KR100264953B1 - 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신속하면서 우수한 살충력을 갖는 재조합 베큘로바이러스(Baculovirus), 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제에 관한 것이다.

Description

재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제{RECOMBINANT BACULOVIRUS, PROCESS FOR PREPARING THEREOF AND MICROBIAL INSECTICIDES CONTAINING SAME}
본 발명은 신속하면서 우수한 살충력을 갖는 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제에 관한 것이다.
핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus, NPV)는 베큘로바이러스에 속하는 바이러스로, 곤충을 숙주로 하고 바이러스 증식력에 의한 살충력을 가지면서 척추 동물에는 병원성이 없어 안전하고 야외환경에서 바이러스 활성을 장기간 유지하는 장점을 가지고 있어, 20 여종의 바이러스가 살충제로 상품화되어 있다. 그러나 핵다각체병 바이러스는 높은 숙주 특이성으로 인해 숙주범위가 좁고 살충효과가 늦은 지효성의 단점이 있다.
최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해, 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템(Baculovirus expression vector system)을 이용하여 해충에 대한 독성 유전자를 발현하는 살충성 재조합 바이러스를 개발하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 보고되고 있는 살충성 재조합 바이러스는 부수스 에우페우스(Buthus eupeus)의 곤충독소 단백질 유전자(Carbonell et al.,Gene,73, 409-418 (1988)), 만두카 섹스타(Manduca sexta)의 이뇨 호르몬 유전자(Maeda,Biochem. Biophys. Res. Commun.,165, 1177-1183 (1989)), 헬리오시스 비레스센스(Heliothis virescens)의 유약 호르몬 에스터레이즈(esterase) 유전자(Hammock et al.,Nature,344, 458-461 (1990); Bonning et al.,Insect Biochem. Mol. Biol.,22, 453-458 (1992)), 피에모테스 트리티시(Pyemotes tritici)의 곤충독소 단백질 유전자(Tomalski ＆ Miller,Nature,352, 82-85 (1991)), 북아프리카산 전갈의 곤충독소 단백질 유전자(Stewart et al.,Nature,352, 85-88 (1991)), 거미의 곤충독소 단백질 유전자(Hughes et al.,J. Invertebr. Pathol.,69, 112-118 (1997)) 등을 해충에 대한 독소 유전자로 포함하는 것들이다. 그러나 이중 전갈의 곤충독소 유전자가 도입된 재조합 바이러스만이 높은 살충력을 보였을 뿐 다른 유전자들의 경우에는 살충력이 미미했으며, 전갈 독소 유전자가 도입된 재조합 바이러스도 여전히 지효성의 문제를 가지고 있다. 따라서 신속하면서도 우수한 살충력을 갖는 새로운 살충성 재조합 바이러스의 개발이 절실하다.
한편, 비티(Bacillus thuringiensis)의 내독소 단백질은 그람 양성 토양세균으로부터 포자형성시 함께 생산되는 곤충특이 독소로, 살충력이 높고 인간과 가축에는 무해한 장점으로 인해 미생물 살충제로 널리 이용되어 왔다(Feitelson et al.,Bio/Technology,10, 271-275 (1992)). 이 내독소 단백질의 살충기작으로는, 감수성 곤충에게 섭취된 내독소 단백질이 중장속 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 절단되어 활성화된 살충성 절편(독소)으로 전환된 후 중장의 상피세포와 결합하면서 중장을 파괴하며, 결국 내독소 단백질을 섭취한 곤충이 소화액과 체액의 산도(pH)변화에 의해 마비증상을 보이고 섭식을 중단하면서 24 내지 48시간 내에 치사하는 것이다. 예를 들어, 비티 내독소 단백질의 하나로 주로 나비목 곤충에 대해 독성을 나타내는 크라이 1(Cry 1) 단백질은 단백질 전체 크기는 약 130 kDa의 크기이지만 단백질 분해효소에 의해 만들어지는 활성화된 살충성 절편은 약 60 내지 70kDa이다(Aronson et al.,Microbiol. Rev.,50, 1-24 (1986)).
