JPH07507447A - 異種の免疫刺激ドメインをその配列内に含む組換え抗原−ワクチンとしてのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 異種の免疫刺激ドメインをその配列内に含む組換え抗原−ワクチンとしてのその 使用 産業上の利用分野 本発明は、改善された免疫原性を発現する、ワクチンとして用いられる組換えペ プチド抗原に関する。抗原は、組換え抗原のペプチド配列内に挿入された免疫刺 激ドメインを含む。

発明の背景 生物の免疫応答を刺激するペプチド抗原の効能は、アジユバントを抗原と共に投 与することによってかなり向上することが証明されている。

インビボにおいて効果的な保護免疫を付与するのに不十分な抗体応答を刺激する 特定の抗原の免疫原性が低いことが、このような需要の誘因となっている。

良好でない免疫原性は、残念ながら、人間および動物の予防接種に将来有望視さ れている組換え抗原の特徴である（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、　１９９２、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｔｏ、７６３）　、従って、抗原性を引き上げ、ワクチ ンにおける効能を向上させ得る組換え抗原と組み合わせて用いられ得るアジユバ ントが要求されている。

ペプチド抗原の抗原性を増強する多数のアジユバントが当該分野で公知である。

最も一般的に用いられているアジュバントの１つに、水相に抗原が加えられる油 中水型エマルジ。

ンであるフロイント不完全アジュバントがある。このエマルジョンは、生体内で は耐分散性であり、抗原を徐々に放出するように機能するため、抗原の長期間の 刺激が可能である。

死滅細菌材料を加えると、マクロファージを刺激することによりアジュバント活 性を増強し、抗原に対する免疫系の応答を増強する因子が生成される。例えば、 熱殺菌された如ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（結核菌）は 、フロイント完全アジュバントに含まれる。

残念なことに、フロインドアジュバントは、多数の周知の副作用を有しているた め、人間に使用するには適切ではない。

人間の予防接種に認められているアルミニウム塩などの他のアジユバントは、効 能が低く、望ましくない副作用がある（Ｐｉｎｅａｕら、１９９２年、Ｔｏｘｉ ｃｏｌｏｇｙ、　７３．１１７）。

米国特許第４．６０６．９１８号に開示されているＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ −スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）　、Ｎ−アセチル−ノル ムラミルーし一アラニルーＤ−イソグルタミニ／　（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ −アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２ −（１°−２°ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオ キシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）のようなムラミルジペプチド（ＭＤＰ） 　ＩＮ導体を含む新世代のアジュバントが現在、人間に使用するために研究され ている。

組換え抗原に対する免疫応答を増強するための可能なアブローチの１つとして、 免疫応答の天然刺激因子であるインターロイキンｌまたは腫瘍壊死因子αなどの 免疫刺激サイトカインを用いることが挙げられる。しかし、このような作用物質 は、毒性が強く、前炎症（ｐｒｏｉｎＮａｗ＋ｅａｔｏｒｙ）作用を有すること が周知であり、このため、人間への実際的な適用は限定されている（　５ｔａｒ ｕｃｈおよびＷｏｏｄ、　１９８３年、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３０゜２１ ９１−２１９４ＨＧｈｉａｒａら、　１９８７年、　Ｊ、１ｉｎｕｎｏ１．、　 １３９．　３６７６−３６７９ＨＲｅｅｄら、１９８９年、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、１４２．２０６？−２０７１）。

免疫刺激サイトカインの副作用によって生じる問題を解決するために、有害な特 性を有さない、それらの単離されたフラグメントの使用が提案されている。特に 、そのペプチドの免疫刺激特性を有するが、その毒性、炎症性または発熱性活性 を有さないＩＬ−１βのドメインを含むと思われるヒトＩＬ−１βのフラグメン トが同定されている（Ａｎｔｏｎｉら、１９８６年、Ｊ、　１ｍに位置する／ナ ペプチドＶＱＧＥＥＳＮＤに（Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）内に含まれている。

このノナペプチドは、抗原と混合して（Ｔａｇｌ　１ａｂｕｅら、１９８９年、 Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、、　Ｐ−、３１１−３１５）　、および抗原性 ペプチドの末端と結合して（ＲａｏおよびＮａｙａｋ、　１９９０年、ＰＮＡＳ ％８７．５５１９−５５２２）　、免疫原性の低い抗原（Ｎｅｎｃ　ｉｏｎ　ｉ ら、１９８７年、Ｊ。

として提案されている。

組換えワクチンと混合して免疫刺激ペプチドを用いることは非常に有望である見 られているが、特にアジュバントが、ＩＬ−１βノナペプチドの場合のように、 組換え工程から得られるならば、組換え抗原にアジュバントを加えると不利な点 が生じ続ける。例えば、ＩＬ−１β由来の７ナベブチドは、インビボにおいて非 常に短い半減期を有し得、そのことによりその有用性が限定され、または非常に 高濃度での使用が必要とされる（Ｐｅｓｓｉｎａら、１９９０年、Ｌｙｍｐｈｏ ｋｉｎｅ　ｒｅｓ、、　９．　３７１）　ａ　さらに、抗原およびアジュバント を混合するにはさらなる処理工程が含まれ、アジュバントが組換え生産されるな らば、抗原生産工程およびアジニバント生産工程の両方において規制認可が得ら れなければならない。これにより、ワクチンの生産コストが非常に高くなるため 、発展途上国用のワクチンの場合にはまず第１にこのことが考慮され得る。

さらに、ＲａｏおよびＮａｙａｋ　（上述）の工程は、一端にＶＱＧＥＥＳＮＤ Ｋペプチドを含む小さな合成ペプチドの使用に限定される。

このアプローチが、複雑な三次元構造を有するより大きなペプチド抗原に適用さ れ得るかどうかは決して明白ではない。

国際特許出願Ｗ０９１／１７１８４においては、インターロイキン−１インヒビ ターが、組換えＤＮＡ技術によるその残基７６位でのＩＬ−１βノナペプチドの 挿入によって増強され得ることが開示されている。しかし、この組換え分子は、 ワクチンとしての有用性がなく、そのような使用のために提案されていない。

本発明によると、組換えＤＮＡ技術によって、ＩＬ−１βノナペプチドを組換え 抗原に導入すると、免疫原性特性が向上した抗原が生産されることが見いだされ た。このような組換え抗原は、免疫原性活性が増大し、そのために有効なワクチ ンの生産を意図している。

発明の詳細な説明 本発明の第一の局面によれば、そのアミノ酸配列内に異種の免疫刺激ドメインの アミノ酸配列が含まれる組換えペプチド抗原が提供される。ただしこの抗原は、 インターロイキン−１インヒビターではない。

本発明の組換えペプチド抗原は、ワクチンとしての使用に付加的なアジュバント を必要としないが（臨床的な意味では必要に応じて添加し得るが）、その中にペ プチド抗原に対する免疫応答を増強するように作用する免疫ドメインを有するこ とが理解され得る。

このペプチド抗原は、一種またはそれ以上の同一または異なる異種の免疫刺激ド メインを包含し得る。さらに、このペプチド抗原は、同種または異種であり得る 一種またはそれ以上の抗原ペプチドを包含し得る。免疫刺激ドメインは、任意の 単一ペプチド内のアミノ酸配列または任、意の２種のペプチドのアミノ酸配列間 に位置し得る。

さらに、抗原がキャリアペプチドへのエピトープの取り込みにより形成されると き（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０．７０）異種の免疫 刺激ドメインが抗原のキャリア部に取り込まれ得ることが理解され得る。

用語「異種の免疫刺激ドメイン」により、直接的にまたは間接的に、抗原の免疫 原性特性を増大し得る、抗原に対して異種の任意のアミノ酸配列を示すことが意 図される。

好適には、この免疫刺激ドメインは、サイトカインに由来する。サイトカインの 例としては、インターロイキンｌから１２、腫瘍壊死因子、インターフェロン、 ＴＧＦ、および走化性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ）サイトカイン（例えばＭＩＰ 、　ＭＡＰおよびＮＡＰ）が挙げられる。

例えば、免疫刺激ドメインは、ＩＬ−１βに由来し得る。ＩＬ−１βの１６３− １７１の範囲の残基であるノナペプチドＶＱＧＥＥＳＮＤＫは、免疫刺激特性を 有するが、このサイトカインの毒性、発熱性または炎症特性の付与の原因となら ないことが見いだされた。

従って、好都合に、ノナペプチドＶＱＧＥＥＳＮ囲は、組換えペプチド抗原のア ミノ酸配列内に取り込まれる。

アミノ酸付加、欠失、または置換が、以下に述べるように、免疫刺激ドメインに 対して行われ得ることが、当業者により理解され得る。保存するのが望ましい免 疫刺激ドメインの生物学的特性は、ドメインが抗原に対する免疫応答を刺激し得 ることであることは明らかである。

この活性を保存するノナペプチドの改変は、Ｂｏｒａｓｃｈｉら、１９９０、Ｅ ｕｒ、　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔ、　１．２１−２６により示されたように、 可能であり得る。特に、ペプチドＧＥＥＳＨのような、より小さいフラグメント が使用され得る。

驚くべきことに、免疫刺激ドメインが抗原の分子構造中に組み込まれるが、例え ば、大きな構造上の改変によって抗原の抗原特異性が有意に影響を受けることが な（、そして免疫刺激ドメインの免疫原性特性が保持されるような方法で、免疫 刺激ドメインを抗原のアミノ酸配列内に挿入することが可能であることが見いだ された。

好適には、免疫刺激ドメインの挿入部位は、ハイブリッド分子中のその活性を増 強するように選択され、無傷の抗原の少なくとも一つの抗原エピトープを除去す る。

好都合には、免疫刺激ドメインは、抗原の分子構造内で所定の位置で挿入される 。

用語「分子構造内」により、免疫刺激ドメインが、その組み込み部分を形成する ために、ペプチド抗原の構造に組み込まれることを示すことが意図される。従っ て、免疫刺激ドメインは、そこから分離し得ないような抗原に単に結合され得る のではなく、むしろ抗原に組み込まれ、それらの新規なドメインとなる。このこ とにより、その抗原特異性を保持しながら、免疫原性活性を増強する。

免疫刺激ドメインの適切な挿入部位は、当業者が利用できる種々の方法の任意の 一つにより決定され得る。この方法は、ペプチド構造分析および構造／機能予測 方法を含む。特定の部位が、それ自身をドメインの挿入のための適切な位置とし て提示していると考えられる。例えば、タンパク質配列の超可突部は、保存抗原 エピトープの決定基であるタンパク質の構造中に含まれていないと考えられてお り、このため、ドメインの挿入の強力な候補である。

さらに、抗原の主要構造から遠位のループおよび結合配列は、この抗原の構造が 影響を受けない、ドメインの挿入のためのむき出しの部位を提供し得る。

好適には、免疫刺激ドメインの挿入部位は、以下の特徴の少な（とも一つに従っ て選択される： １）、アミノ酸配列中の改変に寛容； ２）、抗原の構造の要素間にある結合配列として機能；および ３）、抗原の３次元構造のむき出しの領域に位置。

用語「アミノ酸配列中の改変に寛容」により、考慮されているタンパク質構造の 領域が、以下に述べるように、ペプチドの全体の構造および機能に影響を及ぼす ことなく、付加された、除去された、または欠失されたアミノ酸残基を有し得る ことを示すことが意図される。しかし、この配列が、非保存的アミノ酸変化にも 寛容であることが特に好ましい。

「抗原の構造要素間にある結合配列として機能」する配列は、タンパク質の構造 部分を含むヘリックスおよびβ−シート間に見いだされるペプチド配列の部分（ ｓｅｃｔｉｏｎ）である。例えば、これらの配列は、そのようなヘリックスまた はシートの間のループの形ｆｉ（Ｌばしばむき出しである）であり得る。

「抗原構造のむき出しの領域」は、上記のようなループであり、生理学的溶液中 でタンパク質の外側から接近可能な配列である。それらは、頻繁にはむき出され たループの形態であるが、また、ペプチドの構造要素または他の領域中に位置し 得る。このことにより、免疫刺激ドメインが、免疫刺激が行われる免疫系の作用 因子に確実に接近可能であることが意図される。

ペプチド抗原は、ヒトまたは動物被験体において免疫応答を惹起し得る任意のペ プチドであり得る。しかしながら、好適には、このペプチド抗原は、それに対し て被験体を保護するのが望まれる病原体に由来する。そのような抗原の例として 、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ポリオ、パピローマおよびインフルエンザの ような病原性ウィルスのタンパク質が挙げられる。また、百日咳毒素、破傷風毒 素、ジフテリア毒１３０ｋＤａ細胞毒素のような細菌毒素類、および、細菌によ る感染に対してワクチン化するのに使用され得るさらなる任意の細菌毒素類を含 む。

毒素由来の抗原は、好適には、改変されて、その毒性が減少または除去される。

適切な抗原のさらなる例は、ＣＲＭ−１９７（Ｇｉａｎｎｉｎｉら、ＮＡＲｌｌ ｌ、４０６３）、もしくはＭｅｎｉｎ　ｏｃｏｃｃｕｓＡ群、Ｂ群、または０群 （それぞれ、Ｍｅｎ　Ａ、　Ｍｅｎ　ＢおよびＭｅｎ　Ｃ）またはＰｎｅｕｍｏ ｃｏｃｃｕｓまたは■」」１江ｕｉ　ｎ　ｒ　ｌ　ｕ　ｅ　ｎ　ｚ　ａ　ｅの多 糖類を有するヒートン１１　’ｉクタンパク質複合体を含む。また、江ロジ１組 のＭＯＭＩ’およびマラリアＰｌａｓ＋ｍｏｄｉｕｍの環形橿虫（ｃｉｒｃｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）の表面タンパク質のような、寄生性または感染性の生 物の表面抗原を含む。

しかし、抗原は感染性病原体に由来する必要がないことが明らかであり得る。そ れは、例えば、腫瘍抗原のような疾病の発病で生成される内因性ペプチドの異常 形態であり得る。

さらに、本発明は、組換え抗−イディオタイプ抗体、Ｔ細胞レセプター、および 、腫瘍、自己免疫疾患、および特徴的免疫学的プロフィールを有する他の症状に 対して治療または免疫化するのに用いられ得る他の薬剤に適用され得る。

本発明の第２の局面によれば、本発明の第１の局面による組換え抗原をコードす るポリ核酸配列が提供される。

好適には、この抗原をコードするポリ核酸配列は、天然の供給源から単離された ゲノムまたはｃＤＮＡクローンに由来する。

あるいは、抗原をコードするポリ核酸配列は化学的に合成され得る。ゲノムまた はｃＤＮＡクローンの単離および核酸の化学合成のための方法は当該分野で周知 である。

好適には、ポリ核酸配列は、ペプチド抗原をコードするポリ核酸配列を含み、そ の中に、異種の免疫刺激ドメインをコードするポリ核酸配列が、正確な読み枠で 挿入されている。

