JP2000333686A - ワクチンおよび診断に有用なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉタンパク質 - Google Patents

ワクチンおよび診断に有用なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉタンパク質

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テルフォード ジョン
Giovanni Macchia
マッチア ジョバンニ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの新たな診断法の開発に有
用な、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ「細胞毒素関連免疫優性」抗原
のタンパク質を提供すること。 【解決手段】 免疫原性であり、そして毒性に対して機
能的寄与をまったく示さないか、または毒性に対して実
質的に低い機能的寄与を示す組換えポリペプチドであっ
て、以下の特性を有する、少なくとも８アミノ酸の連続
する配列を含む組換えポリペプチド：（１）該少なくと
も８アミノ酸の連続する配列は、少なくとも１つの部位
を含み、ここで該部位はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐ
ｙｌｏｒｉに対する抗体によって結合され得；そして
（２）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、開示
されたアミノ酸配列から得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は概して、特定のＨｅ
ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉタンパク質、これ
らのタンパク質を発現する遺伝子、および、診断および
ワクチンへの適用に有用なこれらのタンパク質の使用に
関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
ｉは、１９８２年に慢性胃炎患者の胃生検より初めて単
離された、螺旋状の微好気性グラム陰性細菌である（Ｗ
ａｒｒｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ ｉ：１２７３−７５（１
９８３））。元来Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ
ｏｒｉと呼ばれていたものが、別属に属するものと認め
られ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒと命名された（Ｇｏｏ
ｄｗｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．３９：３９７−４０５（１９８９））。この細菌は
ヒト胃粘膜にコロニーを形成し、感染が何十年もの間継
続する。ここ数年の間に、この細菌の存在は、大半の感
染患者は無症候性であるが、消化性潰瘍および胃腺癌の
危険性をかなり増大する症状である、慢性Ｂ型胃炎に関
連づけられた。ごく最近の研究で、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感
染が、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍、および胃癌の原因または
補助因子であり得ることが、強く示唆された（例えば、
Ｂｌａｓｅｒ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９
３：３７１−８３（１９８７）；Ｄｏｏｌｅｙら、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１５６２−６６
（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｎｅｔら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１１２７−３１（１９９１）
を参照のこと）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、経口経路により
伝搬されると考えられており（Ｔｈｏｍａｓら、Ｌａｎ
ｃｅｔ ｉ：３４０，１１９４（１９９２））、その感
染の危険性は、年齢とともに増大し（Ｇｒａｈａｍら、
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １００：１４９５
−１５０１（１９９１））、群衆化により促進される
（Ｄｒｕｍｍら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．４３
２２：３５９−６３（１９９０）；Ｂｌａｓｅｒ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：３８６−９３（１
９９２））。先進諸国では、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原に対
する抗体の存在が、３０才代の人では２０％未満から、
６０才代では５０％以上に増加している（Ｊｏｎｅｓ
ら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２２：５７−６２（１
９８６）；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎ．Ｚ．Ｍｅｄ．Ｊ．９
９：６５７−５９（１９８６））が、一方発展途上国で
は、人口の８０％以上が２０才代までにすでに感染して
いる（Ｇｒａｈａｍら、ＤｉｇｅｓｔｉｖｅＤｉｓｅａ
ｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６：１０８４−
８８（１９９１））。
【０００３】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ発病因子の特性および機
能は、いまだによく理解されていない。今までのところ
同定された因子には、おそらく粘膜層を越えて移動する
ために必要な鞭毛（例えば、Ｌｅｙｉｎｇら、Ｍｏｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２８６３−７４（１９９２）
を参照のこと）；胃の酸性環境を中和し、初期のコロニ
ー化を可能にするために必要なウレアーゼ（例えば、Ｃ
ｕｓｓａｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：２４
６６−７３（１９９２）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３６５８−３６
６３（１９９２）；Ａｕｓｔｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１７４：７４７０−７３（１９９２）；ＰＣＴ
公開Ｎｏ．ＷＯ９０／０４０３０を参照のこと）、およ
び、真核上皮細胞中に空胞形成をなし、疾患に関連する
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株により産生される、報告によれば８
７ｋＤａの分子量を有するモノマーにより形成された、
高分子量細胞毒性タンパク質（例えば、Ｃｏｖｅｒら、
Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０５７０−７５（１
９９２）（特定のＮ末端２３アミノ酸配列を有する「空
胞形成毒素」を参照）；Ｃｏｖｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９１３−１８（１９９２）；Ｌｅ
ｕｎｋ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３：５６８
６−８９（１９９１）を参照のこと）が包含される。さ
らに、以下のことが周知である。
【０００４】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養上清には、分子量が
１２０、１２８、または１３０ｋＤａである抗原が含有
されることが、別々の著者により示された（Ａｐｅｌ
ら、Ａｅｎｔｒａｌｂｌａｔ ｆｕｒ Ｂａｋｔｅｒｉ
ｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．ｕｎｄＨｙｇｉｅｎｅ ２６８：
２７１−７６（１９８８）；Ｃｒａｂｔｒｅｅら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ ４５：７３３−３４（１９９
２）；Ｃｏｖｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｕｎｎ．５
８：６０３−１０（１９９０）；Ｆｉｇｕｒａら、Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉ ｑａｓｔｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｐｅｐｔ
ｉｃ ｕｌｃｅｒ（Ｍａｌｆｒｔｈｅｉｎｅｒら、
編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
（１９９０））。記載された抗原の大きさの相違は、同
じタンパク質の分子量測定についての各研究室間の相違
によるのか、同じ抗原の大きさの可変性によるのか、ま
たは、実際に異なるタンパク質であるのかは、明白では
なかった。このタンパク質についてのヌクレオチド配列
またはアミノ酸配列の情報はなかった。Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ感染の実質的に全患者の血清中に、特異抗体が検出さ
れたので、感染ヒト中で、このタンパク質は非常に免疫
原性である（Ｇｅｒｓｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：５９５−６
０１（１９９２））。
【０００５】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ熱ショックタンパク質
（ｈｓｐ）が記載された（Ｅｖａｎｓら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２１２５−２７（１９９２）
〔４４アミノ酸Ｎ末端配列および分子量約６２ｋＤ
ａ）；Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：
１９４６−５１（１９９２）（Ｎ末端配列中に認められ
た３３アミノ酸および分子量約５４ｋＤａ）；Ａｕｓｔ
ｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７４７０−
７３（１９９２）（Ｎ末端配列中に認められた３７アミ
ノ酸および分子量約６０ｋＤａ）〕。Ａｕｓｔｉｎら
は、Ｎ末端に同じアミノ酸配列を有する同じタンパク質
が事実存在することを示唆している。
【０００６】診断試験の例については、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ溶解物または半精製抗原に基づいた〔Ｅｖａｎｓら、
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９６：１００４−
０８（１９８９）；Ｕ．Ｓ．４，８８２，２７１；ＰＣ
Ｔ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０８８４３（いずれもウレアー
ゼ活性を有する、外膜表面由来の同じ高分子量（３００
−７００ｋＤａ）抗原を含有する組成物およびアッセイ
に関連する）；ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２９ ５７０（６
３、５７、４５および３１ｋＤａの群からの少なくとも
１つのフラグメントを有する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体を
検出するための抗原性組成物に関する）を参照のこ
と〕。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】症候状態または無症候
状態のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染患者の割合は、発展途上国
および先進国の両方において非常に高く、入院費および
治療費からして、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉワクチンおよびこの
疾患に対するさらなる診断試験の開発が望まれる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉの３つの主要なタンパク質のヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列に関する。詳細には、これらは、細胞毒
素、「細胞毒素関連免疫優性」（ＣＡＩ）抗原、および
熱ショックタンパク質である。これらのタンパク質の完
全なアミノ酸配列は未知であり、それらの遺伝子も同定
されていない。本発明は、これらの精製タンパク質およ
びそれらの遺伝子に関するばかりではなく、それらに関
連する組換え物、例えば、ベクターおよび宿主細胞にも
関する。これらのタンパク質の分子レベルでの特性およ
び機能についての理解、ならびに、組換え産物の入手可
能性は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの新たな診断法の開発、およ
び、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染の予防および疾患の処置を行
い得るワクチン設計に、重要な影響を及ぼす。
【０００９】このように、これらのタンパク質は、ワク
チンおよび診断の両方の用途に使用され得る。本発明に
は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに関連する疾患の処置および診断
のための方法が包含される。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、Ｂ型
胃炎、消化性潰瘍、および胃腺癌に関連するので、本発
明が、これらの疾患症状の初期検出および緩和の助けと
なることが望まれる。最近では、診断は内視鏡および生
検の組織学的染色に依存し、既存の免疫アッセイは、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ溶解物または半精製抗原に基づく。こ
のようなアッセイにおいて認められる不均一性により、
疾患症状との相関性は十分には確立されていない。従っ
て、組換え抗原に基づくアッセイは、疾患検出のための
核酸アッセイと同様に優れる。従来、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
感染または処置のための市販ワクチンは存在しない。従
って、組換えワクチンは本発明の目的である。
【００１０】
【発明の実施の形態】（Ａ．一般的な方法論）本発明の
実施には、他に示されていなければ、当該分野の分子生
物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の
方法を使用する。このような方法は、文献に十分に説明
されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，第二版（１９８９）；ＤＮＡ ＣＬＯ
ＮＩＮＧ，ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ ＡＮＤ ＩＩ（Ｄ．
Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣ
ＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉ
ｔ編 １９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢ
ＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．
Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩ
ＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．
Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９
８４）；ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ
（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；ＩＭＭＯ
ＢＩＬＩＺＥＤ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ
（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂ
ａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ
ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭ
ＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒおよび
Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５
４およびＶｏｌ．１５５（それぞれに、ＷｕおよびＧｒ
ｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａ
ｌｋｅｒ編（１９８７），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡ
Ｌ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬ
ＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８
７），ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：Ｐ
ＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，第二
版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、お
よび、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ
ＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ−Ｉ
Ｖ （Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅ
ｌｌ編 １９８６）を参照のこと。
【００１１】ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な省
略形が、本明細書中で使用されている。本明細書中に掲
載されている、全ての刊行物、特許、および特許出願
は、参考として援用されている。
【００１２】（Ｂ．定義）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの「細胞毒
素」または「毒素」とは、図１〜３および４にそれぞれ
に示されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を
有する、タンパク質またはそれらのフラグメント、なら
びに、それらの誘導体のことであり、分子量は約１４０
ｋＤａである。このタンパク質は、分子量が約１００ｋ
Ｄａの細胞毒素活性を有するタンパク質の前駆体として
機能する。細胞毒素は、空胞を形成して多くの真核細胞
型を死滅させ、そして、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養上清から
精製された。さらに、細胞毒素は、タンパク性であり、
ゲル濾過法による見かけの分子量約９５０−９７２ｋＤ
ａを有する。精製物質の変性ゲル電気泳動により、報告
によれば、９５０ー９７２ｋＤａ分子の主要成分が、見
かけの分子量８７ｋＤａのポリペプチドであったことが
以前に示されている（Ｃｏｖｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７：１０５７０−７５ １９９２）。しか
し、本明細書中において、以前に記載された８７ｋＤａ
は、１００ｋＤａタンパク質のさらなるプロセッシング
によるのか、または、精製中に大きなタンパク質がタン
パク質分解したことによるかのいずれかであることが示
唆される。
【００１３】「細胞毒素関連免疫優性」（ＣＡＩ）抗原
とは、図６〜８に記載されているアミノ酸配列を有する
タンパク質およびそのフラグメント、およびそれらの誘
導体のことである。これは、親水性の表面露出タンパク
質であり、約１２０−１３２ｋＤａ、好ましくは１２８
−１３０ｋＤａの分子量を有し、臨床分離株から産生さ
れる。遺伝子の大きさ、およびコードされるタンパク質
の大きさは、遺伝子内部の領域の複製を含む機構によ
り、個々の株により変化する。ＣＡＩ抗原を産生しない
臨床分離株は、ｃａｉ遺伝子を有さず、また活性細胞毒
素も産生し得ない。ｃａｉ遺伝子の存在と細胞毒性との
関連は、ｃａｉ遺伝子産物が、細胞毒素の転写、折り畳
み、移送、または機能に必要であることを示唆する。ま
たは、細胞毒素（ＣＴ）およびｃａｉ遺伝子の両方が、
非細胞毒性株には存在しない。このことは、２つの遺伝
子間である種の物理的連鎖を示唆する。ＣＡＩ抗原固有
の特性は、大きさの可変性であり、このことはｃａｉ遺
伝子が連続的に変化していることを示唆する。ＣＡＩ抗
原は、細胞表面に結合されるようである。このことは、
上清中への抗原放出が、抗原自身または細菌表面に結合
されたＣＡＩ抗原を有する複合体のいずれかを切断す
る、血清中に存在するプロテアーゼの作用のためであり
得ることを示唆する。同様のプロセッシング活性が、イ
ンビボにおける増殖中に抗原を放出し得る。典型的なリ
ーダーペプチド配列が存在しないことにより、非依存的
移送系が存在することが示唆される。
【００１４】「熱ショックタンパク質」（ｈｓｐ）と
は、図９〜１１に示されているアミノ酸配列を有する、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質およびそのフラグメントの
ことであり、分子量は５４−６２ｋＤａの範囲であり、
好ましくは約５８−６０ｋＤａである。このｈｓｐは、
グラム陰性細菌熱ショックタンパク質群、ｈｓｐ６０に
属する。一般的には、ｈｓｐは、原核および真核いずれ
も、動物および植物の全ての生物中に最も保存されたタ
ンパク質に属し、この保存は全配列に沿って広がってい
る。この高度の保存は、その活性を損なうことなく改変
されることはあり得ない、タンパク質の機能構造に、全
配列が関与することを示唆する。
【００１５】本発明に使用され得るタンパク質の例に
は、このタンパク質の天然アミノ酸配列から主要でない
アミノ酸が変化したポリペプチドが含まれ、特に、同類
アミノ酸置換が予測される。同類置換は、それらの側鎖
が縁続きのアミノ酸ファミリー内でなされる置換であ
る。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４つのフ
ァミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、
グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒ
スチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン；および、（４）非帯電極性＝
グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリ
ン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプ
トファン、およびチロシンは、ときには、合わせて、芳
香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイ
ソロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸の
グルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置
換、または、構造的に関連するアミノ酸による同様の同
類置換などの分離された置換が、生物学的活性に重要な
影響を与えないことが、当然予測される。タンパク質と
して実質的に同じアミノ酸配列を有するが、実質的に機
能面に影響しない、主要でないアミノ酸置換を有するポ
リペプチド分子は、タンパク質の定義内に存在する。
【００１６】天然源からのタンパク質の単離および精製
によるのではなく、組換えＤＮＡ法によるタンパク質の
生産の重要な利点は、天然源からタンパク質を単離する
ために要求される開始物質より、より少量の物質を使用
して、同量のタンパク質が生産され得ることである。組
換え法によるタンパク質の生産はまた、細胞内に通常存
在するある種の分子を伴わずにタンパク質を単離するこ
とを可能にする。組換え非ヒト宿主により産生されたヒ
トタンパク質のみが議論の組換えタンパク質であるの
で、事実、いかなるヒトタンパク質夾雑物も完全に含ま
ないタンパク質組成物が、容易に生産され得る。天然源
からの潜在的なウイルス因子、および、ヒトに対して病
原性であるウイルス成分もまた除外される。
【００１７】本明細書中に使用されているように、用語
「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半
合成または合成起源のポリヌクレチドを示し、その起源
または操作により：（１）天然では結合しているポリヌ
クレオチドの全てまたは一部と結合しない、（２）天然
ではそれに結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌ
クレオチドに結合する、または（３）天然では存在しな
い。従って、この用語はまた、Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ細菌
ゲノムが遺伝子的に改変されて（例えば、変異誘発によ
り）、１つ以上の改変ポリペプチドを産生する状態も包
含する。
【００１８】本明細書中に使用されているように、用語
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチ
ド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形
