JPH07504565A - ワクチンおよび診断に有用なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンおよび診　に　なＨｅ１ｉ蛋旦叩、ＬＪ２２且旦９７　ｔ＜ノ１発明の 背景 １、　発明の分野 本発明は概して、特定のＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　１ｏｒｉタンパク質、これ らのタンパク質を発現する遺伝子、および、診断およびワクチンへの適用に有用 なこれらのタンパク質の使用に関する。

２、連技術の簡単な１明 匡旦ｃｏｂａｃｔμ」ｌ側且は、１９８２年に慢性胃炎患者の胃生検より初めて 単離された、螺旋状の微好気性グラム陰性細菌である（Ｗａｒｒｅｎら、Ｌａｎ ｃｅｔ　ｉ：１２７３−７５　（１９８３））　ｏ元来印可り亙■幻」工」シ佳 ユ０工と呼ばれていたものが、別属に属するものと認められ、Ｈｅｌ　１ｃｏｂ ａｃｔｅｒと命名された（　Ｇｏｏｄｗ　ｉｎら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙ３ｔ、 　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３９：３９７−４０５　（１９８９））　ｏ　この細 菌はヒト胃粘膜にフロニーを形成し、感染が何十年もの間継続する。ここ数年の 間に、この細菌の存在は、大半の感染患者は無症候性であるが、消化性潰瘍およ び胃腺癌の危険性をかなり増大する症状である、慢性Ｂ型冑炎に関連づけられた 。ごく最近の研究で、Ｌｌ山且感染が、Ｂ型冑炎、消化性潰瘍、および胃癌の原 因または補助因子であり得ることが、強く示唆された（例えば、Ｂｌａｓｅｒ、 　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　９３：３７１−８３　（１９８７）：　 Ｄｏｏｌｅｙら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２１：１５６２−６６　（ １９８９）：　Ｐａｒｓｏｎｎｅｔら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３ ２５：１１２７−３１　（１９９１）を参照のこと）、）ｌ。

−ゎ１ヅ」は、経口経路により伝搬されると考えられており（Ｔｈｏｍａｓら、 Ｌａｎｃｅｔ　ｊ：３４０．１１９４　（１９９２＞）　、その感染の危険性は 、年齢とともに増大しくＧｒａｈａｍら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　 １００：１４９５−１５０１　（１９９１））　、群衆化ニよ’）　促進すｈ　 ６　（Ｄｒｕｍｍう、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　４３２２：３５９ −６３　（１９９０）；　Ｂｌａｓｅｒ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ 、　１５：３８６−９３　（１９９２））　ｏ先進諸国では、Ｌ」ｆユロ抗原に 対する抗体の存在が、３０才代の人では２０％未満がら、６０才代では５０％以 上に増加している（　Ｊｏｎｅｓら、Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｔｏ、２２：５７ −６２　（１９８６）；　Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎ、Ｚ、Ｍｅｄ、Ｊ、９９：６５７ −５９（１９８６））が、一方発展途上国では、人口の８０％以上が２０才代ま でにすでに感染している（　Ｇｒａｈａｍら、Ｄｆｇｅｓｔｆｖｅ　Ｄｉｓｅａ ｓｅｓａｎｄ　５ｃｆｅｎｃｅｓ　３６：１０８４−８８　（ｆ９９１））。

Ｌ−ｌム旦Ｌ２発病因子の特性および機能は、いまだによく理解されていない。

今までのところ同定された因子には、おそらく粘膜層を越えて移動するために必 要な鞭毛（例えば、Ｌｅｙｉｎｇら、Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　６：２ ８６３−７４　（１９９２）を参照のこと）；胃の酸性環境を中和し、初期のコ ロニー化を可能にするために必要なウレアーゼ（例えば、Ｃｕ５ｓａｃら、Ｊ、 　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７４：２４６６−７３　（１９９２）；Ｐｅｒｅｚ− Ｐｅｒｅｚら、　ノ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎｍｕｎ、６０：３５５８−３６６３　 （１９９２ン；　Ａｕ５ｔｉｎら、　）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７４ニア４７ ０−７３（１９９２）：　ｐｃｒ公開Ｎｏ、Ｗｏ　９０１０４０３０を参照のこ と）、および、真核上皮細胞中に空胞形成をなし、疾患に関連するＬ−Ｌり２堕 １株により産生される、報告によれば８７　ｋＤａの分子量を有するモノマーに より形成された、高分子量細胞毒性タンパク質（例えば、Ｃｏｖｅｒら、Ｊ、　 Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｌｌｌ、　２６７：１０５７０−７５　（１９９２＞　（特定 のＮ末端２３アミノ酸配列を有する「空胞形成毒素」を参照）；Ｃｏｖｅｒら、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、９０：９１３−１８　（１９９２）：　Ｌｅｕｎ ｋ、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１３＋５６８６−８９　（１９９１） を参照のこと）が包含される。さらに、以下のことが周知である。

し−１己旦わ、培養上清には、分子量が１２０．１２８、または１３０ｋＤａで ある抗原が含有されることが、別々の著者により示された（　Ａｐｅｌら、Ａｅ ｎｔｒａｌｂｌａｔ　ｆｕｒ　Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ、Ｍｉｃｒｏｂ、ｕｎｄ　Ｈ ｙｇｉｅｎｅ　２６８：２７１−７６　（１９８８）；　Ｃｒａｂｔｒｅｅら、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ　４５ニア３３−３４　（１９９２）；　Ｃｏｖｅ ｒら、Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｕｎｎ、５８：６０３−１０　（１９９０）；　Ｆｉ ｇｕｒａら、Ｈ，ｔａｒｔ　ａｓｔｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｅ　ｔｉｃ　ｕｌｃｅ ｒ　（Ｍａｌｆｒｔｈｅｉｎｅｒら、編）、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ 、　Ｂｅｒｌｉｎ　（１９９０））　ｏ記載された抗原の大きさの相違は、同じ タンパク質の分子量測定についての各研究室間の相違によるのか、同じ抗原の大 きさの可変性によるのか、または、実際に異なるタンパク質であるのかは、明白 ではなかった。このタンパク質についてのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列 の情報はなかった。Ｌｍ■感染の実質的に全患者の血清中に、特異抗体が検出さ れたので、感染ヒト中で、このタンパク質は非常に免疫原性である（　Ｇｅｒｓ ｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１ １：５９５−６０１　（１９９２））。

Ｌ−ムユ旦わ工熱シａツクタンパク質（ｈｓｐ）が記載された（Ｅｖａｎｓら、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、６０：２１２５−２７　（１９９２）　Ｃ４４アミ ノ酸Ｎ末端配列および分子量約６２ｋＤａ）　；　Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、　６０：１９４６−５１　（１９９２）　（Ｎ末端配列中に認めら れた３３アミノ酸および分子量約５４ｋＤａ）　；　Ａｕ５ｔｉｎら、Ｊ、　Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７４ニア４７０−７３（１９９２）　（Ｎ末端配列中に 認められた３７アミノ酸および分子量約６０ｋＤａ）　）。Ａｕ５ｔｉｎらは、 Ｎ末端に同じアミノ酸配列を有する同じタンパク質が事実存在することを示唆し ている。

診断試験の例については、Ｌ−１己旦わ、溶解物または半精製抗原に基づいた（ Ｅｖａｎｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　９６：１００４−０８　（ １９８９）：　Ｕ、Ｓ、　４．８８２，２７１；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、ＷＯ８９１ ０８８４３（いずれもウレアーゼ活性を有する、外膜表面由来の同じ高分子量（ ３００−７ｏｏ　ｋＤａ）抗原を含有する組成物およびアッセイに関連する）： ＥＰＯ公開Ｎｏ、３２９５７０　（６３，５７，４５および３１　ｋＤａの群か らの少なくとも１つのフラグメントを有する、這−ｌム且０工抗体を検出するた めの抗原性組成物に関する）を参照のこと〕。

症候状態または無症候状態のＬｎ比皿感染患者の割合は、発展途上国および先進 国の両方において非常に高（、入院費および治療費からして、Ｌ」Ｌ１１ワクチ ンおよびこの疾患に対するさらなる診断試験の開発が望まれる。

発明の要旨 本発明は、Ｌ−且ム旦口、の３つの主要なタンパク質のヌクレオチド配列および アミノ酸配列に関する。詳細には、これらは、細胞毒素、「細胞毒素関連免疫優 性Ｊ　（ＣＡＩ）抗原、および熱シヨツクタンパク質である。これらのタンパク 質の完全なアミノ酸配列は未知であり、それらの遺伝子も同定されていない。本 発明は、これらの精製タンパク質およびそれらの遺伝子に関するばかりではなく 、それらに関連する組換え物、例えば、ベクターおよび宿主細胞にも関する。こ れらのタンパク質の分子レベルでの特性および機能についての理解、ならびに、 組換え産物の入手可能性は、し−ジ」旦０１の新たな診断法の開発、および、Ｌ １山旦感染の予防および疾患の処置を行い得るワクチン設計に、重要な影響を及 ぼす。

このように、これらのタンパク質は、ワクチンおよび診断の両方の用途に使用さ れ得る。本発明には、Ｈ，Ｊｊｆ二に関連する疾患の処置および診断のための方 法が包含される。Ｌ」ｂ且叶は、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍、および胃腺癌に関連す るので、本発明か、ごれらの疾患症状の初期検出および緩和の助けとなることが 望まれる。最近では、診断は内視鏡および生検の組織学的染色に依存し、既存の 免疫アッセイは、し」ユＯＬｊ溶解物または半精製抗原に基づく。このようなア ッセイにおいて認められる不均一性により、疾患症状との相関性は十分には確立 されていない。従って、組換え抗原に基つくアッセイは、疾患検出のための核酸 アッセイと同様に優れる。従来、！ＬＪＩ　ｙ　ｌ　ｏ　ｒ　ｉ感染または処置 のための市販ワクチンは存在しない。従って、組換えワクチンは本発明の目的で ある。

図面の簡単な説明 図ｔは、細胞毒素（ＣＴ）タンパク質のヌクレオチド配列である。

図２は、細胞毒素（ＣＴ）タンパク質のアミノ酸配列である。

図３は、ＣＡＩタンパク質の生遺伝子マツプ、および、この遺伝子の同定および 配列決定に使用されたクローンのまとめである。

図４は、ＣＡＩ抗原のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。

図５は、熱／ヨノクタンパク質（ｈｓｐ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配 列である。

発明の詳細な説明 Ａ　−的な　′論 本発明の実施には、他に示されていなければ、当該分野の分子生物学、微生物学 、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の方法を使用する。このような方法は、文 献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第二版（１９８ ９）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　ＡＮＤＩＩ（Ｄ、Ｎ 、　Ｇｌｏｖｅｒｍ　１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮ ＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ。

Ｊ、　Ｇａｌｔ編１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＩＩＹＢＲＩＤＩＺ ＡＴ［ＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅＳおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８ ４）：　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　（Ｂ 、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）；　ＡＮＩＭＡ Ｌ　ＣＥＬＬＣＵＬ丁ＬＩＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編　１９８６）； 　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤＥＮＺＹＭＥＳ　（ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、　１９８６）；　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　 ＧｕｔＤＥ　ＴＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）；　ＭＥＴ ＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹンリーズ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｉｎｃ、）＋　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡ ＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　（Ｊ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、　Ｐ、　Ｃａ １ｏｓｉ！ｉ　１９８７゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ、１５４ およびＶｏｌ、１５５　（それぞれに、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ。

およびＷｕ編）　、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編　（１９８７）、ＩＭＭＩ ＪＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥ ＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ ）、５ｃｏｐｅｓ、（１９８７）、　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯ Ｎ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、第二版（Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、）、および、ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸ ＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ−ＩＶ　 （Ｄ、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｉｇ　１９８６）を参 照のこと。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な省略形が、本明細書中で使用されている 。本明細書中に掲載されている、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考 として援用されている。

Ｌづ１艮 り上セ旦の「細胞毒素」または「毒素」とは、図１および２にそれぞれに示され ているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する、タンパク質またはそれら の７ラグメント、ならびに、それらの誘導体のことであり、分子量は約１４０　 ｋＤλである。このタンパク質は、分子量が約１００　ｋＤａの細胞毒素活性を 有するタンパク質の前駆体とｌ、て機能する。細胞毒素は、空胞を形成して多く の真核細胞型を死滅させ、そして、Ｌ上セユ培養上清から精製された。さらに、 細胞毒素は、タンパク性であり、ゲル濾過法による見かけの分子量約９５０−９ ７２　ｋＤａを有する。精製物質の変性ゲル電気泳動により、報告によれば、９ ５０−９７２　ｋＤａ分子の主要成分が、見かけの分子量８７ｋＤａのポリペプ チドであったことが以前に示されている（　Ｃｏｖｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅａｐ、２６７：１０５７０−７５１９９２）　。しかし、本明細書中におい て、以前に記載された８７　ｋＤａは、１００　ｋＤａタンパク質のさらなるプ ロセッシングによるのか、または、精製中に大きなタンパク質がタンパク質分解 したことによるかのいずれかであることが示唆される。

［細胞毒素関連免疫優性Ｊ　（ＣＡＩ）抗原とは、図４に記載されているアミノ 酸配列を有するタンパク質およびそのフラグメント、およびそれらの誘導体のこ とである。これは、親水性の表面露出タンパク質であり、約１２０−１３２　ｋ Ｄａ、好ましくは１２８−１３０　ｋＤａの分子量を有し、臨床分離株から産生 される。遺伝子の大きさ、およびコードされるタンパク質の大きさは、遺伝子内 部の領域の複製を含む機構により、個々の株により変化する。ＣＡＩ抗原を産生 じない臨床分離株は、■遺伝子を有さず、また活性細胞毒素も産生じ得ない。釘 遺伝子の存在と細胞毒性との関連は、釘遺伝子産物が、細胞毒素の転写、折り量 み、移送、または機能に必要であることを示唆する。

または、細胞毒素（ＣＴ）および虫遺伝子の両方が、非細胞毒性株には存在しな い。このことは、２つの遺伝子間である種の物理的連鎖を示唆する。ＣＡＩ抗原 固有の特性は、大きさの可変性であり、このことは匡遺伝子が連続的に変化して いることを示唆する。ＣＡＩ抗原は、細胞表面に結合されるようである。

このことは、上清中への抗原放出が、抗原自身または細菌表面に結合されたＣＡ Ｉ抗原を有する複合体のいずれかを切断する、血清中に存在するプロテアーゼの 作用のためであり得ることを示唆する。同様のプロセッシング活性が、インビボ における増殖中に抗原を放出し得る。典型的なリーダーペプチド配列が存在しな いことにより、非依存的移送系が存在することが示唆される。

［熱シヨツクタンパク質Ｊ　（ｈｓｐ）とは、図５に示されているアミノ酸配列 を有する、Ｌ−ＬムＡ０２タンパク質およびそのフラグメントのことであり、分 子量は５４−６２　ｋＤａの範囲であり２、好ましくは約５８−６０　ｋＤａで ある。このｈｓｐは、グラム陰性細菌熱ショックタンパク質群、ｈｓｐ６０に属 する。一般的には、ｈｓｐは、原核および真核いずれも、動物および植物の全て の生物中に最も保存されたタンパク質に属し、この保存は全配列に沿って広がっ ている。この高度の保存は、その活性を損なうことなく改変されることはあり得 ない、タンパク質の機能構造に、全配列が関与することを示唆する。

本発明に使用され得るタンパク質の例には、このタンノ（り質の天然アミノ酸配 列から主要でないアミノ酸が変化したポリペプチドが含まれ、特に、同類アミノ 酸置換が予測される。

同類置換は、それらの側鎖が縁続きのアミノ酸ファミリー内でなされる置換であ る。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられる： （１）酸性＝アス１＜ラギン酸、グルタミン酸；　（２）塩基性＝リシン、アル ギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および、（４ ）非帯電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレ オニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、と きには、合わせて、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソ ロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、 スレオニンのセリンによる置換、または、構造的に関連するアミノ酸による同様 の同類置換などの分離された置換が、生物学的活性に重要な影響を与えないこと が、当然予測される。タンパク質として実質的に同じアミノ酸配列を有するが、 実質的に機能面に影響しない、主要でないアミノ酸置換を有するポリペプチド分 子は、タンパク質の定義内に存在する。

天然源からのタンパク質の単離および精製によるのではなく、組換えＤＮＡ法に よるタンパク質の生産の重要な利へよ、天然源からタンパク質を単離するために 要求される開始物質より、より少量の物質を使用して、同量のタンパク質が生産 され得ることである。組換え法によるタンパク質の生産はまた、細胞内に通常存 在するある種の分子を伴わずにタンノ（り質を単離することを可能にする。組換 え非ヒト宿主により産生されたヒトタンパク質のみが議論の組換えタン）＜り質 であるので、事実、いかなるヒトタンパク質夾雑物も完全に含まないタンパク質 組成物が、容易に生産され得る。天然源からの潜夜釣なウィルス因子、および、 ヒトに対して病原性であるウィルス成分もまた除外される。