このポリ核酸配列の発現により、上記で規定されたような組換え抗原の生産が起 こる。

異種の免疫刺激ドメインをコードするポリ核酸配列は、好適には、上記に記載さ れたような免疫刺激ドメインをコードする。好都合には、このドメインは、ＩＬ −１β由来のノナペプチドＶＱＧＥＥＳＮＤＫテアル。

このドメインをコードする配列は好適には以下の配列であり、 ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＡＡＣＧＡＴ　ＡＡＡまた は、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ中に含まれる、免疫刺激ドメインをコードするその機能 的な等偽物であり、遺伝コードの縮重性が考慮される。

本発明は、さらに、上記で規定されたポリ核酸配列を含む核酸ベクターを包含す る。このベクターは、エビソーム状態で選択された宿主細胞内に維持され得るか 、または宿主ゲノム中に組み込まれると考察される。従って、好適には、ベクタ ーは、これらの維持の様式のいずれかを促進するのに有効な配列を含み得る。

本発明のさらなる局面によれば、上記で規定されたようなベクターで形質転換さ れた宿主細胞が提供される。

原核または真核起源の宿主細胞が、選択されたベクターのタイプに依存して、本 発明のベクターと組み合わせて使用され得る。ベクターおよび宿主細胞の両者を 含む適切な発現系は、以下に提示される。

本発明のさらに別の局面によれば、上記に記載されたような、異種の免疫刺激ド メインを含む組換えペプチド抗原であって、インターロイキン−１インヒビター ではない抗原を生産する方法が提供され、この方法は以下の工程を包含する：抗 原をコードするポリ核酸配列を調製する工程であって、この配列はその中に正確 な読み枠で異種の免疫刺激ドメインをコードするポリ核酸配列が挿入されている ；この調製されたポリ核酸配列を発現系に挿入する工程；この調製されたポリ核 酸配列を発現し、その分子構造内に、異種の免疫刺激ドメインを含む抗原を生産 する工程；および該抗原を収集する工程。

また、本発明によるベクターで宿主細胞を形質転換する方法、および本発明によ る宿主細胞を培養して本発明の組換え抗原を生産する方法が包含される。

本発明はさらに、ワクチンとしての使用のための組成物の製造における、ペプチ ド抗原のアミノ酸配列を含む組換几ペプチド抗原の使用であって、この抗原内に 異種の免疫刺激ドメインのアミノ酸配列が含まれる使用を包含する。

本発明はさらに、ワクチン製剤化のための方法を包含し、上記に記載されたよう な組換え抗原と薬学的に受容可能なキャリアとを会合させる工程を包含する。必 要に応じて、このワクチンは、特に、傷ついた免疫系を既に患う患者の場合、抗 原の免疫原性を最大化するためにアジュバントを含有し得る。単一のワクチン製 剤中にまたは実に単一のペプチド抗原中に複数の抗原を含むことが考察される。

本発明のさらなる局面は、ヒトまたは動物被験体において病気を予防または治療 するための方法であって、該被験体に、上記に記載された組換え抗原を含むワク チンの有効量を投与する工程を含む方法が提供される。

図面の簡単な説明 以下、本発明を実施例により図面を参照しながら説明する。

図１（ａ）ｉ！、　５つノへリソクス（Ａ−Ｅ）および配列ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ の挿入点を示すヒトフェリチンＨ鎖の模式図である。

図１（ｂ）は、超可変部内の配列ＶＱＧＥＥＳＮＤＫの挿入点を示す１ｍｏｎｅ ｌ！ａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎからのフラジェリンペプチドを示す模式図である。

図２（ａ）は、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ配列の位置を示すフェリチンα−へリノクス のリボン型図である。

図２（ｂ）は、フェリチンＨ鎖ポリマーを、星印を付けたＶＱＧＥＥＳＮＤＫの 位置と共に示す模式図である。

図３は、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫを挿入した場合と挿入しない場合とでフェリチンと フラジェリンとを区別する抗ＩＬ−１β抗体の能力を示す。

（Ａ）ｌ／−７１および２：変性１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したフェリチン のクマシーブルー染色。レーン３から６＝精製フエソチンの免疫プロット分析。

１０％５ＯＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにプロットした後、タンパ ク質をポリクローナル抗フェリチン抗体（レーン３．４）またはモノクローナル 抗−ＩＬ−１β（レーン５．６）を用いてアッセイした。レーン１，３および５ ：精製Ｆｅｒ８３　（野生型フェリチン）；レーン２．４および６：精製Ｆｅｒ １０３　（ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ含有フェリチン）。タンパク質サイズマーカーは 、左マージンにｋＤａで示されている。

（Ｂ）レーア１および２：変性１０％５ＤＳ−ＰＡＧＩｊ？泳動したフラジェリ ンのクマシーブルー染色。レーン３から６＝精製フラジエリンの免疫プロット分 析。精製フラジェリンを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに 移し、抗サルモネラ鞭毛（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ）ｄ抗体 （レーン３および４）またはポリクローナル抗ＩＬ−１β抗体（レーン５および ６）でのウェスタンプロットで検出した。レーン１，３および５：精製Ｆ１ａ４ ０８　（野生型フラジェリン）；レーン２．４および６：ｌｌｆ製ＦＩａ４０９ 　（ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ含有フラジェリン）。タンパク質サイズマーカーは、左 マージンにｋＤａで示されている。

図４は、ＶＱＧＥＥＳＮ囲を挿入する場合と挿入しない場合とのフェリチンの免 疫原性とフラジェリンの免疫原性とを比較するアッセイの結果を示す。

（Ａ）抗フェリチンＰＦＣアッセイ。異なる投与量のＦｅｒ８３　（黒い棒線） またはＦｅｒ１０３　（斜線をつけた棒線）を腹腔内注射でマウスに接種し、４ 日後、マウスの膵臓を、指標としてＦｅｒ８３に結合した５ＲＢＣを用いること によってアッセイした。バックグラウンドＰＦＣ／牌臓は、５５０±３７であっ た。（Ｂ）抗フラジェリンＰＦＣア１セイ。異なる投与量のＦ１ａ４０８　（黒 い棒線）またはＦ１ａ４９９　（斜線をつけた棒線）を用いて、腹腔内注射でマ ウスを免疫し、４日後、マウスの膵臓を、指標としてＦ１ａ４０８に共役した５ ＲＢＣを用いることによってアッセイした。バックグラウンドＰＦＣ／牌臓は、 ４６７±４４であった。バーは、３匹のマウスのグループの特異性ＰＦＣ／牌臓 の平均±ＳＥＭを示している。

図５（ａ）は、マウスを野生型フェリチンおよび組換えフェリチンの両方で接種 した後に抗フェリチンＩｇＧのレベルをアッセイした実験の結果を示す。

（Ａ）　ｓｏμｇ／ｋｇのＦｅｒ８３　（白抜き三角）またはＦｅｒ１０３　（ 黒い三角）を３匹のマウスのグループに腹腔内注射した。接種の１０日後、血清 を集めた。血清のＦｅｒ８３との反応性を、アルカリホスファターゼコンジュゲ ートヒツジ抗マウスＩｇＧを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。データは、３つ のウェルから得られた吸光度の平均±ＳＥＭとして表している。

図５（ｂ）は、野生型フラジェリンおよび組換えフラジェリンを用いて４０日間 行った同様の実験の結果を示す。

（Ｂ）　２４０μｇ／ｋｇのＦ１ａ４０８　（白抜き四角）またはＦ１ａ４４９ 　（黒い四角）をマウスに腹腔内注射した。接種後、マウスは異なる日に採血し 、ＩｇＧ抗−Ｆ１ａ４０８の力価を測定した。データは、３回の測定から得られ る力価の平均±ＳＥＭとして表される。力価は、コントロールの非免疫血清の最 も低い希釈で得られる吸光度の２倍に等しい吸光度を与える最も高い血清希釈と して決定された。

場合によっては、使用している図の記号よりも小さいため、誤差バーが示されな いことがある。

（以下余白） 実施態様の詳細な説明 １、一般的な方法論 本発明の実施には、他に示されていなければ、当該分野の分子生物学、微生物学 、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の方法を使用する。このような方法は、文 献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＩＩＩＮＧ、　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第二板（１９ ８９）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉおよび　ＩＩ（Ｄ、 Ｎ　Ｇｉｏｖｅｒｉｌ　１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５Ｙ ＮＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ。

Ｊ、　Ｇａｌｔ編１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡ ＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４ ）：　ＴＲＡＮＳＣＲｆＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　（Ｂ、 Ｄ、ＨａｉｅｓおよびＳ、　Ｊ、旧ｇｇｉｎｓｉ！　１９Ｂ４）；　ＡＮＩＭＡ Ｌ　ＣＥＬＬ　ＣＬＩＬＴＵＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）； 　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）：　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ 　ＧυＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）；　Ｍ ＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）；　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳＦＯＲＭ ＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　（Ｊ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａ ｌｏｓ編１９８７、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１５４およ びＶｏｌ、１５５　（それぞれに、ＮｕおよびＧｒｏｓｓｖｉａｎ、およびＷｕ 編）　、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編　（１９８７）、ＩＭＭＵＮＯＣＨＥ ＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢ ＩＯＬＯＧＹ　（ＡｃａｄｅｍｌｃＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）、５ｃｏｐｅｓ 、（１９８７）、ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰ ＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、第二板（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ 、　Ｎ、Ｙ、）、および、）ＩＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡ Ｌ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ−ＩＶ　（Ｄ、Ｍ、　Ｗｅｉ ｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌ１編１９８６）を参照のこと。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な省略形が、本明細書中で使用されている 。本明細書中に掲載されている、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考 として援用されている。

２、定義 本発明に使用し得る組換えペプチド抗原および免疫刺激ドメインとしては、上記 のポリペプチド、および、上記タンパク質の天然のアミノ酸配列から少数のアミ ノ酸が変異したポリペプチドが挙げられ；特に保存的なアミノ酸置換が予期され る。

保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である 。遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される ：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギ ニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および、（４） 非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、ンステイン、セリン、トレ オニン、チロシン。

フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミ ノ酸として、−緒に分類される。例えば、ロイシンとインロイシンまたはバリン の、アスパラギン酸とグルタミン酸の、トレオニンとセリンとの単独の置換、あ るいは、あるアミノ酸と、構造が関連するアミノ酸との同様の保存的置換が、生 物学的活性に大きな影響を与えないことは当然予想し得る。タンパク質として実 質的に同じアミノ酸配列を有するが、機能面に実質的に影響しない少数のアミノ 酸置換を有するポリペプチド分子は、本タンパク質の定義の範囲に含まれる。

天然の供給源からタンパク質を単離精製するよりも、組換えＤＮＡ技術により組 換えペプチド抗原を生産する大きな長所は、天然の供給源からタンパク質を単離 するのに要求されるよりも少ない開始物質を用いて、同量のタンパク質が生産さ れ得ることである。組換え技術によるタンパク質の生産により、細胞中に通常存 在するい（っかの分子の非存在下でも、タンパク質の単離が可能になる。実際、 ヒトタンパク質混入の痕跡が全くないタンパク質組成物を容易に生産し得る。な ぜなら、組換え非ヒト宿主により生産されるヒトタンパク質は、問題の組換えタ ンパク質のみだからである。天然の供給源からの潜在的なウィルス性物質および ヒトに対して発病性のウィルス成分もまた、避けられる。

本明細書中に使用されているように、用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノ ム、ＣＤＮＡ％半合成または合成起源のポリペプチドを示し、その起源または操 作により：（１）天然では結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結 合しない、（２）天然ではそれに結合しているポリヌクレオチド以外のボッヌク レオチドに結合する、または（３）天然では存在しない。

本明細書中に使用されているように、用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長 さのヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態のこと であり、本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」と 相互変換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみを示す。従って、こ の用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチドが 包含される。これにはさらに、既知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識 の存在、メチル化、末端ｒｃａｐｓＪ、１つ以上の天然に存在するヌクレオチド の類似体との置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、ある型の非荷電性結合（例 えば、ホスポン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン 酸エステルナト）、または、荷電性結合（例えば、ホスポロチオエート、ホスホ ロジチオエートなど）との置換）、ペンダント部分の導入（例えば、タンパク質 （ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ−リシンなど）、挿 入剤（例えば、アクリジン、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）、キレート 剤（例えば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分など）、アルキル化剤（例え ば、αアノマー性核酸など））が、包含される。

用語「ゲノムの」により、ベクターにクローニングされた制限フラグメント由来 のＤＮＡ分子のコレクションまたはライブラリーを意味する。これには、生物の 遺伝子物質の全てまたは一部が含まれ得る。

用語［ｃＤＮＡＪにより、ｍＲＮＡ配列に相補的なおよびハイブリダイズするＤ ＮＡ配列を意味する。

本明細書中で使用されているように、用ｆｉ！「オリゴマー」は、プライマーお よびプローブの両方を意味し、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と相互変 換的に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典 型的にオリゴマーは、１０００ヌクレオチド以下、より典型的には５００ヌクレ オチド以下、さらに典型的には２５０ヌクレオチド以下であり、それらは１００ ヌクレオチド以下であり得、７５ヌクレオチド以下、そしてさらに５０ヌクレオ チド以下の長さであり得る。しかし、単一のヌクレオチドより大きい長さの任意 のサイズであり得ることが理解されるべきである。

本明細書中で使用されているように、用語「プライマー」とは、適切な条件下で 使用されるときに、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として作用し得るオリゴマ ーのことである。

プライマーは、コピーされるべきポリヌクレオチド鎖の領域に、完全にまたは実 質的に相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件下で、プライ マーは、分析物鎖の相補領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラ ーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加により、プライマーは、重合 剤により伸長されて分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは一本鎖であり得 るか、または、部分的または全体に二本鎖であり得る。

用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」とは、標的領域を含有する と思われる、一本鎖または二本鎖核酸分子のことであり、生物学的試料中に存在 し得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プローブ」とは、標的領域中の配列 とプローブ中の少な（とも１つの配列との相補性により、標的配列とハイブリッ ド構造を形成するポリヌクレオチドを含有する構造のことである。プローブのポ リヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌ クレオチド類似体から構成され得る。「捕獲プローブ」および「標識プローブ」 は、プローブ内に包含される。

本明細書中で使用されているように、用語「標的領域」とは、増幅および／また は検出されるべき核酸領域のことである。用語「標的配列」とは、プローブまた はプライマーが、所望の条件下で安定なハイブリッドを形成し得る配列のことで ある。

