JPH03139286A - 狂犬病ウイルスｇ蛋白質を産生する組み換えバキュロウイルス及びｇ蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は狂犬病ウィルス糖蛋白質（以下Ｇ蛋白質とする
）をコードする遺伝子を昆虫ウィルスであるバキュロウ
ィルス（以下「＾ＣＮＰＶＪ　という）のポリヘドリン
（多角体）遺伝子のプロモーターの下流に組み込んだ組
み換えＡｃＮＰＶの作出、およびこの組み換えＡｃＮＰ
Ｖを昆虫細胞に感染させた場合に発現される組み換え狂
犬病ウィルスＧ蛋白質の製造方法に関するものである。

（発明の背景） 狂犬病は古くギリシャ時代から知られていた病気の一つ
であり、ウィルスに感染したのち発症した場合には致死
率がほぼ１００％に達する病気である。わが国において
は昭和３１年（１９５６年）の発生を最後に１９５７年
以降完全な撲滅状態が維持されている。この無病状態の
樹立およびその維持ができたのは昭和２５年に制定され
た狂犬病予防法のもとに、木屑の人への主たる伝播者で
ある犬を対象として検疫、野犬捕獲、著大の登録および
予防注射の３本柱による防疫対策の徹底実施のためであ
る。しかしながら世界的には木屑は発生拡大の傾向にあ
り、わが国においても狂犬病の問題はなくなったわけで
はなく、例えば１９７０年にネパール旅行中の日本人学
生が犬に噛まれ、帰国後発症死亡している。

〔従来の技術〕

狂犬病ウィルス粒子はり、Ｎ、Ｇ、ＮＳ、Ｍの５種類の
蛋白質より構成されているが、このうちＧ蛋白質が強い
中和抗体８導を担っており　（ウィクトーら（Ｗｉｋｔ
ｏｒ　ｅｔ　ａｔ、）、　１９７３、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、、１１０：２６９−２７８）　、感染防御抗原とし
て有効であろうと考えられている。今日までにはヨルバ
ートンら（Ｙｏｌｖｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８
３゜５ｃｉｅｎｃｅ、　２１９：８１４−６２０）が大
腸菌の発現系を用いてこのＧ蛋白質を発現させており、
キエニら　（Ｋｉｅｎｙ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８４
．　　Ｎａｔｒｕｒｅ、３１２：１６３−１［ｉ６）は
ワクシニアウィルスの発現系を用いて発現させている。

また酵母により発現させる提案もなされている（特願平
１−１７１４８９号）。

（解決しようとする課題） しかしながら、上記した従来の発現系によっては、Ｇ蛋
白質の産生量が少なく、工業的規模で大量にこれを製造
するためには未だ改善すべき余地がある。

本発明においてはこのＧ蛋白質を哺乳動物には病原性の
ないバキュロウィルスの発現系を用いて発現させ、得ら
れた蛋白質が本来のウィルス粒子中のＧ蛋白質と抗原性
が同じであることを確認し、本発明をなすに至ったもの
である。

上記目的を実現する本発明の特徴は、バキュロウィルス
（ＡｃＮＰＶ　）のポリヘドリンをコードする遺伝子の
プロモータの下流に、上記ポリヘドリンをコードする遺
伝子に組み換えて狂犬病ウィルスＧ蛋白質をコードする
遺伝子を組込んだ組み換えバキュロウィルスにあり、特
に狂犬病ウィルスＧ蛋白質をコードする遺伝子が、狂犬
病ウィルスＲＣ−ＨＬ株由来である組み換えバキュロウ
ィルスにある。

また本発明の他の特徴は、上記組み換えバキユロウィル
スを、スボドプテラ　フルジベルダ細胞（Ｓ　ｏｄｏ　
ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ細胞：以下ｒＳ、ｆ、
、細胞という）に感染させて、この細胞を培養後、細胞
内に蓄積している狂犬病ウィルスＧ蛋白質を分離精製す
るところにある。

