KR20150061030A

KR20150061030A - 소 과립구 콜로니 자극 인자 및 그의 변이체를 위한 제제

Info

Publication number: KR20150061030A
Application number: KR1020157012907A
Authority: KR
Inventors: 주앙 다바그니노; 캐서린 응안 카; 앨런 보스캠프 클로츠
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2010-09-23
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2015-06-03
Also published as: JP2013538828A; KR101563852B1; CN103096916A; WO2012040421A1; SG188287A1; US20220152155A1; MY161665A; IL224848A; CA2812704A1; CL2013000771A1; NZ608164A; CN103096916B; TW201305194A; KR20130055665A; ES2540862T3; AU2011305386B2; EA026073B1; AU2011305386A1; PL2618830T3; CO6690780A2

Abstract

본 발명은 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 완충제 물질 및 부형제를 포함하고, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는 안정한 수성 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 제제의 동결건조 또는 분말화 형태의 사용 방법 및 제제의 제조 방법을 제공한다.

Description

소 과립구 콜로니 자극 인자 및 그의 변이체를 위한 제제 {FORMULATIONS FOR BOVINE GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR AND VARIANTS THEREOF}

과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)는 성장 호르몬 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이다. G-CSF는 특정한 골수 전구체 세포의 증식 및 과립구로의 그의 분화를 자극한다. 또한, G-CSF는 호중구 증식 및 생체내 성숙을 위해 유력한 자극제이다 (문헌 [Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 2484-2488]; [Heidari et al., Vet. Immol. Immunopathol. 2001; 81:45-57] 참조). G-CSF는 또한 시험관내에서 성숙한 호중구의 기능적 활성화 또는 "프라이밍(priming)"을 유도할 수 있다 (문헌 [Weisbart, R. H. et al., Annals of Internal Medicine 1989; 110: 297-303]). G-CSF는 인간 과립구를 자극하고, 화학주성 펩티드 N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌에 의해 자극되는 슈퍼옥시드 방출을 향상시키고 (문헌 [S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144: 1143-1146] 및 [C. F. Nathan, Blood 1989; 74:301-306]), 인간 호중구 IgA 매개 식세포작용을 활성화 (문헌 [Weisbart, R. H. et al., Nature 1988; 332: 647-649])하는 것으로 밝혀졌다.

G-CSF는 호중구의 증가가 이로움을 주는 징후를 치료하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. G-CSF는 또한, 배양액에서 세포의 성장 또는 팽창을 위해, 예를 들어 골수 이식을 위해 단독으로 또는 다른 화합물 (예컨대 다른 시토카인)과 조합으로 유용하다.

재조합 인간 G-CSF (hG-CSF)의 cDNA 클로닝 및 발현이 설명되어 있으며, 재조합 hG-CSF는 천연 분자의 생물학적 성질을 대부분 (전부가 아니라면)을 나타낸다 (문헌 [Souza, L. et al., Science 232, 61-65 (1986)]). cDNA 및 게놈 DNA 클론의 서열 분석은, 아미노산 서열을 추론할 수 있도록 하고, 단백질이 30개 아미노산의 신호 서열을 가진 204개 아미노산 길이임을 나타낸다. 성숙한 단백질은 174개 아미노산 길이이고, 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위를 갖지 않지만 O-결합 글리코실화를 위해 몇 개의 가능한 부위를 갖고 있다.

hG-CSF를 함유한 제약 조제물이 당업계에 공지되어 있고, 이에는 다수의 제제가 포함된다. 예를 들어, hG-CSF의 다양한 제제가 문헌 [Piedmonte et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 60: 50-58 (2008)], [Herman et al., Formulation, Characterization and Stability of Protein Drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York (1996)], 미국 특허 5,919,757 (Michaelis et al.) 및 미국 특허 6,908,610 (Sato et al.)에 기재되어 있다. 전통적으로, 계면활성제가 hG-CSF 제제에 포함되고, 잠재적 탈안정화 계면에서 가공 동안에 겪게 되는 표면에 대해, 그리고 그의 입체형태적 안정성의 변경에 대해 hG-CSF를 보호할 수도 있다.

재조합 소 G-CSF (bG-CSF)의 cDNA 클로닝 및 발현이 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 성숙한 bG-CSF의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 미국 특허 5,849,883에 제시되어 있으며, 이것은 폴리펩티드 및 그의 유사체를 클로닝하고, 단리하고 정제하기 위한 방법을 설명한다. 성숙한 bG-CSF는 174개 아미노산 길이이고, hG-CSF에 대해 82% 상동성을 갖는다. 문헌 [Heidari et al. 상기]은 bG-CSF의 발현, 정제 및 생물학적 활성을 설명한다.

소에 bG-CSF를 투여하면 치료 이점을 제공할 수 있다. 따라서, 치료 잠재성을 이용하기 위하여 bG-CSF를 함유한 제약 제제가 바람직하다. 그러나, 당업계에 공지된 전통적인 방법에 따라 개발된 bG-CSF 제약 제제는, bG-CSF 폴리펩티드 및/또는 제제의 응집 및 탈안정화와 같은 바람직하지 못한 생성물 성질을 갖는다.

따라서, 바람직한 성질, 예컨대 최소의 생성물 응집 및 탈안정화 성질을 가진 안정한 bG-CSF 제약 제제가 요구되고 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 성질을 나타내고 또한 관련된 장점을 제공하는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 가진 안정한 수성 제약 제제를 제공한다.

본 발명은 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 완충제 물질 및 부형제를 포함하고, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는 안정한 수성 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 동결건조되거나 분말 형태의 제제의 사용 방법 및 제제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 바람직한 성질을 나타내고 또한 관련된 장점을 제공하는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 가진 안정한 수성 제약 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 소 과립구 콜로니 자극 인자 ("bG-CSF")의 안정한 수성 제제는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유한다. 여기에서 사용된 "소 G-CSF 폴리펩티드" (대안적으로 "bG-CSF 폴리펩티드", "소 G-CSF" 또는 "bG-CSF"라 일컬어짐) 및 그의 변이체는, 그의 생물학적 활성과 무관하게, 또한 시험관내에서, 생체내에서 핵산 분자의 마이크로주입, 합성, 트랜스제닉 및 유전자 활성화 방법에 의한 재조합 (cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 다른 형태로부터 생성됨을 막론함)을 포함하나 이에 한정되지 않는 합성 또는 제조 방법과는 무관하게, CSF, bG-CSF 유사체, bG-CSF 돌연변이체, 변경된 글리코실화 bG-CSF, PEG 접합 bG-CSF, bG-CSF 이소형, bG-CSF 모방체, bG-CSF 단편, 하이브리드 bG-CSF 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 상동체, 글리코실화 패턴 변이체, 그의 변이체, 스플라이스 변이체, 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질을 포함해야 한다. 추가로, 용어 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 bG-CSF 폴리펩티드를 포함한다. 소 G-CSF의 유사체의 예에 관해서는 미국 특허 5,849,883 참조. 성숙한 bG-CSF 폴리펩티드의 서열은 174개 아미노산 길이이고 다음과 같다:

또한, 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 가진 bG-CSF 폴리펩티드는 다음과 같다:

bG-CSF에서 매우 다양한 아미노산 위치에서의 치환이 설명되어 있다. 이에 한정되지 않지만 제약상 안정성을 조절하고, 효능제 활성을 증가시키고, 프로테아제 저항성을 증가시키고, 폴리펩티드를 길항제로 전환하는 것 등을 포함하는 치환이 용어 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 의해 포함된다.