態のことであり、本明細書中では、用語「オリゴヌクレ
オチド」および「オリゴマー」と相互変換的に使用され
る。この用語は、分子の一次構造のみを示す。従って、
この用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびアンチ
センスポリヌクレオチドが包含される。これにはさら
に、既知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識の
存在、メチル化、末端「ｃａｐｓ」、１つ以上の天然に
存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチ
ド間の改変（例えば、ある型の非荷電性結合（例えば、
ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデ
ート、カルバミン酸エステルなど）、または、荷電性結
合（例えば、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート
など）との置換）、ペンダント部分の導入（例えば、タ
ンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチ
ド、ポリーＬーリシンなど）、挿入剤（例えば、アクリ
ジン、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ））、キレーター
（例えば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分な
ど）、アルキル化剤（例えば、αアノマー性核酸））；
が、包含される。
【００１９】用語「ゲノムの」により、ベクターにクロ
ーン化された制限フラグメント由来のＤＮＡ分子のコレ
クションまたはライブラリーを意味する。これには、微
生物の遺伝子物質の全てまたは一部が包含される。
【００２０】用語「ｃＤＮＡ」により、ｍＲＮＡの相補
鎖にハイブリダイズする相補ｍＲＮＡ配列を意味する。
【００２１】本明細書中で使用されているように、用語
「オリゴマー」は、プライマーおよびプローブの両方を
意味し、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と相互
変換的に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさ
を意味しない。しかし、典型的にオリゴマーは、１００
０ヌクレオチド未満、より典型的には５００ヌクレオチ
ド未満、さらに典型的には２５０ヌクレオチド未満であ
り、それらは１００ヌクレオチド未満であり得、７５ヌ
クレオチド未満、そしてさらに５０ヌクレオチド未満の
長さであり得る。
【００２２】本明細書中で使用されているように、用語
「プライマー」とは、適切な条件下で使用されるとき
に、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として作用し得る
オリゴマーのことである。プライマーは、コピーされる
べきポリヌクレオチド鎖の領域に、完全にまたは実質的
に相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行
う条件下で、プライマーは、分析物である鎖の相補領域
にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラー
ゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加によ
り、プライマーは、重合剤により伸長されて分析物であ
る鎖のコピーを形成する。プライマーは一本鎖であり得
るか、または、部分的または全体に二本鎖であり得る。
【００２３】用語「分析物ポリヌクレオチド」および
「分析物鎖」とは、標的領域を含有すると思われる、一
本鎖または二本鎖核酸分子のことであり、生物学的試料
中に存在し得る。
【００２４】本明細書中で使用されているように、用語
「プローブ」とは、標的配列中の配列とプローブ中の少
なくとも１つの配列との相補性により、標的配列とハイ
ブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを含有する構
造のことである。プローブのポリヌクレオチド領域は、
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌク
レオチドアナログから構成され得る。「捕獲プローブ」
および「標識プローブ」は、プローブ内に包含される。
【００２５】本明細書中で使用されているように、用語
「標的領域」とは、増幅および／または検出されるべき
核酸領域のことである。用語「標的配列」とは、プロー
ブまたはプライマーが、所望の条件下で安定なハイブリ
ッドを形成し得る配列のことである。
【００２６】本明細書中で使用されているように、用語
「捕獲プローブ」とは、結合パートナーに組み合わされ
る一本鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプ
ローブのことである。この一本鎖ポリヌクレオチドは、
標的するポリヌクレオチド配列に含有され、これは、分
析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的領域内の
標的配列に相補的である。この相補領域は、二本鎖に、
分析物ポリヌクレオチドを固体表面に固定する（結合パ
ートナーを介して）のに十分に安定性を与えるために、
十分な長さからなり、標的配列に対して相補的である。
結合パートナーは、第二の結合パートナーに特異的であ
り、第二の結合パートナーは、固体支持体の表面に結合
され得るか、または、その他の構造物または結合パート
ナーを介して間接的に固体支持体に結合され得る。
【００２７】本明細書中で使用されているように、用語
「標的するポリヌクレオチド配列」とは、標的ヌクレオ
チド配列に相補的であるヌクレオチド配列が含有される
ポリヌクレチド配列のことであり、その配列は、意図さ
れる目的に十分な安定性を有する二本鎖を形成するの
に、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。
【００２８】本明細書中で使用されているように、用語
「結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに特異的
な抗体のような、高度な特異性を有するリガンド分子を
結合し得る分子のことである。一般的に、特異結合パー
トナーは、単離条件下で、分析物コピー／相補鎖の二本
鎖（捕獲プローブの場合）を固定するのに十分な親和性
で結合する。特異結合パートナーは、当該分野で公知で
あり、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトア
ビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、多くの既知のレセプタ
ー−リガンド対、および、相補的ポリヌクレオチド鎖を
包含する。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場
合には、パートナーは通常、少なくとも約１５塩基の長
さであり、少なくとも４０塩基であり得、さらに、少な
くとも約４０％から約６０％のＧ＋Ｃ含有量を有する。
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレ
オチドアナログを含み得る。
【００２９】本明細書中で使用されているように、用語
「カップルした（ｃｏｕｐｌｅｄ）」とは、共有結合に
よるまたは非共有結合の強い相互作用（例えば、疎水相
互作用、水素結合など）による付着のことである。共有
結合は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステ
ル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭
素−リン結合などであり得る。
【００３０】用語「支持体」とは、所望の結合パートナ
ーが固定され得る、いずれもの固体または半固体の表面
のことである。適切な支持体には、ガラス、プラスチッ
ク、金属、ポリマーゲルなどが含まれ、ビーズ、ウエ
ル、ディップスティック、膜などの形態にされ得る。
【００３１】本明細書中で使用されているように、用語
「標識」とは、検出し得る（好ましくは定量し得る）シ
グナルを提供するために使用され得、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドに結合され得る、いずれもの元素ま
たは部分のことである。
【００３２】本明細書中で使用されているように、用語
「標識プローブ」とは、分析物ポリヌクレオチド中の検
出されるべき標的配列に相補的である、標的するポリヌ
クレオチド配列を含有するポリヌクレオチドプローブの
ことである。この相補領域は、「標識プローブ」および
「標識配列」を含有する二本鎖が、標識により検出され
るように、十分な長さからなり、標的配列に相補的であ
る。標識プローブは、直接に、または、マルチマーを含
む、互いに高度な特異性を有する１組のリガンド分子を
介して間接に、標識とカップルする。
【００３３】本明細書中で使用されているように、用語
「マルチマー」とは、同じ繰り返しの一本鎖ポリヌクレ
オチドユニットまたは異なる一本鎖ポリヌクレオチドユ
ニットの、直鎖状または分枝状ポリマーのことである。
ユニットの少なくとも１つは、目的の、第一の一本鎖ヌ
クレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合
したポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プロー
ブ）に特異的にハイブリダイズし得る、配列、長さ、お
よび組成を有する。このような特異性および安定性を得
るために、このユニットは、通常は少なくとも約１５ヌ
クレオチドの長さであり、典型的には約５０ヌクレオチ
ド以下の長さ、そして好ましくは約３０ヌクレオチドの
長さであり；Ｇ＋Ｃ含有量は、通常は少なくとも約４０
％、ほとんどは約６０％である。このようなユニットに
加えて、マルチマーには、目的の第二の一本鎖ヌクレオ
チド、典型的には標識ポリヌクレオチドまたはその他の
マルチマーに、特異的および安定にハイブリダイズし得
る、多くのユニットが包含される。これらのユニット
は、上記に考察されたマルチマーのように、一般にはほ
ぼ同じ大きさおよび組成である。マルチマーがその他の
マルチマーにハイブリダイズされるように設計されてい
るときには、第一および第二のオリゴヌクレオチドユニ
ットは異質（異なる）であり、選択されたアッセイの条
件下では、互いにはハイブリダイズしない。従って、マ
ルチマーは、標識プローブであり得るか、または標識を
プローブにカップルするリガンドであり得る。
【００３４】「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオ
チド複製の自己複製ユニットとして挙動する、すなわ
ち、自己制御下に複製し得るいずれもの遺伝子エレメン
ト、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミド
などである。これには選択マーカーが含まれる。
【００３５】「ＰＣＲ」とは、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２４：１６３（１９８６）；およびＳｃｈａｒ
ｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−
１０７８；および米国特許第４，６８３，１９５号；な
らびに米国特許第４，６８３，２０２号に記載されてい
るようなポリメラーゼ連鎖反応のことである。
【００３６】本明細書中で使用されているように、本来
ｘが、同じ様式でｙに関連しない場合に、ｘはｙに関し
て「異種」である。すなわち、天然ではｘが全くｙに関
連しないか、または、天然に実在して認められるような
同じ様式でｙに関連しない。
【００３７】「相同性」とは、ｘとｙとの間の類似性の
程度のことである。１つの形態の配列と別の配列との類
似は、当該分野で公知の方法により決定され得る。例え
ば、それらはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較に
より決定され得る。または、相同は、相同領域（例え
ば、Ｓ1消化の前に使用される）間で安定な二本鎖を形
成する条件下でポリヌクレオチドをハイブイブリダイズ
し、その後、一本鎖特異ヌクレアーゼにより消化し、そ
の後に消化されたフラグメントの大きさを決定すること
により決定され得る。
【００３８】「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセ
グメントが接続されて、この接続されたセグメントの複
製および／または発現をもたらすレプリコンである。
【００３９】「制御配列」とは、それらが連結されるコ
ーディング配列の発現をもたらすために必要であるポリ
ヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の
性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、こ
のような制御配列は、一般的にプロモーター、リボソー
ム結合部位、および転写終止配列を含み；真核生物で
は、一般的に、このような制御配列は、プロモーターお
よび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最少
限、発現に必要とされる全成分を含み、さらに存在が有
利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融
合パートナー配列を含み得ると意図される。
【００４０】「作動可能に連結された」とは、記載され
ている成分が、それらの意図する様式で機能し得る関係
にある並列のことである。コーディング配列に「作動可
能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現
が制御配列に適合した条件下で得られるように連結され
ている。
【００４１】「オープンリーディングフレーム」（ＯＲ
Ｆ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の領域のことである；この領域は、コーディング配列
の一部またはコーディング配列全てを示し得る。
【００４２】「コーディング配列」は、適切な調節配列
の制御下におかれると、通常はｍＲＮＡを介してポリペ
プチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コー
ディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよ
び３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーデ
ィング配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチ
ド配列が含まれる得るが、これらに限定されない。
【００４３】本明細書中で使用されているように、用語
「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定
の長さの産物を指すわけではない；従って、ペプチド、
オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの
定義内に包含される。この用語にはまた、ポリペプチド
の発現後改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化など）は意味されず、すなわち包含されない。定
義に包含されるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のア
ナログを含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ
酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、およ
び当該分野で公知の天然に存在するおよび存在しない改
変である。
【００４４】示された核酸配列「由来の」ポリペプチド
またはアミノ酸配列とは、配列にコードされたポリペプ
チドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、またはそれらの部分、ここで、この部分は、
少なくとも３−５アミノ酸、さらに好ましくは少なくと
も８−１０アミノ酸、そしてよりさらに好ましくは少な
くとも１１−１５アミノ酸からなる、または配列にコー
ドされたポリペプチドにより免疫学的に同定され得るポ
リペプチドのことである。この用語にはまた、示された
核酸配列から発現されるポリペプチドも包含される。
【００４５】「免疫原性の」とは、アジュバントの存在
または非存在下で、それのみで、またはキャリアに結合
されて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答
を引き起こすポリペプチドの能力のことである。「中
和」とは、感染因子の感染力を、部分的または全体的に
抑制する免疫応答のことである。
【００４６】「エピトープ」とは、ペプチド、ポリペプ
チド、またはタンパク質の抗原決定基のことである；１
つのエピトープは、そのエピトープに対して唯一の高次
構造（ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
で、３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピ
トープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からな
り、さらに通常には少なくとも８−１０のこのようなア
ミノ酸からなる。アミノ酸の高次構造の決定方法は当該
分野では公知であり、例えば、これらには、ｘ線結晶解
析および二次元核磁気共鳴が含まれる。同じエピトープ
を認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原に対するその
他の抗原の結合を阻む能力を示す、簡単な免疫アッセイ
において同定され得る。
【００４７】本明細書中で使用されているように、「処
置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、予防および／または
治療（ｔｈｅｒａｐｙ）（すなわち、あらゆる疾患症状
の調整）のことである。「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａ
ｌ）」は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染が疑われる動物を意味
し、これにはヒトを含む霊長類が包含されるが、これら
に限定されない。「ワクチン」は、免疫原性の、また
は、部分的または完全にＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する保護
を誘起し得る、個体の処置に有用な組成物である。
【００４８】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質は、このタン
パク質に特異的な、モノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体の産生に使用され得る。これらの抗体を産生する
方法は、当該分野で公知である。
【００４９】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞培養物」、およびその他のこのような用語
は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体とし
て使用され得るか、または使用されてきた、微生物、昆
虫細胞、および哺乳類細胞を示し、これには、形質転換
されたもとの細胞の子孫も包含される。１つの母細胞の
子孫は、自然突然変異、偶発突然変異または意図的突然
変異（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）のた
めに、形態学的に、または、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮ
Ａ成分が、もとの母細胞と完全に同一である必要はない
ことが理解される。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサル腎（ＣＯ
Ｓ）細胞が含まれる。
【００５０】特定して、本明細書中で使用されているよ
うに、用語「細胞系」とは、インビトロにおいて継続し
てまたは長期間に増殖および分裂し得る細胞群のことで
ある。しばしば、細胞系は１つの幹細胞（ｐｒｏｇｅｎ
ｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）からのクローン群である。このよ
うなクローン群の貯蔵または転移の間に、核型に自発変
化または誘導変化が起こり得ることが、当該分野では公
知である。従って、いわゆる細胞系由来の細胞は、祖先
細胞または培養物に正確には同一ではなく、この細胞系
には、このような変異体が包含される。用語「細胞系」
はまた、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系
は、非ハイブリッド細胞系、または二細胞型のハイブリ
ドーマを包含する。
【００５１】本明細書中で使用されているように、用語
「微生物」には、細菌および真菌のような、原核微生物
種および真核微生物種が包含され、後者には、酵母およ
び糸状菌が含まれる。
【００５２】本明細書中で使用されているように、「形
質転換」とは、挿入に用いられる方法（例えば、直接取
り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロポーレー
ション）に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細
胞への挿入のことである。外因性ポリヌクレオチドは、
非組込みベクター（例えばプラスミド）として維持され
得るか、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【００５３】ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関
するときには、「精製された」および「単離された」と
は、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子
を実質的に含まずに存在することを意味する。本明細書
中で使用されているように、用語「精製された」は、好
ましくは、同じ型の生物学的高分子が、少なくとも７５
重量％、さらに好ましくは少なくとも８５重量％、さら
に好ましくは９５重量％、そして最も好ましくは９８重
量％で存在することを意味する（しかし、水、緩衝液、
およびその他の小分子、特に、１０００未満の分子量を
有する分子は存在し得る）。
【００５４】（Ｃ．核酸アッセイ）基本としてＨ．ｐｙ
ｌｏｒｉゲノムを使用して、約８ヌクレオチド以上のポ
リヌクレオチドプローブは、ｃＤＮＡに加えて、ＲＮＡ
の正鎖またはその相補鎖にハイブリダイズするように調
製され得る。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドの検出、単離および／ま
たは標識用のプローブとして、および／または標的配列
の転写および／または複製用のプライマーとして働く。
各プローブは標的するポリヌクレオチド配列を含有し、
標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドから構成
される；その配列は、意図する目的に対して十分に安定
性を有する二本鎖を形成するために、十分な長さからな
り、その配列に相補的である。例えば、目的が、標的配
列を含有する分析物を固定化により単離することである
ときには、プローブは、単離条件下で分析物を固体表面
上に固定するのに十分な二本鎖安定性をもたらすため
に、十分な長さからなる、標的される配列に相補的であ
るポリヌクレオチド領域を含有する。さらに例えば、標
的配列の転写および／または複製用のプライマーとして
働くときには、プローブは、複製を成し遂げるために、
十分な長さからなる、標的される配列に相補的であるポ
リヌクレオチド領域を含有する。さらに例えば、ポリヌ
クレオチドプローブが、標識プローブとして用いられる
か、またはマルチマーに結合されるときには、標的する
ポリヌクレオチド領域は、標識プローブおよび／または
マルチマーと安定なハイブリッド二本鎖構造を形成する
のに、十分な長さからなり、相補的である。このプロー
ブは、標的される配列に相補的である、最低約４つの連
続したヌクレオチドを含有し得る；通常は、このオリゴ
マーは、標的される配列に相補的な最低約８つの連続し
たヌクレオチド、そして好ましくは標的される配列に相
補的な最低約１４個の連続したヌクレオチドを含有す
る。
【００５５】しかし、プローブは、標的される配列に相
補的な配列のみからなる必要はない。それらは、さらな
るヌクレオチド配列またはその他の部分を含有し得る。
例えば、プローブがＰＣＲによる配列の増幅のためのプ
ライマーとして使用されるときには、それらは、二本鎖
の場合には、増幅される配列のクローニングを促進する
制限酵素部位を形成する配列を含有し得る。さらに例え
ば、プローブがハイブリダイゼーションアッセイでの
「捕獲プローブ」として使用されるときには、それら
は、上記定義のような「結合パートナー」にカップルさ
れる。プローブの調製は、当該分野で公知の手段によ
り、このような手段には、例えば、切り出し、転写、ま
たは化学合成を含む方法によることが含まれる。
【００５６】（Ｄ．発現系）一旦、適切なＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉコーディング配列が単離されると、それは種々の異
なる発現系、例えば、哺乳類細胞、バキュロウイルス、
細菌、および酵母により用いられる発現系、で発現され
得る。
【００５７】（ｉ．哺乳類系）哺乳類発現系は当該分野
で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポ
リメラーゼを結合し得、コーディング配列（例えば、構
造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得
る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、通
常はコーディング配列の５’末端近傍に位置する転写開
始領域、および、通常は転写開始部位の上流２５−３０
塩基対（ｂｐ）に位置するＴＡＴＡボックスを有する。
ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＲＮＡ
合成を適切な部位で開始させるのを導くと考えられてい
る。哺乳類プロモーターはさらに、通常はＴＡＴＡボッ
クスの上流１００から２００ｂｐ内に位置する上流プロ
モーターエレメントを有する。上流プロモーターエレメ
ントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの向
きに作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第二版（１９８９））。
【００５８】哺乳類ウイルス遺伝子は、しばしば高度に
発現され、広範囲の宿主を有する；従って、哺乳類ウイ
ルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモータ
ー配列を提供する。例には、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウ
イルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および
単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。さら
に、ネズミメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｅｉ
ｏｎｅｉｎ）遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配
列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現
は、構成的または調節され得（誘導可能な）、プロモー
ターに依存して、ホルモン−応答細胞中でグルココルチ
コイドにより誘導され得る。
【００５９】上記のプロモーターエレメントに組み合わ
されたエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在
は、通常は発現レベルを増大させる。エンハンサーは、
相同または異種プロモーターに連結されたときに、通常
のＲＮＡ開始部位で合成を開始して、最高１０００倍ま
で転写を促進し得る調節ＤＮＡ配列である。さらに、エ
ンハンサーは、通常の向きまたは裏返しの向きで転写開
始部位から上流または下流に、または、プロモーターか
ら１０００ヌクレオチドを超える位置に配置されるとき
に活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｎｃｅ ２
３６：１２３７（１９８９）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｃｅｌ
ｌ，第二版（１９８９））。ウイルス由来のエンハンサ
ーエレメントは、通常は広範囲の宿主を有するので、特
に有用である。例には、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ
ー（Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ．
４：７６１）、および、ラウス肉腫ウイルスの長末端反
復（ＬＴＲ）由来（Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）
およびヒトサイトメガロウイルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔ
ら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２２１）のエンハ
ンサー／プロモーターが含まれる。さらに、いくつかの
エンハンサーは、調節可能であり、ホルモンまたは金属
イオンのような誘導物質が存在するときのみに活性にな
る（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）Ｔｒ
ｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３
７）。
【００６０】ＤＮＡ分子は、哺乳類細胞において細胞内
に発現され得る。プロモータ配列はＤＮＡ分子に直接連
結され得るが、この場合にはいつも、組換えタンパク質
のＮ末端の最初のアミノ酸がメチオニンであり、ＡＴＧ
開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端
は、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーシ
ョンにより、タンパク質から切断され得る。
【００６１】あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳類
細胞で外来タンパク質の分泌をなすリーダー配列フラグ
メントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮ
Ａ分子をつくることにより、細胞から増殖培地内に分泌
され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺
伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在
し、これは、インビボまたはインビトロのいずれかにお
いて切断され得る。リーダー配列フラグメントは通常、
細胞からのタンパク質の分泌を導く、疎水性アミノ酸か
ら構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウ
イルス３分節系リーダーは、哺乳類細胞内での外来タン
パク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００６２】一般には、哺乳類細胞により認識される転
写終止およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに
対し３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモ
ーターエレメントとともに、コーディング配列に隣接す
る。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的に翻訳後に
切断され、ポリアデニル化されて形成される（Ｂｉｒｎ
ｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；
ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８
８）「真核ＲＮＡの終結および３’末端プロセッシング
（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ ｅｎｄ ｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｒ
ＮＡ）」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌ
ｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏ
ｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これ
らの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに
翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導く。転写ターミネータ
ー／ポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０由来の
ものが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）。
【００６３】いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配
列とも呼ばれる）が存在するときに、より効率よく発現
され得る。しかし、数個のｃＤＮＡは、スプライシング
シグナル（スプライス供与部位および受容部位とも呼ば
れる）が欠如しているベクターから効率よく発現された
（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１
９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照のこ
と）。イントロンは、スプライス供与部位および受容部
位を有するコーディング配列内の介在非コーディング配
列である。それらは、一次転写物のポリアデニル化の後
に、「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより除去
される（Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８
６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐ
ａｄｇｅｔｔら、（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭ
ａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡスプライシング
（ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍ
ｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編））。
【００６４】通常、プロモーター、ポリアデニル化シグ
ナル、およ転写終止配列を含有する上記の成分は、発現
構築物中に組み立てられる。エンハンサー、機能性スプ
ライス供与部位および受容部位を有するイントロン、お
よびリーダー配列もまた、所望であれば発現構築物中に
含まれる。発現構築物は、哺乳類細胞または細菌のよう
な宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例
えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持され
る。哺乳類複製系には、複製にトランス作用因子が必要
とされる動物ウイルス由来のものが含まれる。例えば、
ＳＶ４０のようなパポーバウイルス（Ｇｌｕｚｍａｎ
（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）またはポリオー
マウイルスの複製系を含むプラスミドが、適切なウイル
スＴ抗原存在下で、非常に多数のコピーを複製する。哺
乳類レプリコンのさらなる例には、ウシパピローマウイ
ルスおよびエプスタイン・バーウイルス由来のものが含
まれる。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、
このため、例えば、発現のために哺乳類細胞中に、およ
びクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中に維
持される。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの
例には、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）、およびｐＨＥ
ＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が含まれる。
【００６５】使用される形質転換方法は、形質転換され
るべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳類
細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキスト
ラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降
法、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラ
スト融合、エレクトロポレーションポリヌクレオチドの
リポソーム内へのカプセル化、および、ＤＮＡの核への
直接マイクロインジェクションを包含する。
【００６６】発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞
系は、当該分野で公知であり、チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター
腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞
癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）および多くのその他の
細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な多く
の不死化細胞系を包含する。
【００６７】（ｉｉ．バキュロウイルス系）タンパク質
をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現
ベクターに挿入され得、ベクター内の制御エレメントに
作動可能に連結される。ベクター構築には、当該分野で
公知の方法が用いられる。
【００６８】一般的に、発現系の成分には転移ベクタ
ー、通常は細菌プラスミドが含まれ、これは、バキュロ
ウイルスゲノムフラグメントと、発現されるべき異種の
遺伝子または遺伝子群挿入のための便宜的な制限部位と
の両方；転移ベクター内のバキュロウイルス特異フラグ
メントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス
（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の
相同的組換えを考慮する）；および、適切な昆虫宿主細
胞および増殖培地を含む。
【００６９】タンパク質をコードするＤＮＡ配列を転移
ベクター内に挿入した後に、ベクターおよび野生型ウイ
ルスゲノムが、昆虫宿主細胞内へトランスフェクトさ
れ、そこでベクターとウイルスゲノムとの組換えが起こ
る。パッケージングされた組換えウイルスが発現され、
組換えプラークが同定および精製される。バキュロウイ
ルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キット形
態で、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ ＣＡ（”ＭａｘＢａｃ”キット）から市販されてい
る。これらの方法は当業者に公知であり、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓおよびＳｍｉｔｈ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以
後、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に十分に記
載されている。
【００７０】タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキ
ュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、リ
ーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、お
よび転写終止配列を含む上記の成分が、通常は中間置換
構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａ
ｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（転移ベクター）
に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および
作動可能に連結された調節エレメント；各遺伝子がそれ
自身の固有のセットの作動可能に連結された調節エレメ
ントを有する複数の遺伝子；または、同じセットの調節
エレメントに調節される複数の遺伝子、を含む。中間置
換構築物はしばしば、細菌のような宿主中で安定して維
持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）
のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは１
つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅
のために適切な宿主中に維持される。
【００７１】現在では、ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入
するための最も一般的に使用される転移ベクターは、ｐ
Ａｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベク
ターもまた設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ
９８５（ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに
変え、ＡＴＴ下流３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング
部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照）。
【００７２】プラスミドは通常さらに、ポリヘドロンポ
リアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７
７）、および、選択およびＥ．ｃｏｌｉ中での増殖のた
めの原核アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製
起点を含有する。
【００７３】バキュロウイルス転移ベクターは通常、バ
キュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイ
ルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラ
ーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構
造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）翻訳を
開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモータ
ーは、コーディング配列の５’末端近傍に通常位置する
転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮ
Ａポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含有す
る。バキュロウイスル転移ベクターもまた、エンハンサ
ーと呼ばれる第二ドメインを有し、これは存在する場合
には、構造遺伝子の遠位に存在する。発現は調節され得
るか、または構成的であり得る。
【００７４】ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写
された構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提
供する。例には、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコ
ードする遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９
８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節（Ｔｈｅ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」，Ｔｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ
編）；ＥＰＯ公開Ｎｏ．１２７ ８３９およびＮｏ．１
５５ ４７６）；および、ｐ１０タンパク質をコードす
る遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６９：７６５）が含まれる。
【００７５】適切なシグナル配列をコードするＤＮＡ
は、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のような、昆
虫またはバキュロウイルス分泌タンパク質の遺伝子由来
であり得る（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎ
ｅ，７３：４０９）。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後の
改変（シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、お
よびリン酸化のような）のためのシグナルは、昆虫細胞
により認識されると考えられており、そして分泌に必要
なシグナルおよび核集積は、無脊椎動物および脊椎動物
間で保存されているとも考えられているので、ヒトα−
インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５），Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプ
チド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８
８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２
９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：
８４０４）；マウス ＩＬ−３，（Ｍｉｙａｊｉｍａ
ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３；ヒトグルコ
セレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ
７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起
源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供するために使
用され得る。
【００７６】組換えポリペプチドまたはポリタンパク質
は、細胞内に発現され得るか、または、適切な調節配列
で発現されれば分泌され得る。非融合外来タンパク質の
良好な細胞内発現は通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適
切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理
想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、
Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアン
とのインキュベーションにより、成熟タンパク質から切
断され得る。
【００７７】あるいは、天然では分泌されない組換えポ
リタンパク質またはタンパク質は、昆虫において外来タ
ンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを
有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を
つくることにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダ
ー配列フラグメントは通常、小胞体へのタンパク質の輸
送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を導く、疎水性アミ
ノ酸を有するシグナルペプチドをコードする。
【００７８】タンパク質の発現産物の前駆体をコードす
るＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後に、昆虫細
胞宿主を、転移ベクターの異種ＤＮＡと野生型バキュロ
ウイルスのゲノムＤＮＡとで共形質転換（通常は共トラ
ンスフェクション）する。構築物のプロモーターおよび
転写終止配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２−５
ｋｂ断片を含有する。バキュロウイルスの所望の部位に
異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である。
（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｊｕら（１９８
７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
（１９８３）３：２１５６；および、Ｌｕｃｋｏｗおよ
びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例え
ば、挿入は、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、相
同的二本鎖交差組換えによりなされ得る；挿入はまた、
所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素
部位になされ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９），Ｂ
ｉｏｅｓｓａｙｓ ４：９１。
【００７９】ＤＮＡ配列は、発現ベクターのポリヘドリ
ン遺伝子の位置にクローニングされたときには、ポリヘ
ドリン特異配列により、５’および３’両側に隣接さ
れ、ポリヘドリンプロモーターの下流に配置される。
【００８０】新たに形成されたバキュロウイルス発現ベ
クターは、次に、感染性組換えバキュロウイルス中にパ
ッケージングされる。相同的組換えは低頻度（約１％か
ら約５％の間）で生じるため、共トランスフェクション
後に産生された主要なウイルスは、まだ野生型である。
従って、組換えウイルスを同定する方法が必要である。
発現系の利点は、視覚スクリーニングにより、組換えウ
イルスの区別が可能であることである。天然ウイルスに
より産生されるポリヘドリンタンパク質は、ウイルス感
染後、後期に感染細胞の核に非常に高レベルで産生され
る。集積されたポリヘドリンタンパク質は、埋め込まれ
た粒子をも含む封入体を形成する。これらの封入体は、
１５μｍまでの大きさであり、非常に屈折性であるため
に、光学顕微鏡下で容易に視覚化される光沢のある外観
となる。組換えウイルスに感染した細胞には、封入体が
ない。野生型ウイルスから組換えウイルスを区別するに
は、トランスフェクション上清を、当業者に公知の方法
により、単層の昆虫細胞上でプラーク形成させる。すな
わち、プラークを光学顕微鏡下で、封入体の存在（野生
型ウイルスの指標）または非存在（組換えウイルスの指