木２明においては、狂犬病ウィルスとして西ケ原株に由
来するＲＣ・ＨＬ株（日本生物科学研究所作出、野村吉
利、１９８５、食品衛生研究、３５二２０９−２１８　
、また岐阜大学農学部、源宣之博士より入手可能）を用
いた６本ウィルスのＧ蛋白質をコードするｃＤＮＡ（以
下ｒ　Ｇ−ＣＤＮＡＪという）は、精製狂犬病ウィルス
より遺伝子ＲＮＡを抽出し、合成ブライマーを用いてギ
ュブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆ
ｍａｎ、１９８３．　Ｇｅｎｅ。

２５：　２１ｉ３−２６９）の方法により、クローニン
グすることがで各る。クローニングしたＧ−ｃＤＮＡは
ＡｃＮＰＶ　トランスファーベクターであるｐＡｃＹＭ
ｌ（マツウラ（Ｍａｔｕｕｒａ）ら、１９８７．Ｊ、ｇ
ｅｎ、Ｖｉｒｏｌ。

１＋８：１２３３−１２５０）の多角体プロそ一ターの
下流へ組み込むために、合成ブライマーの部位から翻訳
開始コドンであるＡＴＧの数塩基上流までを除く。除去
には例えばキロシークエンスプレージョンキット（宝酒
造社製）を用いる方法やＢａ１３１エクソヌクレアーゼ
を用いる方法を例示することができる。後記する実施例
においては、前者のキットを用いて不要部分を除き、こ
のＧ−ｃＤＮＡをｐＡｃＹＭｌ　トランス７フーベクタ
ーの多角体プロモーターの下流に組み込んだ組み換えｐ
ＡｃＹＭ１ベクターを構築した１組み換えＡｃＮＰＶを
得るために上記の組み換えｐＡｃＹＭ１ベクターと野生
型＾ｃＮＰＶの遺伝子ＤＮＡの混合ＤＮＡをスポドブテ
ラ　フラジペルダ（Ｓ、ｆ、）細胞にトランスフェクト
する。トランスフェクトさせた細胞を４〜５日間培養す
ると培養上清中に野生型ＡｃＮＰＶのほかにホモロガス
リコンビネーションによって作られた組み換えＡｃＮＰ
Ｖが放出される１組み換えＡｃＮＰＶはポリヘドリン（
多角体）遺伝子を欠いているのでポリヘドリンを産出し
なし）ウィルスクローンをブラック法によりクローニン
グできる。

以上の手順により組み換えＡｃＮＰＶを得るために必要
なｐＡｃＹＭｌ　）ランスフ１−ベクター、野生型Ａｃ
ＮＰＶ及びその遺伝子ＤＮＡ　、Ｓ、ｆ、細胞は英国Ｎ
ＥＲＣウィルス学研究所のビショップ博、±（Ｄ、Ｈ，
Ｌ、、Ｂ１５ｈｏｐ）より入手可能である。

上述の組み換えＡｃＮＰＶは、Ｓ、ｆ、細胞に感染する
と狂犬病ウィルスＧ蛋白質を発現し、この確認は各種抗
原−・抗体反応、例えば蛍光抗体法やイミュノブロツテ
イング法により行なうこと力（で診る。また、目的蛋白
質の発現量を直接確認するためには５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行ないクーマシーブルーで染色
して行なうことができる。

本発明で得た組み換えＡｃＮＰＶを、Ｓ、ｆ、細胞へ感
染させると蛍光抗体法により感染細胞中に特異蛍光がＵ
められ、イミュノブロツテイング法によってもＧ蛋白質
に特異的なバンドが認められた。またクーマシーブルー
によって染色したゲル上でも組み換え＾ｃＮＰＶ感染細
胞に特異的なバンドが認められ、これはイミュノブロツ
ティング法によって認められたバンドと一致した。

本発明における狂犬病ウィルス組み換えＧ蛋白質の発現
量は組み換えＡｃＮＰＶ感染細胞の全蛋白質の１０％程
度を占め、大量にＧ蛋白質を得るたやの有益な方法であ
る。

なお、本発明によって発現させたＧ蛋白質は、狂犬病ウ
ィルス中のＧ蛋白質より−やや分子量が小さいことが確
認されているが、これはＧ蛋白質の糖鎖の付加の仕方が
両者で異なっているためと思われる。しかしながら、上
述したように抗原性という観点からの比較においては両
者は同一であるため、本発明で得られたＧ蛋白質は狂犬
病ウィルスのサブユニットワクチンの開発あるいは診断
用抗原として有用である。