용어 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 글리코실화 bG-CSF, 예컨대 이에 한정되지 않지만 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩티드, 폴리펩티드의 N-연결 글리코실화 형태, 또는 폴리펩티드의 O-연결 글리코실화 형태를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 함유하는 변이체는 bG-CSF 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체로서 간주된다. 또한, 단일 뉴클레오티드 변화를 함유하는 변이체는 bG-CSF의 생물학적 활성 변이체로서 간주된다. 추가로, 스플라이스 변이체가 또한 포함된다. 용어 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 또한 화학적 수단에 의해 연결되거나 융합 단백질로서 발현되는, 임의의 하나 이상의 bG-CSF 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 임의 유형의 다른 활성 분자의 bG-CSF 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체, 또는 동종다량체를 포함할 뿐만 아니라 (예를 들어, 미국 특허 6,261,550; 6,166,183; 6,204,247; 6,261,550; 및 6,017,876 참조) 예를 들어 특정한 결실 또는 다른 변형을 함유하면서도 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드 유사체를 포함한다 (예를 들어 미국 특허 6,261,550; 6,004,548; 및 6,632,426 참조). bG-CSF 폴리펩티드 및 그의 변이체는 예를 들어 미국 특허 출원 12/507,237 (현, 미국 특허 출원 공개 2010/0035812) (본원에서 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 코딩 아미노산이 bG-CSF의 하기 위치; 8, 62, 69, 125, 133, 136 및 그의 임의의 조합의 하나 이상에 혼입된다 (성숙한 bG-CSF 폴리펩티드 또는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 가진 bG-CSF 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 비-천연 코딩 아미노산 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF)은 하기 위치: S8, S62, L69, G125, T133, A136 및 그의 임의의 조합 중 하나에서 천연 코딩 아미노산을 대체한다 (성숙한 bG-CSF 폴리펩티드 또는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 가진 bG-CSF 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산).

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-S8pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 S8에서 이루어진다.

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-S62pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 S62에서 이루어진다.

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-L69pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 L69에서 이루어진다.

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-G125pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 G125에서 이루어진다.

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-T133pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 T133에서 이루어진다.

하나의 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 하기 서열을 가진 bG-CSF-A136pAF이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 A136에서 이루어진다.

본 발명의 제제는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 링커, 중합체 및 생물학적 활성 분자는 미국 특허 출원 12/507,237 (현재 미국 특허 출원 공개 2010/0035812)에 기재되어 있다. 용어 "결합" 또는 "링커"는 화학 반응의 결과로서 형성되고 전형적으로 공유 결합인 기 또는 결합을 가리키기 위해 사용된다. 가수분해적으로 안정한 결합은, 결합이 실질적으로 물에서 안정하고 이에 한정되지 않지만 생리학적 조건하에서를 포함하여 유용한 pH 값에서 장기간 동안, 아마도 심지어 무한정으로 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은, 결합이 물 또는 예를 들어 혈액을 포함한 수용액에서 분해될 수 있음을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은, 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있음을 의미한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, PEG 및 관련된 중합체는 중합체 백본에서 또는 중합체 백본과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 관능기 사이의 링커 기에서 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알콜 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건 하에서 가수분해되어 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 결합은, 이에 한정되지 않지만 카르보네이트 결합; 아민과 알데히드의 반응으로부터 얻어진 이민 결합; 알콜을 포스페이트 기와 반응시킴으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합; 알데히드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 이에 한정되지 않지만 PEG와 같은 중합체의 말단에서를 포함하는 아민 기와 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 이에 한정되지 않지만 중합체의 말단에서를 포함하는 포스포르아미다이트 기 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.

일부 실시양태에서, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 수용성 중합체에 결합된다. 여기에서 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매에서 가용성인 중합체를 가리킨다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 대한 수용성 중합체의 결합에 의하여, 이에 한정되지 않지만 증가되거나 조절된 혈청 반감기, 변형되지 않은 형태에 비해 증가되거나 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 연합 특징, 예컨대 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 변경된 결합, 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하는 변화가 일어날 수 있다. 수용성 중합체는 그의 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않을 수도 있고, 이에 한정되지 않지만 하나 이상의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하는 다른 물질에 bG-CSF를 결합시키기 위한 링커로서 사용될 수도 있다. 적절한 중합체는 이에 한정되지 않지만 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (미국 특허 5,252,714에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레 안히드라이드, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 술페이트를 포함한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고당, 글리칸, 셀룰로스 및 이에 한정되지 않지만 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하여 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 상기와 같은 수용성 중합체의 예는 이에 한정되지 않지만 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함한다. WO 03/074087 및 WO 03/074088은 단백질 또는 소분자의 히드록시알킬 전분 (HAS)에의 컨쥬게이션을 기재한다. 히드록시알킬 전분의 예는 이에 한정되지 않지만 히드록시에틸 전분을 포함한다. 히드록시알킬 전분과 다른 분자의 컨쥬게이션은 예를 들어 HAS의 말단 알데히드 기와 다른 분자의 반응성 기 간의 공유 결합을 포함할 수도 있다.

일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 수용성 중합체는 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 약 10 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 수용성 중합체는 약 15 kDa 내지 약 25 kDa의 분자량을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 수용성 중합체는 약 20 kDa의 분자량을 갖는다. 당업자라면, "약 20 kDa"의 분자량을 가진 수용성 중합체가 해당 모이어티의 다분산 및 상세를 기초로 하여 약 15%의 분자량 가변성 (즉, 약 17 kDa 내지 약 23 kDa)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 S8에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-S8pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 S8에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 S62에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-S62pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 S62에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 L69에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-L69pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 L69에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 G125에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-G125pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 G125에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 T133에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-T133pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 T133에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서, 단일 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF) 치환은 위치 A136에서 이루어지고, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티에 결합된다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 약 20 kDa의 분자량을 갖는다면, 이러한 실시양태에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 "bG-CSF-A136pAF-20K PEG"로서 확인될 수 있고, 이것은 20 kDa 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티가 위치 A136에서 이루어진 pAF 치환에 결합됨을 나타낸다.

여기에서 사용된 바와 같이, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는 제제의 맥락에서 용어 "안정성" 및 "안정한"이란, 주어진 제조, 준비, 운송 및 보관 조건 하에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 열적 및 화학적 풀림(unfolding), 응집, 분해, 변성, 단편화 또는 탈활성화를 가리킨다. 본 발명의 "안정한" 제제는 구조적 일체성을 유지하고, 그 결과 주어진 제조, 준비, 운송 및 보관 조건 하에서 생물학적 활성, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 초과의 활성을 유지한다. 제제의 안정성은 당업자에게 공지되어 있고 본원에 설명된 방법에 의하여 응집 정도, 탈페길화, 분해, 변성 또는 단편화 정도에 의해 평가될 수 있다.

여기에서 사용된, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는 제제의 맥락에서의 용어 "수성"은 물, 하나 이상의 수용성 유기 용매 또는 그의 혼합물을 가리킨다. 용어 "유기 용매"는 본원에서, 수소 원자, 탄소 원자, 및 임의로 다른 원자를 함유하는 분자 구조를 가지며, 고체 기체 또는 액체를 용해시킬 수 있는 액체 유기 화합물, 전형적으로 액체, 바람직하게는 비교적 비-점성 액체 형태의 단량체 유기 물질을 가리키는 그의 통상적인 의미로 사용된다.

본 발명의 제약 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 투여되는 특별한 조성물에 의해 부분적으로 결정될 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특별한 방법에 의해 결정된다 (예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참조). 적절한 제약상 허용되는 담체는 이에 한정되지 않지만 완충제 물질 및 부형제, 예컨대 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및/또는 그의 조합을 함유하는 것을 포함한다. 적절한 담체는 숙시네이트, 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 히스티딘, 이미다졸, 아세테이트, 비카르보네이트, 및 기타 유기산을 함유하는 완충제 물질일 수 있다. 적절한 담체는 다가 당 알콜, 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, 류신, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알콜, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등 (이노시톨과 같은 시클리톨 포함)을 함유한 부형제; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황-함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오술페이트; 저분자량 폴리펩티드 (즉, 10 미만의 잔기); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 모노사카라이드, 예컨대 크실로스, 만노스, 프룩토스 및 글루코스; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 말토스 및 수크로스; 트리사카라이드, 예컨대 라피노스, 및 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란일 수 있다.