標）についてスクリーニングする。”Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ” Ｖｏｌ．２（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（Ｓ
ｕｐｐ． １０， １９９０）；Ｓｕｍｍｅｒｓおよび
Ｓｍｉｔｈ；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００８１】組換えバキュロウイルス発現ベクターは、
数種の昆虫細胞への感染のために開発されている。例え
ば、組換えバキュロウイルは、とりわけ、Ａｅｄｅｓ
ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕ
ｓｉａ ｎｉのために開発されている（ＰＣＴ公開Ｎ
ｏ．ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、
（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇ
ｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍ
ｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
３：２１５６；および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９
８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌ．２５：２２５を参照のこと）。
【００８２】細胞および細胞培養培地は、バキュロウイ
ルス／発現系での異種ポリペプチドの直接発現および融
合発現市販されている；細胞培養法は、一般に当業者に
公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ
を参照のこと。
【００８３】次に、改変昆虫細胞は、適切な栄養培地で
増殖され得る。この栄養培地により、改変昆虫宿主内に
存在するプラスミドは安定に維持され得る。発現産物遺
伝子が誘導制御下にある場合には、宿主は高密度に増殖
され得、発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的
である場合には、産物は培地に連続的に発現される。目
的の産物を取り出し、枯渇した栄養分を補給しながら、
栄養培地を連続的に取り替えねばならない。産物は、例
えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ー；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などの方法
で精製され得る。適切には、培地に分泌されるかまたは
昆虫細胞溶解から生じるいずれもの昆虫タンパク質を実
質的に除去するために、宿主の破片（例えば、タンパク
質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない
産物を提供するために、必要であれば産物はさらに精製
され得る。
【００８４】タンパク質発現を得るために、形質転換体
由来の組換え宿主細胞は、配列をコードする組換えタン
パク質の発現を可能にする条件下でインキュベートされ
る。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変
化する。しかし、条件は、当該分野で公知のものに基づ
いて、当業者に容易に確認され得る。
【００８５】（ｉｉｉ．細菌系）細菌発現法は当該分野
で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメ
ラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺
伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’’）転写を開始し得る
いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コ
ーディング配列の５’末端近傍に位置する転写開始領域
を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラー
ゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモータ
ーはまた、オペレーターと呼ばれる第二ドメインを有し
得、これは、ＲＮＡ合成を開始する位置である隣接ＲＮ
Ａポリメラーゼ結合部位に重複し得る。遺伝子リプレッ
サータンパク質はオペレターに結合し得、そのことによ
り特異遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーター
は、負の調節（誘導可能な）転写を行い得る。構成的発
現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存
在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子活性化
タンパク質結合配列により達成され得、これは、存在す
る場合には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（５’）
の近くに存在する。遺伝子活性化タンパク質の例は、カ
タボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これ
は、Ｅ．ｃｏｌｉでのｌａｃオペロンの転写開始を助け
る（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節的発現は正
または負のいずれかであり得、そのことにより転写を促
進または減退する。
【００８６】代謝経路の酵素をコードする配列は、特に
有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクト
ース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９７
７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマルト
ースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列が含ま
れる。さらなる例には、トリプトファン（ｔｒｐ）のよ
うな生合成酵素由来のプロモーター配列が含まれる（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許
第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６７７
６およびＮｏ．１２１７７５）。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ
−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗ
ｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロンのク
ローニングおよびその他のｍｉｓｔａｋｅｓ（Ｔｈｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ
ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ）」 Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）、バクテリオファ
ージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９２：１２８）、およびＴ５（米国特許第
４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた、有用な
プロモーター配列を提供する。
【００８７】さらに、天然に存在しない合成プロモータ
ーもまた細菌プロモーターとして機能する。例えば、１
つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写
活性化配列は、その他の細菌またはバクテリオファージ
プロモーターのオペロン配列に接続され得て、合成雑種
プロモーターをつくる（米国特許第４，５５１，４３３
号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッ
サーにより調節される、ｔｒｐプロモーターおよびｌａ
ｃオペロン両配列を含有する雑種ｔｒｐ−ｌａｃプロモ
ーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２
５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、
細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合
し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に
存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に
存在するプロモーターはまた、適合するＲＮＡポリメラ
ーゼと結合して原核生物中である種の遺伝子を高レベル
で発現し得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系
の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８
５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１
０７４）。さらに、雑種プロモーターもまた、バクテリ
オファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレータ
ー領域を含有し得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ．２６７８５
１）。
【００８８】機能プロモーター配列に加えて、能率のよ
いリボソーム結合部位もまた、原核生物での外来遺伝子
の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、リボソーム結
合部位はシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、
開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌク
レオチド上流に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配
列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２
５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ
１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端（３’ ａｎｄ）との間で
塩基対合してｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進する
と考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「メッ
センジャーＲＮＡにおける遺伝シグナルおよびヌクレオ
チド配列（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍ
ｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏ
ｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱リボソーム結合部位を有す
る原核遺伝子および真核遺伝子を発現するために、（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ）。
【００８９】ＤＮＡ分子は細胞内に発現され得る。プロ
モーター配列は、直接ＤＮＡ分子に連結され得、その場
合、Ｎ末端の最初のアミノ酸はメチオニンであり、これ
はＡＴＧ開始コドンによりコードされる。必要であれ
ば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シ
アンとのインキュベーション、または細菌メチオニンＮ
末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキ
ュベーションにより、タンパク質から切断され得る（Ｅ
ＰＯ公開Ｎｏ．２１９２３７）。
【００９０】融合タンパク質は、直接発現の代替を提供
する。通常は、内因性細菌タンパク質またはその他の安
定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列
が、異種コーディング配列の５’末端に融合される。発
現に際し、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を
提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子が
外来遺伝子の５’末端で連結され得、細菌内で発現され
得る。得られた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺
伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するため
のプロセッシング酵素（因子Ｘａ）に対する部位を保持
している（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３
０９：８１０）。融合タンパク質はまたｌａｃＺ由来の
配列を用いて生成され得る（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅ
ｎｅ ６０：１９７，ｔｒｐＥ，Ａｌｌｅｎら（１９８
７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆ
ｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１
３５：１１、およびＥＰＯ公開Ｎｏ．３２４６４７，ｇ
ｅｎｅｓ）。２つのアミノ酸配列を接続したＤＮＡ配列
は、切断部位をコードし得るか、またはコードし得な
い。その他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。
このような融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子
からユビキチンを切断するためのプロセッシング酵素
（例えば、ユビキチン特異プロセッシングプロテアー
ゼ）に対する部位を保持しているユビキチン領域を用い
て生成される。この方法によって、そのままの外来タン
パク質が単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。
【００９１】あるいは、外来タンパク質はまた、細菌で
外来タンパク質分泌を提供するシグナルペプチド配列フ
ラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメ
ラＤＮＡ分子をつくることにより、細胞から分泌され得
る（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列
フラグメントは通常、細胞からのタンパク質分泌を導く
疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードす
る。タンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、また
は、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グ
ラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、
シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコ
ードされるプロセッシング部位が存在し、これはインビ
ボまたはインビトロにおいて切断され得る。
【００９２】適切なシグナル配列をコードするＤＮＡ
は、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）
（Ｍａｓｕｉら（１９８３），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭ
ＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリ
ホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ），（Ｏｋａら
（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８２：７２１２）のような、分泌される細菌タンパク質
の遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢ
ａｃｉｌｌｕｓ株由来のαーアミラーゼ遺伝子のシグナ
ル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を
分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７９：５５８２；ＥＰＯ公開Ｎｏ．２４４０４２）。
【００９３】通常、細菌により認識される転写終止配列
は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置する調節領域
であり、従って、プロモーターとともにコーディング配
列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡにコードされる
ポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導く。転
写終止配列はしばしば、転写終止の助けとなるステムル
ープ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配
列を含む。例には、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および
その他の生合成遺伝子のような、強プロモーターを伴っ
た遺伝子由来の転写終止配列が含まれる。
【００９４】通常、プロモーター、シグナル配列（所望
であれば）、目的のコーディング配列、および転写終止
配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられ
る。発現構築物は、細菌のような宿主に安定して維持さ
れ得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のよ
うな、レプリコン中に維持される。レプリコンは、１つ
の複製系を有し、このため、発現、またはクローニング
および増幅のいずれかのために原核宿主中に維持され
る。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー
数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミド
は、一般的に、約５から約２００、そして通常約１０か
ら約１５０、の範囲のコピー数を有する。高コピー数の
プラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約
１０、より好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを
含有する。高コピー数または低コピー数のいずれかのベ
クターが、宿主でのベクターの効果および外来タンパク
質に依存して選択され得る。
【００９５】あるいは、発現構築物は、組込みベクター
を用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクター
は通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体に相
同な少なくとも１つの配列を含有する。組込みは、ベク
ター中の相同ＤＮＡと細菌染色体と間の組換えによると
考えられる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来の
ＤＮＡで構築された組込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ染色体に組み込む（ＥＰＯ公開Ｎｏ．１２７３２
８）。組込みベクターはまた、バクテリオファージまた
はトランスポゾン配列を含有し得る。
【００９６】通常、染色体外および組込み発現構築物
は、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マー
カーを含有し得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現
され得、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリス
ロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテト
ラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺
伝子を含有し得る。（Ｄａｖｉｅｓら、（１９７８）Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６
９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファ
ン、およびロイシンの生合成経路でのような、生合成遺
伝子を含み得る。
【００９７】あるいは、上記成分のいくつかは、形質転
換ベクター中に組み立てられ得る。形質転換ベクターは
通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクタ
ーに組み込まれる選択マーカーを含有する。
【００９８】染色体外レプリコンまたは組込みベクター
である、発現および形質転換ベクターは、多くの細菌へ
の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベク
ターは、特に以下の細菌のために開発されている：Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｐａｌｖら（１９８
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
９：５５８２；ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６２５９およびＮ
ｏ．０６３９５３；ＰＣＴ公開Ｎｏ．Ｗｏ８４／０４５
４１；Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１
９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら
（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；
ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６７７６，Ｎｏ．１３６８２９お
よびＮｏ．１３６９０７；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｒｅｍｏｒｉｓ，Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６
５５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ，Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ
ｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；およびＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、米国特許第
４，７４５，０５６号。
【００９９】外因性ＤＮＡの細菌宿主への導入方法は当
該分野で公知であり、ＣａＣｌ２、または、二価カチオ
ンおよびＤＭＳ０のようなその他の試薬で処理された細
菌の形質転換を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロポ
ーレーションにより細菌細胞中に導入され得る。形質転
換の方法は、通常形質転換されるべき細菌種により変化
する。Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． ６０：２７３；Ｐａｌｖａら
（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６２５
９およびＮｏ．０６３９５３；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８
４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓに関する；Ｍｉｌｌ
ｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒに関する；Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄ
ｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）
「ＣｏｌＥ１由来プラスミドによるＥ．ｃｏｌｉ形質転
換のための改良法（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
Ｅ．ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｐｌａｓｍｉｄｓ）」， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．
Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎ
ｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１
５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａに関する；Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭ
Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関する；Ｆｉｅｄｌｅｒら
（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１７０：３８、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに関する；Ａｕｇｕｓｔｉｎら
