JP3394774B2 - コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンltの免疫原性無毒化変異体,それらの調製,ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用 - Google Patents
コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンltの免疫原性無毒化変異体,それらの調製,ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用Info
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Description
またはPro−106の1つ以上のアミノ酸の置換を有する、
コレラトキシン(CT)の免疫原性無毒化タンパク質、あ
るいは、Escherichia coli(E.coli)の毒素原性株によ
り産生された非耐熱性トキシン(LT)の免疫原性無毒化
タンパク質、ならびに、コレラまたは毒素原性E.coliの
感染の予防あるいは治療に有用なワクチンでのそれらの
使用に関する。これらのタンパク質は、野生型トキシン
をコードするDNAの部位特異的変異誘発による組換えDNA
技術を用いて、適切に産生され得る。
病であり、ある地域では、それは風土病である。腸系に
生じるこの重い病気は、この疾患の記録されているケー
スの高い割合で致命的であることが示される。
(V.cholerae)である。これは、汚染された食物あるい
は水の摂取を介して接触した個体の腸管にコロニー化
し、そして非常に高密度に繁殖する。基本的な症状は、
激しい下痢であり、その結果被検体は、ふん便によって
一日あたり10〜15リットルもの液体を損失し得る。この
激しい脱水および電解質の損失の結果、被検体は、この
感染の50〜60%のケースにおいて耐えられず、死亡す
る。V.choleraeにより起きた下痢は、アデニレートシク
ラーゼ酵素の活性化を刺激することにより作用して細胞
レベルで障害を引き起こす、コレラトキシンCTの分泌に
よる。コレラは、制御された強烈な水分再吸収(rehydr
ation)再水和により効果的に治癒され得るが、この疾
患の完全な制御および将来的な絶滅には、ワクチンの普
及が望まれる。
るワクチン接種が存在する。いくつかの国では、この疾
患に対するワクチン接種が要求されているが、現在の細
胞性ワクチンは、完全の50%のケースにおいてのみ予防
し、そしてその予防はまた6ヶ月未満の持続に極度に制
限されるので、その真の有用性が非常に疑わしい。
られる。コレラトキシンのサブユニットBを付加した死
滅細菌からなる経口ワクチンの、実験的な試みが進行中
である(1990−92)。この産物は、特別な副作用も伴わ
ず、永続的な予防を持続する(Holmgren J.,Clemens
J.,Sack DA.,Sanchez J.およびSvennerholm AM;「コレ
ラに対する経口免疫処置」Curr.Top.Microbiol.Immuno
l.(1988),146,197−204)。
非耐熱性トキシンに、アミノ酸配列、構造、および作用
様式において、類似する。
ており(コレラよりも激しくないが)、激しい下痢およ
び腸の疾患からなる。
原因である1つのAサブユニット(あるいはプロトマー
A)(本明細書中ではCT−AあるいはLT−A)、およ
び、トキシンと腸上皮細胞との結合に関連する、5つの
同一の(identical)Bサブユニット(あるいはプロト
マーB)(本明細書ではCT−BあるいはLT−B)を含有
する。
を制御するGTP結合タンパク質のNAD依存ADPリボシル化
により、アデニレートシクラーゼの活性化を引き起こ
す。これの臨床的な影響は、腸での大量の液体の損失を
引き起こすことである。
性トキシンについて行われてきた。
J.J.ら、Nature 306,551ページ(1983))。
るように、CTに80%相同であり、これもまた周知で科学
文献に記載されている。Spicer E.K.ら(Biol.Chem.257
p.5716−5721(1982))には、ブタに認められるE.col
iの毒素原性株由来の非耐熱性トキシンのAサブユニッ
トのアミノ酸配列が記載されている。
169,5180−5187,(1987))により、同定され、そして
配列決定された。
LTのAサブユニットの配列もまた、配列決定された(Ya
mamotoら、J.Biol.Chem.,259,5037−5044(1984))。
臨床上の重要性の観点から、コレラおよび毒素原性細菌
に対して免疫し得る、無毒化トキシンを生産する、継続
的かつ偉大な目的が存在する。遺伝子工学の技術は、こ
のトキシンをコードする遺伝子への特定の変異株の導
入、ならびに、遺伝子発現およびタンパク質精製の従来
の技術による、変異トキシンの生産を可能にする。
性の損失に関連する、遺伝子変異の同定を試みてきた。
これらの研究は、主としてE.coli由来のトキシンLTの遺
伝子に関して実施されている。
9))には、ブタに対して病原性のE.coli由来のLT−A
遺伝子のインビトロ変異誘発による、トキソイドの生産
が記載されている。得られた成功例の変異は、Ser−61
−Phe置換およびGly−79−Lys置換を包含する。前者は
より重要と考えられる。Harfordらは、ヒトおよびブタ
に病原性であるE.coli中にLT−A遺伝子と、CT−A遺伝
子との間の類似性、ならびに、このトキシンは共通の機
構により作動すると考えられることから、Ser−61−Phe