시트레이트, 히스티딘, 말레에이트, 숙시네이트, 포스페이트 또는 그의 조합이 본 발명에 따라 완충제 물질로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시트레이트 또는 숙시네이트가 안정한 수성 제제 중에 완충제 물질로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 완충제 물질은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 몰농도를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 완충제 물질은 약 30 mM의 몰농도를 갖는다. 완충제 물질은 상응하는 유리 산의 형태로 또는 알칼리, 알칼리 토금속 또는 암모늄 염의 형태로 존재할 수 있다. 추가로 제제는 통상적인 제약상 보조 물질을 추가로 함유할 수 있다. 액체 제약 제제의 제조 동안에 다양한 보조 물질 또는 활성 물질의 첨가 순서는 본 발명에서 발견되는 보관 시의 안정화 효과와 대부분 무관하고, 당업자의 판단에 따른다.

염화나트륨, 트레할로스, 소르비톨, 아르기닌 또는 그의 조합이 본 발명에 따른 부형제로서 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 부형제는 아르기닌이다. 일부 실시양태에서, 아르기닌은 약 100 mM 내지 약 500 mM의 몰농도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 아르기닌은 약 200 내지 약 300 mM의 몰농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아르기닌은 약 250 mM의 몰농도를 갖는다.

전통적으로, 단백질의 제약 제제는 계면활성제를 포함한다. 계면활성제의 포함은, 잠재적 탈활성화 계면에서 가공 동안에 겪게 되는 표면에 대해, 그리고 그들의 열역학적 입체형태적 안정성의 변경에 대해 단백질을 보호할 수도 있다. 계면활성제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 폴리소르베이트 계면활성제가 있다. 폴리소르베이트 계면활성제의 하나의 예는 브랜드명 트윈(Tween) 20^®으로 공지된 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트이다. 그러나, 미량의 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 함유하는 bG-CSF 제제에 대한 연구는, 25℃에서 5일의 인큐베이션 후에 응집물이 3.2% (크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 측정됨)까지 증가함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 제제는 계면활성제, 폴리소르베이트 계면활성제, 및/또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는다. 여기에서 사용된 바와 같이, 계면활성제, 폴리소르베이트 계면활성제, 및/또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 "실질적으로 함유하지 않는"이란 용어는 0.033% 미만, 0.001% 미만, 0.0005% 미만, 0.0003% 미만, 또는 0.0001% 미만의 계면활성제, 폴리소르베이트 계면활성제 및/또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 함유하는 제제를 가리킨다. 바람직한 성질, 예컨대 최소의 생성물 응집 및 최소의 탈안정화, 및 적용가능하다면 감소된 탈페길화를 가진 안정한 제제를 달성하기 위하여, 본 발명의 제제는 계면활성제, 폴리소르베이트 계면활성제 및/또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는다.

여기에서 사용된 용어 "생물학적 활성 분자"는, 이에 한정되지 않지만 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포손, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함한 유기체에 관련된 생물학적 체계, 경로, 분자 또는 상호작용의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 물질을 의미한다. 특히, 여기에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 이에 한정되지 않지만 인간 또는 다른 동물에서의 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방을 위한 임의의 물질 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 건강을 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예는 이에 한정되지 않지만 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 백신, 면역원, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종, 올리고뉴클레오티드, 톡소이드, 독소, 원핵 및 진핵 세포, 바이러스, 폴리사카라이드, 바이러스, 박테리아, 곤충 또는 동물 또는 기타 세포 또는 세포 유형으로부터 수득되거나 유래된 핵산 및 그의 일부, 리포솜, 마이크로입자 및 미셀을 포함한다.

본 발명의 제약 제제는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 추가하여 하나 이상의 다른 활성 성분을 임의로 함유하는 것을 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "활성 성분" 또는 "치료 성분"이란 치료 활성 화합물 뿐만 아니라 그의 전구약물, 및 상기 화합물 및 전구약물의 제약상 허용되는 염, 수화물 및 용매화물을 가리킨다. 다른 활성 성분은 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체와 조합될 수 있고, 별도로 또는 동일한 제약 제제에서 투여될 수 있다. 다른 활성 성분의 제공량은 bG-CSF로의 치료를 기준으로 하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 제약 제제는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 추가하여 하나 이상의 다른 불활성 성분을 임의로 함유하는 것을 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "불활성 성분"이란 치료적 불활성 화합물 뿐만 아니라 그의 임의의 전구약물, 및 상기 화합물 및 전구약물의 제약상 허용되는 염, 수화물 및 용매화물을 가리킨다. 다른 불활성 성분은 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체와 조합될 수 있고, 별도로 또는 동일한 제약 제제에서 투여될 수 있다. 다른 불활성 성분의 제공량은 bG-CSF로의 치료를 기준으로 하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

안정한 수성 제제에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 양은 치료 효과를 달성하기에 적절한 양이다. 여기에서 사용된 용어 "치료 유효량"이란 동물에 목적하는 유익을 제공하는 양을 가리키고, 치료 및 예방 투여 둘 모두를 포함한다. 양은 개개인에 따라 다양할 것이고, 환자의 전체 신체 상태 및 치료될 병태의 기본 원인을 포함한 여러 요인에 의존될 것이다. 치료를 위해 사용되는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 양은 허용가능한 변화 속도를 제공하고 유리한 수준에서 원하는 반응을 유지한다. 본 조성물의 치료 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수도 있다. 예를 들어, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 양은 약 0.5 내지 약 12 그램/리터, 바람직하게는 약 5 그램/리터의 양으로 제제에 존재할 수 있다.

본 발명에 따르면, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 안정한 수성 제제는 다양한 pH 값에서 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 수성 제제는 약 5.7 내지 약 6.6의 pH 값을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 안정한 수성 제제는 약 6.0 내지 약 6.3의 pH를 갖는다. 제제의 목적하는 pH 값은 알칼리 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물 또는 수산화암모늄과 같은 염기를 첨가함으로써 조정된다. pH 조정을 위하여 수산화나트륨이 바람직하게 사용된다. 원하는 pH 값의 조정은 원칙적으로 염기성 용액을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 약 산과 강 염기의 염, 예컨대 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 인산수소이나트륨 또는 인산수소이칼륨 또는 탄산나트륨이 사용될 수 있다. 보조 물질의 제약 용액이 염기성 pH 값을 갖는다면, 이것은 4-5 또는 7-8의 원하는 pH 범위에 이르를 때까지 산으로의 적정에 의해 조절된다. 생리학상 허용되는 무기 또는 유기 산은 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 시트르산 또는 산성 pH 값을 가진 통상적인 물질의 용액과 같은 산으로 고려된다. 이러한 측면에서, 일례의 물질은 약 염기와 강산의 염, 예를 들어 인산이수소나트륨 또는 인산이수소칼륨이다.

하기 실시예에 증명된 바와 같이, 본 발명의 bG-CSF 제제는 스트레스 보관 조건 및 가속 보관 조건에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 낮은 응집물 농도를 나타낸다. 여기에서 사용된 바와 같이, 스트레스 보관 조건은 제제 샘플을 25℃에서 5일 동안 인큐베이션한 후에 평가된다. 여기에서 사용된 바와 같이, 가속 보관 조건은 제제 샘플을 40℃에서 1일 동안 인큐베이션한 후에 평가된다. 본 발명의 목적을 위하여, 보관 조건은 다른 다양한 온도에서 다양한 지속기간 동안 평가될 수 있다. 예를 들어, 제제 샘플을 25℃에서 28일 동안 인큐베이션한 후에 또는 제제 샘플을 40℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후에, 보관 조건을 평가할 수 있다.

