KR100436232B1 - 재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현시스템으로 외래 유전자를 발현시키는 방법 - Google Patents

재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현시스템으로 외래 유전자를 발현시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베큘로바이러스의 폴리헤드린 (polyhedrin) 유전자 대신에 선별표지 마커 유전자 (selectable maker gene), 미니 F 레플리콘 (mini F replicon) 및 바이러스 증식에 필수적인 유전자의 절단된 절편 (truncated fragment)을 포함하는 재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현 시스템 (Baculovirus Expression System)으로 외래 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 바이러스는 대장균 (E. coli) 내에서는 증식이 가능하지만 곤충세포 (insect cell) 내에서는 증식할 수 없기 때문에 외래 유전자를 발현하는 재조합 바이러스 (recombinant virus)의 분리효율과 생성효율이 우수하여 베큘로바이러스 발현 시스템의 외래 유전자 발현 재조합 바이러스 제작을 위한 모벡터로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현 시스템으로 외래 유전자를 발현시키는 방법{RECOMBINANT VIRUS AND A METHOD FOR EXPRESSING FOREIGN GENE BY VACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM USING SAME}
본 발명은 베큘로바이러스의 폴리헤드린 (polyhedrin) 유전자 대신에 선별표지 마커 유전자 (selectable maker gene), 미니 F 레플리콘 (mini F replicon) 및바이러스 증식에 필수적인 유전자의 절단된 절편 (truncated fragment)을 포함하는 재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현 시스템 (Baculovirus Expression System)으로 외래 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
핵다각체병 바이러스 (Nuclear Polyhedrosis Virus; NPV) 유전자의 강력한 프로모터 (Promoter)를 이용하는 베큘로바이러스 발현벡터 시스템 (Baculovirus Expression Vector System)은 발현효율이 매우 높을 뿐만 아니라 고등 진핵세포인 곤충세포를 이용함으로써 발현된 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균 (E. coli), 효모 (Yeast), 포유동물세포 (Mammal cell) 등을 이용하는 다른 발현벡터 시스템에 비해 크게 주목을 받고 있다 (O'Reillyet al.,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual,W. H. Freeman and Company, New York, 1992). 현재, 오토그라파켈리포니카 핵다각체병 바이러스 (Autographa californicaNPV; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스 (Bombyx moriNPV; BmNPV)를 이용하는 두 가지 발현벡터 시스템이 널리 이용되고 있다 (Smithet al.,Mol. Cell. Biol.3:2156-2165, 1983; Maedaet al.,Nature315:592-594, 1985).
이들 바이러스의 게놈은 약 134 kb 크기의 이중나선 (double stranded)의 원상 (circular) DNA 구조로 이루어져 있는데, 게놈의 사이즈가 너무 크기 때문에 단순히 이들 바이러스 게놈을 제한효소로 절단하고 외래 단백질 유전자를 삽입하는 것이 용이하지 않다. 대신에, 실험관 내 (in vitro) 상태에서 상동재조합 반응(homologus recombination)에 통해 외래 단백질 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 제작되고 있다 (O'Reillyet al.,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual,W. H. Freeman and Company, New York, 1992). 즉, 재조합을 하고자 하는 위치의 바이러스 유전자 절편과 바이러스의 강력한 프로모터인 폴리헤드린 (polyhedrin) 프로모터를 포함하는 벡터에 외래 단백질 유전자를 클로닝 (cloning)하여 전이벡터 (transfer vector)를 만들고 상기 전이벡터를 바이러스 전체 게놈과 함께 곤충세포 (insect cell)에 동시 형질감염 (cotransfection)을 시키면 이들간에 이중 상동재조합이 일어나게 되고 외래 단백질 유전자는 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에서 바이러스 게놈 내에 삽입되게 된다. 이렇게 생성된 재조합 바이러스는 다각체 (polyhedra)를 형성하지 않기 때문에 다각체를 형성하는 야생주 바이러스 (wild-type virus)로부터 순수하게 분리될 수 있다. 그러나, 실제로 상동재조합이 일어날 확률은 0.1 내지 1% 밖에 되지 않기 때문에 수없이 많이 생성되어진 야생주 바이러스로부터 재조합 바이러스를 분리하는 작업이 쉽지가 않다.
현재 이러한 문제를 해결하기 위한 연구가 여러 방법으로 이루어지고 있다. 그 첫 번째 방법은 바이러스 DNA를 선상화 (linearization)시키는 것이다 (Kittset al.,Nucleic Acids Res.18:5667-5762, 1990). 선상화된 바이러스 DNA는 그 자체로는 바이러스 활성이 없지만 전이벡터와 함께 재조합이 일어나게 되면 재조합 바이러스는 재원상화 (recircularization)되고 증식력을 가지게 된다. 특히, 이러한 방법을 이용할 때에는 바이러스 게놈 내에 존재하는 필수 유전자 (essentialgene)를 이용하는 것이 매우 효과적이다. 베큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자 하류에는 바이러스의 캡시드 (capsid) 단백질을 발현하는 ORF 1629라는 유전자가 존재하는데, 상기 유전자는 바이러스의 증식에 있어서 필수적인 유전자이다. 킷츠와 포시 (Kitts and Possee,BioTechniques14:810-817, 1993)는 폴리헤드린 유전자의 상류부분 (upstream region)과 ORF 1629 유전자 내에 제한효소Bsu36I의 작용점을 가지는 재조합 AcNPV 변이주 (variant), BacPAK 6을 제작하였다. 상기 바이러스 게놈에 제한효소Bsu36I을 처리하게 되면 바이러스 내에 존재하는 ORF 1629 유전자가 부분적으로 제거되고 바이러스가 선상화되면서 증식력을 잃게 된다. 그러나, 완전한 ORF 1629 유전자를 가진 전이벡터와 재조합이 일어나게 되면 바이러스는 다시 증식력을 가지게 되는데, 이때 목적 유전자가 삽입되면서 이로부터 증식된 바이러스는 대부분 재조합 바이러스가 되는 것이다. 실제로 이러한 방법을 이용하면 약 90% 이상의 재조합 바이러스를 얻을 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 이러한 방법의 가장 큰 문제점은 바이러스 게놈이Bsu36I에 의해 완전처리가 되어야 하고, 그렇지 못할 경우에는 남아있는 야생주 바이러스에 의해 재조합 바이러스의 분리효율이 급격히 떨어지게 된다는 것이다.