本明細書中に使用されているように、用語「組換えボＩＪ　、ｊクレオチド」は 、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレチドを示し、その起源 または操作により：（１）天然では結合しているポリヌクレオチドの全てまたは 一部と結合しない、（２）天然ではそれに結合しているポリヌクレオチド以外の ポリヌクレオチドに結合する、または（３）天然では存在しない。従って、この 用語はまた、Ｌ−Ｌ１旦０１細菌ゲノムが遺伝子的に改変されて（例えば、変異 誘発により）、１つ以上の数本明細書中に使用されているように、用語「ポリヌ クレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレ オチドのポリマー形態のことであり、本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチ ド」および「オリゴマー」と相互変換的に使用される。この用語は、分子の一次 構造のみを示す。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびアン チセンスポリヌクレオチドが包含される。これにはさらに、既知の型の改変、例 えば、当該分野で公知の標識の存在、メチル化、末端「ｃａｐｓＪ、１つ以上の 天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間の改変（例え ば、ある型の非荷電性結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、 ホスホアミデート、カルバミン酸エステルなと）、または、荷電性結合（例えば 、ホスホチオエート、ホスホロジチオエートなど）との置換）、ペンダント部分 の導入（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、 ポリーＬ−リジンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ブソラレン（ｐｓｏｒ ａｌｅｎ））　、キレータ−（例えば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分な ど）、アルキル化剤（例えば、αアノマー性核酸））；が、包含される。

用語「ゲノムの」により、ベクターにクローン化された制限フラグメント由来の ＤＮＡ分子のコレクションまたはライブラリーを意味する。これには、微生物の 遺伝子物質の全てまたは一部が包含される。

用語ｒｃＤＮＡＪにより、ｍＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズする相補ｍＲＮＡ 配列を意味する。

本明細書中で使用されているように、用語「オリゴマー」は、プライマーおよび プローブの両方を意味し、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と相互変換的 に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的 にオリゴマーは、１０００ヌクレオチド未満、より典型的には５００ヌクレオチ ド未満、さらに典型的には２５０ヌクレオチド未満であり、それらは１００ヌク レオチド未満であり得、７５ヌクレオチド未満、そしてさらに５０ヌクレオチド 未満の長さであり本明細書中で使用されているように、用語「プライマー」とは 、適切な条件下で使用されるときに、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として作 用し得るオリゴマーのことである。

プライマーは、コピーされるべきポリヌクレオチド鎖の領域に、完全にまたは実 質的に相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件下で、プライ マーは、分析物である鎖の相補領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポ リメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加により、プライマーは 、重合剤により伸長されて分析物である鎖のコピーを形成する。プライマーは一 本鎖であり得るか、または、部分的または全体に二本鎖であり得る。

用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」とは、標的領域を含有する と思われる、−重鎖または二本鎖核酸分子のことであり、生物学的試料中に存在 し得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プローブ」とは、標的配列中の配列 とプローブ中の少なくとも１つの配列との相補性により、標的配列とハイブリッ ド構造を形成するポリヌクレオチドを含有する構造のことである。プローブのポ リヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌク レオチドアナログから構成され得る。「捕獲プローブ」および「標識プローブ」 は、プローブ内に包含される。

本明細書中で使用されているように、用語「標的領域」とは、増幅および／また は検出されるべき核酸領域のことである。用語「標的配列」とは、プローブまた はプライマーが、所望の条件下で安定なハイブリッドを形成し得る配列のことで ある。

本明細書中で使用されているように、用語「捕獲プローブ」とは、結合パートナ −に組み合わされる一本鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプローブ のことである。この−重鎖ポリヌクレオチドは、標的するポリヌクレオチド配列 に含有され、これは、分析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的領域内の 標的配列に相補的である。この相補領域は、二本鎖に、分析物ポリヌクレオチド を固体表面に固定する（結合パートナ−を介して）のに十分に安定性を与えるた めに、十分な長さからなり、標的配列に対して相補的である。

結合パートナ−は、第二の結合パートナ−に特異的であり、第二の結合パートナ −は、固体支持体の表面に結合され得るか、または、その他の構造物または結合 パートナ−を介して間接的に固体支持体に結合され得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標的するポリヌクレオチド配列」と は、標的ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列が含有されるポリヌ クレオド配列のことであり、その配列は、意図される目的に十分な安定性を有す る二本鎖を形成するのに、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。

本明細書中で使用されているように、用語「結合パートナ−」とは、例えば、抗 原とそれに特異的な抗体のような、高度な特異性を有するリガンド分子を結合し 得る分子のことである。一般的に、特異結合パートナ−は、単離条件下で、分折 物コピー／相補鎖の二本鎖（捕獲プローブの場合）ヲ固定するのに十分な親和性 で結合する。特異結合パートナ−は、当該分野で公知であり、例えば、ビオチン とアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロティンＡ１多くの既知のレ セプター−リガンド対、および、相補的ポリヌクレオチド鎖を包含する。相補的 ポリヌクレオチド結合パートナ−の場合には、パートナ−は通常、少なくとも約 １５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基であり得、さらに、少なくとも約４ ０％から約６０％のＧ＋Ｃ含有量を有する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ％ＲＮ Ａまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。

本明細書中で使用されているように、用語「カップルした（ｃｏｕｐｌｅｄＮと は、共有結合によるまたは非共有結合の強い相互作用（例えば、疎水相互作用、 水素結合など）による付着゛のことである。共有結合は、例えば、エステル、エ ーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素 −リン結合などであり得る。

用語「支持体」とは、所望の結合パートナ−が固定され得る、いずれもの固体ま たは半固体の表面のことである。適切な支持体には、ガラス、プラスチック、金 属、ポリマーゲルなどが含まれ、ビーズ、ウェル、ディノブスティノク、膜など の形態にされ得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標識」とは、検出し得る（好ましく は定量し得る）／グナルを提供するために使用され得、ポリヌクレオチドまたは ポリペプチドに結合され得る、いずれもの元素または部分のことである。

本明細書中で使用されているように、用語「標識プローブ」とは、分析物ポリヌ クレオチド中の検出されるべき標的配列に相補的である、標的するポリヌクレオ チド配列を含有するポリヌクレオチドプローブのことである。この相補領域は、 「標識プローブ」および「標識配列」を含有する二本鎖が、標識により検出され るように、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。標識プローブは、直 接に、または、マルチマーを含む、互いに高度な特異性を有する１組のリガンド 分子を介して間接に、標識とカップルする。

本明細書中で使用されているように、用語「マルチマー」とは、同じ繰り返しの 一重鎖ポリヌクレオチドユニットまたは異なる一重鎖ポリヌクレオチドユニット の、直鎖状または分枝状ポリマーのことである。ユニットの少なくとも１つは、 目的の、第一の一重鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合 したポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プローブ）に特異的にハイブリダ イズし得る、配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性 を得るために、このユニットは、通常は少なくとも約１５ヌクレオチドの長さで あり、典型的には約５０ヌクレオチド以下の長さ、そして好ましくは約３０ヌク レオチドの長さでありｉＧ＋ｃ含有量は、通常は少な（とも約４０％、はとんど は約６０％である。

このようなユニットに加えて、マルチマーには、目的の第二の一重鎖ヌクレオチ ド、典型的には標識ポリヌクレオチドまたはその池のマルチマーに、特異的およ び安定に）＼イブリダイズし得る、多くのユニットが包含される。これらのユニ 。

トは、上記に考察されたマルチマーのように、一般にはほぼ同じ大きさおよび組 成である。マルチマーがその他のマルチマーにハイブリダイズされるように設計 されているときには、第一および第二のオリゴヌクレオチドユニットは異質（異 なる）であり、選択されたアッセイの条件下では、互いにはノ・イブリダイズし ない。従って、マルチマーは、標識プローブてあり得るか、または標識をプロー ブに力・ノプルするリガンドであり得る。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自己複製ユニットとして挙 動する、すなわち、自己制御下に複製し得るいずれもの遺伝子エレメント、例え ば、プラスミド、染色体、ウィルス、コスミドなどである。これには選択マーカ ーが含まれる。

ｒ　ＰＣＲＪとは、５ａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３　（１９８６ ）；および５ｃｈａｒｆら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：１０７６ −１０７８：および米国特許第４、６８３．１９５号：ならひに米国特許第４． ６８３．２０２号に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応のことである。

本明細書中で使用されているように、本来Ｘが、同じ様式でｙに関連しない場合 に、Ｘはｙに関して「異種」である。

すなわち、天然ではＸが全くｙに関連しないか、また（よ、天然に実在して認め られるような同じ様式でｙに関連しなし）。

「相同性Ｊとは、Ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。１つの形態の配列 と別の配列との類似は、当該分野で公知の方法により決定され得る。例えば、そ れらはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。または、相 同は、相同領域（例えば、Ｓ１消化の前に使用される）間で安定な二本鎖を形成 する条件下でポリヌクレオチドをハイブイブリダイズし、その後、−重鎖特異ヌ クレアーゼにより消化し、その後に消化されたフラグメントの大きさを決定する ことにより決定され得る。

「ヘクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが接Ｍされて、この接続され たセグメントの複製および／または発現をもたらすレプリコンである。

「制御配列」とは、それらが連結されるコーディング配列の発現をもたらすため に必要であるポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の性質は 、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的に プロモーター、リポソーム結合部位、および転写終止配列を含み；真核生物では 、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。

用語「制御配列」は、最少限、発現に必要とされる全成分を含み、さらに存在が 有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナ−配列を含 み得ると意図される。

「作動可能に連結された」とは、記載されている成分が、それらの意図する様式 で機能し得る関係にある並列のことである。コーディング配列に「作動可能に連 結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合した条件下で 得られるように連結されている。

［オーブンリーディングフレームＪ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをフードする ポリヌクレオチド配列の領域のことである、この領域は、コーディング配列の一 部またはコーディング配列全てを示し得る。

「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下におかれると、通常はａ＋Ｒ ＮＡを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディ ング配列の境界は、５°末端の翻訳開始コドンおよび３°末端の翻訳終止コドン により決定される。コーディング配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオ チド配列が含まれる得るが、これらに限定されない。

本明細書中で使用されているように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリ マーを指し、特定の長さの産物を指すわけではない；従って、ペプチド、オリゴ ペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語 にはまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコジル化、アセチル化、リ ン酸化など）は意味されず、すなわち包含されない。定義に包含されるのは、例 えば、アミノ酸の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド（例えば、非天然 アミノ酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知 の天然に存在するおよび存在しない改変である。

示された核酸配列「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、配列にコー ドされたポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ ド、またはそれらの部分、ここで、この部分は、少なくとも３〜５アミノ酸、さ らに好ましくは少なくとも８−１０アミノ酸、そしてよりさらに好ましくは少な くとも１ｌ−Ｉｓアミノ酸からなる、または配列にコードされたポリペプチドに より免疫学的に同定され得るポリペプチドのことである。この用語にはまた、示 された核酸配列から発現されるポリペプチドも包含される。

「免疫原性の」とは、アジ二バントの存在または非存在下で、それのみで、また はキャリアに結合されて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を引き 起こすポリペプチドの能力のことである。「中和」とは、感染因子の感染力を、 部分的または全体的に抑制する免疫応答のことである。

「エピトープ」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原決定基 のことである；１つのエピトープは、そのエピトープに対して唯一の高次構造（ ｓｐａｔｉａｌ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｔｏｎ）で、３つ以上のアミノ酸を含み得 る。一般的には、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸がらなり 、さらに通常には少な（とも８−１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸 の高次構造の決定方法は当該分野では公知であり、例えば、これらには、Ｘ線結 晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。同じエピトープを認識する抗体は、 １つの抗体が標的抗原に対するその他の抗原の結合を阻む能力を示す、簡単な免 疫アッセイにおいて同定され得る。

本明細書中で使用されているように、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）　Ｊとは、 予防および／または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）　（すなわち、あらゆる疾患症状の 調整）のことである。「個体（ｉｎｄｉｖｉｃ！ｕａｌ）Ｊは、Ｌ」Ｌｌｄ＠染 が疑われる動物を意味し、これにはヒトを含む霊長類が包含されるが、これらに 限定されない。「ワクチン」は、免疫原性の、または、部分的または完全にＬ」 Ｌｌｏに対する保護を誘起し得る、個体の処置に有用な組成物である。

Ｌ」１旦旺タンパク質は、このタンパク質に特異的な、モノクローナルまたはポ リクローナル抗体の産生に使用され得る。

これらの抗体を産生ずる方法は、当該分野で公知である。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、およびその他 のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体として使用 され得るか、または使用されてきた、微生物、昆虫細胞、および哺乳類細胞を示 し、これには、形質転換されたもとの細胞の子孫も包含される。

１つの母細胞の子孫は、自然突然変異、偶発突然変異または意図的突然変異（ｄ ｅｌｉｂｅｒａｔｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）のために、形態学的に、または、ゲノ ムＤＮＡまたは全ＤＮＡ成分が、もとの母細胞と完全に同一である必要はないこ とが理解される。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ） １０）細胞およびサル腎（ＣＯＳ）細胞が含まれる。

特定して、本明細書中で使用されているように、用語「細胞系」とは、インビト ロにおいて継続してまたは長期間に増殖および分裂し得る細胞群のことである。

しばしば、細胞系は１つの幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）からのク ローン群である。

このようなりローン群の貯蔵または転移の間に、核型に自発変化または誘導変化 が起こり得ることが、当該分野では公知である。従って、いわゆる細胞系由来の 細胞は、祖先細胞または培養物に正確には同一ではなく、この細胞系には、この ような変異体が包含される。用語「細胞系」はまた、不死化細胞を包含する。好 ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系、または二細胞型のハイブリドーマ を包含する。

本明細書中で使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のよ うな、原核微生物種および真核微生物種が包含され、後者には、酵母および糸状 菌が含まれる。

本明細書中で使用されているように、「形質転換」とは、挿入に用いられる方法 （例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロボーレーション ）に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことである。外因 性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えばプラスミド）として維持され 得るか、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するときには、「精製された」および 「単離された」とは、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子を実質 的に含まずに存在することを意味する。本明細書中で使用されているように、用 語「精製された」は、好ましくは、同じ型の生物学的高分子が、少なくとも７５ 重量％、さらに好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは９５重里％ 、そして最も好ましくは９８ｆ１１％で存在することを意味するくしかし、水、 緩衝液、およびその池の小分子、特に、ｔｏｏｏ未膚の分子量を有する分子は存 在し得る）。

Ｃ１核酸アッセイ 基本としてＬ」月旦１ゲノムを使用して、約８ヌクレオチド以上のポリヌクレオ チドプローブは、ｃＤＮＡに加えて、ＲＮＡの１鎖またはその相補鎖にハイブリ ダイズするように調製され得る。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配 列を含むポリヌクレオチドの検出、単離および／または標識用のプローブとして 、および／または標的配列の転写および／または複製用のプライマーとして働く 。各プローブは標的するポリヌクレオチド配列を含有し、標的ヌクレオチド配列 に相補的なヌクレオチドから構成される；その配列は、意図する目的に対して十 分に安定性を有する二本鎖を形成するために、十分な長さからなり、その配列に 相補的である。例えば、目的が、標的配列を含有する分析物を固定化により単離 することであるときには、プローブは、単離条件下で分析物を固体表面上に固定 するのに十分な二本鎖安定性をもたらすために、十分な長さからなる、標的され る配列に相補的であるポリヌクレオチド領域を含有する。さらに例えば、標的配 列の転写および／または？ｊｆ製用のプライマーとして働くときには、プローブ は、複製を成し遂げるために、十分な長さからなる、標的される配列に相補的で あるポリヌクレオチド領域を含有する。さらに例えば、ポリヌクレオチドプロー ブが、標識フ。−ブとして用いられるが、またはマルチマーに結合されるときに は、標的するポリヌクレオチド領域は、標識プローブおよび／またはマルチマー と安定なハイブリッド二本鎖構造を形成するのに、十分な長さからなり、相補的 である。このプローブは、標的される配列に相補的である、最低約４つの連続し たヌクレオチドを含有し得る；通常は、このオリゴマーは、標的される配列に相 補的な最低約８つの連続したヌクレオチド、そして好ましくは標的される配列に 相補的な最低約１４個の連続したヌクレオチドを含有する。

しかし、プローブは、標的される配列に相補的な配列のみからなる必要はない。

それらは、さらなるヌクレオチド配列またはその他の部分を含有し得る。例えば 、プローブがＰＣＨによる配列の増幅のためのプライマーとして使用されるとき には、それらは、二本鎖の場合には、増幅される配列のクローニングを促進する 制限酵素部位を形成する配列を含有し得る。

さらに例えば、プローブがハイブリダイゼーションアッセイでの「捕獲プローブ 」として使用されるときには、それらは、上記定義のような「結合パートナ−」 にカップルされる。プローブの調製は、当該分野で公知の手段により、このよう な手段には、例えば、切り出し、転写、または化学合成を含む方法によることが 含まれる。

Ｄ９発現系 一旦、適切なし」ｆ旦吐コーディング配列が単離されると、それは種々の異なる 発現系、例えば、哺乳類細胞、バキュ。

ウィルス、細菌、および酵母により用いられる発現系、で発現され得る。

Ｌ厘ＬＩ上 哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポ リメラーゼを結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへ の下流（３°）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーター は、通常はコーディング配列の５°末端近傍に位置する転写開始領域、および、 通常は転写開始部位の上流２５−３０塩基対（ｂｐ）に位置するＴＡＴＡボック スを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＲＮＡ合成を適切 な部位で開始させるのを導くと考えられている。哺乳類プロモーターはさらに、 通常はＴＡＴＡボ、クスの上流１００から２００　ｂｐ内に位置する上流プロモ ーターエレメントを有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される 速度を決定し、いずれかの向きに作用し得る（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ−１−；版 （１９８９））　。

哺乳類ウィルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、広範囲の宿主を有する；従 って、哺乳類ウィルス遺伝子をフードする配列は、特に有用なプロモーター配列 を提供する。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルスＬＴＲプ ロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）　、および 単純ヘルペスウィルスプロモーターが含まれる。さらに、不ズミメタロチオ不イ ン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｅｉｏｎｅｉｎ）遺伝子のような非ウィルス遺伝子由来 の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的または調節 され得（誘導可能な）、プロモーターに依存して、ホルモン一応答細胞中でグル ココルチコイドにより誘導され得る。