変異をCT−A遺伝子に導入することにより、コレラのハ
ロトキソイドを生産する可能性があり得ることを示唆し
ている。
は、変異LTの毒性に影響するが、そのタンパク質の免疫
原性は変化させない、1つの置換Glu−112−Lysを産生
するプラスミドEWD299由来のLT−A遺伝子の変異が記載
されている。
rican Society for Microbiologyの要旨集B289,1992年
5月26−30日)には、酵素活性を著しく低下させる、LT
−A中の、44位および70位のヒスチジンならびに127位
のトリプトファンの同類置換が記載されている。
きた。
ican Society for Microbiologyの要旨集B291,1992年5
月26−30日)には、本質的に全ての活性を排除する、CT
−A中の、Asp−9およびHis−44の変異、ならびに、ア
ミノ酸180位以降の切断(truncating)が記載されてい
る。Arg−9変異は著しく活性を弱めると言われてい
る。その他のアミノ酸部位の変異は、毒性に対してほと
んど影響はなかった。
70,(1991)には、Bordetella pertussisトキシンのA
サブユニットの公知の無毒化変異と平行する、Arg−7
−Lys変異を産生するCT−Aの部位特異的変異誘発が記
載されている。変異は、検出可能なADPリボシルトラン
スフェラーゼ活性を完全に撤廃させた。
en Inc.)には、Arg−7、Asp−9、Arg−11、His−4
4、His−70、およびGlu−112でのCT−Aの変異が記載さ
れている。
変異もまた、文献に記載されている(Lobet,Inf.Immu
n.,2870,1991;Lai,Biochem.Biophys.Res.Comm.341 198
3;Okamoto J.Bacteriol.2208,1988)。
1年5月)により決定され、変異誘発が以前の文献に記
載された結果生じることが確認された。このことは、A
サブユニットの活性に、Glu−112およびSer−61の構造
的な重要性を説明し、そして、非常にすぐ近位のHis−4
4、Ser−114、およびArg−54が、触媒作用および認識に
重要であり得ることを示唆する。
およびLT−Aの配列中のかなり遠くのアミノ酸が、適切
に、個別に、あるいはその他の変異と結合するように変
異した際に、CTおよびLTの酵素活性を減少し得る位置に
存在することが、発見された。
はLT由来のトキソイドである1つの抗原からなる、二次
発生産物による、コレラあるいは毒素原性E.coliに対す
る完全な予防を与えるワクチンの提供である。
させ、そして、好ましくはなくするが、トキソイドの免
疫原性特性は維持している。
A)のサブユニットAのアミノ酸配列またはそのフラグ
メント、あるいは、Escherichia coli非耐熱性トキシン
(LT−A)のサブユニットAのアミノ酸配列あるいはそ
のフラグメントを含有する、免疫原性無毒化タンパク質
が提供される。ここでVal−53、Ser−63、Val−97、Try
−104、またはPro−106のいずれかの位置またはこれら
に対応する位置にある、1つ以上のアミノ酸が、他のア
ミノ酸と置換される。
中に位置している。これはアミノ酸配列中および構造的
に保存されており、従って、CTおよび種々のLT類に共通
である。
る野生型トキシンと、本質的に同じ構造のコンフォメー
ションを有する。これは、免疫学的に活性であり、野生
型トキシンに対する抗体と交差反応する。
する変異株、さらに、構築された毒素の免疫原性に影響
しない、本明細書で開示されている配列由来の変化を包
含するその他の変異株が、包含される。
物とは、成熟コレラトキシンサブユニットA(CT−A)
の配列中のその位置のアミノ酸のことを示し、これには
シグナル配列がない(図1を参照のこと)。
が、図1に示されるような、CT−A中の対応する位置を
さしている。
に対応し、そして、CT中のSer−63はLT1のSer−62に対
応するので、LT1配列の番号をつけたアミノ酸89位まで
に1つのアミノ酸の異なりが存在する。CT配列中のVal
−97は、配列中のその位置で4つのアミノ酸の異なりが
あるので、LT1配列中のVal−93に対応する。
ば、Arg−7、Asp−9、Arg−11、His−44、Arg−54、S
er−61、His−70、His−107、Glu−110、Glu−112、Ser
−114、Trp−127、Arg−146、あるいはArg−192での1
つ以上の置換のような、その他の変異を含み得る。
に存在するアミノ酸であり得る、あるいは、改変または
合成アミノ酸であり得る。置換には、アミノ酸全体の欠
損が含まれ得る。ここで、変異は、必要な免疫原性特性
を維持し、実質的に毒性の低下を示す。
いるが、両電解質性および親水性を変化させる置換が、
一般的には好ましい。
l−53−Tyr、Ser−63−Lys、Val−97−Lys、Val−97−T
yr、His−107−Glu、Tyr−104−Lys、Tyr−104−Asp、T
yr−104−Ser、Pro−106−Ser、Ser−114−Glu、Ser−1
14−Lysが含まれる。
免疫原性組成物が、それに対応の天然に存在するトキシ
ンに比較して、実質的により低い毒性を示すことを意味
する。実質的により低い毒性は、著しい副作用の引き起
こしを伴なうワクチンとして、免疫学的に有効な量で免
疫原性組成物に使用されるタンパク質に関して、十分に
低くあるべきである。例えば、免疫原性無毒化タンパク
質は、それに対応の天然に存在するトキシンに0.01%未
満の毒性を有するべきである。毒性は、マウスCHO細胞
で、あるいは、好ましくはY1細胞に誘導された形態学的
