疗病毒性呼吸道疾病相关的实施方案中，所述疾病可以选自急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-19或COVID-19)、流感、与哮喘、肺炎、支气管炎、肺结核、反应性气道疾病综合征和间质性肺病相关的病毒感染。在这样的实施方案中，病毒性呼吸道疾病可由选自以下的病毒引起：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和呼吸道腺病毒。
在本发明的各种实施方案中，组合物可以以喷雾形式或雾化形式施用，或以干粉形式用于吸入。
在具有蛋白质或肽的本发明的组合物中，所述蛋白质或肽具有硫氧还蛋白活性位点，且不包括大于约400nm波长具有UV吸光度的硫氧还蛋白的蛋白质级分，此类组合物可进一步包含蒸气压为至少约3mmHg的水性溶剂。或者，组合物可以基本上由蛋白质或肽、水和氯化钠组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。此外，这样的组合物可以干燥至水含量小于约3.0wt.％。
在生产具有蛋白质或肽的组合物的本发明的方法中，所述蛋白质或肽具有硫氧还蛋白活性位点，其中除去在大于约400nm处具有吸光度的硫氧还蛋白的肽或蛋白质级分以产生该组合物，所述组合物可以进一步表征为具有肽或蛋白质级分，所述肽或蛋白质级分在小于约300nm的UV光波长处具有吸光度。在这样的实施方案中，去除步骤可以包括疏水相互作用色谱法和/或将组合物干燥至水含量小于约3.0wt.％。
具体实施方式
本发明一般地涉及含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽在治疗粘膜疾病中的用途，所述粘膜疾病的特征在于包括异常粘液、炎症、感染或高血压中的一种或多种的症状。更具体地，本发明人发现具有硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽，包括包含单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽，降低炎症或异常痰或粘液的粘弹性和/或粘性，从而是使痰或粘液正常化的有效试剂。
因此，含有如上所述还原状态的硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽，或编码此类蛋白质的核酸分子，可以单独使用或以组合物使用，以治疗与不希望的粘液或顽固且粘稠的痰相关的多种病症或疾病，以及用于治疗炎症、高血压和/或感染。例如，呼吸道疾病如囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、鼻窦炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压和哮喘，包括哮喘持续状态，特别适合使用本发明的产品和方法治疗。此外，与增稠或粘附性粘液相关的消化道疾病，例如球虫病也特别适合使用本发明的产品和方法治疗。也适合治疗其他粘膜表面的类似疾病，例如特征在于异常增稠的粘液分泌、炎症和/或感染的干眼病，还适合治疗涉及氧化应激和炎症的眼疾病，包括黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、青光眼和白内障。
因此，本发明涉及含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽(包括其中硫氧还蛋白的蛋白质或肽包含单半胱氨酸活性位点)用于降低粘液或痰的粘弹性的用途，特别是用于降低异常或过度粘稠和/或粘性的粘液或痰的粘弹性。可以以有效降低粘液或痰的粘弹性的方式和量将蛋白质施用于患有或受这种异常或过度粘液或痰影响的患者，优选地为患者提供治疗益处。此外，可将蛋白质施用于患有炎症或感染的患者，包括具有失控的炎性反应或处于失控的炎性反应的风险的患者，例如细胞因子释放综合征(CRS)和相关的急性肺损伤例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
具有硫氧还蛋白活性位点的蛋白质和肽
硫氧还蛋白-1(Trx)是一种小的(12kDa)天然存在的氧化还原蛋白，二硫化物蛋白质是其优选的底物。Trx是一种必需的人蛋白质，通过有效和特异性的二硫键还原在调节蛋白质和酶活性方面发挥重要的生物学作用。
Trx在其高度保守的Cys-Gly-Pro-Cys(SEQ ID NO:1)活性位点中具有氧化还原活性的二硫醇，该二硫醇被黄素酶硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和辅因子NADPH从氧化形式还原。这三种组分共同形成硫氧还蛋白系统，其还原能力比小分子还原剂强许多倍。
凭借其在可逆二硫键调控中的作用，哺乳动物Trx参与许多细胞内和细胞外氧化还原信号传导活性，包括作为蛋氨酸亚砜还原酶的辅助因子、修饰受体和转录因子的DNA结合活性以及参与蛋白质折叠。此外，Trx可以清除自由基，并能够保护细胞免受氧化应激，并且在粘膜表面需要分泌的Trx来激活(通过二硫键还原)重要的分泌型抗微生物人β-防御素-1，hBD-1。
如本文所公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽在用于治疗如囊性纤维化的病症中具有优于其他还原剂的优势。例如，与其他还原剂如N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Nacystelyn(NAL)、二硫苏糖醇(DTT)或还原型谷胱甘肽(GSH)不同，本文公开的突变硫氧还蛋白对酶促或自氧化机制的失活较不敏感，包括产生超氧化物、过氧化氢、羟基自由基和其他毒性氧代谢物的反应。此外，天然或野生型硫氧还蛋白是一种天然存在的化合物，通常在细胞外分泌到气道表面，因此，将硫氧还蛋白引入气道应该是非激惹性的并且不太可能诱导不适当的免疫反应。硫氧还蛋白也不是糖基化的，因此更容易制造，并且以天然或重组形式施用蛋白质不会诱导固有免疫反应。或许更显著的是，与其他还原剂相比，还原的硫氧还蛋白更快、更有效地将治疗的粘液或痰恢复到正常的粘度水平，并且这种正常化持续更长的时间。例如，NAC、NAL、DTT和GSH随着时间的推移变得“消耗”或氧化，在这个阶段，正常化的痰或粘液可以恢复到异常的粘度状态。相反，硫氧还蛋白产生的粘度或粘弹性降低似乎持续更长时间，很可能是由于其还原系统的循环再还原。此外，通过保持与粘蛋白Cys残基的共价结合，与天然硫氧还蛋白相比，本文公开的单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白产生了甚至更有效且持续时间更长的粘度降低。最后，硫氧还蛋白在二硫键还原方面比其他还原剂更有效且更特异，因此，为达到有益效果，其可以以比其他试剂显著更低的剂量使用。
如上所述，硫氧还蛋白(Trx)是一种二硫键还原酶的蛋白质，其催化许多硫醇依赖性细胞还原过程。天然硫氧还蛋白含有两个在物种间高度保守的氧化还原活性半胱氨酸。在其氧化形式中，这些半胱氨酸形成从蛋白质的三维结构中突出的二硫键桥。蛋白质二硫化物是Trx介导的还原作用的优选底物。将两个Trx活性位点半胱氨酸之一修饰为半胱氨酸以外的残基，产生单半胱氨酸活性位点。
本发明一般地涉及含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白蛋白质或肽的用途。提及“硫氧还蛋白活性位点”包括包含氨基酸序列C-X-X-X(SEQ ID NO:17)的硫氧还蛋白单半胱氨酸(即单硫醇)活性位点或包含两个氧化还原活性半胱氨酸的天然(或野生型)硫氧还蛋白二硫醇活性位点(N-末端半胱氨酸和C-末端半胱氨酸(其包含具有SEQ IDNO：16的氨基酸序列C-X-X-C)。如本文所用，表示为“C”的氨基酸残基是半胱氨酸残基，表示为“X”的氨基酸残基可以是除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基，特别是其余20个标准氨基酸残基或合成的非天然或修饰的氨基酸中的任何。X残基的标识独立于其他X残基。也就是说，任何X残基的标识可以与其他X残基相同或不同。
本发明的硫氧还蛋白活性位点可包含氨基酸序列C-G-P-X(SEQ ID NO:18)，其中天然或野生型序列包含氨基酸序列C-G-P-C(SEQ ID NO:1)。硫氧还蛋白活性位点可进一步包含氨基酸序列X-C-X-X-X-X(SEQ ID NO:19)，其中天然或野生型序列包含氨基酸序列X-C-X-X-C-X(SEQ ID NO:20)。此外，本发明的硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列X-C-G-P-X-X(SEQ ID NO:21)，其中表示为“G”的此类氨基酸残基是甘氨酸残基，其中表示为“P”的此类氨基酸残基是脯氨酸残基，并且其中天然或野生型序列包含氨基酸序列X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO:22)。本发明的另一硫氧还蛋白活性位点包含氨基酸序列W-C-G-P-X-K(SEQ IDNO:23)，其中表示为“W”的此类氨基酸残基是色氨酸残基，其中表示为“K”的此类氨基酸残基是赖氨酸残基，并且其中天然序列包含氨基酸序列W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO:3)。硫氧还蛋白活性位点可以包含氨基酸序列C-X-X-S(SEQ ID NO:24)。本发明的此类硫氧还蛋白活性位点优选包含氨基酸序列C-G-P-S(SEQ ID NO:1)。硫氧还蛋白活性位点可进一步包含氨基酸序列X-C-X-X-S-X(SEQ ID NO:25)、X-C-G-P-S-X(SEQ ID NO:26)或W-C-G-P-S-K(SEQID NO:27)，其中表示为“X”的氨基酸残基可以是除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基。如上所述，单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点可以通过取代天然活性位点的C末端半胱氨酸而不同于相应的天然序列。此外，硫氧还蛋白活性位点可通过缺失天然活性位点的C末端半胱氨酸而不同。
硫氧还蛋白的其他变体
含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽还可在硫氧还蛋白活性位点以外的非活性位点半胱氨酸残基处包含一个或多个半胱氨酸缺失、取代或其组合。在一方面，硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸被除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代。在一方面，硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸被除半胱氨酸或丙氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代。在一方面，硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸被丝氨酸取代。在另一方面，在硫氧还蛋白的蛋白质或肽中，硫氧还蛋白活性位点以外的所有非活性半胱氨酸都被缺失、被丝氨酸残基取代、或其组合。在另一方面，在硫氧还蛋白的蛋白质或肽中，硫氧还蛋白活性位点以外的所有非活性半胱氨酸都被缺失、和/或被丝氨酸残基取代、或其组合，并且硫氧还蛋白活性位点中的C-末端半胱氨酸也被丝氨酸残基取代。
硫氧还蛋白的类型
在本发明的一个方面，含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质是全长硫氧还蛋白的蛋白质或其任何片段，其含有如上文在结构和功能上描述的硫氧还蛋白活性位点。优选的具有活性位点的硫氧还蛋白包括原核硫氧还蛋白、酵母硫氧还蛋白、植物硫氧还蛋白和动物硫氧还蛋白，动物硫氧还蛋白的进一步实施方案是哺乳动物和人硫氧还蛋白。来自多种生物体的硫氧还蛋白的核酸和氨基酸序列在本领域中是众所周知的并且旨在包含在本发明中。例如，SEQ ID NO：4-15代表来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(SEQ ID NO:4)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(SEQ ID NO:5)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(SEQ ID NO:6)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(SEQ ID NO:7)、原鸡(Gallus)(SEQ ID NO:8)、小鼠(Mus musculus)(SEQ IDNO:9)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(SEQ ID NO:10)、家牛(Bos taurus)(SEQ ID NO:11)、智人(Homo sapiens)(SEQ ID NO:12)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(SEQ ID NO:13)、玉米(Zea mays)(SEQ ID NO:14)、和水稻(Oryza sativa)(SEQ ID NO:15)的硫氧还蛋白的氨基酸序列。提及这些序列中的每一个，具有SEQ ID NO:16的C-X-X-C基序可存在于以下：SEQ ID NO:4(位置34-37)、SEQ ID NO:5(位置29-32)、SEQ ID NO:6(位置28-31)、SEQ IDNO:7(位置30-33)、SEQ ID NO:8(位置32-35)、SEQ ID NO:9(位置32-35)、SEQ ID NO:10(位置32-35)、SEQ ID NO:11(位置32-35)、SEQ ID NO:12(位置32-35)、SEQ ID NO:13(位置60-63)、SEQ ID NO:14(位置89-92)和SEQ ID NO:15(位置95-98)。
活性位点以外的修饰
提及SEQ ID NO：12，可以被缺失和/或取代的硫氧还蛋白活性位点以外的非活性半胱氨酸残基可存在于人硫氧还蛋白-1序列的位置62、69和73位。再次提及SEQ ID NO：12，活性位点Cys存在于位置32和35，其中位置32上的半胱氨酸称为N-末端半胱氨酸，位置35上的半胱氨酸称为C-末端半胱氨酸。在一方面，SEQ ID NO：12的位置62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸，被缺失、被除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代，或其组合。在另一个方面，SEQ ID NO：12的位置62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸，被除半胱氨酸残基或丙氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代。在另一方面，SEQ ID NO：12的位置62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被丝氨酸取代。在又一方面，SEQ ID NO：12的位置35、62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被丝氨酸取代。在一方面，SEQ IDNO：12的位置62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被缺失，并且SEQ ID NO：12的位置35上的半胱氨酸，或在其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代，优选地被丝氨酸残基取代。在又一方面，SEQID NO：12的位置62、69和73上的半胱氨酸，或其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被缺失、和/或被除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代、和/或其组合，并且SEQ ID NO：12的位置35上的半胱氨酸，或在其他硫氧还蛋白中相应位置的半胱氨酸被除半胱氨酸残基以外的任何氨基酸残基取代，优选地被丝氨酸残基取代。
单半胱氨酸硫氧还蛋白
在本发明的一个具体实施方案中，硫氧还蛋白是蛋白质或肽，其包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点中的单个半胱氨酸残基以外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基，如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示，其中硫氧还蛋白是SEQ ID NO:12的完全单半胱氨酸变体，其中唯一的半胱氨酸在位置32(或更一般地在硫氧还蛋白活性位点的N末端位置)。本发明的这个实施方案还包括SEQID NO:28和SEQ ID NO:29的变体，其具有被取代和/或缺失的氨基酸，同时仍然是完全单半胱氨酸并且在位置32上(或更一般地在硫氧还蛋白活性位点的N末端位置)具有唯一的半胱氨酸。这样的变体可以相对于SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个此类取代和/或缺失。在替代实施方案中，变体的特征在于与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少约80％的同一性，与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少约85％的同一性，与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少约90％的同一性，与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少约95％的同一性，与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有至少约99％的同一性，或至少在80％至99％之间的任何整数百分比同一性。
已经解析了几种硫氧还蛋白的三维结构，包括人和细菌的硫氧还蛋白。因此，来自多种生物体的硫氧还蛋白的结构和活性位点在本领域是众所周知的，并且本领域技术人员将能够容易地鉴定和产生全长硫氧还蛋白的片段或同源物，包括具有单半胱氨酸活性位点的硫氧还蛋白，其组合了可以在本发明中使用的硫氧还蛋白活性位点以外的非活性半胱氨酸残基的缺失、取代或其组合。硫氧还蛋白的示例包括ORP-100，其是具有单硫醇活性位点的硫氧还蛋白，其中位置35的第二活性位点半胱氨酸(即C-末端半胱氨酸)已被丝氨酸残基取代。ORP100S是具有单硫醇活性位点的硫氧还蛋白，其中位置35的第二活性位点半胱氨酸(即C-末端半胱氨酸)已被丝氨酸取代，并且其中硫氧还蛋白活性位点以外的所有非活性半胱氨酸残基(存在于位置62、69和73)也被丝氨酸残基取代(SEQ ID NO:29)。
还原的半胱氨酸
短语“还原状态”具体描述了本发明的蛋白质或肽的活性位点中半胱氨酸残基的状态。在还原状态下，相邻的半胱氨酸残基形成二硫醇(即两个游离的巯基，-SH)。相反，在氧化形式中，此类半胱氨酸残基形成分子内二硫键桥；此类分子可以称为胱氨酸。在还原状态下，硫氧还蛋白活性位点能够通过其活性位点硫醇可逆地氧化成二硫化物来参与氧化还原反应，并催化硫醇-二硫化物交换反应，从而导致与靶标二硫化物半胱氨酸之一的共价连接。对于本发明的含有硫氧还蛋白单硫醇活性位点并且进一步包含硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基的缺失、用除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基对其进行的取代或其组合的蛋白质或肽，在活性位点中的N-末端半胱氨酸作为单硫醇处于还原状态，因此能够与靶蛋白上的半胱氨酸形成稳定的混合二硫化物。
蛋白质或肽的大小
如本文所用，含有硫氧还蛋白活性位点的本发明的蛋白质或肽可以是硫氧还蛋白活性位点本身，或者是通过糖苷键连接到其他氨基酸的硫氧还蛋白活性位点。因此，本发明的蛋白质或肽的最小大小为约4至约6个氨基酸长度，优选大小取决于是否想要的是此类蛋白质的全长、融合、多价或仅功能部分。优选地，本发明的蛋白质或肽的长度延伸约4至约100个氨基酸残基或更多，其中具体地设想具有任何中间整数长度(即,4,5,6,7...99,100,101...)的肽。其也可以是在N和C末端被阻断的短硫氧还蛋白模拟肽，如Bachnoff等人,Free Radical Biol Med 50:1355-67,2011所述。
同源物
在进一步优选的实施方案中，本发明的蛋白质可以是全长蛋白质或此类蛋白质的任何同源物。如本文所用，术语“同源物”用于指通过对天然存在的蛋白质或肽进行修饰而不同于天然存在的蛋白质或肽(即，“原型”或“野生型”蛋白质)的蛋白质或肽，但是其保留了天然存在形式的基本蛋白质和侧链结构，和/或保留了天然蛋白质的至少一个生物活性部分(例如硫氧还蛋白活性位点)的基本三维结构。此类变化包括但不限于：一个或几个氨基酸侧链的变化；一个或几个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白质或肽(片段)的截短形式)、插入和/或取代；一个或几个原子的立体化学变化；和/或不重要的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。根据本发明，可用于本发明的任何蛋白质或肽(包括天然硫氧还蛋白的同源物)具有硫氧还蛋白单硫醇活性位点，使得在还原状态下，蛋白质或肽能够通过将其活性位点硫醇氧化成二硫化物参与氧化还原反应，和/或降低粘液或痰的粘弹性或粘性，或增加粘液或痰的液化。
如本文所用，含有硫氧还蛋白活性位点并且进一步包含硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基缺失和/或被除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基取代和/或其组合的蛋白质或肽可以具有与硫氧还蛋白相似的特征，优选地，是选自以下的硫氧还蛋白：原核生物硫氧还蛋白、真菌硫氧还蛋白(包括酵母)、植物硫氧还蛋白、动物硫氧还蛋白或哺乳动物硫氧还蛋白。在一个特别优选的实施方案中，蛋白质是人硫氧还蛋白。
同源物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。编码蛋白质的核酸的天然存在的等位基因变体是在基因组中与编码此类蛋白质的基因基本上相同的一个或多个基因座上出现的基因，但是，由于例如由突变或重组引起的天然变异，其具有相似但不相同的序列。等位基因变体通常编码与其比较的基因编码的蛋白质具有相似活性的蛋白质。由于遗传密码的简并性，一类等位基因变体可以编码相同的蛋白质，但具有不同的核酸序列。等位基因变体还可以包含基因5'或3'非翻译区(例如，调节控制区)的改变。等位基因变体是本领域技术人员所熟知。
