JPH11506905A

JPH11506905A - ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣａｇＩ領域

Info

Publication number: JPH11506905A
Application number: JP8531592A
Authority: JP
Inventors: コバッシ，アントネロ
Original assignee: ビオチーネエセ．ピー．アー．
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-18
Publication date: 1999-06-22
Also published as: EP0821735A1; WO1996033274A1; AU5160596A; US5928865A

Abstract

(57)【要約】 Helicobacter pyloriは、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍、および胃腫瘍を引き起こす原因またはこれらの補因子であることが公知である。先進国および発展途上国の両方において、高い割合の人々がこの細菌に感染される。本発明は、一般的に、CagA遺伝子座の5'に位置する特定のH．pylori領域、それによりコードされるタンパク質、ならびに診断およびワクチン適用についてのこれらの遺伝子およびタンパク質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Helicobacter pylori CagI 領域１．開示の分野本発明は、一般的に、特定のHelicobacter pylori遺伝子領域、これらの領域により発現されるタンパク質、ならびに診断およびワクチン適用へのこれらの遺伝子およびタンパク質の使用に関する。２．関連技術の簡単な説明 Helicobacter pyloriは、湾曲した、微好気性の、グラム陰性細菌であり、198 2年に初めて慢性胃炎の患者の胃生検から単離された（Warrenら、Lancet i:1273 -75(1983)）。最初はCampylobacter pyloriと命名され、Helicobacterという名の別の属の一部であると認識されていた（Goodwinら、Int．J．Syst．Bacteriol . 39:397-405(1989)）。この細菌はヒトの胃粘膜にコロニー形成し、そして感染は10年間持続し得る。最近２〜３年の間、細菌の存在は、ほとんどの感染したヒトで無症候性を保持し得るが消化性潰瘍および胃腺癌の危険性がかなり増加している状態である、慢性Ｂ型胃炎に関連している。最も最近の研究は、H ．pylori 感染がＢ型胃炎、消化性潰瘍、および胃腫瘍の原因または補因子のいずれかであり得ることを強く示唆する。例えば、Blaser、Gastroenterology 93:371-83(198 7)；Dooleyら、New Engl．J．Med．321:1562-66(1989)；Parsonnetら、New Engl ．J．Med．325:1127-31(1991)を参照のこと。H ．pyloriは経口経路により伝染されると考えられており（Thomasら、Lancet i:340，1194(1992)）、そして感染の危険性は年齢とともに増加し（Grahamら、Gastroenterology 100:1495-1501(199 1)）、そして密集により促進される（Drummら、New Engl．J．Med．4322:359-63 (1990)；Blaser、Clin．Infect．Dis．15:386-93(1992)）。先進国では、H ．pyl ori 抗原に対する抗体の存在は、30および60歳のヒトにおいてそれぞれ20％未満から50％以上に増加し（Jonesら、Med．Microbio．22:57-62(1986)；Morrisら、 N.Z．Med．J．99:657-59(1986)）、一方、発展途上国では、人口の80％以上が20歳までにすでに感染する（Grahamら、Digestive Diseases and Sciences 36:1084-88(1991)）。これまでに同定されたH ．pyloriは、粘液層を横切って移動するためにおそらく必要である鞭毛、例えば、Leyingら、Mol．Microbiol．6:2863-74(1992)を参照のこと；ウレアーゼ、これは胃の酸性環境を中和するために、および最初のコロニー形成を可能にするために必要である、例えば、Cussacら、J．Bacteriol． 174:2466-73(1992)、Perez-Perezら、J．Infect．Immun．60:3658-3663(1992)、 Austinら、J．Bacteriol．174:7470-73(1992)、PCT公開公報第WO 90/04030号を参照のこと；H ．pyloriサイトトキシン（空胞形成を引き起こす場合、ときどきV acAと呼ばれる）、例えば、PCT公開公報第WO 93/18150号、Telford，J.L.ら、J ．Exp．Med．179:1653-58(1994)、Coverら、J．Bio．Chem．267:10570-75(1992) 、Coverら、J．Clin．Invest．90:913-18(1992)、Leunk，Rev．Infect．Dis．13 :5686-89(1991)を参照のこと;H ．pylori熱ショックタンパク質、例えば、PCT公開公報第WO 93/18150号、Evansら、Infect．Immun．60:2125-27(1992)、Dunnら、Infect．Immun．60:1946-51(1992)、Austinら、J．Bacteriol．174:7470-73(1 992)を参照のこと；およびサイトトキシン関連タンパク質、CagA、例えば、PCT 公開公報第WO 93/18150号、Covacci，A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:57 91-95(1993)、Tummuru，M.K.ら、Infect．Immun．61:1799-1809(1994)を参照のこと、を含む。現在、H ．pylori株は、少なくとも２つの主な群に分割され得、これらはサイトトキシンおよびCagAタンパク質を発現する（Ｉ型）が発現しない（II型）かのいずれかである。Ｉ型株はCagAおよびトキシン遺伝子を含み、そしてこれらの抗原の活性形態を産生する。II型株は、CagA遺伝子座を欠き、そしてサイトトキシンを発現し得ない。CagA遺伝子の存在と細胞傷害性との関連は、CagA遺伝子の産物がサイトトキシンの転写、折り畳み、輸送、または機能に必要であることを示唆する。疫学的分析は、Ｉ型細菌が十二指腸潰瘍形成、胃潰瘍形成、および活性な胃炎の重篤な形態に関連することを示す。消化性潰瘍におけるH ．pyloriの病原性の役割の一般的な総説については、Tel ford，J.L.ら、TibTech 12:420-426(1994)を参照のこと。発明の要旨本発明は、CagA遺伝子の5'領域に位置するヌクレオチド配列を記載する。Ｉ型株におけるCagA遺伝子の不在が、CagA遺伝子座の5'に位置する遺伝子配列の不在に関連することが見いだされている。この一般的な領域はCagIと命名されており、そしてＩ型株に限定された毒性因子をコードし得る。この領域由来の配列は、すべてのＩ型株において相同配列を認識し得たが、II型株由来のDNAとハイブリダイズしなかった。したがって、この領域は、病原性Ｉ型細菌の診断と重要な関係を有する。本発明は、このCagI領域のみならず、ベクター、宿主細胞、およびこのような領域によりコードされるタンパク質のようなこの領域に関連する組換え物質に関する。この領域の性質および役割ならびに組換え産物の有用性の分子レベルでの理解は、H ．pyloriの新しい診断の開発、およびH ．pylori感染を予防し病気を処置し得るワクチンの設計と、重要な関係を有する。このように、この領域は診断およびワクチンへの適用を有する。本発明は、H ．pyloriに関連するそれらの病気の診断方法を包含する。H ．pyloriがＢ型胃炎、消化性潰瘍、および胃腺癌に関連しているので、本発明がこれらの病気の状態の早期検出および軽減を援助することが望まれる。図面の簡単な説明図１は、特定のクローンの位置を示すH ．pylori CagI領域の概略図である。図２は、３つの配列セグメントにより表されるような、H ．pylori CagI遺伝子座についての、ヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列、ならびに制限酵素部位である（以下を参照のこと）。図３は、H ．pylori CagI遺伝子座についての完全ヌクレオチド配列である（19 ,932塩基対）。図４は、CagI遺伝子座および他のタンパク質とのその可能な相同性についての推定オープンリーディングフレーム（ORF）である。発明の詳細な説明Ａ．一般的方法論本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING; A LABOR ATOTY MANUAL，第２版(1989)；DNA CLONING，第Ｉ巻および第II巻（D.N Glover 編 1985）；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（M.J．Gait編、1984）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D．HamesおよびS.J．Higgins編 1984）；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION（B.D．HamesおよびS.J．Higgins編 1984）；ANIMAL CELL CULTURE （R.I.Freshney編 1986）；IMMOBILZED CELLS AND ENZYMES（IRL Press，1986）；B．Perbal、A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984)；シリーズであるMETHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（J.H．MillerおよびM.P.Calos編 1987，Cold Spring Harbor Laboratory）、Methods in Enzymology第154巻および第155巻（それぞれ、WuおよびGrossman、ならびにWu編）、MayerおよびWalker編(1987)，IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY（Academic Press，London）、Scopes ，(1987),PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE，第２版(Springer- Verlag，N.Y.)、およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，第Ｉ-IV巻（D.M ．WeirおよびC.C．Blackwell編 1986）を参照のこと。ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的略号が本明細書で使用される。本明細書に引用されたすべての出版物、特許、および特許出願は、参考として援用される。Ｂ．定義「CagI」とは、CagA遺伝子座の5'に位置する遺伝子領域をいい、その不在はＩ型細菌株におけるCagA遺伝子の不在に関連する。CagIのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２、３、および４に示す。本発明で用いられ得るCagI領域によりコードされるタンパク質の例として、タンパク質の天然のアミノ酸配列由来の少数のアミノ酸変異を有するポリペプチドを包含する；特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分割される：(1)酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときどき芳香族アミノ酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで、あるいはアミノ酸の同様の保存的置換を構造的に関連するアミノ酸で独立して置換することは、生物学的活性に大きな影響を有さないことが、合理的に予測され得る。タンパク質として実質的に同じアミノ酸配列を有するが機能局面に実質的に影響を与えない少数のアミノ酸置換を有するポリペプチド分子は、タンパク質の定義の範囲内である。天然のソースからタンパク質を単離および精製することによるよりも組換えDN A技法によりタンパク質を産生することの顕著な有利点は、天然のソースからタンパク質を単離するために必要とされるよりも少ない開始物質を用いることにより、等量のタンパク質が産生され得ることである。組換え技法によりタンパク質を産生することはまた、タンパク質が細胞中に通常存在するいくつかの分子の不在下で単離されることを可能にする。実際、わずかな量のヒトタンパク質夾雑物を全く含まないタンパク質組成物は、容易に産生され得る。なぜなら、組換え非ヒト宿主により産生されるヒトタンパク質のみが目的の組換えタンパク質であるからである。天然のソース由来の潜在的なウイルス性薬剤およびヒトに対して病原性のウイルス成分もまた避けられる。本明細書で用いられる用語「組換えポリヌクレオチド」は、以下の起源または操作により：(1)天然に結合されているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と結合されていない、(2)天然に連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結される、または(3)天然に存在しない、ゲノム、cDNA、半合成、または合成の起源のポリヌクレオチドを意図する。したがって、この用語はまた、H ．