（１９９０） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに関
する；Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． １４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８
７）「エレクトロポーレーションによるＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換（Ｔｒａｎｓｆ
ｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）」，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ （Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ
ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃ．
Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８
８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏ
ｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｒｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関
する、を参照のこと。
【０１００】（ｉｖ．酵母発現）酵母発現系もまた当業
者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリ
メラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造
遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得
る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、コ
ーディング配列の５’末端近傍に通常位置する転写開始
領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメ
ラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開
始部位を含む。酵母プロモーターはさらに、上流活性化
配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第二ドメインを有し得、これ
は、存在する場合には通常構造遺伝子の遠位に存在す
る。ＵＡＳにより、調節（誘導可能な）発現が行われ
る。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で起こる。調節的
発現は正または負のいずれかであり得、そのことにより
転写を促進または減退する。
【０１０１】酵母は、活性代謝経路を有する発酵微生物
であり、従って、代謝経路の酵素をコードする配列は特
に有用なプロモーター配列を提供する。例には、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開Ｎｏ．２
８４０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコー
ス−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤ
Ｈ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−
ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナー
ゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２９２０３）が包含
される。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５
遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍ
ｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。
【０１０２】さらに、天然に存在しない合成プロモータ
ーもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、
１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロ
モーターの転写活性化領域に接続され得、合成雑種プロ
モーターがつくられ得る。このような雑種プロモーター
の例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調
節配列が含まれる（米国特許第４，８７６，１９７号お
よび米国特許第４，８８０，７３４号）。雑種プロモー
ターのその他の例には、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解
糖酵素遺伝子の転写活性化領域に組み合わされた、ＡＤ
Ｈ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の
いずれかの調節配列からなるプロモーターが含まれる
（ＥＰＯ公開Ｎｏ．１６４５５６）。さらに、酵母プロ
モーターには、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写
を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在する
プロモーターが含まれ得る。このようなプロモーターの
例には、特に、Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；
Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８
３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕ
ｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７
９）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅでの細菌抗生物質耐性遺伝子の発現（Ｔｈｅ
Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎ
ｔｉｂｉｏｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」：Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏ
ｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａ
ｎｄＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ
（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；
Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇ
ｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８
０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９が、含まれる。
【０１０３】ＤＮＡ分子は酵母において細胞内に発現さ
れ得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子に直接に連結
され得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最
初のアミノ酸はいつもメチオニンであり、これはＡＴＧ
開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端
メチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン
キュベーションにより、タンパク質から切断され得る。
【０１０４】融合タンパク質は、哺乳類、バキュロウイ
ルス、および細菌発現系と同様に、酵母発現系の代替を
提供する。通常、内因性酵母タンパク質またはその他の
安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列
が、異種コーディング配列の５’に融合される。発現に
際し、この構築物は、２つアミノ酸配列の融合を提供す
る。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスム
ターゼ（ＳＯＤ）遺伝子が、外来遺伝子の５’末端で連
結され得、酵母で発現され得る。２つのアミノ酸配列の
接続部位ＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、ま
たはコードし得ない。例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ．１９６
０５６を参照のこと。その他の例は、ユビキチン融合タ
ンパク質である。このような融合タンパク質は、好まし
くは、外来タンパク質からユビキチンを切断するための
プロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異プロセッ
シングプロテアーゼ）に対する部位を保持しているユビ
キチン領域でつくられる。従って、この方法によってそ
のままの外来タンパク質が単離され得る（例えば、ＰＣ
Ｔ公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０２４０６６を参照のこと）。
【０１０５】あるいは、外来タンパク質はまた、酵母で
の外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグ
メントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラ
ＤＮＡ分子をつくることにより、細胞から増殖培地に分
泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来
遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在
し、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得
る。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタン
パク質の分泌を導く疎水性アミノ酸を含有するシグナル
ペプチドをコードする。
【０１０６】適切なシグナル配列をコードするＤＮＡ
は、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ公開Ｎｏ．０１
２８７３；ＪＰＯ公開Ｎｏ．６２，０９６，０８６）お
よびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）
のような、分泌酵母タンパク質の遺伝子に由来し得る。
あるいは、インターフェロンリーダーのような、非酵母
起源のリーダーが存在し、これもまた酵母での分泌を提
供する（ＥＰＯ公開Ｎｏ．０６００５７）。
【０１０７】分泌リーダーの好ましいクラスには、酵母
α因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダーがあり、
これは「ｐｒｅ」シグナル配列および「ｐｒｏ」領域の
両方を含有する。用いられ得るα因子フラグメントの型
には、全長ｐｒｅ−ｐｒｏα因子リーダー（約８３アミ
ノ酸残基）および切断型α因子リーダー（通常約２５か
ら約５０アミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４，５
４６，０８３号および米国特許第４，８７０，００８
号；ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２４２７４）。分泌を提供する
α因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーに
は、第一酵母のｐｒｅ配列でつくられたハイブリッドα
因子リーダーが含まれるが、第二酵母のα因子のｐｒｏ
領域は含まれない。（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８
９／０２４６３を参照のこと）。
【０１０８】通常、酵母により認識される転写終止配列
は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置する調節領域
であり、従って、プロモーターとともにコーディング領
域に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードさ
れるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導
く。転写終止配列およびその他の酵母認識終止配列の例
は、解糖酵素をコードする配列などである。
【０１０９】通常、プロモーター、リーダー（所望であ
れば）、目的のコーディング配列、および転写終止配列
を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。
発現構築物はしばしば、酵母または細菌のような宿主中
に安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、
プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レ
プリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、
発現のために酵母中に、およびクローニングおよび増幅
のために原核宿主中に維持される。このような酵母−細
菌シャトルベクターの例には、ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７−２４）；ｐ
Ｃｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６４２−４６
４６）；およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら
（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）
が含まれる。さらに、レプリコンは、高コピー数または
低コピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラ
スミドは一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を
有し、通常約１０から約１５０のコピー数を有する。高
コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少
なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０を有
する。高コピー数または低コピー数のベクターは、宿主
におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存し
て選択され得る。
【０１１０】あるいは、発現構築物は、組込みベクター
を用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクター
は通常、ベクターの組込みを可能にする、酵母染色体に
相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発
現構築物に隣接する２つの相同な配列を含有する。組込
みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との組換え
によると考えられる（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８
３）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２
２８−２４５）。組込みベクターは、ベクター中への封
入に適切な相同配列を選択することにより、酵母の特異
的な座に導かれ得る。１つ以上の発現構築物が組み込ま
れ得、おそらく産生される組換えタンパク質レベルに影
響し得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベ
クターに含まれる染色体配列は、ベクター中の１つのセ
グメントとして存在して、完全ベクターの組込みになり
得るか、または、染色体中の隣接セグメントに相同で、
ベクター中で発現構築物に隣接する２つのセグメントと
して存在して、発現構築物のみの安定な組込みになり得
る。
【０１１１】通常は、染色体外および組込み発現構築物
は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マー
カーを含有し得る。選択マーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ
４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７のような、酵
母宿主で発現され得る生合成遺伝子、および、ツニカマ
イシンおよびＧ４１８のそれぞれに対する酵母細胞にお
いて耐性を与えるＧ４１８耐性遺伝子を含み得る。さら
に、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒素成分
の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例
えば、ＣＵＰ１の存在は、銅イオンの存在下での酵母の
増殖を可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ，Ｒｅｖ． ５１：３５１）。
【０１１２】あるいは、上記成分のいくつかは、形質転
換ベクター中に組み立てれられ得る。形質転換ベクター
は通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベク
ターに組み込まれる選択マーカーを含有する。
【０１１３】染色体外レプリコンまたは組込みベクター
である、発現および形質転換ベクターは、多くの酵母の
形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクタ
ーは、特に以下の酵母のために開発されている：Ｃａｎ
ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８
６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：１４２）；Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８
５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２５：１
４１）；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ １３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ
ら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：
３０２）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌ
ｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５８：１１６５）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌ
ａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８
３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ８：１３５）；Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌ
ｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂ
ａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）；Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８
５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国
特許第４，８３７．１４８号および米国特許第４，９２
９，５５５号）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９
２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５３：１６３）；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３００：７０６）；および、Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）
Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１ Ｇａｉｌ
ｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１
０：４９）。
【０１１４】外因性ＤＮＡの酵母宿主への導入方法は、
当該分野では公知であり、通常は、スフェロプラストま
たは完全酵母細胞をアルカリカチオンで処理する形質転
換を包含する。形質転換方法は通常、形質転換される酵
母種により変化する。例えば、Ｋｕｒｔｚら（１９８
６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎ
ｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２５：１４１、Ｃａｎｄｉｄａに関する；Ｇｌｅｅ
ｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｙ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９
８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２、
Ｈａｎｓｅｎｕｌａに関する；Ｄａｓら（１９８４）
Ｊ．ｂｉｏｔｅｒｉｏｌ．５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏ
ｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら
（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３
５、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓに関する；Ｃｒｅｇｇ
ら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３
７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３
７，１４８号および米国特許第４，９２９，５５５号、
Ｐｉｃｈｉａに関する；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５；
１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１５３：１６３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関
する；Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３０
０：７０６、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
に関する；Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇ
ｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９
８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９、Ｙａｒｒｏ
ｗｉａに関する；参照のこと。
【０１１５】（Ｅ．ワクチン）本明細書中で考察されて
いる各Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質は、単一ワクチン候
補物として、または１つ以上のその他の抗原との組み合
わせで使用され得、後者はＨ．ｐｙｌｏｒｉまたはその
他の病原のいずれかに由来する。好ましくは「カクテ
ル」ワクチンであり、例えば、細胞毒素（ＣＴ）抗原、
ＣＡＩタンパク質、およびウレアーゼを含有する。さら
に、ｈｓｐが、これらの成分の１つ以上に対して加えら
れ得る。これらのワクチンは、予防剤（感染を予防する
ため）または治療剤（感染後に疾患を治療するため）の
いずれかであり得る。
【０１１６】このようなワクチンは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
抗原または抗原類を、通常は「薬学的に受容可能なキャ
リア」との組合せで含有し、このキャリアは、この組成
物が与えられる個体に対して有害な抗体の産生をそれ自
身が誘導しないいずれものキャリアを含む。適切なキャ
リアは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、
ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリ
マー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、
および不活性ウイルス粒子のような、大きくて徐々に代
謝される高分子である。このようなキャリアは、当業者
に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激
剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗
原は、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
などの病原体のような細菌トキソイドにコンジュゲート
され得る。