최근에는 비티 내독소 단백질을 베큘로바이러스에서 발현시킴으로써 바이러스의 살충력을 향상시키는 연구가 활발히 진행되었다(Bonning ＆ Hammock,Annu. Rev. Entomol.,41, 191-210 (1996)). 그러나 이 재조합 베큘로바이러스는 곤충의 혈림프에서 비티 내독소 단백질을 다량으로 생산하지만 치사되는 곤충이 없을 정도로 살충력이 저조한 문제점이 있었다. 그 이유는 비티 내독소 단백질의 살충기작이 일어나는 부위는 단백질 분해효소와 상피세포가 존재하는 중장내임에도 불구하고 이 점을 고려하지 않아 혈림프에서 프로모터 Ppol로부터 발현된 단일 비티 내독소 단백질이 중장에서 활성화되지 못하기 때문이다.
이에 본 발명자들은 베큘로바이러스 다각체 단백질(Polyhedrin, PH)이 중장내에서 알칼리 조건과 단백질 분해 효소에 의해 분해된다는 점에 착안하여, PH에 비티 내독소 단백질을 융합함으로써 중장에서 활성화된 비티 내독소 단백질을 방출하는, 신속하면서도 우수한 살충력을 가진 재조합 베큘로바이러스를 개발하고자 거듭 연구하였다.
본 발명의 목적은 신속하면서 우수한 살충력을 갖는 재조합 베큘로바이러스를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 베큘로바이러스 전이벡터(transfection vector)를 이용한 상기 재조합 베큘로바이러스의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전이벡터를 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 베큘로바이러스를 포함하는 살충제를 제공하는 데 있다.
도 1a, b 및 c는 각각 전이벡터 pAcG, pColorPol 및 pColorBtrus의 모식도이다.
도 2a 및 2b는 각각 대조구 베큘로바이러스 AcNPV로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2c 및 2d는 각각 재조합 베큘로바이러스 AcG로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2e 및 2f는 각각 재조합 베큘로바이러스 ColorPol로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2g 및 2h는 각각 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이다.
도 3a, 3b 및 3c는 재조합 다각체에 대해 각각 GFP 항체, PH 항체 및 CryIAc 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과이다.
도 4a 및 4b는 각각 대조구 베큘로바이러스 AcNPV 및 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체에 GFP 항체, PH 항체 및 CryIAc 항체를 처리한 투과전자현미경 사진이다.
도 5는 누에 소화액이 처리된 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus에 대해 CryIAc 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과이다.
도 6은 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체의 시간경과에 따른 살충력 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체 처리후 3일이 경과된 때의 치사된 배추좀나방 사진이고, 7b는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체 처리후 6일이 경과된 때의 치사된 배추좀나방 지방체세포의 형광현미경 사진이다.
도 8a 및 8b는 각각 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus가 처리된 배추 및 야생주 베큘로바이러스가 처리된 배추에서의 배추좀나방 유충에 의한 가해정도를 나타내는 사진이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 베큘로바이러스 다각체 단백질(PH), 비티 내독소 단백질(CP) 및 초록색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)의 융합단백질(이하 "PH-CP-GFP 융합단백질"이라 함)로 이루어진 재조합 다각체를 형성하는 재조합 베큘로바이러스를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 PH-CP-GFP 융합단백질을 코딩하는 융합유전자를 포함하는 전이벡터와 야생형 베큘로바이러스 게놈을 곤충 세포주에 도입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 베큘로바이러스의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 방법에 사용되는 PH-CP-GFP 융합단백질을 코딩하는 융합유전자를 포함하는 전이벡터를 제공한다.
본 발명에서는 상기 재조합 베큘로바이러스를 포함하는 살충제 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 베큘로바이러스는 다각체(Polyhedra)내에 베큘로바이러스 비리온이 포매된 것을 의미하고, 다각체는 베큘로바이러스 감염 말기에 곤충 세포의 핵에 형성되는, PH로 구성된 다각체 단백질 덩어리를 의미하므로 다각체 단백질 PH, 베큘로바이러스와는 구별된다. 또한 재조합 다각체는 특별한 언급이 없는 한 PH-CP-GFP 융합단백질로 구성되어 있는 다각체를 의미한다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스는 베큘로바이러스 PH의 C 말단에, 비티 CP와 북미산 해파리 GFP가 차례로 연결된 융합단백질로 이루어진 재조합 다각체를 형성한다.