本明細書中で使用されているように、用語「捕獲プローブ」とは、結合パートナ −に結合する一本鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプローブのこと である。この一本鎖ポリヌクレオチドは、標的するポリヌクレオチド配列に含有 され、これは、分析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的領域内の標的配 列に相補的である。この相補領域は、二本鎖に、分析物ポリヌクレオチドを固体 表面に固定する（結合パートナ−を介して）のに十分に安定性を与えるために、 十分な長さからなり、標的配列に対して相補的である。結合パートナ−は、第二 の結合パートナ−に特異的であり、第二の結合パートナ−は、固体支持体の表面 に結合され得るが、または、その他の構造物または結合パートナ−を介して間接 的に固体支持体に結合され得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標的するポリヌクレオチド配列」と は、標的ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドが含有されるポリヌクレ オド配列のことであり、その配列は、意図される目的に十分な安定性を有する二 本鎖を形成するのに、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。

本明細書中で使用されているように、用語「結合パートナ−」とは、例えば、抗 原とそれに特異的な抗体のような、高度な特異性を有するリガンド分子を結合し 得る分子のことである。一般的に、特異的結合パートナ−は、単離条件下で、分 析物コピー／相補鎖の二本鎖（捕獲プローブの場合）を固定するのに十分な親和 性で結合しなければならない。特異的結合パートナ−は、当該分野で公知であり 、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロティン Ａ。

多くの既知のレセプター−リガンド対、および、相補的ポリヌクレオチド鎖を包 含する。相補的ポリヌクレオチド結合パートナ−の場合には、パートナ−は通常 、少なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基であり得、さらに、 少な（とも約４０％から約６０％のＧ＋Ｃ含有量を有する。ポリヌクレオチドは 、ＤＮＡ、　ＲＮＡまたは合成ヌクレオチド類似体を含み得る。

本明細書中で使用されているように、用語［カップルした（ｃｏｕｐｌｅｄ）　 Ｊとは、共有結合によるまたは非共有結合の強い相互作用（例えば、疎水相互作 用、水素結合など）による結合のことである。共有結合は、例えば、エステル、 エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭 素−リン結合などであり得る。

用語「支持体」とは、所望の結合パートナ−が固定され得る、いずれもの固体ま たは半固体の表面のことである。適切な支持体には、ガラス、プラスチック、金 属、ポリマーゲルなどが含まれ、ビーズ、ウェル、ディツプスティック、膜など の形態にされ得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標識」とは、検出し得る（好ましく は定量し得る）シグナルを提供するために使用され得、ポリヌクレオチドまたは ポリペプチドに結合され得る、いずれもの元素または部分のことである。

本明細書中で使用されているように、用語「標識プローブ」とは、分析物ポリヌ クレオチド中の検出されるべき標的配列に相補的である、標的するポリヌクレオ チド配列を含有するポリヌクレオチドプローブのことである。この相補領域は、 「標識プローブ」および「標識配列」を含有する二本鎖が、標識により検出され るように、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。標識プローブは、直 接に、または、マルチマーを含む、互いに高度な特異性を有する１組のリガンド 分子を介して間接に、標識とカップルする。

本明細書中で使用されているように、用語「マルチマー」とは、同じ繰り返しの 一本鎖ポリヌクレオチドユニットまたは異なる一本鎖ポリヌクレオチドユニット の、直鎖状または分枝状ポリマーのことである。ユニットの少なくとも１つは、 目的の第一の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合し たポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プローブ）に特異的にハイブリダイ ズし得る、配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を 得るために、このユニットは、通常は少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであ り、典型的には約５０ヌクレオチド以下の長さ、そして好ましくは約３０ヌクレ オチドの長さであり；さらに、Ｇ＋Ｃ含有量は、通常は少なくとも約４０％、多 くて約６０％である。このようなユニットに加えて、マルチマーには、目的の第 二の一本鎖ヌクレオチド、典型的には標識ポリヌクレオチドまたはその他のマル チマーに、特異的および安定にハイブリダイズし得る、多くのユニットが包含さ れる。これらのユニットは、上記に考察されたマルチマーのように、一般にはほ ぼ同じ大きさおよび組成である。マルチマーがその他のマルチマーにハイブリダ イズされるように設計されているときには、第一および第二のオリゴヌクレオチ ドユニットは異質（異なる）であり、選択されたアッセイの条件下では、互いに はハイブリダイズしない。従って、マルチマーは、標識プローブであり得るか、 または［２をプローブに力・１プルするリガンドであり得る。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自己復製ユニットとして挙 動する、すなわち、自己制御下に複製し得るいずれもの遺伝子要素、例えば、プ ラスミド、染色体、ウィルス、コスミドなどである。これには選択マーカーが含 まれ得る。

ｒ　ＰＣＲＪとは、５ａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３　（１９８６ ）；および５ｃｈａｒｆら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：１０７５ −１０７８；および米国特許第４、６８３．１９５号；ならびに米国特許第４． ６８３．２０２号に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応技術である。

本明細書中で使用されているように、本来Ｘが、同じ様式でｙに関連しない場合 に、Ｘはｙに関して「異種」である。

すなわち、天然ではＸが全くｙに関連しないか、または、Ｘが天然に実在して認 められるような同じ様式でｙに関連しない。

「相同性］とは、Ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。１つの形態の配列 と別の配列との対応は、当該分野で公知の方法により決定され得る。例えば、そ れらはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、 相同性は、相同領域（例えば、Ｓ１消化の前に使用される）間で安定な二本鎖を 形成する条件下でポリヌクレオチドをノ＼イブイブリダイズし、その後、一本鎖 特異ヌクレアーゼにより消化し、その後に消化されたフラグメントの大きさを決 定することにより決定され得る。

「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが接続されて、この接続され たセグメントの復製および／または発現をもたらすレプリコンである。

「制御配列」とは、それらが連結されるコーディング配列の発現をもたらすため に必要であるポリスクレオチド配列のことである。このような制御配列の性質は 、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的に プロモーター、リポソーム結合部位、および転写終止配列を含み；真核生物では 、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。

用語「制御配列」は、最少限、発現に必要とされる全成分を含み、さらに存在が 有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナ−配列を含 み得ると意図される。

「作動可能に連結された」とは、記載されている成分が、それらの意図する様式 で機能し得る関係にある並列のことである。コーディング配列に［作動可能に連 結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合した条件下で 得られるように連結されている。

「読みとり枠Ｊ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配 列の領域のことである；この領域は、コーディング配列の一部またはコーディン グ配列全体を示し得る。

「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下におかれると、通常はｍＲＮ Ａを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディン グ配列の境界は、５°末端の翻訳開始コドンおよび３°末端の翻訳終止コドンに より決定される。コーディング配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポＩＪ　Ｘクレ オチド配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

本明細書中で使用されているように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリ マーを指し、特定の長さの産物を指すわけではない；従って、ペプチド、オリゴ ペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語 にはまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコジル化、アセチル化、リ ン酸化など）を意味せず、あるいは除外しない。定義に包含されるのは、例えば 、アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ 酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知の天然 に存在するおよび存在しない改変である。

示された核酸配列「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、配列にコー ドされたポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ ド、またはそれらの部分、ここで、この部分は、少なくとも３−５アミノ酸、さ らに好ましくは少なくとも８−１０アミノ酸、そしてよりさらに好ましくは少な くとも１１−１５アミノ酸からなる、または配列にコードされたポリペプチドに より免疫学的に同定され得るポリペプチドのことである。この用語にはまた、示 された核酸配列から発現されるポリペプチドも包含される。

「免疫原性の」とは、アジ二パントの存在または非存在下で、それのみで、また はキャリアに結合されて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を引き 起こすポリペプチドの能力のことである。「中和」とは、感染因子の感染力を、 部分的または全体的に抑制する免疫応答のことである。「エピトープ」とは、ペ プチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原決定基のことである；１つのエ ピトープは、そのエピトープに対して唯一の高次構造（ｓｐａｔｉａｌ　ｃｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で、３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピト ープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、さらに通常には少なく とも８−１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の高次構造を決定する方 法は当該分野では公知であり、例えば、これらには、Ｘ線結晶解析および二次元 核磁気共鳴が含まれる。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗 原に対するその他の抗原の結合を阻む能力を示す、簡単な免疫アッセイにおいて 同定され得る。

本明細書中で使用されているように、「処置（ｔｒｅａｔ■ｅｎｔ）Ｊとは、予 防および／または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）　（すなわち、あらゆる疾患症状の調 整）のことである。「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）Ｊは、抗原性の莢膜多糖ま たはオリゴ糖構造を有する細菌の感染が疑われる動物を意味し、これにはヒトを 含む霊長類が包含されるが、これらに限定されない。「ワクチン」は、免疫原性 の、または、部分的または完全にこのような細菌に対する保護を誘起し得る、個 体の処置に有用な組成物である。

本発明のコンジュゲート化合物は、このタンパク質に特異的な、モノクローナル またはポリクローナル抗体の産生に使用され得る。これらの抗体を産生ずる方法 は、当該分野で公知である。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、およびその他 のこのような用語は、例えば、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体と して使用され得るがまたは使用されてきた、微生物、昆虫細胞、および哺乳類細 胞を示し、これには、形質転換されたもとの細胞の子孫も包含される。１つの母 細胞の子孫は、自然突然変異、偶発突然変異または意図的突然変異（ｄｅｌｉｂ ｅｒａｔｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）のために、形態学的に、または、ゲノムＤＮＡ または全ＤＮＡ補体が、必ずしも、もとの母細胞と完全に同一ではあり得ないこ とが理解される。

哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサ ル腎（ＣＯ３）細胞が含まれる。

詳細には、本明細書中で使用されているように、「細胞系」とは、インビトロに おいて継続してまたは長期間に増殖および分裂し得る細胞群のことである。しば しば、細胞系は１つの幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｅｅｌ　１）に由来する クローン群である。さらに、このようなりローン群の貯蔵または転移の間に、核 盟に自発変化または誘導変化が起こり得ることが、当該分野では公知である。従 って、いわゆる細胞系由来の細胞は、祖先細胞または培養物に正確には同一では あり得ず、この細胞系には、このような変異体が包含される。用語「細胞系」は また、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系、 または二細胞型のハイブリドーマを包含する。

本明細書中で使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のよ うな、原核微生物種および真核微生物種が包含され、後者には、酵母および糸状 菌が含まれる。

本明細書中で使用されているように、「形質転換」とは、挿入に用いられる方法 （例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロポーレーション ）に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことである。外因 性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えばプラスミド）として維持され 得るか、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するときには、「精製された」および 「単離された」とは、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子を実質 的に含まずに存在することを意味する。本明細書中で使用されているように、用 語「精製された」は、好ましくは、同じ型の生物学的高分子が、少なくとも７５ 重量％、さらに好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少な（とも ９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％で存在することを意味 するくしかし、水、緩衝液、およびその他の小分子、特に、１０００未満の分子 量を有する分子は存在し得る）。

（以下余白） ３、　発現系 一旦、適切なペプチド抗原のコーディング配列が単離されると、それは種々の異 なる発現系、例えば、哺乳類細胞、バキュロウィルス、細菌、および酵母により 用いられる発現系、で発現され得る。

３．１．　＠乳類系 哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポ リメラーゼを結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）の−ＲＮＡへ の下流（３°）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーター は、通常はコーディング配列の５゛末端近傍に位置する転写開始領域、および、 通常は転写開始部位の上流２５−３０塩基対（ｂｐ）に位置するＴＡＴＡボック スを有する。ＴＡ丁Ａボックスは、ＲＮＡポリメラーゼ■１がＲＮＡ合成を正確 な部位で開始させることを導（と考えられている。哺乳類プロモーターはさらに 、通常はＴＡＴＡボックスの上流１００から２００　ｂｐ内に位置する上流プロ モーター要素を有する。上流プロモーター要素は、転写が開始される速度を決哺 乳類ウィルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、広範囲の宿主を有する；従っ て、哺乳類ウィルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を 提供する。例にｆｉ、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルスＬＴＲプ ロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）　、オよび 単純ヘルペスウィルスプロモーターが含まれる。さらに、ネズミメタロチオネイ ン遺伝子のような非ウィルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列 を提供する。発現は、構成的であるかまたは調節され得（誘導可能な）、プロモ ーターに依存して、ホルモン一応答細胞中でグルココルチコイドにより誘導され 得る。

上記のプロモーター要素に組み合わされたエンハンサ−要素（エンハンサ−）の 存在は、通常は発現レベルを増大させる。エンハンサ−は、相同または異種プロ モーターに連結されたときに、通常のＲＮＡ開始部位で合成を開始して、最高１ ０００倍まで転写を刺激し得る調節ＤＮＡ配列である。さらに、エンハンサ−は 、通常の向きまたは裏返しの向きで転写開始部位から上流または下流に、または 、プロモーターから１ｏｏｏヌクレオチドを超える位置に配置されるときに活性 である（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７　（１９８ ９）：　Ａｌｂｅｒｔｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｃｅ１ｌ、第二板（１９８９））　ｏ　ウィルス由来のエンハンサ−要素は、 通常は広範囲の宿主を有するので、特に有用であり得る。例には、ＳＶ４０初期 遺伝子エンハンサ−ＣＤｉｊｋｅｍａら、（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、４ニア６ １）　、および、ラウス肉腫ウィルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来（Ｇｏｒｍａ ｎら、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　７９： ６７７７）およびヒトサイトメガロウィルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔら、＜１９８ ５）　Ｃｅ１ｌ　４１：５２２１）のエン／％ンサー／プロモーターが含まれる 。さら；こ、いくつかのエン／＼ンサーは、調節可能であり、ホルモンまたは金 属イオンのような誘導物質が存在するときのみに活性になる（　５ａｓｓｏｎｅ −Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、２：２１５；　Ｍ ａｎｉａｔｉｓら、（１９８？）　５ｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７）。

ＤＮＡ分子は、哺乳類細胞において細胞内に発現され得る。プロモータ配列はＤ ＮＡ分子に直接連結され得るが、この場合にはいつも、組換えタンパク質のＮ末 端の最初のアミノ酸がメチオニンテアリ、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーシ ョンにより、タンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳類細胞内での外来タンパク質の分泌を提 供するリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤ ＮＡ分子をつ（ることにより、細胞から増殖培地内に分泌され得る。好ましくは 、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位 が存在し、これは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る 。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く、疎水 性アミノ酸を含むシグナルベブチドをコードする。アデノウィルス３分節系リー ダーは、哺乳類細胞内での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例で ある。