스트레스 보관 조건 및 가속 보관 조건 후에 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 응집물 농도를 분석한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 bG-CSF 제제는 스트레스 보관 조건에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 약 2.1% (중량/중량 퍼센트) 미만의 응집물 농도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 bG-CSF 제제는 스트레스 보관 조건에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 약 1.5% (중량/중량 퍼센트) 미만의 응집물 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 bG-CSF 제제는 가속 보관 조건에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 약 1.5% (중량/중량 퍼센트) 미만의 응집물 농도를 갖는다.

추가로, 본 발명의 제제의 안정성 성질을 평가하기 위하여 강제 교반 연구 또는 동결-해동 연구를 사용할 수 있다. 예를 들어, 강제 교반 연구는 60 rpm과 같은 설정된 속도에서 자기 교반기를 사용하여 유리 비커에서 제제 샘플을 혼합하는 것으로 이루어질 수 있다. 제제 샘플의 특징을 결정하기 위하여 2시간과 같은 결정된 기간 동안 교반이 일어날 수 있다. 동결-해동 주기는 제제 샘플을 약 -75℃에서 1시간 동안 동결하고 얼음이 관찰되지 않을 때까지 대략 1시간 동안 실온에서 해동하는 것으로 구성될 수 있다.

또한, 하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 bG-CSF 제제는 스트레스 보관 조건 및 가속 보관 조건에서 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 바람직한 탈안정화 및/또는 탈페길화 성질을 나타낼 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "탈페길화"는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 결합된 페길화된 모이어티의 부착 안정성, 즉 예를 들어 수용액 중에 보관 동안에 이러한 페길화된 모이어티가 시간에 걸쳐 폴리펩티드에 결합된 채로 유지되는지의 여부, 또는 예를 들어 에스테르 결합 가수분해의 결과로서 이들이 분리되는지의 여부를 가리킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 완충제 물질로서 시트레이트 및 부형제로서 아르기닌을 사용하여 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 안정한 수성 제제를 제제화할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 시트르산 일수화물 (피셔(Fisher), C/6200/60 또는 등가물)을 완충제 물질로서, L-아르기닌 (시그마(Sigma), A8094 또는 등가물)을 부형제로서 사용하여 수성 제제를 제조할 수 있다. 1.6±0.1 그램의 시트르산 일수화물 및 10.9±0.1 그램의 L-아르기닌을 200 mL의 고 품질 물에 첨가함으로써 수성 제제를 제조할 수 있다. 그 후에, 염산을 사용하여 pH를 6.0±0.1로 조정할 수 있고, 고 품질 물을 사용하여 혼합물을 250 mL로 희석할 수 있다. 생성된 제제는 pH 6.0에서 30 mM 시트레이트, 250 mM 아르기닌 및 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.

통상적인 동결건조에 의한 동결건조물 또는 분말을 생성하기 위하여 본 발명에 따른 수성 제제를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 동결건조물을 물 또는 기타 수용액에 용해시킴으로써 수득된다. 동결-건조로 또한 공지된, 용어 "동결건조"는 관심 단백질 제제로부터 물을 제거하기 위해 사용되는, 단백질의 보존을 위해 일반적으로 사용되는 기술이다. 동결건조는, 건조되는 물질을 먼저 동결시킨 다음, 진공 환경에서 승화에 의해 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 방법이다. 동결-건조 공정 동안에 안정성을 향상시키기 위해 및/또는 보관 동안에 동결건조된 생성물의 안정성을 개선하기 위해 부형제가 사전-동결건조된 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Pikal, M. Biopharm. 3(9) 26-30 (1990)] 및 [Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991)] 참조.

제약 성분의 분무 건조가 당업자에게 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", Drug Dev. Ind. Pharm, 18(11&12), 1169-1206 (1992)] 참조. 소분자 제약에 추가로, 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모를 포함하는 각종 생물학적 물질을 분무 건조하였다. 분무 건조는, 액체 제약 제제를 미세하고 먼지가 없고 응집된 분말로 1-단계 공정으로 전환할 수 있기 때문에 유용한 기술이다. 기본 기술은 하기 4 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 스프레이로 분무화; b) 스프레이-공기 접촉; c) 스프레이의 건조; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 생성물의 분리. 예를 들어, 미국 특허 6,235,710 및 6,001,800은 분무 건조에 의한 재조합 에리트로포이에틴의 제조를 설명한다.

bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유한 제제의 사용 방법이 본 발명에 포함된다. bG-CSF는 이에 한정되지 않지만 그의 수용체로의 결합, 그의 수용체의 이량체화 유발, 호중구 생성의 자극, 및 세포 증식 및 분화 자극을 포함한 다양한 생물학적 활성을 갖는다. 과립구 콜로니 자극 인자 및 bG-CSF의 생물학적 활성의 일부의 예가 상기 및 미국 특허 6,676,947; 6,579,525; 6,531,121; 6,521,245; 6,489,293; 6,368,854; 6,316,254; 6,268,336; 6,239,109; 6,165,283; 5,986,047; 5,830,851; 5,043,156; 및 5,773,569에 기재되어 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는 넓은 범위의 장애를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다. "예방하는"이란 수용자가 여기에 기재된 병리학적 상태를 초래하거나 발생시킬 가능성을 감소시키는 것을 가리키고 예방적 투여를 포함한다. 용어 "예방하는"은 특별한 병리학적 상태에 민감한 환자에 특히 적용될 수 있다. "치료하는"이란 질환 또는 상태를 매개하고, 질환의 임상적 효과를 방지하고 역전시키거나, 그의 추가 진행을 완화시키거나, 질환 또는 상태와 관련된 증상을 개선하는 것을 가리킨다.

G-CSF 생성물을 투여하면 백혈구가 형성되는 결과가 얻어진다. 즉, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제의 투여는 감염 위험이 있는 동물에서 감염을 방지하기 위해 유용할 수도 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제를 감염을 가진 동물에 투여할 수도 있다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제로 치료될 수 있는 감염은, 이에 한정되지 않지만 유선염 및 수송 열을 포함한다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제를 예를 들어 출산 전 2주 내지 1일 사이인 동물에 투여할 수 있고, 임의로 출산 당일 또는 출산 후 1주 이내에 추가의 투여를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제가 투여되는 동물은 소이고, 출산을 "송아지를 낳다"라고 언급한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제를 유선염 예방을 위해 분만이 가까운 소에 투여할 수도 있다.

본 발명에 따르면, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제를 단백질 또는 펩티드를 위해 적절한 통상적인 경로에 의해, 이에 한정되지 않지만, 비경구적, 예를 들어 이에 한정되지 않지만 피하 또는 정맥내 또는 다른 형태의 주사 또는 주입을 포함하는 주사 형태를 포함한 경로에 의해 투여할 수도 있다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는, 이에 한정되지 않지만 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하, 혈관내, 근육내 또는 직장내 수단을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유한 제제를 리포솜을 통해 투여할 수 있다. 이러한 투여 경로 및 적절한 제제는 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는, 단독으로 또는 다른 적절한 성분과의 조합으로, 흡입을 통해 투여되어지는 에어로졸 제제로 만들어질 수 있다 (즉, 이들은 "분무"될 수 있다). 에어로졸 제제는 허용가능한 가압 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 넣어질 수 있다.

예를 들어 관절내 (관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 피하 경로와 같은 비경구 투여를 위해 적절한 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 수용자의 혈액과 등장성인 제제를 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는 단위-용량 또는 다-용량 밀봉 용기, 에컨대 앰플 및 바이알에 제공될 수 있다. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제는 주사기, 예컨대 사전충전된 주사기에 제공될 수도 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여는 본 발명의 제제의 가능한 투여 방법이다. 특히, 통상적으로 사용되는 제제와 함께 천연 아미노산 상동체 치료제를 위해 이미 사용중인 투여 경로 (이에 한정되지 않지만 EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터류킨, 항체, FGF 및/또는 기타 제약학적으로 전달되는 단백질용으로 전형적으로 사용되는 것을 포함함)는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 함유하는 제제의 가능한 투여 경로를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제제는 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 약 0.5 내지 약 12그램/리터의 양으로 함유한다. 본 발명의 내용에서 동물에 투여된 용량은 적용에 따라 시간에 걸쳐 동물에서의 유리한 치료 반응 또는 다른 적절한 활성을 갖기에 충분하다. 용량은 특정한 벡터의 효과, 또는 제제 및 사용된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기, 및 동물의 상태 뿐만 아니라 치료되는 동물의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 용량 크기는 또한 특정 동물에서의 특정한 벡터, 제제 등의 투여에 동반되는 부작용의 존재, 성질, 및 정도에 의해 결정된다.