재조합 바이러스 분리를 위한 또 다른 방법으로는 폴리헤드린 지역에 미니 F 레플리콘 (mini-F replicon)과 Tn7 전이 부위 (Tn7 transposition site)를 가진 재조합 바이러스, 백미드 (bacmid)를 이용하는 방법이다 (Luckowet al.,J. Virol.67:4566-4579, 1993). 상기 백미드의 DNA는 대장균에서 증식이 가능하다. 즉, 삽입하고자 하는 유전자를 전이벡터 내에 존재하는 Tn7 말단 사이에 클로닝한 후, 이전이벡터를 백미드 게놈을 포함하면서 Tn7 전이효소 (transposase)를 발현하는 대장균 내에 도입하면 목적 유전자는 백미드 게놈 내의 전이 부위에 정확히 삽입된다. 이렇게 만들어진 재조합 바이러스 DNA를 대장균으로부터 순수하게 분리한 후 곤충세포에 감염시키면 순수한 재조합 바이러스를 얻을 수 있다. 그러나, 상기 방법은 재조합 바이러스 분리과정이 대장균의 콜로니로부터 이루어지기 때문에 바이러스 플라크 (plaque)를 분리하는 것 보다 쉬운 장점은 있으나, 순수한 재조합 바이러스를 얻기 위해서는 대장균 및 곤충세포의 두 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 극복하고 야생주 바이러스로부터 외래 유전자를 발현하는 재조합 바이러스의 분리를 용이하게 하고자 예의 연구 노력한 결과, 폴리헤드린 유전자 대신 선별표지 마커 유전자와 미니 F 레플리콘을 포함하면서 바이러스 증식에 필수적인 유전자의 절단된 절편을 갖는 재조합 바이러스를 제작하고 상기 재조합 바이러스가 대장균 내에서는 증식하지만 곤충세포주 내에서는 증식하지 않아 베큘로바이러스 발현 시스템의 제조합 바이러스 제작을 위한 모벡터로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 외래 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 야생주 바이러스로부터 용이하게 분리하기 위하여 대장균 내에서는 증식하지만 곤충세포주 내에서는 증식하지 않는 재조합 바이러스를 제공하는 것이다.
도 1a,도 1b및도 1c는 전이벡터 pAcLacZ의 제작과정을 나타낸 모식도이고,
도 2는 대장균 내에서 증식하는 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 분리과정을 나타낸 것이고,
도 3a는 전이벡터 pAcLacZ, bAcLacZ 및 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈 (genome) DNA에 제한효소EcoRI과PstI을 처리한 후 아가로스 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis)을 수행한 결과이고,
레인 1: λ HindⅢ 크기 마커,
레인 2: 1 kb DNA 사다리 마커 (Fermentas. Co., USA)
레인 3: 제한효소EcoRI으로 처리된 pAcLacZ DNA,
레인 4: 제한효소EcoRI으로 처리된 bAcLacZ DNA,
레인 5: 제한효소EcoRI으로 처리된 bAcGOZA DNA,
레인 6: 제한효소PstI으로 처리된 pAcLacZ DNA,
레인 7: 제한효소PstI으로 처리된 bAcLacZ DNA,
레인 8: 제한효소PstI으로 처리된 bAcGOZA DNA
도 3b는도 3a의 아가로스 겔을 미니 F 레플리콘과 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드 pMiniF-Kan을 탐침으로 하여 서던 블럿 분석 (Southern blot analysis)을 수행한 결과이고,
레인 3 내지 레인 8의 시료는도 3a와 동일하며,
도 3c는도 3a의 아가로스 겔을 lacZα 요소와 ORF 1629 절편을 포함하는 플라스미드 pBacLeLac을 탐침으로 하여 서던 블럿 분석을 수행한 결과이고,
레인 3 내지 레인 8의 시료는도 3a와 동일하며,
도 3d는도 3a의 아가로스 겔을 LacZ α 요소 (element) DNA를 탐침으로 하여 서던 블럿 분석을 수행한 결과이고,
레인 3 내지 레인 8의 시료는도 3a와 동일하며,
도 4는 전이벡터 pAcLacZ, bAcLacZ 및 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 제한효소 지도 (restriction enzyme map)를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자 대신 선별표지 마커 유전자, 미니 F 레플리콘 및 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자의 절단된 절편을 갖는 재조합 바이러스 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 모벡터로 이용하는 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 외래 유전자를 발현하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 베큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자 대신 선별표지 마커 유전자, 미니 F 레플리콘 및 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자의 절단된 절편을 갖는 재조합 바이러스 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 외래 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 야생주 바이러스로부터 용이하게 분리하기 위하여 대장균 내에서는 증식하지만 곤충세포주 내에서는 증식하지 않는 재조합 바이러스를 제작한다.