上記のプロモーターエレメントに組み合わされたエンハンサ−エレメント（エン ハンサ−）の存在は、通常は発現レベルを増大させる。エンハンサ−は、相同ま たは異種プロモーターに連結されたときに、通常のＲＮＡ開始部位で合成を開始 して、最高１０００倍まで転写を促進し得る調節ＤＮＡ配列である。さらに、エ ンハシサーは、通常の向きまたは裏返しの向きで転写開始部位から上流または下 流に、または、プロモーターから１０００ヌクレオチドを超える位置に配置され るときに活性である　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、５ｃｉｎｃｅ　２３６：１２３７ 　（１９８９）：　Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ−幻ヒー 免（」ｈｅ　Ｃｅ１１．第二版（１９８９））。ウィルス由来のエンハンサ−エ レメントは、通常は広範囲の宿主を有するので、特に有用である。例には、ＳＶ ４０初期遺伝子エンハンサ−（Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、 　４ニア６１）　、および、ラウス肉腫ウィルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来（ Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　７９：６７７７）およびヒトサイトメガロウィルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔら、 （１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１：５２２１）のエンハンサ−／プロモーターが含 まれる。さらに、いくつかのエンハンサ−は、調節可能であり、ホルモンまたは 金属イオンのような誘導物質が存在するときのみに活性になる（　５ａｓｓｏｎ ｅ−Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、２：２１５；　 Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）５ｃｉｅｎｃｅ　２３６＋１２３７）　。

ＤＮＡ分子は、哺乳類細胞において細胞内に発現され得る。プロモータ配列はＤ ＮＡ分子に直接連結され得るが、この場合にはいつも、組換えタンパク質のＮ末 端の最初のアミノ酸がメチオニンであり、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーシ ョンにより、タンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳類細胞で外来タンパク質の分泌をなすリ ーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子 をつくることにより、細胞から増殖培地内に分泌され得る。好ましくは、リーダ ーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し 、これは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る。リーダ ー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く、疎水性アミノ 酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウィルス３分節系リー ダーは、哺乳類細胞内での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例で ある。

一般には、哺乳類細胞により認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、 翻訳終止コドンに対し３°側に位置する調節領域であり、従って、プロモーター エレメントとともに、コーディング配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３゛末端は 、部位特異的に翻訳後に切断され、ポリアデニル化されて形成される（　Ｂｉｒ ｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１：３４９：　Ｐｒｏｕｄｆｏｏ ｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ　（１９８８）　ｒ真核ＲＮＡの終結および３′末端 ブロセ、シンク（Ｔｅｒｖｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　３’　ｅｎｄ　ｐｒｏｃｅ ｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＲＮＡ）ＪＴｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉｎ　（Ｂ、Ｄ、　）ｌａｎｃｅｓおよびり、Ｍ、　 Ｇｌｏｖｅｒ編）；　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　（１９８９）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉ ｏｃｈｅａ＋、　Ｓｃｉ、　１４：１０５）。

これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得る＋ｌｌ ＲＮＡの転写を導（。転写ターミネータ−／ポリアデニル化シグナルの例には、 ＳＶ４０由来のものが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９）、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａＬｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、）。

い（っかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在するときに、 より効率よく発現され得る。しかし、数個のｃＤＮＡは、スプライシングシグナ ル（スプライス供与部位および受容部位とも呼ばれる）が欠如しているベクター から効率よく発現された（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ　（ １９８１）　Ｎ、ａｔｕｒｅ　２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、 スプライス供与部位および受容部位を有するコーディング配列内の介在非コーデ ィング配列である。それらは、−次転写物のポリアデニル化の後に、「スプライ シング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Ｎｅｖｉｎｓ　（１９８３）　 Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２：４４１；　Ｇｒｅｅｎ　（１ ９８６）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、２０：６７１；　Ｐａｄｇｅｔ ｔら、（１９８６）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５５：１１１９ ；　ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ　（１９８８）　ｒＲＮＡスブラス プライシングＡ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）Ｊ　、　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａ ｎｄ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　（Ｂ、Ｄ、　Ｈａａ＋ｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｖ ｅｒ編））。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およ転写終止配列を含有する上 記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。エンハンサ−１機能性スプライス 供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所望 であれば発現構築物中に含まれる。発現構築物は、哺乳類細胞または細菌のよう な宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のよ うな、レプリコン中に維持される。哺乳類複製系には、複製にトランス作用因子 が必要とされる動物ウィルス由来のものが含まれる。例えば、ＳＶ４０のような パボーバウイルス（Ｇｌｕｚｍａｎ　（１９８１）　Ｃｅ１１２３：１７５）ま たはポリオーマウィルスの複製系を含むプラスミドが、適切なウィルスＴ抗原存 在下で（非常に多数のフビーを複製する。哺乳類レプリコンのさらなる例には、 ウシパピローマウィルスおよびエプスタイン・バーウィルス由来のものか含まれ る。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のた めに哺乳類細胞中に、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中に 維持される。

このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例には、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎ ら（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９：９４６）　、および ｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、６：１０７４）が含まれる。

使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌク レオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン介 在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン介在トランスフ ェクション、プロトフラスト融合、エレクトロボレーンヨンボリヌクレオチドの リポソーム内へのカプセル化、および、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェク ンヨンを包含する。

発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞系は、当該分野で公知であり、チャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（Ｂ ＨＫ）細胞、サル腎細胞（Ｃ０Ｓ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２ ）および多くのその他の細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　 （ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含する。

（以下余白） ｉｆ、バキニロウイルス系 タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現ベクターに挿 入され得、ベクター内の制御エレメントに作動可能に連結される。ヘクター構築 には、当該分野で公知の方法が用いられる。

一般的に、発現系の成分には転移ベクター、通常は細菌プラスミドが含まれ、こ れは、バキュロウィルスゲノムフラグメントと、発現されるべき異種の遺伝子ま たは遺伝子群挿入のための便宜的な制限部位との両方；転移ベクター内のバキュ ロウィルス特異フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウィルス（こ れは、バキュロウィルスゲノム内への異種遺伝子の相同的組換えを考慮する）； および、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を含む。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列を転移ベクター内に挿入した後に、ベクター および野生型ウィルスゲノムが、昆虫宿主細胞内へトランスフェクトされ、そこ でベクターとウィルスゲノムとの組換えが起こる。パッケージングされた組換え ウィルスが発現され、組換えプラークが同定および精製される。

バキュロウィルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キット形態で、特に 、ＩｎｖｉＬｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ　（−ＭａｘＢａｃ−キ ット）から市販されている。これらの方法は当業者に公知であり、Ｓｕｍｍｅｒ ｓおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉ ｒＱｅｎｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５　（１９ ８７）　（以後、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＪ　）に十分に記載されて いる。

タンパク質を一コードするＤＮＡ配列をバキュロウィルスゲ、ムに挿入する前に 、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および 転写終止配列を含む上記の成分が、通常は中間置換構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ ａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｏ＋ｅｎｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）　（転移ベク ター）に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および作動可能に連結さ れた調節エレメント；各遺伝子がそれ自身の固有のセットの作動可能に連結され た調節エレメントを有する複数の遺伝子；または、同じセットの調節エレメント に調節される複数の遺伝子、を含む。

中間置換構築物はしばしば、細菌のような宿主中で安定して維持され得る染色体 外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レ プリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅のために適 切な宿主中に維持される。

現在では、ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するための最も一般的に使用される転 移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベクターも また設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９３ｓ　（ポリヘトリン開始フ ドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＡＴＴ下流３２塩基対にＢａｍ旧クローニング 部位を導入する；ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（ １９８９）　１７：３１を参照）ロブラスミドは通常さらに、ポリへドロンポリ アデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら　（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４２：１７７）、および、選択およびＥ、　ｃａｄｉ中 での増殖のための原核アンピシリン耐性（１）遺伝子および複製起点を含有する 。

バキュロウィルス転移ベクターは通常、バキュロウィルスプロモーターを含有す る。バキュロウィルスプロモーターハ、バキュロウィルスＲＮＡポリメラーゼを 結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流 （５′から３゛）翻訳を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモータ ーは、コーディング配列の５°末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。

この転写開始領域は通常、ＲＮＡボリメラーセ結合部位および転写開始部位を含 有する。バキュロウイスル転移ヘクターもまた、エンハンサーと呼ばれる第ニド メインを有し、これは存在する場合には、構造遺伝子の遠位に存在する。発現は 調節され得るか、または構成的であり得る。

ウィルス感染サイクルの後期に多量に転写された構造遺伝子は、特に有用なプロ モーター配列を提供する。例には、ウィルスポリヘドロンタンパク質をコードす る遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）　ｒバキュロウィルス遺 伝子発現の調節（Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ ｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｊ　、　Ｚｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏ上＋　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆ ｌｅｒ編）；　ＥＩ’Ｏ公開Ｎｏ、１２７８３９およびＮｏ、１５５４７６）　 ；および、ｐｌｏタンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８）、 　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９ニア６５）が含まれる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、／＜牛二ロウイルスボリヘドリン遺 伝子のような、昆虫または／　ｚＨキ二ロウイルス分泌タンパク質の遺伝子由来 であり得る（　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９Ｈ）Ｇｅｎｅ、　７３・４０９）。

あるいは、哺乳類細胞の翻訳後の改変（シグナルペプチド切断、タンパク質分解 切断、およびリン酸化のような）のためのシグナルは、昆虫細胞により認識され ると考えられており、そして分泌に必要なシグナルおよび核集積は、無を推動物 およびを椎動物間で保存されているとも考えられているので、ヒトα−インター フェロン（Ｍａｅｄａ　ラ、（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２） 　；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１ ９８ｇ）、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、８＋３１２９）　；ヒトＩＬ− ２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ。

８２：８４０４）　；　７ウス　ＩＬ−３，（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７ ）　Ｇｅｎｅ　５８二２７３；ヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら　 （１９８８）　ＤＮＡ　７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起 源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供するために使用され得る。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内に発現され得るか、または 、適切な調節配列で発現されれば分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な 細胞内発現は通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有す る短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。

所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベーシヨンにより、成熟タンパク質から切断され得る。

あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆 虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを有する 融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、昆虫細胞か ら分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、小胞体、のタンパク質の輸 送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を導く、疎水性アミノ酸を有するシグナルペ プチドをコードする。

タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の 挿入後に、昆虫細胞宿主を、転移ベクターノ異種ＤＮＡと野生型バキュロウィル スのゲノムＤＮＡとで共形質転換（通常は共トランスフェクション）する。構築 物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常バキュロウィルスゲノムの２−５ 　ｋｂ断片を含有する。バキュロウィルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する 方法は、当該分野で公知である。（Ｓｕｍｎ＋ｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＨＪｕら （１９Ｂ？）ＨＳｍ１ｔｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８３）　３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ　（ １９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、ポリヘトリン遺伝子のような遺伝 子に、相同的二本鎖交差組換えによりなされ得る；挿入はまた、所望のバキュロ ウィルス遺伝子中に設計された制限酵素部位になされ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（ １９８９）、　Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　４：９１゜ＤＮＡ配列は、発現ベクターの ポリヘトリン遺伝子の位置にクローニングされたときには、ポリヘトリン特異配 列により、５°および３゛両側に隣接され、ポリへドリンプロモーターの下流に 配置される。

新たに形成されたバキュロウィルス発現ベクターは、次に、感染性組換えバキュ ロウィルス中にノクノケージングされる。

相同的組換えは低頻度（約１％から約５％の間）で生じるため、共トランスフェ クション後に産生された主要なウィルスは、まだ野生型である。従って、組換え ウィルスを同定する方法が必要である。発現系の利点は、視覚スクリーニングに より、組換えウィルスの区別が可能であることである。天然ウィルスにより産生 されるポリヘトリンタンパク質は、ウィルス感染後、後期に感染細胞の核に非常 に高レベルで産生される。

集積されたポリヘトリンタンパク質は、埋め込まれた粒子をも含む封入体を形成 する。これらの封入体は、１５μｍまでの大きさであり、非常に屈折性であるた めに、光学顕微鏡下で容易に視覚化される光沢のある外観となる。組換えウィル スに感染した細胞には、封入体がない。野生型ウィルスがら組換えウィルスを区 別するには、トランスフェクション上清を、当業者に公知の方法により、単層の 昆虫細胞上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを光学顕微鏡下で、封入 体の存在（野生型ウィルスの指標）または非存在（組換えウィルスの指標）につ いてスクリーニングする。”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ。

Ｉｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｆｏｌｏｇｙ″Ｖｏ１．２　＜Ａｕ５ｕｂｅｌら［） 　１６．８　（Ｓｕｐｐ、１０、　１９９０）　；　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ １ｔｈ；　Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。

組換えバキュロウィルス発現ベクターは、数種の昆虫細胞への感染のために開発 されている。例えば、組換えバキュロウィルス、とりわけ、Ａｅｄｅｓ　ａｅ　 をへ組胆肛肛膿」１匡蝕旦ｉｃａ、　Ｂｏｍｂ　ｘ　ｍｏｒｉ、　Ｄｒｏｓｏ　 ｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒ、　Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ江■珪肛■、お よびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｉのために開発されている（　ＰＣＴ公開Ｎ ｏ、Ｗｏ　８９１０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）　Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。

５６：１５３：　Ｗｒｉｇｈｔ　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１ニア１８ ；　Ｓｍ１ｔｈら、（１９８３）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３：２１５ ６；および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１ ．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２５：２２５を参照のこと）。

細胞および細胞培養培地は、バ牛ユロウイルス／発現系テの異種ポリペプチドの 直接発現および融合発現市販されている；細胞培養法は、一般に当業者に公知で ある。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈを参照のこと。

次に、改変昆虫細胞は、適切な栄養培地で増殖され得る。

この栄養培地により、改変昆虫宿主内に存在するプラスミドは安定に維持され得 る。発現産物遺伝子が誘導制御下にある場合には、宿主は高密度に増殖され得、 発現が誘導され得る。

あるいは、発現が構成的である場合には、産物は培地に連続的に発現される。目 的の産物を取り出し、枯渇した栄養分を補給しながら、栄養培地を連続的に取り 替えねばならない。

産物は、例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶 媒抽出などの方法で精製され得る。適切には、培地に分泌されるかまたは昆虫細 胞溶解から生じるいずれもの昆虫タンパク質を実質的に除去するために、宿主の 破片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない 産物を提供するために、必要であれば産物はさらに精製され得る。

タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞は、配列をコー ドする組換えタンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。こ れらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、条件は、当該 分野で公知のものに基づいて、当業者に容易に確認され得る。

ＵニーＵ系 細菌発現法は当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラ ーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｆｆ１ＲＮＡへの 下流（３”）転写を開始し得るいずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、 通常コーディング配列の５゛末端近傍に位置する転写開始領域を有する。この転 写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細 菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第ニドメインを有し得、これは 、ＲＮＡ合成を開始する位置である隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重複し得 る。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレターに結合し得、そのことにより特 異遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは、負の調節（誘導可能な）転 写を行い得る。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存 在下で起こり得る。

さらに、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達成され得、これ は、存在する場合には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（５゛）の近くに存在 する。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ ）であり、これは、Ｅ、　ｃｏｌｉでのｌａｃオペロンの転写開始を助ける（　 Ｒａ１ｂａｕｄら（１９８４）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８： １７３）　ｏ従って、調節的発現は正または負のいずれかであり得、そのことに より転写を促進または減退する。

代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。

例には、ガラクトース、ラクトース（Ｉａｃ）　（Ｃｈａｎｇら（１９７７）　 Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）　、およびマルトースのような糖代謝酵素由 来のプロモーター配列が含まれる。

さらなる例には、トリプトファン（ｍ）のような生合成酵素由来のプロモーター 配列が含まれる（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）　ＮｕｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、 ８：４０５７：　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ。

９・７３１：米国特許第４，７３８，９２１号、　ＥＰＯ公開Ｎｏ、０３６７７ ６およびＮｏ。

１２１７７５）　。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−１ａｏｔａｍａｓｅ）　（ｂｌａ） プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　（１９８１）　ｒインターフェロンノク ローニンクおよびその他のｍ１ｓｔａｋｅｓ　（Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ 　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄｏｔｈｅｒ　ｍ１ｓｔａｋｅｓ）Ｊ　Ｉｎｔｅ ｒｆｅｒｏｎ　３（１，Ｇｒｅｓｓｅｒｉｉ）、１＜タテリオファージλＰＬ　 （Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８）　、お よびＴ５　（米国特許第４．６８９．４０６号）プロモーター系もまた、有用な プロモーター配列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた細菌プロモーターとして機能 する。例えば、１つの細菌または／＜タテリオファージプロモーターの転写活性 化配列は、その他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列 に接続され得て、合成雑種プロモーターをつくる（米国特許第４．５５１．４３ ３号）。例えば、Ｌ匹プロモーターは、ｌａｃリブレ・ノサーにより調節される 、ニプロモーターおよびｌａｃオペロン両配列配列有する雑種ｔｇ３−１　ａ　 ｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５：１６７； 　ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラー ゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモ ーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合する ＲＮＡポリメラーゼと結合して原核生物中である種の遺伝子を高レベルで発現し 得ル。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合 されたプロモーター系の例である（　５ｔｕｄｉｅｒら（１９８６）　Ｊ、Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３；　Ｔａｂｏｒら（１９８５）　Ｐｒｏｃ　Ｎ ａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　８２：１０７４）　ａ　さらに、雑種プロモーターもま た、バクテリオファージプロモーターおよび［：、　ｃｏｌｉオペレーター領域 を含有し得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２６７８５１）。