pylori細菌ゲノムが、１つまたはそれより多くの改変されたポリペプチドを産生するように遺伝学的に改変（例えば、変異誘発を介して）される状況を包含する。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」とは、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態、好ましくはデオキシリボヌクレオチドをいい、そして「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」という用語と本明細書では交換可能に使用される。この用語は分子の一次構造についてのみいう。したがって、この用語は、二本および一本鎖DNA、ならびにアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。これは公知のタイプの改変、例えば、当業者に公知の標識、メチル化、末端「キャップ」の存在、１つまたはそれより多くの天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、例えば、特定のタイプの非荷電架橋（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）または荷電架橋（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）との置換のようなヌクレオチド内改変、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを含む）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射活性種、ホウ素、酸化的部分など）、アルキル化剤（例えば、αアノマー核酸など）のようなペンダント部分の導入も包含する。「ゲノム」は、ベクター中にクローニングされている制限フラグメント由来の DNA分子のコレクションまたはライブラリーを意味する。これは、生物のゲノム物質のすべてまたは一部を包含する。「cDNA」は、mRNAの相補鎖にハイブリダイズする相補的mRNA配列を意味する。本明細書で用いられる場合、用語「オリゴマー」はプライマーおよびプローブの両方をいい、そして用語「ポリヌクレオチド」と本明細書中では交換可能に使用される。用語オリゴマーは、分子のサイズを意味しない。しかし、代表的なオリゴマーは、長さが、1000ヌクレオチドより大きくなく、より代表的には、500 ヌクレオチドより大きくなく、さらにより代表的には250ヌクレオチドより大きくない；これらは100ヌクレオチドより大きくなくてもよく、そして75ヌクレオチドよりも大きくなくてもよく、そしてまた50ヌクレオチドより大きくなくてもよい。本明細書で用いられる用語「プライマー」は、適切な条件下で用いられる場合、ポリヌクレオチド鎖の合成の開始点として作用し得るオリゴマーをいう。プライマーは、コピーされるポリヌクレオチド鎖の領域に完全にまたは実質的に相補的である。したがって、ハイブリダイゼーションを促す条件下で、プライマーは分析物鎖の相補的領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加で、プライマーはポリマー形成剤により伸長されて分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは一本鎖であり得るかあるいは部分的または完全な二本鎖であり得る。用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」は、標的配列を含むことが考えられる一本または二本鎖核酸分子、および生物学的試料中に存在し得る一本または二本鎖核酸分子をいう。本明細書で用いられる場合、用語「プローブ」は、標的領域中の配列とプローブ中の少なくとも１つの配列との相補性のために、標的配列とのハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドからなる構造をいう。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA、および／またはRNA、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。プローブは、「捕獲プローブ」および「標識プローブ」を包含する。本明細書で用いられる場合、用語「標的領域」は、増幅されるおよび／または検出されるべき核酸領域をいう。用語「標的配列」は、プローブまたはプライマーがこれとともに所望の条件下で安定なハイブリッドを形成する配列をいう。本明細書で用いられる用語「捕獲プローブ」は、結合パートナーにカップリングされる一本鎖ポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドプローブをいう。一本鎖ポリヌクレオチドは、標的するポリヌクレオチド配列からなり、これは分析物ポリヌクレオチドで検出されるべき標的領域中の標的配列に相補的である。この相補的領域は、分析物ポリヌクレオチドを（結合パートナーを介して）固体表面に固定するために十分な安定性を二重鎖に与えるように、標的配列に対する十分な長さおよび相補性を有する。結合パートナーは、第２の結合パートナーに特異的であり、第２の結合パートナーは固体支持体の表面に結合され得るか、あるいは他の構造または結合パートナーを介して固体支持体に間接的に連結され得る。本明細書で用いられる用語「標的するポリヌクレオチド配列」は、標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう；この配列は、意図される目的のために十分な安定性を有する二重鎖を形成するために、十分な長さおよび標的配列との相補性を有する。本明細書で用いられる用語「結合パートナー」は、例えば、抗原およびそれに対して特異的な抗体のような、高い特異性を有するリガンド分子を結合し得る分子をいう。一般的に、特異的結合パートナーは、単離条件下で分析物のコピー／相補鎖二重鎖（捕獲プローブの場合）を固定するために十分な親和性で結合しなければならない。特異的結合パートナーは当業者に公知であり、例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGおよびプロテインＡ、多くの公知のレセプター−リガンド結合、および相補的ポリヌクレオチド鎖を含む。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場合、パートナーは、通常少なくとも約 15塩基長であり、そして少なくとも40塩基長であり得；さらに、少なくとも約40 ％および約60％ほどのGおよびCの含量を有する。ポリヌクレオチドは、DNA，RNA 、または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。本明細書で用いられる用語「カップリングされた」は、共有結合によるかまたは強い非共有相互作用（例えば、疎水性相互作用、水素結合など）による付加をいう。共有結合は、例えば、エステル結合、エーテル結合、ホスホエステル結合、アミド結合、ペプチド結合、イミド結合、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などであり得る。用語「支持体」は、所望の結合パートナーが据え付けられ得るあらゆる固体または半固体表面をいう。適切な支持体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどが含まれ、そしてビーズ、ウェル、ディップスチック、膜などの形態をとり得る。本明細書で用いられる「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために用いられ得る、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチドに付加され得るあらゆる原子または部分をいう。本明細書で用いられる場合、用語「標識プローブ」は、分析物ポリヌクレオチドで検出されるべき標的配列に相補的な標的するポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドプローブをいう。この相補的領域は、標識により検出されるべき「標識プローブ」および「標的配列」からなる二重鎖を与えるために、標的配列に対して十分な長さおよび相補性を有する。標識プローブは、直接、あるいは、マルチマーを含む互いに高い特異性を有する１セットのリガンド分子を介して間接的に、カップリングされる。本明細書で用いられる場合、用語「マルチマー」は、同一の反復の一本鎖ポリヌクレオチド単位または異なる一本鎖ポリヌクレオチド単位の直線または分枝状のポリマーをいう。少なくとも１つの単位は、目的の第１の一本鎖ヌクレオチド配列、代表的には分析物または分析物に結合されるポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プローブ）に特異的にハイブリダイズすることを可能にする、配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を達成するために、この単位は、通常は少なくとも約15ヌクレオチド長、代表的には約50ヌクレオチド長以下、そして好ましくは約30ヌクレオチド長であり；さらに、GおよびCの含量は、通常少なくとも約40％、および多くとも約60％である。このような単位に加え、マルチマーは、目的の第２の一本鎖ヌクレオチドに、代表的には標識されたポリヌクレオチドまたは他のマルチマーに、特異的および安定にハイブリダイズされ得る多数の単位を含む。これらの単位は、一般的に、上記のマルチマーとほとんど同じサイズおよび組成である。マルチマーが別のマルチマーにハイブリダイズされるように設計されるとき、第１および第２のオリゴヌクレオチド単位は異種であり（異なり）、そして選択されたアッセイの条件下で互いにハイブリダイズしない。したがって、マルチマーは標識プローブであり得るか、または標識をプローブにカップリングするリガンドであり得る。「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチドレプリコンの自律単位として作用する任意の遺伝的エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどである；すなわち、それ自体の制御下で複製し得る。これは、選択マーカーを含み得る。「PCR」は、Saikiら、Nature 324:163(1986)；およびScharfら、Science（198 6）233:1076-1078；および米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号に記載されるポリメラーゼ連鎖反応の技法をいう。本明細書で用いられる場合、ｘが同一の様式でｙと天然に関連しないならば、ｘはｙに関して「異種」である。すなわち、ｘは天然にｙと関連しないか、またはｘは天然で見られるのと同様の様式でｙと関連しない。「相同性」は、ｘとｙとの間の類似の程度をいう。１つの形態由来の配列と他との間の相関は、当業者に公知の技法により決定され得る。例えば、これらはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同性は、相同領域（例えば、Ｓ₁切断前に用いられる領域）間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの切断、続く切断されたフラグメントのサイズ決定により決定され得る。「ベクター」は、付加したセグメントの複製および／または発現を引き起こすために、別のポリヌクレオチドセグメントが付加するレプリコンである。「制御配列」は、これらが連結されるコード配列の発現をひきおこすために必要であるポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位、および転写終結配列を含み；真核生物では、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低限、その存在が発現に必要であるすべての成分を含むことを意図し、そしてその存在が有利である追加成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。「作動可能に連結された」は、記載された成分が意図された様式で機能することを可能にする関係である並置をいう。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合可能な条件下で達成されるように連結される。「オープンリーディングフレーム」（ORF）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である；この領域は、コード配列の一部または全コード配列を表し得る。「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、通常mRNAを介して、ポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、cDNA、および組換えポリヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーをいい、そして特定の長さの産物をいうのではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの発現後修飾をいうのではないかまたは排除しない。定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された架橋を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない当業者に公知の他の改変を有するポリペプチドが含まれる。指定された核酸配列「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、配列中にコードされるポリペプチドの配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその一部をいい、ここで、その一部は、少なくとも３〜５アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも８〜10アミノ酸、およびさらにより好ましくは少なくとも11〜15アミノ酸からなり、すなわち配列中にコードされるポリペプチドで免疫学的に同定可能である。