상기 재조합 바이러스는
1) 선별표지 마커 유전자, 미니 F 레플리콘, 바이러스 증식에 필수적인 유전자 절편 및 lacZα 요소를 포함하는 전이벡터를 제작하는 단계;
2) 상기 전이벡터를 야생형 베큘로바이러스 DNA와 함께 곤충세포에 동시 형질감염시켜 다각체를 형성하지 않는 재조합 바이러스만을 순수하게 분리하는 단계;
3) 상기 재조합 바이러스를 곤충세포에서 다시 증식시킨 후 이로부터 바이러스 게놈을 분리하는 단계;
4) 상기 바이러스 게놈을 대장균에 형질전환시킨 후 이를 선별배지에 도말하여 대장균 형질전환체 중 재조합 바이러스를 포함하는 콜로니만을 선별하는 단계; 및
5) 상기 대장균 형질전환체로부터 재조합 바이러스의 게놈 DNA를 분리하는 단계에 의해 제작된다.
단계 1)의 전이벡터로서 본 발명의 바람직한 실시예에서 제작된 벡터 pAcLacZ는 베큘로바이러스 폴리헤드린 유전자 대신에 선별표지 마커 유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고, 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자로 캡시드 단백질 발현 유전자인 ORF 1629 유전자 절편, 대장균의 복제원점인 미니 F 레플리콘 및 알파 상보작용 (α complementation)을 유도하는 lacZα 요소를 포함하며, 이들 모두는 폴리헤드린 상류와 완전한 형태의 ORF 1629 유전자 사이에 존재하게 된다 (도 1c참조; ORF 603 유전자는 AcNPV 바이러스 게놈에서 폴리헤드린 유전자 왼쪽에 위치한 비필수 [non-essential] 유전자로서, 이 ORF 603을 포함한 왼쪽 부분과 ORF 1629를 포함하는 오른쪽 부분이 전이 벡터와 바이러스 게놈간의 상동재조합이 일어나는 곳이다.). 베큘로바이러스의 ORF 1629 유전자는 GenBank에 (등재번호 L22858)로 등재되어 있다. 상기 전이벡터에서 ORF 1629 유전자 절편은 완전한 형태의 ORF 1629 유전자와 인접하여 동일한 방향으로 존재하며, lacZα 요소는 X-gal과 IPTG가 존재하는 배지 내에서 형질전환된 균주의 콜로니 (colony) 색깔을 푸른빛으로 유도하게 된다. 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자로는 상기에서 사용된 ORF 1629 유전자 이외에도 헬리케이즈 (Helicase), DNA 중합효소 (DNA polymerase) 또는 여러 종류의 후기 유전자 발현 요소 (late gene expression factor; lef) 유전자 등이 사용될 수 있고, 또한 이들은 완전한 크기를 갖지 못하면 바이러스를 증식시키지 못하므로 이들의 절단된 단편은 임의의 크기라도 본 발명의 목적을 충족시킬 수 있다. 선별표지 마커 유전자로는 카나마이신 저항성 유전자 이외에 암피실린 저항성 유전자 또는 lacZα 유전자 등이 사용될 수 있다.
단계 2)에서 사용될 수 있는 곤충세포주로는 Sf9, Sf21 또는 Tn5 등이 있으며, 다각체를 형성하지 않는 재조합 바이러스는 플라크법 (O'Reillyet al.,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual,W. H. Freeman and Company, New York, 1992)을 통해 순수하게 분리할 수 있다.
단계 3)에서 분리된 바이러스 게놈은 두 가지의 형태로 존재하는데, 하나는 ORF 1629의 완전한 형태의 유전자와 절편간의 상동재조합에 의해 lacZα 요소와 ORF 1629 유전자의 일부분이 제거된 바이러스 게놈 vAcGOZA이고 다른 하나는 상기와 같은 상동재조합이 일어나지 않아 lacZα 요소와 전체 ORF 1629 유전자를 모두 포함하는 바이러스 게놈 vAcLacZ이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 GenBank에 등재번호 L22858로 기재된 ORF 1629 유전자의 염기서열 중 1222부터 1632까지의 염기서열인 411 bp의 절편이 제거된 바이러스 게놈이 상동 재조합에 의해 형성되었다.
이들 게놈을 단계 4)와 같이 대장균에 형질전환 (transformation)시킨 후카나마이신 (kanamycin), X-gal 및 IPTG가 존재하는 배지에 도말 (Plateing)하여 배양하면 대장균 내에 존재하는 바이러스 게놈 bAcGOZA는 상동재조합에 의해 lacZα 요소가 제거되었기 때문에 하얀색 콜로니를 형성하는 반면 bAcLacz는 lacZα 요소를 포함하고 있어 푸른색 콜로니를 형성하게 된다.
단계 5)에서 대장균 형질전환체로부터 증식된 재조합 바이러스 게놈 DNA를 이용하여 서던 블럿 분석과 제한효소 지도작성을 수행한 결과, 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA는 LacZα 요소와 ORF 1629 유전자의 일부분이 제거된 게놈을 가지고 있음을 확인하였다 (도 3및도 4참조).
상기 과정을 통해 선별된 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈으로 형질전환된 대장균 형질전환체 DH10B/bAcGOZA는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2000년 2월 22일자로 기탁되었다 (수탁번호: KCTC-18077P).