機能プロモーター配列に加えて、能率のよいリポソーム結合部位もまた、原核生 物での外来遺伝子の発現に有用である。

Ｅ、　ｃｏｌｉでは、リポソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列 と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流 に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（５ｈｉｎｅら（１９７５） 　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）　。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ、　ｃｏｌｉ　 １６Ｓ　ｒＲＮＡの３°末端（３°ａｎｄ）との間で塩基対合してｍＲＮＡのリ ポソームへの結合を促進すると考えられている（　５ｔｅｉ　ｔｚら（１９７９ ）　ｒメツセンジャーＲＮＡにおける遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列（Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ）Ｊ　、　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　 Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ−Ｇｅｎｅ　ＥＸ　ｒｅ ｓｓｉｏｎ　（Ｒ玉Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒｇ））　。

弱リポソーム結合部位を有する原核遺伝子および真核遺伝子を発現するために、 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ：　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ）。

ＤＮＡ分子は細胞内に発現され得る。プロモーター配列ハ、直接ＤＮＡ分子に連 結され得、その場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸はメチオニンであり、これはＡＴ Ｇ開始コドンによりコードされる。必要であれば、Ｎ末端のメチオニンは、イン ビトロにおける臭化シアンとのインキュベーション、または細菌メチオニンＮ末 端ペブチグーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションにより、タン パク質から切断され得る（ＥＰＯ公開ＮＯ，２＋９２３７）。

融合タンパク質は、直接発現の代替を提供する。通常は、内因性細菌タンパク質 またはその他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種 コーディング配列の５°末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つの アミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子が外 来遺伝子の５°末端で連結され得、細菌内で発現され得る。得られた融合タンパ ク質は、好ましくは、外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断する ためのプロセッシング酵素（因子Ｘａ）に対する部位を保持している（Ｎａｇａ ｉら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０）　。融合タンパク質はまた Ｉ工Ｚ由来の配列を用いて生成され得る（Ｊｉａら（１９８７）　Ｇｅｎｅ　６ ０：１９７．　（ＬＲ旦、Ａ１１ｅｎら　（１９８７）　ノ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ、５：９３；　Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　１３５：１１、およびＥＰＯ公開Ｎｏ３２４６４７、　ｇｅｎｅｓ ）。２つのアミノ酸配列を接続したＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、 またはコードし得ない。その他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。この ような融合断するためのプロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異ブロセノ シングブロテアーゼ）に対する部位を保持しているユビキチン領域を用いて生成 される。この方法によって、そのままの外来タンパク質が単離され得る（Ｍｉｌ ｌｅｒら（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９８）。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌で外来タンパク質分泌を提供するシグナ ルペプチド配列フラグメントを含有スる融合タンパク質をコードするキメラＤＮ Ａ分子をつくることにより、細胞から分泌され得る（米国特許第４．３３６．３ ３６号）。シグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質分泌を導く 疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖 培地（グラム陽性細ｍ）、または、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺 腔（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチド フラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し、 これはインビボまたはインビトロにおいて切断され得る。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ、　ｃｏｌｉ外膜タ外膜タンパ低 質遺伝子）　（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、　ＥＸ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａ ｎｉｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ；　Ｇｈｒａｙｅ ｂら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、３：２４３７）およびＥ、　ｃｏｌｉアルカリ ボスファターゼシグナル配列（吐並）　、（Ｏｋａら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８２ニア２１２）のような、分泌される細菌タン パク質の遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株 由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓがら異 種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２４４０ ４２）。

通常、細菌により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３°側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍ ＲＮＡの転写を導く。転写終止配列はしばしば、転写終止の助けとなるステムル ープ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、Ｅ、 　ｃｏｌｉのｍ遺伝子およびその他の生合成遺伝子のような、強プロモーターを 伴った遺伝子由来の転写終止配列が含まれる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列 、および転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発 現構築物は、細菌のような宿主に安定して維持され得る染色体外エレメント（例 えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは、１つ の複製系を有し、このため、発現、またはクローニングおよび増幅のいずれかの ために原核宿主中に維持される。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コ ピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５か ら約２００．そして通常約１０から約１５０゜の範囲のコピー数を有する。高コ ピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ま しくは少なくとも約２０のプラスミドを含有する。高コピー数または低コピー数 のいずれかのベクターが、宿主でのベクターの効果および外来タンパク質に依存 して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体に相同な少 な（とも１つの配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色 体と間の組換えによると考えられる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来の ＤＮＡで構築された組込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込む（Ｅ ＰＯ公開Ｎｏ、　１２７３２８）。組込みベクターはまた、バクテリオファージ またはトランスポゾン配列を含有し得る。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能 にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、 アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオ マイシン）およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝 子を含有し得る。（Ｄａｖｉｅｓら、（１９７ｇ）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　３２：４６９）　。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリ プトファン、およびロイシンの生合成経路でのような、生合成遺伝子を含み得る 。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てられ得る。形 質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに組 み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは 、特に以下の細菌のために開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ、　Ｐａ１ｖら（１９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６２５９およびＮｏ、 ０６３９５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、Ｗｏ　８４１０４５４１；　Ｅ、　ｃｏｌｉ 、　Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８；　Ａ ｍａｎｎら（１９８５）　Ｇｅｎｅ　４０：１８３；５ｔｕｄｉｅｒら（１９８ ６）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、０３６ ７７６、Ｎｏ、１３６８２９およびＮｏ、１３６９０７；　５ｔｒｅ　ｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、　Ｐｏｗｅｌ　Ｉら（１９８Ｂ）　Ａｐｐｌ、　 Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５：　旺匹匹ｏｃｏｃｃｕ ｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ、　Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４：６５５；および５ｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅ ｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ、米国特許第４，７４５．０５６号。

外因性ＤＮＡの細菌宿主への導入方法は当該分野で公知であり、ＣａＣｌ　２、 または、二価カチオンおよびＤＭＳＯのようなその他の試薬で処理された細菌の 形質転換を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロボーレーンヨンにより細菌細胞 中に導入され得る。形質転換の方法は、通常形質転換されるべき細菌種により変 化する。Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔ ｔ、６０：２７３；　Ｐａ１ｖａら（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６２５ ９およびＮｏ、０６３９５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、　ｗｏ　８４１０４５４１． 　Ｂａｃｉ旦旦に関するＨＭＮＩｅｒら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、　８５：８５６：　Ｗａｎｇら（１９９０）　Ｊ、Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、１？２：９４９、Ｃａｍ　ＩｏｂａｃｔｅＬに関するＨ　Ｃｏ ｈｅｎら（１９７３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　６９ ：２１１０；　Ｄｏｗｅｒら（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、１６：６１２７；　Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）　ｒｃｏｌＥ１由来プラス ミドにょるＥ、　ｃｏｌｉ形質転換のための改良法（Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　 ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ｗｉｔｈ　Ｃｏ１Ｅ１−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ）Ｊ　、　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｎ＋　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　 Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　（Ｈ，Ｗ、　ＢｏｙｅｒおよびＳ、　Ｎ１ｃｏｓｉａｉ ｉ）　；　Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３： １５９；　Ｔａｋｅｔｏ　（１９８ｇ）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９４９：３１１１、Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａに関 する；　Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅ ｔｔ、　４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関する；　Ｆｉｅｄｌｅ ｒら（１９８８）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａ且に関するｓ　Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　６６：２０３、Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓに関 するＨ　Ｂａｒａｎｙら（１９８０）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、１４４：６ ９８：　Ｈａｒｌａｎｄｅｒ　（１９８７）　ｒエレクトロポーレーションによ る５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｍａ ｔｉｏｎ　ｏｆＳｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔ ｒｏｐｏｒａｔｊｏｎ）Ｊ　、　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ　（Ｊ、　ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ，Ｃｕｒｔｉｓｓ　１１１編）ＨＰｅｒ ｒｙら（１９８１）　Ｉｎｆｅｃ、１ｍｍｕｎ、３２：１２９５；　Ｐｏｗｅｌ ｌら（１９８８）　Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５；　Ｓｏｍｋｕｔ＋ら（ １９８７）　Ｐｒｏｃ、　４ｔｈＥｖｒ、Ｃｏｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｒ ｙ　１：４１２．５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓに関する、を参７照のこと。

江工！母発現 酵母発現系もまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメ ラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下 流（３′）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、 コーディング配列の５゛末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転 写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボ、クラス」）お よび転写開始部位を含む。酵母プロモーターはさらに、上流活性化配列（ＵＡＳ ）と呼ばれる第ニドメインを有し得、これは、存在する場合には通常構造遺伝子 の遠位に存在する。ＬＩＡＳにより、調節（誘導可能な）発現が行われる。構成 的発現は、ＵＡＳの非存在下で起こる。調節的発現は正また１ま負のいずれかで あり得、そのことにより転写を促進または減退する。

酵母は、活性代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、代謝経路の酵素をコ ードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、アルコールデ ヒドロゲナーゼ（ＡＤＩ＋）　（ＥＰＯ公開Ｎｏ、２８４０４４）　、エノラー ゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒ ド−ン酸−テ′ヒドロゲナーゼ（　ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）　、へ牛゛ノキナ ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピル ビン酸キナーゼ（　ＰｙＫ）　（　ＥＰＯ公開Ｎｏ．　３２９２０３）力）包含 される。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺伝子もまた、有用なプ ロモーター配列を提供する（　Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：１）　。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機 能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモータ ーの転写活性化領域に接続され得、合成雑種プロモーターかつ（られ得る。この ような雑種プロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調 節配列が含まれる（米国特許第４，　８７６、　１９７号および米国特許第４， 　８８０，　７３４号）。雑種プロモーターのその他の例には、ＧＡＰまたはＰ ｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に組み合わされた、ＡＤＨ２，　 ＧＡμ、ＧＡＬＩＯ、またはＰＨ０５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロ モーターが含まれる（　ＥＰＯ公開Ｎｏ．１６４５５６）　。さらに、酵母プロ モーターには、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する 、非酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。このようなプロモー ターの例には、特に、Ｃｏｈｅｎら（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　？？＋１０７８；　Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９ ８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２８３＋８３５；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１ ）　Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍ＋ｕｎｏｌ。

９６＋１１９：　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）　［酵母Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの細菌抗生物質耐性遺伝子の発現（Ｔｈ ｅ　Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ　ｏｆＢａｃｔａｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｉｃ　Ｒｅ ｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｅｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｊ　：　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄ ｉｃ＋山二Ｅｎｖｉｒｏｎｏ＋ｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　１ ｍ　ｏｒｔａｎｃｅ　（Ｋ．Ｎ．　ＴｉｍｍｉｓおよびＡ。

Ｐｕｈｌｅｒ編）；　Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら＜１９８０）　Ｇ ｅｎｅ　１１：１６３；　Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅ ｎｅｔ．　２：１０９が、含まれる。

ＤＮＡ分子は酵母において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ 分子に直接に連結され得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のア ミノ酸はいつもメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端メチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベーションにより、タンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、哺乳類、バキュロウィルス、および細菌発現系と同様に、酵 母発現系の代替を提供する。通常、内因性酵母タンパク質またはその他の安定な タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コーディング配列の５ °に融合される。発現に際し、この構築物は、２つアミノ酸配列の融合を提供す る。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（　ＳＯＤ）遺伝 子が、外来遺伝子の５°末端で連結され得、酵母で発現され得る。２つのアミノ 酸配列の接続部位ＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、またはコードし得 ない。例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ．　１９６０５６を参照のこと。その他の例は、 ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、 外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセッシング酵素（例えば、 ユビキチン特異ブロセノシングブロテアーゼ）に対する部位を保持して０るユビ キチン領域でつくられる。従って、この方法によってそのままの外来タンパク質 が単離され得る（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．　Ｗｏ　８８１０２４０６６を参照 のこと）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母での外来タン、（り質の分泌を提供する リーダー配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラＤＮ Ａ分子をつくることにより、細胞から増殖培地に分泌され得る。好ましくは、リ ーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存 在し、インビボまたはインビトロのいずれがで切断され得る。リーダー配列フラ グメントは通常、細胞がらのタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸を含有する シグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（　ＥＰ Ｏ公開Ｎｏ．０１２８７３；　ＪＰＯ公開Ｎｏ．　６２，０９６，　０８６）お よびＡ因子遺伝子（米国特許第４，　５８８，　６８４号）のような、分泌酵母 タンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのよう な、非酵母起源のリーダーが存在し、これもまた酵母での分泌を提供する（ＥＰ Ｏ公開Ｎｏ．　０６００５７）。

分泌リーダーの好ましいクラスには、酵母α因子遺伝子のフラグメントを用いる リーダーがあり、これはｒｐｒｅＪシグナル配列およびｒ　ｐｒｏＪ領域の両方 を含有する。用いられ得るα因子フラグメントの型には、全長ｐｒｅ−ｐｒｏα 因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および切断型α因子リーダー（通常約２５ から約５０アミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４，　５４６，　０８３号お よび米国特許第４，　８７０．　００８号；　ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２４２７４） 　。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーには、第 一酵母のｐｒｅ配列でつ（られたハイブリッドα因子リーダーが含まれるが、第 二酵母のα因子のｐｒｏ領域は含まレナイ。＜例エバ、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｎｏ 　８９１０２４６３を参照のこと）。

通常、酵母により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３′側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング領域に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得 る１ＲＮＡの転写を導く。転写終止配列およびその他の酵母認識終止配列の例は 、解糖酵素をコードする配列などである。

通常、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、お よび転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組ろ立てられる。発現構 築物はしばしば、酵母または細菌のような宿主中に安定して維持され得る染色体 外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レ プリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のために酵母中に、 およびクローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持される。このような酵 母−細菌シャトルベクターの例には、ＹＥｐ２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９ ７９）　Ｇｅｎｅ　８：１７−２４）　；　ｐｃｌ／１　（Ｂｒａｋｅら（１９ ８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　８１：４６４２− ４６４６）　；およびＹＲｐ１７　（Ｓｔｉｎｅｈｃｏｍｂら（１９８２）　Ｊ 、　Ｍｏ１．　Ｂｉａｓ、　Ｈ５８：１５７）が含まれる。さらに、レプリコン は、高コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラス ミドは一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を有し、通常約１０から約１ ５０のコピー数を有する。

高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約ｌＯ１より 好ま（−＜は少なくとも約２０を有する。高コピー数または低コピー数のベクタ ーは、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得 る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする、酵母染色体に相同な 少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同 な配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との組換え によると考えられる（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：２２８−２４５）　、組込みベクターは、ベク ター中への封入に適切な相同配列を選択することに誹り、酵母の特異的な座に導 かれ得る。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタ ンパク質レベルに影響し得る（Ｒｆｎｅら（１９８３）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色 体配列は、ベクター中の１つのセグメントとして存在して、完全ベクターの組込 みになり得るか、または、染色体中の隣接セグメントに相同で、ベクター中で発 現構築物に隣接する２つのセグメントとして存在して、発現構築、物のみの安定 な組込みになり得る。

通常は、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可 能にする選択マーカーを含有し得る１゜選択マーカーは、故■、肋、凹、ＴＲＰ 　１、およびＡｌＯ２のような、酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、および 、ツニカマイシンおよびＧ４１８のそれぞれに対する酵母細胞において耐性を与 える６４１８耐性遺伝子を含み得る。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属 のような毒素成分の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、 ＣＵＰＬの存在は、銅イオンの存在下での酵母の増殖を可能にする（Ｂｕｔｔら （１９８７）　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５１：３５１）。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てれられ得る。

形質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに 組み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くの酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、 特に以下の酵母のために開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｊｃａｎｓ 　（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２） 　＋　Ｃａ回士仄」す１ｔｏｓａ　（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、　Ｂａ５ ｉｃ　Ｍｔｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１４１）　；　）ＩａｎｓｅｎｕｉＬＪＬ ｑＵｉ凹工亀（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ　１３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｎｐら（１９８６）　Ｍａｔ、Ｇ ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２：３０２）　：　【凰江旺恒■ｅｓ工見−ｇｉ　ｌｉ ｓ　（Ｄａｓら（１９８４）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５）　 ：　ｕ友か」１咀■ｅｓ　１．７ｃ±ｉｓ、（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｅｏｕｒｔら （１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４ニア３７；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　 Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｊｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５）　；　 Ｐｉ妨オシ旺月士猛Ｉｙ佳ｕ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２５＋１４１）　：　Ｐ’ｃｈｉａ　ａｓｔｏｒｉｓ　（Ｃｒｅｇｇら（１９８ ５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：３３７６；米国特許第４．８３ １．１４８号および米国特許第４．９２９、５５５号）　；　Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（）Ｉｉｎｎｅｎら（１９７８）　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：１９２９；　Ｉｔｏら（１ ９８３）　Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉａｌ、１５３：１６３）　；　Ｓｃｈｉｚｏｓａ ｃｅｂａｒｏｍ　ｃｅシ男ユ胚（Ｂｅａｃｈら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ００ニア０６）　；および、Ｙａｒｒｏｗｉａ　Ｉｆ　ｏｌ　ｔｉｃａ　（Ｄａ ｖｉｄｏｖら（Ｌ９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１．０：３８０４７１　Ｇ ａｆｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、、ｉｏ：４９）。

外因性ＤＮＡの酵母宿主への導入方法は、当該分野では公知であり、通常は、ス フェロプラストまたは完全酵母細胞をアルカリカチオンで処理する形質転換を包 含する。形質転換方法は通常、形質転換される酵母種により変化する。例えば、 Ｋｕｒｔｚら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２；　 Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５：１４ １、Ｃａｎｄｉｄａに関するＨ　Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ ｉｅｒｏｂｉｏｙ、１３２：３４５９：　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６） 　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　２０２：３０２．１４ａｎｓｅｎｕＬ＋− に関するｓ　Ｄａｓら（１，９８４）　Ｊ。