変化の評価により測定され得る。用語「トキソイド」と
は、遺伝子的に無毒化されたトキシンを意味する。
トキソイドであり得るが、好ましくは、1つの変異CT−
AあるいはLT−AサブユニットおよびCTあるいはLTの5
つのBサブユニットを含有する、構築された(assemble
d)トキシンである。Bサブユニットは、天然に存在す
るサブユニットであり得るか、あるいはそれ自身変異さ
れ得る。
切に改変された、天然に存在するCT−AあるいはLT−A
である。しかし、保守的アミノ酸変化は、免疫原性タン
パク質の免疫原性あるいは毒性には影響せず、好ましく
は、Bサブユニットタンパク質を有する完全なトキシン
を形成する免疫原性タンパク質の活性には影響しないよ
うになされ得る。さらに、免疫原性タンパク質は、CT−
AあるいはLT−Aのフラグメントであり得る。ここで、
フラグメントは、免疫原性かつ非毒性であり、本発明に
従う変異の1つを含有する、少なくとも1つの保存領域
を含有する。
免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキ
ャリアを含有するワクチンとしての使用のための、免疫
原性組成物が提供される。
よび/または薬学的に受容可能な希釈剤を含有し得る。
無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを
含有するワクチン組成物を提供する。このワクチン組成
物はさらにアジュバントを含有し得る。
leraeあるいはEscherichia coliの毒素原性株に対する
ワクチン接種の方法を提供する。この方法には、本発明
の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質を免疫学
的に有効な量で投与する工程が包含される。
ド合成技術を用いて化学的に合成され得るが、好ましく
は、組換えDNA技術により生産される。
従う免疫原性無毒化タンパク質をコードするDNA配列が
提供される。
ット中に、無毒化サブユニットAおよびサブユニットB
の両方をコードするDNAを包含する、完全なCTまたはLT
をコードするDNA配列を含む。あるいは、このDNAは無毒
化サブユニットAのみをコードし得る。
従うDNAを輸送するベクターを提供する。
従うベクターで形質転換された宿主細胞系を提供する。
あり得るが、所望する免疫原性無毒化タンパク質を産生
するように好適に設計された、好ましくは細菌、最も好
ましくはE.coliあるいはV.choleraeである。
胞はそれ自身、防御種(protective species)、例え
ば、野生型LTあるいはCTを欠き、そして本発明の第一局
面の免疫原性無毒化タンパク質を運搬して発現する表現
型に変異されたE.coliあるいはV.cholerae株を提供し得
る。
胞は、本発明の第一の局面に従う染色体LT−A遺伝子を
発現し得る。
従う免疫原性無毒化タンパク質の製造方法を提供する。
この方法には、本発明の第六の局面に従う宿主細胞を培
養する工程が包含される。
従うDNAの製造方法を提供する。この方法には、CT−A
またはLT−AをコードするDNAあるいはそれらのフラグ
メントを、部位特異的変異誘発に供する工程を包含す
る。
従う免疫原性無毒化タンパク質を、薬学的に受容可能な
キャリア、および、必要に応じてアジュバントと合わせ
る工程を包含する、ワクチンの調製方法を提供する。
るいはE.coliトキシン原性株による感染の予防および治
療に有用なワクチン組成物の活性成分を構成する。従っ
て、この組成物は製薬業での使用に適用し得る。
を示す: i) コレラトキシン(CT−Mekalanosら、前掲) ii) ヒトに認められるE.coli株由来の非耐熱性トキシ
ン(LT1_1−Yamamotoら、前掲) iii)ブタに認められるE.coli株由来の非耐熱性トキシ
ン(LT1−Spicerら、前掲)、および iv) 感染体源由来の非耐熱性トキシン(LT1_1−Picke
ttら、前掲) シグナル配列は示していない。
る。記号「.」は、アミノ酸がないことを示し、印刷上
のスペースで、比較が容易となるように配列を整列させ
た。記号「−」は、CT中の対応アミノ酸と一致するLT1
およびLT2配列中のアミノ酸を示す。各列に対する番号
は、その列の最初のアミノ酸のアミノ酸番号である。
す。
ミノ酸およびDNA配列の比較である。
(Dallasら)の制限マップである。
内の、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫
学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に
十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULA
R CLONING;A LABORATORY MANUAL,第2版(1989);DNA C
LONING,I巻およびII巻(D.N.Glover編1985);OLIGONUCL
EOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編、1984);NUCLEIC ACID
HYBRIDIZATION(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編1984);
TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.HamesおよびS.J.
Higgins編1984);ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney
編1986);IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES(IRL Press,
1986);B.Perbal,A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLO
NING(1984);シリーズのMETHODS IN ENZYMOLOGY(Aca
demic Press,Inc.);GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMA
LIAN CELLS(J.H.MillerおよびM.P.Calos編1987,Cold S
pring Harbor Laboratory),Methods in Enzymology Vo
l.154およびVol.155(それぞれ、WuおよびGrossman,お
よびWu,編),MayerおよびWalker,編(1987),IMMUNOCHE
MICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Acade
mic Press,London),Scopes,(1987),PROTEIN PURIFIC
ATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,第2版(Springer−Ve
rlag,N.Y.)、およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNO
LOGY.I−IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編1986)
を、参照のこと。
細書で使用されている。本明細書に引用された全ての出
版物、特許、および特許出願は、参考として援用されて
いる。
施例に挙げた例には、特に掲載した変異の部位以外で、
タンパク質の天然アミノ酸配列から比較的少ないアミノ
酸の変異を有するポリペプチドが包含される。
組換えDNA技術により免疫原性無毒化タンパク質を生産
する重大な利点は、天然源からタンパク質を単離するの
に必要とされる量よりも少量の開始物質を使用して、同
量のタンパク質が生産され得ることである。組換え技術
によるタンパク質の生産はまた、細胞内に通常存在する
ある種の分子の非存在下での、タンパク質の単離を可能
にする。事実、どのようなヒトタンパク質夾雑物(cont
aminants)も完全に含まないタンパク質組成物が、容易
に製造され得る。なぜなら、組換え非ヒト宿主により生
産されたヒトタンパク質のみが、問題の組換えタンパク
質である。ヒトに対して病原性の、天然源からの潜在的
ウイルス因子およびウイルス成分もまた、排除される。
さらに、遺伝子的に無毒化されたトキシンは、従来の化
学的に無毒化されたトキシンほど毒性が戻らないようで
ある。
成物が与えられる個体に有害な抗体の産生を誘導しな
い、任意のキャリアが包含される。適切なキャリアは、
典型的には大きく、徐々に代謝される高分子、例えば、
タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ
マー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体(例
えば、油滴またはリポソーム)、および不活性化ウイル
ス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知で
ある。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激物質(ア
ジュバント)として機能し得る。
は、以下が包含されるが、限定はされない:水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど
のようなアルミニウム塩(alum)、ムラミルペプチドま
たは細菌細胞壁成分のような多の特定の免疫刺激物質を
伴うかまたは伴わない、オイルエマルジョン調製物、例
えば、(1)MF59(公開国際特許出願第WO−A−90/148
37号、5%スクアレン、0.5% Tweew 80、0.5% Span
85を含有する(必要ではないが、場合に応じて、種
々の量のMTP−PE(以下を参照のこと)を含有する);
ここでMF59は、Model 110Yマイクロフルイダイザー(mi
crofluidizer)(Microfluidics,Newton,MA 02164)の
ようなマイクロフルイダイザーを用いて、サブミクロン
粒子に調製されている、(2)SAF、すなわち10%スク
アレン、0.4% Tween 80、5%プルロニックブロックポ
リマーL121(Pluronic−blocked polymer L121)、およ
びthr−MDP(以下を参照のこと)を含有する;ここでSA
Fは、マイクロフルイダイザーでサブミクロンエマルジ
ョンにするか、または、ボルテックスにかけてより大き
な粒子サイズのエマルジョンにする、および、(3)RI
BITMアジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilto
n,MT);2%スクアレン、0.2% Tween 80、および、以
下からなる群の1つ以上の細胞壁成分を含有する:モノ
ホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジマイコレ
ート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMP
L+CWS(DetoxTM)、ムラミルペプチド(例えば、N−
アセチム−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタ
ミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルウラミル−L−
アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセ
チルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−
L−アラニン−2−(1'−2'−ジパルミトイル−sn−グ
リセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルア
ミン(MTP−PE)など)、およびサイトカイン(インタ
ーロイキン(IL−1、IL−2など)マクロファージコロ
ニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)な
ど)。さらに、StimulonTM(Cambridge Bioscience,Wor
cester,MA)のようなサポニンアジュバントが使用され
得るか、または、それからISCOMS(免疫刺激複合体)の
ような粒子がつくられ得る。さらに、完全フロイントア
ジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバン
ト(IFA)が、使用され得る。AlumおよびMF59が好まし
い。
キャリアおよびアジュバント)は、典型的には、水、生
理食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈剤を含
有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質な
どの補助物質が、このような賦形剤に存在し得る。
溶液または懸濁液のいずれかに調製される;それはま
た、注射の前に液体賦形剤中で、溶液あるいは懸濁液と
するのに適した固形として、調製され得る。調製物もま
た、上記のように、薬学的に受容可能なキャリア中で、
アジュバント効果を増強するために、乳化されるか、あ
るいはリポソームにカプセル化され得る。
的に有効な量の抗原ポリペプチドに加えて、必要に応じ
て、他の上記した成分を含有し得る。「免疫学的に有効
な量」により、個体への投与量が、単回投与において、
または一連の一部として、治療または予防に有効である
ことを意味する。この量は、治療されるべき個体の健康
状態または生理的状態、治療されるべき個体の分類群
(例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など)、抗体合成
に対する個体の免疫系の許容量、所望の予防の程度、ワ
クチン調製物、医学上の治療医の見解、およびその他の
関連因子に依存して変化する。その量は、日常試験によ
り決定され得るが、比較的広範囲であることが予測され
る。
たは筋肉内注射のいずれかで、従来より投与されてい
る。その他の投与形態に適した調製物には、経口および
肺用の調製物、坐薬および経皮塗布が包含される。投与
治療は、単回投与スケジュールあるいは複数回投与スケ
ジュールであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤
と組み合わせて投与され得る。
チド」とは、ゲノム、cDNA、半合成、または合成起源
の、以下の起源または操作による、ポリヌクレオチドの
ことを意味する:(1)天然に結合されているポリヌク
レオチドの全体または部分に結合しない、(2)天然に
連結されているその他のポリヌクレオチドに結合する、
あるいは(3)天然に存在しない。
とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドのいずれかの、任意の長さのポリマー型のヌクレオチ
ドのことである。この用語は、分子の一次構造のみを呼
ぶ。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖DNAお
よびRNAが包含される。さらに、この用語には、周知の
改変型、倒えば、当該分野で公知の標識、メチル化、
「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのアナログ
との1つ以上の置換、ヌクレオチド内の改変(例えば、
非帯電結合(例えば、メチルホスフェート、トリエステ
ルホスフェート、ホスホアミデート、カルバメートな
ど)および帯電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエートなど)での改変(この場合、ペンダ
ント部分として、例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、
トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジン
などを包含する)を有する)、挿入剤(例えば、アクリ
ジン、ソラレンなど)での改変、キレーター(例えば、
金属、放射活性金属、ボロン、酸化金属など)を含む改
変、アルキル化剤を含む改変、改変結合(例えば、α−
アノマー核酸など)での改変)、および、ポリヌクレオ
チドの非改変型が、包含される。
自律ユニットとして挙動する、すなわち、それ自身の制
御下で複製し得る、遺伝要素(例えば、プラスミド、染
色体、ウイルス、コスミドなど)である。これには、選
択可能なマーカーが含まれる。
/または発現をもたらすように、他のポリヌクレオチド