본 발명의 맥락에서 동물에 투여되는 용량은 시간에 걸쳐 대상체에 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 용량 당 비경구 투여되는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 총 제약상 유효량은, 치료적 판단에 따르긴 하지만, 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg(동물 체중)의 범위이다. 대안적으로, 용량 당 비경구 투여되는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 제약상 유효량은 약 1 mg 내지 약 25 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 20 mg이다. 예를 들어, 용량 당 비경구 투여되는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 제약상 유효량은 약 14 mg일 수 있다. 투여 빈도는 치료적 판단에 따른다.

bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 제약상 유효량을 1회 용량으로 또는 다-용량 스케쥴의 일부로서 동물에 투여할 수도 있다. 예를 들어, bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 다-용량 스케쥴로 투여할 수도 있고, 스케쥴은 적어도 2회 용량 요법이다. 하나의 실시양태에서, 다-용량 스케쥴은 2회 용량 요법이다.

하나의 실시양태에서, 다-용량 스케쥴은, 동물이 출산하기 전 약 1일 내지 약 14일에 동물에 투여된 첫 번째 용량을 포함하고, 두 번째 용량은 동물이 출산한 후 약 4일 내지 약 7일 전에 동물에 투여된다. 다른 실시양태에서, 다-용량 스케쥴은 동물이 출산하기 전 약 7일에 동물에 투여되는 첫 번째 용량을 포함하고, 두 번째 용량은 동물이 출산한 날에 동물에 투여된다.

하기 실시양태가 또한 고려된다:

1. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 완충제 물질 및 부형제를 포함하고, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는 안정한 수성 제제.

2. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합되어 있는 것인, 항목 1의 제제.

*3. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 수용성 중합체에 결합되어 있는 것인, 항목 1 또는 항목 2의 제제.

4. 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 것인, 항목 3의 제제.

5. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 3 또는 항목 4의 제제.

6. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 3 내지 5 중 어느 하나의 제제.

7. 수용성 중합체가 약 20 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 3 내지 6 중 어느 하나의 제제.

8. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 bG-CSF-T133pAF-20K PEG인, 항목 1 내지 7 중 어느 하나의 제제.

9. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 약 0.5 내지 약 12 그램/리터의 양으로 존재하는 것인, 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 제제.

10. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 약 5 그램/리터의 양으로 존재하는 것인, 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 제제.

11. 완충제 물질이 시트레이트, 히스티딘, 말레에이트, 숙시네이트, 포스페이트 또는 그의 조합인, 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 제제.

12. 완충제 물질이 시트레이트 또는 숙시네이트인, 항목 1 내지 11 중 어느 하나의 제제.

13. 완충제 물질이 시트레이트인, 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 제제.

14. 완충제 물질이 숙시네이트인, 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 제제.

15. 완충제 물질이 약 10 mM 내지 약 50 mM의 몰농도를 갖는 것인, 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 제제.

16. 완충제 물질이 약 30 mM의 몰농도를 갖는 것인, 항목 1 내지 15 중 어느 하나의 제제.

17. 부형제가 염화나트륨, 트레할로스, 소르비톨, 아르기닌 또는 그의 조합인, 항목 1 내지 16 중 어느 하나의 제제.

18. 부형제가 아르기닌인, 항목 1 내지 17 중 어느 하나의 제제.

19. 아르기닌이 약 100 mM 내지 약 500 mM의 몰농도를 갖는 것인, 항목 18의 제제.

20. 아르기닌이 약 200 내지 약 300 mM의 몰농도를 갖는 것인, 항목 18 또는 항목 19의 제제.

21. 아르기닌이 약 250 mM의 몰농도를 갖는 것인, 항목 18 내지 20 중 어느 하나의 제제.

22. 약 5.7 내지 약 6.6의 pH를 갖는, 항목 1 내지 21 중 어느 하나의 제제.

23. 약 6.0 내지 약 6.3의 pH를 갖는, 항목 1 내지 22 중 어느 하나의 제제.

24. 스트레스 보관 조건에서 5일의 인큐베이션 기간 후에, 약 2.1% wt/wt% 미만의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 제제.

25. 가속 보관 조건에서 1일의 인큐베이션 기간 후에, 약 1.5% wt/wt% 미만의 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 1 내지 24 중 어느 하나의 제제.

26. 하나 이상의 기타 치료 성분을 임의로 포함하는, 항목 1 내지 25 중 어느 하나의 제제.

27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나의 제제의 동결건조물 또는 분말.

28. 항목 27의 동결건조물 또는 분말을 물에 용해시킴으로써 제조된 수용액.

29. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 완충제 물질, 및 부형제를 포함하는 안정한 수용액을 형성시키는 것을 포함하는, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 실질적으로 함유하지 않는 항목 1 내지 26 중 어느 하나의 제제의 제조 방법.

30. bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 갖는 동물에게 치료 유효량의 항목 1 내지 26 중 어느 하나의 제제를 투여하는 것을 포함하는, bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 갖는 동물의 치료 방법.

31. 상기 장애가 감염인, 항목 30의 방법.

32. 상기 감염이 유선염이고, 상기 동물이 분만이 가까운 소인, 항목 31의 방법.

33. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 시트레이트 또는 숙시네이트 완충제, 아르기닌 및 임의로 아르기닌에 대한 반대 이온을 포함하는 안정한 수성 제제.

34. 폴리소르베이트 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는, 항목 33의 제제.

35. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합되어 있는 것인, 항목 33 또는 항목 34의 제제.

36. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 수용성 중합체에 결합되어 있는 것인, 항목 33 내지 35 중 어느 하나의 제제.

37. 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 것인, 항목 36의 제제.

38. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 36 또는 항목 37의 제제.

39. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 36 내지 38 중 어느 하나의 제제.

40. 수용성 중합체가 약 20 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 36 내지 39 중 어느 하나의 제제.

*41. 상기 폴리소르베이트 계면활성제가 나트륨 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체인, 항목 34 내지 40 중 어느 하나의 제제.

42. 상기 폴리소르베이트 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트인, 항목 34 내지 41 중 어느 하나의 제제.

43. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 bG-CSF-T133pAF-20K PEG인 항목 33 내지 42 중 어느 하나의 제제.

44. bG-CSF-T133pAF-20K PEG가 약 0.5 내지 약 12 그램/리터의 양으로 존재하고, 시트레이트 완충제가 약 30 mM의 몰농도를 갖고, 아르기닌이 약 250 mM의 몰농도를 갖고, 제제의 pH 값이 약 6.0인, 항목 43의 제제.

45. 25℃에서 28일의 인큐베이션 기간 후에 약 1.6% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 43 또는 항목 44의 제제.

46. 40℃에서 3일의 인큐베이션 기간 후에 약 2.8% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 43 내지 45 중 어느 하나의 제제.

47. 강제 교반 연구 후에 약 1.6% wt/wt% 이하의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 43 내지 46 중 어느 하나의 제제.

48. 5회의 동결-해동 주기 후에 약 1.6% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 43 내지 47 중 어느 하나의 제제.

49. 아르기닌에 대한 반대 이온이 클로라이드 또는 술페이트인, 항목 33 내지 48 중 어느 하나의 제제.

50. 하나 이상의 다른 치료 성분을 임의로 포함하는, 항목 33 내지 49 중 어느 하나의 제제.