상기 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈은 바이러스의 모든 유전자 외에, 폴리헤드린 유전자 대신 카나마이신 저항성 유전자와 미니 F 레플리콘을 가지면서 필수 유전자인 ORF 1629의 절단된 (truncated) 절편을 포함한다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA는 대장균 내에서는 증식이 가능하지만 곤충세포 내에서는 증식할 수 없으므로 외래 유전자를 포함하는 재조합 바이러스의 분리효율을 증진시킬 수 있다. 이러한 특징을 갖는 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA는 기존에 개발된 곤충세포 내에서는 증식이 가능하지만 대장균 내에서는 증식할 수 없는 재조합 바이러스 BacPAK 6이나 곤충세포와 대장균 모두에서 증식할 수 있는 백미드를 베큘로바이러스 발현 시스템에서 외래 유전자를 함유하는 재조합 바이러스 제작을위한 모벡터로 사용하는 경우에 지적되어 온 복잡한 분리과정 및 낮은 분리효율 등의 문제점을 해결한 발명이다.
특히, 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈 내에 존재하는 ORF 1629의 절단된 절편은 기존의 제한효소 처리 방법이 아닌 바이러스 게놈 내의 상동재조합 에 의한 것으로, BacPAK 6에서와 같은 제한효소 처리과정이 요구되지 않는다.
더욱이, 이러한 상동재조합에 의한 필수 유전자 절편의 제거방법은 지금까지 한번도 시도된 적이 없는 독창적인 방법으로, ORF 1629 유전자 뿐만 아니라 헬리케이즈 (Hellicase), DNA 중합효소 (DNA polymerase) 또는 여러 종류의 후기 유전자 발현 요소 (late gene expression factor; lef) 유전자 등 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자들에 대해서도 동일한 방법으로 적용이 가능하다. 즉, vAcLacZ와 유사하게, 상기의 목적한 필수 유전자의 절단된 절편을 완전한 형태의 동일한 필수 유전자와 인접하여 동일한 방향으로 존재하게 하고, 그 사이에 lacZα 등의 요소와 같은 마커 유전자가 삽입된 재조합 바이러스들을 각각 제작한다. 이들 재조합 바이러스를 Sf9, Sf21 또는 Tn5 등과 같은 곤충 세포주에서 증식시킨다. 이들 게놈을 대장균에 형질전환 (transformation)시킨 후 카나마이신 (kanamycin), X-gal 및 IPTG가 존재하는 배지에 도말 (Plateing)하여 배양하면 상동재조합이 일어나지 않은 바이러스 게놈은 lacZα 요소를 포함하고 있어 푸른색 콜로니를 형성하는 반면, 상동재조합이 일어나 필수 유전자의 일부와 lacZα 요소가 제거된 바이러스 게놈은 대장균 내에 존재하면서 하얀색 콜로니를 형성하게 된다.
위의 상동재조합을 통한 필수 유전자의 절편 제거와 이들을 대장균을 통해선발하는 방법만이 바이러스의 생존에 필수적인 유전자가 제거된 상태의 바이러스 게놈을 순수하게 분리할 수 있는 방법이며 이러한 방법은 바이러스의 특성 조사 등의 연구에 매우 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 상기 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈은 대장균 내에서 증식이 가능하기 때문에 기존의 초원심을 이용한 바이러스 게놈 분리방법과 달리 상업적으로 이용 가능한 대장균 게놈 분리 키트 (Kit)를 이용하여 대량의 바이러스 게놈을 쉽고 간편하게 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈은 상보성이 있는 ORF 1629 절편을 목적 유전자를 가진 전이벡터와 함께 곤충세포 내에 동시 형질감염시키므로 두 DNA 간의 상동재조합에 의해 완전한 형태의 ORF 1629와 목적 유전자를 가진 재조합 바이러스가 생성되고 이들만이 증식력을 갖게 되므로 기존의 백미드 시스템 (bacmid system)과는 달리 재조합 바이러스 분리를 위한 다른 처리과정이 요구되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 모벡터로 이용하는 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
ORF 1629는 모든 베큘로바이러스에 있어 필수 유전자로 알려져 있고 미니 F 레플리콘 또한 200 kb 이하인 모든 베큘로바이러스 게놈을 대장균에서 증식시킬 수 있기 때문에 이들을 포함하는 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 제작방법은 AcNPV 이외에 BmNPV 등 모든 베큘로바이러스를 이용한 발현 시스템에 적용가능하며, 재조합 바이러스 제작을 위한 각각의 베큘로바이러스 모벡터로 유용하게 이용될 수 있다.
이와 같이 본 발명의 재조합 바이러스를 이용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법은
1) 패트리 디쉬에 곤충세포를 도포한 후 정치 배양하는 단계;
2) 상기 세포를 혈청이 포함되지 않은 배양액으로 세척한 후 정치 배양하는 단계;
3) 본 발명의 재조합 바이러스 DNA, 바람직하게는 bAcGOZA DNA 발현시키고자 하는 외래 유전자를 포함하는 전이벡터 DNA 및 리포펙틴을 혼합한 후 혼합액을 실온에서 15 내지 30분 동안 정치시키는 단계;
4) 상기 혼합액을 혈청이 포함되지 않은 세포 배양액과 혼합한 후 이 용액을 단계 2)의 세포에 첨가하고 4 내지 5시간 동안 정치 배양하는 단계; 및
5) 정치 후 상기 혼합액을 버리고 혈청이 포함된 세포 배양액으로 교체한 후 4 내지 5일 동안 관찰하면서 바이러스 감염 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
단계 1)에서 곤충세포는 Sf9 혹은 Sf21 세포를 1 내지 1.5 × 106개의 농도로 도포한 후 28℃에서 2 내지 24시간 동안 정치 배양하는 것이 바람직하다.