この用語はまた、指定された核酸配列から発現されるポリペプチドを含む。「免疫学的」は、アジュバントの存在または不在下で、単独またはキャリアに連結してのいずれかで、体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすためのポリペプチドの能力をいう。「中和」は、感染剤の部分的または全体のいずれかの感染力をブロックする免疫応答をいう。「エピトープ」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原決定基をいう；エピトープは、エピトープに独特の空間コンフォメーションで３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、このようなアミノ酸の少なくとも５つからなり、そしてより通常には、このようなアミノ酸の少なくとも８〜 10個からなる。アミノ酸の空間コンフォメーションを決定する方法は、当業者に公知であり、そして、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する他の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイで同定され得る。本明細書で用いられる場合、「処置」は、予防および／または治療（すなわち、任意の病気の徴候のモジュレーション）をいう。「個体」は、H ．pyloriによる感染が疑われる動物を示し、そしてヒトを含む霊長類を含むがこれに限定されない。「ワクチン」は、免疫原性であり、さもなければH ．pyloriに対する保護（部分的または完全のいずれか）を誘起し得る、個体の処置に有用な組成物である。このように、ワクチンは、改変された細菌（例えば、化学的または遺伝学的変更）；細菌タンパク質サブユニット（組換えにより産生されるかまたは細胞溶解物から精製されるかのいずれか）；ポリヌクレオチドワクチンに用いられる細菌遺伝物質などを含むが、これらに限定されない。 H ．pyloriタンパク質は、このタンパク質に特異的な、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの抗体を産生するために使用され得る。これらの抗体を産生する方法は当該分野において公知である。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、および他のこのような用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーDNAのためのレシピエントとして使用され得るかまたは使用された、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示し、そして形質転換された元の細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、自然、突然、または意図的変異のため、形態学的にあるいはゲノムまたは全DNA相補物が、元の親と必ずしも完全に同一でなくても良いことが理解される。哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞およびサル腎臓（COS）細胞を含む。詳細には、本明細書で用いられる場合、「細胞株」は、インビトロで連続または延長した増殖および分裂し得る細胞集団をいう。しばしば、細胞株は、１つの先祖細胞に由来するクローン集団である。さらに、自発的または誘導された変化が、このようなクローン集団の貯蔵または転移の間に核型に生じ得ることが当該分野において公知である。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖の細胞または培養物と正確に同一ではないかもしれず、そして言及される細胞株はこのような変異体を含む。用語「細胞株」はまた、不死化された細胞を含む。好ましくは、細胞株は、非ハイブリッド細胞株、または２つの細胞タイプのみのハイブリドーマを含む。本明細書で用いられる場合、用語「微生物」は、細菌および菌類のような原核および真核微生物種を含み、後者は酵母および糸状菌を含む。本明細書で用いられる場合、「形質転換」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取り込み、形質導入、f-交配、またはエレクトロポレーションに関わりなく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持されても、あるいは宿主ゲノム中に組込まれても良い。「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列をいう場合、示された分子が、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な不在下に存在することを意味する。本明細書で用いられる用語「精製された」は、存在する同じタイプの生物学的巨大分子の、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、さらにより好ましくは少なくとも95重量％、および最も好ましくは少なくとも98重量％を意味する（しかし、水、緩衝液、および他の小分子、特に1000より小さい分子量を有する分子は存在し得る）。Ｃ．核酸アッセイ H ．pyloriのゲノムを、そしてより詳細にはCagIのゲノム領域を基本として使用して、RNAまたはその相補物のポジティブ鎖、ならびにcDNAにハイブリダイズする、約８またはそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチドプローブが調製され得る。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの検出、単離、および／または標識のためのプローブとして、および／または標的される配列の転写および／または複製のためのプライマーとして用いられる。各プローブは標的するポリヌクレオチド配列を含み、この標的するポリヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドを含む；標的ヌクレオチド配列は、意図される目的のために十分な安定性を有する二重鎖を形成するために、配列に対して十分な長さおよび相補性を有する。例えば、目的が、標的配列を含む分析物の、固定を介する単離である場合、プローブは、単離条件下で固体表面上へ分析物を固定するために十分な二重鎖安定性を与えるために、標的される配列に対する十分な長さおよび相補性を有するポリヌクレオチド領域を含む。例えば、また、ポリヌクレオチドプローブが標的配列の転写および／または複製のためのプライマーとして用いられる場合、プローブは、複製を可能にするために標的される配列に対する十分な長さおよび相補性を有するポリヌクレオチド領域を含む。例えば、また、ポリヌクレオチドプローブが標識プローブとして用いられるか、またはマルチマーに結合する場合、標的するポリヌクレオチド領域は、標識プローブおよび／またはマルチマーとの安定なハイブリッド二重鎖構造を形成して二重鎖の検出を可能にするために、十分な長さおよび相補性を有する。プローブは、標的される配列に相補的な最小限約４個の連続するヌクレオチドを含み得る；通常、オリゴマーは、標的される配列に相補的な最小限約８個の連続するヌクレオチドを含み、そして好ましくは標的される配列に相補的な最小限約14個の連続するヌクレオチドを含む。しかし、プローブは、標的される配列に相補的な配列からのみなる必要はない。これらは追加のヌクレオチド配列または他の部分を含み得る。例えば、プローブがPCRによる配列の増幅のためのプライマーとして用いられる場合、これらは、二重鎖における場合、増幅された配列のクローニングを促進する制限酵素部位を形成する配列を含み得る。例えば、また、プローブがハイブリダイゼーションアッセイにおいて「捕獲プローブ」として用いられる場合、これらは上の定義のような「結合パートナー」にカップリングする。プローブの調製は、当該分野において公知の手段によるものであり、例えば、切除、転写、または化学合成を含む方法によるものを包含する。Ｄ．発現系一旦、適切なH ．pyloriコード配列が単離されると、それは種々の異なる発現系で発現され得る；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母とともに用いられる発現系。ｉ．哺乳動物系哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼを結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流(3')のmRNAへの転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、コード配列の5'末端に対して近位に通常位置する転写開始領域、および転写開始部位の25〜30塩基対（bp）上流に通常位置するTATAボックスを有する。TATAボックスは正確な位置でRNA合成を始めるためにRNAポリメラーゼIIを指示すると考えられる。哺乳動物プロモーターはまた、TATAボックスの100〜200bp上流に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれの方向でも作用し得る（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第２版（1989））。哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現されそして広い宿主範囲を有する；したがって、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、ホルモン応答性細胞中でグルココルチコイドで誘導され得るプロモーターに依存して、構成的であるかまたは調節される（誘導性）かのいずれでもあっても良い。上記のプロモーターエレメントと組み合わされた、エンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常、発現レベルを上昇させる。エンハンサーは、同種または異種プロモーターに連結される場合、正常なRNA開始部位で始まる合成の1000倍まで転写を刺激し得る調節DNA配列である。エンハンサーはまた、それらが転写開始部位の上流または下流に配置される場合、正常または反対（flippe d）方向のいずれでも、あるいはプロモーターから1000ヌクレオチド以上離れた距離で活性である（Maniatisら、Science 236:1237(1989)；Albertsら、Molecul ar Biology of the Cell ，第２版(1989)）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、これらが通常、より広い宿主範囲を有するので、特に有用であり得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー（Dijkemaら(1985)EMBO J．4:761）、およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（LTR）由来（Gormanら(1982)Proc．Nat l．Acad．Sci．79:6777）およびヒトサイトメガロウイルス由来（Boshartら(198 5)Cell 41:5221）のエンハンサー／プロモーターが挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーが調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのようなインデューサーの存在下においてのみ活性になる（Sassone-Corsiら(1986 )Trends Genet．2:215；Maniatisら(1987)Science 236:1237）。 DNA分子は、哺乳動物細胞で細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、DNA 分子と直接連結され得、その場合組換えタンパク質のＮ末端での最初のアミノ酸はいつもメチオニンであり、これはATG開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによりタンパク質から切り離され得る。あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳動物細胞中の外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDN A分子を生成することにより、細胞から培養培地中に分泌され得る。好ましくは、インビトロまたはインビボのいずれかで切り離され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位がある。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３部分リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。通常、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの3'側に位置する調節領域であり、したがってプロモーターエレメントとともに、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3'末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Blmstielら（1985）Cell 41:34 9；ProudfootおよびWhitelaw（1988）「真核生物RNAの終結および3'末端プロセシング」Transcription and splicing（B.D．HamesおよびD.M．