一般には、哺乳類細胞により認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、 翻訳終止コドンに対し３°側に位置する調節５ｆｉ域であり、従って、プロモー ター要素とともに、コーディング配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３°末端は、 部位特異的に翻訳後に切断され、ポリアデニル化されて形成される（Ｂｉｒｎｓ ｔｉｅｌら、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１＋３４９；　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔお よびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）　ｒ真核ＲＮＡの終結および３°末端プロセ ツシングＪ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｐｌｉｃｉＢ　（Ｂ、Ｄ 、　Ｈａ＋＊ｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ編）：　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　 （１９８９）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１４：１０５）　 ｏ　これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍ ＲＮＡの転写を導く。転写ターミネータ−／ポリアデニル化シグナルの例には、 ＳＶ４０由来のものが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９Ｂ９）、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　 。

いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在するときに、 より効率よく発現され得る。しかし、数個のｃＤＮＡは、スプライシングシグナ ル（スプライス供与部位および受容部位とも呼ばれる）が欠如しているベクター から効率よく発現された（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ　（ １９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、ス プライス供与部位および受容部位を有するコーディング配列内の介在非コーディ ング配列である。それらは、−次転写物のポリアデニル化の後に、「スプライシ ング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Ｎｅｖｉｎｓ　（１９ｇ３）　Ａ ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　５２：４４１；　Ｇｒｅｅｎ　（１９８ ６）　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、２０：６７１；　Ｐａｄｇｅｔｔら、 （１９８６）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５５：１１１９；　Ｋ ｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ　（１９８８）　ｒＲＮＡスプライシング Ｊ　、　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｐｌｉｅｉｎｇ　（Ｂ、Ｄ、 　ｌ（ａｗｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ編））。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終止配列を含有する 上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。エンハンサ−１機能性スプライ ス供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所 望であれば発現構築物中に含まれる。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞また は細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素（例えば、プラスミド ）のような、レプリコン中に維持される。哺乳類複製系には、複製にトランス作 用因子が必要とされる動物ウィルス由来のものが含まれる。

例えば、ＳＶ４０のようなバ−ウィルス由ｅ１ｌ　２３：１７５）またはポリオ ーマウィルスの複製系を含むプラスミドが、適切なウィルスＴ抗原存在下で、非 常に多数のコピーを復製する。哺乳類レプリコンのさらなる例には、ウシパピロ ーマウィルスおよびエプスタイン・バーウィルス由来のものが含まれる。さらに 、レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のために哺乳類 細胞中に、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中に維持される 。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例には、ｐＭＴ２　（Ｋａｕｆｍ ａｎら（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｔ、　９：９４６）　、お よびｐ）ＩＥＢＯ（Ｓｈｉｉｉｚｕら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、６＋１０７４）が含まれる。

使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌク レオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン介 在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン介在トランスフ ェクション、プロトプラスト融合、エレクトロボーレージ璽ンボリヌクレオチド のリポソーム内へのカプセル化、および、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェ クションを包含する。

発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞系は、当該分野で公知であり、チャイ ニーズハムスター卵ＪＫ　（ＣＨＯ）　細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター 腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（Ｃ０Ｓ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅ ｐ　Ｇ２）および多（のその他の細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコ レクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含するが、これ らに限定されない。

ｉｆ、バキュロウィルス系 タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクターに挿 入され得、ベクター内の制御要素に作動可能に連結される。ベクター構築には、 当該分野で公知の方法が用いられる。

一般的に、発現系の成分には転移ベクター、通常は細菌プラスミドが含まれ、こ れは、バキュロウィルスゲノムフラグメントと、発現されるべき異種の遺伝子ま たは遺伝子群挿入のための便宜的な制限部位との両方；転移ベクター内のバキュ ロウィルス特異フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウィルス（こ れは、バキュロウィルスゲノム内への異種遺伝子の相同的組換えを考慮する）； および、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を含む。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列を転移ベクター内に挿入した後に、ベクター および野生型ウィルスゲノムが、昆虫宿主細胞内へトランスフェクトされ、そこ でベクターとウィルスゲノムとの組換えが起こる。パッケージソゲされた組換え ウィルスが発現され、組換えプラークが同定および精製される。

バキュロウィルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キット形態で、特に 、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＧＡ　（ｒＭａｘＢａｃＪキ ット）から市販されている。これらの方法は当業者に公知であり、Ｓｕ＋＊ｍｅ ｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５　（１９８ ７）　（以後、ｒ　Ｓｕｍａ＋ｅｒｓおよびＳ＋５ｉｔｈＪ　）に十分に記載さ れている。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウィルスゲノムに挿入する前に、 プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転 写終止配列を含む上記の成分が、通常は中間置換構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｔｅ　Ｌｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）　（転移ベクター ）に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および作動可能に連結された 調節要素；各遺伝子がそれ自身の固有のセットの作動可能に連結された調節要素 を有する複数の遺伝子；または、同じセットの調節要素に調節される複数の遺伝 子を含み得る。中間置換構築物はしばしば、細菌のような宿主中で安定して維持 され得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持さ れる。レプリコンは１つの復製系を有し、このため、クローニングおよび増幅の ために適切な宿主中に維持される。

現在では、ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するための最も一般的に使用される転 移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベクターも また設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５　（ポリヘトリン開始コ ドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＡＴＴ下流３２塩基対にＢａ１１旧クロ一ニン グ部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 （１９８９）　１７：３１を参照）。

プラスミドは通常さらに、ポリへドロンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ ら（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４２：１７？ ）、および、選択およびＥ、　ｃｏｌｉ中での増殖のための原核アンピシリン耐 性（±）遺伝子および複製起点を含有する。

バキュロウィルス転移ベクターは通常、バキュロウィルスプロモーターを含有す る。バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスＲＮＡポリメラーゼを 結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流 （５゛から３°）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモータ ーは、コーディング配列の５゛末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。

この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含 有する。バキュロウィス転移ベクターもまた、エンハンサ−と呼ばれる第ニドメ インを有し得、これは存在する場合には、構造遺伝子の遠位に存在する。発現は 調節され得るか、または構成的であり得る。

ウィルス感染サイクルの後期に多量に転写された構造遺伝子は、特に有用なプロ モーター配列を提供する。例には、つィルスポリへドロンタンパク質をコードす る遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）　ｒバキュロウィルス遺 伝子発現の調節」　、　丁ｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｄｏｅｒｒ　ｌｅｒ編）；　Ｅ ＰＯ公開Ｎｏ、１２７８３９およびＮｏ、１５５４７６）　；および、ｐｔｏタ ンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８）、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　 Ｖｔｒｏｌ、　６９＋７６５）が含まれる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バキ１０ウィルスポリヘトリン遺伝 子のような、昆虫またはバキュロウィルス分泌タンパク質の遺伝子由来であり得 る（　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８ｇ）Ｇｅｎｅ、　７３：４０９）。あるい は、哺乳類細胞の翻訳後の改変（シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、 およびリン酸化のような）のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されると考 えられており、そして分泌に必要なシグナルおよび核集積は、無を椎動物細胞と を椎動物細胞との間で保存されているとも考えられているので、ヒトα−インタ ーフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２） 　；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１ ９８８）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８＋３１２９）　；　ヒ トＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　８２：８４０４）　；　ｖウス　ＩＬ−３，（Ｍｔｙａ ｊｉｍａら、（１９ｇ？）Ｇｅｎｅ　５８：２７３　；および、ヒトグルコセレ ブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）　ＤＮＡ　７：９９）をコードする 遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供するた めに使用され得る。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内に発現され得るか、または 、適切な調節配列で発現されれば分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な 細胞内発現は通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有す る短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。

所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベージ１ンにより、成熟タンパク質から切断され得る。

あるいは、組換えポリタンパク質または天然では分泌されないタンパク質は、昆 虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを有する 融合タンパク質をフードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、昆虫細胞か ら分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、小胞体へのタンパク質の輸 送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を導く、疎水性アミノ酸を有するシグナルペ プチドをコードする。

タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の 挿入後に、昆虫細胞宿主を、転移ベクターの異種ＤＮＡと野生型バキュロウィル スのゲノムＤＮＡとで共形質転換（通常は共トランスフェクシブン）する。構築 物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常パキ二ロウイルスゲノムの２−５ 　ｋｂ断片を含有する。バキュロウィルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する 方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＨＪｕら（ １９８７）；　Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８３）　３＋２１５６；および、ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓ　（ １９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、ポリヘトリン遺伝子のような遺伝 子に、相同的二本鎖交差組換えによりなされ得る；挿入はまた、所望のバキュロ ウィルス遺伝子中に設計された制限酵素部位になされ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（ １９８９）、　Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　４：９１゜ＤＮＡ配列は、発現ベクターの ポリヘトリン遺伝子の位置にクローニングされたときには、ポリヘトリン特異配 列により、５°および３°両側に隣接され、ポリへドリンプロモーターの下流に 配置される。

新たに形成されたバキュロウィルス発現ベクターは、次に、感染性組換えバキュ ロウィルス中にパッケージングされる。

相同的組換えは低頻度（約１％と約５％との間）で生じるため、共トランスフェ クシテン後に産生された主要なウィルスは、まだ野生型である。従って、組換え ウィルスを同定する方法が必要である。発現系の利点は、視覚スクリーニングに より、組換えウィルスの区別が可能であることである。天然ウィルスにより産生 されるポリヘトワンタンパク質は、ウィルス感染後、後期に感染細胞の核に非常 に高レベルで産生される。

集積されたポリヘトリンタンパク質は、埋め込まれた粒子をも含む封入体を形成 する。これらの封入体は、１５μ園までの大きさであり、非常に屈折性であるた めに、光学顕微鏡下で容易に視覚化される光沢のある外観となる。組換えウィル スに感染した細胞には、封入体がない。野生型ウィルスから組換えウィルスを区 別するには、トランスフェクシコン上清を、当業者に公知の方法により、単層の 昆虫細胞上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを光学顕微鏡下で、封入 体の存在（野生型ウィルスの指標）または非存在（組換えウィルスの指標）につ いてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ　Ｖｏｌ、２　（ＡｕｓｕｂｅｌらＩｉ）　１６．８　 （Ｓｕｐｐ。

１０．１９９０）　；　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈＨＭｉｌｌｅｒら（１ ９１１９）。

組換えバキュロウィルス発現ベクターは、数種の昆虫細胞への感染のために開発 されている。例えば、組換えバキユロウイルは、とりわけ、Ａｅｄｅｓ　ａｅ　 をへ組座釘」ｊ」１比包皿当、陛すＶ」咀旦、肚旦並厄おｍｅｌａ＋匪旺桂肛・ 陣列」山猛り江ユ止肛■、およびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｉのために開発 されている（　ＰＣＴ公開ＮｏＪＯ８９１０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ら、（１９８５）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

５６：１５３：　ｆｒｉｇｈｔ　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１ニア１８ ：　Ｓｍ１ｔｈら、（１９１１３）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２ １５６；および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２５：２２５を参照のこと）。

バキュロウィルス／発現系での異種ポリペプチドの直接発現および融合発現のた めの細胞および細胞培養培地は、市販されている；細胞培養法は、一般に当業者 に公知である。例えば、Ｓｕｍ＋＊ｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。

次に、改変昆虫細胞は、適切な栄養培地で増殖され得る。

この栄養培地により、改変昆虫宿主内に存在するプラスミドは安定に維持され得 る。発現産物遺伝子が誘導制御下にある場合には、宿主は高密度に増殖され得、 発現が誘導され得る。

あるいは、発現が構成的である場合には、産物は培地に連続的に発現される。目 的の産物を取り出し、枯渇した栄養分を補給しながら、栄養培地を連続的に取り 替えねばならない。

産物は、例えば、ｌｌｌ’ｉ、Ｃ，アフィニティークロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；電気泳動：密度勾配遠心分 離；溶媒抽出などの方法で精製され得る。適切には、培地に分泌されるかまたは 昆虫細胞溶解から生じるいずれもの昆虫タンパク質を実質的に除去するために、 宿主の破片（例えば、タンパク質、脂質および多Ｗｉ＠）を少な（とも実質的に 含まない産物を提供するために、必要であれば産物はさらに精製され得る。

タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞は、配列をコー ドする組換えタンノくり質の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。

これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、条件は、当 該分野で公知のものに基づいて、当業者に容易に確認され得る。

ｉｉｉ、細菌系 細菌発現法は当該分野で公知である。細菌プロモータ−１細菌ＲＮＡポリメラー ゼに結合し得、コーディング配列（例え（ｆ１構造遺伝子）の５ＲＮＡへの下流 （３′）転写を開始し得る〜）ずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、通 常コーディング配列の５゛末端近傍に位置する転写開始領域を有する。この転写 開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌 プロモーターはまた、オペレーターと呼（ずれる第ニドメインを有し得、これは 、ＲＮＡ合成を開始する位置である隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重復し得 る。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレーターに結合し得、そのことにより 特異遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは、負の調節（誘導可能な） 転写を行い得る。構成的発現は、オペレーターのような負の調節要素の非存在下 で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達 成され得、これは、存在する場合には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（５° ）の近くに存在する。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライト活性化タン パク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅ、　ｅｏｌｉでのｌａｃオペロンの転写開 始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ ｔ、　１８：１７３）　ｏ従って、調節的発現は正または負のいずれかであり得 、そのことにより転写を促進または減退する。

代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。

例には、ガラクトース、ラクトース（１ａｃ）　（Ｃｈａｎｇら（１９７７）　 Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）　、およびマルトースのような糖代謝酵素由 来のプロモーター配列が含まれる。

さらなる例には、トリプトファン（ｔｒｐ）のような生合成酵素由来のプロモー ター配列が含まれる（　Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）　Ｈｕｅ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７；　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）　Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

９ニア３１；米国特許第４，７３８．９２１号、ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６７７ ６およびＮｏ。

１２１７７５）　。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−１ａｏｔａｉａｓｅ）　（ｂｌａ） プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　（１９８１）　ｒインターフェロンのク ローニングおよびその他の誤り（ａ＋１ｓｔａｋｅｓ）ｊ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ ｎ　３（［、Ｇｒｅｓｓｅｒｖｉａ＞、バクテリオファージλＰＬ　（Ｓｈｉｍ ａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９２：１２Ｂ）　、およびＴ５（米 国特許第４．６８９．４０６号）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配 列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた細菌プロモーターとして機能 する。例えば、１つの細菌また＋！ノ＜タテリオファージプロモーターの転写活 性化配列は、その他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配 列に接続され得て、合成雑種プロモーターをつくる（米国特許第４．５５１．４ ３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリブレ・ノサーにより調節さ れる、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃオペロン両配列配列有する雑種ｔｒｐ− １ａｃプロモーターである（Ａｌａｎｎら（１９Ｂ３）　Ｇｅｎｅ　２Ｓ：１６ ７；　ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細！！ｌＲＮＡポ１ツ メラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在する プロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適 合するＲＮＡボ１ツメラーゼと結合して原核生物中である種の遺伝子を高レベル で発現し得る。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系 は、結合されたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）　Ｊ 、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３ＨＴａｂｏｒら（１９８５）　Ｐｒｏｃ 　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２：１０７４）　ｏ　さらに、雑種プロモーターｔ１ また、バクテリオファージプロモーターおよびＥ、　ｃｏｌｔオペレーター領域 を含有し得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２６７８５１）。