상기 PH는 감염 말기에 곤충 세포의 핵으로부터 대량 합성되어지는 베큘로바이러스 다각체의 구조단백질로(Smith et al.,J. Virol.,46, 584-593 (1983)), 오토그라파 칼리포니카 핵다각체바이러스(Autographa californicaNucleopolyhedrovirus, AcNPV)의 PH, 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 핵다각체바이러스의 PH(Elisabeth et al.,J. Gen. Virol.,13, 2813-2821(1992)), 봄빅스 모리(Bombix mori) 핵다각체바이러스의 PH(Iatrou et al.,J. Virol.,54, 436-445 (1985)) 등이 있으며 AcNPV의 PH가 바람직하다. PH는 그 자체로는 살충성이 없고 외부로부터 바이러스 입자를 보호하며 섭식곤충의 중장내에서 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 용해되어 바이러스 입자를 방출하는 역할을 한다.
상기 CP는 비티균주의 내독소 단백질로, 크라이 I Ac(CryIAc) 단백질, 크라이 I Ab(CryIAb), 크라이 I E(CryIE), 이들의 살충성 절편을 포함하는 절편 등이 있으며, CryIAc 단백질중 1번부터 613번까지의 아미노산 서열을 갖는 절편이 바람직하다. CP는 곤충의 중장에서 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 분해되어 활성화된 살충성 절편으로 유리되는데, 예를들어 CryIAc의 살충성 절편은 29번째부터 607번째까지의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서 본 발명의 융합단백질은 베큘로바이러스의 재조합 다각체를 구성하면서 곤충에 섭식되면 곤충의 중장에서 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 융합단백질중의 PH이 분해되어 바이러스를 방출함과 동시에 융합단백질중의 CP가 분해되어 활성화된 살충성 절편으로 유리된다. 유리된 살충성 절편은 곤충 중장의 상피세포와 결합하여 중장을 파괴하며, 결국 내독소 단백질을 섭취한 곤충이 소화액과 체액의 산도(pH)변화에 의해 마비증상을 보이고 섭식을 중단하면서 24 내지 48시간 내에 치사하게 한다.
상기 GFP는 북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)에서 유래된 초록색 형광 단백질로, 자외선이 조사되면 초록색의 형광빛을 발하는 매우 안정된 단백질이다. 이 GFP 유전자는 해충을 제어할 목적으로 재조합 바이러스에 도입된 바 있다(Chao et al., Nature, 380, 396-397, 1996). 본 발명에서는 GFP는 단순한 자외선 조사에 의해 본 발명의 재조합 베큘로바이러스로 감염된 유충의 탐색 및 자연생태계내에 감염 유충의 분포 상태의 파악을 용이하게 하여, 궁극적으로는 무분별한 살충제의 남용을 피할 수 있게 한다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스의 대표적인 예로는 AcNPV 유래의 PH, CryIAc의 1번부터 613번까지의 아미노산 서열을 갖는 절편, 및 GFP가 차례로 연결된 융합 단백질로 이루어진 재조합 다각체를 형성하는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus를 들 수 있으며, 본 발명자들은 이 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus를 생명공학연구소 부설 유전공학연구소에 1998년 3월 10일자 기탁번호 제 KCTC 0444BP 호로 기탁하였다.
이하 본 발명의 재조합 베큘로바이러스의 제조방법을 설명한다.
먼저, PH-CP-GFP 융합단백질을 코딩하는 융합유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터 pColorBtrus를 제조한다. 상기 PH 코딩 염기서열로는 AcNPV의 PH 유전자, 스포돕테라 엑시구아 핵다각체바이러스의 PH, 봄빅스 모리 핵다각체바이러스의 PH 등의 코딩 염기서열을 사용할 수 있으며, AcNPV 유래의 PH 유전자가 바람직하다. 또한, 상기 CP 코딩 염기서열로는 CryIAc(Adang, M.J. et al.,Gene,36, 289-300(1985)), CryIAb, CryIE 등의 코딩 염기서열 또는 이들의 살충성 절편을 코딩하는 일부 염기서열을 사용할 수 있으며, CryIAc 단백질중 1번부터 613번까지의 아미노산 서열을 갖는 절편의 코딩 염기서열이 바람직하다. 상기 GFP 코딩 염기서열로는 북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아 유래의 GFP 유전자 등의 코딩 서열을 사용할 수 있다. 이들 코딩 염기서열은 이들 서열이 포함된 벡터로부터 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 제한효소의 절단 등의 통상적인 방법으로 얻거나 화학적인 방법으로 합성할 수 있다.