Glover編）；Pro udfoot（1989）Trends Biochem．Sci．14:105）。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を指示する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、SV40由来のものが挙げられる（Sambro okら(1989)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual）。いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在するとき、より効率的に発現され得る。しかし、いくつかのcDNAは、スプライシングシグナル（スプライスドナーおよびアクセプター部位とも呼ばれる）を欠くベクターから効率的に発現されている（例えば、GethingおよびSambrook（1981）Nature 29 3:620を参照のこと）。イントロンは、スプライスドナーおよびアクセプター部位を含むコード配列内の介在非コード配列である。これらは、一次転写物のポリアデニル化後の「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Nevi ns（1983）Annu．Rev．Biochem．52:441；Green（1986）Annu．Rev．Genet．20: 671；Padgettら（1986）Annu．Rev．Biochem．55:1119；KrainerおよびManiatis （1988）「RNAスプライシング」Transcription and splicing(B.D．Hamesおよび D.M．Glover編)）。通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の成分は、発現構築物中にともに置かれる。エンハンサー、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所望であれば、発現構築物中に含まれ得る。発現構築物は、しばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主中での安定な維持が可能である染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持される。哺乳動物複製系は、複製するためにトランス作用因子を必要とする動物ウイルス由来のものを含む。例えば、SV40（Gluzman（1981）Cell 23:175）のようなパポバウイルスまたはポリオーマウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下で非常に高いコピー数に複製する。哺乳動物レプリコンの他の例は、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン-バー・ウイルスに由来するものを含む。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、したがって、例えば、発現のための哺乳動物細胞中ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主中で、維持されることが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例は、pMT2（Kaufmanら（1989）Mol．Cell．Blol．9:946）およびpHEBO（Shimizu ら（1986）Mol．Cell．Biol．6:1074）を含む。用いられる形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入の方法は当該分野において公知であり、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該分野において公知であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含み、これらには、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Hep G2）、および多くの他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。 ii ．バキュロウイルス系タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そしてそのベクター内の制御エレメントに作動可能に連結される。ベクター構築は、当該分野において公知の技法を用いる。一般に、発現系の成分としては、バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および異種遺伝子または発現される遺伝子の挿入のために好都合な制限部位の両方を含むトランスファーベクター（通常は細菌プラスミド）；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。トランスファーベクター中にタンパク質をコードするDNA配列を挿入した後、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムは、ベクターおよびウイルスゲノムが組換えを可能にされる昆虫宿主細胞中ヘトランスフェクトされる。パッケージされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークは同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Invitr ogen，San Diego CA からキットの形態(「MaxBac」キット)で市販されている。これらの技法は、当業者に一般的に公知であり、そしてSummersおよびSmith、Te xas Agricultural Experiment Station Bulletin、第1555号（1987）（以後「Su mmersおよびSmith」）に十分記載されている。タンパク質をコードするDNA配列をバキュロウイルスゲノム中に挿入する前に、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の成分は、通常、中間転移構築物（トランスファーベクター）に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；それが固有のセットの作動可能に連結された調節エレメントを有する複数の遺伝子；または、同じセットの調節エレメントにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主中での安定な維持を可能にする染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持される。レプリコンは複製系を有し、したがって、クローニングおよび増幅のために適切な宿主中に維持されることが可能である。現在、AcNPV中に外来遺伝子を導入するために最も普通に使用されるトランスファーベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらには、例えば、pVL985が挙げられる（これは、ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変え、そしてATTから32塩基対下流のBamHIクローニング部位を導入する；LuckowおよびSummers，Virology（1989）17:31を参照のこと）。プラスミドはまた、通常、ポリヘドロンポリアデニル化シグナル（Millerら(1 988)Ann．Rev．Microbiol.，42:177）ならびにE ．coliでの選択および増殖のための原核生物アンピシリン耐性（amp）遺伝子および複製起点を含む。バキュロウイルストランスファーベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼを結合し得、そしてmRNAへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（ 5'から3'）への転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーター、転写開始領域を有し、これは通常、コード配列の5'末端に対して近位に位置する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルストランスファーベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在するならば、通常、構造遺伝子に対して遠位である。発現は調節され得るかまたは構成的であり得るかのいずれかである。ウイルス感染サイクル中の後期に豊富に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする遺伝子（Friesenら(1986)「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」The Molecular Biology of Baculoviruses （Walter Doerfler編）；欧州特許公開公報第127 839号および第155 476号）；およびp10タンパク質をコードする遺伝子（Vlakら(1988)，J．Gen．Virol．69:765）由来の配列が挙げられる。適切なシグナル配列をコードするDNAは、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のような、分泌される昆虫またはバキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る（Carbonellら（1988）Gene，73:409）。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後改変（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されるようであり、そして、分泌および核蓄積に必要とされるシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されるようであるので、ヒトａ-インターフェロン（Maedaら(1985)，Na ture 315:592）；ヒトガストリン放出ペプチド（Lebacq-Verheydenら(1988)，Mo lec．Cell．Blol．8:3129）；ヒトIL-2（Smithら（1985）Proc．Nat'l．Acad．S ci．USA，82:8404）；マウスIL-3（Miyajimaら（1987）Gene 58:273）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Martinら（1988）DNA 7:99）をコードする遺伝子由来のリーダーのような非昆虫起源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供するために使用され得る。組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現され得、または適切な調節配列とともに発現されるならば、これらは分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常、ATG開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより成熟タンパク質から切断され得る。あるいは、天然に分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆虫での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を生成することによって、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは、通常、小胞体中へのタンパク質の輸送を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質の発現産物前駆体をコードするDNA配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主は、トランスファーベクターの異種DNAと野生型バキュロウイルスのゲノムDNAとで、通常は同時トランスフェクションによって、同時形質転換される。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常、バキュロウイルスゲノムの２〜５kbセクションを含む。バキュロウイルスの所望の部位中に異種DNAを導入する方法は、当該分野において公知である。（SummersおよびSmith ；Juら（1987）；Smithら，Mol．Cell．Biol．（1983）3:2156；ならびにLuckow およびSummers(1989)を参照のこと）。例えば、挿入は、相同な二重交差組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中へ行われ得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位中へ行われ得る（Mill erら（1989）Bioessays 4:91）。発現ベクター中でポリヘドリン遺伝子の代わりにクローニングされる場合、DN A配列は、ポリヘドリン特異的配列が5'および3'側の両方に隣接し、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に配置される。新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、続いて、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージされる。相同組換えは低い頻度で生じる（約１％と約５％との間）；したがって、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大多数は、まだ野生型ウイルスである。