【０１１７】組成物の効果を増強させる好ましいアジュ
バントには、以下が包含されるが、これらに限定されな
い：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）（水酸化アルミ
ニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムな
ど）；（２）水中油型エマルジョン製剤〔ムラミルペプ
チド（下記を参照）のようなその他の特異免疫刺激剤ま
たは細菌細胞壁成分を伴うまたは伴わない〕、例えば、
（ａ）ＭＦ５９（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９０／１４８３
７）：５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、お
よび０．５％Ｓｐａｎ ８５〔必須ではないが必要に応
じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照）を含有す
る〕を含有して、１１０Ｙ型マイクロフルイダイザー
（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）
のようなマイクロフルイダイザーを使用して、サブミク
ロン粒子に処方される；（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクワレ
ン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）−ブロックポリマーＬ１２１、および
ｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照）を含有し、マイクロフル
イダイザーにかけてサブミクロン粒子エマルジョンにさ
れるか、ボルテックスにかけてより大きな粒子サイズの
エマルジョンを生成する；および、（ｃ）ＲｉｂｉTMア
ジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）：２％スクワレン、
０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および、１つ以上の細菌細胞
壁成分（モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈ
ｏｒｙｌｉｐｉｄ） Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミ
コレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）より
なる群にから選ばれる、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄ
ｅｔｏｘTM）を含有する；（３）サポニンアジュバント
（例えばＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））が
使用され得るか、または、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合
体）のような、それらからつくられた粒子；（４）完全
フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイ
ントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例
えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）など）；および、（６）組成物の効
果を増強するための免疫刺激剤として作用するその他の
物質。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９が好ましい。
【０１１８】上記のように、ムラミルペプチドには、Ｎ
−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグル
タミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミ
ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤ
Ｐ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソ
グルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパ
ルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリ
ルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘ
ｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる
が、これらに限定されない。
【０１１９】免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に
受容可能なキャリア、およびアジュバント）は典型的
に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの
ような希釈剤を含有する。さらに、湿潤または乳化剤、
ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このような賦形
剤中に存在し得る。
【０１２０】典型的には、免疫原性組成物は、溶液また
は懸濁液のいずれかとして注射用に調製される；注射の
前に液体賦形剤に溶解または懸濁するのに適切な固形も
また、調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアにつ
いて上記で考察したように、調製物は、アジュバント効
果を増強するために、エマルジョンにされるか、または
リポソームにカプセル化され得る。
【０１２１】ワクチンとして使用される免疫原性組成物
は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペプチド、および必
要であれば、上記成分のいかなる他の成分をも含有す
る。「免疫学的に有効な量」とは、単回投与でまたは連
続投与の一部として個体に投与される量が、治療または
予防に有効であることを意味する。この量は、処置され
る個体の健康状態および身体条件、処置される個体の分
類学上のグループ（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類
など）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力、所
望の予防程度、ワクチン処方、医療状況での治療医の評
価、およびその他の関連因子に依存して変化する。その
量は比較的広範囲にあり、所定の試行により決定され得
ると思われる。
【０１２２】免疫原性組成物は従来より非経口的に、例
えば、皮下または筋肉内注射により、投与される。その
他の投与形態に適した処方には、経口および肺への処
方、坐薬、および経皮投与が含まれる。経口処方は、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質に対して最も好ましい。投
与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケ
ジュールであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤
と組み合わせて投与され得る。
【０１２３】（Ｆ．免疫診断アッセイ）Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ抗原は、抗体レベルを検出するために免疫アッセイに
おいて使用され得（または逆に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体
が抗原レベルを検出するために使用され得る）、特に、
胃十二指腸疾患および十二指腸潰瘍との相関が得られ得
る。免疫アッセイは、よく判っている組換え抗原に基づ
いて、今日使用されている観血的診断法に置き換えられ
るように開発され得る。例えば、血液または血清試料を
包含する生物学的試料中のＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質
に対する抗体が、検出され得る。免疫アッセイの設計は
非常に多様であり、これらの多様性は当該分野では公知
である。免疫アッセイのプロトコールは、例えば、競
合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき
得る。プロトコールはさらに、例えば、固体支持体を使
用し得るか、または免疫沈降法によるものであり得る。
ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプ
チドの使用を包含する；その標識は、例えば、蛍光、化
学発光、放射性、または染色分子であり得る。プローブ
からのシグナルを増幅するアッセイもまた周知である；
その例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセ
イ、ならびに、ＥＬＩＳＡアッセイのような酵素が標識
および介在した免疫アッセイである。
【０１２４】免疫診断に適した、適切な標識試薬を含む
キットが、適当な容器中に、本発明の組成物を含む適切
な材料を、アッセイの実施に必要とされるその他の試薬
および材料（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）、な
らびにアッセイの説明書とともに包装することにより、
構成される。
【０１２５】
【実施例】（Ｇ．実施例）以下に示されている実施例
は、当業者が実施するための指針として提供され、いか
なる方法においても本発明を限定するようには構成され
ていない。
【０１２６】（ｉ．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素（ＣＴ）
抗原） （１．材料および方法）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ増殖およびＤ
ＮＡ単離に関する一般的な材料および方法については、
ＣＡＩ抗原およびｈｓｐのそれぞれに関する、以下のｉ
ｉ節およびｉｉｉ節を参照のこと。
【０１２７】（ａ．クローニング）縮重オリゴヌクレオ
チドの２つの混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓモデル３８０ＢのＤＮＡシンセサイザーを使用
して、合成した。これらの混合物を、Ｇｅｎａｍｐ Ｐ
ＣＲキットを使用して、製造業者の指示に従い、２００
ｎｇの精製ＤＮＡと１００μｌのポリメラーゼ連鎖反応
に４μＭの濃度で使用した。この反応物を、９４℃で１
分間、４８℃で２分間、および５６℃で２分間インキュ
ベートした。反応混合物をこの条件に３０サイクル供し
た。
【０１２８】この反応の生成物をアガロースゲル電気泳
動により分析すると、約８７ｂｐの顕著なＤＮＡフラグ
メントが現れた。制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで
の消化後に、そのフラグメントを、前もってＸｂａＩお
よびＥｃｏＲＩで消化したＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋
（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ）プラスミドに連結した。混合し
た連結物を使用して、（２００Ω）ａ ＢｉｏＲａｄ
Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使
用する２０００Ｖおよび２５μＦでのエレクトロポレー
ションにより、コンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換し
た。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、１００μｇ／ｍＬ
のアンピシリンを含有するＬ−寒天プレート上での増殖
に対して選択した。プラスミドＤＮＡは、陽性Ｅ．ｃｏ
ｌｉ単離物から抽出して、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２（Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ＤＮＡ配列決定キットを使用
し、製造業者の指示に従って配列分析にかけた。
【０１２９】（ｂ．ライブラリーの調製） （１）ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのライブラリー ７μｇの精製ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩで完全に
消化した。３μｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋プラ
スミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、次
に、仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。両ＤＮＡ混合
物を、水飽和フェノールと撹拌して精製し、次に６７％
Ｖ／Ｖまでエチルアルコールを加えて沈澱させた。両Ｄ
ＮＡを５０μＬの水に再懸濁させた。０．７μｇのＤＮ
Ａフラグメントを、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼを含有する溶液５０μＬ中の、０．３μ
ｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡと混合した。この混
合物を１５℃で２０時間インキュベートし、その後、Ｄ
ＮＡを水飽和フェノールで抽出して、エチルアルコール
で沈澱させた。続いて、そのＤＮＡを５０μＬの水に再
懸濁させた。エレクトロポーレーションにより、このＤ
ＮＡ１μｇをＥ．ｃｏｌｉに導入して、約３０００−１
０，０００のアンピシリン耐性細菌コロニーを得た。
【０１３０】２）ＥｃｏＲＩフラグメントのライブラリ
ー 約０．７μｇのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを精製し、前もっ
てＥｃｏＲＩで消化して仔ウシ腸ホスファターゼで処理
しておいた０．４５μｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
＋プラスミドと混合した。そのフラグメントを５０μＬ
の溶液中で連結した。精製および沈澱の後に、そのＤＮ
Ａを５０μＬの水に再懸濁させた。この溶液１μＬによ
るＥ．ｃｏｌｉのエレクトロポレーションで、約２００
のアンピシリン耐性細菌コロニーを得た。
【０１３１】さらなるクローニング用のゲノムから適切
な制限フラグントを同定するために、プラスミドを３２
ｐで均一に標識し、種々の制限酵素で消化した株ＣＣＵ
Ｇ由来のＤＮＡを分析するためのプローブとして使用
し、アガロースゲル電気泳動で分離し、そしてニトロセ
ルロースフィルターに移した。そのプローブにより、単
一の約３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが
現れた。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントのライ
ブラリーを調製し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベ
クターにクローニングした。このライブラリーを、予め
クローニングしておいた８７ｂｐフラグメントに対応す
る３２ｐ標識ＤＮＡでスクリーニングした。同一の約
３．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有する
２つのクローンが同定された。これらのＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントのＤＮＡ配列決定により、前記の８７ｋＤ
ａ細胞毒素のアミノ末端に対応する２３アミノ酸をコー
ドし得る配列が明らかになった。これらの配列は、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ制限酵素部位により境界を定められフラグメ
ントの末端で終止する、約３００ヌクレオチドのオープ
ンリーディングフレームの部分を含有した。また、この
配列からは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位から１２０ｂｐ離れた
推定オープンリーディングフレーム内にＥｃｏＲＩ制限
部位が存在することが明らかになった。
【０１３２】ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との
間の配列に対応する３２ｐ標識プローブを、Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫベクターにクローニングされたＤＮＡ
由来のＥｃｏＲフラグメントのライブラリーをスクリー
ニングするために使用した。このプローブにより、２つ
のクローンが、約７．３ｋｂｐフラグメントを含有する
ことが明らかになった。このフラグメントのＤＮＡ配列
決定により、３．２ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トから決定された配列と重複した、連続的なオープンリ
ーディングフレームがあることが判った。これらの重複
フラグメントのＤＮＡ配列、および、含有される１つの
長いオープンリーディングフレームの概念的な（ｃｏｎ
ｃｅｐｔｕａｌ）翻訳を、それぞれ図１〜３および４に
示す。
【０１３３】これらのクローンは非常に不安定であるこ
とが認められたことは注目されるべきである。スクリー
ニングで同定された最初のコロニーは、あまりにも小さ
いので検出が困難であった。１６−１８時間の継代培養
の従来方法によるこれらのクローンの広がりは、ＤＮＡ
再配列および欠失のために非常に不均一な群のプラスミ
ドとなった。これらのクローンの十分な量を、抗生物質
選択のない８−１０時間の継代培養により増殖させた。
この様式では、プラスミドの収量は比較的に少ないが、
生存再配列プラスミドを含有する細菌の選択および副産
物を排除した。
【０１３４】（Ｃ．ＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ）顕著な８７ ｂｐフラグメントを含有するＰＣＲ反
応産物を、Ｐｒｉｍｅ−ａ−ｇｅｎｅキット（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）を使用するランダムプライマー法により３２ｐ
で標識した。この標識プローブを、ニトロセルロースフ
ィルター上に固定された約３０００の細菌クローン由来
のＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応に使用した。
ハイブリダイゼーション反応は、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶
液中６０℃で実施した。陽性細菌クローンを発展させ
て、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドは、約
３．３ｋｂのＤＮＡ挿入断片を含有し、ＴＯＸＨＨ１と
呼ばれた。
【０１３５】図１〜３に示されている２９２位と４１０
位との間の配列を含有する１２０ｂｐフラグメントは、
プラスミドＴＯＸＨＨ１由来であり、ＥｃｏＲＩフラグ
メントのライブラリーの約４００コロニーをスクリーニ
ングするために使用した。約７．３ｋｂのＤＮＡ配列を
含有し、ＴＯＸＥＥ１と呼ばれる陽性クローンを単離し
た。
【０１３６】図１〜３に示されているヌクレオチド配列
は、クローンＴＯＸＨＨ１およびＴＯＸＥＥ１から、Ｓ
ｅｑｕｅｎａｓｅ ２配列決定キットを使用して得た。
図１〜３の１位と４１０位との間のヌクレオチオドをＴ
ＯＸＨＨ１から得、そして、２９１位と３５０７位との
間のヌクレオチドをＴＯＸＥＥ１から得た。プラスミド
ＴＯＸＨＨ１およびＴＯＸＥＥ１を含有するＥ．ｃｏｌ
ｉをアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し
た。下記を参照のこと。
【０１３７】（ｄ．細胞毒素に対する抗血清の調製）図
１〜３に示されている配列のヌクレオチド１１６ー４１
３に対応するＤＮＡフラグメントを、細菌発現ベクター
ｐｅｘ ３４ Ａにクローニングし、細菌プロモーター
の誘導で、細胞毒素ポリペプチドのアミノ酸に融合さ
れ、以前に同定された２３アミノ酸を含有する、ＭＳ２
ポリメラーゼポリペプチドの一部を含有する融合タンパ
ク質を産生させた。この融合タンパク質の約２００μｇ
を、アクリルアミド電気泳動で部分精製し、標準的な方
法でウサギを免疫するために使用した。
【０１３８】１ヶ月間隔３回の免疫後に採取したこれら
のウサギからの抗血清を、標準的なイムノブロッティン
グ実験に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの細胞毒素陽性株および細
胞毒素陰性株からのタンパク質抽出物をプローブするた
めに使用した。その抗血清は、見かけの分子量１００ｋ
Ｄａの、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で移動
したポリペプチドを現した。このポリペプチドは、細胞
毒素陽性株のタンパク質抽出物には検出されたが、細胞
毒素陰性株には検出されなかった。免疫前に採取した血
清は、このポリペプチドと反応しなかった。
【０１３９】（ｅ．空胞化活性の部分精製）６ｍｇ／ｍ
ｌの濃度のＨ．ｐｙｌｏｒｉ全膜を、１％ ＣＨＡＰ
Ｓ、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ
７．４）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロース溶
液に、４℃で１時間溶解した。次に、この混合物を、３
０％、３５％、４０％、および５５％スクロース段階を
含む、不連続スクロースグラジエントにかけ、そして２
００００ｘｇで１７時間超遠心分離にかけた。グラジエ
ントにかけたものを分画して、各画分を空胞化活性およ
びウレアーゼ活性に対して試験した。ウレアーゼ活性に
関連した空胞化活性を、グラジエント画分のいくつかに
認めた。空胞化活性のピークもまた、グラジエントの一
番高い画分に認め、これらの画分には、本質的にウレア
ーゼ活性はなかった。
【０１４０】このウレアーゼ非依存空胞化活性を、２０
％から３４％の濃度の間の硫酸アンモニウムによる段階
沈澱法（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏ
ｎ）によってさらに分画した。異なる濃度の硫酸アンモ
ニウムで沈澱させたタンパク質の変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で顕著な約１００ｋＤａポリペプチドが
現れ、このポリペプチドは空胞化活性に関して精製され
た。このポリペプチドは、上記の組換え融合タンパク質
に対してつくられたウサギ抗血清により認識された。
【０１４１】（２．結果）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉゲノムの約
１０ｋｂｐに対応する２つの重複フラグメントがクロー
ニングされた。これらのクローンは、１２９６アミノ酸
（図４に示されている）のポリペプチドをコードし得る
３９６０ｂｐ（図１〜３に示されている）からなる遺伝
子を含有する。この推定ポリペプチドの分子量は１３
９．８ｋｄである。図１〜３における１８位のメチオニ
ンコドンの９ｂｐ上流のヌクレオチド配列ＡＧＧＡＡＧ
は、シャイン−ダルガーノコンセンサス配列（ｔｈｅ
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に密接に類似しており、このメチオ
ニンがポリペプチド合成の開始メチオニンに相当すると
いう仮説を支持する。図１〜３の３９０６位の推定終止
コドンの１０ｂｐ下流に始まる３０ｂｐヌクレオチド配
列は、原核転写ターミネーターの構造に密接に類似して
おり、メッセンジャーＲＮＡコーディング配列の末端に
相当すると思われる。
【０１４２】細胞毒素遺伝子は、以下の基準により、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ空胞化活性のポリペプチド前駆体をコ
ードするとして定義される： （ｉ）推定ポリペプチドは、以前に記載された８７ｋＤ
ａ空胞化タンパク質（Ｃｌｏｖｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７：１０５７０−７５（１９９２））の
アミノ末端として同定された２３アミノ酸配列（図４、
３４−５６位）を含有する。この配列は、原核リーダー
配列に類似する３３アミノ酸の後に続き、従って、この
配列は、成熟タンパク質のアミノ末端に相当すると思わ
れる； （ｉｉ）目的のアミノ末端を含有する推定ポリペプチド
の１００アミノ酸フラグメントに特異的なウサギ抗血清
は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの細胞毒素陽性株の１００ｋＤａ
ポリペプチドを認識したが、細胞毒素陰性株では認識し
なかった。この１００ｋＤａポリペプチドは、Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ膜から空胞化活性に対して精製する。
【０１４３】まとめて、本明細書中に記載された遺伝子
は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素活性に関連の１００ｋＤ
ａポリペプチドにプロセスされる約１４０ｋＤａポリペ
プチドをコードする。以前に記載された８７ｋＤａポリ
ペチドは、１００ｋＤａポリペプチドがさらにプロセス
されたか、または精製中のタンパク質分解によるかのい
ずれかにちがいない。
【０１４４】（ｉｉ．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＡＩ抗原） （１．材料および方法） （ａ．材料の起源）クローンＡ１、６４／４、Ｇ５、Ａ
１７、２４および５７／Ｄは、λｇｔ１１ライブラリー
から得た。クローンＢ１は、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トのゲノムプラスミドライブラリーから得た。００７は
ＰＣＲにより得た。細胞毒素を産生するＨ．ｐｙｌｏｒ
ｉ株は、以下である：Ｇ１０、Ｇ２７、Ｇ２９、Ｇ３
２、Ｇ３３、Ｇ３９、Ｇ５６、Ｇ６５、Ｇ１０５、Ｇ１
１３Ａ。非細胞毒素株は、以下である：Ｇ１２、Ｇ２