ｂｆｏｔｅｒｉｏｌ、５８：１＋６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら　（ １９１１３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４＋１１６５：　Ｖａｎ　ｄｅｎ 　Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５、Ｋｌ ｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓに関するＨ　Ｃｒｅｇｇら（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂ１ｎ１、　５＋３３７６ＨＫｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５＋１４１：　米国特許第４．８３７．１４８号 および米国特許第４．９２９．５５５号、■吐几に関するＨ　Ｈ４ｎｎｅｎら（ １９７８）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５； １９２９；　Ｉｔｏら（１９８３）　Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１５３：１６３ 、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ旦に関するＨ　Ｂｅａｃｈら（＋９８１）　Ｎａｔ ｕｒｅ　３００ニア０６、Ｓｃ　ｊｚｏｓａｃｃｈａ匹ｇに関するＨ　Ｄａｖｉ ｄｏｗら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０：３９；　Ｇａ１ｌｌ ａｒｄｉｎら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０：４９、Ｙａｒｒ ｏｗｉａに関する；参照のこと。

Ｅ、ワクチン 本明細書中で考察されている各Ｌ」Ｌ園ｌタンｌ＜り質は、単一ワクチン候補物 として、または１つ以上のその他の抗原との組み合わせで使用され得、後者はＬ −Ｌ」旦０．またはその他の病原のいずれかに由来する。好ましくは「カクテル 」ワクチンであり、例えば、細胞毒素（ＣＴ）抗原、ＣＡＩタンノくり質、およ びウレアーゼを含有する。さらに、ｈｓｐが、これらの成分の１つ以上に対して 加えられ得る。これらのワクチンは、予防剤（感染を予防するため）または治療 剤（感染後；こ疾患を治療するため）のいずれかであり得る。

このようなワクチンは、Ｈ，コニーｕ抗原または抗原類を、通常は「薬学的に受 容可能なキャリア」との絹合せで含有し、このキャリアは、この組成物が与えら れる個体に対して有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しな０（′１ずれもの牛ヤ １ノアを含む。適切なキャリアは、典型的には、タン／ずり質、多糖類、ポリ乳 酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（ 例えば、油滴またｌま１７ボ・ノーム）、および不活性ウィルス粒子のような、 大きくて徐々（こ代謝される高分子である。このようなキャリアＩよ、当業＠に 周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤（「アジュバント」）と （て機能し得る。さら甑抗原ｌマ、ジフテ１ノア、破傷風、コＬ・う、ＬＪ２ｉ ｉ！ｇ１１などの病原体のような細菌トキ゛ノイド（こコニ・ジュゲー　トされ 得る。

組成物の効果を増強させる好まい１アジユ１＜ン・ト（こＣよ、以下が包含され るが、これらに限定されない＝（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）　（水酸化ア ルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エ マルジョン製剤〔ムラミルペプチド（下記を参照）のようなその他の特異免疫刺 激剤または細菌細胞壁成分を伴うまたは伴わない〕、例えば、（ａ）ＭＦ５９　 （ＰＣＴ公開Ｎｏ、　１ｆＯ９０／１４８３７）　＋　５％スクワレン、０．５ ％Ｔｗｅｅｎ　８０、および０．５％５ｐａｎ　３５　（必須ではないが必要に 応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ　（下記を参照）を含有する）を含有して、１ １０Ｙ型マイクロフルイダイザ−（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｌ。

ｎ、　ＭＡ）のようなマイクロ７ルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に 処方される；　（ｂ）ＳＡＦ：　１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ　８０ ．５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−プロ・／クポリマーＬ１２１、およ びｔｈｒ−ＭＤＰ　（下記を参照）を含有し、マイクロ７ルイダイザーにかけて サブミクロン粒子エマルジョンにされるか、ポルテックスにかけてより大きな粒 子サイズのエマルジョンを生成する；および、（ｃ）Ｒｉｂｉ”アジ二ｌくント 系（ＲＡＳ）　（Ｒｉｂｉ　ｌ＋ｉｍｕｎｏｅｈｅ＋ｎ、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、 　ＭＴ）　：　２％スクワレンー、　０．２％　Ｔｗｅｅｎ　８０、および、１ つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリビド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈＯｒｙ ｌｌｐｉｄ）　Ａ　（ＭＰＩ、）、トレ／＼ロースシミコレート（ＴＤＭ）　、 および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群（１力１ら選ばれる、好ましくはＭＰＬ 　＋　ＣＷＳ　（Ｄｅｔｏｘ”）を含有する：（３）サポニンアジュバント（例 えばＳ口ｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅ、　Ｗｏ ｒｃｅｓＬｅｒ、　ＭＡ）　）が使用され得るか、まカニ（よ、ｌＳＣ０Ｍ　（ 免疫刺激複合体）のような、それらからつくられた粒子：（４）完全フロインＩ ・アジノバンＩ−（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）　 ；（５）サイトカイン（例えば、イ二／ターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２す（ ！’　）　、マクロファージコロニーφＩＩ激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）　、腫瘍壊死 因子（ＴＮＦ）など）；および、（６）組成物の効果を増強するための免疫刺激 剤と１．、て作用するその他の物質。ＡｌｕｍｋよびＭＰ５９が好まＩ、い。

十３己のように、ムラミルペプチドには、ドアセチル−ムラにルーｌ、−トレオ ニルー〇−イソグルタミン（ｔｂｒ−ＭＤＰ）　、　Ｎ−ア七チル＝／ルトラミ ルー１２−アラニル−Ｄ−イソグルタミイ（ｎｏｒ・−ＭＤＰ）、Ｎ−ア七チル ムラミルー１．−アラニルＤ−イソグルタミニルー！、−７ラニンー７−＜１’ −２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオシーシけ ｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）　）−エチルアミン（ＭＴＰ−Ｐ Ｅ）などが含まれるが、。これらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバ ント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希 釈剤を含有する。

さらに、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このような 賦形剤中に存在し得る。

典ν的には、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液の私１ずれかとして注射用に 調製される；注射の前に液体賦形剤に溶解または懸濁するのに適切な固形もまた 、調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアについて上記で考察したように、 調製物は、アジュバント効果を増強するために、エマルジョンにされるか、また はリポソームにカプセル化され得る。

ワクチンと１．て使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリ ペプチド、および必要であれば、上記成分のいかなる他の成分をも含有する。［ 免疫学的に有効な１」とは、単回投与でまたは連続投与の一部として個体に投与 される量が、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、処置され る個体の健康状態および身体条件、処置される個体の分類学上のグループ（例え ば１．ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫系の 能力、所望の予防程度、ワクチン処方、医療状況での治療医の評価、およびその 他の関連因子に依存して変化する。その量は比較的広範囲にあり、所定の試行（ こより決定され得ると思われる。

免疫原性組成物は従来より非経口的に、例えば、皮下または筋肉内注射により、 投与される、その他の投与形態に適した処方には、経口および肺への処方、生薬 ５．および経皮投与が含まれる。経口処方は、Ｌ刀とｒユタンパク質に対して最 も好ましい。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュール であり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤と絹み合わせて投与され得る。

（以下余白） Ｆ、　診断アッセイ Ｌ」ｆ互■抗原は、抗体レベルを検出するために免疫アッセイにおいて使用され 得（または逆に、Ｌ−ツ」旦ロー抗体が抗原レベルを検出するために使用され得 る）、特に、胃十二指腸疾患および十二指腸潰瘍との相関が得られ得る。免疫ア ッセイは、よく判っている組換え抗原に基づいて、今日使用されている観血的診 断法に置き換えられるように開発され得る。例えば、血液または血清試料を包含 する生物学的試料中のし」出且タンパク質に対する抗体が、検出され得る。免疫 アッセイの設計は非常に多様であり、これらの多様性は当該分野では公知である 。免疫アッセイのプロトコールは、例えば、競合、直接反応、またはサンドイッ チ型アッセイに基づき得る。

プロトコールはさらに、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降法 によるものであり得る。はとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプ チドの使用を包含する；その標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射性、または 染色分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた周知で ある；その例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに、ＥＬ 　Ｉ　ＳＡアッセイのような酵素が標識および介在した免疫アッセイである。

免疫診断に適した、適切な標識試薬を含むキットが、適当な容器中に、本発明の 組成物を含む適切な材料を、アッセイの実施に必要とされるその他の試薬および 材料（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）、ならびにアッセイの説明書ととも に包装することにより、構成される。

虹１１Ｌ週 以下に示されている実施例は、当業者が実施するための指針として提供され、い かなる方法においても本発明を限定するようには構成されていない。

ｉ、Ｈ，１ｏｒｉ　ＪＬＩＵ力二工度 Ｌ」す七慰鉦囚方迭 Ｌ−１が旦〔１増殖およびＤＮＡ単離に関する一般的な材料および方法について は、ＣＡＩ抗原およびｈｓｐのそれぞれに関する、以下のｉｆ節およびｔｉｔ節 を参照のこと。

ａ、クローニング 縮重オリゴヌクレオチドの２つの混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓモデル３８０Ｂｃ）ＤＮＡシンセサイザーを使用して、合成した。

これらの混合物を、Ｇｅｎａｍｐ　ＰＣＲキットを使用して、製造業者の指示に 従い、２００ｎｇの精製ＤＮＡと１００μｌのポリメラーゼ連鎖反応に４μＭの 濃度で使用した。この反応物を、９４°Ｃで１分間、４８℃で２分間、および５ ６℃で２分間インキュベートした。反応混合物をこの条件に３０サイクル供した 。

この反応の生成物を７ガロースゲル電気泳動により分析すると、約８７　ｂｐの 顕著なりＮＡフラグメントが現れた。制限酵素ＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩでの消 化後に、そのフラグメントを、前もってＸｂａｌおよびＥｃｏＲｌで消化したＢ ｌｕｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ）プラスミドに連結した。混 合した連結物を使用して、（２００Ω）ａ　ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓ ｅｒ　（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用する２０００Ｖおよび２５μＦでのエレ クトロポレーションにより、コンピテントＥ。

ｃｏｌｊを形質転換した。形質転換されたＥ、　ｃｏｌｔを、１ｏｏＪｔｇ／Ｉ 、ｌＬのアンピシリンを含有するし一寒天プレート上での増殖に対して選択した 。プラスミドＤＮＡは、陽性Ｅ、　ｃｏｌｉ単離物から抽出して、５ｅｑｕｅｎ ａｓｅ　２　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ）　ＤＮＡ配列決定キットを使用し、製造業者の指示に従って 配列分析にかけた。

ｂ、ライブラリーの調製 （１）Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントのライブラリー７μｇの精製ＤＮＡを、制限 酵素旧ｎｄ１１で完全に消化した。３μｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋プラ スミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄｌｌｌで完全に消化し、次に、仔つシ腸ホスファター ゼで処理した。両ＤＮＡ混合物を、水飽和フェノールと攪拌して精製し、次に６ ７％Ｖ／Ｖまでエチルアルコールを加えて沈澱させた。両ＤＮＡを５０μＬの水 に再懸濁させた。０．７μｇのＤＮＡフラグメントを、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　 （ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２および５ユニツトのＴ４　ＤＮＡ　リ ガーゼを含有する溶液５０μＬ中の、ＯＪμｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＤＮＡ と混合した。この混合物を１５°Ｃで２０時間インキュベートし、その後、ＤＮ Ａを水飽和フェノールで抽出して、エチルアルコールで沈澱させた。続いて、そ のＤＮＡを５０μＬの水に再懸濁させた。エレクトロボーレーションにより、こ のＤＮＡ１μｇを）：、　ｃｏｌｔに導入して、約３０００−１０．０００のア ンピシリン耐性細菌コロニーを得た。

２）ＥｃｏＲＩフラグメントのライブラリー約０．７μｇのＥｃｏＲＩ消化ＤＮ Ａを精製し、前もってＥｃｏＲｌで消化して仔つシ腸ホスファターゼで処理して おいた０、４５μｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋プラスミドと混合した。そ のフラグメントを５ｏｕｔ。

の溶液中で連結した。精製および沈澱の後に、そのＤＮＡを５０μＬの水に再懸 濁させた。この溶液ｌμＬによるＥ、　ｃｏｌｉのエレクトロポレーションで、 約２００のアンピシリン耐性細菌コロニーを得た。

さらなるクローニング用のゲノムから適切な制限フラグントを同定するために、 プラスミドを３２ｐで均一に標識し、種々の制限酵素で消化した株ＣＣＵＧ由来 のＤＮＡを分析するためのプローブとして使用し、アガロースゲル電気泳動で分 離し、そしてニトロセルロースフィルターに移した。そのプローブにより、単一 の約３．５ｋｂの旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　＋制限フラグメントが現れた。旧ｎｄｌｌ＋ 消化ＤＮＡフラグメントのライブラリーを調製し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラス ミドベクターにクローニングした。このライブラリーを、予め、クローニングし ておいた８７ｂｐフラグメントに対応する３２ｐ標識ＤＮＡでスクリーニングし た。同一の約３．３　ｋｂｐのＨｊｎｄｌｌｌフラグメントを含有する２つのク ローンが同定された。

これらの旧ｎｄｌｌｌフラグメントのＤＮＡ配列決定により、前記の８７　ｋＤ ａ細胞毒素のアミノ末端に対応する２３アミノ酸をコードし得る配列が明らかに なった。これらの配列は、Ｈｉｎｄｌｌ！制限酵素部位により境界を定められフ ラグメントの末端で終止する、約３００ヌクレオチドのオーブンリーディングフ レームの部分を含有した。また、この配列からは、Ｂ　ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　１部位 から１２０ｂｐ離れた推定オーブンリーディングフレーム内にＥｃｏＲＩ制限部 位が存在することが明らかになった。

ＥｃｏＲ１部位と旧ｎｄｌ１１部位との間の配列に対応する３２ｐ標識プローブ を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫベクターにクローニングされたＤＮＡ由来のＥ ｃｏＲフラグメントのライブラリーをスクリーニングするために使用した。この プローブにより、２つのクローンが、約７．３ｋｂｐフラグメントを含有するこ とが明らかになった。このフラグメントのＤＮＡ配列決定により、３．２　ｋｂ ｐの旧ｎｄｌｌｌフラグメントから決定された配列と重複した、連続的なオープ ンリーディングフレームがあることが判った。これらの重複フラグメントのＤＮ Ａ配列、および、含有される１つの長いオープンリーディングフレームの概念的 な（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ）翻訳を、それぞれ図１および２に示す。

これらのクローンは非常に不安定であることが認められたことは注目されるべき である。スクリーニングで同定された最初のコロニーは、あまりにも小さいので 検出が困難であった。１６−１８時間の継代培養の従来方法によるこれらのクロ ーンの広がりは、ＤＮＡ再配列および欠失のために非常に不均一な群のプラスミ ドとなった。これらのクローンの十分な量を、抗生物質選択のない８−１０時間 の継代培養により増殖させた。この様式では、プラスミドの収量は比較的に少な いが、生存再配列プラスミドを含有する細菌の選択および副産物を排除した。

Ｃ，ＤＮＡライブラリーのスクリーニング顕著な８７　ｂｐフラグメントを含有 するＰＣＲ反応産物を、Ｐｒｉｍｅ−ａ−ｇｅｎｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を 使用するランダムプライマー法により３２ｐで標識した。この標識プローブを、 ニトロセルロースフ／イルター上に固定された約３０００の細菌クローン由来の ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応に使用した。ハイブリダイゼーション反 応は、０．３　Ｍ　ＮａＣ１溶液中６０’Ｃで実施した。陽性細菌クローンを発 展させて、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドは、約３．３ｋｂのＤＮＡ 挿入断片を含有し、ＴＯＸＥＥｌと呼ばれた。

図１に示されている２９２位と４１０位との間の配列を含有する１２０　ｂｐフ ラグメントは、プラスミドＴＯＸＨＨＩ由来であり、ＥｃｏＲＩフラグメントの ライブラリーの約４００コロニーをスクリーニングするために使用した。約７． ３ｋｂのＤＮＡ配列を含有し、ＴＯＸＥＥｌと呼ばれる陽性クローンを単離した 。

図１に示されているヌクレオチド配列は、クローンＴＯＸＨ旧およびＴＯＸＥＥ Ｉから、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２配列決定キットを使用して得た。図１の１位と ４１０位との間のヌクレオチドをＴＯＸＨ旧から得、そして、２９１位と３５０ ７位との間のヌクレオチドをＴＯＸＥＥＩがら得た。プラスミドＴＯＸＨ旧およ びＴＯＸＥＥＩを含有するＥ、　ｃｏｌｔをアメリカンタイプカルチャーコレク ションに寄託した。下記を参照のこと。

ｄ、細胞毒素に対する抗血清の調製 図１に示されている配列のヌクレオチド１１６−４１３に対応するＤＮＡ　７ラ クメントを、細菌発現ベクターｐｅｘ　３４　Ａにクローニングし、細菌プロモ ーターの誘導で、細胞毒素ポリペプチドのアミノ酸に融合され、以前に同定され た２３アミノ酸を含有する、ＭＳ２ポリメラーゼポリペプチドの一部を含有する 融合タンパク質を産生させた。この融合タンパク質の約２００μｇを、アクリル アミド電気泳動で部分精製し、標準的な方法でウサギを免疫するために使用した 。

′ｌケ月間隔３回の免疫後に採取したこれらのウサギからの抗血清を、標準的な イムノブロッティング実験に、Ｌ」ム肛出物をプローブするために使用した。そ の抗血清は、見かけの分子量１００ｋＤａの、変性ポリアクリルアミドゲル電気 泳動上で移動したポリペプチドを現した。このポリペプチドは、細胞毒素陽性株 のタンパク質抽出物には検出されたが、細胞毒素陰性法には検出されなかった。