したがって、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。発現系の利点は、組換えウイルスの区別を可能にする可視スクリーニングである。元のままのウイルスにより産生されるポリヘドリンタンパク質は、ウイルス感染後の遅い時期に感染された細胞の核中で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリヘドリンタンパク質は、包埋された粒子も含む吸蔵体（occlusion body）を形成する。これらの吸蔵体は、15mmまでのサイズであり、高い屈折力があり、光学顕微鏡下で容易に可視化される明るく光る外観を与える。組換えウイルスに感染された細胞は吸蔵体を欠く。組換えウイルスを野生型ウイルスと区別するために、トランスフェクション上清は、当業者に公知の技法により昆虫細胞の単層上にプラークされる。すなわち、プラークは、吸蔵体の存在（野生型ウイルスを示す）または不在（組換えウイルスを示す）について光学顕微鏡下でスクリーニングされる。「Current Protocols in Mic robiology」第２巻（Ausubelら編）16.8（1990年10月増刊）；SummersおよびSmi th；Millerら(1989)。組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞中への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下について開発されている：Aedes aegypti、Autogrpha californica、Bombyx mori、Drosoph ila melanogaster 、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia ni（PCT公開公報第WO 89/046699号；Carbonellら（1985）J．Virol．56:153；Wright（1986 ）Nature 321:718；Smithら（1983）Mol．Cell．Biol．3:2156；および、一般的に、Fraserら（1989）In Vitro Cell．Dev．Biol．25:225を参照のこと）。細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接および融合発現の両方のために市販されている；細胞培養技術は当業者に一般的に公知である。例えば、SummersおよびSmithを参照のこと。次いで、改変された昆虫細胞は、適切な栄養培地中で増殖され得、これは、改変された昆虫細胞中に存在するプラスミドの安定な維持を可能にする。発現産物遺伝子が誘導性制御下にある場合、宿主は高密度に増殖され得、そして発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、産物は培地中に連続して発現され、そして栄養培地は、目的の産物を取り出し、そして枯渇した栄養を追加しながら、連続的に循環されなければならない。産物は、クロマトグラフィー（例えば、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技法により精製され得る。適切には、産物は、必要に応じて、培地にまた分泌されるかまたは昆虫細胞の溶解から生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去するために、宿主のデブリ（例えば、タンパク質、脂質、および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を提供するために、さらに精製され得る。タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、条件は、当該分野において公知であることに基づいて、当業者に容易に確認され得る。 iii ．細菌系細菌発現技法は当該分野において公知である。細菌プロモーターは、細菌RNA ポリメラーゼを結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流(3') のmRNAへの転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、コード配列の5'末端に対して近位に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有し得、このドメインは、RNA合成が始まる隣接したRNAポリメラーゼ結合部位にオーバーラップし得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターを結合し得、それにより特定の遺伝子の転写を阻害するので、オペレーターは、ネガティブに調節された（誘導性）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのようなネガティブ調節エレメントの不在下で生じ得る。さらに、ポジティブ調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得る。この配列は、存在する場合、通常RN Aポリメラーゼ結合配列の近位（5'）にある。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（CAP）であり、これは、E ．co li におけるlacオペロンの転写の開始を助ける（Raibaudら（1984）Annu．Rev．G enet．18:173）。したがって、調節された発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それにより転写を増強するかまたは減少するかのいずれかである。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（lac）（Changら（1977）Nature 198:1 056）、およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。他の例としては、トリプトファン（trp）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる（Goeddelら（1980）Nuc．Acids Res．8:4057；Yelve rtonら（1981）Nucl．Acids Res．9:731；米国特許第4,738,921号；欧州特許公開公報第036 776号および第121 775号）。β-グラコタマーゼ（bla）プロモーター系（Weissmann（1981）「インターフェロンのクローニングおよび他の間違い」Interferon 3(I．Gresser編)）、バクテリオファージλPL（Shimatakeら（198 1）Nature 292:128）、およびT5（米国特許第4,689,406号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。さらに、天然に生じない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成される（米国特許第4,551,433号）。例えば、tacプロモーターは、lacリプレッサーにより調節される、trpプロモーターおよびlacオペロンの両方の配列を含むハイブリッドtrp-lacプロモーターである（Amannら（1983）Gene 25:167；de Boerら(1 983)Proc．Natl．Acad．Sci．80:21）。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNA ポリメラーゼを結合して転写を開始するための能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合可能なRNAポリメラーゼとカップリングされて、原核細胞中でいくつかの遺伝子の高レベル発現を生じ得る。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ／プロモーター系は、カップリングされたプロモーター系の例である（Studier ら（1986）J．Mol．Blol．189:113；Taborら（1985）Proc Natl．Acad．Sci．82 :1074）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびE ．coliオペレーター領域を含み得る（欧州特許公開公報第267 8 51号）。機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位もまた、原核細胞中での外来遺伝子の発現に有用である。E ．coliにおいて、リボソーム結合部位はシャイン-ダルガルノ（SD）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ATG）および開始コドンの３〜11ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Shineら（1975）Nature 254:34）。SD配列は、SD配列とE ．coli 16S rRNAの3'末端との間の塩基を対にすることにより、mRNAのリボソームへの結合を促進すると考えられる（Steitzら（1979）「メッセンジャーRNA中の遺伝子シグナルおよびヌクレオチド配列」Biological Regulation and Development: Gene Expression (R.F．Goldberger編)）。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させるためには、Sambrookら(1989)，Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual 。 DNA分子は細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、DNA分子と直接的に連結され得、その場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、これは ATG開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、あるいは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションにより、タンパク質から切断され得る（欧州特許公開公報第219 237号）。融合タンパク質は直接発現の代替物を提供する。通常、内因性細菌タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするDNA配列は、異種コード配列の5'末端に融合される。発現時、この構築物は２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5'末端で連結され、そして細菌中で発現され得る。得られる融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するために、プロセシング酵素（第Xa因子）部位を保持する（Nagaiら（1984）Nature 309:810）。融合タンパク質はまた、lacZ（Jiaら（1987）Gene 60:197）、trpE（Allenら（1 987）J.Biotechnol．5:93；Makoffら（1989）J．Gen．Microbiol．135:11；および欧州特許公開公報第 324 647号）遺伝子由来の配列を用いて作成され得る。２つのアミノ酸配列の接合点のDNA配列は、切断可能部位をコードしてもしなくても良い。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するために、好ましくは、プロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）部位を保持するユビキチン領域を用いて作成される。この方法によって、元のままの外来タンパク質が単離され得る（Millerら（1989）Bio/Technology 7:698）。あるいは、外来タンパク質はまた、細菌において外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を生成することによって、細胞から分泌され得る（米国特許第4,336,3 36号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中（グラム陽性菌）、あるいは細胞の内膜と外膜との間に位置する周辺腔中（グラム陰性菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされ、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、プロセシング部位がある。適切なシグナル配列をコードするDNAは、E ．coli外膜タンパク質遺伝子（ompA ）（Masuiら（1983）Experimental Manipulation of Gene Expression；Ghrayeb ら（1984）EMBO J．3:2437）、およびE ．coliアルカリホスファターゼシグナル配列（phoA）（Okaら（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．82:7212）のような、分泌される細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。他の例としては、種々のBacill us 株由来のα-アミラーゼ遺伝子のシグナル配列が、B．subtilisから異種タンパク質を分泌させるために使用され得る（Palvaら（1982）Proc．Natl．Acad．Sci ． USA 79:5582；欧州特許公開公報第244 042号）。通常、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの3'側に位置する調節領域であり、そして従ってプロモーターとともにコード配列に隣接する。