이 절편들을 PH 코딩 염기서열의 3' 말단에 CP 코딩 염기서열, GFP 코딩 염기서열이 차례로 연결되도록 공지된 방법에 따라 융합시킨 후, 공지된 베큘로바이러스 전이벡터, 예를 들어, pAcUW31(GenBank 등록번호 U02452)에 삽입시켜 PH-CP-GFP 융합단백질을 코딩하는 융합유전자를 포함하는 베큘로바이러스 전이벡터를 제작할 수 있다.
예를 들면, 북미산 해파리 유래의 GFP 유전자를 포함하는 플라스미드 pGFP (Clonetech사 제품)로부터 PCR에 의해 GFP 코딩 염기서열을 얻고, 야생주 AcNPV 로부터 PCR에 의해 PH 유전자를 얻고, 이 절편들을 PH 코딩 염기서열의 3' 말단에 GFP가 연결되도록 베큘로바이러스 발현벡터 pAcUW31(Clonetech사 제품)에 삽입하여, 베큘로바이러스 전이벡터 pColorPol을 제작한다(도 1b). 비티 CryIAc를 포함하는 플라스미드 pPN6.6(Dr. Adang 으로부터 입수함)를 PCR하여 CryIAc를 얻고, pColorPol의 PH 코딩 절편의 3' 말단에 삽입시켜 베큘로바이러스 전이벡터 pColorBtrus를 제작한다(도 1c). pColorBtrus에서는 PH, CryIAc, GFP의 3개의 코딩 염기서열이 차례로 융합되어 있다. 이때, 한 세포에서 원래의 PH 유전자와 PH-CryIAc-GFP 융합유전자를 동시발현시킬 목적으로 이중 프로모터 시스템을 사용하는데, PH-CryIAc-GFP 융합유전자를 PH 프로모터(PPH)의 하류에 도입함과 동시에 원래의 PH 유전자를 p10 프로모터(PP10)의 하류에 도입한다.
이어서, 본 발명의 베큘로바이러스를 제조하기 위해 상기에서 제조된 베큘로바이러스 전이벡터와 야생주 베큘로바이러스의 게놈 DNA를 혼합하고, 여기에 20 mM 헤페스 (HEPES) 완충액을 가한다. 이 혼합액에 리포펙틴(Lipofectin, Gibco사 제품)을 가하고 상온에서 방치한 다음, 이를 곤충 세포주, 예를 들면 Sf9(InVitrogen 사 제품) 세포주의 배양액에 접종하고 더 배양하여 재조합 베큘로바이러스가 형성되도록 한다. 이때, 곤충 세포주로는 Sf9 세포주외에도 Sf21, Tn5 등을 사용할 수 있으며, Sf9 세포주가 바람직하다. 배양액을 위상차현미경으로 관찰하여 다각체를 확인하고, 확인된 배양액을 원심분리한 후 상층액을 분리하여 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus를 얻는다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스는 야생주 AcNPV에 비해 100 배 이상 우수하면서 5 배 단축된 살충 효과를 가지고 있어 살충제로서 유용하다. 본 발명의 살충제는 재조합 베큘로바이러스와 함께 살충제의 제조에 통상적으로 사용되는 화이트카본, 수크로스, 폴리비닐알콜 등을 포함할 수 있다.
상기 살충제의 대상 곤충으로는 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충, 파밤나방(Spodoptera exigua), 흰불나방(Hyphantria cunea) 등의 나비목 곤충이 있다.
상기 미생물 살충제는 입제, 분제, 액상수화제, 수화제 등의 형태로 제형화될 수 있는데 이에 한정되지는 않으며, 수화제가 바람직하다. 예를 들면 수화제는 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 2x1010개, 화이트카본 100g, 수크로스 100g, 폴리비닐알콜 50g, 트리톤 X-100 10㎖, 및 벤토나이트(Bentonite) 10g를 혼합하여 제조할 수 있으며, 이 조성물을 물 10ℓ에 섞어 살포할 수 있다.
제형화된 살충제는 파, 배추, 담배, 뽕잎, 과수, 화훼, 원예 작물 등의 식물 표면이나 이들 식물이 생장하고 있는 토양에 처리될 수 있으며 또는 재배하여 수송 또는 저장중인 채소 표면에도 처리될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 베큘로바이러스 전이벡터의 제작
(1) 전이벡터 pAcG의 제작
북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 GFP 유전자를 포함하는 플라스미드 pGFP (Clonetech사 제품)로부터 하기 서열 1과 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 GFP 유전자를 얻었다.