（実　施　例） 以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する。

なお各実施例のうち遺伝操作法においては、特に断りが
ない限り以下の試薬及び方法を用いた。

牝ＩＬｊ臼に１生ヌ 制限酵素は宝酒造■社製及び東洋紡績■社製のものを添
付のプロトコールの条件にしたがって使用した。

修飾酵素及びキット等は、以下のメーカーより購入した
。すなわち生化学工業■社より逆転写酵素を、宝酒造■
社より大腸菌ＲＮａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、大腸菌アルカリフォスフ１
ターゼ、クレノー酵素、キロシーフェンス用デレージョ
ンキット、ライゲージコンキットを、ファルマシア社よ
り子牛胸腺由来ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ、各種デオキシリボヌクレオチドトリフ
ォスフエイトを、ＢＲＬ社よりｐＢＲ３２２のＰｓｔ　
　Ｉ部位にｄＧポリマーを付加したベクターを、アマジ
ャム社よりα−３２Ｐ−ｄｃＴＰα−”Ｐ−ｄＡＴＰを
それぞれ入手し、添付のプロトコールの条件あるいはモ
レキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃ、ｕｌａｒ　（：
１ｏｎｉＢ、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ
　ａｌ、）、１９８２．コールドスプリングへ−バー　
ラボラトリ−）に記載の条件にしたがって使用した。

ＤＮＡの　断、　飾　びライゲーション各々の反応に使
用する酵素及びキットに添付されているプロトコール及
び上記モレキュラークローニングに従った。

アガロース　気味　によるＤＮＡ断片の回収ＢＩＯＩＯ
１社製ＤＮＡ精製用キットＧＥＮＥＣＬＥＡＮをフナコ
シ薬品■社より購入し、添付のプロトコールに従って目
的のＤＮＡ断片を回収した。

プラスミドの　出・精製 モレキュラークローニングｐ９０〜９１及びｐ３６ａ〜
３６９に記載されているアルカリ法を用いた。

ドツト・プロットハイブリダイゼーション第３図に示し
た狂犬病ウィルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株のＧ−ＣＤＮＡ
断片であるプローブＩの部分とプローブＩＩの部分を各
々Ｍ１３ベクターにクローニングした一本鎖ＤＮＡを、
京都大学　河合明彦教授より分与を受け、この−末娘Ｄ
ＮＡに、Ｍ１３ベクターに相補的なブライマーをアニー
ルさせ、クレノー酵素及びα−”Ｐ−ｄｃＴＰを用いて
、アイソトープ標識したプローブを調整した。検査する
プラスミドｔｌＮへのニトロセルロースフィルタ− グされたＤＮＡと上述のプローブとのハイブリダイゼー
ションは、モレキュラークローニングｐ３３１＆びｐ３
８７〜３８９に記載されている方法に従った。

実施例１　：　Ｇ−ｃＤＮＡのクローニング（１）　Ｒ
Ｃ−）ｆＬ株のブラッククローニングＧ−ｃＤＮＡ（７
）クローニングに先立ち、狂犬病ウィルスをセドウイッ
クとウイクトー（Ｓｅｄｗｉｃｋａｎｄ　Ｗｉｋｔｏｒ
，　１９６７、　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．、　１．　１２２
４）の方法に準じて寒天内浮遊法により　Ｂ）ＩＫ−２
　１細胞を用いてブラッククローニングした。すなわち
５　Ｘ　１０’個のＢ）１に一２１細胞をＯ，詰の寒天
培地に浮遊させ、６０ｍｍプッシュに播種し、この細胞
にウィルス液を接種してブラックを形成させクローニン
グした。このクローニングしたウィルスをルー瓶に培養
したＢＨＫ−２１細胞に感染させ、増殖したウィルスを
回収し種ウィルスとした。