機能プロモーター配列に加えて、能率のよ４ｔ＋７ボ゛ノ一ム結合部位もまた、 原核生物での外来遺伝子の発現に有用である。

Ｅ、　ｃｏｌｉでは、リポソーム結合部位はシャイン、ダルガーノ（ＳＤ）配列 と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流 に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５） 　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）　ｏ　ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ、　ｃｏｌｔ 　１６Ｓ　ｒＲＮＡの３°末端（３°ａｎｄ）との間で塩基対合してｍＲＮＡの リポソームへの結合を促進すると考えられている（　５ｔｅｉ　ｔｚら（１９７ ９）　ｒメツセンジャーＲＮＡにおける遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列Ｊ 　、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ：　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｒ，Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅ ｒ編））０弱すポソーム結合部位を有する原核遺伝子および真核遺伝子を発現す るためには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎＩｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌを参照のこと０ＤＮＡ分子 は細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、直接ＤＮＡ分子に連結され得、 その場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸はメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コド ンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにお ける臭化シアンとのインキュベーション、または細菌メチオニンＮ末端ペプチダ ーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションにより、タンパク質から 切断され得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２１９２３７）。

融合タンパク質は、直接発現の代替を提供する。通常は、内因性細菌タンパク質 またはその他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種 コーディング配列の５°末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つの アミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子が外 来遺伝子の５°末端で連結され得、細菌内で発現され得る。得られた融合タンパ ク質は、好ましくは、外来遺伝子からバタテリオファージタンパク質を切断する ためのプロセノンング酵素（因子Ｘａ）に対する部位を保持している（Ｎａｇａ ｉら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１Ｇ）　ｏ融合タンパク質はまた １ａｃＺ由来の配列を用いて生成され得る（Ｊｉａら（１９８？）　Ｇｅｎｅ　 ６０：１９７．　ｔｒｐＥ、Ａ１１ｅｎら（１９Ｂ？）　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ、５：９３：　Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　１３５：１１、およびＥＰＯ公開Ｎｏ、３２４６４７、　ｇｅｎｅ ｓ）。２つのアミノ酸配列を接続したＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか 、またはコードし得ない。その他（７）例は、ユピキチン融合タンパク質である 。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からユビキチンを切断 するためのブロセソンング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセノンングプロ テアーゼ）に対する部位を保持しているユピ牛チン領域を用いて生成される。こ の方法によって、そのままの外来タンパク質が単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（ １９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９８）。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌で外来タンパク質分泌を提供するシグナ ルペプチド配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラＤ ＮＡ分子をつくることにより、細胞から分泌され得る（米国特許第４．３３６． ３３６号）。

シグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質分泌を導く疎水性アミ ノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地（グラ ム陽性細菌）、または、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム 陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチドフラグメン トと外来遺伝子との間でコードされるブロセ、ンング部位が存在し、これはイン ビボまたはインビトロにおいて切断され得る。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ、　ｃｏｌｉ外膜タ外膜タンパ低 質遺伝子ｐＡ）　（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　 Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＨＧｈｒａ ｙｅｂら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、３：２４３７）およびＥ、　ｃｏｌｉアル カリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）　（Ｏｋａら（１９８５）　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、８２ニア２１２）のような、細菌分泌タン パク質の遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株 由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ、　５ｕｂｔｆｌｉｓから異 種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開？Ｉａ、　２４４０４２）。

通常、細菌により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３′側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍ ＲＮＡの転写を導く。転写終止配列はしばしば、転写終止の助けとなるステムル ープ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、Ｅ、 　ｃｏｌｔのｔｒｐ遺伝子およびその他の生合成遺伝子のような、強プロモータ ーを伴った遺伝子由来の転写終止配列が含まれる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列 、および転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発 現構築物は、細菌のような宿主に安定して維持され得る染色体外要素（例えば、 プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは、１つの複製 系を有し、このため、発現、またはクローニングおよび増幅のいずれかのために 原核宿主中に維持される。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数 のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５から約２ ００、そして通常約１０から約１５０、の範囲のコピー数を有する。高コピー数 のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは 少なくとも約２０のプラスミドを含有する。高コピー数または低コピー数のいず れかのベクターが、宿主でのベクターの効果および外来タンパク質に依存して選 択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体に相同な少 なくとも１つの配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色 体との開の組換えによると考えられる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌＵＳ株由来 のＤＮＡで構築された組込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込む（ ＥＰＯ公開Ｎｏ、　１２７３２８）。組込みベクターはまた、バクテリオファー ジまたはトランスポゾン配列を含有し得る。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能 にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、 アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオ マイシン）およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝 子を含有し得る。（Ｄａｖｉｅｓら、（１９７ｇ）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　３２：４６９）　ａ選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリ プトフアン、およびロイシンの生合成経路でのような、生合成遺伝子を含み得る 。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てられ得る。形 質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに組 み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは 、特に以下の細菌のために開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ、　Ｐａ１ｖら（１９８２）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　７９二５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６２５９およびＮｏ、０６３９ ５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、Ｗｏ　８４１０４５４１；　Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｓｈ ｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８：　Ａｍａｎｎ ら（１９８５）　Ｇｅｎｅ　４０：１８３；５ｔｕｄｉｅｒら（１９８６）　Ｊ 、　Ｍｏ＋、　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、０３６７７６、 Ｎｏ、１３６８２９およびＮｏ、１３６９０７；　５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｃｕｓ 　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、　Ｐｏｖｅｌ　Ｉら（１９８８）　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。５４＋６５５：　江■旦ｏｃｏｅｅｕｓ　１［ ｖｉｄａｎｓ、　Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、 　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｓ４：Ｓ５Ｓ；および５ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　１ ｉｖｉｄａｎｓ、米国特許第４．７４５．０５６号。

外因性ＤＮＡの細菌宿主への導入方法は当該分野で周知であり、ＣａＣＩｚ、ま たは、二価カチオンおよびＤＭＳＣＩのようなその他の試薬で処理された細菌の 形質転換を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロボーレーシヲンにより細菌細胞 中に導入され得る。形質転換の方法は、通常形質転換されるべき細菌種により変 化する。例えば、Ｍａｓｓｏｎら（１９Ｂ９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、　Ｌｅｔｔ、　６０：２７３；　Ｐａ１ｖａら（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：５５８２；ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６ ２５９およびＮｏ、０６３９５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｎｏ　８４１０４５４ １、Ｂａｃｉｌｌｕｓに関する：　Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａ口、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、８５：８５６；　Ｗａｎｇら（１９９Ｇ）　Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、 １７２：９４９、以すＩ■盆ｌ」虹に関するＨ　Ｃｏｈｅｎら（１９７３）　Ｐ ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

６９：２１１０：　Ｄｏｗｅｒら（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、１６：６１２７：　にＵｓｈｎｅｒ　（１９７Ｂ）　ｒｃｏｌＥ１由来 プラスミドによるＥ、　ｃｏｌｔ形質転換のための改良法ｊ　、　Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙ＋ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ　（ＩＬＷ、ＢｏｙｅｒおよびＳ、Ｎｌｃｏｓｉａ編）　ＨＭ ａｎｄｅＬら（１９７０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３：１５９；　Ｔ ａｋｅｔｏ　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　 ９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａに関するｉ　Ｃｈａｓｓｙら（１９ｇ ？）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１、　Ｌｅｔｔ、４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関するＨ　Ｆｉ ｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７０：３８、Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓに関するＨ　Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）　ＦＥＭＳ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　６６：２０３、Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕ ｓｌ：関するＨ　Ｂａｒａｎｙら（１９８０）　Ｊ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、　 １４４：６９８；　Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）　「エレクトロポーレーシ ョンによる５ｔｒｅ　ｔｏｅｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓの形質転換Ｊ　、　５ｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｅａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｊ、　Ｆｅｒｒｅｔｔｉおよび Ｒ，Ｃｕｒｔｉｓｓ　ＩＩＩ編）；　Ｐｅｒｒｙら（１９８１）　１ｎｆｅｃ、 　Ｉｍｍｕｎ、　３２：１２９５；　Ｐｏｗｅｌｌら（１９８１１）　Ａｐｐｌ 、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５Ｓ；　Ｓｏｍｋｕｔｉ ら（１９８７）　Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｅｖｒ、Ｃｏｎｇ、Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙｌ：４１２、録且Σμ！匹旦に関する、を参照のこと。

ｉｖ、酵母発現 酵母発現系もまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメ ラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下 流（３゛）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロそ一ターは、 コープインク配列の５°末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転 写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボックス」）およ び転写開始部位を含む。酵母プロモーターはさらに、上流活性化配列（ＵＡＳ） と呼ばれる第ニドメインを有し得、これは、存在する場合には通常構造遺伝子の 遠位に存在する。ＵＡＳにより、調節（誘導可能な）発現が行われる。構成的発 現は、ｔｌＡｓの非存在下で起こる。調節的発現は正または負のいずれかであり 得、そのことにより転写を促進または減退する。

酵母は、活性代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、代謝経路の酵素をコ ードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、アルコールデ ヒドロゲナーゼ（ＡＤ）り　（ＥＰＯ公開Ｎｏ、２８４０４４）　、エノラーゼ 、グルコキナーゼ、グルツース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド −３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＩＩ）　、ヘキソキナー ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビ ン酸中ナーゼ（ＰｙＫ）　（ｉ：ｐｏ公開Ｎｏ、　３２９２０３）が包含される 。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺伝子もまた、有用なプロモー ター配列を提供する（　Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ 口、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８０：１）。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機 能する。例えば、１つの酵母プロモーターのｔｌＡｓ配列は、別の酵母プロモー ターの転写活性化領域（こ接続され得、合成雑種プロモーターがつくられ得る。

このような雑種プロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域ｔこ連結されたＡ 　Ｄ　Ｈｇ節配列が含まれる（米国特許第４．８７６、１９７号および米国特許 第４．８８０．７３４号）。雑種プロモーターのその他の例１こは、ＧＡＰまた はＰｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に組み合わされた、ＡＤＨ２ 、ＧＡＬ４、ＧＡＬＩＯｌまた１よＰＨ０５遺伝子のいずれかの調節配列からな るプロモーターが含まれる（　ＥＰＯ公開Ｎｏ、１６４５５６）　ｏ　さらに、 酵母プロモーターに（ま、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能 力を有する１、１μ酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。この ようなブｏ　％　−ター　（７）例には、特に、Ｃｏｈｅｎら（１９８０）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７：１０７８：　Ｈｅｎ１ｋｏｆｆら（１９８１ ）　Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）　 Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｔｃｒｏｂｔｏｌ、Ｉｖａｕｎｏ％。

９６：１１９；　）Ｉｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）　ｒ酵母Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅテノ細菌抗生物質耐性遺伝子の発現Ｊ　 ：　Ｐｌａｓ＋１ｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ ｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉ＋＊ｐｏｒｔａｎｃｅ　（Ｋ、Ｎ、　Ｔ ｉｌｌ１ａ＋ｉｓおよびＡ、　Ｐｕｈｌｅｒ編）；　Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉ ｇａｌｏｎら（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１：１６３；　Ｐａｎｔｈｉｅｒら（ １９８０）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、２：１０９が、含まれる。

ＤＮＡ分子は酵母において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ 分子に直接に連結され得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のア ミノ酸はいつもメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端メチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベージフンにより、タンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、哺乳類、バキユロウィルス、および細菌発現系と同様に、酵 母発現系の代替を提供する。通常、内因性酵母タンパク質またはその他の安定な タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コーディング配列の５ ′末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を 提供する。例えば、酵母またはヒトのスーツ（−オキシドジスムターゼ（ＳＯＤ ）遺伝子が、外来遺伝子の５°末端で連結され得、酵母で発現され得る。２つの アミノ酸配列の接続部位のＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、またはコ ードし得ない。例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ、　１９６０５６を参照のこと。その他 の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ま しくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセッシング酵素（ 例えば、ユビキチンｅＸ的プロセッシングプロテアーゼ）に対する部位を保持し ているユビキチン領域でつくられる。従って、この方法によってそのままの外来 タンパク質が単離され得る（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｗｏ　８８１０２４０ ６６を参照のこと）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母での外来タンパク質の分泌を提供するリ ーダー配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ 分子をつくることにより、細胞から増殖培地に分泌され得る。好ましくは、リー ダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッング酵素が存在し 、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る。リーダー配列フラグメ ントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸を含有するシグ ナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ 公開Ｎｏ、０ＩＺ８７３；　ＪＰＯ公開Ｎｏ、　６２．０９６．０８６）および Ａ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）のような、酵母分泌タンパク 質の遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、非酵 母起源のリーダーが存在し、これもまた酵母での分泌を提供する（ＥＰＯ公開Ｎ ｏ、　０６００５７）。

分泌リーダーの好ましいクラスには、酵母α因子遺伝子の７ラグメントを用いる リーダーがあり、これはｒｐｒｅＪシグナル配列およびｒ　ｐｒｏＪ領域の両方 を含有する。用いられ得るα因子フラグメントの型には、全長ｐｒｅ−ｐｒｏα 因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および切断型α因子リーダー（通常約２５ から約５０アミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４．５４６．０８３号および 米国特許第４．８７０．００８号；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、３２４２７４）　。分泌 を提供するα因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーには、第二酵母の α因子のｐｒＯ領域以外は、第一酵母のｐｒｅ配列でつ（られたハイブリッドα 因子リーダーが含まれる（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｎｏ　８９１０２４６３ を参照のこと）。

通常、酵母により認識される転写終止配列は、翻訳終止フドンに対して３°側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング領域に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得 る諷ＲＮＡの転写を導く。転写終止配列およびその他の酵母認識終止配列の例は 、解糖酵素をコードする配列などである。

通常、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、お よび転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発現構 築物はしばしば、酵母または細菌のような宿主中に安定して維持され得る染色体 外要素（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコ ンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のために酵母中に、および クローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持される。このような酵母−細 菌シャトルベクターの例には、ＹＥｐ２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９） 　Ｇｅｎｅ　８：１７−２４）　；　ｐｃｌ／ｌ　（Ｂｒａｋｅら（１９８４） 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ　８１：４６４２−４６ ４６）　；およびＹＲｐ１７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５ｇ：１５７）が含まれる。さらに、レプリコンは、高 コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。