可以使用本领域已知的用于生产蛋白质的技术来生产同源物，包括但不限于直接修饰分离的天然存在的蛋白质、直接蛋白质合成或使用例如经典或重组DNA技术以实现随机或靶向诱变来修饰编码蛋白质的核酸序列。
与野生型蛋白质相比，同源物的修饰与天然存在的蛋白质相比，激动、拮抗或基本上不改变同源物的基本生物活性。通常，蛋白质的生物活性或生物作用是指归因于蛋白质的天然存在形式的蛋白质所表现或执行的任何功能，如在体内(即在蛋白质的天然生理环境中)或体外(即，在实验室条件下)所测量或观察到的。蛋白质，例如同源物或模拟物(下文讨论)中的修饰，可产生与天然存在的蛋白质具有相同生物活性的蛋白质，或与天然存在的蛋白质相比具有降低或增加的生物活性的蛋白质。导致蛋白质表达降低或蛋白质活性降低的修饰可称为蛋白质的失活(完全或部分)、下调或作用降低。类似地，导致蛋白质表达增加或蛋白质活性增加的修饰可以指蛋白质的扩增、过量产生、活化、增强、上调或作用增加。
硫氧还蛋白组合物的制备
由于硫氧还蛋白的结构稳定性和物理稳健性特征，主要的制剂开发目标是将储存的蛋白质维持在完全还原的活性形式。作为最初的方法，将使用DTT还原的蛋白质交换到PBS中，用氮气脱气以去除氧气，并在-80℃下以一次性等分试样冷冻，以避免连续的冻融循环。这种策略需要在储存和使用过程中非常小心，并且不是最佳的，因为即使在深度冷冻时蛋白质在水溶液中也会迅速氧化。基于在Syngenta Corp and Octoplus(制剂开发专家)进行的大量工作评估了其他制剂，这些工作利用糖类和化学赋形剂的各种复杂组合来稳定干燥储存制剂中的天然Trx的还原状态。仅发现这些制剂中的一种(9％蔗糖、1.7mM EDTA，pH5.2)在冻干后赋予硫氧还蛋白恰当的氧化还原稳定性，使得即使在40℃加速储存六个月期间也几乎完全保留了起始活性。然而，这种复杂的制剂引起了对吸入时潜在炎症的担忧，并且高浓度的蔗糖不利地增加了溶液粘度，并使得在药物递送所需的蛋白质浓度下在合适的缓冲液中等渗重构成为挑战。尽管进行了大量实验，但没有报道可以适当地将硫氧还蛋白维持在还原状态而不氧化、二聚化或多聚化的良性制剂。
本发明人突破性地认识到，使用挥发性溶剂例如20mM乙酸铵(pH 5.5)的制剂方法可以允许本发明的硫氧还蛋白的蛋白质或肽以还原形式冷冻并冻干，在此过程中溶剂将完全蒸发，在冻干物中仅留下纯蛋白质。令人惊讶地发现，这种相反的方法赋予还原的硫氧还蛋白甚至优于Syngenta的复合蔗糖制剂的有益的氧化还原稳定特性，但没有蔗糖和EDTA的促炎作用。此外，通过消除冻干物质中的残留赋形剂，可以将稳定的硫氧还蛋白重构至任何所需的缓冲液，而无需担心张力改变，从而使稳定的溶液浓度超过5-10mM。
本发明的另一个实施方案是制备用于储存和转运本发明的硫氧还蛋白的蛋白质和肽的组合物的方法。此类组合物可用于制备包含本发明的硫氧还蛋白的蛋白质和肽的药物组合物以施用于患者。特别地，本发明的硫氧还蛋白的蛋白质和肽可以在最少的制剂中以还原状态稳定地储存和转运，而无需复杂的稳定剂或其他制剂要求。因此，由此类组合物制备的重构的本发明硫氧还蛋白的蛋白质和肽可以存在于最小的裸制剂中，而无需复杂的制剂要求或不需要任何赋形剂。发明人发现了令人惊讶和出乎意料的结果，即该方法允许保留蛋白质和氧化还原稳定性，其与使用需要大量实验所获得的复杂的非挥发性赋形剂(包括例如WO2006/090127中所述的蔗糖-EDTA制剂)所获得的结果一样好或更好。
该方法包括提供一种组合物，其包含蛋白质或肽和水性溶剂，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点，所述水性溶剂具有至少约3mmHg的蒸气压。然后，所述方法包括使水性溶剂挥发以产生包含蛋白质或肽的干燥组合物。此类组合物和所得药物组合物基本上不含有污染物，例如稀释剂、溶剂、其他溶液或液体、缓冲液、盐、表面活性剂和其他化学品。此类组合物可以由蛋白质或肽组成或可以基本上由蛋白质或肽组成。此类组合物的基本和新特性包括以下特征中的一种或多种：蛋白质或肽的硫氧还蛋白活性位点是还原状态的、缺乏进行自发氧化的显著能力或缺乏进行自发二聚化的显著能力和/或者一旦在等渗盐水中重构，蛋白质或肽以还原形式具有活性(即，可以与靶标形成稳定的二硫键)。在单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白的情况下，其还能够共价结合靶蛋白二硫化物的Cys残基，这减弱了硫氧还蛋白以活性形式被细胞内摄取的能力。
如本文所用的术语“溶剂”是指本发明的蛋白质或肽悬浮和/或溶解于其中的液体或溶液，之后通过挥发(例如通过冻干)除去溶剂。如本文所用，术语“稀释剂”是指在通过挥发除去溶剂之后，本发明的蛋白质或肽重构于其中的液体或溶液。这种重构可以使得本发明的蛋白质或肽悬浮或溶解在稀释剂中。
通过将本发明的蛋白质或肽悬浮或溶解在溶剂中开始，实现通过该方法制备组合物以产生本发明的蛋白质或肽。溶剂可具有适于冻干硫氧还蛋白的蒸汽压，例如至少约3mmHg。蒸气压也可以是至少约1mmHg、2mmHg、3mmHg、4mmHg、5mmHg、6mmHg或7mmHg或至少约1mmHg至7mmHg之间的任何十进制数。在其他实施方案中，水性溶剂的蒸气压可以在由1mmHg至10mmHg之间的任何两个值限定的范围内。然后可以根据合适的方法进行挥发，例如通过标准方案进行冻干以产生处于还原状态的本发明的蛋白质或肽，其不包含溶剂或其他液体。这样所得的蛋白质或肽可以是基本上纯的(例如，至少约95、96、97、98、99、99.5、99.9％或100％纯)。
在一些实施方案中，水性溶剂可以选自乙酸铵、碳酸氢铵、甲酸铵、乙酸三乙铵和碳酸氢三乙铵。水性溶剂的浓度可以在约1mM和约50mM之间，或1mM和约50mM之间的任何整数范围，和/或具有约4至约7之间的pH，或约4至约7之间任何十进制数范围。在一些实施方案中，具有包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽和蒸气压为至少约3mmHg的水性溶剂的组合物不包含糖或糖衍生物，并且在一些实施方案中，所述组合物不包含任何除蛋白质或肽以外的、蒸气压小于约3mmHg的化合物。
根据该方法提供的本发明的溶剂和蛋白质或肽的混合物可以基本上仅由单一溶剂和本发明的蛋白质或肽组成。该混合物还可以由本发明的蛋白质或肽和共同满足该方法的蒸气压限制的多种溶剂(即混合溶剂)组成。该混合物还可以包含多于一种本发明的蛋白质或肽，例如多于一种本文公开的硫氧还蛋白的变体和/或其他蛋白质或肽。
或者，本发明的蛋白质或肽和溶剂的混合物可以基本上由本发明的蛋白质或肽和溶剂组成。此类实施方案的基本和新特征是混合物中除了本发明的蛋白质或肽以外的组分可以挥发，而本发明的蛋白质或肽以还原状态保留。以这种方式，本发明的蛋白质或肽可以稳定保存在还原状态，并被冻干成可稳定储存的状态，并且易于在还原状态下重构以用于药物和/或非药物用途。
冻干过程的一个重要方面是其可以产生稳定的还原状态的本发明的蛋白质或肽。如果用于冻干的起始物质是还原的硫氧还蛋白，则本文所述的方法可以将硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸保存在还原状态，并产生具有还原状态的活性位点半胱氨酸的基本上纯的硫氧还蛋白。此外，无论在硫氧还蛋白中是否存在其他半胱氨酸，硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸可以以还原状态保存。
然后，具有还原状态的活性位点半胱氨酸的本发明的基本上纯的蛋白质或肽适于储存，并且比通过其他方法制备的蛋白质组合物更易于在各种温度和各种持续时间下储存。例如，通过该方法制备的本发明的蛋白质或肽可以是稳定的(例如，具有还原状态的活性位点半胱氨酸)，例如具有大于约50％的活性、大于约60％的活性、大于约70％的活性、大于约80％的活性、大于约90％的活性或大于约95％的活性。此类活性水平可以实现至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约2周或至少约1个月。此外，所得组合物可在-80℃至40℃之间储存，并能够保持硫氧还蛋白还原活性。
通过该方法产生的组合物可以基本上不含盐，例如具有少于约0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5或10mM的盐。此外，冻干组合物的进一步的特征在于按重量计包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的本发明的蛋白质或肽。
然后可以重构如上制备的本发明的蛋白质或肽，用于各种用途，包括药物和非药物用途。可以通过将本发明的蛋白质或肽重悬或溶解在合适的稀释剂中来完成重构。例如，可以用无菌水、等渗盐水、高渗盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、其组合或适合于重构的其他稀释剂重构本发明的蛋白质或肽。在一些实施方案中，稀释剂适合施用于患者，例如人患者，但也包括其他动物，包括非人哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物和两栖动物。
或者，如上制备的本发明的蛋白质或肽可以不经重构而使用。例如，本发明的蛋白质或肽可以作为粉末或作为食品或片剂中的干燥组分施用。非重构的硫氧还蛋白的其他用途是可能的。
本文所述的制备方法可用于任何硫氧还蛋白变体、片段、活性位点、同源物或本文所述的硫氧还蛋白的其他形式。
本发明人开发的该方法和所得制剂利用挥发性溶剂，在冻干后产生纯的干燥蛋白质。该过程允许在组分，例如等渗缓冲盐水(PBS)中进行重构，从而大大简化了制剂和递送过程。值得注意的是，新的冻干蛋白具有类似于基于蔗糖的制剂的相当的氧化还原稳定性，同时消除了吸入蔗糖/EDTA的潜在炎症风险。这种新的制剂允许在最终冻干物质中消除所有赋形剂，有助于在简单的等渗盐水缓冲液中重构，以用于通过装置(例如，电子振动网状雾化器)进行递送。相较于含有蔗糖的吸入药物产品的潜在安全性和递送/效率的挑战，所得制剂作为不含盐/赋形剂的制剂，是简单的，并且具有令人信服的优势。初步的稳定性数据表明其可等同于或优于原始蔗糖制剂。
在进一步的实施方案中，本发明包括包含蛋白质或肽的组合物以及其制备方法，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物不包含在大于约400nm处具有紫外(UV)吸光度的硫氧还蛋白的蛋白质级分。已经令人惊讶地发现，在产生本发明的蛋白质之后，纯化具有硫氧还蛋白活性的蛋白质级分，包括去除在大于约400nm的光波长处具有吸光度的蛋白质级分，增加了组合物中肽或蛋白质的稳定性，所述组合物无论是干燥(冻干)形式还是已经重构的组合物，例如，由干燥形式重构的盐水缓冲液中的组合物。还发现此类肽或蛋白质组合物能够被干燥至较低的水含量，例如低于约5.0wt.％、4.0wt.％、3.0wt.％、或低于5.0wt.％至1.0wt.％之间任何约0.1wt.％的增量。
在一些实施方案中，组合物中剩余的肽或蛋白质级分在光波长小于约400nm、小于约390nm、小于约380nm、小于约370nm、小于约360nm、小于约350nm、小于约340nm、小于约330nm、小于约320nm、小于约310nm、小于约300nm、小于约290nm或小于约280nm处具有吸光度。
本发明实施方案包括的包含蛋白质或肽的组合物可以是如本文别处所述的各种形式，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物不包含在大于约400nm处具有吸光度的级分。例如，此类组合物可以是适合冻干的形式，其中包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽处于还原状态，并且其中该组合物还包含蒸气压为至少约3mmHg的水性溶剂。或者，此类组合物可以是如上所述的具有低水含量的干燥状态。此外，此类组合物可以重构，因此其适用于例如在基本上由包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽、水和氯化钠组成的组合物中施用。
其他实施方案包括制备包含蛋白质或肽的组合物的方法，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物不包括在大于约400nm处具有吸光度的级分。此类方法包括提供包含蛋白质或肽的裂解物，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点；浓缩组合物中的蛋白质或肽；以及去除在大于约400nm处具有吸光度的肽或蛋白质级分。例如但不限于，本发明的蛋白质可以通过重组生产在宿主细胞中产生。细胞可以被裂解和澄清。得到的澄清组合物可以进行进一步的纯化，例如离子交换色谱法。已经发现，通过离子交换色谱步骤，不能将在大于约400nm处具有吸光度的级分从剩余的具有硫氧还蛋白活性、且在小于约400nm的波长处(例如在约280nm处)具有吸光度的主要蛋白质级分分离。然而，对该级分进行疏水相互作用色谱法导致主要蛋白质级分从在大于约400nm处具有吸光度的级分分离。所得主要蛋白质级分具有上述有益特性，即干燥时含水量较低且稳定性提高(例如通过游离SH基团和单体百分比测量)。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含蛋白质或肽溶液，所述蛋白质或肽含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点。在一个实施方案中，除了硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点中的单个半胱氨酸残基以外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。此类药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在各种实施方案中，赋形剂可以选自乙酸铵缓冲液、甲酸、含铵的乙酸、不含铵的乙酸及其组合。
在一些实施方案中，硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点包含选自以下的氨基酸序列：C-X-X-S(SEQ ID NO:24),C-X-X-X(SEQ ID NO:17),X-C-X-X-X-X(SEQ ID NO:19),X-C-G-P-X-X(SEQ ID NO:21),W-C-G-P-X-K(SEQ ID NO:23),X-C-X-X-S-X(SEQ ID NO:25),X-C-G-P-S-X(SEQ ID NO:26)和W-C-G-P-S-K(SEQ ID NO:27),其中X残基是半胱氨酸以外的任何氨基酸残基。在其他实施方案中，蛋白质或肽包含SEQ ID NO：1的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点序列。在进一步的实施方案中，蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO:28的序列和与SEQ ID NO:28具有至少约80％同一性的序列，其中硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点位于对应于SEQ ID NO：28的位置32-35的位置。在进一步的实施方案中，蛋白质或肽包含选自SEQID NO:29的序列和与SEQ ID NO:29具有至少约80％同一性的序列，其中硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点位于对应于SEQ ID NO：29的位置32-35的位置。
此类药物组合物可以配制用于通过选择的以下途径施用给患者：口、直肠、鼻、气管内、支气管、直接设置到肺、吸入、口、局部和眼。
施用
此外，包括本发明的药物组合物的组合物可以在药学上可接受的载体中施用于患者。如本文所用，药学上可接受的载体是指适用于将在本发明的方法中使用的治疗性蛋白质、核酸或其他化合物递送至合适的体内或体外部位的任何物质。优选的药学上可接受的载体能够维持蛋白质、核酸分子或化合物的形式，使得当所述蛋白质、核酸分子或化合物到达所需部位时(例如，分泌或排出待治疗的粘液或痰的部位)，能够接触粘液或痰(在蛋白质或化合物的情况下)或进入细胞并被细胞表达并被分泌(在核酸分子的情况下)，使得表达的还原状态的蛋白质能够接触粘液或痰。
向患者施用的如本文公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的合适或有效的量能够：通过其活性位点硫醇可逆地氧化成二硫化物参与氧化还原反应、催化硫醇-二硫化物交换反应、特别是降低粘液或痰的粘弹性或粘性和/或增加患者中粘液或痰的液化，足以为患者提供治疗益处。可以如本文先前所述或通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测量、检测或测定粘液或痰的粘弹性或粘性的降低或液化的增加。如上所述，此类测量包括测定和比较与合适或有效量的含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽接触之前和之后，来自患者的粘液或痰样品中游离硫醇的百分比，以及测定和比较与合适或有效量的含有还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽接触之前和之后，患者的FEV水平。
除了降低粘液或痰的粘弹性外，如本文所公开的具有还原状态的硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽还具有治疗用途，例如治疗炎症、高血压、氧化应激或感染，其中通过吸入、直接应用、滴注或口服施用进行局部施用硫氧还蛋白的蛋白质或肽；或者，可选地，通过输注、注射或其他适合全身性细胞外治疗的施用途径施用。
用于测定配制在药学上可接受的溶液中的还原状态硫氧还蛋白的活性的方法包括通过测定法测定硫氧还蛋白中半胱氨酸的氧化还原状态，所述测定法例如荧光测定法和/或比色测定法，例如DTNB测定法(使用5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)。一方面，硫氧还蛋白包含单个半胱氨酸氨基酸。在一方面，通过荧光测定法和/或比色测定法(例如DTNB测定法)测定硫氧还蛋白活性位点中N-末端半胱氨酸的氧化还原状态。
在一个实施方案中，施用给患者的如本文公开的包含硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的合适或有效量包括约10μmoles/kg,15μmoles/kg,20μmoles/kg,25μmoles/kg,30μmoles/kg,35μmoles/kg,40μmoles/kg,45μmoles/kg,50μmoles/kg,55μmoles/kg,60μmoles/kg,65μmoles/kg,70μmoles/kg,75μmoles/kg,80μmoles/kg,85μmoles/kg,90μmoles/kg,95μmoles/kg,100μmoles/kg,105μmoles/kg,110μmoles/kg,115μmoles/kg,120μmoles/kg,125μmoles/kg,130μmoles/kg,135μmoles/kg,140μmoles/kg,145μmoles/kg,150μmoles/kg,175μmoles/kg,200μmoles/kg,225μmoles/kg,250μmoles/kg,275μmoles/kg,300μmoles/kg,325μmoles/kg,350μmoles/kg,375μmoles/kg,400μmoles/kg,425μmoles/kg,450μmoles/kg,475μmoles/kg,500μmoles/kg,525μmoles/kg,550μmoles/kg,575μmoles/kg,600μmoles/kg,625μmoles/kg,650μmoles/kg,675μmoles/kg,700μmoles/kg,725μmoles/kg,750μmoles/kg,775μmoles/kg,800μmoles/kg,825μmoles/kg,850μmoles/kg,875μmoles/kg,900μmoles/kg,925μmoles/kg,950μmoles/kg,975μmoles/kg,1000μmoles/kg,1100μmoles/kg,1200μmoles/kg,1300μmoles/kg,1400μmoles/kg,1500μmoles/kg,1600μmoles/kg,1700μmoles/kg,1800μmoles/kg,1900μmoles/kg,2000μmoles/kg,2100μmoles/kg,2200μmoles/kg,2300μmoles/kg,2400μmoles/kg，或约2500μmoles/kg患者体重。
在另一个实施方案中，如果递送途径是向肺的气溶胶递送或类似途径，则施用给患者的如本文公开的包含硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的量包括约0.25mg/剂量单位(例如，用于人的剂量单位通常为约2-3ml)至约100mg/剂量单位，使得在靶部位达到至少100uM的有效浓度。优选地，施用给患者的如本文公开的包含硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的量包括约0.25mg,0.50mg,1.0mg,5.0mg,10mg,15mg,20mg,25mg,30mg,35mg,40mg,45mg,50mg,55mg,60mg,65mg,70mg,75mg,80mg,85mg,90mg,95mg或约100mg每剂量单位。取决于用于气溶胶递送的装置，一些气溶胶递送装置仅允许将气溶胶中大约10％的体积实际递送到肺。然而，当递送装置是振动网状雾化器时，可以递送约90％的气溶胶体积。电子振动网状雾化器能够更快地递送药物，并且是更小、更便携的设备，深受CF患者的喜爱(Geller,D.E.,Pediatric Pulmonology,43(S9):S5-S17,2008)。与喷气式雾化器相比，振动网状雾化器在以更少的残留剂量递送药物方面也更有效。这对于降低治疗成本特别重要，因为为获得治疗益处需要更小的剂量。诸如此类的装置也不会导致蛋白质的生物活性降低(Kesser,K.C.等人Resp Care,54(6):754-768,2009；Scherer,T.等人J Pharm Sci,100(1):98-109,2011)。因此，对于其他施用途径，当递送至该部位的组合物的体积较大时，将容易看出可以使用较低剂量的包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽。
施用于动物的本发明蛋白质的最佳量将根据施用途径而变化。例如，如果通过吸入(气溶胶)途径施用蛋白质，则待施用的最佳量可能不同于通过气管内微喷雾施用的最佳量。根据此类施用途径改变量在本领域技术人员的能力范围内。重要的是要注意本发明的蛋白质的合适量是具有所需功能而不对动物有毒的量。其他施用途径包括但不限于口服施用，特别是用于治疗消化道粘液，或用于治疗生殖道粘液的局部施用。