（２）狂犬病ウィルス遺伝子ＲＮＡの抽出上記（１）の
穏ウィルスをルー瓶ｌＯ本分の８１（Ｋ−２１細胞に　
ｍｏｉ＝１．５で感染させ６０時間３７℃で培養した。

得られた培養液を４，ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心し、
その上清へ最終濃度として６、５零ポリエチレングリコ
ール＃　６０００と、２．２零ＮａＣ　ｆＬを加え遠心
によりウィルスの沈殿を得た．さらにこの沈殿よりウィ
ルス粒子を精製するために、１０〜４５　ｗ／ｖ９ｇの
ショ糖密度勾配を用いて遠心し、精製ウィルスを得た。

これにより、５００ｍｌの培養上清より約２ｍｇ相当の
ウィルス蛋白質が得られた．精製ウィルス粒子をトルド
（Ｔｏｄｏｒ）ら（１９８６，　ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉ
ｄ　Ｒｅｓｅｒｃｈ，　１４：　２６７１−２６８３）
の方法に従ってブロテイナーゼにおよびＳＯＳ処理し遺
伝子ＲＮＡを得た。

（３）狂犬病ウィルスＧ蛋白質をコードするｃＤＮＡの
合成とクローニング 二本ｔｉｃＤＮ＾の合成はギュブラーとホフマン（Ｇｕ
ｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ．　１９８３，Ｇｅ
ｎｅ，　２５：　２８３−２６９）の方法に準じて行な
った．即ち最初に遺伝子ＲＮＡのＧ蛋白質をコードする
領域の３°側の部分に相補的な２Ｂ塩基の合成ブライマ
ー［５　’−ＴＡＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＴＡＴ
ＣＣＣＧＣＡ＾−３°１をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｉ
＋）社製ＤＮＡ合成機Ｓｙｓｔｅ＠ＩＥ　Ｐｌｕｓによ
り合成した。また上記（２）で得た狂犬病ウィルス遺伝
子ＲＮＡを、モレキュラークローニングのｐ２３１に記
載の方法により水酸化メチル水銀でディネーチャーさせ
た．これらのブライマー（７．５ピコモル）と遺伝子Ｒ
　Ｎ　Ａ　（０．７５ピコモル）をアニールさせ、５０
μ１反応液中で、逆転写酵素により一木１ｉｃＴＩＮ＾
を合成した。

次に一木娘ｃＤＮ＾とハイブリダイズしているＲ　Ｎ　
Ａ　＊ｉに大腸菌ＴＩＮａｓｅＨによってニックを導入
し、形成されたＲ　Ｎ　Ａ　ＩＪｉ断片をブライマーと
して大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■及び大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼにより二本鎖ｃＤＮＡを合成した（第１図）。

このようにして合成した二本鎖ｃＤＮＡに子牛胸腺由来
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を用いて（ＩＣポリマーを付加し、クローニングベクタ
ーであるｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１部位にｄＧポリマー
を付加したベクター（　ＢＲＬ社製）とアニールさせた
（第２図）。

この組み換えＤＮＡをコンピテントな状態の大腸菌Ｄ）
１５α株に導入し、形質転換細胞ｐＢＲ−ＲａＧＬのク
ローンを得た。得られたクローンのうち５０個について
第３図に示す狂犬病ウィルスＨＥ．Ｐ−Ｆｌｕｒｙ株の
Ｇ蛋白質ｃＤＮＡ断片をプローブとしてドットプロット
ハイプリダイゼーシミンを行ない陽性クローンを得た。

この陽性クローンについて制限酵素他国をモレキュラー
クローニングの方法に従って作成し、第３図に示した。

この第３図から分るように本発明者らがクローニングし
た西ケ原株由来Ｒ（ニーＭＬ　ａのＧ−ｃＤＮＡと、板
木ら（特開平１−１７１４８９号）がクローニングした
同株由来Ｎ−１（Ｌ株のＧ−Ｃ［ｌＮＡを比較すると、
Ｇ蛋白質をコードする領域内には、少なくとも６種類の
制限酵素の切断部位のうちＮｒｕｒ部位とＸｈｏ１部位
に変異が認められた。