51. 항목 33 내지 50 중 어느 하나의 제제의 동결건조물 또는 분말.

52. 항목 51의 동결건조물 또는 분말을 물에 용해시킴으로써 제조된 수용액.

53. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 시트레이트 완충제, 아르기닌 및 임의로 아르기닌에 대한 반대 이온을 포함하는 안정한 수용액을 형성시키는 것을 포함하는, 항목 33 내지 50 중 어느 하나의 제제의 제조 방법.

54. 제제가 폴리소르베이트 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 항목 53의 방법.

55. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 bG-CSF-T133pAF-20K PEG인, 항목 53 또는 항목 54의 방법.

56. bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 가진 동물에게 치료 유효량의 항목 33 내지 50 중 어느 하나의 제제를 투여하는 것을 포함하는, bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 가진 동물의 치료 방법.

*57. 상기 장애가 감염인, 항목 56의 방법.

58. 상기 감염이 유선염이고, 상기 동물이 분만이 가까운 소인, 항목 57의 방법.

59. 본질적으로 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 시트레이트 또는 숙시네이트 완충제, 아르기닌 및 임의로 아르기닌에 대한 반대 이온으로 이루어진 안정한 수성 제제.

60. 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는, 항목 59의 제제.

61. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합되어 있는 것인, 항목 59 또는 항목 60의 제제.

62. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 수용성 중합체에 결합되어 있는 것인, 항목 59 내지 61 중 어느 하나의 제제.

63. 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함하는 것인, 항목 62의 제제.

64. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 62 또는 항목 63의 제제.

65. 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 62 내지 64 중 어느 하나의 제제.

66. 수용성 중합체가 약 20 kDa의 분자량을 갖는 것인, 항목 62 내지 65 중 어느 하나의 제제.

67. 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 계면활성제인, 항목 60 내지 66 중 어느 하나의 제제.

68. 상기 계면활성제가 나트륨 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체인, 항목 60 내지 67 중 어느 하나의 제제.

69. 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트인, 항목 60 내지 68 중 어느 하나의 제제.

70. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 bG-CSF-T133pAF-20K PEG인, 항목 59 내지 69 중 어느 하나의 제제.

71. bG-CSF-T133pAF-20K PEG가 약 0.5 내지 약 12 그램/리터의 양으로 존재하고, 시트레이트 완충제가 약 30 mM의 몰농도를 갖고, 아르기닌이 약 250 mM의 몰농도를 갖고, 제제의 pH 값이 약 6.0인, 항목 70의 제제.

72. 25℃에서 28일의 인큐베이션 기간 후에 약 1.6% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 70 또는 71의 제제.

73. 40℃에서 3일의 인큐베이션 기간 후에 약 2.8% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 70 내지 72 중 어느 하나의 제제.

74. 강제 교반 연구 후에 약 1.6% wt/wt% 이하의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 70 내지 73 중 어느 하나의 제제.

75. 5회의 동결-해동 주기 후에 약 1.6% wt/wt% 미만의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG의 평균 응집물 농도를 갖는, 항목 70 내지 74 중 어느 하나의 제제.

76. 아르기닌에 대한 반대 이온이 클로라이드 또는 술페이트인, 항목 59 내지 75 중 어느 하나의 제제.

*77. 하나 이상의 기타 치료 성분을 임의로 포함하는, 항목 59 내지 76 중 어느 하나의 제제.

78. 항목 59 내지 77 중 어느 하나의 제제의 동결건조물 또는 분말.

79. 항목 78의 동결건조물 또는 분말을 물에 용해시킴으로써 제조된 수용액.

80. 본질적으로 bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 시트레이트 완충제, 아르기닌 및 임의로 아르기닌에 대한 반대 이온으로 이루어진 안정한 수용액을 형성시키는 것을 포함하는, 항목 59 내지 77 중 어느 하나의 제제의 제조 방법.

81. 제제가 계면활성제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 항목 80의 방법.

82. bG-CSF 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 bG-CSF-T133pAF-20K PEG인, 항목 80 또는 항목 81의 방법.

83. bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 가진 동물에게 치료 유효량의 항목 59 내지 77 중 어느 하나의 제제를 투여하는 것을 포함하는, bG-CSF에 의해 조절되는 장애를 가진 동물의 치료 방법.

84. 상기 장애가 감염인, 항목 83의 방법.

85. 상기 감염이 유선염이고, 상기 동물이 분만이 가까운 소인, 항목 84의 방법.

86. 본질적으로 bG-CSF-T133pAF-20K PEG, 약 30 mM의 몰농도를 갖는 시트레이트 완충제, 약 250 mM의 몰농도를 갖는 아르기닌, 및 임의로 아르기닌에 대한 반대 이온으로 이루어진 안정한 수성 제제.

실시예 1

완충제 및 부형제 스크리닝 연구

다수의 완충제 및 부형제 (염화나트륨, 트레할로스 및 아르기닌)를 사용하여 생성물 안정성을 평가하기 위해, 배경에 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 갖지 않는 bGCSF-T133-20K PEG 제제를 스크리닝할 수 있다. 모든 투석 완충제를 위한 목표 pH는 pH 6.0이다. 비교를 위하여, pH 6.0에서 10 mM 포스페이트, 180 mM 만니톨 및 60 mM 트레할로스를 함유하는 제제를 제조할 수 있다. 산소의 존재 및 부재 하에 단백질 응집 및 탈페길화에 미치는 효과에 대해 제제를 평가할 수 있다.

1 mL의 bGCSF-T133-20K PEG를 2 내지 8℃에서 각각의 제제에 투석함으로써 샘플을 제조할 수 있다. 단백질 농도를 5 mg/mL로 표준화하기 전에, 투석된 샘플의 단백질 농도를 결정할 수 있다. 투석 및 농도 표준화 후에, 대략 3×1 mL의 투석 후 및 희석된 풀을 5 mL 유리 바이알에 충전할 수 있다. 초기 조건을 제공하기 위하여 샘플의 하나의 세트를 시험할 수 있다. 두 번째 세트를 시험 전에 25℃/60% RH에서 5일 동안 보관할 수 있다. 샘플의 세 번째 세트를 동결건조 챔버에서 탈기시킬 수 있고 불활성 대기 (질소) 하에 밀폐시킨 다음 시험 전에 25℃/60% RH에서 5일 동안 보관할 수 있다. 5일 후에 SEC에 의해 측정된 응집물 수준이 2.0% 이하라면, 탈기 및 비-탈기된 샘플 둘 모두를 40℃에서 1일 동안 인큐베이션할 수 있다.

5일의 인큐베이션 후에, 각각의 샘플의 단백질 농도를 측정할 수 있다. 표 1은 단백질 농도를 나타낸다.

표 2는 각 샘플의 pH 결과를 나타낸다.

각각의 제제에서 단백질 응집 및 탈페길화 수준을 SEC에 의해 분석할 수 있다. 표 3은 SEC 결과를 나타내고, 응집 및 탈페길화 수준이 모든 샘플에서 유사하였음을 나타낸다.

표 4는 40℃에서 1일 동안 인큐베이션된 샘플에 대한 SEC 결과를 나타낸다. 응집물 조성물의 비교는, 아르기닌을 함유한 제제가 가장 낮은 생성물 응집을 가짐을 나타낸다. 또한, 참조 제제 10 mM 포스페이트, 180 mM 만니톨 및 60 mM 트레할로스 pH 6은, 스크리닝 연구에서 다른 모든 제제에 비하여 가장 높은 수준의 응집을 갖는다.

이러한 스크리닝 연구로부터의 결과는, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 갖지 않은 숙시네이트, 히스티딘, 말레에이트 및 시트레이트 제제가 모두, 25℃에서 5일 인큐베이션 후에 무시할 만한 정도 (SEC에 의해 1% 미만)의 응집물 증가를 가짐을 나타낸다. 또한, 탈기 및 비-탈기 샘플 간에 단백질 안정성의 차이가 존재하지 않는다. 또한, 40℃에서 1일 동안 스트레스 조건 하의 샘플로부터의 SEC 결과는, 0.1 M 아르기닌을 함유하는 제제가 염화나트륨 및 트레할로스 부형제를 함유한 제제에 비하여 낮은 응집을 가짐을 나타낸다.