免疫前に採取した血清は、このポリペプチドと反応しなかった。

ｅ、空胞化活性の部分精製 ６　ｍｇ／ｍｌの濃度のし−Ｌ」旦ロー全膜を、１％ＣＨＡＰＳ、　０．５　Ｍ 　ＮａＣ１゜１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）　、２．５　ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、　２０％スクロース溶液に、４°Ｃで１時間溶解した。次に、この混合物 を、３０％、３５％、４０％、および５５蔦スクロ一ス段階を含む、不連続スク ロースグラジェントにかけ、そして２００００　ｘ　ｇで１７時間超遠心分離に かけた。グラジェントにかけたものを分画して、各画分を空胞化活性およびウレ アーゼ活性に対して試験した。ウレアーゼ活性に関連した空胞化活性を、グラジ ェント画分のいくつかニ認めた。空胞化活性のピークもまた、グラジェントの一 番高い画分に認め、これらの画分には、本質的にウレアーゼ活性はなかった。

このウレアーゼ非依存空胞化活性を、２０％がら３４％の濃度の間の硫酸アンモ ニウムによる段階沈澱法（ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）に よってさらに分画した。異なる濃度の硫酸アンモニラムチ沈澱させたタンパク質 の変性ポリアクリルアミドケル電気泳動で顕著な約１００　ｋＤａポリペプチド が現れ、このポリペプチドは空胞化活性に関して精製された。このポリペプチド は、上記の組換え融合タンパク質に対してつくられたウサギ抗血清により認識さ れた。

Ｕ果 Ｌ」Ｌｌ杜ゲノムの約１０　ｋｂｐに対応する２つの重複フラグメントがクロー ニングされた。これらのクローンは、１２９６アミノ酸（図２に示されている） のポリペプチドをコードし得る３９６０　ｂｐ　（図１に示されている）からな る遺伝子を含有する。

この推定ポリペプチドの分子量は１３９．８　ｋｄである。図１における１８位 のメチオニンコドンの９　ｂｐ上流のヌクレオチド配列ＡＧＧＡＡＧは、シャイ ンーダルガーノコンセンサス配列（ｔｈｅ　ｃａｎｓｅｎｓｕｓ　Ｓｈｉｎｅ− Ｄａｌｇａｒｎｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に密接に類似しており〜このメチオニン がポリペプチド合成の開始メチオニンに相当するという仮説を支持する。図１の ３９０６位の推定終止コドンの１０　ｂｐ下流に始まる３０　ｂｐヌクレオチド 配列は、原核転写ターミネータ−の構造に密接に類似しており、メツセンジャー ＲＮＡコーディング配列の末端に相当すると思われる。

細胞毒素遺伝子は、以下の基準により、Ｌ−且汀旦す、空胞化活性のポリペプチ ド前駆体をコードするとして定義される＝（ｉ）推定ポリペプチドは、以前に記 載された８７　ｋＤａ空胞化タンパク質（Ｃ１ｏｖｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅ＋＊、２６７：１０５７０−７５（１９９２））のアミノ末端として同定され た２３アミノ酸配列（図２．３４−５６位）を含有する。この配列は、原核リー ダー配列に類似する３３アミノ酸の後に続き、従って、この配列は、成熟タンパ ク質のアミノ末端に相当すると思われる；（ｉｉ）目的のアミノ末端を含有する 推定ポリペプチド旺包葺の細胞毒素遺伝子の１００　ｋＤａポリペプチドを認識 したが、細胞毒素遺伝子では認識しなかった。この１００　ｋＤａポリペプチド は、Ｌ」ｆ且ｌ膜から空胞化活性に対して精製する。

まとめて、本明細書中に記載された遺伝子は、Ｌ−囚１旦わ、細胞毒素活性に関 連の１００　ｋＤａポリペプチドにプロセスされる約１４０　ｋＤａポリペプチ ドをコードする。以前に記載された８７　ｋＤａポリベチドは、１００　ｋＤａ ポリペプチドがさらにプロセスされたか、または精製中のタンパク質分解による かのいずれかにちがいない。

ｔｔ、　Ｔ１．　１ｏｒｉ　ＣＡＩ抗原Ｌ」１打方ｍ汰 ３、材料の起源 クローンＡ１．６４／４、Ｇ５、ＡＩ？、２４および５７／Ｄは、λｇｔｌｌラ イブラリーから得た。クローンＢ１は、Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントのゲノムプ ラスミドライブラリーから得た。００７はＰＣＨにより得た。

細胞毒素を産生ずるニュ株は、以下である：　ＧＩＯ，Ｇ２７、Ｇ２９、Ｇ３２ 、Ｇ３３、Ｇ３９、Ｇ５６、Ｇ６５、Ｇ１０５、Ｇ１１３Ａｏ非細胞毒素株は、 以下である：Ｇ１２、Ｇｅｌ、Ｇ２５、Ｇ４７、Ｇ５０、Ｇ２０４゜それらは、 Ｇｒｏｓｓｅｔｏ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　（Ｔｕｓｃａｎｙ、　Ｉｔａｌｙ）の内 視鏡検査生検標本から単離された。株ＣＣＵＧ　１７８７４　（細胞毒素陽性） はＣｕｌ　ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ　ｏｒ　Ｇｏｔｈｅｂｏｒｇから得た。非細胞毒素株Ｐｙｌｏ　２Ｕ＋　（ウ レアーゼ陽性）およびＰｙｌｏ　２Ｕ−（ウレアーゼ陰性）は、Ｆ、　Ｍｅｇｒ ａｕｄ、　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌｉｅｒ、　Ｂｏｒｄｅａｕｘ　（Ｆ ｒａｎｃｅ）から得た。Ｅ、　ｃｏｌｉ株のＤＨＩＯＢ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ＴＧＩ、Ｋ１２ΔＨ１Δｔ ｒｐＳＹ１０８８、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０は、当該分野では公知である。プラ スミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏ ｌｌａ、　ＣＡ）を、クローニング用ベクターとして使用した。ＭＳ２融合タン パク質の発現用の、ｐＥｘ３４　ａ。

ｂｓｃプラスミドは、以前に記載されている。ライブラリー発現に使用されたλ ｇｔｌｌファージベクターは、λｇｔｌｌクローニングシステムキット（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔａｒｉｅｓ）からのものである 。Ｅ、　ｃｏｌｉ株は、ＬＢ培地（２４）で培養した。Ｌ上カニ株は、選択培地 （５％ウマ血液、Ｄｅｎｔ　ｏｒ　５ｋｉｒｒｏｖ’ｓ抗生物質補充のＣｏｌｕ ｍｂｉａ寒天ベース、０．２％シクロデキストリン）、または、５％ウシ胎児血 清（６）または０．２％シクロデキストリン（２５）を含有するＢｒｕｃｅｌｌ ａ肉汁液体培地にプレートした。

ｂ、　Ｌ」ｆユ■の増殖およびＤＮＡ単離Ｌ」Ｌ旦■株は、３７°Ｃで３日間、 固体培地または液体培地中で培養した。両方とも、０ｘｏｉｄ　（Ｂａｓｉｎｇ ｓｔｏｋｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）またはＢｅｃｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｉｎｓ ｉｎ　（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）ガスノゞツクジェネレーターを使 用した微好気性環境中、ま、たは、５％ＣＯ２補充空気を含有するインキユベー ター（２６）中で培養した。細菌を採取して、最終濃度１００μｇ／ｌｌ１１の りゾチームを含有するＳＴＥ　（ＮａＣＩ　０．ＩＭ　、　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　 １０ｍＭ　（ｐＨ８）、ＥＤＴＡ　１　ｍＭ（ｐＨ８））に再懸濁させ、室温で ５分間インキコベートした。細菌を溶解するために、最終濃度１％にＳＤＳを加 え、６５℃に加熱した。プロテイナーゼＫを最終濃度２５μｇ／ｍｌに加えた後 、溶液を５０℃で２時間インキュベートした。ＤＮＡを、臭化エチジウムを加え たＣｓＣｌグラジェントにより精製し、７７％エタノールで沈澱させて封入ガラ スキャピラリーで回収した。

Ｃ９λｇｔｌ１発現ライブラリーの構築およびスクリーニングλｇｔｌ１発現ラ イブラリーを作製するために、制限酵素Ｈａｅ１１１およびＡｌｕｌで部分消化 した、ＣＣ１１Ｇ　１７８７４株由来のゲノムＤＮＡを使用した。０．８％アガ ロースゲル上での分画後、０．６ｋｂと８Ｋｂとの間の大きさのＤＮＡを、Ｃｏ ５ｔａｒ　５ｐｉｎ−Ｘ　（０，２２ミクロン）微量遠心分離フィルターを使用 して溶出した。各消化からの産物を合わせて、λｇｔｌｌクローニングシステム キット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）お よびＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄｚゞツケージングキット（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を使用して・発現ライブラリーを構築 するために使用した。０．８−１　ｘ　１０６個の組換えファージを含有するラ イブラリーをＥ、　ｃｏｌｔ　Ｙ２Ｏ２Ｓで増幅し、１０９フアージ／ｍｌの力 価、８５％組換え、平均押入断片の大きさ９００塩基対の溶解物１５０　ｍｌを 得た。Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ ｌ）を使用する標準的な方法により、免疫学的スクリーニングを実施した。

ｄ、プラスミドライブラリーの構築 ＥＭＢＬ４またはλＤａｓｈのような標準ベクターを使用する、部分消化された 染色体ＤＮＡの完全ゲノムライブラリーを作製する試みは、Ｌ」ＬＩＩＤＮＡク ローニングにおいての多くの著者により記載された困難に直面し、十分なライブ ラリーを得られなかった。従って、制限酵素旧ｎｄｌｌｌで消化し、Ｂｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋にクローニングした株ＣＣｔｌＧ　１７８７４、Ｇ３９およ びＧ５０由来のゲノムＤＮＡを使用して、部分ライブラリーを得た。ＤＮＡ連結 、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨＩＯＢのエレクトロボレーシロン、スクリーニング、お よびライブラリー増幅を実施した。１０％を超えないバックグラウンドとともに ７００００から８５０００の範囲のコロニーを有するライブラリーを得た。

ｅ、　ＤＮＡ操作およびヌクレオチド配列決定ＤＮＡ操作を標準的な方法によっ て実施した。ＤＮＡ配列決定を５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０　（ＵＳＢ）を使用 して実施し、図３に示されているＤＮＡフラグメントをＢｌｕｓｃｒｉｐｔ　Ｋ Ｓ＋にサブクローニングした。

各鎖を少なくとも３回配列決定した。ＤＮＡクローンが入手できなかった１５３ ３と２２８９との間の領域をＰＣＨにより増幅し、非対称ＰＣＲ１および増幅産 物の直接配列決定により配列決定した。この領域の重複は、ｏｎｅ　ａｎｄ　ｄ ｏｕｂｌｅ　５ｉｄｅ　ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲにより確認した＝５°付着末 端旧ｎｄｌｌ＋配列、およびＣ１ａｌ、５ａｉｌ、　Ｘｈ。

ｌの認識部位を含むエクスターナルユニバーサルアンカー（ｅｘｔｅｒｎａｌ　 ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ａｎｃｈｏｒ）（５−ＧＣＡＡＧＣＴＴＡ丁ＣＧＡＴＧＴ ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴ−３’　／　Ｓ’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣ ＧＡ−３“）を、プライマー伸長ＤＮＡに連結して増幅した。次に、入れられた （ｎｅｓｔｅｄ）プライマーによるＰＣＨの第二ラウンドを使用して、クローニ ングおよび配列決定に適したＤＮＡフラグメントを得た。ＤＮＡ配列データを集 めて、ＶＭＳ下のＶＡＸ　３９００走査ＧＣＧパツケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 Ｃｏ＋ａｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｉｎｃ、、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＩＩ）に より分析したＯ　ＥＭＢＬ　ＶＡｘ（ｌｕｓｔｅｒを使用して、ＧｅｎＢａｎｋ およびＥＭＢＬデータベースを調べた。

ｆ、タンパク質調製およびＥＬＩＳＡ タンパク質抽出物を、Ｌ−Ｌｄ旦口、ベレットを６Ｍグアニジンで処理して得た 。ウェスタンブロッティング、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、電気溶出を、標準的な方法で 実施した。融合タンパク質を誘導し、ｅｌｅｃｔｒｏｃｕｔｉｏｎまたはイオン 交換クロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質を、ウサギを免疫する ため、およびＥＬＩＳＡアッセイのマイクロタイタープレートをコーティングす るために使用した。正常粘膜保有者、血液供給者、および患者に由来する血清は 、Ａ、　Ｐｏｎｚｅｔｔｏ　（Ｔｏｒｆｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から得た。臨床診断 は、両生検の組織学に基づいた。試料の空胞化活性は、Ｃｏｖｅｒら、Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍ＋ａｕｎ、　５９：１２６４−Ｔｏ　（ＩＨｌ）に記載されている ようにＨｅＬａ細胞で試験した。

（以下余白） ２、結果 ａ、免疫優性および細胞毒性 胃十二指腸疾患にかかっている患者由来の血清でプローブさｈｔニー　Ｌ」ｆ旦 ｌグアニジン抽出物のウェスタンプロットは、クーマシーブルー染色ゲルでの主 要でない成分である１３０　ｋＤａのタンパク質が、試験された全血清により強 く認識されることを示した。ＣＡＩタンパク質を電気溶出し、ウェスタンプロッ トでこのタンパク質のみを認識するマウス血清をつくるのにこれを使用した。次 に、この血清を、Ｌ−刀」１０１株の抽出物中のＣＡＩタンパク質をウェスタン ブロッティングにより検出するために使用した。抗原は、ＨｅＬａ細胞で空胞化 活性を有する１゜株全てに存在しており、このような活性を有さない８株には存 在していなかった；さらに、タンパク質の大きさは株によりわずかに異なってい た。ＣＡＩ抗原は、すｌＬム旦脂匹１虹二カＵ且旧１、Ｈｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅ ｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ、　Ｅ、　ｃｏｌｉｓおよびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒ 山Ｌｓｓｆｓのようなその他の試験された種では、ウェスタンブロッティングに より検出されなかった。

ｂ、　ｃａｉ遺伝子の構造 λｇｔｌ１発現ライブラリーの１０６個のクローンを、ＣＡＩ抗原に対して特異 的なマウス血清を用いて、および胃十二指腸疾患の患者由来の血清プールを使用 して、スクリーニングした。

マウス血清により、３　ｘ　１０−３の頻度で陽性クローンが検出された。８つ のクローンの配列分析により、それら全てが、図３に示されているクローンＡ１ と部分的に重複することが明らかになった。ヒト血清プールにより、クローン５ ７／Ｄ、　６４／４および２４、および、クローンＡ１に重複する数種のクロー ンを含む、リュ遺伝子の異なる領域を含有する多（のクローンが同定された。

図３中のクローンＡ１．６４／４、Ｇ５、ＡＩ？、２４、および５７／Ｄは、λ ｇｔｌｌライブラリーから得た。クローンＢ１は、Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント のプラスミドライブラリーから得た。プラスミド５７／Ｄ　。

６４／４、Ｂｌ（Ｂ／１）、およびＰｉ−２４（最も後ろのプラスミドはヌクレ オチド２１５０から２６５０）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ ＡＴＣＣ）に寄託した。下記を参照のこと。００７はＰＣＨにより得た。オーブ ンリーディングフレームは、図３の下段に示されている。矢印は、配列決定のた めのプライマーとして使用した合成オリゴヌクレチドの位置および方向を示し、 そして、Ｇ３９の繰り返し配列の挿入位置が示されている。株Ｇ３ｇに認められ る繰り返し配列のうち１つのヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまた、示されて いる。大文字は、釘遺伝子から複製された配列Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３を示し、 小文字は、ヌクレオチドおよびアミノ酸リンカ−を示し、Ｐはプロモーターであ り、およびＴはターミネータ−である。

λｇｔｌｌライブラリー由来のクローン、Ｈ４ｎｄｌｌ＋プラスミドライブラリ ーから単離されたクローンＢ１、および染色体ＤＮＡのＰＣＨにより得られたフ ラグメント００７を使用して、全領域のヌクレオチド配列を決定した。５９２５ 個のヌクレオチド配列のコンピューター分析により、ヌクレオチド５３５から３ ９７７にわたる長いオーブンリーディングフレームが、λｇｔｌｌクローン６４ ／４．２４およびＡ１およびＡ１７から生じる融合タンパク質のフレーム内には まっていることが明らかになった。クローン５７／Ｄは、クローニングされたフ ラグメントの３°末端のみにオーブンリーディングフレームを含有するため、遺 伝子をλｇｔ１１のβガラクトシダーゼと融合し得なかった。λｇｔｌｌクロー ン５７／ｐ中の免疫反応性タンパク質の存在は、非融合タンパク質の発現を誘導 する内因性プロモーターの存在によってのみ説明され得る。この仮説は、Ｂｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターに挿入断片５７／４を両方向モサブクローニ ングすること、および、免疫反応性タンパク質が両場合ともに得られたことを示 すことによって、真実であることが証明された。同定された遺伝子が事実ＣＡＩ 抗原をコードするという確実な証拠は、ｐＥｘ　３４Ｂプラスミドベクターに挿 入断片Ａ１？および６４／４をサブクローニングして、融合タンパク質を得、こ れを精製して用いてウサギを免疫することにより得られる。得られた血清は、細 胞毒素し」ル虱株中のＣＡＩ抗原バンドを特異的に認識した。