実施例２　：　Ｇ−ｃＤＮＡのデイリージョン及びＧ−
ｃＤＮＡを組み込んだＡｃＮＰＶ　）ランスファーベク
ターの構築 （１）　Ｇ−ｃＤＮＡのデイリージョンＧ−ｃＤＮＡの
翻訳開始コドンであるＡＴＧの上流の非翻訳領域を除く
ために次の手順によりデイリージョンを行なった。

実施例１で得たクローンよりＧ蛋白質のオープンリーデ
ィングフレームを含むＰｓｔ　１−Ｈｉｎｄｌｌｒ消化
２．：ｌ　ｋｂフラグメントをｐｕｃｔａベクターのＰ
ｓｔ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｌｌｌ切断部位へ組み込んだ（第
４図）。このプラスミドについてキロシーフェンス用デ
レージョンキットを用いてデイリージョン反応を行ない
（第５図）、上記ＡＴＧコドンの６塩基上流までデイリ
ージョンされたクローン９０Ｃ−ΔＲａＧを得た。

上記ＡＴＧ付近の塩基配列は、ハラトリとササキ（ｉｌ
ａｔｔｏｒｉ　ａｎｄ　５ａｓａｋｉ、　１９Ｈ，八ｎ
ａｌ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、、　１５２；　２３２）の方法に準じ
てニラポンジーン（財）社製Ｍ１３シークエンシングキ
ットを用いてシーフェンスし３４６図に示した。

シーフェンスした部位は前述のＮ−ＨＬ株と比較すると
２つの塩基に変異が認められ、そのうち１つの変異はア
ミノ酸の変異を誘導していた。

（２）　Ｇ−ｃＤＮＡを組み込んだＡｃＮＰＶ　）ラン
スファーベクターの構築 上記のｐｕｃ−ΔＲａＧよりεｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　
ＩＴＩ消化２．Ｏｋｂ　フラグメントを調整しクレノー
酵素により末端を平滑化した。また、マツウラら（Ｍａ
ｔｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｊ、ｇｅｎ、
　Ｖｉｒｏｌ、。

６８：１２３３−ｉ２５０）の開発したＡｃＮＰＶ　ト
ランスファーベクターであるｐＡｃＹ旧をＢａｍＨＩで
消化切断した後、同様にクレノー酵素により末端を平滑
化した。上記の２．０ｋｂフラグメントとｐＡｃＹＭ１
ベクターをライゲーシミンさせ、得られたプラスミドの
うちＧ−ｃＤＮＡが多角体プロモーターに対して順方向
に挿入されているクローンを選び、これをｐＡｃ−Ｒａ
Ｇとした（第７図）。

以上の方法によりＡｃＮＰＶ多角体プロモータの下流に
Ｇ−ｃＤＮＡを組み込んだ場合、両者の結合部位の塩基
配列は以下のようになる。すなわち［５°−・・・・Ａ
ＣＣＴ＾＾＾ＴＡＣＧＧＡＴＣＩ＾＾ＴＴＣＧＡＧＣＴ
ＣＧＧＧＡＡＡ眩■ＧＴＩＩ：ＣＧＣ・・・−３°］と
なり、配列中縦線の上流が多角体プロモータの配列、下
流がＧ−ｃＤＮＡの配列を示し、下線を引いたＡＴＧが
翻訳開始コドンを示している。

実施例３：組み換えＡｃＮＰＶのクローニング野生型Ａ
ｃＮＰＶよりスミスとサマー（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄＳｕ
ｍｍｅｒ、１９８３、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ！
、、　３：　２１５６−２１６５）の方法によって得た
ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡと上記の組み換えトランスファーベ
クターｐＡｃ−ＲａＧの混合ＤＮＡを、マツウラら（Ｍ
ａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａ１７１９８７゜Ｊ、　ｇｅｎ
、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１Ｓ：１２３３−１２５０）の
方法によりＡｃＮＰＶの宿主細胞であるＳ、ｆ、細胞に
トランスフェクトした。２８℃で４日間培養後、培養上
清を回収しＳ、ｆ、細胞上でブラックアッセイを行なっ
た。多角体を産生じていないブラックについて３回ブラ
ッククローニングを行ない狂犬病ウィルスＧ−ｃＤＮ＾
を組み込んだ組み換えＡｃＮＰＶを得た（第８図）。