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を指示する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る約50ヌクレオチドのDNA配列を含む。例としては、E．coli中のtrp 遺伝子ならびに他の生合成遺伝子のような、強いプロモーターを有する遺伝子に由来する転写終結配列が挙げられる。通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の成分は、発現構築物中に一緒に置かれる。発現構築物は、しばしば、細菌のような宿主中の安定な維持を可能にする染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持される。レプリコンは、複製系を有し、したがって、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために原核生物宿主中で維持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５〜約200、および通常約10〜150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約10 、およびより好ましくは少なくとも約20のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数のいずれかのベクターは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の影響に依存して、選択され得る。あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いてに細菌ゲノム中に組み込まれ得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組み込むことを可能にする細菌の染色体に相同な少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクター中の相同DNA と細菌染色体との間の組換えにより生じるようである。例えば、種々のBacillus 株由来のDNAで構築された組込みベクターは、Bacillus染色体中に組み込む（欧州特許公開公報第127 328号）。組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、細菌宿主で発現され得、そして細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬物に耐性にする遺伝子を含み得る。Daviesら（1978）Annu．Rev．Microbiol．32:469。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路におけるような生合成遺伝子を含み得る。あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクター中に一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクター中で開発されるかのいずれかである選択マーカーを含む。発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかであり、多くの細菌における形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の細菌について開発されている：Bacillus subtilis 、Palvら（1982）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:5582；欧州特許公開公報第036 259号および第063 953号；PCT公開公報第WO 84/04541号；E ．coli 、Shimatakeら（1981）Nature 292:128；Amannら（1985）Gene 40:183；Studier ら(1986)J．Mol．Biol．189:113；欧州特許公開公報第036 776号、第136 829号、および第136 907号；Streptococcus cremoris、Powellら（1988）Appl．Envir on． Microbiol．54:655；Streptococcus lividans、Powellら（1988）Appl．En viron．Microbiol．54:655；およびStreptomyce lividans、米国特許第4,745,05 6号。細菌宿主中へ外因性DNAを導入する方法は当該分野において周知であり、そして通常、CaCl₂、または二価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤で処理された細菌の形質転換のいずれかを含む。DNAはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞中に導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌種により変化する。例えば、Bacillusについては、Massonら（1989）FEMS Mocrobiol． Lett．60:273；Palvaら（1982）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:5582；欧州特許公開公報第036 259号および第063 953号；PCT公開公報第WO 84/04541号：Camp ylobacter については、Millerら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．85:856；Wang ら（1990）J．Bacteriol．172:949：Escherichiaについては、Cohenら（1973）P roc．Natl．Acad．Sci．69:2110；Dowerら（1988）Nucleic Acids Res．16:6127 ；Kushner（1978）「ColEl由来のプラスミドでのE ．coliの形質転換の改良方法」Genetic Engineering:Proceedings of the International Symposium on Gene tic Engineering (H.W．BoyerおよびS．Nicosia編)；Mandelら（1970）J．Mol．B iol．53:159；Taketo（1988）Biochim．Biophys．Acta 949:318：Lactobacillus については、Chassyら（1987）FEMS Microbiol．Lett．44:173：Pseudomononas については、Fiedlerら（1988）Anal．Biochem 170:38：Staphylococcusについては、Augustinら（1990）FEMS Microbiol．Lett．66:203：Streptococcusについては、Baranyら（1980）J．Bacteriol．144:698；Harlander（1987）「エレクトロポレーションによるStreptococcus lactisの形質転換」Streptococccal Gen etics(J．FerrettiおよびR．Curtiss III編)；Perryら（1981）Infec．Immun．3 2:1295；Powellら（1988）Appl．Environ．Microbiol．54:655；Somkutiら（198 7）Proc．4th Evr．Cong．Biotechnology 1:412を参照のこと。 iv ．酵母発現酵母発現系もまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（3'）のmRNAへの転写を開始することが可能な任意のDNA配列である。プロモーターは、通常コード配列の5'末端の近位に配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位（「TATAボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流活性化配列（UAS）と呼ばれる第２のドメインを有し得、存在するならば、これは通常、構造遺伝子の遠位である。UASは、調節された（誘導性）発現を可能にする。構成的発現は、UASの不在下で生じる。調節された発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それにより転写を増強するかまたは減少するかのいずれかである。酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、したがって、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーターを提供する。例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）（欧州特許公開公報第284 044号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPまたはGAPDH）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ PyK）（欧州特許公開公報第329 203号）が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子もまた有用なプロモーター配列を提供する（Myanohara ら（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:1）。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのUAS配列は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域に接合され、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域に連結されたADH調節配列が挙げられる（米国特許第4,876,197号および米国特許第4,88 0,734号）。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わされた、ADH2、GAL4、GAL10、またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる（欧州特許公開公報第164 556号）。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、特に、Cohenら（1980 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:1078；Henikoffら（1981）Nature 283:835； Hollenbergら（1981）Curr．Topics Microbiol．Immunol．96:119；Hollenberg ら（1979）「酵母Saccharomyces cerevisiaeの細菌性抗生物質耐性遺伝子の発現」Plasmids of Medical ，Environmental and Commercial Importance(K.N．Timm isおよびA．Puhler編)；Mercerau-Puigalonら（1980）Gene 11:163；Panthierら (1980)Curr．Genet．2:109が挙げられる。 DNA分子は、酵母の細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、DNA配列に直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、これはATG開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは臭化シアンとのインビトロインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。融合タンパク質は、哺乳動物系、バキュロウイルス系、および細菌発現系における場合と同様の酵母発現系の代替物を提供する。通常、外因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするDNA配列は、異種コード配列の5'末端に融合される。発現時、この構築物は２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）遺伝子は、外来遺伝子の5'末端に連結され、そして酵母で発現され得る。２つのアミノ酸配列の結合点でのDNA配列は、切断可能部位をコードしてもよくまたはコードしなくてもよい。例えば、欧州特許第196 056号を参照のこと。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するために、好ましくは、プロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）の部位を保持するユビキチン領域を用いて作製される。従って、この方法によって、元のままの外来タンパク質が単離され得る（例えば、PCT公開公報第WO 88/024066号を参照のこと）。あるいは、外来タンパク質はまた、酵母中で外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製することによって、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされ、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、プロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするDNAは、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開公報第012 873号；日本特許公開公報第62,096,086号）およびA-因子遺伝子（米国特許第4,588,684号）のような、分泌される酵母タンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存在して、酵母における分泌をまた提供する（欧州特許公開公報第060 057 号）。