단계 2)에서 배양액은 곤충세포 배양용 배지면 모두 사용이 가능하고 일예로 TC-100 인섹트 미디움 (Gibco BRL)이 사용될 수 있다.
단계 3)에서 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA DNA는 10 ng 내지 10 ㎍, 발현시키고자 하는 외래 유전자를 포함하는 전이벡터 DNA는 50 ng 내지 50 ㎍, 리포펙틴은 1 ㎍ 내지 50 ㎍씩 사용하여 혼합하는 것이 바람직하다. 이때, 리포펙틴 뿐만 아니라 상업적으로 이용가능한 모든 트랜스펙션 리에젼트 (transfection reagent)를 사용할 수 있으며, 각각의 DNA 양은 사용되어지는 트랜스펙션 리에이젼트의 양에 따라 조절할 수 있다.
기존의 방법들에서는 재조합되지 않은 야생주 바이러스가 비교적 높은 비율로 함께 나타나 재조합 바이러스와 야생주 바이러스이 구별이 이루어지지 않기 때문에 이후 플라크법이나 희석법을 수 차례 수행하여 재조합 바이러스를 분리해야 하는 번거로움이 있다. 그러나, 상기 방법에 의한 경우에는 야생주 바이러스가 생존력이 없어 감염되지 않기 때문에 대부분 재조합 바이러스만이 감염되어 곤충세포로부터 나오므로 추가적인 과정이 필요하지 않아 그 분리 과정이 기존의 방법보다 매우 간편하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하나 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전이벡터 pAcLacZ 제작
전이벡터 pAcLacZ의 제작과정을도 1a,도 1b및도 1c에 요약하였다. 우선, 플라스미드 pBacPAK8 (Clontech, Palo Alto, Ca)을 제한효소XhoI과HindIII로 절단하여 AcNPV의 폴리헤드린 프로모터와 ORF 1629의 C-말단 부분을 제거한 후 이를 다시 연결하여 플라스미드 pBacPAK8-1을 제작하였다. 상기 플라스미드pBacPAK8-1을 다시 제한효소BamHI과ClaI으로 처리하여 630 bp의 ORF 1629 절편을 분리한 후 클레노우 절편 (Klenow fragment)으로 블런팅 (blunting)하였다. 또한, 플라스미드 pBacPAK9 (Clontech)를 제한효소KpnI과XbaI으로 절단하여 블런팅한 후 상기에서 블런팅된 630 bp의 ORF 1629 절편을 삽입하여 플라스미드 pBacLe를 제작하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pBacLe는 완전한 형태의 ORF 1629 유전자와 인접하여 630 bp의 ORF 1629 절편이 동일한 방향으로 존재한다.
한편, 알파 상보작용 (α complementation)을 유도하는 lacZα 요소 (element)를 플라스미드 pGEM-5Zf(-) (Promega, Madison, Wi)로부터 제한효소PvuII의 부분처리 (partial digestion)와 NaeI의 완전처리 (full digestion)에 의해 834 bp 절편으로 분리하였고, 이것을 제한효소XhoI과PacI으로 절단하여 블런팅한 플라스미드 pBacLe에 삽입하여 플라스미드 pBacLeLac를 제조하였다 (도 1a). 이렇게 만들어진 플라스미드 pBacLeLac에서 lacZα 요소는 완전한 형태의 ORF 1629 유전자와 630 bp의 ORF 1629 절편 사이에 존재하게 되는데, X-gal과 IPTG가 존재하는 배지 내에서 형질전환된 균주의 콜로니 (colony) 색깔을 푸른빛으로 유도하게 된다.
한편, pUC4-K (Taylor and Rose,Nucleic Acid Res., 16: 358, 1988)로부터 제한효소PstI 처리에 의해 카나마이신 (Kanamycin) 저항성 유전자 (resistant gene)가 포함된 1,240 bp 절편을 분리한 후 pBacPAK8의PstI위치에 삽입하여 클론 (clone) pBac8-Kan을 제작하였다. 대장균에 있어 복제 원점 (Replication Origin)인 미니 F 레플리콘은 pMon14272 (Luckowet al.,J. Virol.67: 4566-4579, 1993)로부터 제한효소HpaI을 이용하여 분리하였고 이것을 다시 pBac8-Kan으로부터 제한효소BamHI과EcoRI 처리와 클레노우 절편으로 블런팅된 카나마이신 저항성 유전자와 연결하여 플라스미드 pMiniF-Kan을 제작하였다 (도 1b). 마지막으로, 플라스미드 pMiniF-Kan은 제한효소SacI으로, 그리고 플라스미드 pBacLeLac는 제한효소EcoRI으로 처리하고 각각을 블런팅한 후 이들을 서로 연결하여 최종적으로 전이벡터 pAcLacZ를 제작하였다 (도 1c).
이와 같이 제작된 전이벡터 pAcLacZ는 카나마이신 저항성 유전자, 미니 F 레플리콘, ORF 1629 유전자의 절편 그리고 lacZα 요소를 포함하고 있으며, 이들 모두는 폴리헤드린 상류와 완전한 형태의 ORF 1629 유전자 사이에 존재하게 된다.
<실시예 2> 대장균 내에서 증식 가능한 베큘로바이러스 게놈의 제작
대장균에서 증식이 가능한 본 발명의 베큘로바이러스 bAcGOZA 게놈의 제작과정을도 2에 요약하였다. 상기 실시예 1에서 제작된 전이벡터 pAcLacZ를 야생주 AcNPV (Dr. Summers, USA)DNA 와 함께 곤충세포주인 Sf9 세포 (Dr. Summers)에 동시 형질감염 (cotransfection)시킨 후 플라크법 (O'Reillyet al.,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual,W. H. Freeman and Company, New York, 1992)을 통하여 다각체를 형성하지 않는 재조합 바이러스 vAcLacZ (여기서, 'v'는 바이러스를 의미함)를 순수하게 분리하였다.