実施例４：組み換えＡｃＮＰＶを感染させたＳ、ｆ、細
胞での狂犬病ウィルルＧ蛋白質の発 現 組み換え八ｃＮＰＶをｍｏｉ＝　１でＳ、ｆ、細胞へ感
染させ２８℃で４日間瑣養した後感染細胞を回収し、以
下に述べる方法により狂犬病ウィルスＧ蛋白質の発現を
確認した。

（１）間接蛍光抗体法によるＧ蛋白質の検出回収した感
染細胞をスライドグラスに適当量滴下し風乾により細胞
を付着させ一２０℃のアセトンにて１０分間処理して抗
原検出用の材料とした。

一次血清には抗狂犬病つィルスＧ蛋白質ウサギ血清を１
：１００に希釈して使用し、二次血清はＦＩＴＣ標識抗
ウサギつｇＧヤギ血清を用いた。

反応はウィルス実験学総論（国立予防衛生研究所学友会
１編）に従りた。

蛍光顕微鏡による観察の結果、Ｇ蛋白質に対して特異的
な蛍光は組み換えＡＣＮＰＶを感染させたＳ、ｆ、細胞
にのみ認められ、野生型ＡｃＮＰＶを感染させた細胞や
ウィルスを感染させていない細胞では認められなかった
。

（２）　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
るＧ蛋白質の確認 レムリ（Ｌａｅｍｌｉ、　１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ、
　２２７：６８０）の方法に準じて１０％ポリアクリル
アミドゲル上で感染細胞の蛋白質電気泳動を行なった。

泳動したゲルをクーマシーブルー染色し、染色された蛋
白質のバンドをアタゴ抹社製デンシトメータによりスキ
ャンした結果を第９図に示した。第９図（Ｃ）に示すよ
うに野生型ＡｃＮＰＶ感染細胞では約３３キロダルトン
（ｋＤａ）のところに多角体蛋白質のバンドが観察され
るのに対し、組み換えＡｃＮＰＶを感染させた細胞では
多角体蛋白質のバンドはなく、かわりに約５８ｋＤａの
ところに新たなバンドが観察された（第９図（ａ）参照
）。また、狂犬病ウィルス蛋白質を泳動した場合には約
６７ｋＤａのところにＧ蛋白質のバンドが認められた（
第９図（ｂ）参照）。この５８ｋＤａの蛋白質の発現量
をクーマシーブルーでの染色の濃度から求めると１０’
個の細胞光たり約２０μｇであり、感染細胞の全蛋白質
の約１０％を占めていた。

そこで、上記５８ｋＤａのバンドが狂犬病ウィルスＧ蛋
白質と抗原性が同一であることを確認するために５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった後株動さ
れた蛋白質をニトロセルロースフィルターに転写し酵素
抗体法により調べた。−次血清には蛍光抗体法と同様に
抗狂犬病つィルスＧ蛋白質ウサギ血清を使用し、−次血
清の結合したバンドの検出にはホースラディシュベルオ
キシダーゼ標識プロティンＡとジアミノベンチジンを使
用した。反応はアンチボディーズ（＾ｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　＋ハローとレーン（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎ
ｅ）編、１９８２゜コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−）に準じた。発現量を上記と同様にデンシトメー
タでスキャンした結果を第１０図に示した。

その結果、第１０図に示すように上記の５８ｋＤａのバ
ンドは狂犬病ウィルスＧ蛋白質と抗原性が同一であるこ
とが確認された。なお、クーマシーブルー染色では肥め
られなかったが５８ｋＤａよりやや大きな分子量のＧ蛋
白質も発現しており、この両者の違い及びこれらと狂犬
病ウィルス粒子中のＧ蛋白質の分子量の違いは、糖鎖の
付加の相違によると推定される。