１、Ｇ２５、Ｇ４７、Ｇ５０、Ｇ２０４。それらは、Ｇ
ｒｏｓｓｅｔｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｔｕｓｃａｎｙ，
Ｉｔａｌｙ）の内視鏡検査生検標本から単離された。株
ＣＣＵＧ １７８７４（細胞毒素陽性）はＣｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ ｏｆＧｏｔｈｅｂｏｒｇから得た。非細胞
毒素株Ｐｙｌｏ ２Ｕ＋（ウレアーゼ陽性）およびＰｙ
ｌｏ ２Ｕ−（ウレアーゼ陰性）は、Ｆ． Ｍｅｇｒａ
ｕｄ， Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ，Ｂｏ
ｒｄｅａｕｘ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。Ｅ．ｃｏｌｉ
株のＤＨ１０Ｂ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＴＧ１、Ｋ１２ΔＨ１
Δｔｒｐ、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０は、当
該分野では公知である。プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）を、クローニング用ベクターとして使用し
た。ＭＳ２融合タンパク質の発現用の、ｐＥｘ３４ａ、
ｂ、ｃプラスミドは、以前に記載されている。ライブラ
リー発現に使用されたλｇｔ１１ファージベクターは、
λｇｔ１１クローニングシステムキット（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
からのものである。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ＬＢ培地（２
４）で培養した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株は、選択培地（５
％ウマ血液、Ｄｅｎｔ ｏｒ Ｓｋｉｒｒｏｗ’ｓ抗生
物質補充のＣｏｌｕｍｂｉａ寒天ベース、０．２％シク
ロデキストリン）、または、５％ ウシ胎児血清（６）
または０．２％シクロデキストリン（２５）を含有する
Ｂｒｕｃｅｌｌａ肉汁液体培地にプレートした。
【０１４５】（ｂ．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの増殖およびＤＮ
Ａ単離）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株は、３７℃で３日間、固体
培地または液体培地中で培養した。両方とも、Ｏｘｏｉ
ｄ（Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）または
Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｉｎ（Ｃｏｃｋ
ｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）ガスパックジェネレーターを
使用した微好気性環境中、または、５％ＣＯ２補充空気
を含有するインキュベーター（２６）中で培養した。細
菌を採取して、最終濃度１００μｇ／ｍｌのリゾチーム
を含有するＳＴＥ（ＮａＣｌ ０．１Ｍ、Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ １０ｍＭ（ｐＨ８）、ＥＤＴＡ １ｍＭ（ｐＨ
８））に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートし
た。細菌を溶解するために、最終濃度１％にＳＤＳを加
え、６５℃に加熱した。プロテイナーゼＫを最終濃度２
５μｇ／ｍｌに加えた後、溶液を５０℃で２時間インキ
ュベートした。ＤＮＡを、臭化エチジウムを加えたＣｓ
Ｃｌグラジエントにより精製し、７７％エタノールで沈
澱させて封入ガラスキャピラリーで回収した。
【０１４６】（ｃ．λｇｔ１１発現ライブラリーの構築
およびスクリーニング）λｇｔ１１発現ライブラリーを
作製するために、制限酵素ＨａｅＩＩＩおよびＡｌｕＩ
で部分消化した、ＣＣＵＧ １７８７４株由来のゲノム
ＤＮＡを使用した。０．８％アガロースゲル上での分画
後、０．６ｋｂと８Ｋｂとの間の大きさのＤＮＡを、Ｃ
ｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ（０．２２ミクロン）微量遠
心分離フィルターを使用して溶出した。各消化からの産
物を合わせて、λｇｔ１１クローニングシステムキット
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）およびＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌ
ｄパッケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、発現ライブラリー
を構築するために使用した。０．８−１ｘ１０６個の組
換えファージを含有するライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ
Ｙ１０８８で増幅し、１０９ファージ／ｍｌの力価、８
５％組換え、平均挿入断片の大きさ９００塩基対の溶解
物１５０ｍｌを得た。Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔシステム（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用する標準
的な方法により、免疫学的スクリーニングを実施した。
【０１４７】（ｄ．プラスミドライブラリーの構築）Ｅ
ＭＢＬ４またはλＤａｓｈのような標準ベクターを使用
する、部分消化された染色体ＤＮＡの完全ゲノムライブ
ラリーを作製する試みは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＤＮＡクロ
ーニングにおいての多くの著者により記載された困難に
直面し、十分なライブラリーを得られなかった。従っ
て、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした株ＣＣＵＧ １７８
７４、Ｇ３９およびＧ５０由来のゲノムＤＮＡを使用し
て、部分ライブラリーを得た。ＤＮＡ連結、Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＤＨ １０Ｂのエレクトロポレーション、スクリ
ーニング、およびライブラリー増幅を実施した。１０％
を超えないバックグラウンドとともに７００００から８
５０００の範囲のコロニーを有するライブラリーを得
た。
【０１４８】（ｅ．ＤＮＡ操作およびヌクレオチド配列
決定）ＤＮＡ操作を標準的な方法によって実施した。Ｄ
ＮＡ配列決定をＳｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０（ＵＳＢ）
を使用して実施し、図５に示されているＤＮＡフラグメ
ントをＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋にサブクローニング
した。各鎖を少なくとも３回配列決定した。ＤＮＡクロ
ーンが入手できなかった１５３３と２２８９との間の領
域をＰＣＲにより増幅し、非対称ＰＣＲ、および増幅産
物の直接配列決定により配列決定した。この領域の重複
は、ｏｎｅ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ ｓｉｄｅ ａｎｃ
ｈｏｒｅｄ ＰＣＲにより確認した：５’付着末端Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ配列、およびＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ
の認識部位を含むエクスターナルユニバーサルアンカー
（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｎｃｈｏ
ｒ）（５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡ
ＣＴＣＧＡＧＣＴ−３’／５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＧＡＣＡＴＣＧＡ−３’）を、プライマー伸長ＤＮＡに
連結して増幅した。次に、入れられた（ｎｅｓｔｅｄ）
プライマーによるＰＣＲの第二ラウンドを使用して、ク
ローニングおよび配列決定に適したＤＮＡフラグメント
を得た。ＤＮＡ配列データを集めて、ＶＭＳ下のＶＡＸ
３９００走査ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ）により分析した。ＥＭＢＬ ＶＡＸｃｌｕ
ｓｔｅｒを使用して、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデ
ータベースを調べた。
【０１４９】（ｆ．タンパク質調製およびＥＬＩＳＡ）
タンパク質抽出物を、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉペレットを６Ｍ
グアニジンで処理して得た。ウエスタンブロッティン
グ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気溶出を、標準的な方法で実
施した。融合タンパク質を誘導し、ｅｌｅｃｔｒｏｃｕ
ｔｉｏｎまたはイオン交換クロマトグラフィーにより精
製した。精製タンパク質を、ウサギを免疫するため、お
よびＥＬＩＳＡアッセイのマイクロタイタープレートを
コーティングするために使用した。正常粘膜保有者、血
液供給者、および患者に由来する血清は、Ａ．Ｐｏｎｚ
ｅｔｔｏ（Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）から得た。臨床
診断は、胃生検の組織学に基づいた。試料の空胞化活性
は、Ｃｏｖｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：
１２６４−７０（１９９１）に記載されているようにＨ
ｅＬａ細胞で試験した。
【０１５０】（２．結果） （ａ．免疫優性および細胞毒性）胃十二指腸疾患にかか
っている患者由来の血清でプローブされたＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉグアニジン抽出物のウエスタンブロットは、クーマ
シーブルー染色ゲルでの主要でない成分である１３０ｋ
Ｄａのタンパク質が、試験された全血清により強く認識
されることを示した。ＣＡＩタンパク質を電気溶出し、
ウエスタンブロットでこのタンパク質のみを認識するマ
ウス血清をつくるのにこれを使用した。次に、この血清
を、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株の抽出物中のＣＡＩタンパク質
をウエスタンブロッティングにより検出するために使用
した。抗原は、ＨｅＬａ細胞で空胞化活性を有する１０
株全てに存在しており、このような活性を有さない８株
には存在していなかった；さらに、タンパク質の大きさ
は株によりわずかに異なっていた。ＣＡＩ抗原は、Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、およ
びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのような
その他の試験された種では、ウエスタンブロッティング
により検出されなかった。
【０１５１】（ｂ．ｃａｉ遺伝子の構造）λｇｔ１１発
現ライブラリーの１０6個のクローンを、ＣＡＩ抗原に
対して特異的なマウス血清を用いて、および胃十二指腸
疾患の患者由来の血清プールを使用して、スクリーニン
グした。マウス血清により、３ｘ１０-3の頻度で陽性ク
ローンが検出された。８つのクローンの配列分析によ
り、それら全てが、図５に示されているクローンＡ１と
部分的に重複することが明らかになった。ヒト血清プー
ルにより、クローン５７／Ｄ、６４／４および２４、お
よび、クローンＡ１に重複する数種のクローンを含む、
ｃａｉ遺伝子の異なる領域を含有する多くのクローンが
同定された。
【０１５２】図５中のクローンＡ１、６４／４、Ｇ５、
Ａ１７、２４、および５７／Ｄは、λｇｔ１１ライブラ
リーから得た。クローンＢ１は、ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントのプラスミドライブラリーから得た。プラスミド
５７／Ｄ、６４／４、Ｂ１（Ｂ／１）、およびＰ１−２
４（最も後ろのプラスミドはヌクレオチド２１５０から
２６５０）は、アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（ＡＴＣＣ）に寄託した。下記を参照のこと。００７
はＰＣＲにより得た。オープンリーディングフレーム
は、図５の下段に示されている。矢印は、配列決定のた
めのプライマーとして使用した合成オリゴヌクレチドの
位置および方向を示し、そして、Ｇ３９の繰り返し配列
の挿入位置が示されている。株Ｇ３９に認められる繰り
返し配列のうち１つのヌクレオチドおよびアミノ酸配列
もまた、示されている。大文字は、ｃａｉ遺伝子から複
製された配列Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３を示し、小文字
は、ヌクレオチドおよびアミノ酸リンカーを示し、Ｐは
プロモーターであり、およびＴはターミネーターであ
る。
【０１５３】λｇｔ１１ライブラリー由来のクローン、
ＨｉｎｄＩＩＩプラスミドライブラリーから単離された
クローンＢ１、および染色体ＤＮＡのＰＣＲにより得ら
れたフラグメント００７を使用して、全領域のヌクレオ
チド配列を決定した。５９２５個のヌクレオチド配列の
コンピューター分析により、ヌクレオチド５３５から３
９７７にわたる長いオープンリーディングフレームが、
λｇｔ１１クローン６４／４、２４およびＡ１およびＡ
１７から生じる融合タンパク質のフレーム内にはまって
いることが明らかになった。クローン５７／Ｄは、クロ
ーニングされたフラグメントの３’末端のみにオープン
リーディングフレームを含有するため、遺伝子をλｇｔ
１１のβガラクトシダーゼと融合し得なかった。λｇｔ
１１クローン５７／Ｄ中の免疫反応性タンパク質の存在
は、非融合タンパク質の発現を誘導する内因性プロモー
ターの存在によってのみ説明され得る。この仮説は、Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターに挿入断片５７
／４を両方向でサブクローニングすること、および、免
疫反応性タンパク質が両場合ともに得られたことを示す
ことによって、真実であることが証明された。同定され
た遺伝子が事実ＣＡＩ抗原をコードするという確実な証
拠は、ｐＥｘ ３４Ｂプラスミドベクターに挿入断片Ａ
１７および６４／４をサブクローニングして、融合タン
パク質を得、これを精製して用いてウサギを免疫するこ
とにより得られる。得られた血清は、細胞毒素Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ株中のＣＡＩ抗原バンドを特異的に認識した。
【０１５４】ｃａｉ遺伝子は、１１４７アミノ酸からな
る、推定分子量１２８０１２．７３ダルトンおよび、等
電点９．７２を有する推定タンパク質をコードすた。精
製タンパク質の基本特性を、二次元ゲル電気泳動により
確認した。遺伝子のコドンの用法およびＧＣ含有量（３
７％）は、その他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ遺伝子に関する記
載と類似した（１３，２６）。推定リボソーム結合部
位：ＡＧＧＡＧは、目的のＡＴＧ開始コドンから５塩基
対上流に同定された。ＡＴＧ開始コドンから上流領域の
プロモーター配列についてのコンピューター検索は、−
１０または−３５領域のいづれかに類似する配列を同定
したが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターに共通する領域また
は公開されえいるＨ．ｐｙｌｏｒｉプロモーター配列に
類似することは見いだされなかった。精製Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉＲＮＡのプライマー伸長分析により、ＡＴＧ開始コ
ドンの１０４および２１４塩基対上流に２つの転写開始
部位が存在することが示された。正統なプロモーター
は、いずれの転写開始部位の上流にも同定され得なかっ
た。クローン５７／ＤによるＣＡＩ抗原部分の発現は、
Ｅ．ｃｏｌｉもまた、この領域のプロモーターを認識し
ていることを示唆したが、Ｅ．ｃｏｌｉがＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉの同じプロモーターを認識するか、またはＡ−Ｔに
富むＨ．ｐｙｌｏｒｉＤＮＡが、プロモーターとして作
用し得る領域を有するＥ． ｃｏｌｉを提供するかは、
明らかではない。ｒｈｏ非依存ターミネーターが、開始
コドンの下流に同定された。図６〜８では、ＡＧＧＡＧ
リボソーム結合部位およびターミネーターには下線を付
け、繰り返し配列および６個のアスパラギンを含有する
モチーフは線で囲った。ＣＡＩ抗原は非常に親水性であ
り、明白なリーダーペプチドまたはトランスメンブラン
配列を示さなかった。最も親水性である領域は、アミノ
酸６００から９００であり、そこではまた、多くの例外
的な特徴が認められ得る：配列 ＥＦＫＮＧＫＮＫＤＦ
ＳＫおよびＥＰＹＩＡの繰り返し、および、６個の連続
したアスパラギンの存在（図６〜８では線で囲った）。
【０１５５】（ｃ．ｃａｉ遺伝子の多様性）遺伝子の多
様性は、内部複製により生じると考えられている。異な
る株におけるＣＡＩタンパク質の大きさの不均一性の機
構を見いだすために、より大きなＣＡＩタンパク質（Ｇ
３９）を有する１つの株の構造を、サザンブロッティン
グ、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により分析した。結果
は、Ｇ３９およびＣＣＵＧ１７８７４のｃａｉ遺伝子が
３４０６位までの大きさで同一であることを示し、Ｇ３
９株が、１０２塩基対からなる２つの同一の繰り返しに
より生成される２０４塩基対の挿入断片を含有すること
が分かった。各繰り返しは、ｃａｉ遺伝子の同じ領域か
らの３つのＤＮＡセグメント（図５の配列Ｄ１、Ｄ２お
よびＤ３）の複製から生じ、小さなリンカー配列により
接続されている配列を含有することが認められた。挿入
がなされた領域および挿入断片自身の図式を、図５に示
す。
【０１５６】（ｄ．非細胞毒素株中のｃａｉ抗原の非存
在）ＣＡＩ抗原が非細胞毒素株に存在しない理由を研究
するために、それらの２つ（Ｇ５０およびＧ２１）から
のＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨａｅＩ
ＩＩ制限酵素で消化し、ｃａｉ遺伝子内の２つのプロー
ブ（それぞれに、ヌクレオチド５２０−１８４０および
２８５０−４３３１の範囲）を使用したサザンブロッテ
ィングにより試験した。両プローブは、株ＣＣＵＧ １
７８７４およびＧ３９において強くハイブリダイズする
バンドを認識した。そのバンドは２つの株で大きさが変
わり、遺伝子の多様性に一致する。しかし、プローブ
は、Ｇ５０およびＧ２１ ＤＮＡのいずれにもハイブリ
ダイズしなかった。このことは、試験された非細胞毒素
株がｃａｉ遺伝子を含まないことを示した。
【０１５７】（ｅ．血清抗体）ＣＡＩ抗原に対する血清
抗体の存在を、胃十二指腸疾患に関連づけた。ＣＡＩ抗
原に対する定量的抗体応答を研究するために、ｐＥｘ３
４にサブクローニングされたＡ１７フラグメントにより
産生された融合タンパク質を、均質に精製して、ＥＬＩ
ＳＡ試験用にμタイタープレートをコーティングするた
めに使用した。このアッセイでは、胃十二指腸病状の患
者は、無作偽に選択された血液供給者および正常な胃粘
膜を有する人間に認められるより、有意に高い平均ＥＬ
ＩＳＡ力価を有した。抗体力価が、特に胃十二指腸疾患
に関連するかどうかを評価するために、既知の組織学的
診断による患者からの血清を、ＥＬＩＳＡアッセイで試
験した。十二指腸潰瘍の患者は、その他全ての患者より
有意に高い平均抗体力価を有した。概して、ＥＬＩＳＡ
は、胃十二指腸疾患患者の７５．３％、および十二指腸
潰瘍患者の１００％を予測し得ることが認められた。
【０１５８】１つの特定のＥＬＩＳＡでは、ＣＡＩ抗原
に由来する２３０アミノ酸を含有する組換えタンパク質
を、タンパク質に特異的な抗血清を使用した、Ｈ． ｐ
ｙｌｏｒｉ ＤＮＡの発現ライブラリーのスクリーニン
グによって同定した。組換え抗原を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で
融合タンパク質として発現させ、均質に精製して、μタ
イタープレートをコーティングするために使用した。次
に、そのプレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスフ
ァターゼコンジュゲートの１／２０００希釈と９０分間
インキュベートした。洗浄後、酵素基質をプレートに加
え、３０分間後に４０５ｎｍでの光学濃度を読みとっ
た。胃疾患ではなく、ウエスタンブロッティングで検出
可能な抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体を有さない２０人の固体
からの血清を使用して、カットオフレベルを、平均吸光
度＋２標準偏差により決定した。ＥＬＩＳＡアッセイ
を、規定通りの上部胃十二指腸内視鏡検査を受けた８２
人の消化不良患者（平均年齢５０．６±１３．４才、２
８才から８０才）の末梢血試料で試験した。患者の胃洞
部粘膜を、組織学およびギムザ染色のために得た。２０
人の患者は十二指腸潰瘍、５人は胃潰瘍、４３人は慢性
活性Ｂ型胃炎、８人は十二指腸炎、そして６人は胃粘膜
が正常であった。十二指腸潰瘍の全ての患者は、カット
オフレベルを超える光学濃度値を有した。十二指腸炎、
胃潰瘍、および慢性胃炎の患者は、それぞれに、７５
％、８０％および５３．９％の症例において陽性ＥＬＩ
ＳＡ値を有した。ＥＬＩＳＡと組織学的ギムザ染色間と
の一致は、十二指腸潰瘍で９５％、十二指腸炎で９８
％、胃潰瘍で８０％、そして、慢性胃炎で５５．８％で
あった。このアッセイは、十二指腸炎潰瘍疾患と非常に
相関性を与えた（ｐ＜０．０００５）。
【０１５９】（ｉｉｉ．熱ショックタンパク質（ｈｓ
ｐ）） （１．材料および方法） （ａ．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株および増殖条件）使用した
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株は：ＣＣＵＧ １７８７４、Ｇ３
９、およびＧ３３（ｔｈｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ
Ｇｒｏｓｓｅｔｏ， Ｉｔａｌｙでの胃生検から単離し
た）、Ｐｙｌｏ ２Ｕ＋およびＰｙｌｏ ２Ｕ−（Ｆ．
Ｍｅｇｒａｕｄ， ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｅｌｌｅｇ
ｚｉｎ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＢＡ９６
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｅｎａ，Ｉｔａｌ
ｙでの胃生検で単離した）であった。Ｐｙｌｏ ２Ｕ＋
株は非細胞毒性；Ｐｙｌｏ２Ｕ−株は非細胞毒性および
ウレアーゼ陰性である。全株は、０．２％シクロデキス
トリン、５μｇ／ｍｌセフスロジン、および５μｇ／ｍ
ｌアムホテリシンＢを含有するＣｏｌｕｍｂｉａ寒天
で、微好気性条件下で３７℃で５ー６日間ルーチンで増
殖した。細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。ペレットを
Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に再懸濁させ、煮沸して溶解
した。
【０１６０】胃炎および潰瘍に冒された患者の血清
（Ａ．Ｐｏｎｚｅｔｔｏ，ｈｏｓｐｉｔａｌ ”Ｌｅ
Ｍｏｌｉｎｅｔｔｅ”，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙから
提供された）、および胃癌患者の血清（Ｆ．Ｒｏｖｉｅ
ｌｌｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｓｉｅｎａ，Ｉｔ
ａｌｙから提供された）を使用した。
【０１６１】（ｂ．ライブラリーの免疫スクリーニン
グ）λｇｔ１１ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡ発現ライブ
ラリーの５００，０００プラークを、０．２％マルトー
スおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有するＬＢ中で一晩
増殖させたＥ．ｃｏｌｉＹ１０９０株の懸濁液５ｍｌと
混合し、０．５ Ｏ．Ｄ．で１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に
再懸濁させた。３７℃で１０分間のインキュベーション
後に、溶かしたＴｏｐＡｇａｒｏｓｅ７５ｍｌを、細菌
／ファージ混合物に注ぎ入れ、その全部をＢＢＬプレー
トに塗布した（５０，０００プラーク／プレート）。塗
布したライブラリーを４２℃で３．５時間インキュベー
トした後、予め１０ｍＭ ＩＰＴＧで湿潤させたニトロ
セルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を
プレートに取付けて３７℃でのインキュベーションを
３．５時間続け、次いで４℃で一晩放置した。λタンパ
ク質のついたフィルターを持ち上げてＰＢＳですすぎ、
ＴＢＳＴ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、５Ｍ ＭｇＣｌ２）に溶解した５％脱脂粉乳
に２０分間浸した。最初のハイブリダイゼーション工程
は、患者血清を用いて実施した；陽性プラークの呈色お
よび可視化のために、アルカリホスファターゼコンジュ
ゲート抗ヒトＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ，Ｗｅｓｔ Ｃｈ
ｅｓｔｅｒ，ＰＡ）、およびＡＰ緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ２）中のＮＢＴ／ＢＣＩＰキット（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、製造者の指示に従
って使用した。
【０１６２】（ｃ．組換えＤＮＡ法）使用した試薬およ