바이러스의 농도 결정 및 순화를 위한 플라크법은 곤충세포를 60 ㎜ 배양 플레이트 당 2 × 106개로 분주하여 1시간 동안 정치한 후 배양액을 제거하고, 준비한 바이러스 접종액을 접종하여 28℃에서 1시간 동안 배양하여 바이러스가 감염되도록 하였다. 그 후 접종액을 제거하고 새 배양액으로 교체한 후, LM 아가로오스 (Seakem, USA) 0.5%가 포함된 배양액 3 ㎖을 세포주 위에 보충하고 28℃에서 계속 배양하였다. 접종 4 내지 5일 후부터 바이러스 감염에 의한 플라크 형성 유무를 위상차 도립현미경으로 관찰하였다.
Sf9 세포주에 대한 DNA의 동시 형질감염은 리포펙틴TM(LipofectinTM, GIBCO BRL/Life Technologies, USA)를 이용하여 제조 회사의 지침에 따라 실시하였다. 구체적으로, 1 내지 1.5 × 106세포를 35 ㎜ 배양 플레이트에 접종하고 28℃에서 2 내지 24시간 동안 정치시킨 후 야생주 AcNPV DNA 1 ㎍ : 전이벡터 pAcLacZ 5 ㎍의 비율로 리포펙틴 100 ㎕에 희석하여 상온에서 15분간 반응시켰다. 그 후 세포 배양액과 혼합하여 4 내지 5시간 동안 처리하고, 새 배양액으로 교체한 후 접종 4 내지 5일 후부터 병징 유무를 통하여 감염을 확인하였다.
이렇게 감염을 확인한 재조합 바이러스 vAcLacZ를 Sf9 세포에 다시 증식시킨 후 이로부터 바이러스 게놈을 분리하였다. 이와 같이 분리된 바이러스 게놈은 두 가지의 형태로 존재하게 되는데, 즉 vAcLacZ 내에 존재하는 ORF 1629의 완전한 형태의 유전자와 절편간의 상동재조합에 의해 lacZα 요소와 ORF 1629 유전자의 일부분이 제거된 vAcGOZA와 상동재조합이 일어나지 않아 lacZα 요소와 전체 ORF 1629 유전자를 포함하는 vAcLacZ가 그것이다. 이들 게놈을 대장균 DH10B (Invitrogen,USA)에 형질전환 (transformation)시킨 후 10 ㎍/㎖ 카나마이신 (kanamycin), 20 ㎎/㎖ X-gal 및 200 ㎎/㎖ IPTG가 존재하는 배지에 도말 (Plateing)하여 37℃에서 16시간 동안 배양하면 bAcGOZA (여기서, 'b'는 대장균 내에 존재하는 바이러스 게놈을 의미함)는 상동재조합에 의해 lacZα 요소가 제거되었기 때문에 하얀색 콜로니를 형성하는 반면 bAcLacz는 lacZα 요소를 포함하고 있어 푸른색 콜로니를 형성하게 된다.
이상의 결과로 대장균으로부터 증식된 재조합 바이러스 게놈 bAcLacZ와 bAcGOZA를 분리하였다.
<실시예 3> 베큘로바이러스 게놈 bAcLacZ와 bAcGOZA의 구조 확인
대장균으로부터 증식된 베큘로바이러스 게놈 bAcLacZ와 bAcGOZA의 구조를 분석하기 위해 서던 블럿 분석과 제한효소 지도 작성을 수행하였다 (도 3및도 4). bAcLacZ (레인 4와 7)와 bAcGOZA (레인 5와 8)의 바이러스 게놈과 대조구인 플라스미드 pAcLacZ DNA (레인 3과 6)를 퀴아젠 칼럼 (Qiagen column; Studio City, Ca.)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 순수하게 분리하였고, 제한효소EcoRI (레인 3, 4 및 5)과PstI (레인 6, 7 및 8)으로 각각 처리하여 전기영동을 수행한 후 (도 3a) 서던 블럿의 일반적인 방법으로 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 탐침 (probe)으로는 pMiniF-kan (도 3b), pBacLeLac (도 3c) 및 lacZα 요소 (도 3d)를 이용하였고, 이들을 각각 DIG DNA 라벨링 키트 (DIG DNA labelling kit, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)을 이용하여 표지 (labeling)하였다.