セグメントが接続されたレプリコンである。
たらすのに必要なポリヌクレオチドのことである。この
ような制御配列の特性は、宿主生物に依存して異なる;
原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロモ
ーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含
む;原核生物において、このような制御配列は一般に、
プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配
列」は、最少限で、発現に必要な全ての成分を含み、さ
らに、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列
のような、存在すれば好都合である成分も含む。
た様式で機能し得る関係にある並置のことである。コー
ド配列に「作動可能に結合された」制御配列は、制御配
列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成される
ように連結される。
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であ
る;この領域は、コード配列の一部分または全コード配
列を表し得る。
れると、通常mRNAを介してポリペプチドに翻訳され得る
ポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'
−末端の翻訳開始コドンおよび3'−末端の終止コドンに
より決定される。コード配列には、cDNAおよび組換えポ
リヌクレオチド配列が含まれ得るが、限定はされない。
よびScharfら、Science(1986)233:1076−1078;および
米国特許第4,683,195号;および米国特許第4,683,202号
に記載されているポリメラーゼ連鎖反応の技術のことで
ある。
様式でyと関連しない場合、xはyに関して「異種」で
ある;すなわち、xが事実上yに関連しないか、あるい
はxが実際に認められるのと同じ様式でyに関連しない
場合である。
ある。1つの型とその他の型との配列間の相関は、当該
分野に公知の方法により決定される。例えば、これら
は、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定
され得る。あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成
する条件下で、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ
(例えば、ハイブリダイゼーションはS1消化に先だって
用いられる)、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼによ
り消化し、次に、消化フラグメントのサイズを測定する
ことにより、相同が決定され得る。
は、アミノ酸ポリマーのことであり、特定の長さの産物
のことではない;従って、ポリペプチドの定義には、ペ
プチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が包含され
る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変、例
えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを意味
するのではなく、すなわち除外する。定義に含まれるも
のは、例えば、1つ以上のアミノ酸アナログ(例えば、
非天然のアミノ酸を含む)を有するポリペプチド、置換
連結(substituted linkages)、および、当該分野に公
知の他の天然に存在ならびに天然に非存在の両方の、改
変を有するポリペプチドである。
ノ酸配列は、その配列中にコードされたポリペプチドの
アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、あるいはその部分のことであり、ここでその部分
は、少なくとも3−5のアミノ酸からなり、さらに好ま
しくは、少なくとも8−10のアミノ酸、さらに好ましく
は少なくとも11−15のアミノ酸からなるか、または、そ
のペプチドは配列中にコードされたポリペプチドと免疫
学的に同一であると見なし得る。この用語にはまた、指
定の核酸配列から発現されるポリペプチドが包含され
る。
ーナルあるいはポリクローナルのいずれかの抗体を産生
するのに使用され得る。これらの抗体を産生する方法
は、当該分野に公知である。
胞培養物」および、その他のこのような用語は、例え
ば、組換えベクターあるいはその他のトランスファーDN
A用の受容体として使用され得るか、または使用された
微生物、昆虫細胞、および哺乳類細胞を意味し、そし
て、形質転換された初代細胞の子孫を包含する。単一の
親細胞の子孫は、自然的、偶発的あるいは意図的変異に
より、形態学あるいはゲノムDNAまたは全DNA相補鎖にお
いて、初代の親のようには必ずしも完全に同一であり得
ないことは理解される。哺乳類宿主細胞の例としては、
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびサル腎
(COS)細胞が挙げられる。
ビトロにおいて増殖および分化を継続あるいは延長し得
る細胞群のことである。しばしば、細胞系は、単一の先
祖細胞に由来するクローン群である。このようなクロー
ン群の貯蔵あるいは移動の間に、自発変化あるいは誘発
変化が核型において生じ得ることがさらに当該分野では
知られている。従って、引用の細胞系由来の細胞は、先