分泌リーダーの好ましいクラスは、「プレ」シグナル配列および「プロ」領域の両方を含む、酵母α-ファクター遺伝子のフラグメントを用いるものである。用いられ得るα-ファクターフラグメントのタイプは、全長のプレプロαファクターリーダー（約83アミノ酸残基）ならびに短縮型α-ファクターリーダー（通常、約25〜約50アミノ酸残基）を含む（米国特許第4,546,083号および米国特許第4,870,008号；欧州特許公開公報第324 274号）。分泌を提供するα-ファクターリーダーフラグメントを用いる他のリーダーは、第１の酵母のプレ配列だけでなく、第２の酵母αファクター由来のプロ領域を用いて作製されたハイブリッド α-ファクターリーダーを含む。（例えば、PCT公開公報第WO 89/02463号を参照のこと）。通常、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの3'に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコード配列に隣接する。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を指示する。転写終結配列および他の酵母が認識する終結配列の例は、解糖酵素をコードするものである。通常、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の成分は、発現構築物中に一緒に置かれる。発現構築物は、しばしば、酵母または細菌のような宿主中の安定な維持を可能にする染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中に維持される。レプリコンは、２つの複製系を有し得、したがって、発現については酵母中で、およびクローニングおよび増幅については原核生物宿主中で維持されることを可能にする。このような酵母-細菌シャトルベクターの例としては、YEp24（Botsteinら（1979）Gene 8:17-24）；pCl/1（Brakeら（1984）Proc．Natl．Acad．Sci USA8 1:4642-4646）；およびYRp17（Stinchcombら（1982）J．Mol．Blol．158:157）が挙げられる。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５〜約200、および通常約10〜150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約10、およびより好ましくは少なくとも約20プラスミドを有する。高コピー数または低コピー数のベクターは、宿主に対するベクターおよび外来遺伝子の影響に依存して、選択され得る。あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノム中に組み込まれ得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組み込むことを可能にする酵母の染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組込みは、ベクター中の相同DNAと酵母染色体との間の組換えにより生じるようである（Orr-Weaverら（1983）Methods in Enzym ol．101:228-245）。組込みベクターは、ベクター中の封入について適切な相同配列を選択することにより、酵母における特定の遺伝子座へ指向され得る。１つまたはそれより多い発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生された組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Rineら（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:6750）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中の単一のセグメント（これは完全なベクターの組込みを生じる）として、あるいは、染色体中の近接するセグメントに相同であり、そしてベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメント（これは発現構築物のみの安定な組込みを生じ得る）としてのいずれかで、生じ得る。通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およびALG7のような酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、ならびにG418耐性遺伝子を含み得、これらは酵母細胞においてそれぞれ、ツニカマイシンおよびG418 への耐性を与える。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、CUP1の存在は、銅イオンの存在下での酵母の増殖を可能にする（Buttら（1987）Microbiol．Rev ．51:351）。あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクター中に一緒に置かれ得る。形質転換ベクターは、通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクター中で開発されるかのいずれかである選択マーカーを含む。発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかであり、多くの酵母における形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の酵母について開発されている：Candida albicans ，Kurtzら（1986）Mol．Cell．Biol．6:142；Candida maltosa，Kunze ら(1985)J．Basic Microbiol．25:141；Hansenula polymorpha、Gleesonら（198 8）J．Gen．Microbiol．132:3459；Roggenkampら（1986）Mol．Gen．Genet．202 :302；Kluyveromyces fragilis、Dasら（1984）J．Bacteriol．158:1165；Kluy veromyces lactis 、De Louvencourtら（1983）J．Bacteriol．154:737；Van den Bergら（1990）Bio/Technology 8:135；Pichia guillerimondii、Kunzeら（198 5）J．Basic Microbiol．25:141；Pichia pastoris、Creggら（1985）Mol．Cell ．Biol．5:3376；米国特許第4,837,148号および米国特許第4,929,555号；Saccha romyces cerevisiae 、Hinnenら（1978）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929； Itoら（1983）J．Bacteriol．153:163；Schizosaccharomyces pombe、Beachら（ 1981）Nature 300:706；およびYarrowia lipolytica、Davidowら（1985）Curr． Genet．10:380471；Gaillardinら（1985）Curr．Genet．10:49。酵母宿主中へ外因性DNAを導入する方法は当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオンで処理した完全な酵母細胞の形質転換のいずれかを含む。形質転換手順は、通常、形質転換される酵母種で変化する。例えば、Candidaについては、Kurtzら（1986）Mol．Cell．B iol．6:142；Kunzeら（1985）J．Basic Microbiol．25:141；Hansenulaについては、Gleesonら（1986）J．Gen．Microbioy．132:3459；Roggenkampら（1986）Mo l．Gen．Genet．202:302；Kluyveromycesについては、Dasら（1984）J．Bacteri ol．158:1165；De Louvencourtら（1983）J．Bacteriol．154:1165；Van den Be rgら（1990）Bio/Technology 8:135；Pichiaについては、Creggら（1985）Mol． Cell．Biol．5:3376；Kunzeら（1985）J．Basic Microbiol．25:141；米国特許第4,837,148号および米国特許第4,929,555号；Saccharomycesについては、Hinne nら（1978）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929；Itoら（1983）J．Bacteriol ．153:163；Schizosaccharomycesについては、Beachら（1981）Nature 300:706 ；Yarrowlaについては、Davidowら（1985）Curr．Genet．10:39；Gaillardinら（1985）Curr．Genet．10:49を参照のこと。Ｅ．ワクチン CagI領域（ならびにポリヌクレオチドワクチンの形態でそれ自体の領域由来の DNA）によりコードされるタンパク質は、単独のワクチン候補物として、あるいは１つ以上の他の抗原と組み合わせて使用され得、後者は、H ．pyloriまたは他の病原性供給源のいずれかに由来する。好ましくは、「カクテル」ワクチンは、例えば、サイトトキシン（CTまたはVacA）抗原、CagAタンパク質、およびウレアーゼを含む。さらに、hspは１つ以上のこれらの成分に添加され得る。これらのワクチンは、予防的（感染を防ぐこと）または治療的（感染後の疾患を処置すること）のいずれかであり得る。このようなワクチンは、１または複数のH ．pylori抗原を、通常は「薬学的に受容可能なキャリア」と組み合わせて含み、これには、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソームのような）、および不活性ウイルス粒子のような、大きな、ゆっくり代謝される巨大分子である。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラ、H ．pylori、などの病原体由来のトキソイドのような細菌トキソイドに結合され得る。組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントには、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：(1)アルミニウム塩（Alum）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；(2)水中油型乳化処方物（他の特定のムラミルペプチド（以下を参照のこと）のような免疫刺激薬剤または細菌細胞壁成分を含むまたは含まない）、例えば、(a)MF59（およびPCT公開公報第WO 90/14837号に記載された他のサブミクロン水中油型乳剤）、これは、Model 110Yマイクロフルイダイザー（Microfluidics、Newton、MA）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子中に処方された、５％スクアレン、0.5％ Tween 80、および0.5％ Span 85（必要ではないが、種々の量のMTP-PE（以下を参照こと）を任意に含む）を含む、(b)SAF、これは、サブミクロン乳剤中に微流動化されるか、またはより大きな粒子サイズの乳剤を生成するためにボルテックス撹拌されるかいずれかで、10％スクワラン、0.4％ Tween 80、５％プルロニックブロックされたポリマーL 121、およびthr-MDP（以下を参照のこと）を含む、ならびに(c)Ribi^TMアジュバントシステム（RAS）（Ribi Imm unochem、Hamilton，MT）、これは、２％スクアレン、0.2％ Tween 80、および、モノホスホリリピドＡ（MPL）、トレハロースジミコレート（TDM）、および細胞壁骨格（CWS）、好ましくはMPL＋CWS（Detox^TM）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含む；(3)サポニンアジュバント、例えば、Stimulon^TM（Cambrid ge Bioscience、Worcester、MA）が用いられるか、またはISCOM（免疫刺激複合体）のようなそれから生成された粒子；(4)完全フロイントアジュバント（CFA）および不完全フロイントアジュバント（IFA）；(5)サイトカイン、例えば、インターロイキン（IL-1、IL-2など）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）など；および(6)組成物の有効性を増強するための免疫刺激薬剤として作用する他の物質。AlumおよびMF59が好ましい。上記のように、ムラミルペプチドとしては、以下を含むが、これらに限定されない：N-アセチルームラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N- アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（MTP-PE）など。