在本发明的一个实施方案中，进一步配制如本文公开的包含硫氧还蛋白(所述硫氧还蛋白含有硫氧还蛋白活性位点)的本发明的组合物(包括药物组合物)，用于与一种或多种试剂一起递送，所述试剂维持硫氧还蛋白活性位点的在使用还原剂进行初始还原后的还原状态。用于本发明的此类还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、硫辛酸、NADH或NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、还原型谷胱甘肽、二硫代乙醇酸、2-巯基乙醇、Tris-(2-羧乙基)膦、N-乙酰半胱氨酸、NADPH、NADH等生物或化学还原剂。如本文所述，令人惊讶地发现对于还原的硫氧还蛋白，优选的冻干储存制剂不需要任何制剂赋形剂，尽管对于某些粘膜或上皮靶标，特定的递送制剂可能有益。
治疗方面
与天然或野生型硫氧还蛋白相比，本文公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽有一些优点和益处。设计用除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基取代C-末端半胱氨酸的活性位点修饰、以及硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基的缺失和/或用除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基的取代或其组合，旨在最大限度地减少与细胞内信号传导或全身暴露相关的硫氧还蛋白的潜在副作用，例如Rancourt等人(Free Radical Biol&Med 42:1441-43,2007)中描述的那些。这些修饰防止对由N-末端硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸(例如，位于人硫氧还蛋白位置32，SEQ ID NO：12)催化的硫氧还蛋白和靶蛋白二硫化物之间形成的混合二硫化物的亲核攻击。
令人惊讶的是，本发明人已经确定此类硫氧还蛋白比野生型硫氧还蛋白具有更大的降低(趋于液化)患病人粘液的粘弹性并使其正常化的效力。本发明人发现，含有单硫醇活性位点以及硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基缺失和/或被除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基取代和/或其组合的硫氧还蛋白，与野生型硫氧还蛋白相比不仅没有显示出活性受损，而且其在流变学测定法中在降低人CF粘液粘度方面表现出更大的稳定性和定量能力，尤其是与在位置62、69和73上仍然保留三个非活性位点Cys残基的硫氧还蛋白相比。
气道粘液阻塞可引起CF患者显著的发病率和死亡率。本发明人已经证明，通过本文公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽显著降低促进这些分泌物在气道内持久存在的粘弹特性，并且在大鼠中给药甚至高达40mg/kg也不会引起副作用。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种使具有过度粘稠或粘着的粘液或痰的患者中粘液或痰的粘弹性正常化或降低的方法。所述方法包括使患者的粘液或痰与包含硫氧还蛋白的蛋白质或肽的组合物接触的步骤，所述蛋白质或肽具有还原状态的硫氧还蛋白活性位点，与接触步骤之前相比，所述组合物有效降低粘液或痰的粘弹性，其中所述硫氧还蛋白的蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基的缺失和/或用除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基的取代和/或其组合，并且优选当所有非活性位点半胱氨酸被修饰为其他非半胱氨酸氨基酸时。
根据本发明，术语“粘液”通常是指由身体各种组织(包括呼吸道、胃肠道和生殖道)中的粘膜分泌的通常为透明的粘性液体。粘液润湿、润滑并保护分泌其的组织。粘液包含粘蛋白大分子(包括粘液蛋白、核酸和碳水化合物)，其是粘液的凝胶形成组分。粘液蛋白包括但不限于呼吸道粘液蛋白、消化道粘液蛋白、生殖道粘液蛋白和眼粘液蛋白。正常粘液的粘弹特性取决于粘蛋白聚合物之间的浓度、分子量和缠结程度。术语“痰”通常是指唾液和从呼吸道排出物的混合物，包括粘液。痰通常是唾液和粘液(以及来自呼吸道组织的其他分泌物)的咳出混合物。因此，粘液是痰的主要组分，因此，过度粘弹性粘液的存在导致痰本身具有过度粘弹性。本发明涉及降低异常粘弹性的粘液或痰的粘度和/或硬度(stiffness)。
术语“液化”是指变得更加液态的行为。因此，粘液或痰的液化增加是指与更加固相或粘稠相相比，粘液或痰的液相或液态增加。在与疾病相关的异常粘稠或过度的粘液的情况下，目标是恢复粘液粘度的正常水平。因此，液化(或“正常化”)也可以被认为是粘液粘度的降低。过度液化本身是有害的，因此特别希望液化剂天然地限制其活性，从而使粘液正常化而不是完全液化。
可以理解，通过生物还原剂与可氧化半胱氨酸的适当比例实现正常的粘液功能。因此，过量的氧化半胱氨酸或缺乏生物还原剂引起生物还原剂活性的缺乏。因此，当氧化应激增加和/或粘液水平升高或天然还原剂活性水平降低时，恢复生物还原活性的适当水平是确保氧化(二硫键形成)和还原(二硫键断裂)之间正确平衡的一种手段。
粘液和痰在体内的一般功能要求粘液(以及痰的粘液组分)具有粘弹特性。在具有正常粘液和痰的个体(即健康个体，或更具体地，没有遭受由粘液或痰的粘度或粘性引起或加剧的症状或病症的个体)中，粘弹性取决于粘蛋白聚合物之间的浓度、分子量和缠结度(Verdugo等人,Biorheology 20:223-230,1983)。尤其是在CF中，当粘液中的粘蛋白与死亡的炎性细胞释放的DNA和f-肌动蛋白聚合物相互作用时，粘液(以及痰)会变得更加致密和粘稠。不能通过咳嗽或粘膜纤毛清除来清除异常、增稠的粘液，这促进了机会性病原体在肺的定植。
因此，异常或过度粘稠和/或粘性的粘液的特征在于比来自正常或健康患者(优选年龄和性别匹配的患者)的粘液可测量地或可检测地更粘稠或粘性的粘液，和/或，由于其粘度和/或粘性水平，在患者中引起或促成至少一种引起患者不适或疼痛的症状、或引起或加重病症或疾病的粘液。换言之，异常或过度粘稠和/或粘性的痰是与正常粘液或痰偏离的，其中需要治疗患者以提供对病症的一些缓解或其他治疗益处。在气道表面的情况下，异常粘液可以是流动的分泌粘液，或在胃肠道、颊和鼻咽腔、生殖道或眼中，异常粘液可以是静态的分泌粘液。
本发明的方法和组合物可用于治疗希望降低粘液或痰的粘弹性的任何患者，以及用于治疗炎症、高血压、纤维化、氧化应激或感染，并且更优选其中硫氧还蛋白的蛋白质或肽通过输注或注射施用。患有某些肺、鼻窦、鼻、眼、消化道或胃肠道或生殖道疾病或病症的患者可以受益于使用本发明的方法和组合物的治疗。
本发明对于改善或减轻由粘液或痰的异常或过度粘弹性和/或粘性引起或加剧的病症或疾病的至少一种症状最有用，其当然可以包括肺相关疾病，例如囊性纤维化，以及消化道疾病，如球虫病或炎性肠疾病，其中异常粘弹性的粘液可与炎症和对病原体的反应受损相结合。
至少在某些时候，其他疾病可与粘液或痰的异常或过度粘弹性和/或粘性相关，当出现此类症状时，本发明的方法可用于降低粘液或痰的粘弹性，并为患者提供至少一些缓解或治疗益处。此类疾病的示例包括但不限于：囊性纤维化；慢性或急性支气管炎；支气管扩张(非CF和CF支气管扩张)；COPD/肺气肿；急性气管炎(细菌、病毒、支原体或由其他生物引起)；急性或慢性鼻窦炎；由气道急性或慢性粘液堵塞引起的肺不张(肺或肺叶塌陷)(有时见于多种疾病，如哮喘，包括哮喘持续状态)；细支气管炎(病毒或其他)；由粘液浓缩引起的急性、亚急性或慢性肠梗阻，包括但不限于CF或类似疾病中的胎粪性肠梗阻或胎粪性肠梗阻等同物；由于(但不限于)子宫颈、输精管或其他重要生殖结构的阻塞而导致的其他消化道疾病和不孕症，以及干眼症，其中异常增稠的粘液分泌促进炎症的恶性循环和进一步的异常分泌。此外，由于改善的粘膜纤毛清除与从肺中清除细菌和其他病原体相关，本发明的组合物和方法可用于减轻患有各种呼吸道感染，包括病毒和细菌感染的患者中与粘液或痰的过度粘弹性和/或粘性相关的症状。
硫氧还蛋白在调节失控的炎性反应和急性肺损伤中具有作用。细胞外硫氧还蛋白广泛作用于降低经历持续炎症过程的动物的炎症。这已在COPD的小鼠模型中观察到，其中硫氧还蛋白抑制中性粒细胞炎症，并且在甲型流感病毒感染诱导的急性肺损伤模型中观察到，其中硫氧还蛋白的外源递送或转基因过表达预防小鼠的病毒性肺炎。发现硫氧还蛋白抑制小鼠体内灌洗液和肺组织中以及体外鼠肺上皮细胞中的促炎介质TNF-a和CXCL1的诱导。在小鼠中，硫氧还蛋白抑制脂多糖诱导的中性粒细胞趋化性和LPS诱导的IL-1b在人巨噬细胞中的表达。已经提出硫氧还蛋白的抗炎和免疫调节作用涉及控制细胞因子介质释放、抑制细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达和抑制炎性体的活性。重要的是，硫氧还蛋白还保护气道AT2干细胞免受炎症损伤。这些作用很可能通过变构控制机制以及对炎性靶标的直接活性发挥作用。然而，发现快速清除和较差的药理学是外源性天然硫氧还蛋白治疗用途的显著功能限制。此外，细胞核中高浓度的硫氧还蛋白可自相矛盾地导致响应刺激而释放促炎细胞因子。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种治疗肺炎症、失控的炎性反应和急性肺损伤例如与病毒性呼吸道疾病相关的那些的方法。此类方法包括向患有或处于发生此类病症和/或病毒性呼吸道疾病风险的受试者施用包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。具有单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽可以是本文所述的任何吸入、局部抗炎和粘液正常化的治疗剂。与天然硫氧还蛋白相比，此类治疗组合物被认为提供了活性的划分，以防止细胞内/细胞核还原应激并改善药代动力学。
在这个实施方案中，肺炎症、失控的炎性反应和急性肺损伤可与病毒性呼吸道疾病相关，所述病毒性呼吸道疾病是一种由病毒引起并影响呼吸道的疾病。此类病毒性呼吸道疾病可包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-19或COVID-19)、流感、与哮喘、肺炎、支气管炎、肺结核、反应性气道疾病综合征和间质性肺病相关的病毒感染。所涉及的病毒可导致一种或多种病毒性呼吸道疾病，包括冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和呼吸道腺病毒。
新出现的证据强烈暗示感染呼吸道上皮细胞的SARS-CoV-2引发了一系列可导致严重COVID-19疾病的事件。在这些受严重影响的个体中，感染后气道细胞因子释放的失调可导致细胞因子释放综合征(CRS)，其中免疫系统的高反应性引发对感染的失控反应，造成比病原体本身更大的损害。肺泡上皮II型(AT2)细胞、成人肺的干细胞以及产生气道表面活性剂的细胞通过分泌细胞因子来募集信号而对病原体和肺泡损伤反应，并启动巨噬细胞的活化以保护肺泡。当这种反应变得异常活化时，其会导致CRS，在受严重影响的患者中会变成全身性的，导致强大的、致命的病理。然而，由于病毒感染的直接细胞毒性作用导致AT2细胞的损失也可导致呼吸道功能受损，因为死亡细胞的积累阻止有效的粘膜纤毛清除并增强肺液潴留和肺炎，从而导致炎性反应增加的恶性循环。
ARDS是COVID-19和严重流感最可怕的并发症之一，与肺广泛的炎症相关。ARDS的潜在机制涉及对形成肺微观气囊(肺泡)屏障的细胞的弥漫性损伤，表面活性剂功能障碍和免疫系统的激活。与ARDS相关的肺积液的部分原因是炎症引起的血管渗漏。由感染引发的ARDS的一个重要方面是肺上皮细胞和内皮细胞分泌的化学信号和其他炎性介质的初始释放。中性粒细胞和一些T淋巴细胞迁移到发炎的肺组织中并导致ARDS的放大/恶化。炎症脂质介质(前列腺素)产生的减少可能会损害与ARDS相关的炎症消退(Fukunaga,等人,Cyclooxygenase 2Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute LungInjury.Journal of Immunology 2005；174:5033-5039.；Gao等人J Immunol 2017；199:2043-2054)。
可使用本发明方法的其他疾病或病症是用于治疗炎症、高血压、氧化应激、感染或纤维化。因此，在一些实施方案中，本发明包括治疗受试者的细菌或其他感染的方法。在该实施方案中，所述方法可以包括配制用于通过选自以下途径施用于患者的组合物：口、直肠、鼻、吸入、气管内、支气管、直接设置、局部和眼，包括眼注射。在用于治疗感染的一些实施方案中，组合物可以是纯化的药物组合物、营养制品或表达蛋白质或肽的微生物细胞的粗提物或纯化提取物。例如，此类提取物可用于动物饲料组合物的用途中。在一些实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包含可操作以活化抗微生物肽的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中所述活化产生治疗有效的试剂以治疗或预防感染性疾病。这种抗微生物肽可以是防御素。
本发明的其他实施方案包括调节受试者的微生物组组成的方法，包括向受试者的粘膜表面局部施用包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。此类粘膜表面可以是肺表面、鼻咽表面或胃肠表面。在此类实施方案中，微生物组的调节可以通过本发明的蛋白质或肽激活一种或多种抗微生物肽来实现。
治疗益处不一定是对特定疾病或病症的治愈，而是优选地包括以下结果：最典型地包括疾病或病症的缓解、疾病或病症的消除、与疾病或病症相关的症状的减轻或消除、由原发疾病或病症的发生引起的继发疾病或病症(例如，由利用呼吸道中过度粘稠的粘液的机会性病原微生物引起的感染性疾病)的预防或减轻、和/或预防潜在的疾病或病症或与该疾病或病症相关的症状。
如本文所用，短语“免受疾病侵害”是指减轻疾病的症状；姑息治疗(缓解或减轻疾病的症状而没有实现治愈)；减少疾病的发生，和/或降低疾病的严重性或减轻疾病的至少一种症状、体征或疾病或病症的原因。预防是指本发明的组合物在施用于患者时预防疾病发生的能力。治愈(或疾病改善)是指本发明的组合物在施用于患者时治愈疾病的能力。保护患者免受疾病侵害包括治疗患有疾病的患者(治疗性治疗)。预防疾病/病症包括预防疾病的发生(预防性治疗)。特别地，通过以下实现保护患者免受疾病侵害(或预防疾病)：使粘液或痰与本文公开的包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白接触，增加患者中异常粘稠的粘液或痰的液化(使其正常化)。有益效果可以由本领域普通技术人员和/或正在治疗患者的受过训练的临床医生容易地评估。
术语“疾病”是指患者从正常健康状况的任何偏离，包括出现疾病症状时的状态，以及发生偏离(例如感染、基因突变、遗传缺陷等)的状况，但症状尚未显现。
患者的粘液和/或痰与如本文所公开的还原状态的硫氧还蛋白的蛋白质或肽(或包含此类蛋白质的组合物)接触旨在导致与组合物接触之前相比，粘液或痰的粘弹性降低/液化增加。根据本发明，粘液或痰的正常化可以是与之前的液化水平相比，任何可测量或可检测的粘液或痰的液化水平的增加，并且优选地是统计学上显著的增加(即，患者样本和基线对照之间测量的液化水平的差异具有统计学上的显著性，置信度至少p<0.05)。
通常，“基线对照”是施用治疗前的患者样品，因为正常、健康的个体通常不能产生足以用作对照的痰量，尽管不排除来自正常、健康个体的痰作为基线对照。此外，粘度的降低导致肺功能的改善。这种改善可以通过多种方法确定，包括患者报告的结果、恶化到入院的平均时间和/或用力呼气量(FEV)的增加。
在本发明的一方面，FEV的增加被描述为，与来自与本发明的组合物或蛋白质接触之前的患者的样品相比，增加至少约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约7.5％、约8.0％、约8.5％、约9.0％、和约9.5％和约10％。优选地，与来自与本发明的组合物或蛋白质接触之前的患者的样品相比，本发明的蛋白质或组合物与患者样品的粘液或痰的接触导致约2.5％的增加。
可以使用本领域已知的任何合适的技术测量粘液或痰的液化和/或粘弹性的降低，包括但不限于如实施例部分所述的压实测定法。在此类测定法中，测量固相(凝胶)与水相(液体)中的粘液或痰的量。
在本发明的其他方面，粘液或痰的相对粘度或粘性可以使用其他参数或指标来测量，包括但不限于粘弹性(例如，通过流变仪或磁微流变仪测量)、糖蛋白含量或DNA含量。在本发明的另一个方面，可以通过使用试剂如NEM(N-乙基马来酰亚胺)估计粘液蛋白二硫键的变化，所述试剂优先与通过使二硫键断裂产生的未结合(游离)的Cys残基硫醇基团反应(Rancourt,R.等人,Free Radic Biol Med,42(9):1441-1453,2007)。
在本发明的一方面，液化水平被描述为处于水(液体)相中的给定粘液或痰样品的量占粘液或痰样品总体积的百分比。例如，在患有囊性纤维化的患者中，粘液或痰的液化水平可低至低于总体积的10％甚至低于5％。优选地，本发明的蛋白质或组合物与粘液或痰的接触导致粘液或痰的液化改变，使得总体积的至少约15％为液相，更优选地，总体积的至少约20％为液相，更优选地，总体积的至少约25％为液相，更优选地，总体积的至少约30％为液相，并且更优选地，总体积的至少约35％为液相，更优选地，总体积的至少约40％为液相，更优选地，总体积的至少约45％为液体相，更优选地，总体积的至少约50％为液相，或直到由粘液引起的阻断或功能抑制已经清除(例如，直到患者气道被充分清除以开始咳出液体)。通常不希望增加超过80或90％，因为导致粘蛋白解聚的完全液化破坏了通过纤毛作用转运粘液所需的有益粘弹性。粘液或痰的过度液化也可能对患者有害(例如，液化的痰可能会倒流并用稀薄的液体涌入小气道，这也可能在患者清除痰之前被感染)。在这方面，靶标选择性天然还原剂如硫氧还蛋白是非常优选的，因为它们偏好高度结构化的二硫键(例如，如Passam,F.J.,和Chiu,J.,Allosteric disulphide bonds as reversible mechano-sensitive switches that control protein functions in the vasculature,BiophysRev 11,419-430,2019中所述)而不是平面二硫化物，后者形成了对产生粘液的聚合结构至关重要的分子间键。小分子还原剂缺乏靶标偏好，因此会因过度液化而产生不利影响。在一些实施方案中，本发明的蛋白质或组合物与粘液或痰的接触导致粘液或痰液化的变化，使得总体积的约15％至约90％为液相，或15％至90％之间的任何整数范围。
一般而言，因此优选痰或粘液的液化以小的、逐渐的增量增加，直到气道或其他阻塞通道(例如，在胃肠道或生殖道)被清除，但不会过度液化痰。优选地，与治疗前相比，本发明的蛋白质、肽或组合物与粘液或痰的接触使粘液或痰的液化体积比以1％的增量增加至少约1％，更优选地，增加至少约2％，等等，直到患者气道或其他堵塞的通道被清除。一旦实现了这种清除，例如通过去除所谓的“粘液塞”以改善药物进入小气道和肺泡的通道，则可以进行低剂量的维持治疗，以将新分泌的粘蛋白维持在二硫键的正常状态。与非选择性还原剂相比，硫氧还蛋白，特别是结合靶标的单硫醇硫氧还蛋白，产生过度液化的可能性要小得多，从而大大增加了有效剂量和毒性剂量之间的治疗窗口。
一方面，该治疗与从患者的受影响组织(呼吸道、消化道、生殖道)中清除变薄物质的方法结合进行。例如，在呼吸系统的情况下，可以将本发明的方法与体位引流法、呼气咳嗽法和其他呼吸练习或任何其他用于咳出液化的粘液或痰的合适方法结合使用。
根据本发明，待治疗患者的粘液或痰与本文公开的硫氧还蛋白蛋白(或包含该蛋白质的组合物)接触，所述硫氧还蛋白蛋白含有硫氧还蛋白活性位点以外的一个或多个半胱氨酸残基被除半胱氨酸以外的任何氨基的取代。与接触步骤之前相比，该蛋白质有效降低痰或粘液的粘弹性和粘性和/或增加痰或粘液的液化。如前所述，硫氧还蛋白是一种蛋白质二硫键还原酶，存在于大多数生物体中，参与许多硫醇依赖性细胞还原过程。在人中，硫氧还蛋白也被称为成人T细胞白血病衍生因子(ADF)。在细胞内，大多数这种普遍存在的低分子量(11,700)蛋白质保持还原。还原或氧化的硫氧还蛋白可进入完整细胞或吸收到细胞膜，其中少量随着时间逐渐内化。天然硫氧还蛋白在活性位点具有两个邻近的半胱氨酸残基，在氧化蛋白质中形成二硫键桥，位于蛋白质三维结构的突出部分。黄素蛋白硫氧还蛋白还原酶催化这种二硫化物的NADPH依赖性还原。此外，如美国专利7,071,307中所述，为改变辅因子特异性而修饰的硫氧还蛋白还原酶的工程化形式可以利用NADH替代或补充NADPH，该专利通过引用并入本文。硫氧还蛋白的小幅增加会导致蛋白质中巯基-二硫化物氧化还原状态的极大变化。氧化的硫氧还蛋白，尤其是分泌形式，也可以通过谷胱甘肽与分泌酶谷氧还蛋白的作用还原(Du,Y.,Zhang,H.,Lu,J.和Holmgren,A.,Glutathione andglutaredoxin act as a backup of human thioredoxin reductase 1to reducethioredoxin 1preventing cell death by aurothioglucose,Journal of BiologicalChemistry 287,38210-38219,2012)。气道中GSH和谷氧还蛋白丰富。
除了影响细胞蛋白质还原的能力外，人们认识到硫氧还蛋白可以直接充当抗氧化剂(例如，通过清除活性氧类来防止可氧化底物的氧化)以及激活过氧化物酶，尽管与其他硫醇不同，硫氧还蛋白通常不通过自氧化促进细胞中的氧化应激(例如通过自氧化产生超氧自由基)。White等人(同上)的美国专利号5,985,261表明硫氧还蛋白直接诱导MnSOD的产生，并且此类诱导受还原状态的硫氧还蛋白的影响。
进一步的治疗变体
在一个实施方案中，本文所公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽可以是药物设计或选择的产物，并且可以使用本领域已知的各种方法生产。此类蛋白质或肽可称为模拟物。模拟物是指能够模拟天然存在的肽的生物作用的任何肽或非肽化合物，通常是因为模拟物具有的基本结构模拟天然存在的肽的基本结构和/或模拟物具有天然存在的肽的显著生物学特性。模拟物可以包括但不限于：对原型进行实质性修饰的肽，例如与天然存在的肽不具有侧链相似性(例如，此类修饰可降低其对降解的敏感性)；抗独特型和/或催化抗体，或其片段；分离蛋白质的非蛋白质部分(例如,碳水化合物结构)；或合成或天然的有机分子，例如包括通过组合化学鉴定的核酸和药物。