서열 1
5'-AAGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3'
서열 2
5'-AACTGCAGCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3'
이 GFP 유전자를 발현벡터 pBacPAK8(Clonetech사 제품)의 BamHI과 PstI 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAcG를 제작하였다. 이 벡터에서 GFP 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다(도 1a).
(2) 전이벡터 pColorPol의 제작
야생주 베큘로바이러스 AcNPV 게놈 DNA로부터 하기 서열 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 PH 유전자를 얻었다.
서열 3
5'-AGTTGCTGATATCATGG-3'
서열 4
5'-AACTCGAGATACGCCGGACCAGTG-3'
상기 서열 3에서 밑줄은 EcoRV 절단부위이다.
이 PH 유전자를 pBacPAK6의 EcoRV와 XhoI 절단부위에 삽입하여 pPol을 제작하였다. 이어서, GFP 유전자로부터 하기 서열 5 및 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 GFP 유전자를 얻었다.
서열 5
5'-AACTCGAGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3'
서열 6
5'-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3'
상기 서열 5에서 밑줄은 XhoI 절단부위이다.
이 GFP 유전자를 pPol의 XhoI와 SnaBI의 절단부위에 삽입하여 pPolGFP를 제작하였다. 이중 PH-GFP 융합유전자를 이중프로모터의 발현벡터 pAcUW31(U02452)의 SnaB1과 BamHI 절단부위에 삽입하고, 야생주 AcNPV PH 유전자를 EcoRI과 BglII 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pColorPol을 제작하였다. 전이벡터 pColorPol에서 PH-GFP 융합유전자는 PH 프로모터(PPH) 하류에, AcNPV PH 유전자는 p10 프로모터(PP10) 하류에 위치한다(도 1b).
(3) 전이벡터 pColorBtrus의 제작
비티 CryIAc를 포함하는 플라스미드 pPN6.6(Adang, M. J. et al.Gene,36, 289-300 (1985))로부터 하기 서열 7 및 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 CryIAc 절편을 얻었다.
서열 7
5'-AACTCGAGATGGATAACAATCCGAAC-3'
서열 8
5'-AACTCGAGTGTTGCAGTAACTGG-3'
상기 서열 7 및 8에서 밑줄은 XhoI 절단부위이다.
이 CryIAc 절편을 pColorPol의 XhoI 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pColorBtrus를 제작하였다. pColorBtrus에서는 PH, CryIAc, GFP의 3개의 유전자가 차례로 융합된 융합유전자가 PPH하류에 위치한다(도 1c).
실시예 2: 재조합 베큘로바이러스의 제조
실시예 1에서 제작된 전이벡터 pAcG, pColorPol 또는 pColorBtrus DNA 5 ㎍과 야생주 AcNPV 게놈 DNA(BacPAK6, Clontech사 제품, Cat. No. 6144-1) 1 ㎍을 혼합하고 20 mM 헤페스 (HEPES) 완충액을 가하여 최종 부피를 50 ㎕로 한 후, 리포펙틴(Lipofectin, Gibco사 제품) 50 ㎕를 가하고 상온에서 15분간 방치하였다. 이 혼합액을, 곤충 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda) 세포주 Sf9(InVitrogen 사 제품, Cat. No.: B825-01)를 10% FBS(GIBCO-BRD사 제품)가 포함된 TC-100 배지(Sigma 사 제품)에서 27℃로 배양한 배양액에 접종하고 27℃에서 6시간동안 처리한 후, 새로운 TC-100 배지로 교환하고 동일한 온도로 4 내지 5일동안 배양하였다. 배양액을 위상차현미경(x100)으로 관찰하여 다각체를 확인하고, 확인된 배양액을 7,000xg로 5분동안 원심분리한 후 상층액을 분리하여 재조합 베큘로바이러스 AcG, ColorPol 또는 ColorBtrus를 분리하였다.