실시예 2

bG- CSF 제제에 미치는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트의 효과

교반 연구를 위해 미래의 제제에 대한 영향을 결정하기 위하여 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트의 응집에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 4 mL의 bGCSF-T133-20K PEG를 2 내지 8℃에서 pH 6.0의 10 mM 포스페이트 및 150 mM NaCl에 투석함으로써 샘플을 제조할 수 있다. 투석 후에, 투석된 풀을 1% 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 원액으로 스파이크(spike)한 다음, pH 6.0의 10 mM 포스페이트 및 150 mM NaCl로 5 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석할 수 있다. 각각의 제제로부터의 샘플을 2×1 mL 분취량으로 나누어 1 mL 유리 바이알에 충전하여 2개 샘플 세트를 만들 수 있다. 하나의 세트를 2 내지 8℃에서 보관하고 초기 조건에서 시험할 수 있고; 두 번째 세트를 40℃에서 1일 동안 보관할 수 있다.

표 5는, SEC 통합 데이터를 보여주고, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 농도의 증가에 따라 응집 수준이 증가함을 나타낸다. 샘플의 SEC 분석은, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 농도에 따라 bGCSF-T133-20K PEG 응집이 증가함을 나타낸다. 그 결과, bGCSF-T133-20K PEG를 위한 미래의 제제 시험으로부터 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 배제할 수 있다.

실시예 3

박스- 벤켄 (Box- Behnken ) 반응 표면 설계 (DOE #1)

주요 효과 뿐만 아니라 그들의 상호작용을 평가하기 위하여, 다른 전통적인 주요 제제 매개변수와 함께 다양한 아르기닌 농도의 효과를 시험할 수 있다. 실험 설계는 각각의 수치 인자가 저, 중 및 고 수준에서 변하는 박스-벤켄 반응 표면일 수 있다. 또한, 완충제 유형은 범주에 속하는 인자일 수 있다. 시트레이트 및 숙시네이트에 대하여 각각 3 중심점에서 매개변수 조합을 중복할 수 있다. 모든 조건에 대해 pH를 6.0으로 설정할 수 있다. 전통적인 결과와의 비교를 위하여, pH 6의 10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl 및 0.0033% 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트를 포함하는 대조 상태를 포함시킬 수 있다.

pH 6.0±0.1에서 모든 투석 완충제를 제조할 수 있다. PEG-bGCSF를 DOE #1 연구의 모든 완충제 상태를 나타내는 18개의 완충제 조건으로 투석할 수 있다. 투석 단계에 걸친 단백질 회수율은 일반적으로 78% 이상일 수 있고, 즉 투석 샘플 세트 내에서 변함없다. 투석 후에, 투석된 풀의 단백질 농도를 투석 완충제로 박스-벤켄 반응 표면 설계에 나타낸 목표 값으로 조절할 수 있다. 이것은 24개의 제제 조합과 시트레이트의 3개 중심점 및 숙시네이트에서의 3개 중심점에서 얻어질 수 있다. 각각의 제제를 3×1 mL 분취량으로 나누어 1 mL 유리 바이알에 채워서 3개의 샘플 세트를 형성할 수 있다: 하나의 세트를 초기 조건으로서 시험한 다음 2 내지 8℃에서 보관할 수 있고, 두 번째 세트를 2주일 동안 25℃에서 보관할 수 있고, 세 번째 세트를 1일 동안 40℃에서 보관할 수 있다.

생성물 안정성을 평가하기 위하여 생성물 농도의 변화를 분석할 수 있다. 표 6은 인큐베이션 전 및 후에 샘플의 생성물 농도를 나타낸다. 10 mM 시트레이트, 300 mM 아르기닌 (8 mg/mL) 및 10 mM 숙시네이트, 300 mM 아르기닌 (8 mg/mL)을 가진 샘플이 가장 높은 증가 (0.5-0.6 mg/mL)를 갖는 반면, 모든 다른 샘플에 대해서는 차이가 적다.

샘플의 pH 안정성을 평가하기 위하여 pH의 변화를 분석할 수 있다. 모든 샘플 pH는 6.0 내지 6.3의 범위 내일 수 있다. 표 7은 pH 값 및 시점 0으로부터의 차이를 나타낸다. 샘플 pH는 DOE #1 연구의 전체 지속기간에서 안정하다.

단백질 안정성을 평가하기 위하여 SEC 응집물, 단량체 및 탈페길화 수준의 변화를 분석할 수 있다. 표 8, 9 및 10은 각각 각 샘플 조성물에서의 응집, 단량체 및 탈페길화의 조성을 나타낸다.

SEC 결과는, 시트레이트 샘플에서의 응집물 수준이 비교적 변화없음을 보여준다. 숙시네이트 샘플은 또한, 100 mM 아르기닌을 가진 샘플을 제외하고는 낮은 응집물 수준을 갖는데, 이것은 낮은 단백질 응집을 유지하기 위하여 숙시네이트-기반 완충제가 100 mM 초과의 아르기닌을 필요로 함을 시사한다. 대조 상태 (10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 및 0.0033% (w/v) 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, pH 6 및 5 mg/mL)는 40℃에서 1일 인큐베이션 후에 3.7% 응집물을 갖는다 (표 8 참조).

탈페길화는 또 다른 단백질 분해 경로이다. 표 10은 탈페길화 생성물에 대한 SEC 결과를 나타내고, 이것은 숙시네이트 샘플에서의 탈페길화 수준이 시트레이트 샘플 (≤0.3%)에 대해서보다 높음 (0.4% - 0.8%)을 나타낸다. 포스페이트 대조군에서의 탈페길화 수준은 모든 시트레이트 제제 샘플보다 더 높고, 대부분의 숙시네이트 제제보다 약간 더 높다.

40℃에서 1일 동안 인큐베이션된 시트레이트 샘플에 대한 SEC 결과는 최소의 응집물을 갖기 때문에, DOE #1 샘플의 하위세트를 25℃에서 28일 동안 인큐베이션할 수 있다. 하기 샘플 조건을 SEC에 의해 분석할 수 있다.

1. 30 mM 시트레이트, 100 mM 아르기닌, 2 mg/mL

2. 30 mM 시트레이트, 500 mM 아르기닌, 2 mg/mL

3. 30 mM 시트레이트, 100 mM 아르기닌, 8 mg/mL

4. 30 mM 시트레이트, 500 mM 아르기닌, 8 mg/mL

5. 30 mM 시트레이트, 300 mM 아르기닌, 5 mg/mL

표 11은 28일 실험의 SEC 결과를 나타낸다. 또한, 생성물 분해가 없도록 하기 위하여, 28일에 인큐베이션된 샘플에서 RP-HPLC에 의한 분석을 수행할 수 있다. 표 12는 이러한 결과를 보여준다.

실시예 4

반대 이온 및 주사기 적합성 평가

아르기닌에 대한 반대 이온으로서 클로라이드 및 술페이트의 비교를 평가할 수 있다. 샘플 조건은 5 mg/mL의 30 mM 시트레이트 및 300 mM 아르기닌일 수 있다 (pH 6). 추가로, 약물 생성물을 함유하기 위한 모노젝트(MONOJECT) 3 mL 폴리프로필렌 주사기에서의 생성물 적합성을 1 mL 유리 바이알과 비교할 수 있다. 시트르산나트륨 및 아르기닌-HCl을 사용하여 30 mM 시트레이트, 300 mM 아르기닌 pH 6 (클로라이드) 완충제를 제조할 수 있고, 용액을 6N HCl로 적정할 수 있다. 시트르산 일수화물, 시트르산나트륨, 및 아르기닌 염기를 사용하여 30 mM 시트레이트, 300 mM 아르기닌 pH 6 (술페이트) 완충제를 제조할 수 있고, 용액을 진한 황산으로 적정할 수 있다. bGCSFT133-20K PEG를 2개의 완충제에 투석할 수 있다. 시점 0에서 SEC에 의해 샘플을 분석할 수 있다. 샘플의 하나의 세트를 1 mL 유리 동결건조 바이알에 넣을 수 있고, 두 번째 세트를 3 mL 주사기에 넣은 후에, 40℃에서 3일 이하 동안 인큐베이션할 수 있다.