可以使用本领域已知的多种方法来设计、选择和/或以其他方式鉴定此类模拟物。Maulik等人,1997,Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications andStrategies,Wiley-Liss,Inc.中公开了可用于本发明中的药物设计、用于设计或选择模拟物或其他治疗化合物的各种方法，其通过引用整体并入本文。Bachnoff等人,Free RadicalBiol Med 50:1355-67(2011)描述了具有强的和选择性氧化还原活性的硫氧还蛋白模拟肽，其通过引用整体并入本文。例如，可以从分子多样性策略(允许快速构建大的化学多样性分子文库的相关策略的组合)、天然或合成化合物的文库获得模拟物，特别是从化学或组合文库(即序列或大小不同但具有相似结构模块的化合物文库)或通过合理的、定向的或随机的药物设计获得模拟物。例如，参见Maulik等人，同上。
在分子多样性策略中，例如，使用生物、酶和/或化学方法从肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成的有机分子合成大型化合物文库。开发分子多样性策略的关键参数包括亚基多样性、分子大小和文库多样性。筛选此类文库的总体目标是利用组合选择的顺序应用来获得所需靶标的高亲和力配体，然后通过随机或定向设计策略优化先导分子。Maulik等人(同上)详细描述了分子多样性的方法。
Maulik等人也公开了，例如，直接设计方法，其中用户从适当选择的片段的片段文库指导创建新的分子；随机设计方法，其中用户使用遗传或其他算法随机突变片段及其组合，同时应用选择标准来评估候选配体的适合度；以及基于网格的方法，其中用户计算三维受体结构和小片段探针之间的相互作用能量，然后将有利的探针位点连在一起。
如前所述的多样性创建方法可以与旨在改善功能或药理学的其他技术相结合，特别是对于像活性位点模拟物这样的大小减小的分子。例如，在早期研究中显示出前景的一种方法是碳氢化合物订合(hydrocarbon-stapled)的α-螺旋肽，这是一类新型合成小蛋白，通过位点特异性地引入化学支撑，将其锁定在其生物活性α-螺旋折叠中，所述化学支撑是一种全碳氢化合物订合。订合可以大大提高肽的药理性能，增加其靶标亲和力和蛋白水解抗性，同时创建适合化学合成的较大蛋白质/酶的较小肽版本(Verdine,G.L.和Hilinsky,G.J.,Methods Enzymol,503:3-33,2012)。
在本发明的一个实施方案中，适用于本发明用途的硫氧还蛋白具有氨基酸序列，其包含、基本上由或由以下组成：具有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的全长序列或其任何片段，如本文所述。例如，如本文所述，包含硫氧还蛋白活性位点的SEQ ID NO：4-15的任何一种天然序列或其片段或其他同源物都包括在本发明中。此类同源物可以包括具有与全长硫氧还蛋白的氨基酸序列至少约10％相同、或与全长硫氧还蛋白的氨基酸序列至少20％相同、或至少30％相同、或至少40％相同、或至少50％相同、或至少60％相同、或至少70％相同、或至少80％相同、或至少90％相同、或大于95％相同的氨基酸序列的蛋白质，包括10％至100％之间的任何整数百分比(10％,11％,12％,...98％,99％,100％)。
如本文所用，除非另有说明，提及百分比(％)同一性是指使用以下方法进行的同源性评估：(1)BLAST 2.0Basic BLAST同源性搜索，其使用blastp进行氨基酸搜索，使用blastn进行核酸搜索，使用标准默认参数，其中查询序列默认过滤低复杂性区域(在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,
Figure BDA0003829764700000351
A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein databasesearch programs.”Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述，通过引用整体并入本文)；(2)BLAST2比对(使用下述参数)；(3)和/或PSI-BLAST，其具有标准默认参数(Position-Specific Iterated BLAST)。值得注意的是，由于BLAST 2.0Basic BLAST和BLAST 2之间的标准参数存在一些差异，使用BLAST 2程序可能会将两个特定序列鉴定为具有显著同源性，而在BLAST 2.0Basic BLAST中使用其中一个序列作为查询序列进行搜索，可能无法在顶部匹配中鉴定第二个序列。此外，PSI-BLAST提供了一个自动化的、易于使用的“档案”搜索版本，这是一种寻找序列同源物的敏感方法。该程序首先执行空位BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使用返回的任何重要比对的信息来构建位置特异的评分矩阵，将查询序列替换为数据库搜索的下一轮。因此，应该理解百分比同一性可以通过使用这些程序中的任一个来确定。
可以使用BLAST 2序列将两个特定序列相互比对，如Tatusova和Madden,(1999),"Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250所述，通过引用将其全部并入本文。使用BLAST 2.0算法在blastp或blastn中进行BLAST 2序列比对，以进行两个序列之间的空位BLAST搜索(BLAST 2.0)，允许在所得比对中引入空位(缺失和插入)。本文为清楚起见，使用如下的标准默认参数进行BLAST 2序列比对。
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：
匹配的奖励＝1
不匹配的罚分＝-2
开放空位(5)和延伸空位(2)罚分
空位x_下降(50)预计(10)字长(11)过滤器(开启)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：
开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
空位x_下降(50)预计(10)字长(3)过滤器(开启)。
可用于本发明的蛋白质还可以包括具有氨基酸序列的硫氧还蛋白，所述氨基酸序列包含含有活性位点的任何全长硫氧还蛋白的至少10个连续氨基酸残基(由SEQ ID NO：4-15表示的天然序列，即，与参考序列的10个连续氨基酸具有100％同一性的10个连续氨基酸残基)，并且在活性位点以外具有非活性半胱氨酸残基的缺失和/或取代。在其他实施方案中，硫氧还蛋白的同源物包括包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含天然存在的硫氧还蛋白的氨基酸序列的至少15个、或至少20个、或至少25个、或至少30个、或至少35个、或至少40个、或至少45个、或至少50个、或至少55个、或至少60个、或至少65个、或至少70个、或至少75个、或至少80个连续的氨基酸残基，依此类推，直到包含蛋白质的全长，包括整数个(10、11、12、..)的任何中间长度，并且包含一个活性位点。
根据本发明，关于本文所述的序列，术语“连续的”或“连续”是指以不间断序列连接。例如，第一序列包含第二序列的30个连续的(或连续)氨基酸，是指第一序列包含与第二个序列中30个氨基酸残基的不间断序列100％相同的30个氨基酸残基的不间断序列。类似地，第一序列与第二序列具有“100％同一性”，意味着第一序列与第二序列完全匹配，在核苷酸或氨基酸之间没有空位。
在另一个实施方案中，用于本发明的蛋白质包括具有氨基酸序列的硫氧还蛋白，所述氨基酸序列与天然硫氧还蛋白的氨基酸序列足够相似，使得编码该同源物的核酸序列能够在中等、高或非常高的严格条件下(如下所述)与(即，和)编码天然硫氧还蛋白的核酸分子杂交的严格条件(即，与编码天然硫氧还蛋白氨基酸序列的核酸链的互补链杂交)。此类杂交条件在下文中详细描述。
编码本发明的硫氧还蛋白的核酸序列的互补核酸序列是指与编码硫氧还蛋白的链互补的核酸链的核酸序列。应当理解，编码给定氨基酸序列的双链DNA包含单链DNA及其互补链，该互补链具有与单链DNA互补的序列。因此，本发明的核酸分子可以是双链的或单链的，并且包括在严格杂交条件下与编码硫氧还蛋白的氨基酸序列的核酸序列、和/或与编码此类氨基酸序列的核酸序列的互补序列形成稳定杂合体的那些核酸分子。推导互补序列的方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，提及杂交条件是指标准杂交条件，在该条件下使用核酸分子鉴定相似核酸分子。此类标准条件公开在，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989.Sambrook等人(同上)，其通过引用整体并入本文(具体参见第9.31-9.62页)。此外，计算合适的杂交和洗涤条件以实现允许不同程度的核苷酸错配的杂交的公式公开于，例如，Meinkoth等人,1984,Anal.Biochem.138,267-284；Meinkoth等人，同上,其通过引用整体并入本文。
更具体地，如本文所指的中等严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于在杂交反应中探测的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约30％或更少的核苷酸错配的条件)。如本文所指的高严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于在杂交反应中探测的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约20％或更少的核苷酸错配的条件)。如本文所指的非常高的严格杂交和洗涤条件是指允许分离与用于在杂交反应中探测的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即，允许约10％或更少的核苷酸错配的条件)。
如上所述，本领域技术人员可以使用Meinkoth等人(同上)的公式计算适当的杂交和洗涤条件以达到这些特定水平的核苷酸错配。此类条件会根据是否形成DNA:RNA或DNA:DNA杂合体而有所不同。计算的DNA:DNA杂合体的解链温度比DNA:RNA杂合体的解链温度低10℃。
在特定实施方案中，DNA:DNA杂合体的严格杂交条件包括在以下条件下杂交：6XSSC(0.9M Na+)的离子强度、在约20℃至约35℃的温度下(较低严格)、更优选在约28℃至约40℃的温度下(更严格)、甚至更优选在约35℃至约45℃的温度下(甚至更严格)，以及适当的洗涤条件。在特定实施方案中，DNA:RNA杂合体的严格杂交条件包括在以下条件下杂交：6X SSC(0.9M Na+)的离子强度、在约30℃至约45℃的温度下、更优选在约38℃至约50℃的温度下、甚至更优选在约45℃至约55℃的温度下，以及类似的严格洗涤条件。这些值基于大于约100个核苷酸分子、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的解链温度计算。或者，可以根据经验计算Tm，如Sambrook等人(同上)，第9.31至9.62页所述。一般来说，洗涤条件应尽可能严格，并应适合所选的杂交条件。例如，杂交条件可以包括盐和温度条件的组合，所述温度条件比计算的特定杂合体的Tm低约20-25℃，并且洗涤条件通常包括盐和温度条件的组合，所述温度条件比计算的特定杂合体的Tm低约12-20℃。适用于DNA:DNA杂合体的杂交条件的一个示例包括：在约42℃在6X SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时，然后是洗涤步骤，包括在室温下在约2X SSC洗涤一次或多次，然后在更高温度和更低离子强度下进行额外的洗涤(例如，在约0.1X-0.5X SSC中在约37℃下至少洗涤一次，然后在约0.1X-0.5X SSC中在约68℃下洗涤至少一次)。
硫氧还蛋白与不同序列的融合
本发明的硫氧还蛋白还可以是融合蛋白，其包括含有硫氧还蛋白活性位点的区段和可以具有多种功能的融合区段。例如，此类融合区段可以用作简化本发明蛋白质纯化的工具发挥作用，例如能够使用亲和色谱法纯化所得的融合蛋白。合适的融合区段可以是具有所需功能的任何大小的结构域(例如，赋予蛋白质增加的稳定性、赋予蛋白质增加的免疫原性、和/或简化蛋白质的纯化)。使用一个或多个融合区段在本发明的范围内。融合区段可以与含有硫氧还蛋白活性位点的区段的氨基和/或羧基末端连接。融合蛋白的融合区段和含有硫氧还蛋白活性位点的结构域之间的连接可易于裂解，以便能够直接回收此类蛋白质的含有硫氧还蛋白活性位点的结构域。优选通过培养用融合核酸分子转化的重组细胞产生融合蛋白，所述融合核酸分子编码包含连接至含有硫氧还蛋白活性位点的结构域的羧基和/或氨基末端的融合区段的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的任何氨基酸序列，例如天然存在的硫氧还蛋白或含有活性位点的硫氧还蛋白的氨基酸序列，可以生成为具有至少一个，至多约20个位于特定氨基酸序列的C-末端和/或N-末端中每个的侧翼的附加异源氨基酸。所得蛋白质或多肽可称为“基本上由”特定氨基酸序列组成。根据本发明，异源氨基酸是自然界中未发现的氨基酸序列(即，未发现天然存在于体内)，其位于特定氨基酸序列的侧翼，或与特定氨基酸序列的功能无关，或对于给定氨基酸序列所源自的生物体，如果使用标准密码子翻译天然存在的序列中的此类核苷酸，则不会如在基因中所发生的，由编码特定氨基酸序列的天然存在的核酸序列的侧翼核苷酸编码。类似地，当用于本文中的核酸序列时，短语“基本上由……组成”，是指编码特定氨基酸序列的核酸序列在编码特定氨基酸序列的核酸序列的5'和/或3'末端中每个的侧翼可以有至少一个，多至约60个附加异源核苷酸。异源核苷酸不像天然基因中所发生的，天然存在于(即，未发现天然于体内)编码特定氨基酸序列的核酸序列的侧翼，或者不编码赋予蛋白质任何额外功能或改变具有特定氨基酸序列的蛋白质的功能的蛋白质。
硫氧还蛋白的来源
在一个实施方案中，适用于本发明方法的本文所公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽包含含有硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽来源于与将施用该蛋白质的动物物种基本相似的动物物种。在另一个实施方案中，本文公开的包含硫氧还蛋白活性位点的任何硫氧还蛋白的蛋白质或肽都可用于给定患者，包括来自不同来源例如微生物、植物和真菌的任何硫氧还蛋白的蛋白质或肽。
在另一个实施方案中，适用于本发明方法的本文所公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽包括分离的或生物学上纯的蛋白质。因此，“分离的”和“生物学上纯的”不一定反映蛋白质的纯化程度。例如，本发明的分离的蛋白质可以从其天然来源获得，使用重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)产生，或化学合成。
在又一个实施方案中，本发明的含有硫氧还蛋白活性位点的化学合成的硫氧还蛋白的蛋白或肽也可以指稳定的形式，例如，通过钉合肽技术、通过环化或通过约束在N末端或C末端，含有在结构上受约束的活性位点的形式。优选地，用于本发明方法的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白具有的体内半衰期足以引起患者粘液或痰的液化上可测量或可检测的增加(或降低粘度或粘性)，和/或对患者产生与患者中粘液和痰相关的可测量、可检测或可感知的治疗益处。这种半衰期可以受此类蛋白质的递送方法影响。本发明的蛋白质优选在动物中具有大于约5分钟的半衰期，更优选在动物中具有大于约4小时、甚至更优选在动物中具有大于约16小时的半衰期。在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质在动物中的半衰期为约5分钟至约24小时，优选在动物中为约2小时至约16小时，更优选在动物中为约4小时至约12小时。
与硫氧还蛋白相关的核酸分子
本发明的其他实施方案包括编码如本文所公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的核酸分子。此类核酸分子可用于在体外或者体内产生可用于本发明方法的蛋白质。本发明的核酸分子包括这样的核酸分子，其包含、基本上由或由编码本文先前描述的任何蛋白质的核酸序列组成。根据本发明，分离的核酸分子是已经从其天然环境中除去的核酸分子(多核苷酸)(即，已经受了人为操作)并且可以包括DNA、RNA或DNA或RNA任一的衍生物，包括cDNA。因此，“分离的”并不反映核酸分子已被纯化的程度。尽管短语“核酸分子”主要是指物理核酸分子，而短语“核酸序列”主要是指核酸分子上的核苷酸序列，但这两个短语可以互换使用，尤其是对于能够编码蛋白质的核酸分子或核酸序列。
本发明的分离的核酸分子可以从其天然来源分离或使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生。分离的核酸分子可以包括例如基因、基因的天然等位基因变体、其编码区或部分，以及通过核苷酸插入、缺失、取代和/或倒位修饰的编码和/或调控区，所述插入、缺失、取代和/或倒位以使得修饰基本上不干扰核酸分子编码本发明所需蛋白质的能力、或在严格条件下与天然基因分离物形成稳定杂合体的能力的方式进行。分离的核酸分子可以包括简并性。如本文所用，核苷酸简并性是指一种氨基酸可以由不同的核苷酸密码子编码的现象。因此，编码可用于本发明的给定蛋白质的核酸分子的核酸序列可以由于简并性而不同。
根据本发明，提及基因包括与天然(即野生型)基因相关的所有核酸序列以及与硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点相关的那些核酸序列，例如控制由基因编码的蛋白质产生的调控区(例如但不限于转录、翻译或翻译后控制区)以及编码区本身。在另一个实施方案中，基因可以是天然存在的等位基因变体，其包括与编码给定蛋白质的核酸序列相似但不相同的序列。前面已经描述了等位基因变体。当核酸分子包含如上所述的基因时，短语“核酸分子”和“基因”可以互换使用。
优选地，本发明的分离的核酸分子可以使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸分子，其中核苷酸已被插入、缺失、取代和/或倒转，插入、缺失、取代和/或倒转以使得此类修饰提供对蛋白质生物活性的预期效果的方式进行。上面已经详细讨论了等位基因变体和蛋白质同源物(例如，由核酸同源物编码的蛋白质)。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法产生核酸分子同源物(例如，如Sambrook等人(同上)中所述)。例如，可以使用多种技术修饰核酸分子，包括但不限于通过经典诱变和重组DNA技术(包括但不限于定点诱变、化学处理、限制性内切酶切割、核酸片段的连接和/或PCR扩增)、或寡核苷酸混合物的合成和化学连接、或体外或者体内通过基因改组(即分子育种，参见例如Stemmer的美国专利号5,605,793；Minshull and Stemmer,Curr.Opin.Chem.Biol.3:284-290,1999；Stemmer,P.N.A.S.USA 91:10747-10751,1994，所有这些都通过引用整体并入本文)方法，重组分子组混合物以“构建”包含其多种组合的重新分类的核酸分子文库。本领域技术人员已知的这些和其他类似技术可用于有效地在蛋白质中引入多个同时的变化。随后可以通过与给定基因杂交来选择核酸分子同源物，或者通过直接表达来筛选由此类核酸分子编码的蛋白质的功能和生物活性。
本发明的一个实施方案涉及一种重组核酸分子，其包含与至少一个转录控制序列可操作地连接的上述分离的核酸分子。更具体地，根据本发明，重组核酸分子通常包含重组载体和如本文所述的分离的核酸分子。根据本发明，重组载体是工程化的(即人工产生的)核酸分子，其用作操作选择的核酸序列和/或将此类核酸序列引入宿主细胞的工具。因此，重组载体适用于克隆、测序和/或以其他方式操作选择的核酸序列，例如通过将选择的核酸序列表达和/或递送到宿主细胞中以形成重组细胞。此类载体通常含有异源核酸序列，即不是天然发现与待克隆或递送的核酸序列相邻的核酸序列，尽管载体也可以含有天然存在于与本发明的核酸序列相邻或可用于表达本发明的核酸分子的调控核酸序列(例如，启动子、非翻译区)(下文详细讨论)。载体可以是RNA或DNA，原核或真核，通常是质粒。载体可以作为染色体外元件(例如，复制质粒)维持，或者它可以整合到重组宿主细胞的染色体中，尽管对于本发明的大多数应用，优选载体与基因组保持分离。整个载体可以保留在宿主细胞内，或者在某些条件下，可以缺失质粒DNA，留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以在染色体启动子控制下、在天然或质粒启动子控制下、或在几个启动子的组合控制下。核酸分子的单个或多个拷贝可以整合到染色体中。本发明的重组载体可以含有至少一种选择性标志物。
在一个实施方案中，用于本发明的重组核酸分子的重组载体是表达载体。如本文所用，短语“表达载体”用于指适合生产编码产物(例如，感兴趣的蛋白质)的载体。在该实施方案中，将编码待产生的产物(例如，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质)的核酸序列插入重组载体中以产生重组核酸分子。将编码待产生的蛋白质的核酸序列插入载体中，其方式是使核酸序列与载体中的调控序列可操作地连接，从而使核酸序列能够在重组宿主细胞内转录和翻译。
在本发明的另一个实施方案中，重组核酸分子包含病毒载体。病毒载体包括整合到病毒基因组或其部分中的本发明的分离的核酸分子，其中核酸分子被包装在允许DNA进入细胞的病毒衣壳中。可以使用许多病毒载体，包括但不限于基于alpha病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺相关病毒和逆转录病毒的那些。
通常，重组核酸分子包含至少一种本发明的核酸分子，其与一种或多种表达控制序列可操作地连接。如本文所用，短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要是指与表达控制序列可操作地连接的核酸分子或核酸序列，但当此类核酸分子是本文所讨论的重组分子时，其可与短语“核酸分子”互换使用。根据本发明，短语“可操作地连接”是指将核酸分子连接到表达控制序列，使得该分子能够在转染(即，转化、转导、转染、缀合或传导)进入宿主细胞时表达。
转录控制序列是控制转录起始、延伸或终止的表达控制序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏序列。合适的转录控制序列包括可以在将要引入重组核酸分子的宿主细胞或生物体中起作用的任何转录控制序列。本发明的重组核酸分子还可以包含额外的调控序列，例如翻译调控序列、复制起点和与重组细胞相容的其他调控序列。
在一个实施方案中，本发明的重组分子(包括整合到宿主细胞染色体中的那些)还含有分泌信号(即，信号区段或信号序列核酸序列)以使表达的蛋白质能够从产生蛋白质的细胞分泌。合适的信号区段包括与待表达的蛋白质天然相关的信号区段或能够指导根据本发明的蛋白质的分泌的任何异源信号区段。