실시예 3: 재조합 다각체의 광학현미경 및 형광현미경 관찰
실시예 2에서 제조된 재조합 베큘로바이러스 AcG, ColorPol 또는 ColorBtrus를 곤충세포주 Sf9 세포에 세포 하나당 5개의 바이러스 입자가 되도록 60㎜×15㎜ 배양 플레이트당 2.0×106개로 분주하여 1시간동안 정치하여 Sf9 세포에 감염시켰다. 접종후 4일이 경과된 때에 세포를 광학현미경과 형광현미경(Axiophot Universal Microscope, Zeiss제품, 1,000배 배율)으로 관찰하여, 감염된 세포내에서 다각체의 형성여부를 조사하였다. 이때 대조구로는 야생형 베큘로바이러스 AcNPV(Clontech사 제품, Cat. No. K1601-D)를 사용하였다.
그 결과는 도 2a 내지 2h와 같다. 도 2a 및 2b는 각각 대조구 AcNPV 로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2c 및 2d는 각각 AcG로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2e 및 2f는 각각 ColorPol로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이고, 2g 및 2h는 각각 ColorBtrus로 감염된 Sf9 세포의 광학현미경 및 형광현미경 사진이다.
도 2e 내지 2h에서 보듯이, 재조합 베큘로바이러스 ColorPol과 ColorBtrus의 다각체는 정상적인 형태를 이루고 있고 형광현미경하에서 형광을 발하고 있다. 따라서 재조합 베큘로바이러스 ColorPol과 ColorBtrus에서 발현되는 다각체는 GFP를 포함하는 재조합 다각체임을 알 수 있다. 이에 반하여, 야생주 베큘로바이러스 AcNPV에서 생산된 다각체는 정상적인 형태의 다각체를 형성하지만 형광을 발하지 않으며, AcG에서 생산된 다각체는 정상적인 형태를 형성하지 않으며 형광현미경하에 세포 전체가 형광을 발하고 있다.
실시예 4: 재조합 다각체의 웨스턴 블랏 분석
실시예 3에서와 동일한 방법으로 재조합 베큘로바이러스 AcG, ColorPol 또는 ColorBtrus로 Sf9 세포를 감염시킨 후, 3일이 경과한 때에 배양액을 4,000xg로 5분간 원심분리하였다. 침전물에 5 X 시료완충액 [0.6 ml 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 5 ml 50% glycerol, 2 ml 10% SDS, 0.5 ml 2-mercaptoethanol, 1 ml 1% bromophenol blue, 0.9 ml H2O]을 가하고 혼합한 후 100℃에서 5분동안 중탕가열하고 상온에서 잠시 정치시킨 다음 7,000xg로 5분간 원심분리하였다. 상등액으로 10% SDS-PAGE을 행하였다. 전기영동한 겔을 니트로셀룰로즈 필터에 일렉트로트랜스퍼(Electro-transfer)하고 각각의 GFP 항체(ClonTech사 제품, Cat. No. 8363-2), AcNPV PH 항체(서울대학교 농업생명과학대학 곤충병리 유전공학 연구실) 또는 비티 CryIAc 항체(서울대학교 농업생명과학대학 곤충병리 유전공학 연구실)를 결합시킨 후 알칼라인 포스파타제가 결합된 항 IgG 2차 항체(Sigma 제품)를 결합시켜 분석하였다.
GFP 항체, PH 항체 및 CryIAc 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과는 각각 도 3a, 3b 및 3c와 같다. 도 3a 내지 3c에서 보듯이, 재조합 베큘로바이러스 ColorPol의 다각체는 33 kDa의 PH와 60 kDa의 PH-GFP 융합단백질로 구성되어 있고, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체는 33 kDa의 PH와 125 kDa의 PH-CryIAc-GFP 융합단백질로 구성됨을 알 수 있다.
실시예 5: 재조합 다각체의 면역학적(Immunogold labeling) 전자현미경 관찰
실시예 3에서와 동일한 방법으로 감염된 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 또는 야생주 AcNPV 배양액을 40 내지 65% 과당밀도구배 초원심분리하여 56% 지점에서 야생주 AcNPV의 다각체 또는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체를 분리하였다. 이 다각체를 1%(w/v) 파라포름알데하이드를 포함한 완충액(0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.5, PBS)으로 고정시킨 후, 0.1 M 글라이신(pH 7.5)으로 세척하고 탈수시켰다. 탈수된 다각체를 로이크리틀(Lowicritl) K4M(Ploysciences 제품)에 포매하고 니켈 그리드(Nickel grid)위에서 초박절편한 다음 GFP 항체, CryIAc 항체 및 PH 항체와 반응시켰다. 여기에 다시 2차항체[Goat anti-rabbit colloidal gold conjugate(Biocell 제품)]를 결합시킨 후 0.2% 리드 시트레이트(Lead citrate)와 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate) 용액으로 염색하고 투과전자현미경(Hitachi M-600)으로 관찰하였다.