표 13은 SEC 결과를 나타낸다. SEC 결과는, 응집물 형성이 유리 바이알에서보다 주사기에 보관된 샘플에서 2 내지 3배 더 높음을 나타낸다. 생성물 탈페길화는 시점 0 샘플에서와 동일하게 유지된다. 두 반대 이온 모두에 대하여, 유리 바이알 내의 샘플이 40℃에서 3일 후에 응집물의 최소 변화를 갖는다. 응집물 형성에 대해 영향을 미치지 않으면서 반대 이온으로서 술페이트 대신에 클로라이드를 사용할 수 있다.

실시예 5

3개의 매개변수, 2-수준 완전 요인 (DOE #2)

시트레이트 완충제에서 pH, 아르기닌 농도 및 단백질 농도의 영향을 평가하기 위하여 두 번째 DOE 연구를 수행할 수 있다. 표 14는 DOE #2에서 사용된 제제화 조건을 나타낸다.

bGCSF-T133-20K PEG를 5개 완충제 조건으로 투석할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 200 mM 아르기닌을 함유하는 pH 5.0의 완충제에서 샘플 1 및 2를 투석할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 200 mM 아르기닌을 함유하는 pH 5.0의 완충제에서 샘플 3 및 4를 투석할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 250 mM 아르기닌을 함유하는 pH 6.0의 완충제에서 샘플 5 및 6을 투석할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 300 mM 아르기닌을 함유하는 pH 6.0 완충제에서 샘플 7 및 8을 투석할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 300 mM 아르기닌을 함유하는 pH 5.5 완충제에서 샘플 9 및 10을 투석할 수 있다. 각각의 투석후 샘플을 최종 목표 생성물 농도로 조정할 수 있고, 이어서 유리 동결건조 바이알에 2×1 mL 분취량으로 나누어 넣어 2개 샘플 세트를 형성할 수 있다: 하나의 세트를 대조군으로서 2 내지 8℃에서 보관할 수 있고 두 번째 세트를 40℃에서 3일 동안 보관할 수 있다.

표 15는 SEC 결과를 나타낸다. 응집물에서의 변화는 -0.1% 내지 2.1%이다. 더 높은 응집물은 더 높은 생성물 농도와 강한 상관관계가 있다. 델타 탈페길화는 0.1% 내지 0.8%이다. 약간 더 높은 탈페길화는 낮은 pH에서 낮은 생성물 농도와 상관관계가 있다. pH가 저하됨에 따라, 탈페길화가 증가하는데, 이러한 경향은 제제화-전 연구에서의 전통적인 관찰과 일치한다.

실시예 6

교반 연구

제제에서 단백질 안정성을 평가하기 위하여 강제 교반 연구를 수행할 수 있다. 샘플은, pH 6.0에서 30 mM 시트레이트 및 250 mM 아르기닌에 대해 bGCSF-T133-20K PEG (10 mM 아세트산나트륨 중의 16.6 mg/mL 단백질, 5% 소르비톨, pH 4.0)를 투석함으로써 제조할 수 있다. 30 mM 시트레이트 및 250 mM 아르기닌을 함유하는 pH 6.0의 완충제를 사용하여, 투석된 물질의 일부를 5 mg/mL의 목표 농도로 희석할 수 있다. 풀을 0.22 마이크로미터 필터를 통해 여과할 수 있고, 이어서 자기 교반기를 사용하여 60 rpm에서 실온에서 2시간 동안 혼합함으로써 유리 비커에서 강제 교반할 수 있다. 샘플을 매 30분마다 취할 수 있다.

모든 샘플이 투명하고 무색이고 모든 시점에서 눈에 보이는 입자가 없다. 각각의 시점에 대해 단백질 농도, 550 nm에서의 흡광도 및 pH 측정을 표 16에 나타낸다.

혼합 과정 전체에 걸쳐 단백질 농도는 안정하게 유지된다. 실험 전체에 걸쳐 pH가 일정하게 유지된다. 또한, 표 17에 나타낸 것과 같이, SEC에 의한 생성물 조성은 연구 전체에 걸쳐 일정하다. 종합하여, 이 연구로부터의 결과는, 강제 교반의 전체 기간 동안 단백질이 안정함을 나타낸다.

실시예 7

동결-해동 연구

다양한 샘플의 단백질 농도 및 pH를 결정하기 위하여 동결-해동 연구를 수행할 수 있다. 샘플에서의 단백질을 5회까지의 동결 및 해동 주기로 처리할 수 있다. 샘플을 0.22 마이크로미터 필터를 통해 여과할 수 있고, 15 mL 바이알에 분배할 수 있다. 하나의 분취량을 대조군으로서 별도로 둘 수 있다. 나머지 3개 분취량에 대해 각각의 동결-해동 주기는, -75±5℃에서 1시간 동안 단백질 용액을 동결시키고, 얼음이 관찰되지 않을 때까지 대략 1시간 동안 실온에서 해동시키는 것으로 구성될 수 있다. 샘플 바이알을 3회 온건하게 휘저어서 샘플을 혼합할 수 있다. 시험을 위해 첫 번째, 두 번째 및 다섯 번째 동결 및 해동 주기 후에 하나의 분취량을 별도로 둘 수 있다.

모든 샘플이 투명하고 무색이고 모든 시점에서 눈에 보이는 입자가 없다. 각각의 시점에 대한 단백질 농도, 550 nm에서의 흡광도 및 pH 측정을 표 18에 제시한다.

각각의 동결-해동 주기 후에 단백질 농도가 안정하게 유지된다. 또한, 5회의 동결-해동 주기에 걸쳐 pH가 일정하게 유지된다. SEC에 의한 생성물 조성은 모든 시점에서 유사하고, 표 19에 제시된다.

SEQUENCE LISTING <110> ELI LILLY & COMPANY <120> FORMULATIONS FOR BOVINE GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR AND VARIANTS THEREOF <130> X18988 <150> 61/385,629 <151> 2010-09-23 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met 35 40 45 Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Thr Ser Cys Leu Asn Gln Leu His Gly 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro 115 120 125 Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg 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taurus <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> wherein Xaa is para-acetylphenylalanine (pAF) linked to a poly(ethylene glycol) moiety <400> 13 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Gln Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Met Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cys Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Thr Ser Cys Leu Asn Gln Leu His 65 70 75 80 Gly Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala 115 120 125 Pro Ala Val Gln Pro Xaa Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala 130 135 140 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg 145 150 155 160 Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Gly Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro 165 170 175 <210> 14 <211> 175 <212> 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Claims

0.5 내지 12 그램/리터의 bG-CSF-T133pAF-20K PEG, 30 mM의 몰농도를 갖는 시트레이트 완충제, 250 mM의 몰농도를 갖는 아르기닌, 0% 이상 0.001% 미만의 계면활성제, 및 아르기닌에 대한 반대 이온으로서 클로라이드 또는 술페이트를 함유하고, 5.7 내지 6.6의 pH 값을 갖는 안정한 수성 제제.
제1항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 계면활성제인 것인 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제제는 유선염 또는 수송 열을 갖는 동물을 치료하기 위해 사용되는 제제.
제3항에 있어서, 상기 제제는 유선염을 갖는 분만이 가까운 소를 치료하기 위해 사용되는 제제.