그 결과, 미니 F 레플리콘과 카나마이신 저항성 유전자를 탐침으로 서던 블럿 분석을 수행한 경우에는, 제한효소EcoRI과PstI으로 처리된 각각의 bAcLacZ와 bAcGOZA의 밴드 패턴이 pAcLacZ에 검출되는 밴드와 동일한 양상을 나타냄으로써 이들 바이러스 게놈 내에 완전한 형태의 미니 F 레플리콘과 카나마이신 저항성 유전자가 존재함을 확인하였다 (도 3b). 그러나, lacZα 요소와 ORF 1629 절편을 포함하는 플라스미드 pBacLeLac을 탐침으로 서던 블럿 분석을 수행한 경우에는 두 바이러스 게놈간에 서로 다른 밴드 패턴이 검출되었다. 즉, 제한효소EcoRI으로 처리된 bAcLacZ의 경우에는 4.15와 4.01 kb의 밴드가 검출되는 반면에 bAcGOZA의 경우에는 4.15와 2.07 kb의 밴드가 검출되었다. 또한, 제한효소PstI으로 처리된 bAcLacZ 경우에는 6.06, 5.01 및 1.24 kb의 밴드가 검출되는 반면에 bAcGOZA의 경우에는 6.06과 4.31 kb의 밴드가 검출되었다 (도 3c). 이러한 차이는도 4에 나타난 바와 같이 bAcGOZA의 바이러스 게놈에서 lacZα 요소와 ORF 1629의 일부분이 제거되었음을 나타내는 것이다. 상기 결과는 lacZα 요소만을 탐침으로 서던 블럿 분석을 수행한 경우에 더욱 확실히 증명되는데, bAcLacZ와 pAcLacZ는 lacZα 요소의 밴드가 검출되는 반면 bAcGOZA의 경우에는 아무런 밴드도 검출되지 않았다 (도 3d).
상기와 같이 LacZα 요소와 ORF 1629 유전자의 일부분이 제거된 게놈을 갖는 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA의 게놈으로 형질전환된 대장균 형질전환체 DH10B/bAcGOZA는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2000년 2월 22일자로 기탁되었다 (수탁번호: KCTC-18077P).
<실시예 4> bAcGOZA를 이용한 재조합 바이러스 제작
베큘로바이러스 발현 시스템에 있어 재조합 바이러스 제작을 위한 본 발명의 베큘로바이러스 게놈 bAcGOZA의 이용가능성을 확인하기 위하여, 대장균으로부터 순수하게 분리한 bAcGOZA 게놈을 폴리헤드린 프로모터를 기초로 한 전이벡터 pBacPAK-LacZ와 함께 Sf9 세포에 동시 형질감염시키고 상기 재조합 바이러스의 생성효율을 측정하였다. 대조구로는 동시감염 전에 제한효소Sse8387I (TaKaRa Biomedicals, Japan)로 처리된 bAcGOZA 게놈을 이용하였다. 야생주 AcNPV 게놈은 제한효소Sse8387I로는 절단되지 않지만, 본 발명의 베큘로바이러스 게놈 bAcGOZA는도 4에 나타난 바와 같이 4곳에 제한효소 절단위치가 존재한다. 따라서,Sse8387I로 처리된 bAcGOZA의 게놈은 기존에 보고된 제한효소Bsu36I로 처리된 BacPAK6의 바이러스 게놈과 기능상으로 유사하여 본 발명의 대조구로서 뿐 아니라 자체 제품으로서의 이용가치를 갖는다. 또한, 본 실험에 사용된 폴리헤드린 기초 전이벡터 pBacPAK-LacZ는 플라스미드 pCH110 (Pharmacia)으로부터 표지 유전자 (reporter gene)인 대장균 lacZ 유전자 3.7 kbHindIII-BamHI 절편을 순수하게 분리하여 클레노우 단편으로 블런팅한 후, 이를 제한효소BamHI와 블런팅 처리된 pBacPAK8 (Clontech) 내에 삽입시켜 제작한 벡터이다. 상기 전이벡터에 의해 형성된 재조합 바이러스는 곤충세포주 내에서 X-gal 처리시 푸른색 플라크를 나타내기 때문에 재조합 바이러스의 생성량을 측정하기가 용이하다.
제한효소Sse8387I로 처리하거나 (Linear) 처리하지 않은 (Circular) 각각의 bAcGOZA DNA 100 ng 씩을 500 ng의 전이벡터 DNA와 함께 전이물질인 리포펙틴(Lipofectin; GIBCO BRL/Life Technologies, USA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 리포좀 매개전이 (Liposome mediated transfection) 방법으로 Sf9 세포에 동시 형질감염시켰다. 아울러, bAcGOZA 자체의 증식력 여부를 확인하기 위하여 bAcGOZA DNA 100 ng만을 상기와 동일한 방법으로 전이시켰다. 감염 5일 후 각각의 곤충세포주를 수거하여 상등액만을 분리하고 상등액 내에 존재하는 재조합 바이러스의 농도를 일반적인 플라크법과 X-gal 처리에 의하여 측정하였고 (O'Reillyet al.,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual,W. H. Freeman and Company, New York, 1992), 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.
bAcGOZA를 이용한 재조합 바이러스의 생성효율
바이러스 DNA 전이벡터 역가 (1×106pfu/㎖)
평균 (n=3) 최저 최상
선형 bAcGOZA pBacPAK-LacZ 1.77 1.73 1.81
환형 bAcGOZA pBacPAK-LacZ 5.79 2.18 11.1
환형 bAcGOZA None ND* ND ND
ND*: 검출되지 않음
상기표 1에 나타난 바와 같이, bAcGOZA와 pBacPAK-LacZ의 동시감염에 의해 생성된 재조합 바이러스의 농도는 평균 5.79 × 106pfu/㎖로 제한효소Sse8387I로 처리된 bAcGOZA 게놈의 재조합 바이러스 (1.77 × 106pfu/㎖) 보다 약 3배 정도 생성효율이 높은 것으로 확인되었으며, bAcGOZA만을 감염시킨 경우에는 예상했던 바와 같이 바이러스가 전혀 증식하지 못했다.
이상의 결과는 본 발명에 의해 제조된 재조합 바이러스 bAcGOZA가 제한효소Sse8387I로 처리하든, 처리하지 않든 베큘로바이러스 발현 시스템의 재조합 바이러스 제작에 있어 모벡터로 이용할 수 있음을 보여주는 것이다.