高コピー数のプラスミドは一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を有し、 通常約１０から約１５０のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有す る宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０を有 する。高コピー数または低コピー数のベクターは、宿主におけるベクターおよび 外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする、酵母染色体に相同な 少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同 な配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組 換えによると考えられる（　０ｒｒｉｅａｖｅｒら（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：２２８−２４５）　ｏ組込みベクターは 、ベクター中への封入に適切な相同配列を選択すること（こより、酵母の特異的 な座に導かれ得る。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、これは、おそらく産 生される組換えタンパク質しヘルニ影響し得る（　Ｒｉｎｅら（１９８３）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１１０：６７５０）。

ベクターに含まれる染色体配Ｖｌｌ　ｌよ、ベクター中の１つのセグメントとし て存在して、ベクター全体を組込み得るか、または、染色体中の隣接セグメント （こ相同で、ベクター中で発現構築物に隣接する２つのセグメントとして存在し て、発現構築物のみを安定して組込み得る。

通常は、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可 能にする選択マーカーを含有し得る。

選択マーカーは、ＡＤＥ２、旧Ｓ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ　１、およびＡｌＯ２の ような酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、および、Ｇ４１１１４性遺伝子を 含み得る。これらの遺伝子は、酵母細胞においてツニカマイシンおよび０４１８ のそれぞれに対する耐性を与える。

さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒素化合物の存在下で増殖す る能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰＩの存在は、銅イオンの存在 下での酵母の増殖を可能にする（１３ｕｔｔら（１９ｇ？）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　Ｒｅｖ、　５１：３５１）。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てれられ得る。

形質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに 組み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多（の酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、 特に以下の酵母のために開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ 　（Ｋｕｒｔｚら＜１９０）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２）　 ；　Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ　（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、　Ｂ ａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１４１）　：　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　 ｏｌ　ｗ＋ｏｒ　ｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、１３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｆｆｉｐら（１９！１６） 　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２：３０２）　：　Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ 　ｃｅｓむユｉ上ｉｓ　（Ｄａｓら（１９８４）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１ ５８：１１６５）　；　ｕ旦ＤＬｒａｍ　ｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　（Ｄｅ　Ｌｏ ｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４＋７３ ７；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　８：１３５）　；　Ｐｉｃｈｉａ　ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ　（Ｋｕｎ ｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２５：１４１）　：　Ｐｉｃｈｉａ　ａｓｔｏｒｉｓ　（Ｃｒｅｇｇら（１９８ ５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：３３７６；米国特許第４．８３ ７．１４８号および米国特許第４．９２９、５５５号）　：　５ａｃｃｈａｒｏ ＋Ｉｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ　（旧ｎｎｅｎら（１９７ｇ）　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７５：１９２９；　ｌｔｏら（１９８ ３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、１５３＋１６３）　；　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ ｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｏｍｂｅ　（Ｂｅａｃｈら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　 ３００ニア０６）　；および、Ｙａｒｒｏｖｉａ　１４　ｏｌ　ｔｉｃａ　（Ｄ ａｖｉｄｏｔら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、ｌｏ：３８０４７１　Ｇ ａ１１１ａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１０：４９）　。

外因性ＤＮＡの酵母宿主への導入方法は、当該分野では公知であり、通常は、ス フェロプラストまたは完全酵母細胞をアルカリカチオンで処理する形質転換を包 含する。形質転換方法は通常、形質転換される酵母種により変化する。例えば、 Ｋｕｒｔｚら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２；　 Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１ ４１、Ｃａｎｄｉｄａに関するＨ　Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ、Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｙ、１３２：３４５９：　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６ ）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２＋３０２、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ に関する；　Ｄａｓら（１９ｇ４）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら　 （１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４＋１１６５；　Ｖａｎ　ｄｅｎ 　Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５ＳＫｌ ｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓに関するＨ　Ｃｒｅｇｇら（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５：３３７６；　Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５：１４１；亘に関するＨ　Ｈｉｎｎｅｎら（１ ９７Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ７５；１９ ２９；　Ｉｔｏら（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３：１６３、ガ ル１五旦吐ｅｅＳに関する；　［３ｅａｃｈら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ００ニア０６．５ｃｈｉｚｏｓａｃｃＩ旦ジエ妊に関する；　Ｄａｖｔｄｏｖら （１９８５）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、１０：３９；Ｇａ１ｌｌａｒｃｌｉｎ ら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、１０：４９、Ｙａｒｒｏｗｌａに関 する；参照のこと。

４、　ワクチン 本明細書中で考察されている各組換えペプチド抗原は、単一ワクチン候補物とし て、または他の病原由来の１つ以上のその他の抗原との組み合わせで使用され得 る。これらのワクチンは、予防剤（感染を予防するため）または治療剤（感染後 に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。

このようなワクチンは、ペプチド抗原を、通常は「薬学的に受容可能なキャリア 」との組合せで含有し、このキャリアは、この組成物が与えられる個体に対して 有害な抗体の産生　。

をそれ自身が誘導しないいずれものキャリアを含む。適切なキャリアは、典型的 には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、 アミノ酸コポリマー、脂質凝集体く例えば、油滴またはリポソーム）、および不 活性ウィルス粒子のような、大きくて徐々に代謝される高分子である。このよう なキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤 （「アジ１バント」）として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風 などのような細菌トキソイドにフンジニゲートされ得ル。

組成物の効果を増強する好ましいアジュバントには、以下が包含されるが、これ らに限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）　（水酸化アルミニウム 、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン 製剤〔ムラミルペプチド（下記を参照）のようなその他の特異的免疫刺激剤また は細菌細胞壁成分を伴うまたは伴わない〕、例えば、（ａ）ＭＦ５９　（ＰＣＴ 公開Ｎｏ、　Ｎｏ　９０／１４８３７）　：　５％スクヮレン、０．５％Ｔｖｅ ｅｎ　８０、および０．５％５ｐａｎ　８５　（必須ではないが必要に応じて、 種々の量のＭＴＰ−ＰＥ　（下記を参照）を含有する〕を含有して、ｌｌ０Ｙ型 マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｗｔ。

ｎ、　ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に 処方される；　（ｂ）ＳＡＦ：　１０％スクヮラン、０．４％Ｔｓｅｅｎ　８０ ．５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−ブｏ　’ｙクボリ？−Ｌ１２１、お よびｔｈｒ−ＭＤＰ　（下記を参照）を含有し、マイクロフルイダイザーにかけ てサブミクロン粒子エマルジョンにされるか、ポルテックスにかけてより大きな 粒子サイズのエマルジョンを生成する；および、（ｃ）Ｒｉｂｉ”アジュバント 系（ＲＡＳ）　（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｍ Ｔ）　：　２％スクワレン、０．２％Ｔｖｅｅｎ　８０、および、１つ以上の細 菌細胞壁成分（モノホスホリルリビドＡ　（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレー ト（ＴＤＭ）　、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群から、好ましくはＭＰ Ｌ、　＋　ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ”）　）を含有する；（３）サポニンアジュバン ト（例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ”　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 、　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　ＭＡ）　）が使用され得るか、または、ＩｓｃＯＭ 　（免疫刺激複合体）のような、それらからつ（られた粒子；（４）完全フロイ ンドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）　 ？　（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）　、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）など）；および、（６）組成物の効果を増強するための免疫刺激剤として作用 するその他の物質。Ａｌｕ謹およびＭＦ５９が好ましい。

上記のように、ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−）レオニ ル−Ｄ−イングルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）　、　Ｎ−アセチル−ノルムラミル ー１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミ ル−１−アラニル−ｄ−イングルタミニルーｌ−アラニン−２−（１’−２’− ツパルミトイルーｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシーエチルア ミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれるが、これらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバ ント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希 釈剤を含有する。

さらに、湿潤または乳化剤などのような補助物質、ｐＨ緩衝物質などが、このよ うな賦形剤中に存在し得る。

典型的には、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射用に調 製される；注射の前に液体賦形剤に溶解または懸濁するのに適切な固形もまた、 調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアについて上記で考察したように、調 製物はまた、アジュバント効果を増強するために、エマルジ璽ンにされるか、ま たはリポソームにカプセル化され得ル。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペ プチド、および必要であれば、上記成分のいかなる他の成分をも含有する。「免 疫学的に有効な量」とは、単回投与でまたは連続投与の一部として個体に投与さ れる量が、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される 個体の健康状態および身体条件、処置される個体の分類学上のグループ（例えば 、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力 、所望の予防程度、ワクチン処方、医療状況での治療医の評価、およびその他の 関連因子に依存して変化する。その量は比較的広範囲にあり、日常の試行により 決定され得ると思われる。

免疫原性組成物は従来より非経口的に、例えば、皮下または筋肉内注射により、 投与される。その他の投与形態に適した処方には、経口および肺への処方、生薬 、および経皮投与が含まれる。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回 投与スケジュールであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤と組み合わせて 投与され得る。

フェリチンおよびフラジェリン　の　。　の゛フラジェリンを、未知の３次元構 造のタンパク質の例として選択した。なぜなら、異種のエピトープのキャリアと して、この構造により、最近、提示された興味による。ＩＬ−１βノナペプチド を超可変部に挿入した。この領域は、挿入に特に寛容であることが既に示されて いる（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ。

２４０．７０；　ｆｕら、１９８９、ＰＮＡＳ、　８６．４７２６；　ＭｃＥｖ ａｎら、１９９２、Ｖａｃｃｉｎｅ　１０．４０５）ロ フェリチンを、その構造が詳細に知られている免疫原性おの低いペプチドとして 選択した。ヒトフェリチンのＨ鎖は、マウスフェリチンとの高い配列相同性のた め、マウス中では免疫原性は低い（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９８ｇ、　ＭＡＲ， １６，１０３７３）。ヒトヒフエリチンホモポリマーの３次元構造は高解像度で 知られており（Ｌａｖｓｏｎら、１９９１．　Ｎａｔｕｒｅ、　３４９．５４１ ）、そして詳細な変異分析により、このタンパク質の一般的な折り畳みを害する ことなくペプチド挿入を受容し得る寛容部位が示されている（Ｌｕｚｚａｇｏお よびＣｅ５ａｒｅｎＬ　１９ｇ９．　ＥＭＢＯＪ、、　８．５６９；　Ｊａｐｐ ｅｌｌｉら、１９９２、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２２ユ、　５３２）。

フェリチンは、異なる組織で異なる比率でアセンブルする、２種類のタイプの鎖 （ＨおよびＬ）からなるヘテロポリマーである（Ａｒｏｓｉｏら、１９７８、　 ＪＢＣ±、　４４５１）。モノマーは、ループによって結合された４つの逆平行 （ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）　ａへソックス（Ａ−Ｄ）の束からなる。

本発明では、フェリチンＨ鎖が、λバクテリオファージのｐｉプロモーターを含 むプラスミドベクターを用いることによりＥ、ｃｏｌｉ中で効果的に発現された 。フェリチンＨ鎖をコードする配列を改変し、部位特異的突然変異により、Ｄお よびＥヘリックスを結合する領域中に唯一の５ｏｄａ　＋制限酵素部位を導入し た。次いで、配列ＹＱＧＥＥＳＮＤＫをコードする２種の相捕的すりゴヌクレオ チドを唯一のＳｍａ１部位中に導入した（図１の模式図を参照）。次いで、この 配列の正確な挿入を、変異発現ベクターを配列決定することにより、そしてＶＱ ＧＥＥＳＮＤＫ配列特異的なモノクローナル抗体を用いて精製タンパク質のウェ スタンプロットにおいてポジティブ染色を行うことにより確認した（Ｂｏｒａｓ ｃｈｉら、１９８８、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６８．６７８）。野生型 フェリチンまたは変異フェリチンを、以前に公開されたようにして（Ｌｕｚｚａ ｇｏおよびＣｅ５ａｒｅｎｉ、　１９８９）、精製した。

材料および方法 ・・　の　および フェリチン： プラスミドＦ８３は、バクテリオファージλのｐｉプロモーターの制御下で、ヒ トフェリチンの改変Ｈ鎖を合成する発現プラスミドである。Ｆ８３は、フェリチ ンのヘリ・ノクスＤおよびへ１ノ・ノクスＥの間のループをコードする配列中に 唯一の５Ｉｌａ１部位を含み、モしてＤ−Ｅループ中のペプチド挿入物を発現す る改変フェリチンをコードするノ蔦イブリ・ノドフェリチン遺伝子を構築するの に利用され得る。Ｆ８３は、ｐ２ＨＦｔ（Ｌｅｖｉら、　１９８７゜に、フェリ チンタンパク質をコードする配列を、α−ペプチド遺伝子をコードするβ−ガラ クトシダーゼ遺伝子の断片（こ、オリゴヌクレオチド特異的変異（オリゴ１２２ 　：ＡＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＧＧＣＣＧＴＣＧ）により融合した。このプラスミ ド（Ｆ２７）で；よ、２つの遺伝子が、抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ　１ｂｌｅ）ア ンバーコドンにより分離されている。次いで、８６位のＬｙｓをＧｌｎに変化さ せて（オリゴ１７２：ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧ）　、カルシウ ムの存在下で結晶を形成するフェリチンを合成するプラスミド（Ｆ２）を得る（ Ｌａｖｓｏｎら、１９９１）。次いで、唯一の５ｅａｌおよびＡｐａｌ認識部位 を、オリゴＲ２６：　ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧを用 いてＤ−Ｅループコーディング配列に導入した。この最終オリゴヌクレオチドも また、残基Ａｌａ　１６０およびＧｌｕ　１６２を２つのａｔｙ残基で置換する 。結果として、野生型Ｄ−Ｅループ（ＧＡＰＥＳＣ）のアミノ酸配列はＧＧＰＧ ＳＧに変わる。しかしながら、改変フェリチンタンパク質の物理化学的性質は、 野生型とは種々の基準では区別できない（Ｊａｐｐｅｌｌ　ｉら、１９９２）。

このプラスミドによりコードされたフェリチンタンパク質は、以後Ｆｅｒ８３と 呼ぶ。

１）　−Ｅ　ループ中＋７）ヒトＩＬ−１β配列１６３−１７１　（ＶＱＧＥＥ ＳＮＩ）Ｋ）を発現するフェリチン分子をコードするプラスミドＦ１０３を構築 するために、Ｆ８３のＳｍａ１部位に、配列ＰＧｖＱＧＥＥＳＮＤＫのウンデカ ペプチドをコードする２つの相捕的オリゴヌクレオチド（ＣＣＣＧＧＧＧＴＴＣ ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＡＡＣＧＡＴＡＡＡおよびＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡ ＣＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＣＧＧＧ）を挿入した。従って、プラ スミドＦ１０３により生産されたフェリチンのＤ−Ｅループのペプチド配列は、 ＧＩＳ９ＧＰＧＶＱＧＥＥＳＮＤＫＰ　１６１　ＧＳ　１６３テある。このプラ スミドによりコードされたタンパク質は、以後Ｆｅｒ１０３と呼ぶ。