在另一个实施方案中，本发明的重组分子包含前导序列，以使表达的蛋白质能够被递送并插入宿主细胞的膜中。其他信号序列包括那些能够指导周质或细胞外分泌或保留在所需区室中的信号序列。合适的前导序列包括与蛋白质天然相关的前导序列，或能够指导蛋白质递送和插入细胞膜的任何异源前导序列。
根据本发明，术语“转染”用于指可以将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当术语“转化”用于指将核酸分子引入微生物细胞或植物时，该术语可以与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获得外源核酸而引起的遗传变化，并且基本上与术语“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化获得了第二个含义，它可以指例如，细胞癌变后在培养物中细胞生长特性的变化(如上所述)。因此，为避免混淆，术语“转染”优选用于将外源核酸引入动物细胞，并且在本文中用于一般地包括动物细胞的转染以及植物细胞和微生物细胞的转化，这些术语涉及的程度为将外源核酸引入细胞。因此，转染技术包括但不限于转化、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。
对人和非人脊椎动物的施用
在本发明的方法中，可以将组合物,包括药物组合物施用于脊椎动物类的任何成员的患者，包括但不限于灵长类动物、啮齿动物、家畜、鸡、火鸡和家养宠物、伴侣动物或赛马。
如上所述，本发明的组合物，包括药物组合物，以将组合物，特别是本文公开的包含硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白和/或组合物中的任何其他化合物，有效递送到靶部位的方式施用于患者(例如，对于蛋白质和化合物，递送到待处理的粘液或痰；对于重组核酸分子，递送到将位于或正位于待处理的粘液或痰环境中的靶宿主细胞)。合适的施用方案包括任何体内或者体外施用方案。
根据本发明，有效的施用方案(即，以有效方式施用本发明的组合物)包括合适的剂量参数和施用方式，其导致本文公开的含有硫氧还蛋白活性位点的硫氧还蛋白和/或组合物中的其他化合物与待治疗的粘液或痰接触，优选地使得患者从这种施用中获得一些可测量的、可观察的或可感知的益处。或者，可以使用体外样品、体内动物模型、如果患者是人类，则最终进行临床试验，来通过实验确定有效剂量参数。可以使用本领域中针对特定疾病或病症的标准方法来确定有效剂量参数。例如，此类方法包括确定存活率、副作用(即毒性)和疾病的进展或消退、以及相关的生理参数，例如一秒内的用力呼气量(FEV，FEV1)。
根据本发明，将本发明的组合物施用于患者的合适方法包括任何途径的体内施用，其适合于将组合物递送至患者体内或体表的所需部位。优选的施用途径对于本领域技术人员将是显而易见的，这取决于化合物是蛋白质还是其他化合物(例如药物)、组合物将被施用到身体的哪个部位以及患者所经历的疾病或病症。一般来说，本文所公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽的合适的体内施用方法包括但不限于皮肤递送、气管内施用、吸入(例如气溶胶)、鼻、口、肺施用和导管注入。耳递送可以包括滴耳剂，鼻内递送可以包括滴鼻剂或鼻内注射，眼内递送可以包括滴眼剂或使用合适的装置使药物穿过巩膜和/或到达眼睛后部。气溶胶(吸入)递送也可以使用本领域标准方法进行(参见，例如，Stribling等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281,1992,其通过引用整体并入本文)。口递送可以包括可通过口摄取的固体和液体，例如作为片剂或胶囊，以及配制成食品和饮料产品或动物饲料或饲料颗粒。对粘膜组织有用的其他施用途径包括支气管、鼻内、其他吸入、直肠、局部、经皮、阴道、经宫颈、宫颈周围和尿道途径。此外，施用方案可以包括预处理装置，例如将蛋白质、肽或组合物应用到隔膜中(例如，应用到宫颈)，以用于如不孕症的应用，以及手术辅助的局部施用，例如注射到窦腔。
在本发明的一个优选实施方案中，当施用本发明的蛋白质或组合物以治疗呼吸道(气道)中过度或异常粘稠或粘性的痰或粘液时，含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽(或组合物)或其他化合物通过以下途径施用：包括但不限于吸入(即通过吸入气溶胶，例如在表面活性剂中或与表面活性剂一起的气溶胶)；通过支气管镜、气管内导管和/或通过任何人工通气装置直接设置到肺；鼻施用(鼻内或经鼻)、支气管或气管内施用(即通过直接注射到气管或气管切开术)，直接或通过脂质包封或表面活性剂。本发明包括将组合物或蛋白质引入气道以使其可以接触其中的粘液或痰的任何可能的方法。
饲料
本发明的另一个实施方案涉及一种动物饲料组合物，其包含本文公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽，该硫氧还蛋白的蛋白质或肽含有还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
动物饲料用于满足任何类型驯养动物的营养需求。动物饲料包括饲料(fodder)和草料(forage)。例如，本文公开的硫氧还蛋白的蛋白质或肽可以通过混合到饲料(fodder)和/或草料(forage)中或与饲料(fodder)和/或草料(forage)混合、施用于或以任何方式掺入到饲料(fodder)和/或草料(forage)中或上而用于饲料(fodder)和/或草料(forage)中或上。动物饲料的例子包括但不限于干草、稻草、青贮饲料、压缩和颗粒饲料、油和混合口粮、发芽谷物、豆类、作物残渣、谷物、谷类作物和玉米。
动物饲料包括用于伴侣动物、家畜和希望满足其营养需求的其他类型动物的饲料。伴侣动物包括但不限于狗、猫、其他哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼和其他伴侣动物。家畜包括但不限于牛、马、水牛、绵羊、山羊、猪、其他有蹄类动物、鸡、火鸡、鸭、其他鸟类、鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、其他鱼类或其他类型的家畜。单硫醇硫氧还蛋白的热稳定性特性使其特别适合掺入必须承受超过80摄氏度加热数分钟的颗粒饲料中。
本文讨论或引用的每篇出版物和其他参考文献均通过引用整体并入本文。
尽管已经详细描述了本发明的各种实施方案，但是很明显，那些实施方案的修改和改造对于本领域的技术人员来说是显而易见的。然而，应当明确理解，这些修改和改造在如所附权利要求中所述的本发明的范围内。
实施例
对于以下实施例，“ORP100S”作为示例性硫氧还蛋白提供，并且本文公开的任何硫氧还蛋白可以替代ORP100S。
实施例1ORP100S的表达和表征
这个实施例证实了ORP100S的结构、构造、表达和评估。与C35S单半胱氨酸活性位点硫氧还蛋白ORP-100相比，ORP100S还并入了其余三个非活性位点硫氧还蛋白-1Cys残基的Ser突变，从而产生了具有改善的稳定性、活性和更稳健分析的完全单半胱氨酸硫氧还蛋白。
单硫醇C35S活性位点硫氧还蛋白ORP-100和ORP100S
天然Trx酶的活性位点包含在物种间高度保守的两个氧化还原活性的Cys残基。在其非活性的氧化形式中，这些Cys构成从蛋白质的三维结构突出的二硫键桥(Holmgren A.，1985，Thioredoxin，Annu Rev Biochem 54：237-71)。该活性中心的还原(通过TrxR酶、GSH/戊二醛或通过化学还原剂的合成活化)允许Trx作为具有二硫醇/二硫化物交换能力的电子载体发挥作用。蛋白质二硫化物是Trx介导的还原活性的优选底物。最初，在Cys32硫醇盐阴离子的亲核攻击后，在硫氧还蛋白活性位点的N-末端Cys32和相容的靶标二硫化物的Cys之间形成瞬时混合二硫化物(Holmgren A.,1995,Thioredoxin structure and mechanism:conformational changes on oxidation of the active-site sulfhydryls to adisulfide.Structure 3:239-43)。然后，在天然Trx中，C-末端活性位点半胱氨酸(Cys35)由于活性位点的构象变化而被激活，从而稳定Cys35硫醇盐阴离子，降低pKa并允许攻击分子内混合二硫键，导致释放氧化的Trx和目前完全还原的靶标(Wynn R,Cocco MJ,RichardsFM.,1995,Mixed disulfide intermediates during the reduction of disulfides byEscherichia coli thioredoxin.Biochemistry 34:11807-13)。
ORP-100和ORP100S是Trx的修饰版本，通过将活性位点Cys35突变为Ser(C35STrx)进行工程化。如图1所示，这通过阻止由初始的Cys32反应形成的混合二硫化物中间体的分解(resolution)而消除了Trx-二硫化物还原的第二阶段，并导致该Cys与蛋白质靶标的稳定共价连接。在人CF粘液的情况下，用还原的C35S Trx处理破坏缩合粘蛋白中过度的二硫键以使粘液粘度正常化，而Trx-粘蛋白加合物阻断新的粘蛋白Cys二硫化物重新形成的能力。此外，与粘液的共价连接将C35S Trx酶固定在细胞外并防止细胞摄取。这种独特的阻断机制允许修饰的Trx适当地作用于粘膜表面，但减少或消除了激活炎症通路或其他可能由细胞内Trx信号传导诱导的脱靶效应的机会。至关重要的是，这种单硫醇活性位点C35STrx策略首次能够替代或补充分泌型Trx的活性，而不显著影响细胞内的Trx活性。
ORP100S与ORP-100
与ORP-100相比，ORP100S通过在位置62、69和73的剩余非活性位点Trx Cys残基的Cys至Ser的突变被进一步修饰。这样做的理由是双重的：1)消除能够介导蛋白质：蛋白质相互作用和同二聚化/多聚化的反应性Cys，这可能导致功能性蛋白质的可用性降低和完全还原的单体C35S硫氧还蛋白的不稳定性增加；2)能够使用Cys氧化还原状态定量作为一种稳健且简单的过程中测定法，来监测整体蛋白质还原水平和催化活性潜力。三个非活性位点Cys在天然Trx中不具有结构性功能，并且被认为通过形成减弱二硫键还原活性的分子间键来主要发挥调节作用，包括在Cys73上的同二聚化(Weichsel,A.,Gasdaska,J.R.,Powis,G.,and Montfort,W.R.,1996,Crystal structures of reduced,oxidized,and mutatedhuman thioredoxins:evidence for a regulatory homodimer.Structure 4,735-51)。非活性位点Trx Cys也被证明是GSNOR的S-亚硝基化和潜在的其他翻译后修饰的位点(Wu C,Liu T,Chen W等人，Redox regulatory mechanism of transnitrosylation bythioredoxin,2010,Molecular&Cellular Proteomics 9:2262-75)。也通过消除多聚化的可能性而增加ORP100S(一种完全的单半胱氨酸Trx)的氧化稳定性，因为在ORP100S中仅可能在Cys32处二聚化，而在还保留一个或多个非活性位点Cys的C35S Trx变体中可能存在多个二聚体和更高的多聚体形式。
由于任何Trx Cys的还原硫醇能够还原显色底物，例如DTNB(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)以诱导可定量的吸光度变化，但只有Cys32能够与适当的蛋白质二硫化物底物(如胰岛素)形成混合二硫化物，去除Cys32以外的所有Cys也意味着ORP100S中总Cys的还原状态与Cys32的还原状态相同。因此，ORP100S还原DTNB的活性与其还原蛋白质二硫键的能力相同。这允许DTNB还原的分光光度监测可用作ORP100S蛋白活性的直接测量，而不是使用更复杂和耗时的反相高效液相色谱(RP-HPLC)来确定胰岛素还原状态。
ORP100S设计和构建
ORP100S的序列经过密码子优化以在大肠杆菌中表达，使用基于人硫氧还蛋白-1氨基酸序列的自定义算法。据推测，这即增加了表达水平，又防止了由于相对于人，在细菌中较少出现tRNA消耗而导致的氨基酸错误掺入，这两者都是天然真核生物硫氧还蛋白基因序列在大肠杆菌中重组表达的重大挑战(Harris等人,2012,Determination and controlof low-level amino acid misincorporation in human thioredoxin proteinproduced in a recombinant Escherichia coli production system.Biotechnologyand Bioengineering 109,1987-95)。
ORP100S作为DNA片段合成，其侧翼为用于方便操作并克隆到表达载体pD861(DNA2.0/Atum)中的在鼠李糖诱导型启动子控制下的AflII和HindIII限制性位点，并转化到BL21大肠杆菌中。在某些菌株中，大肠杆菌rhaB基因缺失以增强鼠李糖诱导。在2ml体积培养块(culture blokc)中小规模生长后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证鼠李糖诱导的表达。
ORP100S表达、纯化和分析
ORP100S的台式规模生产的初始策略如下：细胞在分批补料条件下在1.5L发酵罐(Dasgip，Eppendorf)中生长，细胞糊通过离心回收，然后破碎并通过超滤进行初步回收。ORP100S蛋白通过阴离子交换色谱法、然后是尺寸排阻快速蛋白液相色谱法(SEC-FPLC)和超滤/渗滤纯化至>95％。为了激活(还原)，ORP100S用10mM二硫苏糖醇(DTT)处理，然后通过内毒素清除步骤交换到冻干缓冲液中以去除DTT和内毒素。还原的蛋白质在-80℃下冷冻并冻干(Virtis)24–36小时。在通过SDS-PAGE和分析SEC-HPLC进行大小确认和纯度测定后，通过MALDI-TOF和ESI质谱验证序列同一性和同质性。颜色为淡黄色，产生灰白色冻干物。
功能测定法
1.使用DTNB定量ORP100S的还原状态，DTNB与游离SH基团反应，在412nm处产生黄色变化。将50微升2.5mM的rhTrx添加到96孔板中，然后添加175微升样品缓冲液和25微升6mM的DTNB。在通过添加DTNB引发反应后，在30℃下分光光度计监测由于DTNB还原产生的412nm处的动力学吸光度变化。ORP100S浓度由A280确定(Nanodrop)，使用人Trx-1(7,000)的消光系数。根据412nm处的吸光度和DTNB(14,150)的消光系数计算游离巯基的实际浓度，以确定作为游离巯基百分比的还原状态。对于ORP100S，这代表100％的蛋白质二硫化物还原能力，而对于ORP-100，只有四个半胱氨酸中的一个能够进行靶标还原，其代表25％。
2.使用SEC确定溶液中游离单体ORP100S的百分比。在安捷伦1100HPLC系统上运行BioBasic S-300 250X4.6色谱柱(Thermo Scientific)，分析样品。SEC-HPLC流动相缓冲液由40mM乙酸铵(pH 5.5)、2mM EDTA和450mM NaCl组成。低pH使二聚化最小化，而450mM NaCl浓度提高了分辨率。流速为0.35mL/min，在280nm处监测吸光度。每次运行的长度为20分钟。通过用单体级分的峰下面积除以色谱曲线下的总面积进行积分来确定ORP100S单体百分比。
3.通过测定小蛋白质(人胰岛素)的还原状态来定量ORP100S的二硫键还原活性，该蛋白质的异二聚体形式包含两个分子间和一个分子内二硫化物，已知这三种物质都是合适的硫氧还蛋白底物。胰岛素还原经典地用于通过添加NADPH和TrxR后的吸光度变化来定量硫氧还蛋白的活性(Holmgren A.,1979,Thioredoxin catalyzes the reduction ofinsulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide,J Biol Chem 254:9627-32)。此类方法不适用于单硫醇C35S硫氧还蛋白ORP-100和ORP100S，因为，1)由于与二硫键底物的化学计量共价连接而导致缺乏循环，以及，2)NADPH和TrxR不能还原氧化的单硫醇Trx活性位点的Cys32。因此，基于使用反相(RP)HPLC开发了一种新的测定法，以监测二硫键键合的胰岛素异二聚体向单体形式的转化率。人胰岛素的两条链共有六个半胱氨酸残基，在其成熟结构中形成三个二硫键。当还原形式的ORP100S与二聚体胰岛素一起孵育时，其与这些二硫键反应以破坏它们，同时与ORP100S Cys32形成共价键。这导致完整的胰岛素异二聚体的迁移率变化，可以使用RP-HPLC的分离检测，从而使得可能定量异二聚体峰面积随时间的变化，作为蛋白质二硫化物还原活性的量度。ORP100S样品与10mg/mL胰岛素孵育不同的时间点(0-90分钟)，并通过添加碘乙酸(IA)和三氟乙酸(TFA)停止反应。使用Intrada WP-RP 50X3(Imtakt)色谱柱，通过在RP-HPLC(Agilent 1100)上分离后胰岛素异二聚体峰下面积的变化确定每个时间点的相对活性。缓冲液A为0.1％TFA，缓冲液B为0.1％TFA的乙腈溶液。梯度为0至3％B，5分钟，然后是30至60％B，45分钟，然后60至80％B再持续5分钟。流速为0.2mL/min，在280nm处测量吸光度。为了评估完整胰岛素分子的变化，首先使用1M IA和0.1％TFA建立时间0基线，而不添加ORP100S。然后确定完整胰岛素异二聚体峰下的面积并将其设置为等于100％。在与ORP100S反应后，测量完整胰岛素峰的面积(对应于保留时间)。然后用还原后面积的减少除以时间0时的面积再乘以100，计算完整胰岛素的还原百分比。
实施例2.还原活性的pH依赖性
该实施例说明具有硫氧还蛋白活性位点的本发明分子由于较低的pKa值而在生理相关pH下具有比常规硫醇还原剂显著更大的活性。
由于碳酸氢盐介导的质子分泌缓冲作用的丧失，人CF气道表面液体的酸性比未受影响的个体高约0.8个pH单位(Garland AL,Walton WG,Coakley RD,等人,2013,Molecularbasis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways.PNAS110:15973-8；Shah VS,Meyerholz DK,Tang XX等人,2016,Airway acidificationinitiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice,Science 351:503-7)。这对临床使用还原剂治疗缩合的异常粘液具有影响。由于其非活性(质子化)和活性(去质子化)形式之间的高碱性平衡点(pKa)，已批准和研究的硫醇剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、半胱胺和2-巯基乙磺酸钠(美司钠(Mesna))在CF气道pH值下均表现出低水平的二硫化物还原活性。Cys硫醇pKa值的范围从pH 8.5(半胱胺)至pH 9.5(NAC)。与这些经典硫醇形成鲜明对比的是，Trx活性位点Cys32的结构稳定的pKa低2到3个对数(pH 6.1-6.3)，即使在酸性CF气道pH下也能实现高活性(图2)。我们已经通过实验证实了(数据未显示)ORP-100和ORP100S与天然Trx具有相同的pKa，证明单半胱氨酸活性位点修饰不干扰稳定Trx Cys32处去质子化硫醇盐阴离子的独特氢键。
图2A显示了硫氧还蛋白(和ORP-100/ORP100S)与四种代表性小分子硫醇剂在pH范围6-9时计算的去质子化活性形式的硫醇百分比。图2B显示了代表性胰岛素还原实验的RP-HPLC轨迹，显示在pH 6(左，顶部)和pH 8(左，底部)下，1.25和12.5mM NAC的胰岛素异二聚体峰的转化。小图B，右上方，显示在pH 6下获得的0.025mM ORP-100的轨迹。重叠时间0和60分钟的轨迹表明在60分钟的孵育时间内没有还原：1.25mM NAC在pH 6或8时对胰岛素还原无活性，12.5mM的NAC仅在pH 8时能还原胰岛素，但在pH 6时不能，如表示胰岛素异二聚体在60分钟的转换的阴影峰面积所示。相反，即使在酸性pH6下，ORP-100也能够显著降低胰岛素异二聚体峰，并且浓度为NAC的1/500(图2B，右小图，顶部)。表：NAC与ORP-100在pH6–9时的相对活性。使用天然Trx和ORP100S与NAC或GSH获得了类似的结果。这些结果表明，单硫醇活性位点C35S硫氧还蛋白(ORP-100，ORP100S)在人气道中预期的整个生理pH范围内保留了硫氧还蛋白的显著有效的二硫化物还原活性，包括当外源性和内源性(例如，GSH)小硫醇基本上无活性的中性至酸性pH水平。
实施例3ORP100S还原状态与活性的相关性
这个实施例表明完全的单硫醇ORP100S在总蛋白质还原状态和二硫键还原活性之间表现出很强的相关性。
用100mM DTT还原ORP100S，并使用SEPHADEXTMG-25色谱柱(例如，GE HealthcareNAP-5色谱柱)从样品中去除残留的还原剂，以换成20mM乙酸铵，pH 5.5。完全还原的ORP100S(“Red”)以不同的比例与用碘乙酰胺(IA)处理的氧化ORP100S混合，并交换到乙酸铵缓冲液中以去除未反应的碘乙酰胺(“Ox”)。结果如表1所示。如实施例1所述，通过DTNB、SEC和RP-HPLC胰岛素还原测定法分析含有不同比例的还原：氧化蛋白质的ORP100S溶液。在所使用的时间和条件下，与完全还原物质的最大胰岛素异二聚体反应为45％。胰岛素还原值表示为相对于最大值的相对还原。虽然从100％IA处理：0％还原处理中可以明显看出在“完全氧化”样品中存在残留活性，尽管如此，所述结果仍然证实单硫醇Trx ORP100S在总还原状态和二硫键还原活性之间表现出非常好的线性相关性，与具有五个可还原Cys的天然Trx或具有四个可还原Cys的ORP-100不同(未显示)。例如，当活性位点Cys32被二聚化完全氧化时，具有四个总Cys的ORP-100可以是多达75％还原，并且仍然具有0％的胰岛素还原活性。我们已经证实，氧化主要通过分子间二硫化物的形成进行，产生ORP100S同源二聚体(在Trx或ORP-100的情况下，还有更高阶的多聚体)。
表1
Figure BDA0003829764700000501
实施例4溶液与冻干的稳定性
该实施例表明，使用实施例1中描述的初始制造方法在实验室规模产生的单硫醇活性位点硫氧还蛋白ORP-100和ORP100S在作为纯蛋白质从挥发性溶剂中冻干时比作为化合物溶液储存时显著更稳定，如通过游离SH基团和单体百分比所测量的。稳定性与使用复杂的蔗糖和EDTA制剂所获得的稳定性相当，所述蔗糖和EDTA制剂之前是唯一能够在长时间储存期间维持还原形式的硫氧还蛋白的制剂。