び制限酵素は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）から入手した。分子クローニング、一本鎖
ＤＮＡ精製、Ｅ．ｃｏｌｉでの形質転換、プローブの放
射活性標識、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡゲノムライブラ
リーのコロニースクリーニング、サザンブロット分析、
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析について、標準
的な方法を使用した。
【０１６３】（ｄ．ＤＮＡ配列分析）ＤＮＡフラグメン
トをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローニング
した。［33Ｐ］αｄＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＳｅｑｕ
ｅｎａｓｅキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を製造者の指
示に従って使用して、一本鎖ＤＮＡ配列決定を実施し
た。配列は両鎖について決定し、各鎖は平均２回配列決
定した。コンピューター配列分析は、ＧＣＧパッケージ
を用いて実施した。
【０１６４】（ｅ．組換えタンパク質）ＭＳ２ポリメラ
ーゼ融合タンパク質を、ｐＥＸ３１の誘導体である、ベ
クターｐＥＸ３４Ａを用いて生産した。挿入断片Ｈｐ６
７（図９〜１１のヌクレオチド４４５からヌクレオチド
１４０２）およびＥｃｏＲＩリンカーを、ベクターのＥ
ｃｏＲｉ部位に挿入してクローニングした。停止コドン
の位置を確認するために、ＨｐＧ３’ ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを、ｐＥＸ３４ＡのＨｉｎｄＩＩＩ部位に
挿入してクローニングした。組換えプラスミドを、Ｅ
ｃｏｌｉ Ｋ１２：Ｈ１Δｔｒｐに形質転換した。誘導
後両場合とも、予期した分子量の融合タンパク質が産生
された。ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの場合
に、誘導後に得られた融合タンパク質を電気溶出し、標
準的なプロトコールにより、ウサギに免疫した。
【０１６５】（２．結果） （ａ．発現ライブラリーのスクリーニングおよびＨ．
ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐのクローニング）Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉ ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングに適した
血清を見つけるために、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＣＣＵＧ １
７８７４株の超音波処理抽出物を、異なる型の胃炎に冒
された患者の血清に対するウエスタンブロット分析で試
験した。異なる血清による抗原認識のパターンは、おそ
らく、患者の免疫応答の相違、および感染に関連する株
により発現された抗原の相違によって、多用である。
【０１６６】血清Ｎ。１９を、細菌増殖の間にインビボ
で発現されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異抗原を同定するため
のλｇｔ１１ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡ発現ライブラ
リーをスクリーニングするために、選択した。この血清
を用いるライブラリーのスクリーニング後に、多くの陽
性クローンを単離して特徴付けた。Ｈｐ６７と呼ばれ
る、これらのうちの１つのヌクレオチド配列で、熱ショ
ックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに高度の相同性
を有するタンパク質をコードする、９５８塩基対のオー
プンリーディングフレームが明らかにされた（Ｅｌｌｉ
ｓ，Ｎａｔｕｒｅ３５８：１９１−９２（１９９
２））。全コーディング領域を得るために、異なる制限
酵素により消化されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡのサザ
ンブロット分析でのプローブとして、フラグメントＨｐ
６７を使用した。プローブＨｐ６７は、それぞれに約８
００および１０００塩基対の２つのＨｉｎｄＩＩＩバン
ドを認識した。ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたＤＮＡのゲ
ノムＨ．ｐｙｌｏｒｉライブラリーを、プローブＨｐ６
７でスクリーニングし、予期した分子量の２つの陽性ク
ローン（ＨｐＧ５’およびＨｐＧ３’）を得た。プラス
ミドｐＨｐ６０Ｇ２（約ヌクレオチド１から８２９）お
よびｐＨｐ６０Ｇ５（約ヌクレオチド８２４から１８３
８）を含有するＥ．ｃｏｌｉを、アメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０１６７】（ｂ．配列分析）ヌクレオチド配列分析
で、開始ＡＴＧの６塩基対上流の推定リボソーム結合部
位を有する、１６３８塩基対のオープンリーディングフ
レームが明らかにされた。図９〜１１は、Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉ ｈｓｐのヌクレチドおよびアミノ酸配列を示す。
推定リボソーム結合部位および内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位
には、下線を付けた。４４５位のシトシンおよび１４０
２位のグアニンは、Ｈｐ６７フラグメント中の、それぞ
れに最初および最後のヌクレオチドである。１７７２位
のチミジンを、因子独立ターミネーター領域の位置を計
算して、転写された最後の推定ヌクレオチドとして同定
した。オープンリーディングフレームは、推定分子量５
８．３ｋＤａおよび推定ｐＩ値５．３７を有する、５４
６アミノ酸のタンパク質をコードした。この遺伝子のコ
ドン選択は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉコドンの用法と一致す
る。
【０１６８】親水性特性の分析で、推定リーダーペプチ
ドまたはその他のトランスメンブランドメイン以外の大
部分の親水性タンパク質が明らかにされた。アミノ末端
配列は、Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６
０：１９４６−５１（１９９２）により、精製タンパク
質で決定された３０アミノ酸の配列と１００％相同性を
示し、Ｅｖａｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６
０：２１２５−２７（１９９２）により公表された４４
アミノ酸の配列と１残基（Ｌｙｓに代わってＳｅｒ４
２）のみが異なった（Ｅｖａｎｓら、１９９２）。成熟
ｈｓｐタンパク質のＮ末端配列は、開始メチオニンを含
有せず、このことは、メチオニンが翻訳後に除去された
ことを示す。
【０１６９】（ｃ．ｈｓｐ６０ファミリーとの相同性）
アミノ酸配列分析で、熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０
のファミリーと高度な相同性を示した。このファミリー
のメンバーは、あらゆる生物に存在する。異種のｈｓｐ
６０タンパク質間の相同性の程度に基づくと、Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ ｈｓｐは、グラム陰性細菌のｈｓｐ６０タン
パク質のサブグループに属する；しかし、ｈｓｐ６０フ
ァミリーの他のタンパク質との相同性の程度は、非常に
高い（少なくとも５４％一致）。
【０１７０】（ｄ．組換えタンパク質の発現およびポリ
クローナル抗血清の産生）クローンＨｐ６７およびクロ
ーンＨｐＧ３’の挿入断片を、ＭＳ２ポリメラーゼのア
ミノ末端に融合したこれらのオープンリーディングフレ
ームを発現するために、発現ベクターｐＥＸ３４Ａにサ
ブクローニングした。そのクローンは、予測された大き
さの組換えタンパク質を産生し、最初のスクリーニング
のために使用したヒト血清により認識された。クローン
Ｈｐ６７由来の融合タンパク質を電気溶出し、抗ｈｓｐ
特異ポリクローナル抗血清を得るためにウサギの免疫に
使用した。得られた抗血清は、融合タンパク質と、ウレ
アーゼ陰性株および非細胞毒性株を含む、試験したＨ．
ｐｙｌｏｒｉのいくつかの株の全細胞抽出物の５８ＫＤ
ａのタンパク質との両方を認識した。
【０１７１】ｈｓｐは、試験し全Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株に
より発現されたことが示され、その発現はウレアーゼの
存在または細胞毒性に関連しない。抗ｈｓｐ抗血清に認
識されたタンパク質は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの水溶性抽出
物に認められ、ウレアーゼサブユニットとともに精製さ
れた。このことは、このタンパク質の細菌の外膜への弱
い関連性を示唆する。従って、ｈｓｐはウレアーゼ関連
および表面露出されたとして記載され得る。ｈｓｐ相同
タンパク質のほとんどが、細胞質またはミトコンドリア
およびプラスチドに局在するので、細胞表面への局在は
驚きである。ｈｓｐにリーダーペプチドが存在しないこ
とは、これが、特有の移送系により膜に移送されるか、
そのタンパク質が細胞質から放出され、細菌の死後に細
菌の膜に受動的に吸着されるかのいずれかであることを
示唆する。
【０１７２】ｈｓｐ６０タンパク質は、オリゴマーまた
はマルチマータンパク質の正常な折り畳み、組立、およ
び輸送を補助する分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎ）
として作用することが示された。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈ
ｓｐの細胞局在性、およびウレアーゼへの弱い関連性よ
り、ｈｓｐは膜表面に露出された最終四次構造がＡ６Ｂ
６であるタンパク質の折り畳みおよび／または組立を補
助する役割をなし得る、ウレアーゼのような複数のサブ
ユニットからなることを示唆する。Ａｕｓｔｉｎら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７４７０−７３（１
９９２）は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐの超微細構造
は、４つのグループに並んで積み重った円盤状の粒子に
組み立てられた、７つのサブユニットからなることが示
された。この構造はウレアーゼ高分子の形および大きさ
に類似し、このことは、それらが同時精製になるこれら
の２つの高分子の共通の特性を説明し得る。しかし、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐ遺伝子は、ウレアーゼオペロ
ンの部分ではない。他の細菌ｈｓｐ６０タンパク質の遺
伝子構造に一致し、これはジシストロン性オペロンであ
るはずだ。
【０１７３】（ｅ．胃十二指腸疾患患者中の抗ｈｓｐ抗
体の存在）精製融合タンパク質を、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感
染患者ならびに萎縮性および表在性胃炎に冒された患
者、ならびに十二指腸および胃潰瘍患者の血清を使用す
る、ウエスタンブロットにより試験した。ほとんどの血
清は組換えタンパク質を認識した。しかし、認識の程度
は、個々の患者間で非常に多様であり、抗体レベルは、
疾患型と明白な相関を示さなかった。さらに、Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ抗原および特にｈｓｐタンパク質に対する抗体
が、試験された胃癌患者の１２血清のほとんどに認めら
れた。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐ認識は疾患の特定の臨
床状態には関係しないが、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐと
そのヒト相同物間の高度な保存があるとすると、このタ
ンパク質がヒトの対応物と交差反応する自己免疫抗体を
誘導し得ることは可能である。このクラスは相同タンパ
ク質は、別の系における自己免疫疾患の誘導に関係があ
る。従って非消化性患者中のヒト相同物と交差反応する
可能性がある高力価抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐ抗体の
存在は、このタンパク質が胃十二指腸疾患において役割
を有することを示唆する。この自己反応性は、Ｈ．ｐｙ
ｌｏｒｉ誘導性胃炎で生じる組織の損傷に役割を果たし
得、従ってこの細菌感染に関連する病原機序を増加し
た。
【０１７４】このような保存されたタンパク質に対する
高レベルの抗体は、やや異常である；ヒトのものを含む
ｈｓｐ６０ファミリーのメンバー間で高度に相同である
ので、このタンパク質は、宿主免疫系に非常によく許容
されるにちがいない。多くの患者に認められる強い免疫
応答は、２つの異なる方法で説明され得る：（１）免疫
応答は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐに特異的なエピトー
プに対してのみ指示される；（２）免疫応答は、Ｈ．ｐ
ｙｌｏｒｉ ｈｓｐおよびヒト相同物間で共通のエピト
ープに対して指示される。
【０１７５】（Ｈ．生物学的材料の寄託）以下の材料
は、ブダペスト条約（特許手続き上微生物の寄託の国際
的承認に関する）のもとに、本発明の譲受人であるＢｉ
ｏｃｉｎｅ Ｓｃｌａｖｏ，Ｓ．ｐ．Ａ．により、１９
９２年１２月１５日および１９９３年１月２２日に、メ
リーランド州、ロックビル、パークローンドライブ１２
３０１、電話（３０１）２３１−５５１９のアメリカン
タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され
た。
【０１７６】細胞毒素タンパク質（ＣＴ）について： ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５７ プラスミドＴＯＸＨＨ
１を含むＥ．ｃｏｌｉＴＧ１ ＡＴＣＣ Ｎｏ． ｎ／ａ プラスミドＴＯＸＥＥ
１を含むＥ．ｃｏｌｉＴＧ１。
【０１７７】ＣＡＩタンパク質について： ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５８ プラスミド５７／Ｄを
含むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１ ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５９ プラスミド６４／４を
含むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１ ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１６０ プラスミドＰ１−２４
を含むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１ ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１６１ プラスミドＢ／１を含
むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１。
【０１７８】熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）につい
て： ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５５ プラスミドｐＨｐ６０
Ｇ２を含むＥ．ｃｏｌｉＴＧ１ ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５６ プラスミドｐＨｐ６０
５を含むＥ．ｃｏｌｉＴＧ１。
【０１７９】これらの寄託物は、当業者の利便性のため
に提供されており、寄託が米国特許法１１２条のもとに
必要とされることを認めるものではない。これらの寄託
物の核酸配列およびこれらによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用さ
れており、万一寄託物の配列と比較して本明細書中に記
載された配列に任意の誤りがある場合には、参考にされ
るべきである。寄託物質の製造、使用、または売却には
認可が必要であり得るが、ここではそのような認可は承
認されていない。
【０１８０】Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ
は、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍および胃癌の原因または補助
因子であることが知られている。先進国および発展途上
国の両方において、高い割合で人々はこの細菌に感染し
ている。本発明は概して、ある種のＨ．ｐｙｌｏｒｉタ
ンパク質、これらのタンパク質を発現する遺伝子、およ
び、これらのタンパク質の診断およびワクチン用途のた
めの使用に関する。特に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細胞毒素
（ＣＴ）の分子クローニング、ヌクレオチド、およびア
ミノ酸配列、「細胞毒素関連免疫優性」（ＣＡＩ）抗
原、および熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）が、本
明細書中に記載されている。
【０１８１】
【発明の効果】本発明によれば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ「細
胞毒素関連免疫優性」（ＣＡＩ）抗原のタンパク質の分
子レベルでの特性および機能についての理解、ならび
に、組換え産物の入手可能性によって、Ｈ．ｐｙｌｏｒ
ｉの新たな診断法の開発、および、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感
染の予防および疾患の処置を行い得るワクチン設計に有
用な影響を及ぼし得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞毒素（ＣＴ）タンパク質のヌクレオチド配
列を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】細胞毒素（ＣＴ）タンパク質のアミノ酸配列を
示す図である。
【図５】ＣＡＩタンパク質のｃａｉ遺伝子マップ、およ
び、この遺伝子の同定および配列決定に使用されたクロ
ーンのまとめを示す図である。
【図６】ＣＡＩ抗原のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列を示す図である。
【図７】図６の続きである。
【図８】図７の続きである。
【図９】熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）のヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】図１０の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ジョン テルフォード イタリア国 イ−53100 シエナ，ビア フィオレンティーナ １ (72)発明者 ジョバンニ マッチア イタリア国 イ−53100 シエナ，ビア フィオレンティーナ １ (72)発明者 リノ ラプオリ イタリア国 イ−53100 シエナ，ビア フィオレンティーナ １

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫原性であり、そして毒性に対して機
    能的寄与をまったく示さないか、または毒性に対して実
    質的に低い機能的寄与を示す組換えポリペプチドであっ
    て、以下の特性を有する、少なくとも８アミノ酸の連続
    する配列を含む組換えポリペプチド： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化１】 【化２】 【化３】 から得られる。
  2. 【請求項２】 毒性または毒性に対する機能的寄与を低
    下または排除するように化学的に改変されている、請求
    項１に記載の組換えポリペプチド。
  3. 【請求項３】 １つ以上のアミノ酸置換または欠失を含
    む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
  4. 【請求項４】 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
    ｉ感染の処置における使用のための組換えポリペプチド
    であって、以下の特性を有する、少なくとも８アミノ酸
    の連続する配列を含む組換えポリペプチド： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化４】 【化５】 【化６】 から得られる。
  5. 【請求項５】 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ
    ｉ感染の処置における使用のための、請求項１〜３のい
    ずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  6. 【請求項６】 ワクチンとしての使用のための組換えポ
    リペプチドであって、以下の特性を有する、少なくとも
    ８アミノ酸の連続する配列を含む組換えポリペプチド： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化７】 【化８】 【化９】 から得られる。
  7. 【請求項７】 ワクチンとしての使用のための、請求項
    １〜３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
  8. 【請求項８】 組換えポリペプチドおよび薬学的に受容
    可能なキャリアを含む、ワクチンまたは治療組成物であ
    って、該組換えポリペプチドは、以下の特性を有する、
    少なくとも８アミノ酸の連続する配列を含む、ワクチン
    または治療組成物： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化１０】 【化１１】 【化１２】 から得られる。
  9. 【請求項９】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の組
    換えポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを
    含む、ワクチンまたは治療組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項８または９に記載のワクチンま
    たは治療組成物であって、さらに以下のうちの１つ以上
    を組み合わせて含む、ワクチンまたは治療組成物： ｉ）以下の特性を有する、少なくとも８アミノ酸の連続
    する配列を含む組換えポリペプチド： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得、そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化１３】 【化１４】 【化１５】 から得られる； ｉｉ）以下の特性を有する、少なくとも８アミノ酸の連
    続する配列を含む組換えポリペプチド： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得、そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化１６】 【化１７】 【化１８】 から得られる；および／または ｉｉｉ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉウレ
    アーゼ。
  11. 【請求項１１】 アジュバントを含む、請求項８〜１０
    のいずれか１項に記載のワクチンまたは治療組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項８、１０、および１１のいずれ
    か１項に記載のワクチンまたは治療組成物の調製のため
    の方法であって、該方法は以下の工程：組換えポリペプ
    チド、または請求項１０に記載の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の
    うちの１つ以上と組み合わせた該組換えポリペプチド
    を、薬学的に受容可能なキャリア、および必要に応じて
    アジュバントと組み合わせる工程、を包含し、ここで該
    組換えポリペプチドは、以下の特性を有する、少なくと
    も８アミノ酸の連続する配列を含む、方法： （１）該少なくとも８アミノ酸の連続する配列は、少な
    くとも１つの部位を含み、 ここで該部位は、該少なくとも８アミノ酸の連続する配
    列からなる配列中においても該ポリペプチド中において
    もＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗
    体によって結合され得；そして（２）該少なくとも８ア
    ミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列： 【化１９】 【化２０】 【化２１】 から得られる。
  13. 【請求項１３】 請求項９〜１１のいずれか１項に記載
    のワクチンまたは治療組成物の調製のための方法であっ
    て、以下の工程：請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    組換えポリペプチド、または請求項１０に記載の（ｉ）
    〜（ｉｉｉ）のうちの１つ以上と組み合わせた該組換え
    ポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア、および
    必要に応じてアジュバントと組み合わせる工程、を包含
    する、方法。
JP2000126696A 1992-03-02 2000-04-26 ワクチンおよび診断に有用なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉタンパク質 Pending JP2000333686A (ja)

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GB92A000052 1993-01-25
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