Ｆ１２０は、免疫化においてコントロールとして用いた非関連配列のデカペプチ ドを発現するハイブリッドフェリチンを合成する発現プラスミドである。この後 者のハイブリッドタンハク質（７）　Ｄ　−Ｅ　ループのアミノ酸配列は、ＧＧ ＰＧＮＬＬＬＱＴＳＶＶＧＳＣ’ある。対応する発現プラスミドを構築するため に、オリゴヌクレオチドＲ２７（ＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＧ ＣＡＧＧＴＴＴＣＣ）をＲ３１（ＧＧＡＡＡＣＣＴＧＣ）にアニールし、そして ＤＮＡポリメラーゼのクレノーサブユニットを用いて伸長した。この二本鎖のＤ ＮＡフラグメントをプラスミドＦ８３のＳ■ａ１部位に連結し、２つの可能な配 向のうちの１つでプラスミドＦ１２０を生成した。この非関連配列を含むコード されたタンパク質を、　Ｆｅｒ１２０と呼ぶ。フェリチン構築物の模式図につい ては図１３を参照のこと。

プラスミド構築物の正確な挿入および配向は、配列分析により確かめられた。次 いで、すべてのフェリチン構築物を、上記のようにして（Ｊａｐｐｅｌｌｉら、 １９９２）　、　Ｅ、　ｃｏｌｉ中で発現させた。

フラジェリン： プラスミドｐＬｓ４０８　（Ｎｅｗｔｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４．　ＴＯ ）を、５ａｌｅｏｎｅｌｌａ　ｍｕｅｎｅｈｅｎからの旧−ｄフラジェリン遺伝 子を含むフラグメントの挿入により、ｐＵｃ１９プラスミドから得た。そのフラ ジェリン遺伝子からは、その超可変部中の２つのＥｃｏＲＶ部位の間の４８ｂｐ フラグメントが欠失している。従って、このプラスミドは、Ｈｌ−ｄフラジェリ ン遺伝子の２つのコドンの間に唯一のＥｃｏＲＶ制限酵素部位を含み、その制限 酵素部位に、外来配列をコードする枠にはまった（ｉｎ（ｒａｇｅ）挿入物を挿 入し得る。異種配列を発現しない、ｐＬｓ４０ｇによりコードされたフラジェリ ンを、以後Ｆ１ａ４０８と呼ぶ。プラスミドｐＬＳ４４９は、ｐＬｓ４０１１か ら、ＥｃｏＲＶ部位で２つの相捕的オリゴヌクレオチドＡＴＣ（ｉＴＴＣＡＧＧ ＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡおよびＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＡＴ ＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴを挿入することにより得た。これらは、最 初の余分のコドン（ＡＴＣ）を有するヒトＩＬ−１β１６３−１７１ペプチドを コードし、ＥｃｏＲＶ部位を再生する。従って、この挿入によりデカペプチドＩ ＶＱＧＥＥＳＮＤＫが合成される。ｐＬＳ４４９によりコードされたフラジェリ ンタンパク質をＦ１ａ４４９と呼ぶ。非免疫刺激挿入物ＥＧＮＩＪＤＱＶＳ　（ Ｂｏｒａｓｃｈｉら、１９９０）を含むフラジェリンＨ−１ｄ遺伝子をコードす るプラスミドｐＬｓｓ１７は、ヒト！Ｌ−１β　１６３−１７１の同一残基をラ ンダム配列中に含み、ＥｃｏＲＶ部位で２つの相捕的オリゴヌクレオチドＧＡＡ ＧＧＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣおよびＧＧＡＡＡＣＣＴＧ ＧＴＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴＴＣを挿入することにより得られた。

このプラスミドによりコードされたフラジェリン誘導体をＦ１ａ５ｔ７と呼ぶ。

フラジェリン構築物の模式図については図１ｂを参照のこと。プラスミド構築物 の正確な挿入および配向は、配列分析により確かめられた。上記のすべての構築 物は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ中で作製し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｕ助］ｌ■」（Ｎｅ ｗｔｏｎら、１９８９）のＬＢ５０００株を形質転換するのに用いた。５Ｌ５９ ２８は、≧０土ｉｎ　ａｒｏＡ株であり、これは、単一のフラジェリン遺伝子が トランスポゾンＴｎｌＯ（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９）の挿入により不活性化さ れた遺伝子によって置換されているので、非運動性である。

運動性は、機能的なフラジェリンタンパク質を発現する形質転換５Ｌ５９２８株 中で回復する。運動性は、０．４％寒天を含むＬＢ培地４０ｍ１を含むＦａｌｃ ｏｎチューブの先端に接種し、そして３７℃で１晩のインキユベーシヨンの後、 それがチューブの底で生育する能力で評価した。

ハイブリッドタンパク　の、・け フェリチンを、上記のように生産し、そして精製した（Ｊａｐｐｅｌｌｉら、１ ９９２）。３種の改変フェリチンは、すべて可溶性で耐熱性の２４マーにアセン ブルした。Ｆ８３またはＦ１０３プラスミドを含む細菌から精製したフェリチン タン７＜り質屋物を、変性５ＤＳ−ＰＡＧＥｉ；：よす分析し、ニトロセルロー ス上にプロ、ットし、そして抗−７エリチンまたは抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｏｒａ ｓｃｈｉら、１９８９、Ｊ、ｌｍ１ｕｎｏ１．　１４３．　１３１；　Ｓｃａｐ ｌｇｌｉａｔｉら、１９９１．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、、　１３８．３１）のいずれかでプローブした。フラジェリン：ま、 以下のようにして精製した：運動性の株を、１００μｇ７／ｓｌのアンピンリン を含む５００１のＬＢ培地中に接種し、そして３７°Ｃで１晩インキユベートし た。細胞を遠心分離（１０，０００ｘｇ　２０分間）で集め、そして６ｓｌのＰ ＢＳに再懸濁し、そして５分間ガラスピーズ（１５０−２１２μｍ）　（Ｓｉｇ ｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）とともに　ボルテ・ノクスにかけた。細胞 を１０，０ＯＯｘ　ｇ　２０分間の遠心分離により除去し、モして上清を０．４ ５　μｖｒのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｍｏ１ｓｈｅｉｙ＊、　Ｆｒ ａｎｃｅ）を通して濾過した。濾液を４°Ｃで１時間１００，０００ｘｇで遠心 分離した。フラジェリンを含むペレ・ノドを０．５ｓｌの０゜０１Ｎ　）ＩｃＩ 中に再懸濁し、そして１５分間０°Ｃでインキュベートし、フラジェリンをフラ ジェリンサブユニットに完全に解離させた。不溶性物質を４℃で１時間１００， ０００ｘ　ｇで遠心分離することにより除去し、そして上清を一２０°Ｃで貯蔵 した。フラジェリンを最終精製するために、アフィニティークロマトグラフィー を用いた。市販されている抗サルモネラ鞭毛抗血清（Ｄｉｒｃｏ。

Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）からのＩｇＧを、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇアフィニティー クｏｖトゲラフイー　（ＭａｂＴｒａｐ精製キット、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、υ Ｉ）ｐｌｓａｌａ、　５ｖｅｄｅｎ）を用いて精製した。次いで、精製１ｇＧを 、１ｍｍｕｎｏｐｕｒｅＡｇ／Ａｂ　１ｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　 Ｒ３（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、Ｃａｒｂｏｌｉｎｋゲル（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒ ｏｃｋ４ｏｒｄ、ＩＬ）にそのＦｃ領域を介して結合させ、そしてフラジェリン のアフィニティークロマトグラフィーを製造者の指示書に従って行った。最終産 物をＯ，ＯＩＮの１（ＣＩ中で貯蔵した。フラジェリンを、抗−７ラジエリン（ Ｄｉｒｃｏ）または抗−ＩＬ−１β（Ｓｅａｐｉｇｌｉａｔｉら、１９９１）の ポリクローナル抗体を用いる還元５ＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロッティング により分析した。フェリチンまたはフラジェリン中に挿入されたＶＱＧＥＥＳＮ ＤＫ配列の生物学的活性は、Ｇｈｉａｒａら、１９８？、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、、　１３’４．６７６；Ｎｅｎｃｉｏｎｉら、１９８７に記載されたように 、ハイブリ、、、ド構築物が５ＲＢＣ（Ｓｅｌａｖｏ　Ｓｐａ、　５ｉｅｎａ、 　Ｉｔａｌｙ）に対するマウスのインビボ免疫応答を増強する能力により測定し た。

タンパク　の　の？Ａ１ ６〜１０週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪｖウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、　Ｃａ １ｃｏ、　Ｉｔａｌｙ）に、発熱物質フリーの生理食塩水単独、または異なる量 の組換えタンパク質を含む発熱物質フリーの生理食塩水を、腹腔内（ｉ、ｐ、） 注射した。４日後、肺臓を取り出し、そして、以前に公開された手法（Ｓｗｅｅ ｔおよびＷｅｌｌｂｏｒｎ、　１９７１．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１０６ ．１４０７）によりＣｒＣｌ３を用いて、５ＲＢＣに結合した異種配列（Ｆｅｒ ８３またはＦ１ａ４０Ｂ）を持たないタンパク質に対して特異的なプラーク形成 細胞（ＰＦＣ）の数についてアッセイした。免疫化により誘導された特異的なＰ ＦＣ／牌臓の肺臓、生理食塩水単独を投与したマウスから得られたバックグラウ ンドＰＦＣ／肺臓の数を差し引いた後に決定した。抗原に対する血清１ｇＧレベ ルの測定のために、Ｆｅｒ８３（０，０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ　ｐＨ７，４ 中の１０μｇ／＋ｉｌ）またはＦ１ａ４０８（０，ＬＭ　Ｎａ２Ｃ０３ｐＨ９， ６中のｔμｇ／ｍｌ）を、９６ウエＪレプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｄｅｎ ｋｅｄｏｒｆ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）のウニＪしに室温（ＲＴ）で１晩吸着させた 。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いた飽和およびＰＢＳ＋０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２ ０（ＰＢＴ）を用いた充分な洗浄の後、０．１ｍｌの血清連続希釈液をウェルに 加え、そして３７°Ｃで２時間インキュベートシた。ＰＢＴで充分洗浄した後、 ０．１１１１のアルカリホスファターゼコンジコゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 （Ｓｉｇｍａ）　１：１゜０００希釈液を添加し、そして３７℃で２時間インキ ュベートした。

０、１ｍｌの２０＋ａｇ／ｍｌ　ｐ−二トロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｓａ ＞を基質として添加し、そして反応を暗闇中室温で３０分間進行させた。　４１ ５　ｒｖでの吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ（Ｆｌｏｗ　Ｌａ ｂｏｒａｔ。

ｒｉｅＳ、　１ｒｖｉｎｅ、　５ｃｏｔｌａｎｄ）を用いて分光光学的に測定し た。抗体力価（図４ｂ）は、コントロール（非免疫化）血清の最低希釈（１：１ ０）で認められる吸光度の２倍に等しい吸光度を与える、直線内挿で得られた血 清の最大希釈として表した。

逸肚圀近 ＰＦＣアッセイからの結果は、生理食塩水単独で免疫したマウスから得られた自 然ＰＦＣ値の平均値を差し引いた後、個々にアッセイした３匹のマウスのグルー プのＰＦＣ／牌臓の肺臓平均＋ＳＥＭとして表した。ＥＬＩＳＡアッセイからの データは、３〜６匹のマウスのグループのプールされた血清から得られた３回測 定の平均＋ＳＥＭとして表した。統計的な有意差は、スチューデントのｔ検定を 用いて評価した。

結果 ハイブリッド　築　の特徴・け 図１は、上記のようにして得られた、ヒトフェリチンＨ鎖（図１ａ）およびサル モネラフラジェリン（図１ｂ）の両者のハイブリッド構築物の模式図である。Ｖ ＱＧＥＥＳＮＤＫ配列のハイブリッド構築物への正確な発現の確認は、組換え精 製タンパク質のウェスタンプロット分析を用いて行った。図２は、フェリチン分 子の３次元表示でのＶＱＧＥＥＳＮ囲配列の位置を示す。その位置はその構造の 末端にある配列のむき出しのループにあることが、明瞭に示されている。

図３ａは、フェリチンを用い“Ｃ得られた結果を示す。レーン１および２はそれ ぞれ、Ｆｅｒ８３およびＦｅｒ１０３のクマシー染色を示す；　Ｆｅｒ１０３（ レーン２）で高い見かけ分子量が認められたことは、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫが挿入 されたことを示す。レーン３および４は、ポリクローナル抗−フエリチン抗血清 を用いて行ったウェスタンプロット分析の結果を示し、そこでは、両タンパク質 ともが抗体に結合し得たことが理解され得る。一方、ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ配列を 認識する抗−ＩＬ−１βモノクローナル抗体を用いるウェスタンプロ１．トの結 果（レーン５および６）は、キメラ構築物Ｆｅｒ１０３のみが、抗体に結合し得 たことを示す。Ｆｅｒ１０３はまた、ポリクローナル抗−ＩＬ−１β抗体（Ｓｃ ａｐｉｇｌｉａｔｉら、１９９１＞によっても認識された（データ示さず）。

図３ｂは、フラジェリン構築物を用いて行った類似の実験の結果を示す。Ｆ１ａ ４４９のタンパク質構造内にＶＱＧＥＥＳＮＤＫ配列が存在することにより、ク マシー染色（レーン１および２）により認められた見かけの分子量の差異が説明 される。Ｆ１ａ４０８およびＦ１ａ４０８の両者は、ポリクローナルの抗サルモ ネラ鞭毛抗体で染色されたが（レーン３および４）、抗−ＩＬ−１β抗体を用い るウェスタンプロット（レーン５および６）は、Ｆ１ａ４４９のみが認識され得 たことを示す。２種の宿主タンパク質に挿入されたＶＱＧＥＥＳＮＤＫ配列がな おその免疫刺激活性を発揮し得るかどうかを評価するために、フェリチンまたは フラジェリン構築物を、５ＲＢＣに対する免疫応答を増強するアジュ／インドと して使用した。表■は、ヒトＩＬ−１β１６３−１７１配列を有するＦｅｒ１０ ３　（Ｅｘｐ　１）およびＦ１ａ４４９（Ｅｘｐ　２）はともに、５ＦＩＢＣと 一緒に静脈内（ｉ。

ｖ、）注射されたときに免疫応答を有意に増強し得、一方２つのコントロールタ ンパク質Ｆｅｒ８３およびＦ１ａ４０８は不活性であったことを示す。観察され たアジュバント効果は、両実験において、ｌｎｇ／ｋｇの合成ペプチドＶＱＧＥ ＥＳＮＤＫを用いて観察された効果に対して比較され得る。タンパク質の投与量 （フェリチンに対しては２０ｎｇ／ｋｇ、そしてフラジェリンに対してはＳＯｎ ｇ／ｋｇ）は、ｌｎｇ／ｋｇのフリーの１６３−１７１１Ｌ−１β配列のモル量 に匹敵するモル量でマウスに注射するために選択された。