之前的工作，例如WO 2006/090127，教导了用于将硫氧还蛋白维持在还原状态的组合物。需要大量实验来获得能够在储存期间保持硫氧还蛋白还原的组合物，这些组合物很复杂并且需要糖类衍生物和EDTA作为赋形剂。我们的发现，通过将还原的硫氧还蛋白溶解在包含挥发性溶剂的水溶液中(在冻干过程中升华所述挥发性溶剂)，以除去所有赋形剂，可获得相当的稳定性，因此这是意想不到的。使用此类制剂策略进行的稳定性分析结果如图3所示。用100mM DTT还原ORP-100和ORP100S蛋白，并在NAP-5色谱柱上交换到pH5.5的挥发性20mM乙酸铵缓冲液中，以去除残留的还原剂。一半物质在-80℃冷冻，然后冻干，而其余物质在溶液中在5℃或40℃保持不同的时间点(“PH5.5”)。将冻干蛋白重构在20mM醋酸铵pH 5.5中，然后立即进行每个时间点的评估(“冻干”)。通过测量游离SH基团(DTNB显色测定法)和单体百分比(SEC-HPLC)评估稳定性。如图3所示，即使六个月后，在40℃的加速稳定性条件下冻干形式仍获得了出色的储存稳定性。虽然与ORP-100基本相似，但通过SEC-HPLC，ORP100S显示出稍好的单体稳定性，特别是在液体制剂储存的第一周。根据我们之前的结果，相对于单体百分比，ORP-100的较高DTNB反映了对活性没有贡献且ORP100S不存在的非活性位点Cys的还原(参见实施例3)。
图3：PH5.5：ORP-100或ORP100S蛋白质在20mM醋酸铵，pH 5.5的液体制剂中维持0、3、7、14、21、28、90或180天。冻干：ORP-100或ORP100S蛋白质以冻干形式在5℃或40℃下储存0、3、7、14、21、28、90或180天，并在20mM乙酸铵，pH 5.5中重构后进行测定。顶部小图：5℃时游离巯基(还原状态)的百分比。第二小图：在5℃下通过SEC测定法测定的单体百分比。第三 小图：40℃下的游离巯基百分比。第四小图：在40℃下通过SEC测定法测定的单体百分比。
实施例5：大规模制造和去除高UV吸光度硫氧还蛋白蛋白级分
该实施例证实了本发明的硫氧还蛋白组合物的产生，其中除去了高于400nm具有UV吸光度的硫氧还蛋白蛋白级分，并描述了所得组合物的稳定性和吸收特性。
通过培养重组工程化的rhaB-大肠杆菌以在150L发酵罐中表达蛋白质，并通过添加鼠李糖诱导表达，来制备包含ORP100S的组合物。在诱导后48小时收获所得发酵液并均质化以裂解细胞，然后将裂解物冷冻用于进一步加工。105L发酵液中ORP100S的最终滴度为16g/L。通过标准技术解冻和澄清冷冻的裂解物。对澄清裂解物中的蛋白质组合物进行第一结合和洗脱模式的阴离子交换色谱步骤(Capto Q树脂15L-5L x 3,目录号117531604,GEHealthcare)和第二流经模式的阴离子交换色谱步骤(Sartobind STIC PA色谱法-Sartorius)以去除内毒素。对所得蛋白质组合物进行结合和洗脱模式的疏水相互作用色谱法(Capto Phenyl ImpRes 10L-5L x 2,Cat 17548404,GE Healthcare)。这种HIC-纯化的组合物包括在约280nm处具有单个UV吸收峰的主要硫氧还蛋白级分，以及在约423nm处具有另外突出的UV吸收峰的第二硫氧还蛋白级分(对应于硫氧还蛋白量的约10％)，以及在500–600nm范围内的次要峰(图4)。次要级分呈肉色(“红色级分”)，而主要级分基本上是透明的。所有纯化步骤均在DTT存在下进行以保持完全还原。
通过超滤/渗滤将主要级分和红色级分分别交换到乙酸铵缓冲液，pH 5.5中，并在-80℃下在500ml瓶中冷冻。通过HPLC-MS证实DTT完全去除。如下通过冻干干燥组合物。通过从-80℃转移到2-8℃冰箱解冻冷冻产品60小时。使用0.2uM PES过滤器、500mL无菌过滤器/瓶组合过滤解冻的产品。将过滤后的产品转移到Gore LyoGuard冻干托盘(1.5L产品/托盘，相当于3x500mL产品瓶)，将装满的托盘转移到冻干机架上，温度探头放置在托盘顶部。用氮气吹扫后开始冻干循环。
根据以下冻干循环程序对五批产品进行冻干。
表2
Figure BDA0003829764700000531
冻干后，用氮气吹扫托盘，将冻干饼破碎成粉末，包装在无菌储存瓶中，在–20℃下储存(最终回收率为88.7％)。然后测定该产品的水分含量，其中在五个批次中主要级分的水分含量范围为0.81wt％至2.18wt％。相比之下，红色硫氧还蛋白级分只能干燥至约6.0wt％的最小水含量。
表征：干燥并在盐水中重构之后，通过DTNB和RP-HPLC，主要级分显示出与在HIC纯化步骤中未除去红色级分而纯化的硫氧还蛋白组合物相当的二硫化物还原活性。然而，当在盐水中重构并维持在室温时，与通过不足以去除有色级分的方法纯化的硫氧还蛋白组合物相比，缺乏>400nm具有UV吸光度的红色级分的主要级分组合物表现出显著更高的稳定性。如前述实施例中所述，通过SEC分析在室温(25℃)下评估不含红色级分的ORP100S的稳定性。在PBS(盐水)中制备浓度为70、80、90、100和110mg/ml的蛋白质溶液，对应于6.0、6.8、7.7、8.5和9.4mM。这些溶液在室温下孵育0、20、44、68、140、188和232小时。在每个时间点以1000RFC离心试管以检查沉淀物，并通过SEC测定单体ORP100S百分比。此外，在68小时时间点进行DTNB测定法以评估还原程度。在所有浓度水平上几乎没有观察到单体百分比的变化，从时间0到232小时仅下降了2％(见下表)。相比之下，在PBS(盐水)中重构的5mM(59mg/ml)可比浓度的不去除红色级分的ORP100S组合物，在25℃下孵育时，在时间0的起始单体级分百分比为95％，在72小时降至55％，在168小时降至26％。
表3
Figure BDA0003829764700000541
总体而言，如所述去除红色级分的纯化物质纯度更高，外观更均匀，内毒素水平极低。
表4
<u>浓度：</u> 68.4mg/ml
<u>外观：</u>
不透明度： 澄清
可见颗粒： 无
颜色： 无色
<u>纯度：</u>
SDS-PAGE(非还原)： 97.9％(2.1％HMW)
SDS-PAGE(还原)： 100％
SEC-UPLC： 99.6％(0.4％HMW)
<u>安全性：</u>
内毒素水平(Endosafe PTS)： 0.002EU/mg
实施例6ORP100S粘液流变学和粘蛋白分子量降低
本实施例证实了单半胱氨酸人硫氧还蛋白-1ORP100S降低人CF粘液的粘弹性以及粘蛋白糖蛋白的分子量(MW)的功效。评估了ORP100S降低体外培养的源自原代人支气管上皮细胞(HBE)的4％CF粘液的粘稠和弹性系数的能力，以及使用凝胶渗透色谱法(GPC)/多角度光散射(MALLS)评估了ORP100S处理对粘蛋白聚合物大小的影响。这些结果共同证明了ORP100S使CF粘液和痰粘弹性正常化、以及使粘液可转运性正常化的强大能力，并表明ORP100S可能是针对在广泛的气道pH微环境中的活性进行了优化的潜在的CF治疗。
方法：
粘液制备：从来自20个不同CF供体的100多个单独的HBE培养物中收获无菌粘液，并制备成重量百分比为4(4％)的固体，该浓度代表慢性阻塞性肺病(COPD)和轻度CF(Hill,D.B.等人,2014,A biophysical basis for mucus solids concentration as acandidate biomarker for airways disease,PloS one 9,e87681；Anderson,W.H.等人,2015,The relationship of mucus concentration(hydration)to mucus osmoticpressure and transport in chronic bronchitis.,Am J Resp Crit Care Med 192:182-90)。
流变学：按照先前建立的方法，用DTT(1mM)和几个浓度的ORP100S(0.01、0.1和1.0mM)在37℃下处理HBE细胞培养粘液1小时(Hill,D.B.和Button,B.,2012,Establishment of respiratory air–liquid interface cultures and their use instudying mucin production,secretion,and function.In Mucins:Methods andProtocols,D.J.Thornton编辑,第245-58页；Youngren-Ortiz,S.等人,2017,Developmentof optimized inhalable Gemcitabine-loaded gelatin nanocarriers for lungcancer,J Aerosol Med Pulm Drug Delivery 30:299-321；Seagrave,J.等人,2012,Effects of guaifenesin,N-acetylcysteine,and ambroxol on MUC5AC andmucociliary transport in primary differentiated human tracheal-bronchialcells,Respir Res 13:98)。使用TA Instruments DHR3流变仪进行浓度和时间进程测定，以评估测试物品的体积、宏观生物物理效应和对HBE粘液特性的控制。简言之，为每种治疗条件确定了1Hz振幅(应力)扫描的线性状态。选择1Hz的频率是因为其介于与潮式呼吸(约0.25Hz)和粘膜纤毛清除(10-15Hz)相关的频率之间，并且已被证明与粘膜纤毛清除相关(Tomkiewicz,R.等人,1994,Mucolytic treatment with N-acetylcysteine L-lysinatemetered dose inhaler in dogs:airway epithelial function changes.Eur Resp J 7:81-87)。进行了蠕变恢复实验，其中将已知应力(0.05至约100Pa之间)施加到处理的或对照粘液10秒，然后再记录50秒液体的流变恢复。在连续运行中，以对数方式增加施加的应力，直到达到液体的屈服应力(即在该应力下液体的粘度突然急剧下降)。根据测量的参数，液体的粘度和弹性被确定为施加应力的函数。在恒定应力和应变下进行频率扫描，用于确定粘液的基线物理特性及其弹性和粘稠组分(分别为G'和G")。
粘蛋白分子量测定：在Wyatt Heleos MALLS系统上使用凝胶渗透色谱法与多角度激光散射的组合测定测试物品处理后的分子量降低。MALLS是一种以非破坏性方式测定高MW生物分子的分子大小和质量的快速、准确的方法，无需使用相关标准。简而言之，将4％HBE处理的样品在含有10mM EDTA和0.01％叠氮化钠的0.9％NaCl中稀释100倍。通过Sepharose CL2B色谱柱洗脱0.2mL稀释样品，以将高MW粘蛋白与其他粘蛋白分离，并将粘蛋白级分引入MALLS系统。使用Wyatt Astra软件将Berry模型拟合到来自11个不同角度的光散射来确定粘蛋白MW。
结果
粘弹性：ORP100S表现出浓度依赖性降低4％HBE粘液的弹性系数(储存，G')和粘稠系数(损失，G”)的能力(图5，顶部)。在测试的最低ORP100S浓度(10μM)下，G'的显著降低不明显，而观察到G”降低了近2倍。在100μM ORP100S下，G'从基线值0.28Pa降低到0.19Pa，G”降低的量与在10μM时观察到的相似。在此浓度下ORP100S实现的流变学的降低程度与使用1mM DTT(一种具有强效粘液溶解特性的强二硫醇还原剂)所获得的程度相似。引人注目的是，1mM ORP100S显示出比DTT显著更强的流变学降低特性，将G'和G″降低了近3倍。
图5，A和B(顶部)：使用DTT(1mM)和ORP100S(0.01、0.1和1.0mM浓度)在37℃下还原4％固体干重粘液1小时的弹性系数(G')和粘稠系数(G”)的降低。结果表明，0.1mM ORP100S对G'的降低与十倍浓度的DTT一样有效。通过检查在线性状态下进行的粘液频率扫描收集所有数据，并在TA DHR3流变仪上以1rad/s进行分析。
粘蛋白大小：与1mM DTT不同(1mM DTT显示粘蛋白的分子量适度增加(从180MDa至210MDa))，所有三种浓度的ORP100S均将粘蛋白的分子量降低至约150MDa(图5，C底部)。所有化合物都降低了屈光计检查系统中存在的粘蛋白浓度(数据未显示)。使用1mM DTT使粘蛋白平均分子量轻度增加可能是化合物开放反应性半胱氨酸残基的标识，这可能允许粘蛋白大分子与其自身以及与其他粘液蛋白相互作用。像ORP100S这样将游离Cys硫醇封端的单硫醇还原剂预计不会以这种方式反应，将粘蛋白大分子还原为单体的更高浓度的DTT也不会。
图5C。在37℃下，用DTT(1mM)和ORP100S(0.01、0.1和1.0mM浓度)还原1小时的4％固体干重粘液的粘蛋白分子量降低(GPC-MALLS)。
结论：
ORP100S在降低异常粘弹性CF粘液的流变学(摩尔/摩尔)方面表现出比DTT显著更强的能力。重要的是，ORP100S的有效粘弹性调节作用不会导致粘蛋白的完全还原和聚合物解体，这表明对增加聚合物密度的分子内粘蛋白二硫化物的酶促选择性程度高于将粘蛋白单体与功能性凝胶连接的分子间二硫化物。与粘液溶解相反，这种粘液正常化与天然气道粘液二硫化物稳态机制的预期行为一致，该机制基于体内气道表面液体中存在的所有三种组分：硫氧还蛋白、谷胱甘肽和谷氧还蛋白的氧化还原循环(Du,Y.,Zhang,H.,Lu,J.&Holmgren,A.,2012,Glutathione and glutaredoxin act as a backup of humanThioredoxin Reductase 1to reduce Thioredoxin 1preventing cell death byaurothioglucose,J Biol Chem 287,38210-19；Bartlett,J.A.et al.,2013,Proteincomposition of bronchoalveolar lavage fluid and airway surface liquid fromnewborn pigs,Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol 05:L256-66)。
实施例7用ORP100S治疗后CF粘液和痰可转运性
这个实施例在体外培养的原代人支气管上皮细胞中以及切离的成年大鼠气管原位证实了ORP100S增加了CF粘液和痰的可转运性。
方法
原代人支气管上皮的研究
原代人支气管上皮(HBE)细胞来自失去健康的供体和F508del CFTR纯合的CF患者的肺外植体。将细胞扩增并生长至汇合，接种到包被有NIH 3T3成纤维细胞无条件培养基的6.5mm直径可渗透支持物(0.5x 106个细胞/过滤器；Corning)上，并在分化培养基中生长至少6-8周，直到最终分化(Birket SE,Chu KK,Houser GH,Liu L,Fernandez CM,SolomonGM,Lin V,Shastry S,Mazur M,Sloane P等人,2016,Combination therapy with CysticFibrosis Transmembrane Conductance Regulator modulators augment the airwayfunctional microanatomy,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.ajplung 00395；Birket SE,Chu KK,Liu L,Houser GH,Diephuis BJ,Wilsterman EJ,Dierksen G,MazurM,Shastry S,Li Y等人,2014,A functional anatomic defect of the cystic fibrosisairway,Am J Respir Crit Care Med.190(4):421-32)。用PBS洗涤细胞并使其生长48小时，以便在用ORP100S(1-3mM)、载剂对照(PBS；-MG++、-Ca++)或阳性对照DTT(1.6mM；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行顶端处理(模拟气溶胶沉积)之前重新建立新鲜的粘液层。在基线和3小时后处理后获得微光学相干断层扫描(μOCT)图像，每种条件下3-4个单层，每个单层4个感兴趣区。仅使用第一或第二代细胞。
ORP100S在离体对痰转运的影响
为了确定ORP100S对CF痰可转运性的影响，收集了4名因肺恶化住院的CF患者自发咳出的痰标本，并在4℃下储存，然后分成200μL等分试样，并在收集当天或后一天用ORP100S(3mM)、PBS、DTT(1.6mM)、或DNase(10或25μg/ml)处理。治疗后，将痰等分试样置于37℃水浴中2小时，然后将其(每个样品3μl)施加到从成年非CF大鼠切除的气管远端进行μOCT成像。在添加痰之前，用500μl PBS清洗气管2次。在不同的解剖位置以随机顺序一式三份地施加样品条件—在每次添加样品之间使用500μl PBS进行2次洗涤——并且从每个感兴趣区收集至少3张图像。在实验完成后通过用PBS成像来确认气管活力。
μOCT成像
一微米分辨率光谱域μOCT用于获得测量HBE单层中的粘膜纤毛转运(MCT)率和纤毛搏动频率(CBF)以及痰的体外的痰的MCT率。这种首创的高速(每秒40帧，每帧512行)显微反射成像模式能够在细胞培养物和完整组织中同时进行解剖成像，从而很容易区分CF与正常上皮细胞的特性(Liu L,Chu KK,Houser GH,Diephuis BJ,Li Y,Wilsterman EJ,Shastry S,Dierksen G,Birket SE,Mazur M,et al.,2013,Method for quantitativestudy of airway functional microanatomy using micro-optical coherencetomography,PLoS One8(1):e54473；Tuggle KL,Birket SE,Cui X,Hong J,Warren J,ReidL,Chambers A,Ji D,Gamber K,Chu KK,et al.,2014,Characterization of defects inion transport and tissue development in Cystic Fibrosis TransmembraneConductance Regulator(CFTR)-knockout rats.PLoS One 9(3):e91253)。除了MCT率和CBF，μOCT还具有评估气道表面液体的物理特性的能力。如前面参考文献中所述，捕获图像并计算MCT率和CBF。
统计分析
使用ANOVA计算推断统计量(平均值、SD、SE)，并在适当的情况下使用Tukey的事后检验进行多重比较。统计数据表示为平均值±SE，P值<0.05被认为是显著的。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7.0a版(La Jolla，CA)进行。
结果
ORP100S增加非CF和CF原代HBE细胞中的MCT率
为了确定ORP100S是否改变粘液转运，我们评估了其对源自健康的非CF供体和F508del纯合的CF供体的原代HBE细胞中MCT率和CBF的影响。对于这些研究，我们使用了μOCT成像，其可以在不使用外源颗粒或染料的情况下测量气道功能显微解剖的这些和其他参数。结果表明，在处理后3小时，与PBS(0.05±0.007mm/min)相比，ORP100S(“Theradux”)处理的(1-3mM)非CF细胞表现出显著更高的MCT率(2.18±0.3mm/min,P<0.01)，超过了DTT的效果(1.6mM；1.41±0.1mm/min)(图6A)。这种作用在CF细胞中得到了概括，显示出在用ORP100S 3小时时显著提高了MCT率(54.73±15.3mm/min,P<0.05)，而PBS(7.30±2.9mm/min)或DTT(33.33±12.9mm/min)，从基线(15.4±15.3mm/min)的增加(图6C和D)。ORP100S在非CF或CF细胞中没有引起有意义的CBF差异(图6B、E和F)，支持了其二硫化物还原特性作为推动MCT改善的机制。
图6.原代HBE细胞(非CF和CF)中ORP100S(Theradux)的μOCT分析。(A)非CF细胞治疗后3小时的原始粘膜纤毛转运(MCT)率和(B)纤毛博动频率(CBF)。对于CF细胞，(C)3小时时的原始MCT率和(D)处理后3小时的MCT率相对于基线的变化。(E)也测量了原始CBF和(F)CBF相对于基线的变化。在1个非CF和1个CF供体中，每个条件N＝3-4个单层。每个数据点代表每个单层的平均治疗效果。每个条件N＝3-4个单层。*P<0.05**P<0.01
ORP100S改善完整气管中的粘液清除
进一步评估了ORP100S对使用完整大鼠气管的粘液清除的影响，所述完整大鼠气管包括气道表面的复杂性，例如完全分化的粘膜表面的腺体表达。从四名基因型为F508del/F508del、F508del/S589N(N＝2)和F508del/1973_1985del13InsAGAAA(平均年龄＝31岁；平均FEV1＝1.62L)的CF患者收集自发咳出的痰，并用ORP100S(3mM)、PBS、DTT(1.6mM)或DNase(10或25μg/ml)处理2小时。然后将痰添加到活的野生型大鼠气管表面，并在生理条件下使用μOCT成像。图7A-D显示具有代表性的重新切片的μOCT图像，其描述了每种治疗条件的粘液转运。通过将横截面线投影穿过粘液的时间来测量MCT，粒子轨迹的斜率表示速度。如图7E和F所总结的，相对于PBS(0.97±0.17mm/min)，ORP100S处理的细胞显示出更高的MCT率(4.68±0.9)mm/min，P<0.0001)，显著超过标准护理DNase(2.30±0.28mm/min)和DTT(2.31±0.34mm/min)的效果。相对于PBS的作用，归一化的MCT率的变化为3.80±0.35mm/min(P<0.0001)，再次超过使用DNase(2.95±0.40mm/min,P<0.01)或DTT(3.01±0.61mm/分钟，P<0.01)所观察到的。从ORP100S与PBS处理的痰的代表性μOCT图像中可以看出(图7G和H)，ORP100S可有效降低痰的密度，这与先前观察到的粘弹性数据一致。
图7.CF痰中的ORP100S(“Theradux”)的μOCT分析。(A-D)每个处理条件的代表性重新切片的μOCT图像，描述了粘液转运。通过将横截面线投影穿过粘液的时间来测量MCT。粒子轨迹的斜率表示速度。(E)来自N＝4CF供体的样品的用品中相对于PBS归一化的(E)原始粘膜纤毛转运(MCT)速率和(F)MCT率的变化。描绘了相对于(H)PBS(粘液(mu)、上皮(ep))，(G)ORP100S对粘液密度的影响的代表性图像。平均值+/-SEM，**P<0.01，****P<0.0001。
结论
ORP100S处理的原代非CF和CF HBE细胞表现出增加的MCT，超过了DTT的效果。与阳性对照相比，在咳出的CF痰中也观察到ORP100S增加了粘液可转运性，同时痰密度降低。总之，这些结果表明，通过ORP100S减少二硫键会增加粘液的转运能力，并表明ORP100S可能是针对在广泛的气道pH微环境中的活性进行了优化的潜在的CF治疗。