그 결과는 도 4a 및 4b와 같다. 도 4a는 야생주 AcNPV의 다각체에 대한 투과전자현미경 사진이고, 도 4b는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체에 대한 투과전자현미경 사진이며, GFP는 직경 30㎚ 금박, CryI Ac는 직경 20 ㎚ 금박, PH는 직경 10 ㎚ 금박으로 구별된다. 도 4a 및 4b에서 보듯이, 야생주 AcNPV의 다각체에는 PH 항체만이 결합하는데 반해 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체에는 PH 항체, GFP 항체 및 CryIAc 항체가 모두 결합하고 있어, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체는 PH-CryIAc-GFP 융합단백질로 구성되어 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 누에 소화액이 처리된 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 웨스턴 블랏
야생주 AcNPV의 다각체, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 다각체 또는 비티 CryIAc 단백질에, 5령 유충 누에에 전기충격을 가하여 누에가 토해낸 소화액을 부피비 1:1로 첨가하고 상온에서 5분간 방치한 후, 실시예 4에서와 동일한 방법으로 SDS-PAGE, 비티 CryIAc 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 실시하였다. 이때 대조구(Mock)로는 다각체 또는 CryIAc 단백질 대신에 물을 사용하였다.
그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 보듯이, 누에 소화액이 처리된 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 재조합 다각체는 누에 소화액의 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 분해되며, 이때 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 재조합 다각체중의 비티 CryIAc도 누에 소화액의 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 절단되어 활성화된 65 kDa의 살충성 절편이 유리된다. 이로부터 곤충에 섭식된 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus의 재조합 다각체는 즉각 분해되며 이때 다각체 내에 존재하는 바이러스 입자 뿐 아니라 비티 CryIAc의 활성화된 살충성 절편도 함께 유리됨을 알 수 있다.
실시예 7: 재조합 베큘로바이러스 ColorBtus의 살충력 검정
나비목 곤충인 배추좀나방(Plutella xylostella)의 2령 유충 50마리를, 실시예 5에서와 동일한 방법으로 순수분리된 야생주 AcNPV 다각체 또는 ColorBtrus 재조합 다각체가 유충 한 마리당 5120, 1280, 640, 320, 160, 80, 40 또는 20개의 다각체 농도로 분주된 양배추에 가하고 유충의 치사율을 측정하여 50% 살충값(median lethal dose, LD50)을 결정하였다. 이 실험을 3회 반복 실시하였다.
또한 배추좀나방 2령 유충 50마리를 다각체가 유충 한마리당 1500개의 농도로 분주된 양배추에 가하고, 50% 살충시간(median survival time, ST50)을 결정하였다.
그 결과는 하기 표 1과 같다.
바이러스 LD50(다각체수/유충) ST50(시간)
AcNPV 3,000 153.6
ColorBtrus 29.6 31.8
표 1에서 보듯이, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체는 야생주 AcNPV 다각체에 비해 100 배 이상의 높은 살충력과 5 배의 단축된 살충시간을 가진다. 따라서 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체는 적은 양으로도 단시간내에 높은 살충력을 가짐을 알 수 있다.
도 6은 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체의 시간경과에 따른 살충력 변화를 나타낸 그래프로, ●는 5120개/유충 처리구이고 ○는 1280개/유충 처리구이다. 도 6에서 보듯이, 5120개/유충 처리구와 1280개/유충 처리구는 처리후 3일동안에 100%와 90%의 유충 치사율을 보이고, 1280개/유충 처리구는 6일째부터 다시 병사충을 보이며 최종 치사율은 94%이다.
또한 도 7a는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체 처리후 3일이 경과된 때의 배추좀나방 사진이고, 7b는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus 다각체 처리후 6일이 경과된 때의 치사된 배추좀나방 지방체세포의 형광현미경 사진이다. 도 7a와 7b에서 보듯이, 3일이 경과된 때의 치사한 유충은 전형적인 비티 CryIAc에 의한 병징(a)을 보이고, 6일 이후에 치사한 유충으로부터는 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus에 의한 재조합 다각체의 생성이 확인된다. 이로부터 재조합 베큘로바이러스는 감염후 3일이 경과된 때에는 CP에 의해 살충력을 가지고, 감염후 6일 이후부터는 바이러스 증식에 의해 살충력을 가진다는 점을 알 수 있다.