（以下余白） 表■ ＶＱＧＥＥＳＮＤＫペプチドを発現するタンパク質のアジュバント活性％４　Ｐ ＦＣ千ｉ＝　５ｐｓｃ１ｐハｚ−（ｙｓ　＋　ＳＥＭ）シ１信ゾお本　３５，６ ６７　土　１．１４Ｆｅｒ８コ　２０ｇｇ／ｋｇ　３９，０００　＋　１，１１ ７”Ｆ＠ｒｌＯ３６６，０００＋　１，０６４ｂ工Ｌ−１β１６３−１７１　” ９／ｋｃＪ　７０．ココ３　土　コ、５６２ｂｂ９．２ ！Ｌｆｔ＄４）’　３４，５００　＋　５，０５４Ｆｌａ４０Ｊ３　５０ｇｇ／ ｋｇ　４０，８ココ　ｊ　２，５０１”Ｆ１ａ４４９　６４，５００　＋　５， ６３４ｃ工Ｌ−１β＋ｅ、＋ｙ、ｌｎｇ／ｋｇ　７コ、３００　＋　１，０コ３ ’牌臓あたりの抗−５ＲＢＣＰＦＣの数を、材料および方法で記載されたように 、５ＲＢＣ単独、または、組換えタンパク質またはヒ）　ＩＬ−１β（７）合成 ペブ＋　ト１６３−１７１（ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ）とともに用いて行った静脈内 免疫化の４日後に測定した。（Ｆｅｒ８３およびＦ１ａ４０８、コントロールタ ンパク質；　Ｆｅｒ１０３およびＦ１ａ４４９、ＶＱＧＥＥＳＮ囲配列でグラフ ト化されたタンパク質）１　生理食塩水で処理されたマウスと有意な差はない。

ｂ　ｐ≦ｏ、　ｏａｔ　対　生理食塩水マウス’ｐ≦０．０２　対　生理食塩水 マウスｄ　ｐ≦０．００５　対　生理食塩水マウスハイブリッドタンパク　の　 性 発熱物質フリーの生理食塩水単独または異なる量の組換えタンパク質を含む発熱 物質フリーの生理食塩水を、マウスに腹腔内注射した。４日後に肺臓を取り出し 、そして５ＲＢＣに結合した宿主タンパク質に特異的なＰＦＣの数を、生理食塩 水単独を注射したマウスで認められた非特異的プラークを差し引いた後測定した （図４および表１１参照）。図４ａは、フェリチン変異体を用いて得られた結果 を示す。Ｆｅｒ１０３を注射したマウスは、１Ｇ、　５０．または４００ｕ　ｇ ／ｋｇの投与量でＦｅｒ８３で免疫したマウスに比べて、特異的ＰＦＣ／牌臓の 肺臓有意に高かった。マウスを２μｇ／ｋｇの組換えフェリチンで免疫したとき 免疫原性の増加は認められなかった。従って、配列ＶＱＧＥＥＳＮＤＫを含むフ ェリチン分子は、天然分子に比べて免疫原性である。同様の結果が、フラジェリ ン構築物を用いて得られた。図３ｂは、ハイブリッドタンパク質が、試験された いずれの投与量においても、ＩＬ−１β配列を持たないタンパク質より、有意に 多い数のフラジェリン特異的なＰＦＣ／肺臓を誘導したことを示す。

（以下余白） 表１１ コントロールまたは！し一１βペプチドを発現する組換えハイブリッドタンパク 質の免疫原性／ｉｚキＰＦＣ／ｑｉ榎−（ｍ　４　ＳＥＭ）Ｆｅｒ８３　５０Ｉ ｊｇ／ｋｇ　５８７　＋　１２ＢＦｅｒ１２０　”　５Ｅ１７　−ｊ−１８９ｂ ＦＩＯＩ　１，１５３　＋　８８ｃ ＥＸｐ、２’ Ｆ１ａ４０８　５０ｐｇ／ｋｇ　８１２　土６０Ｆｌａ５１７　５７９　＋　１ ００” Ｆ１ａ４４９　１．８１２土１７′ Ｆｅｒ８３（Ｅｘｐ、　１）またはＦ１ａ４０８（Ｅｘｌ）、　２）のいずれか に対して特異的なＰＦＣの数を、材料および方法で記載されたように、組換えタ ンパク質を用いた免疫化の４日後に測定した。

ａ　バックグラウンドＰＦＣ／肺臓は、８１８±７７であった。

ｂＦｅｒ８３免疫マウスと有意な差はない。

Ｃｐ≦０．０３　対　Ｆｅｒδ３免疫マウス。

ｄ　バックグラウンドＰＦＣ／Ｉｌｌ！臓は、５８４±９１であった。

”　Ｆ１ａ４０ｇ免疫マウスと有意な差はない。

′　ｐ≦０．００１対　Ｆ１ａ４０ｇ免疫マウス。

認められた免疫原性の増強の配列特異性を試験するために、非関連ペプチド配列 で同じ長さの挿入物を含むフェリチンおよびフラジェリン両者のハイブリッド構 築物をマウスの免疫化に用い、そしてキャリアタンパク質構造に、対する特異的 なｐｐｃ／Ｗ！ｉｌの数を測定した。表Ｉ＋は、これらのコントロールペプチド 、すなわち、Ｆｅｒ１２０（Ｅｘｐ、ｌ）またはＦ１ａ５１７（ＥＸｐ、　２） を含むハイブリッド構築物が、異種の挿入物（Ｐｅｒ８３およびＦ１ａ４０８） を持たない２つの対応するコントロールタンパク質と同様の免疫原性を有するこ とを示す。従って、Ｆｅｒ８３とＦ１ａ４４９の免疫原性の増強は、明らか！、 ：　ヒｌ−ＩＬ−１β１６３−１７１配列ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ（７）存在による ためであったと結論され得る。ハイブリッド構築物によって誘導された体液性免 疫応答の増大をより特徴付けるために、キャリアタンパク質に特異的なＩｇＧレ ベルを、ＩＬ−１β配列を発現するまたは発現しない組換えタンパク質で免疫し た動物の血清中で測定した。３匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスのグループに、５０ｇ ｇ／ｋｇのＦｅｒ８３を含む発熱物質フリーの生理食塩水またはＦｅｒ１０３を 腹腔内注射した。１０日後、血清を集め、そして宿主フェリチン構造に特異的な ＩｇＧのレベルに対して、　ＥＬＩＳ＾により試験した。図５３は、代表的な実 験の結果を示す；　ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ配列を発現するＦｅｒ１０３で免疫した マウスは、タンパク質Ｆｅｒ８３を投与された動物に対して、抗フェリチンＩｇ Ｇの総量が高かった。図５ｂは、フラジェリン構築物を用いて得られた同様の結 果を示す。６匹のマウスのグループを、Ｆ１ａ４０ｇまたはＦ１ａ４０８のいず れかの２４０ｕｇ／ｋｇを用いて腹腔的投与で免疫し、血清抗フラジェリンＩｇ Ｇカ価を、免疫化後に異なる時間で評価した。ハイブリッドフラジェリンで免疫 したマウスは、処理後１２日目では、非キメラ分子で免疫化したマウスより有意 に高い抗フラジェリン力価を有した。この差異は、注射後３８日目に採取した血 清中でさえ、なお有意であった。

４写ｆ（μｑ／ｋｑ） （ＬＬＩＬＪ　ｇｔｔ＋）　”！−／′７Ｆ％ｐ補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．そのアミノ酸配列内に、異種の免疫刺激ドメインのアミノ酸配列が含まれる 組換えペプチド抗原であって、該抗原はインターロイキン−１インヒビターでは ない、組換え抗原。
2. ２．前記免疫刺激ドメインがサイトカインに由来する、請求項１に記載の組換え 抗原。
3. ３．前記サイトカインがヒト１Ｌ−１βである、請求項２に記載の組換え抗原。
4. ４．前記抗原が配列：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫを含む、請求項１から３のいずれかに 記載の組換え抗原。
5. ５．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中の所定の位置に挿入される 、請求項１から４のいずれかに記載の組換え抗原。
6. ６．前記異種の免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中に、該ドメインの免 疫刺激特性および該抗原の少なくとも一つの保存抗原決定基を保持するような方 法で、挿入される、請求項５に記載の組換え抗原。
7. ７．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原の超可変部に挿入される、請求項６に記 載の組換え抗原。
8. ８．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原分子の以下であると決定される領域から 選択される、該抗原の−領域に挿入される、請求項６に記載の組換え抗原： ａ．アミノ酸配列中の改変に寛容である；および／または ｂ．抗原の構造の要素間にある結合配列である；および／または ｃ．抗原の３次元構造のむき出しの領域に位置する。
9. ９．組換えＤＮＡ技術により生産された、請求項１から８のいずれかに記載の組 換え抗原。
10. １０．請求項１から９にいずれかに記載の組換え抗原をコードするポリ核酸配列 。
11. １１．請求項１０に記載のポリ核酸配列であって、その中に正確な読み枠で挿入 された異種の免疫刺激ドメインをコードするポリ核酸配列を有する、ペプチド抗 原をコードするポリ核酸配列を含む、配列。
12. １２．以下の配列、または機能的に等価な部分、その変異体またはその類似体を 含む、請求項１０または１１に記載のポリ核酸配列： 【配列があります】。
13. １３．請求項１０から１２のいずれかに記載のポリ核酸配列を含むベクター。
14. １４．請求項１３に記載のベクターであって、宿主細胞内でエピソーム状態で該 ベクターの複製および維持を促進するのに有効な配列を含む、ベクター。
15. １５．請求項１３に記載のベクターであって、ベクター由来配列の宿主細胞ゲノ ムヘの組み込みを促進するのに有効な配列を含む、ベクター。
16. １６．請求項１３から１５のいずれかに記載のベクターであって、組換えペプチ ド抗原をコードするポリ核酸配列の転写および翻訳を促進するのに有効な配列を 含む、ベクター。
17. １７．請求項１３から１６のいずれかに記載のベクターで形質転換された宿主細 胞。
18. １８．原核宿主細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
19. １９．真核宿主細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
20. ２０．Ｅ．ｃｏ１ｉである、請求項１８に記載の宿主細胞。
21. ２１．請求項１から９のいずれかに記載の組換えペプチド抗原の生産方法であっ て、以下の工程を包含する、方法：ペプチド抗原をコードするポリ核酸配列を調 製する工程であって、該配列はその中に正確な読み枠で異種の免疫刺激ドメイン をコードするポリ核酸配列が挿入されている、工程；該調製されたポリ核酸配列 を発現系に挿入する工程；該調製されたポリ核酸配列を発現し、異種の免疫刺激 ドメインを含む抗原を生産する工程；および該抗原を収集する工程。
22. ２２．請求項１から８のいずれかに記載の組換え抗原の生産方法であって、以下 の工程を包含する、方法：請求項１３から１６のいずれかに記載のベクターで宿 主細胞を形質転換する工程； 該宿主細胞を培養する工程；および 該抗原を収集する工程。
23. ２３．請求項１から９のいずれかに記載の組換え抗原の生産方法であって、以下 の工程を包含する方法：請求項１７から２０のいずれかに記載の宿主細胞を培養 する工程；および 該抗原を収集する工程。
24. ２４．そのアミノ酸配列内に、異種の免疫刺激ドメインのアミノ酸配列が含まれ る組換えペプチド抗原を含むワクチン組成物。
25. ２５．前記組換えペプチド抗原が、サイトカインに由来する免疫刺激ドメインを 含む、請求項２４に記載のワクチン組成物。
26. ２６．前記サイトカインがヒト１Ｌ−１βである、請求項２５に記載のワクチン 組成物。
27. ２７．前記抗原が配列：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫを含む、請求項２５から２７のいず れかに記載のワクチン組成物。
28. ２８．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中の所定の位置に挿入され る、請求項２５から２７のいずれかに記載のワクチン組成物。
29. ２９．前記異種の免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中に、該ドメインの 免疫刺激特性および該抗原の少なくとも一つの保存抗原決定基を保持するような 方法で、挿入される、請求項２４から２８のいずれかに記載のワクチン組成物。
30. ３０．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原の超可変部に挿入される、請求項２９ に記載のワクチン組成物。
31. ３１．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原分子の以下であると決定される領域か ら選択される、該抗原の−領域に挿入される、請求項２９に記載の組換え抗原： ａ．アミノ酸配列中の改変に寛容である；および／またはｂ．抗原の構造の要素 間にある結合配列である；および／または ｃ．抗原の３次元構造のむき出しの領域に位置する。
32. ３２．前記組換えペプチド抗原が、組換えＤＮＡ技術で生産される、請求項２４ から３１のいずれかに記載のワクチン組成物。
33. ３３．ワクチンとしての使用のための組成物の製造における、ペプチド抗原のア ミノ酸配列を含む組換えペプチド抗原の使用であって、該抗原のアミノ酸配列内 に累種の免疫刺激ドメインのアミノ酸配列が含まれる、使用。
34. ３４．前記組換え抗原が、サイトカイン由来の免疫刺激ドメインを含む、請求項 ３３に記載の使用。
35. ３５．前記サイトカインがヒト１Ｌ−１βである、請求項３４に記載の使用。
36. ３６．前記抗原が配列：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫを含む、請求項３３から３５のいず れかに記載の使用。
37. ３７．前記累種の免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中の所定の位置に挿 入される、請求項３３から３６のいずれかに記載の使用。
38. ３８．前記異種の免疫刺激ドメインが、前記抗原の分子構造中に、該ドメインの 免疫刺激特性および該抗原の少なくとも一つの保存抗原決定基を保持するような 方法で、挿入される、請求項３７に記載の使用。
39. ３９．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原の超可変部に挿入された、請求項３７ に記載の使用。
40. ４０．前記免疫刺激ドメインが、前記抗原分子の以下であると決定される領域か ら選択される、該抗原の−領域に挿入される、請求項３７に記載の組換え抗原： ａ．アミノ酸配列中の改変に寛容である；および／またはｂ．抗原の構造の要素 間にある結合配列である；および／または ｃ．抗原の３次元構造のむき出しの領域に位置する。
41. ４１．前記組換え抗原が、組換えＤＮＡ技術により生産される、請求項３３から ４０に記載の使用。
42. ４２．請求項１から９のいずれかに記載の組換え抗原と薬学的に受容可能なキャ リアとを会合させる工程を含む、ワクチンを製剤化する方法。
43. ４３．ヒトまたは動物被験体において病気を予防または治療するための方法であ って、該被験体に、請求項２４から３２のいずれかに記載のワクチンの有効量を 投与する工程を含む、方法。