实施例8还原形式的ORP100S在体外是非炎性的
在体外进行了气-液界面(HBE-ALI)培养的正常和CF HBE的研究，以评估单硫醇硫氧还蛋白在微喷雾施加到细胞单层后诱导炎性细胞因子释放的潜力。
根据Schlegel及其同事(Suprynowicz,F.A.等人,Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(49):p.20035-40；Becker,M.N.,et al.,Am J Respir Crit Care Med,2004,169(5):第645-53页)的方法改编的方法，将来自正常健康志愿者或CF受试者的鼻气道上皮细胞在无血清培养基中培养，在气液界面上具有粘膜纤毛分化。使用这种技术收集、扩增和冷冻保存了许多独特的CF和健康对照标本。从三个独特的正常或CF供体(F508del纯合子)中的每个供体在ALI培养30个孔以分化超过30天。将一式三份培养物在顶端表面暴露于PBS、天然Trx或ORP-100，并在攻击后4和24小时收集顶端和基底外侧培养基样品。通过将200uL无菌PBS放在顶端表面上并在孵育15分钟后将其回收来进行顶端收集。对每个样品进行一式两份IL-6的ELISA，并使用多重测定法测量其他。将培养基离心以去除碎片并储存在-80℃直到ELISA分析。
在ORP-100或硫氧还蛋白存在或不存在的情况下加入生理盐水(PBS)的促炎细胞因子IL-6(左)和TNF-α(右)变化的代表性数据如图8所示，HBE-ALI来源于健康和CF供体。这些数据表明，还原形式的ORP-100是非炎性的，并且与单独应用PBS载剂相比，对于在正常(等渗)PBS中配制的药物，在浓度高于100uM时表现出显著的抗炎作用，因为在CF HBE-ALI(但不是来自健康供体的那些)中观察到等渗或高渗盐水的应用足以诱导TNF-α和IL-6。还原而不是氧化的ORP-100消除了盐水的炎性作用。在正常大鼠体内的急性气管内滴注研究中重述了这些结果。
图8：来自非CF(左侧系列条形)和CF供体(右侧系列条形)鼻上皮的原代HBE培养物的基底外侧ALI培养基中24小时后诱导的IL-6或TNFα水平。递送：顶端表面推注施加15分钟的200uL体积的对照或测试品溶液。PBS：0.9％磷酸盐缓冲盐水阴性载剂对照(黑条)；ORP100-1000：1mM ORP-100的PBS溶液(实心黑条)；ORP100-1000：100uM ORP-100的PBS溶液(实心浅色阴影条)；Trx-1000：1mM天然硫氧还蛋白-1的PBS溶液(深色阴影条)；Trx-100：100uM天然硫氧还蛋白-1的PBS溶液(浅色阴影条)。所有浓度都反映了递送到HBE顶端表面的体积。
实施例9：还原形式的ORP100S在体内的抗炎作用
这个实施例评估并比较了三种形式的C35S单硫醇Trx(氧化的ORP-100、还原的ORP-100和还原的ORP100S)在体内的炎性潜力，其配制在PCT WO2006/090127中描述的蔗糖/EDTA制剂组合物中并作为雾化气溶胶以4和40mg/kg的剂量递送到正常大鼠。
在用DTT还原后将所有三种形式的ORP-100冻干并配制在蔗糖缓冲液(9％蔗糖，1.17mM EDTA，pH 5.2)中。评估了所有测试物品的低(10mg/kg)和高(40mg/kg)目标递送剂量。将测试物品作为气溶胶通过吸入施用于Charles River Sprague-Dawley大鼠。每个测试物品的气溶胶由市售的振动网状雾化器产生，其输出连接到仅鼻的暴露系统。
通过调节气溶胶暴露时间来实现目标剂量，同时保持气溶胶浓度恒定。低剂量组的动物在20分钟的暴露期间接受单剂量的测试物品，以达到10mg/kg的目标递送剂量和1mg/kg的沉积剂量。高剂量组的动物在75分钟的暴露期间接受单剂量的测试物品，以达到40mg/kg的目标递送剂量和4mg/kg的目标沉积剂量。
通过BCA分析方法测定气溶胶中总ORP-100的浓度，低剂量组的浓度范围为601.1–868.0μg/L，高剂量组的浓度范围为708.7–798.0μg/L。由级联冲击器分析确定，气溶胶颗粒大小在3.0微米MMAD以下(图9，左)。低剂量的氧化ORP-100和还原ORP-100和ORP100S实现的沉积剂量分别为0.9、1.2和1.2mg/kg；高剂量组分别为3.8、3.8和4.2mg/kg，假设沉积分数为10％。对于所有剂量组，实际沉积剂量在目标的25％以内。
通过测量各种参数评估每个研究组中动物的潜在毒性，这些参数包括：临床体征、体重、临床病理学(BALF细胞计数、LDH和白蛋白测量值)、肺组织细胞因子、肺重量、宏观病理学(gross pathology)和呼吸道靶组织的微观病理学。此外，收集了每个低剂量组中三只动物的肺组织用于免疫组织化学(Alizèe Pathology,Thurmont,MD)。每个低剂量组中的三(3)只动物将在暴露后1小时和4小时处以安乐死以收集血液和组织。每个高剂量组中的四(4)只动物将在暴露后4小时和20小时处以安乐死以收集血液和组织。
表5暴露和处死研究设计
Figure BDA0003829764700000631
当将还原的ORP-100和ORP100S与氧化的ORP-100对照组进行比较时，BALF LDH、白蛋白、细胞计数和分类计数的差异并不显著，各种肺组织细胞因子的测量值也是如此。虽然低剂量组的LDH水平略高，但LDH水平在测试品和剂量组之间是可变的，没有明显的趋势。对于所有剂量组，白蛋白水平在1小时时间点最高，但在暴露后4小时和20小时，所有测试品和剂量组间的白蛋白水平相似。
无论剂量水平或评估时间如何，三种测试物品间的BALF总细胞通常相似。巨噬细胞是在BALF中观察到的最普遍的细胞类型，并且在三个测试品间没有显示出明显的趋势。在所有时间点，大多数组的淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数均较低；然而，在20小时处死的所有高剂量组中观察到略高的细胞计数。BALF％-巨噬细胞在所有低剂量的1和4小时时间点以及高剂量的4小时动物中相似。与其他采样时间相比，BALF％-巨噬细胞在20小时时间点略有下降。
主要是，与低剂量组相比，所有高剂量组中％-中性粒细胞的增加解释了％-巨噬细胞的减少。然而，这些变化与在氧化ORP-100对照组中观察到的相似。TA和剂量组之间的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞差异是可变的，没有明显的趋势。
所有动物都存活到尸检；宏观病理学发现通常很少，严重程度低，并且主要由肺的轻微红色变组成。常见的显微镜发现由罕见到少数散在的单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润。这些发现在所有组的动物中都观察到，被认为是背景，并被解释为在测试品暴露之前发生或者是处死过程中的人工产物。
总体而言，在暴露于10mg/kg和40mg/kg的目标递送剂量的氧化ORP-100和还原ORP-100或还原ORP100S测试品，并在暴露后1、4或20小时进行检查的Sprague Dawley大鼠的临床观察、BALF化学、细胞计数、细胞差异、肺组织细胞因子、肉眼发现(macroscopicfindings)或显微镜肺改变中，没有证据表明试验品的不良影响。然而，本研究使用了蔗糖/EDTA制剂，开发该制剂是为了在以还原形式冻干时赋予硫氧还蛋白最大程度的氧化还原稳定性(PCT WO 2006/090127)，并且蔗糖制剂效果明显，如图9右图所示。在氧化的ORP-100对照(缺乏硫氧还蛋白活性)中诱导了指示炎症的中性粒细胞流入。还原的ORP-100能够部分地减轻制剂效果，而还原的ORP100S几乎完全消除了中性粒细胞的流入。
本研究设计中不包括仅载剂组，因此，不可能分开蔗糖/EDTA制剂本身对BALF细胞计数和细胞因子的影响。然而，当在气管内递送的情况下考虑时(Rancourt,R.C.等人,2007,Reduced thioredoxin increases proinflammatory cytokines and neutrophilinflux in rat airways:modulation by airway mucus,Free Radic Biol Med 42,1441-53)，所述气管内递送表明在生理盐水中配制的氧化的硫氧还蛋白失活的蛋白对照与单独的生理盐水具有相同的BALF细胞计数和细胞因子结果，本研究的结果(显示来自氧化的ORP-100失活蛋白对照组的最大反应)与负责观察到的剂量依赖性炎性反应的蔗糖/EDTA制剂一致，而这些反应被还原的ORP100S消除。
本文公开的示例性发明可以在不存在本文未具体公开的任何元素的情况下适当地实施。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的许多变化、改变、修改、其他用途和应用是可能的，并且本发明还涵盖不背离本发明的精神和范围的变化、改变、修改、其他用途和应用，本发明仅受所附权利要求的限制。
出于说明和描述的目的，提出了本发明的前述讨论。前述内容并非旨在将本发明限制于本文所公开的一种或多种形式。例如，在本发明的前述具体实施方式中，本发明的各种特征在一个或多个实施方案中组合在一起，以简化公开内容。本发明的实施方案的特征可以组合上面讨论的那些以外的替代实施方案中。这种公开方法不应被解释为反映了要求保护的发明需要比每项权利要求中明确列举的更多特征的意图。相反，如以下权利要求所反映的，创造性方面不在于单个前述公开的实施方案的所有特征。因此，以下权利要求在此并入本发明的具体实施方案中，每项权利要求作为本发明的单独的优选实施方案独立存在。
此外，尽管本发明的描述已经包括一个或多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但其他变化、组合和修改也在本发明的范围内，例如在理解了本公开之后，在本领域技术人员的技术和知识范围内。旨在获得包括在允许范围内的替代实施方案的权利，包括权利要求的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，无论这种替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文公开，并且不旨在专注于任何可专利的主题。
序列表
<110> 彼得·B·海菲茨(PETER B. HEIFETZ )
哈伊姆·莫斯科维茨(HAIM MOSKOWITZ)
<120> 具有硫氧还蛋白活性的组合物及相关方法
<130> 7579-2-PROV
<140> 未分配
<141> 2015-11-04
<160> 29
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<400> 1
Cys Gly Pro Cys
1
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 2
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Xaa Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val
100 105
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<400> 3
Trp Cys Gly Pro Cys Lys
1 5
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 丁香假单胞菌
<400> 4
Met Ser Asn Asp Leu Ile Lys His Val Thr Asp Ala Ser Phe Glu Ala
1 5 10 15
Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Val Leu Val Asp Tyr Trp Ala Glu
20 25 30
Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Val Leu Asp Glu Ile Ala
35 40 45
Thr Thr Tyr Ala Gly Lys Leu Thr Ile Ala Lys Leu Asn Ile Asp Glu
50 55 60
Asn Gln Glu Thr Pro Ala Lys His Gly Val Arg Gly Ile Pro Thr Leu
65 70 75 80
Met Leu Phe Lys Asn Gly Asn Val Glu Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu
85 90 95
Ser Lys Ser Gln Leu Ala Ala Phe Leu Asp Ala Asn Ile
100 105
<210> 5
<211> 104
<212> PRT
<213> 牙龈卟啉单胞菌
<400> 5
Met Ala Leu Gln Ile Thr Asp Ala Thr Phe Asp Gly Leu Val Ala Glu
1 5 10 15
Gly Lys Pro Met Val Val Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Val Gly Pro Ile Ile Asp Glu Leu Ala Ala Glu Tyr Glu Gly
35 40 45
Arg Ala Ile Ile Gly Lys Val Asp Val Asp Ala Asn Thr Glu Leu Pro
50 55 60
Met Lys Tyr Gly Val Arg Asn Ile Pro Thr Ile Leu Phe Ile Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Val Val Lys Lys Leu Val Gly Ala Gln Ser Lys Asp Val Phe
85 90 95
Lys Lys Glu Leu Asp Ala Leu Phe
100
<210> 6
<211> 103
<212> PRT
<213> 单核细胞增生李斯特菌
<400> 6
Met Val Lys Glu Ile Thr Asp Ala Thr Phe Glu Gln Glu Thr Ser Glu
1 5 10 15
Gly Leu Val Leu Thr Asp Phe Trp Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Arg
20 25 30
Met Val Ala Pro Val Leu Glu Glu Ile Gln Glu Glu Arg Gly Glu Ala
35 40 45
Leu Lys Ile Val Lys Met Asp Val Asp Glu Asn Pro Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Ser Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Ile Lys Lys Asp Gly
65 70 75 80
Glu Val Val Glu Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Pro Lys Glu Glu Leu Asp
85 90 95
Glu Val Ile Asn Lys Tyr Val
100
<210> 7
<211> 103
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 7
Met Val Thr Gln Phe Lys Thr Ala Ser Glu Phe Asp Ser Ala Ile Ala
1 5 10 15
Gln Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Thr Trp Cys Gly Pro
20 25 30
Cys Lys Met Ile Ala Pro Met Ile Glu Lys Phe Ser Glu Gln Tyr Pro
35 40 45
Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Gly Asp Val Ala
50 55 60
Gln Lys Asn Glu Val Ser Ala Met Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Val Ala Lys Val Val Gly Ala Asn Pro Ala Ala Ile Lys
85 90 95
Gln Ala Ile Ala Ala Asn Ala
100
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> 原鸡(Gallus gallus)
<400> 8
Met Val Lys Ser Val Gly Asn Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Leu Lys
1 5 10 15
Ala Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys
35 40 45
Phe Gly Asp Val Val Phe Ile Glu Ile Asp Val Asp Asp Ala Gln Asp
50 55 60
Val Ala Thr His Cys Asp Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Lys Asn Gly Lys Lys Val Gln Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Glu Thr Ile Lys Ser Leu Val
100 105
<210> 9
<211> 105
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Ser Ile Thr Glu Tyr Ala
100 105
<210> 10
<211> 105
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 10
Met Val Lys Leu Ile Glu Ser Lys Glu Ala Phe Gln Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ala Asp Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Thr Glu Phe Ala
100 105
<210> 11
<211> 105
<212> PRT
<213> 家牛
<400> 11
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Tyr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asn
1 5 10 15
Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ala Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Ile
100 105
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val
100 105
<210> 13
<211> 134
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 13
Met Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val Phe Gly Ser Gly Glu Asp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Thr Glu Ser Ser Glu Pro Ser Arg Val Leu Lys Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Ala Arg Trp Gln Leu His Phe Asn Glu Ile Lys Glu Ser Asn
35 40 45
Lys Leu Leu Val Val Asp Phe Ser Ala Ser Trp Cys Gly Pro Cys Arg
50 55 60
Met Ile Glu Pro Ala Ile His Ala Met Ala Asp Lys Phe Asn Asp Val
65 70 75 80
Asp Phe Val Lys Leu Asp Val Asp Glu Leu Pro Asp Val Ala Lys Glu
85 90 95
Phe Asn Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Val Leu Val Lys Arg Gly Lys
100 105 110
Glu Ile Glu Arg Ile Ile Gly Ala Lys Lys Asp Glu Leu Glu Lys Lys
115 120 125
Val Ser Lys Leu Arg Ala
130
<210> 14
<211> 167
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 14
Met Ala Met Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Leu His Ala Pro Ala
1 5 10 15
Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Val Gly Asn Leu Val Leu Pro Ser Lys
20 25 30
Arg Ala Leu Ala Pro Leu Ser Val Gly Arg Val Ala Thr Arg Arg Pro
35 40 45
Arg His Val Cys Gln Ser Lys Asn Ala Val Asp Glu Val Val Val Ala
50 55 60
Asp Glu Lys Asn Trp Asp Gly Leu Val Met Ala Cys Glu Thr Pro Val
65 70 75 80
Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Arg Met Ile Ala
85 90 95
Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Thr Cys
100 105 110
Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn Val Ala Ser Thr Tyr Gly
115 120 125
Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Ile Phe Lys Gly Gly Glu Lys Lys
130 135 140
Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Ser Thr Leu Thr Thr Leu Ile
145 150 155 160
Asp Lys Tyr Ile Gly Ser Ser
165
<210> 15
<211> 172
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 15
Met Ala Leu Glu Thr Cys Phe Arg Ala Trp Ala Thr Leu His Ala Pro
1 5 10 15
Gln Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ser Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ser Gly
20 25 30
Ala Gly Ser Ser Gln Ser Lys Pro Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro Ser
35 40 45
Pro Leu Arg Pro Ala Ser Arg Phe Ala Cys Gln Cys Ser Asn Val Val
50 55 60
Asp Glu Val Val Val Ala Asp Glu Lys Asn Trp Asp Ser Met Val Leu
65 70 75 80
Gly Ser Glu Ala Pro Val Leu Val Glu Phe Trp Ala Pro Trp Cys Gly
85 90 95
Pro Cys Arg Met Ile Ala Pro Val Ile Asp Glu Leu Ala Lys Glu Tyr
100 105 110
Val Gly Lys Ile Lys Cys Cys Lys Val Asn Thr Asp Asp Ser Pro Asn
115 120 125
Ile Ala Thr Asn Tyr Gly Ile Arg Ser Ile Pro Thr Val Leu Met Phe
130 135 140
Lys Asn Gly Glu Lys Lys Glu Ser Val Ile Gly Ala Val Pro Lys Thr
145 150 155 160
Thr Leu Ala Thr Ile Ile Asp Lys Tyr Val Ser Ser
165 170
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 16
Cys Xaa Xaa Cys
1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(4)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 17
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 18
Cys Gly Pro Xaa
1
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 19
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 20
Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 21
Xaa Cys Gly Pro Xaa Xaa
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 22
Xaa Cys Gly Pro Cys Xaa
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 23
Trp Cys Gly Pro Xaa Lys
1 5
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 24
Cys Xaa Xaa Ser
1
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 25
Xaa Cys Xaa Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = 除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 26
Xaa Cys Gly Pro Ser Xaa
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<400> 27
Trp Cys Gly Pro Ser Lys
1 5
<210> 28
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> Xaa是除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa是除半胱氨酸之外的任何氨基酸
<400> 28
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Xaa Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Xaa Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ser Glu Xaa Glu Val Lys Xaa Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val
100 105
<210> 29
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽基序
<400> 29
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Ser Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Ser Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ser Glu Ser Glu Val Lys Ser Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val
100 105

Claims (74)

1.一种降低具有过度粘稠或粘性的粘液或痰的患者中粘液或痰的粘弹性的方法，所述方法包括使患者的粘液或痰与包含蛋白质或肽的组合物接触，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端位置的单个半胱氨酸残基外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
2.一种药物组合物，其包含：
a.蛋白质或肽，其包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端位置的单个半胱氨酸残基外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基；和
b.药学上可接受的赋形剂。
3.一种组合物，其包含：
A.蛋白质或肽,其包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点；和
b.具有至少约3mmHg的蒸气压的水性溶剂。
4.一种药物组合物，其基本上由以下组成：
a.蛋白质或肽,其包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点；
b.水；和
c.氯化钠。
5.一种制备干燥组合物的方法，所述方法包括：
a.提供一种水性组合物，其包含蛋白质或肽和水性溶剂，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点，所述水性溶剂具有至少约3mmHg的蒸气压；和
b.使水性溶剂挥发以产生包含蛋白质或肽的干燥组合物。
6.一种组合物，其基本上由蛋白质或肽和生理盐水组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
7.一种组合物，其基本上由蛋白质或肽组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物是干粉。
8.一种治疗受试者中炎症的方法，其包括向具有炎症或处于发生炎症的风险的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
9.一种治疗受试者中细菌感染的方法，其包括向具有细菌感染或处于发生细菌感染的风险的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
10.一种组合物，其包含可操作地激活一种或多种内源性抗微生物肽的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中所述激活产生治疗有效试剂来治疗或预防感染性疾病的。
11.一种调节受试者的微生物组组成的方法，其包括向受试者的粘膜表面局部施用包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
12.一种确定含有单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽的二硫键还原活性的方法,其包括选择含有单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽，该蛋白质或肽除了硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点内的单个半胱氨酸残基外不含有任何半胱氨酸残基；以及测量蛋白质或肽的整体半胱氨酸硫醇还原状态。
13.一种治疗病毒性呼吸道疾病的方法，其包括向患有病毒性呼吸道疾病或有发生病毒性呼吸道疾病风险的受试者施用包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
14.一种在有需要的受试者中减轻与病毒感染相关的肺炎症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含蛋白质或肽的药物组合物，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点。
15.一种包含蛋白质或肽的组合物，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，其中所述组合物不包含大于约400nm波长具有UV吸光度的硫氧还蛋白的蛋白质级分。
16.一种产生包含蛋白质或肽的组合物的方法，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点，所述方法包括：提供包含蛋白质或肽的裂解物，所述蛋白质或肽包含硫氧还蛋白活性位点；浓缩裂解物中的蛋白质或肽；以及去除在大于约400nm处具有吸光度的硫氧还蛋白的肽或蛋白质级分，以产生组合物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法或组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点是硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其包含选自以下的氨基酸序列：C-X-X-S(SEQ ID NO:24),C-X-X-X(SEQ ID NO:17),X-C-X-X-X-X(SEQ ID NO:19),X-C-G-P-X-X(SEQ ID NO:21),W-C-G-P-X-K(SEQ ID NO:23),X-C-X-X-S-X(SEQ ID NO:25),X-C-G-P-S-X(SEQ IDNo:26)和W-C-G-P-S-K(SEQ ID NO:27)，其中X残基是除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法或组合物，其中所述蛋白质或肽包含与SEQID NO:28或SEQ ID NO:29至少约80％相同的序列，其中硫氧还蛋白活性位点是硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其位于对应于SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置32-35的位置。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法或组合物，其中所述蛋白质或肽包含SEQID NO：28或SEQ ID NO：29的序列。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有肺疾病，其中粘液或痰的异常或过度粘稠或凝聚是所述疾病的症状或原因。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有肺疾病，其中粘液或痰的异常或过度粘度或粘性与生物还原剂活性不足相关。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有选自以下的疾病：囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、哮喘、鼻窦炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、干眼病和消化道疾病。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有囊性纤维化。
24.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自以下的途径将组合物引入患者进行使患者的粘液或痰与组合物接触的步骤：鼻、气管内、支气管、直接设置到肺、吸入、口和眼。
25.根据权利要求1所述的方法，其中待接触的粘液或痰在患者的呼吸道中。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
27.根据权利要求1所述的方法，其中在使患者的粘液或痰与组合物接触的步骤之后，与接触步骤之前相比，患者的用力呼气量(FEV)增加至少约2.5％。
28.权利要求1所述的方法，其中含有硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的蛋白质或肽与粘液蛋白中的半胱氨酸残基共价结合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述粘液蛋白是粘蛋白。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述粘液蛋白是呼吸道粘液蛋白。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包括人硫氧还蛋白。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者是人。
33.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述蛋白质或肽包含SEQ ID NO：1的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点序列。
34.根据权利要求2、8或9中任一项所述的药物组合物或方法，其中所述药物组合物被配制用于通过选自以下的途径施用于患者：口、直肠、鼻、吸入、气管内、支气管、直接滴注、局部和眼。
35.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述水性溶剂选自乙酸铵、碳酸氢铵、甲酸铵、乙酸三乙铵和碳酸氢三乙铵。
36.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述水性溶剂是乙酸铵。
37.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述水性溶剂的浓度在约1mM和约50mM之间。
38.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述水性溶剂具有约4至约7之间的pH。
39.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述组合物不包含糖或糖衍生物。
40.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中所述水性组合物除蛋白质或肽以外，不包含蒸汽压小于约3mmHg的任何化合物。
41.根据权利要求3或4中任一项所述的组合物，其中除硫氧还蛋白活性位点中的一个或两个半胱氨酸残基以外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
42.根据权利要求3、4、14或15中任一项所述的组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点包含选自以下的氨基酸：C-X-X-C(SEQ ID NO:16),X-C-X-X-C-X(SEQ ID NO:20),X-C-G-P-C-X(SEQ ID NO:22),W-C-G-P-C-K(SEQ ID NO:3),其中X残基是除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基。
43.根据权利要求3或4中任一项所述的组合物，其中所述硫氧还蛋白活性位点是单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点。
44.根据权利要求3或5中任一项所述的组合物或方法，其中除了在硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端的单个半胱氨酸残基以外，所述蛋白质或肽不包含任何半胱氨酸残基。
45.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述氯化钠以每1升水约9克氯化钠存在。
46.根据权利要求5所述的方法，其中所述挥发步骤包括使所述组合物经受选自以下的条件：减压、升高温度及其组合。
47.根据权利要求5所述的方法，其中所述挥发步骤在非氧化气氛下进行。
48.根据权利要求5所述的方法，其中所述挥发步骤在氮气氛下进行。
49.根据权利要求5所述的方法，其中所述挥发步骤包括冻干。
50.根据权利要求5所述的方法，进一步包括将干燥的药物组合物溶解在稀释剂中。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述稀释剂是具有约4至约7之间的pH的盐水溶液。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述溶解的药物组合物在约25℃的温度下至少80％以还原形式稳定至少约1天。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述溶解的药物组合物至少80％以还原形式稳定至少约1周。
54.根据权利要求5所述的方法，其中所述硫氧还蛋白包含单半胱氨酸硫氧还蛋白活性位点。
55.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物包含蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点，其中所述蛋白质或肽除了硫氧还蛋白单半胱氨酸活性位点的N-末端的单个半胱氨酸残基外，不包含任何半胱氨酸残基。
56.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物由蛋白质或肽和生理盐水组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
57.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质或肽的施用抑制促炎细胞因子的释放。
58.根据权利要求8所述的方法，其中所述促炎细胞因子选自IL-8、IL-1β、IL-6和TNFα。
59.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物包含表达所述蛋白质或肽的微生物细胞的粗提物或纯化提取物。
60.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗微生物肽是防御素。
61.根据权利要求11所述的方法，其中所述粘膜表面是肺表面。
62.根据权利要求11所述的方法，其中所述粘膜表面是鼻咽表面。
63.根据权利要求11所述的方法，其中所述粘膜表面是胃肠道表面。
64.根据权利要求12所述的方法，其中使用选自以下的方法测量所述半胱氨酸硫醇还原状态：显色测定法、荧光测定法和浊度测定法。
65.根据权利要求12所述的方法，其中所述显色测定法是DTNB测定法。
66.根据权利要求13所述的方法，其中所述病毒性呼吸道疾病选自：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-19或COVID-19)、流感、与哮喘、肺炎、支气管炎、肺结核、反应性气道疾病综合征和间质性肺病相关的病毒感染。
67.根据权利要求13或14中任一项所述的方法，其中所述病毒性呼吸道疾病可由选自以下的病毒引起：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和呼吸道腺病毒。
68.根据权利要求13或14中任一项所述的方法，其中所述组合物以选自以下的形式施用：喷雾形式和雾化形式。
69.根据权利要求15所述的组合物，其中包含硫氧还蛋白活性位点的蛋白质或肽处于还原状态，并且其中所述组合物还包含具有至少约3mmHg的蒸气压的水性溶剂。
70.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物基本上由蛋白质或肽、水和氯化钠组成，所述蛋白质或肽包含还原状态的硫氧还蛋白活性位点。
71.根据权利要求7或15所述的组合物，其中所述组合物被干燥至水含量小于约3.0wt.％。
72.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物包含在小于约300nm的光波长处具有吸光度的肽或蛋白质级分。
73.根据权利要求16所述的方法，其中所述去除步骤包括疏水相互作用色谱法。
74.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括将所述组合物干燥至小于约3.0wt.％的水含量。
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