免疫原性組成物（例えば、抗原またはポリヌクレオチド、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希釈剤を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的には、免疫原性組成物は、液体の溶液としてまたは懸濁液としてのいずれかの、注入可能なように調製される；注入前の液体ビヒクルの溶液にまたは懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアのもとで上記のように、乳化され得るかまたは増強されたアジュバント効果のためのリポソーム中にカプセル化され得る。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性ポリペプチドまたはヌクレオチド、ならびに、必要に応じて、他の任意の上記の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、個体への単回用量または系の一部としての量のいずれかでの量の投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方、医学的状況の処置する医師の評価、および他の関連要因に依存して、変化する。この量は日常的な試行によって決定され得る比較的広い範囲にあることが期待される。免疫原性組成物は、従来、例えば、皮下または筋肉内のいずれかの注入により、非経口で投与される。他の様式の投与に適切な他の処方物には、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮塗布剤が挙げられる。経口処方物は、H ．pylor i タンパク質について最も好ましい。投与量の処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。Ｆ．免疫診断アッセイ CagI領域によりコードされるH ．pylori抗原は、抗体レベルを検出するためにイムノアッセイに使用され得（または、逆に、H ．pylori抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る）、そして、胃十二指腸の疾患、特に十二指腸潰瘍について相関づけられ得る。十分に定義された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、現在使用される侵襲的診断方法を代えるために開発され得る。例えば、血液または血清試料を含む生物学的試料内のH ．pyloriタンパク質に対する抗体が検出され得る。イムノアッセイの設計は、非常に多くの変化を受け、そしてこれらの多くが当該分野で公知である。イムノアッセイのためのプロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、または免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み；標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびにELISAアッセイのような酵素標識および媒介イムノアッセイである。免疫診断に適切であり適切な標識された試薬を含むキットは、適切な材料をパッキングすることにより構築され、これは、適切な容器中に、本発明の組成物を、アッセイの実行に必要な残りの試薬および材料（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびにアッセイの指示書の適切なセットとともに含む。Ｇ．実施例以下に示す実施例は、当業者にさらなる指針として提供され、そしていかなるようにも本発明を限定すると解釈されるべきではない。１．材料および方法ａ．H ．pyloriの増殖およびDNAの単離 H.pylori株を、Oxoid（Basingstoke、England）またはBecton and Dickinson （Cockeysville，MD）ガスパック生成機を用いる微好気性雰囲気で、または５％ CO₂を補充した空気を含むインキュベーターでの両方において、37℃にて３日間、固体または液体培地中で培養し得る（26）。細菌を採集し、そして100マイクログラム/mlの最終濃度でリゾチームを含むSTE（NaCl 0.1M、Tris-HCl 10mM pH 8、EDTA 1mM pH 8）中に再懸濁し、そして室温にて５分間インキュベートし得る。細菌を溶解するために、SDSを添加して最終濃度１％にし、そして65℃に加熱し得る。25マイクログラム/mlの最終濃度でのプロテイナーゼＫの添加後、溶液を50℃にて２時間インキュベートし得る。DNAを、臭化エチジウムの存在下でCsC lグラジエントにより精製し、77％エタノールで沈殿させ、そしてシールされたガラスキャピラリーにより回収し得る。ｂ．λgt11発現ライブラリーの構築およびスクリーニング λgt11発現ライブラリーを生成するために、制限酵素で部分消化したCCUG 178 74株からのゲノムDNAを使用し得る。0.8％アガロースゲル上での分画後、0.6と8 Kbとの間のサイズのDNAを、Costar Spin-X（0.22ミクロン）微量遠心分離フィルターを使用して溶出し得る。各消化からの産物を組み合わせて、λgt11クローニングシステムキット（Bethesda Research Laboratories）およびGigapack II Go ldパッケージングキット（Stratagene，La Jolla、CA）を用いて、発現ライブラリーを構築するために使用し得る。ｃ．クローニング EcoRIおよびHindIIIで消化したCCUG 17874株からのH ．pyloriDNAの重複ライブラリーを用いて、ベクターBluscript SK+中にクローニングされた、CagI領域の全長コピーを含む、H ．pylori染色体の31,000以上の塩基をカバーする隣接するクローンを同定した。ランダムトランスポゾン変異誘発および種々のサブクローン中のad hoc欠失を用いて、表現型改変体を対立遺伝子交換により産生した。図１に見られ得るように、プラスミドライブラリーから生成された４つのクローン、E64（14,500塩基）、H12（4000塩基）、5B（7800塩基）、および11.1A（5 900塩基）は、完全なCagI領域を含み、そしてこれらの４つのクローンはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託されている（以下を参照のこと）。これらのクローンは、CagA領域が重複している（CagAの配列についてはPC T公開公報第WO 93/18150号を参照のこと）。図１で１、２、および３と命名された配列を調べると、以下が注目される：配列１（10299塩基）は、CagAの3'末端、完全なCagA遺伝子、およびCagIの一部を含む。この配列はヌクレオチド１で始まり、そしてヌクレオチド10299で終わる。この領域内で、ヌクレオチド4909から10299はCagA遺伝子座である。ヌクレオチド１から4908はCagIの3'末端である。配列２（5599塩基）はヌクレオチド１で始まり、そして5599で終わる；配列２のヌクレオチド5599と配列１のヌクレオチド１との間に400塩基対の小さなギャップがある。配列３（1529塩基）はヌクレオチド１で始まり、そして1529で終わる。また、配列３のヌクレオチド1529と配列２のヌクレオチド１との間に400塩基対の小さなギャップがある。配列１、２、および３を集めることにより、CagI 領域は5'末端から3'末端までがカバーされる。さらに、図３はCagI遺伝子座（19 ,932塩基対）の完全ヌクレオチド配列であり、CagIの真の5'末端を含み、クローンE64中に含まれ、これは配列３の初めから約2500塩基上流である。ｄ．配列決定重複クローンのヌクレオチド配列を、ネストされた（nested）欠失およびプライマーウォーキングを用いて手動および自動化配列決定によって決定した。得られたデータを、並列スーパーコンピュータで実行するWisconsin Genetic Group パッケージを用いてコンピュータ分析に供した。図２および３は、CagI領域のヌクレオチドおよび推定のアミノ酸配列を示す。ｅ．CagI領域の構造 CagI領域は、種々の極性で、推定のオープンリーディングフレーム（ORF）の集団を含む。図４は、この領域についての推定のオープンリーディングフレーム（ORF）および公知のタンパク質との相同性を示す。これらのORFのいくつかが、Bordetella pertussis のptl遺伝子およびAgrobacterium tumefaciensのVIR B4遺伝子に対して相同性を有する、そしてSalmonella遺伝子の提唱された侵入因子に共有されるモチーフを有するタンパク質のための、輸出分子をコードし得ることが、仮定される。種々のフレームシフトについての推定のアミノ酸配列を、図２および４に示す。ｆ．ハイブリダイゼーションすべてのクローンを、H ．pyloriの44の十分に特徴付けされた臨床的単離物から単離されたDNAのサザンブロッティングによりテストした。CagI領域に位置する隣接するフラグメントは、H ．pyloriのすべてのＩ型株で相同配列を認識し得たが、H ．pyloriのII型株からのDNAとハイブリダイズしなかった。CagI領域の5' -および3'-末端の両方に存在する約120塩基対DNAセグメント（「MAK」）が、Ｉ型およびII型H ．pylori細菌の進化的分化を説明し得る可能性がある。Ｈ．生物学的材料の寄託以下の材料を、特許手続きの目的ための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC ）、12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland、電話(301)231-5519に、1995 年4月7日に寄託した。 ATCC No．69781 プラスミド11.1A（CMCC#4411）を含むE ．coli宿主株TG1； ATCC No．69782 プラスミド5B（CMCC#4412）を含むE ．coli宿主株TG1； ATCC No．69783 プラスミドH12（CMCC#4413）を含むE ．coli宿主株TG1；および ATCC No．69784 プラスミドE64（CMCC#4421）を含むE ．coli宿主株DH10B。これらの寄託物は、当業者に便利なように提供され、そして寄託が米国特許法第112条により必要とされる承認ではない。これらの寄託物の核酸配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用され、そして寄託物の配列と比較して、本明細書に記載された配列の何らかの誤りがある場合に参照されるべきである。寄託された物質を作製し、使用し、または販売するためにはライセンスが必要であり得、そしてこのようなライセンスは本明細書により与えられない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/569 33/569 Ｆ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．８またはそれより多くのヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む組成物であって、該ポリヌクレオチドが、単離されたHelicobacter pylori CagIポリヌクレオチド（配列番号25）またはその相補物とハイブリダイズする、組成物。２．プローブを含む組成物であって、該プローブが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。３．核酸診断キットを含む組成物であって、該核酸診断キットが請求項２に記載のプローブを含む、組成物。４．ワクチンを含む組成物であって、該ワクチンが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。５．ベクターを含む組成物であって、該ベクターが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。６．請求項５に記載のベクターで形質転換した宿主細胞を含む組成物。７．Helicobacter pylori CagIポリヌクレオチド（配列番号25）によりコードされる精製されたタンパク質、またはその少なくとも８つの隣接するアミノ酸を含むフラグメントを含む組成物。８．前記タンパク質が組換えにより産生される、請求項７に記載の組成物。９．前記タンパク質が標識されるかまたは固体支持体にカップリングされる、請求項８に記載の組成物。１０．免疫診断キットを含む組成物であって、該免疫診断キットが請求項９に記載のタンパク質を含む、組成物。１１．ワクチンを含む組成物であって、該ワクチンが請求項７に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。１２．アジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。１３．請求項７に記載のタンパク質と薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程を包含する、H．pyloriワクチンを調製する方法。１４．請求項７に記載のタンパク質と生物学的試料とを接触させる工程、および抗体−抗原複合体を検出する工程を包含する、H．pyloriを診断する方法。１５．請求項２に記載のプローブと生物学的試料とを接触させる工程、および標的配列とのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する、H．pyloriを診断する方法。１６．請求項２に記載のプローブと生物学的試料とを接触させる工程、および標的配列とのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する、H．pyloriの病原性Ｉ型株を診断する方法。１７．請求項１１に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、H．pylor iに感染した個体を処置する方法。１８．請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程、および組換えポリペプチドを単離する工程を包含する、H．pyloriタンパク質を組換えにより産生する方法。