（発明の効果） 本発明によれば、狂犬病ウィルスを構成する蛋白質の一
つであって、しかも病原性はなく、中和抗体８導を担っ
ている感染防禦抗原として有効なＧ蛋白質を、哺乳動物
には病原性のないバキュロウィルスの発現系を用いて大
量に産生させることができるという効果がある。

したがって狂犬病ウィルスのサブユニットワクチンの開
発０診断用抗原への応用の上で、その有用性は高いもの
がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は狂犬病ウィルス遺伝子ＲＮＡに相補的なブライ
マーの合成部位およびＧ−ｃＤＮＡの合成過程を示した
図、第２図はＧ−ｃＤＮＡのｐＢＲ３２２Ｐｓｔ　１部
位へのホモポリマー法によるクローニングの過程を示し
た図、第３図はクローニングされたＧ−ｃＤＮＡの制限
酵素地図およびそれの他株との比較を示した図、第４図
は第３図に示したＧ−ｃＤＮＡのＧ蛋白質をコードする
領域を含んでいる　ＰｓｔＩ　−Ｈｉｎｄｌｌｌ　　２
．３ｋｂフラグメントのｐｔｌｃＩＢベクターへのクロ
ーニングの過程を示した図、第５図はＧ−ｃＤＮＡの＾
ＴＧコドンの上流の不要部分のデイリージョンの過程を
示した図、第６図はクローニングされたＧ−ｃＤＮへの
へＴＧコドンイ寸近の塩基配列とこれから推定されるア
ミノ酸配列をＮ−）ＩＬ株と比較して示した図、第７図
はＧ−ｃＤＮＡを組み込んだバキュロウィルストランス
ファーベクターの構築を示した図、第８図はＧ−ｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えバキュロウィルスの構築を示し
た図である。 第９図（ａ）〜（Ｃ）はＳ［）Ｓポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動したゲルのクーマシーブルー染色像をデンシ
トメータでスキャンした結果を示した図、第１０図（ａ
）　、　（ｂ）はイミュノプロツティングの像をデンシ
トメータでスキャンした結果を示した図である。 狂犬病ウィルス遺伝子ＲＮＡの構造 ０プライマ一合成部位 ［５’−ＴＡＧＡＡＴ＾＾ＴＣＡＧＡ丁ＡＡＴＡＴＣＣ
ＣＧＣＡＡ−３’］遺伝子ＲＮＡ 狂犬病ウィルス ＧＬ−ｃＤＮＡ 第 図 ↓Ｐｓｔ　Ｉ消化 ３・６＝コ［ア３” ＧＬ−ｃＤＮＡ ６．６起］フＧＧＧＧ １：！： ２ 第 ５゜ 図 第 図 Ｂｉｎｄｌｌｌ 口［＝＝］■に二 二ロマ３Σマ弼コ 第 図 ・−・−・・−・−・−−−−−−・・−−−−−Ｃ−
・−−−・−・−・−−−−−一−−・。 −−−Ａｒｇ−−＋　　−・ 第 ７ 図 ↓クレノー酵素処理 ↓クレノー酵素処理 門［＝トモ＝ヨ Ｅ＝二二二二ヨ ＼ ライゲーション ／ 第 図 ＼ コ・トランスフェクション ／ リコンビナントウィルス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンを
   コードする遺伝子のプロモーターの下流に、上記ポリヘ
   ドリンをコードする遺伝子に組み換えて狂犬病ウィルス
   Ｇ蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ組み換えバキュ
   ロウイルス。 ２　請求項１において、狂犬病ウィルスＧ蛋白質をコー
   ドする遺伝子が、狂犬病ウィルスＲＣ・ＨＬ株由来であ
   ることを特徴とする組み換えバキュロウイルス。 ３　請求項１又は２の組み換えバキュロウイルスを、ス
   ポドプテラフルジペルダ（￥Ｓｐｏｄｏｐ−ｔｅｒａｆ
   ｒｕｇｉｐｅｒｄａ￥）細胞に感染させて、この細胞を
   培養後、細胞内に蓄積している狂犬病ウィルスＧ蛋白質
   を分離精製することを特徴とする狂犬病ウィルスＧ蛋白
   質の製造方法。