상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 재조합 바이러스 bAcGOZA는 베큘로바이러스 발현 시스템의 재조합 바이러스 제작에 있어 기존의 모벡터와는 전혀 다른 바이러스 게놈 내 상동재조합 방법에 의해 만들어져 제작이 용이하고, 곤충세포주 내에서는 증식할 수 없지만 대장균 내에서는 증식이 가능하여 재조합 바이러스의 분리효율 및 생성효율이 우수하므로 베큘로바이러스 발현 시스템의 재조합 바이러스 제작을 위한 모벡터로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 베큘로바이러스의 폴리헤드린 (polyhedrin) 유전자 대신 선별표지 마커 유전자, 미니 F 레플리콘 (mini F replicon) 및 베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자가 절단된 절편 (truncated fragment)을 포함하여 대장균 내에서는 증식이 가능하지만 곤충세포 내에서는 증식할 수 없는 재조합 베큘로바이러스.
  2. 제 1항에 있어서,
    베큘로바이러스 증식에 필수적인 유전자는 ORF 1629 유전자, 헬리케이즈(Helicase) 유전자, DNA 중합효소 (DNA polymerase) 유전자 및 후기 유전자 발현 요소 (late gene expression factor; lef) 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 베큘로바이러스.
  3. 제 1항에 있어서,
    선별표지 마커 유전자는 카나마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자 및 lacZα 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 베큘로바이러스.
  4. 제 1항에 있어서,
    필수 유전자의 절단된 절편은 상동재조합 방법에 유전자의 일부가 제거되어 형성되는 것을 특징으로 하는 재조합 베큘로바이러스.
  5. 제 1항에 있어서,
    필수 유전자가 ORF 1629 유전자이고 선별표지 마커 유전자가 카나마이신 저항성 유전자 (kanamycin resistant gene)이며,도 4로 기재되는 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 베큘로바이러스 bAcGOZA.
  6. 재조합 베큘로바이러스 bAcGOZA 게놈으로 형질전환된 대장균 형질전환체 DH10B/bAcGOZA (수탁번호: KCTC 18077P).
  7. 1) 베큘로바이러스의 필수 유전자의 절단된 절편을 완전한 형태의 동일한 필수 유전자와 인접하여 동일한 방향으로 존재하게 하고, 그 사이에 선별 표지 마커 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 제작하는 단계;
    2) 상기 재조합 베큘로바이러스를 곤충 세포주에서 증식시킨 후 바이러스 게놈을 분리하는 단계; 및
    3) 상기 바이러스 게놈을 대장균에 형질전환 (transformation)시킨 후 선별배지에서 선별하는 단계를 포함하는, 상동재조합에 의해 베큘로바이러스의 필수 유전자를 제거하는 방법.
  8. 1) 선별표지 마커 유전자, 미니 F 레플리콘, 바이러스 증식에 필수적인 유전자 절편 및 lacZα 요소를 포함하는 전이벡터를 제작하는 단계;
    2) 상기 전이벡터를 야생형 베큘로바이러스 DNA와 함께 곤충세포에 동시 형질감염시켜 다각체를 형성하지 않는 재조합 베큘로바이러스만을 순수하게 분리하는 단계;
    3) 상기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에서 다시 증식시킨 후 이로부터 바이러스 게놈을 분리하는 단계;
    4) 상기 바이러스 게놈을 대장균에 형질전환시킨 후 이를 선별배지에 도말하여 대장균 형질전환체 중 흰색 콜로니만을 선별하는 단계; 및
    5) 상기 선별된 대장균 형질전환체로부터 재조합 베큘로바이러스의 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함하는, 제 1항의 재조합 베큘로바이러스를 제작하는 방법.
  9. 1) 패트리 디쉬에 곤충세포를 도포한 후 정치 배양하는 단계;
    2) 상기 세포를 혈청이 포함되지 않은 배양액으로 세척한 후 정치 배양하는 단계;
    3) 제 1 항의 재조합 베큘로바이러스 DNA, 발현시키고자 하는 외래 유전자를 포함하는 전이벡터 DNA 및 리포펙틴을 혼합한 후 혼합액을 실온에서 15 내지 30분 동안 정치시키는 단계;
    4) 상기 혼합액을 혈청이 포함되지 않은 세포 배양액과 혼합한 후 이 용액을 단계 2)의 세포에 첨가하고 4 내지 5시간 동안 정치 배양하는 단계; 및
    5) 정치 후 상기 혼합액을 버리고 혈청이 포함된 세포 배양액으로 교체한 후 4 내지 5일 동안 관찰하면서 바이러스 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 제 1항의 재조합 베큘로바이러스를 모벡터로 이용하는 베큘로바이러스 발현 시스템 (Baculovirus Expression System)을 이용하여 외래 유전자를 발현시키는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    단계 3)에서 재조합 베큘로바이러스 DNA는 10 ng 내지 10 ㎍이, 발현시키고자 하는 외래 유전자를 포함하는 전이벡터 DNA는 50 ng 내지 50 ㎍이, 리포펙틴은 1 ㎍ 내지 50 ㎍이 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR10-2001-0042252A KR100436232B1 (ko) 2001-07-13 2001-07-13 재조합 바이러스 및 이를 이용한 베큘로바이러스 발현시스템으로 외래 유전자를 발현시키는 방법

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KR101223577B1 (ko) * 2009-05-06 2013-01-17 서울대학교산학협력단 재조합바이러스 비이지박 (ｂＥａｓｙＢａｃ)과 이를 이용한 베큘로바이러스 발현벡터계

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