도 8a 및 8b는 각각 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus가 처리된 배추 및 야생형 베큘로바이러스가 처리된 배추에서의 배추좀나방 유충에 의한 가해정도를 나타내는 사진이다. 도 8a 및 8b에서 보듯이, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus가 처리된 경우에는 야생형 베큘로바이러스가 처리된 경우보다 배추의 가해정도가 경미하다. 따라서, 재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus는 비티 CryIAc의 살충성 절편으로 인해 배추좀나방 유충의 섭식을 저해함을 알 수 있다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스는, PH-CP-GFP 융합단백질로 이루어진 다각체를 형성함으로써, 곤충의 중장에서 알칼리 조건과 단백질 분해효소에 의해 PH와 CP가 분해되어 베큘로바이러스의 비리온이 방출됨과 동시에 살충성 절편이 유리되어, 신속하면서 우수한 살충력을 가진다. 따라서 본 발명의 재조합 베큘로바이러스는 비티 내독소 단백질의 살충성과 바이러스의 증식력이 조합된 새로운 재조합 바이러스로서 살충제로 매우 유용하다.
또한 본 발명에서는 융합단백질에 GFP를 포함시킴으로써 단순한 자외선 조사에 의해 감염유충의 탐색이 용이하고 자연생태계내에 감염 유충의 분포 상태를 파악할 수 있어 무분별한 살충제의 남용을 피할 수 있게 한다.

Claims (10)

  1. 제1 프로모터 및 그의 하류에 연결된 베큘로바이러스(Baculovirus) 다각체 단백질(PH) 유전자, 및 제2 프로모터 및 그의 하류에 연결된 베큘로바이러스 다각체 단백질(PH) 유전자, 비티(Bacillus thuringiensis) 내독소 단백질(CP) 유전자 및 북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)의 초록색 형광 단백질(GFP) 유전자로 구성된 융합 유전자를 포함하는 전이벡터로 형질전환되고, PH-CP-GFP 융합단백질로 이루어진 재조합 다각체를 생산하는 재조합 베큘로바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 베큘로바이러스 다각체 단백질이 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californicaNucleopolyhedrovirus, AcNPV) 유래의 다각체 단백질이고, 비티 내독소 단백질이 CryIAc 단백질의 1번부터 613번까지의 아미노산 서열을 갖는 절편인 재조합 베큘로바이러스.
  3. 제 1 항에 있어서,
    재조합 베큘로바이러스 ColorBtrus(기탁번호: 제 KCTC 0444BP 호).
  4. 제1 프로모터 및 그의 하류에 연결된 베큘로바이러스 다각체 단백질(PH) 유전자, 및 제2 프로모터 및 그의 하류에 연결된 베큘로바이러스 다각체 단백질(PH) 유전자, 비티 내독소 단백질(CP) 유전자 및 북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아의 초록색 형광 단백질(GFP) 유전자로 구성된 융합 유전자를 포함하는 전이벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제1 프로모터가 p10 프로모터(PP10)이고, 제2 프로모터가 PH 프로모터(PPH)이고, 베큘로바이러스 다각체 단백질이 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californicaNucleopolyhedrovirus, AcNPV) 유래의 다각체 단백질이고, 비티 내독소 단백질이 CryIAc 단백질의 1번부터 613번까지의 아미노산 서열을 갖는 절편인 전이벡터 pColorBtrus인 전이벡터.
  6. 제 4 항의 전이벡터와 야생형 베큘로바이러스를 동시에 곤충 세포에 도입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항의 재조합 베큘로바이러스의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 전이벡터가 pColorBtrus인 방법.
  8. 제 1 항의 재조합 베큘로바이러스 또는 그로부터 분리된 재조합 다각체를 포함하는 살충제 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터가 p10 프로모터(PP10) 또는 PH 프로모터(PPH)인 재조합 베큘로바이러스.
  10. 제 4 항에 있어서,
    상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터가 p10 프로모터(PP10) 또는 PH 프로모터(PPH)인 전이벡터.
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