釘遺伝子は、１１４７アミノ酸からなる、推定分子量１２８０１２゜７３ダルト ンおよび、等電点９．７２を有する推定タンパク質をコードすた。精製タンパク 質の基本特性を、二次元ゲル電気泳動により確認した。遺伝子のコドンの用法お よびＧＣ含有量（３７％）は、その他のＬ−１ｂ旦０工遺伝子に関する記載と類 似した（１３．２６）。推定リポソーム結合部位：　ＡＧＧＡＧは、目的のＡＴ Ｇ開始コドンから５塩基対上流に同定された。ＡＴＧ開始コドンから上流領域の プロモーター配列についてのコンピューター検索は、−１０または一３５領域の いづれかに類似する配列を同定したが、）：、　ｃｏｌ＋プロモーターに共通す る領域または公開されエイるも一且す立ｕエプロモーター配列に類似することは 見いだされなかった。精製ＬΣ１ｏｒｉＲＮ　Ａのプライマー伸長分析により、 ＡＴＧ開始コドンの１０４および２１４塩基対上流に２つの転写開始部位が存在 することが示された。正統なプロモーターは、いずれの転写開始部位の上流にも 同定され得なかった。クローン５７／ＤによるＣＡＩ抗原部分の発現は、Ｅ、　 ｃｏｌｉもまた、この領域のプロモーターを認識していることを示唆したが、Ｅ 、ｃ。

■がも一且０Ａも−の同じプロモーターを認識するか、またはＡ−Ｔに富むし− りが旦ｒｉＤＮＡが、プロモーターとして作用し得る領域を有するｌｌ：、　ｃ ｏｌｉを提供するかは、明らかではない。ｒｈｏ非依存ターミネータ−が、開始 コドンの下流に同定された。図４では、ＡＧＧＡＧリポソーム結合部位およびタ ーミネータ−には下線を付け、繰り返し配列および６個のアスパラギンを含有す るモチーフは線で囲った。ＣＡＩ抗原は非常に親水性であり、明白なリーダーペ プチドまたはトランスメンブラン配列を示さなかった。最も親水性である領域は 、アミノ酸６００から９００であり、そこではまた、多くの例外的な特徴が認め られ得る：配列ＥＦＫＮＧＫＮＫＤＦＳＫおよびＥＰＹＩＡノ繰り返し、および 、６個の連続したアスパラギンの存在（図４では線で囲った）。

（以下余白） ｃ、　ｃａｉ遺伝子の多様性 遺伝子の多様性は、内部複製により生じると考えられている。異なる株における ＣＡＩタンパク質の大きさの不均一性の機構を見いだすために、より大きなＣＡ Ｉタンパク質（Ｇ３９）を有する１つの株の構造を、サザンブロツティング、Ｐ ＣＲおよびＤＮＡ配列決定により分析した。結果は、Ｇ３９およびＣＣＵＧ　１ ７８７４のＣ紅遺伝子が３４０６位までの大きさで同一であることを示し、６３ ９株が、１０２塩基対からなる２つの同一の繰り返しにより生成される２０４塩 基対の挿入断片を含有することが分がった。各繰り返しは、ｃａｔ遺伝子の同じ 領域からの３つのＤＮＡセグメント（図３の配列Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）の複製 から生じ、小さなリンカ−配列により接続されている配列を含有することが認め られた。挿入がなされた領域および挿入断片自身の図式を、図ＣＡＩ抗原が非細 胞毒素株に存在しない理由を研究するために、それらの２つ（Ｇ５０およびＧ２ １）からのＤＮＡをＥｌ：ＯＲ＋％旧ｎｄｌｌｌおよびＨａｅｌ　Ｉ　Ｉ制限酵 素で消化し、親遺伝子内の２つのプローブ（それぞれに、ヌクレオチド５２０− １１１４０および２８５０−４３：Ｈの範囲）を使用したサザンブロッティング により試験した。両プローブは、株ＣＣＵＧ　１７８７４およびＧ３９において 強くハイブリダイズするバンドを認識した。そのバンドは２つの株で大きさが変 わり、遺伝子の多様性に一致する。しかし、プローブは、Ｇ５０およびＧ２１　 ＤＮＡのいずれにもハイブリダイズしなかった。このことは、試験された非細胞 毒素株が工遺伝子を含まないことを示した。

ｅ、血清抗体 ＣＡＩ抗原に対する血清抗体の存在を、胃十二指腸疾患に関連づけた。ＣＡＩ抗 原に対する定量的抗体応答を研究するために、ｐＥｘ３４にサブクローニングさ れたＡ１？フラグメントにより産生された融合タンパク質を、均質に精製して、 ＥＬＩＳＡ試験用にμタイタープレートをコーティングするために使用した。こ のアッセイでは、胃十二指腸病状の患者は、無作偽に選択された血液供給者およ び正常な胃粘膜を有する人間に認められるより、有意に高い平均ＥＬＩＳＡ力価 を有した。抗体力価が、特に胃十二指腸疾患に関連するかどうかを評価するため に、既知の組織学的診断による患者からの血清を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験し た。十二指腸潰瘍の患者は、その地金ての患者より有意に高い平均抗体力価を有 した。概して、ＥＬＩＳＡは、胃十二指腸疾患患者の７５．３％、および十二指 腸潰瘍患者の１００％を予測し得るごとが認められた。

１つの特定のＥＬＩＳＡでは、ＣＡＩ抗原に由来する２３０アミノ酸を含有する 組換えタンパク質を、タンパク質に特異的な抗血清を使用した、Ｌ上山旦ＤＮＡ の発現ライブラリーのスクリーニングによって同定した。組換え抗原を、Ｅ、　 ｃｏｌｉ中で融合タンパク質として発現させ、均質に精製して、μタイタープレ ートをコーティングするために使用した。次に、そのプレートを、ヤギ抗ヒトＩ ｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートの１／２０００希釈と９０分間イン キュベートした。洗浄後、酵素基質をプレートに加え、３０分間後に４０５　ｎ ｎでの光学濃度を読みとった。胃疾患ではなく、ウェスタンブロッティングで検 出可能な抗し」Ｌ旦Ｉ抗体を有さない２０人の固体からの血清を使用して、カッ トオフレベルを、平均吸光度＋２標準偏差により決定した。ＥＬＩＳＡアッセイ を、規定通りの上部胃十二指腸内視鏡検査を受けた８２人の消化不良患者（平均 年齢５０．６±１３．４才、２８才から８０才）の末梢血試料で試験した。患者 の胃洞部粘膜を、組織学およびギムザ染色のために得た。２０人の患者は十二指 腸潰瘍、５人は胃潰瘍、４３人は慢性活性Ｂ型胃炎、８人は十二指腸炎、そして ６人は胃粘膜が正常であった。十二指腸潰瘍の全ての患者は、カットオフレベル を超える光学濃度値を有した。十二指腸炎、胃潰瘍、および慢性胃炎の患者は、 それぞれに、７５％、８０％および５３．９％の症例において陽性ＥＬＩＳＡ値 を有した。ＥＬＩＳＡと組織学的ギムザ染色間との一致は、十二指腸潰瘍で９５ ％、十二指腸炎で９８％、胃潰瘍で８０％、そして、慢性胃炎で５５．８％であ った。このアッセイは、十二指腸炎潰瘍疾患と非常に相関性を与えた（　ｐ＜　 ｏ、　０００５）。

ＬＬＬＪショックタンパク　ｈｓ Ｌ二随社上Ｊ」ε伝法 ａ、Ｈ，Ｊ！１ｉ９ｉｉ株および増殖条件使用したし−１０ユロ２株は：　ＣＣ ＵＧ　１７８７４、Ｇ３９、およびＧ３３（ｔｈｅ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　 Ｇｒｏｓｓｅｔｏ、　Ｉｔａｌｙでの胃生検から単離した）、Ｐｙｌｏ　２０＋ およびＰｙｌｏ　２Ｕ−（Ｆ、　Ｍｅｇｒａｕｄ、　ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｐｅｌ ｌｅｇｚｉｎ。

Ｂｏｒｄｅａｕｘ、　Ｆｒａｎｃｅ）　、ＢＡ９６　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 ｏｆ　５ｉｅｎａ、Ｉｔａｌｙでの胃生検で単離した）であった。Ｐｙｌｏ　Ｚ Ｕ十株□は非細胞毒性；Ｐｙｌｏ　２ＬＩ−株は非細胞毒性およびウレアーゼ陰 性である。全林は、０．２％シクロデキストリン、５Ｍｇ／ｍｌセフスロジン、 および５Ｍｇ７ｍｌアムホテリシンＢを含有するＣｏ１ｕｌｂｉａ寒天で、微好 気性条件下で３７°Ｃで５−６日間ルーチンで増殖した。細胞を採取し、ＰＢＳ で洗浄した。ベレットを１、ａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に再懸濁させ、煮沸して溶 解した。

胃炎および潰瘍に冒された患者の血清（Ａ、　Ｐｏｎｚｅｔｔｏ、　ｈｏｓｐｉ ｔａｌ″Ｌｅ　Ｍｏ１ｉｎｅｔｔｅ−、Ｔｏｒｉｎｏ、　Ｉｔａｌｙから提供さ れた）、および胃癌患者の血清（Ｆ、　Ｒｏｖｉｅｌｌｏ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　ｏｆ　５ｉｅｎａ。

Ｉｔａｌｙから提供された）を使用した。

ｂ、ライブラリーの免疫スクリーニングλｇＨＩ　Ｌ」Ｌ旦旺ＤＮＡ発現ライブ ラリーのｓｏｏ、　ｏｏｏプラークを、０．２％マルトースおよびＩｆ）＋＋Ｍ 　ＭｇＳＯ４を含有するＬＢ中で一晩増殖させたＥ、　ｃｏｌｉＹ１０９０株の 懸濁液Ｓ　ｍｌと混合し、０．５０．Ｄ。

で１０ｒａＭ　Ｍｇ５Ｏ＜中に再懸濁させた。３７℃で１０分間のインキュベー ション後に、溶かしたＴｏｐＡｇａｒｏｓｅ７Ｓ＋ａｌを、細菌／ファージ混合 物に注ぎ入れ、その全部をＢＢＬプレートに塗布した（５０゜０００プラーク／ プレート）。塗布したライブラリーを４２℃で３゜５時間インキュベートした後 、予め１０ｍＭ　ＩＰＴＧで湿潤させたニトロセルロースフィルター（Ｓｅｈｌ ｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１．　Ｄａｓｓｅｌ、　Ｇｅｒｍａｎｙ） をプレートに取付けて３７°Ｃでのインキュページ曹ンを３．５時間続け、次い で４°Ｃで一晩放置した。λタンパク質のついたフィルターを持ち上げてＰＢＳ ですすぎ、ＴＢＳＴ　（１（ｉｓＭ　ＴＲｌ５　ｐＨ８，１０（ｌａＭ　ＮａＣ １，５Ｍ　ＭｇＣｈ）　１．：溶解シタ５％脱脂粉乳に２０分間浸した。最初の ハイブリダイゼーシ１ン工程は、患者血清を用いて実施した；陽性プラークの呈 色および可視化のために、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトｔｇ抗 体（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）、およびＡＰ緩衝液 （１００ｉ＋ＭＴｒｉｓ　ｐＨ９，５，１００５Ｍ　ＮａＣ１，５ｓＭ　ＭｇＣ １２）中（ＤＮＢＴ／ＢＣＩＰ＋　ッ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、 　Ｗｌ）を、製造者の指示に従って使用した。

Ｃ０組換えＤＮＡ法 使用した試薬および制限酵素は、Ｓｉｇａ＋ａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎｎｈｅｊｍ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）がら 入手した。分子クローニング、−重鎖ＤＮＡ精製、Ｅ、　ｃｏｌｉでの形質転換 、プローブの放射活性標識、Ｌ」Ｌ旦ｕＤＮＡゲ／ムライブラリ−のコロニース クリーニング、サザンプロット分析４、ＰＡＧＥおよびウェスタンプロット分析 について、標準的な方法を使用した。

ｄ、　ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）にサブクローニングした。［３３Ｐ］　ａ　 ｄＡＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ ）および５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｕ、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０■）を製造者の指示に従って使用して、 −重鎖ＤＮＡ配列決定を実施した。配列は両鏡について決定し、各鎖は平均２回 配列決定した。コンピューター配列００組換えタンパク質 ＭＳ２ポリメラーゼ融合タンパク質を、ｐＥＸ３１の誘導体である、ベクターｐ ＥＸ３４Ａを用いて生産した。挿入断片Ｈｐ６１　（図５のヌクレオチド４４５ からヌクレオチド１４０２）およびＥｃｏ旧リンカ−を、ベクターのＥｃｏＲｉ 部位に挿入してクローニングした。停止コドンの位置を確認するために、ＨｐＧ ３’　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを、ｐＥＸ３４Ａの旧ｎｄｌ１１部位に挿入 してクローニングした。組換えプラスミドを、Ｅ　ｃｏｌｔ　Ｋ１２：Ｈ１Δｔ ｒｐに形質転換した。誘導後両場合とも、予期した分子量の融合タンパク質が産 生された。ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの場合に、誘導後に得られた融 合タンパク質を電気溶出し、標準的なプロトコールにより、ウサギに免疫した。

Ｌ」１里 ａ１発現ライブラリーのスクリーニングおよびＬ−且ム旦口、ｈｓｐのクローニ ング Ｌ−１ｄ旦ｒｉ　ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングに適した血清を見つ けるために、Ｌ−且ｏ旦ｒｉｃｃＵＧ　１７８７４株の超音波処理抽出物を、異 なる型の胃炎に冒された。患者の血清に対するウェスタンプロｙ）分析で試験し た。異なる血清による抗原認識のパターンは、おそらく、患者の免疫応答の相違 、および感染に関連する株により発現された抗原の相違によって、多用である。

血清Ｎ°１９を、細菌増殖の間にインビボで発現されたし」ムｍ特異抗原を同定 するためのλｇｔｌｌ　Ｌ」Ｌ亙ｄＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングす るために、選択した。この血清を用いるライブラリーのスクリーニング後に、多 くの陽性クローンを単離して特徴付けた。１（ｐ６７と呼ばれる、これらのうち の１つのヌクレオチド配列で、熱シヨツクタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに 高度の相同性を有するタンパク質をコードする、９５８塩基対のオープンリーデ ィングフレームが明らかにされた（Ｅｌｌｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　３５８：１９ １−９２　（１９９２））　。全コーディング領域を得るために、異なる制限酵 素により消化されたＬ」ムｏｒｉ　ＤＮＡのサザンプロット分析でのプローブと して、フラグメントＨｐ６７を使用した。プローブＨｐ６７は、それぞれに約８ ｏｏおよび１０００塩基対の２つの旧ｎｄｌｌｌバンドを認識した。Ｈｉｎｄｌ ｌｌで消化されたＤＮＡのゲノムＬ」Ｌタルライブラリーを、プローブ）１９６ ７でスクリーニングし、予期した分子量の２つの陽性クロー７　（ＨｐＧ５’お よびＨｐＧ３゛）を得た。プラスミｌ／ｐＨ９６０Ｇ２　（約ヌクレオチド１か ら８２９）およびｐＥｌｐ６０Ｇ５　（約ヌクレオチド８２４がら１８３８）を 含有するＥ、　ｃｏｌｔを、アメリカンタイプカルチャーコレクシラン（ＡＴＣ Ｃ）に寄託した。

ｂ、配列分析 ヌクレオチド配列分析で、開始ＡＴＧの６塩基対上流の推定リポソーム結合部位 を有する、１６３８塩基対のオーブンリーディングフレームが明らかにされた。

図５は、Ｌ１且ｕＡゎ−ｈｓｐのヌクレチドおよびアミノ酸配列を示す。推定リ ポソーム結合部位および内部旧ｎｄｌ［１部位には、下線を付けた。４４５位の シトシンおよび１４０２位のグアニンは、Ｈｐ６７フラグメント中の、それぞれ に最初および最後のヌクレオチドである。１７７２位のチミジンを、因子独立タ ーミネータ−領域の位置を計算して、転写された最後の推定ヌクレオチドとして 同定した。オープンリーディングフレームは、推定分子量５８．３　ｋＤａおよ び推定ｐＩ値５．３７を有する、５４６アミノ酸のタンパク質をコードした。

この遺伝子のコドン選択は、Ｌ−Ｌ０立０．コドンの用法と一致する。

親水性特性の分析で、推定リーダーペプチドまたはその他のトランスメンブラン ドメイン以外の大部分の親水性タンパク質が明らかにされた。アミノ末端配列は 、Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ。

１＋ａｍｕｎ、　６０：１９４６−５１　（１９９２）により、精製タンパク質 で決定された３０アミノ酸の配列と１００％相同性を示し、ＥｖａｎＳら、１ｎ ｆｅｃｔ、ｌ＋ｅ＋＊ｕｎ、　６０：２１２５−２７　（１９９２）により公表 された４４アミノ酸の配列と１残基（Ｌｙｓに代わって５ｅｒ４２）のみが異な った（　ＥｖａｎＳら、１９９２）。成熟ｈｓｐタンパク質のＮ末端配列は、開 始メチオニンを含有せず、このことは、メチオニンが翻訳後に除去されたことを 示す。

ｃ、　ｈｓｐ６０ファミリーとの相同性アミノ酸配列分析で、熱シヨツクタン１ ＜り質ｈｓｐ６０のファミリーと高度な相同性を示した。このファミリーのメン ／＜−は、あらゆる生物に存在する。異種のｈｓｐ６０タンパク質間の相同性の 程度に基づくと、Ｌ」Ｌ旦１ｈｓｐは、グラム陰性細菌のｈｓｐ６０タンパク質 のサブグループに属する；しかじ１．ｈｓｐ６０ファミリーの他のタンパク質と の相同性の程度は、非常に高い（少なくとも５４％一致）。

６１組換えタンパク質の発現およびポリクローナル抗血清の産生 クローンＨｐ６７およびクローンＩＩｐＧ３°の挿入断片を、ＭＳ２ポリメラー ゼのアミン末端に融合したこれらのオーブンリーディングフレームを発現するた めに、発現ベクターｐＥＸ３４Ａにサブクローニングした。そのクローンは、予 測された大きさの組換えタンパク質を産生じ、最初のスクリーニングのために使 用したヒト血清により認識された。クローン）Ｉｐ６７由来の融合タンパク質を 電気溶出し、抗ｈｓｐ特異ポリクローナル抗血清を得るためにウサギの免疫に使 用した。得られた抗血清は、融合タンパク質と、ウレアーゼ陰性株および非細胞 毒性株を含む、試験シたＬ−且ム旦堕、のいくっかの株の全細胞抽出物の５８Ｋ Ｄａのタンパク質との両方を認識した。

ｈｓｐは、試験し全も一且ム旦０１株により発現されたことが示され、その発現 はウレアーゼの存在または細胞毒性に関連しない。抗ｈｓｐ抗血清に認識された タンパク質は、Ｌ−見ム旦ローの水溶性抽出物に認められ、ウレアーゼサブユニ ットとともに精製された。このことは、このタンパク質の細菌の外膜への弱い関 連性を示唆する。従って、ｈｓｐはウレアーゼ関連および表面露出されたとして 記載され得る。ｈｓｐ相同タンパク質のほとんどが、細胞質またはミトコンドリ アおよびプラスチドに局在するので、細胞表面への局在は驚きである。ｈｓｐに リーダーペプチドが存在しないことは、これが、特有の移送系により膜に移送さ れるか、そのタンパク質が細胞質がら放出され、細菌の死後に細菌の膜に受動的 に吸着されるかのいずれがであることを示唆する。

ｈｓｐ６０タンパク質は、オリゴマーまたはマルチマータンパク質の正常な折り 量み、組立、および輸送を補助する分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎ）として 作用することが示された。Ｌ」ムｏｒｆ　ｈｓｐの細胞局在性、およびウレアー ゼへの弱い関連性より、ｈｓｐは膜表面に露出された最終四次構造がＡ６Ｂ６で あるタンパク質の折り畳みおよび／または組立を補助する役割をなし得る、ウレ アーゼのような複数のサブユニットからなることを示唆する。Ａｕ５ｔｉｎら、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７４ニア４７０−７３　（１９９２）は、Ｌ」ム旦 ｒｉ　ｈｓｐの超微細構造は、４つのグループに並んで積み重った円盤状の粒子 に組み立てられた、７つのサブユニ、トからなることが示された。この構造はウ レアーゼ高分子の形および大きさに類似し、このことは、それらが同時精製にな るこれらの２つの高分子の共通の特性を説明し得る。しかし、Ｌ」ヱｌ■ｈｓｐ 遺伝子は、ウレアーゼオペロンの部分ではない。

他の細菌ｈｓｐ６０タンパク質の遺伝子構造に一致し、これはジシストロン性オ ペロンであるはずだ。

ｅ、胃十二指腸疾患患者中の抗ｈｓｐ抗体の存在精製融合タンパク質を、Ｌ」ｆ 旦口感染患者ならびに萎縮性および表在性胃炎に冒された患者、ならびに十二指 腸および胃潰瘍患者の血清を使用する、ウェスタンプロットにより試験した。は とんどの血清は組換えタンパク質を認識した。しかし、認識の程度は、個々の患 者間で非常に多様であり、抗体レベルは、疾患型と明白な相関を示さなかった。

さらに、Ｌ−且がＡ０１抗原および特にｈｓｐタンパク質に対する抗体が、試験 された胃癌患者の１２血清のほとんどに認められた。Ｌ」ムｏｒｉ　ｈｓｐ認識 は疾患の特定の臨床状態には関係しないが、Ｈ９ね」旦ｒｉ　ｈｓｐとそのヒト 相同物量の高度な保存があるとすると、このタンパク質がヒトの対応物と交差反 応する自己免疫抗体を誘導し得ることは可能である。このクラスは相同タンパク 質は、別の系における自己免疫疾患の誘導に関係がある。従って非消化性患者中 のヒト相同物と交差反応する可能性がある高力価抗り一且己旦ｒｉ　ｈｓｐ抗体 の存在は、このタンパク質が胃十二指腸疾患において役割を有することを示唆す る。この自己反応性は、Ｌ−Ｌム旦１．誘導性胃炎で生じる組織の損傷に役割を 果たし得、従ってこの細菌感染に関連する病原機序を増加した。

このような保存されたタンパク質に対する高レベルの抗体は、やや異常である； ヒトのものを含むｈｓｐ６０ファミリーのメンバー間で高度に相同であるので、 このタンパク質は、宿主免疫系に非常によく許容されるにちがいない。多くの患 者に認められる強い免疫応答は、２つの異なる方法で説明され得る：（１）免疫 応答は、Ｌ」Ｌｌｌｈｓｐに特異的なエピトープに対してのみ指示される；（２ ）免疫応答は、Ｌ−Ｌ」旦０．ｈｓｐおよびヒト相同物量で共通のエピトープに 対して指示される。

Ｈ１生物“的　・の−匝 以下の材料は、ブダペスト条約（特許手続き上微生物の寄託の国際的承認に関す る）のもとに、本発明の譲受人であるＢｉｏｃｉｎｅ　５ｃｌａｖｏ、　Ｓ、ｐ 、Ａ、により、１９９２年１２月１５日および１９９３年１月２２日に、メリー ランド州、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１、電話（３０１）２３ １−５５１９のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託さ れた。

細胞毒素タンパク質（ＣＴ）について：ＣＡＩタンパク質について： ＡＴＣＣＮｏ、６９１５８　プラスミド５７／Ｄを含むＥ、　ｃｏｌｉ　ＴＧＩ ＡＴＣＣＮｏ、６９１５９　プラスミド６４／４を含むＥ、　ｃｏｌｔ　ＴＧＩ ＡＴＣＣＮｏ、６９１６０　プラスミドＰＬ−２４を含むＥ、ｃｏｌｔ　ＴＧＩ ＡＴＣＣＮｏ、６９１６１　プラスミドＢ／１を含むＥ、ｃｏｌｔ　ＴＧＩ熱シ ョックタンパク質（ｈｓｐ）について：ＡＴＣＣＮｏ、６９１５５　プラスミド ｐＨｐ６０Ｇ２を含むＥ、　ｃｏｌｔ　ＴＧＩＡＴＣＣＮｏ、６９１５６　プラ スミドｐＨｐ６０５を含むＥ、　ｃａｌｆ　ＴＧＩこれらの寄託物は、当業者の 利便性のために提供されており、寄託が米国特許法１１２条のもとに必要とされ ることを認めるものではない。これらの寄託物の核酸配列およびこれらによりコ ードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されて おり、万−寄託物の配列と比較して本明細書中に記載された配列に任意の誤りが ある場合には、参考にされるべきである。寄託物質の製造、使用、または売却に は認可が必要であり得るが、ここではそのような認可は承認されていない。

１　ＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧ　ＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧ　ＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡ ＡＣＡＣＡＣＣＧ　ＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴ５１　ＣＧＣＣＣＴＣＴＧＧ　ＴＴＴ ＣＴＣＴＣＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＧＡ　ＧＣＡＴＴＡＧＴＣＡ　ＧＣＡＴＣＡＣ ＡＣＣｌｏｌ　ＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴ　ＣＡＴＧＣＣＧＣＣＴ　ＴＴＴＴＣＡＣ ＡＡＣＣＧＴＧＡＴＣＡＴＴ　ＣＣＡＧＣＣＡｎＧ１５１　ＴＴＧＧＧＧＧＴＡ Ｔ　ＣＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＡＧ　ＧＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧ ＧＣＴＴＣＴＴ２０１　ＡＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧ ＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣ２５１ＣＧＡＴＡＡＡＧ ｎ　ＴＧＧＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＡ　ＡＧＧＣＴＴＴＡＡＴ　ＧＡ ＡＴＴＣＣＣＴＡ３０１　ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡ　ＣＧＡＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡ ＴＣＣＣＴＴＴ　ＴＡＴＣＣＡＧＴＡＡ　ＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡ３５１　ＧＧｎ ＧＧＧＡＴＴ　ＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＧＣＡＴ　ＴＡＴＴＧＧＧＴ ＣＡ　ＡＡＧＧＣＧＧＧＣＡ４０１　ＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧ　ＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧ　ＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡ　ＣＧＣＴＧＴＡＧＧＧ　ＡＣｎＡＴＡＣＣＴ４５ １　ＴＡＴＣＡＧＧＧＣＴ　ＴＡＧＡＡＡＣＴｒＴ　ＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧ　Ａ ＴｎＡＧＡＴＧＴ　ＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡ５０１　八ＡＡＧＣＣＡＣＴＴ　ＴＡ ＣＧＣＴＴＧＧＧ　ＣＣＡＡＴＴＣＡＡＴ　ＧＧＣＡＡｎＣＴＴ　ＴＴＡＣＡＡ ＧＣＴＡ５５１　ＴＡＡＧＧＡＴＡＧＴ　ＧＣＴＧＡＴＣＧＣＡ　ＣＣＡＣＧＡ ＧＡＧＴ　ＧＡＴＴＴＣＡＡＣＧ　ＣＴＡＡＡＡＡＴＡＴ６０１　ＣＴＣＡＡＴ ＴＧＡＴ　ＡＡＴｎＴＧＣＡＧ　ＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡ　ＣＴＣＧＴＧＴＧＧＧ 　ＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣ６５１ＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧ　ＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧ ＧＴＴＴＴＧＡＣＴ　ＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴ　ＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴ７０１　Ｃ ＡＣＴＡＧＣＧＡＴ　ＡＡＡＡＡＣＧＣＴＧ　ＡＡＡｎＴＣＴＣＴ　ＴＴＡＴＧ ＡＴＧＧＴ　ＧＣＣＡＣＧＣＴＣＡ７５１　ＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧ ＣＧＴＴ　ＡＡＡＴＴＡＡＴＧＧ　ＧＴＡＡ′ｒＧＴＧＴＧ　ＧＡＴＧＧＧＣＣ ＧＴｓｏＩＴＴＧＣＡＡＴＡＣＧ　ＴＧＧＧＡＧＣＧＴＡ　ＴＴＴＧＧＣＣＣＣ Ｔ　ＴＣＡＴＡＣＡＧＣＡ　ｃＧ／ＩｒＡＡＡｃＡｃ８５１　ＴＴＣＡＡＡＡＧ 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換えＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉタンパク質、または誘導体 またはそのフラグメント。 ２．前記タンパク質が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素また は前駆体、誘導体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の組換えタン パク質。 ３．前記細胞毒素、前駆体、誘導体、またはそのフラグメントが、図２のアミノ 酸配列またはその部分を有する、請求項２に記載の組換えタンパク質。 ４．前記タンパク質が、免疫優性抗原または誘導体またはそのフラグメントに結 合されたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素である、請求項１に 記載の組換えタンパク質。 ５．免疫優性抗原、誘導体またはフラグメントに結合される前記細胞毒素が、図 ４のアミノ酸配列またはその部分を有する、請求項４に記載の組換えタンパク質 。 ６前記タンパク質が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ熱シヨックタン パク質、または誘導体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の組換え タンパク質。 ７．前記熱ショックタンパク質、誘導体またはフラグメントが、図５のアミノ酸 配列またはその部分を有する、請求項６に記載の組換えタンパク質。 ８．前記組換えタンパク質が、実質的に非毒性または実質的に低い毒性を示す、 請求項２または３に記載の組換えタンパク質。 ９．前記組換えタンパク質が免疫原性であり、そして、毒性に対して機能的寄与 をまったく示さないか、または毒性に対して実質的に低い機能的寄与を示す、請 求項４から７のいずれかに記載の組換えタンパク質。 １０．前記組換えタンパク質が、毒性または毒性に対する機能的な寄与を低下ま たは排除するために、化学的に改変される、請求項８または９に記載の組換えタ ンパク質。 １１．前記組換えタンパク質が、１つまたはそれより多いアミノ酸置換または欠 失を含む、請求項８または９に記載の組換えタンパク質。 １２．標識されているか、または固体支持体に結合されている、前記請求項のい ずれかに記載の組換えタンパク質。 １３．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の処置における使用のため の、請求項１から１１のいずれかに記載の組換えタンパク質。 １４．ワクチンとしての使用のための、請求項１から１１のいずれかに記載の組 換えタンパク質。 １５．請求項１から１１のいずれかに記載の組換えタンパク質、および薬学的に 受容可能なキャリアを含有する、ワクチンまたは治療組成物。 １６．請求項１から１１のいずれかに記載の２つまたはそれより多い組換えタン パク質を含有する、請求項１５に記載のワクチンまたは治療組成物。 １７．以下の（ｉ）から（ｉｖ）の２つまたはそれより多くを組み合わせて含有 する、請求項１６に記載のワクチンまたは治療組成物： （ｉ）組換えＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素タンパク質、前 駆体、誘導体またはそのフラグメント、（ｉｉ）免疫優性抗原に結合されたＨｅ ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ組換え細胞毒素、または誘導体またはその フラグメント、（ｉｉｉ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ組換え熱シ ョックタンパク質または誘導体またはそのフラグメント、および／または（ｉｖ ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ。 １８．アジュバントを含有する、請求項１５から１７のいずれかに記載のワクチ ンまたは治療組成物。 １９．請求項１から１１のいずれかに記載の、１つまたはそれより多い組換えタ ンパク質を、薬学的に受容可能なキャリア、および、必要に応じてアジュバント と組み合わせることを包含する、請求項１５から１８のいずれかに記載のワクチ ンまたは治療組成物を調製する方法。 ２０．少なくとも１つの結合パートナーとして、必要に応じて標識されたまたは 固体支持体に結合された、請求項１から１２のいずれかに記載の組換えタンパク 質を含む、少なくとも１つの工程を包含する、免疫診断アッセイ。 ２１．請求項１から２０のいずれかに記載の、少なくとも１つの組換えタンパク 質を含有する、請求項２０に記載のアッセイを実施するための免疫診断キット。 ２２．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染の処置用の薬剤の製造のた めの、請求項１から１１のいずれかに記載の１つまたはそれより多い組換えタン パク質の使用。 ２３．請求項１から１１に記載の組換えタンパク質の有効量を投与すること包含 する、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに感染した個体の処置方法。 ２４．以下の（ｉ）から（ｉｖ）の２つまたはそれより多くを組み合わせた有効 量を投与することを包含する、請求項２３に記載の処置方法： （ｉ）組換えＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素タンパク質、前 駆体、誘導体またはそのフラグメント、（ｉｉ）免疫優性抗原に結合されたＨｅ ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ組換え細胞毒素、または誘導体またはその フラグメント、（ｉｉｉ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ組換え熱シ ョックタンパク質または誘導体またはそのフラグメント、および／または（ｉｖ ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ。 ２５．以下の（ｉ）から（ｉｖ）の２つまたはそれより多くを組み合わせた免疫 学的に有効な量を投与することを包含する、ワクチン接種法： （ｉ）組換えＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素タンパク質、前 駆体、誘導体またはそのフラグメント、（ｉｉ）免疫優性抗原に結合されたＨｅ ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ組換え細胞毒素、または誘導体またはその フラグメント、（ｉｉｉ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ組換え熱シ ョックタンパク質または誘導体またはそのフラグメント、および／または（ｉｖ ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ。 ２６．請求項１から１１のいずれかに記載の組換えタンパク質をコードする、組 換えポリヌクレオチド。 ２７．図１のヌクレオチド配列の全てまたは部分を含有する、Ｈｅｌｉｃｏｂａ ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素タンパク質または誘導体またはそのフラグメン トをコードする、組換えポリヌクレオチド。 ２８．図４のヌクレオチド配列の全てまたは部分を含有する、免疫優性抗原に結 合されたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ組換え細胞毒素タンパク質ま たは誘導体またはそのフラグメントをコードする、組換えポリヌクレオチド。 ２９．図５のヌクレオチド配列の全てまたは部分を含有する、Ｈｅｌｉｃｏｂａ ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ組換え熱ショックタンパク質または誘導体またはそのフ ラグメントをコードする、組換えポリヌクレオチド。 ３０．請求項２６から２９のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチドの全てま たは部分を含有する、ポリヌクレオチドプローブ。 ３１．少なくとも１つの工程が、請求項３０に記載のポリヌクレオチドプローブ を含む、核酸アッセイ。 ３２．請求項３０に記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを包含 する核酸アッセイを実施するためのキット。 ３３．少なくとも１つのプライマーが、請求項２６から２９のいずれかに記載の 組換えポリヌクレオチドの全てまたは部分を含有する組換えポリヌクレオチドで あるポリヌクレオチドプライマーを使用する、ポリヌクレオチド増幅方法。 ３４．少なくとも１つのプライマーが、請求項２６から２９のいずれかに記載の 組換えポリヌクレオチドの全てまたは部分を含有する組換えポリヌクレオチドで あるポリヌクレオチドプライマーを使用する、ポリヌクレオチド増幅方法を実施 するためのキット。 ３５．請求項２６から２９のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチドを含有す る、ベクター。 ３６．請求項３５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 ３７．請求項３６に記載の宿主細胞の培養、および組換えポリペプチドの単離を 包含する、請求項１から１１のいずれかに記載の組換えポリペプチドを生産する 方法。