祖細胞あるいは培養物と正確には同一であり得ず、そし
て引用の細胞系は、そのような変種を含む。用語「細胞
系」はまた、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞
系は、非ハイブリッド細胞系あるいはハイブリドーマの
2つの細胞型のみを含む。
および細菌のような原核および真核の微生物種が包含さ
れ、細菌には、酵母および糸状菌が包含される。
ば、直接取り込み(direct uptake)、トランスダクシ
ョン、f−メーティング、あるいはエレクトロポレーシ
ョンのような、挿入に使用される方法に関係なく、宿主
細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入のことである。
外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドのような非組込
みベクターとして維持され得るか、あるいは宿主ゲノム
に組込まれ得る。
制限フラグメントに由来するDNA分子のコレクションあ
るいはライブラリーを意味する。これは、生物の遺伝子
物質の全てあるいは部分を包含し得る。
る、相補DNA鎖を意味する。
プチドあるいはヌクレオチド配列に関する場合には、指
示される分子が、それと同じタイプの生物学的高分子が
他に実質的に存在していない状態で、存在することを意
味する。本明細書に使用されている用語「精製された」
は、同じタイプの生物学的高分子が、少なくとも75重量
%、好ましくは、少なくとも85重量%、さらに好ましく
は、少なくとも95重量%、そして最も好ましくは98重量
%存在することを意味する(しかし、水、緩衝液、およ
びその他の低分子、特に、分子量が1000未満の分子は、
存在し得る)。
の異なった発現系において発現され得る;例えば、それ
は、哺乳類細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母
と共に使用される。
ーターは、哺乳類RNAポリメラーゼを結合し、そしてコ
ード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3')
転写を開始し得るあらゆるDNA配列である。プロモータ
ーは、コード配列の5'末端近傍に通常位置する転写開始
領域、および転写開始部位の25〜30塩基対(bp)上流に
通常位置するTATAボックスを有する。TATAボックスは、
RNAポリメラーゼIIを方向づけ、正しい部位でRNA合成を
開始すると考えられている。哺乳類プロモーターはま
た、TATAボックスの100から200bp上流内に通常位置する
上流プロモーター要素も含む。上流プロモーター要素
は、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に
作用し得る[Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
第2版中のSambrookら、(1989)「哺乳類細胞における
クローン化遺伝子の発現」]。
され、そして広い宿主の範囲を有する。従って、哺乳類
ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモ
ーター配列を提供する。その例として、SV40初期プロモ
ーター、マウス乳ガンウイルスLTRプロモーター、アデ
ノウイルス主後期(majorlate)プロモーター(Ad ML
P)および単純性疱疹ウイルスプロモーターが挙げられ
る。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウ
イルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配
列を提供する。発現は、プロモーターがホルモン応答性
細胞内のグルココルチコイドで誘導され得るか否かによ
って、構成的であり得るか、または調節され得る(誘導
可能)。
れは上記のプロモーター要素と組合わさって、通常、発
現レベルを増加させる。エンハンサーは、相同または異
種のプロモーターと連結すると、正常なRNA開始部位で
の合成開始と共に転写を1000倍にまで増加し得る調節DN
A配列である。エンハンサーはまた、転写開始部位から
上流または下流に位置しても、正常な方向もしくは逆方
向のいずれの方向でも、またはプロモーターから1000ヌ
クレオチドより遠く離れた位置にあっても機能する。
[Maniatisら、(1987)Science 236:1237;Albertsら、
(1989)Molecular Biology of the Cell,第2版]。ウ
イルス由来のエンハンサー要素は特に有用であり得る。
なぜなら、これらは通常、より広い宿主の範囲を有する
ためである。その例としては、SV40初期遺伝子エンハン
サー[Dijkemaら、(1985)EMBO J.4:761]、ならびに
ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)[Gormanら、
(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777]およびヒトサ
イトメガロウイルス[Boshartら、(1985)Cell 41:54
2]由来のエンハンサー/プロモーターが挙げられる。
さらに、エンハンサーの中には調節可能で、ホルモンま
たは金属イオンなどの誘導物質の存在下でのみ活性とな
るものがある[Sassone−CorsiおよびBorelli、(198
6)Trends Genet.2:215;Maniatisら、(1987)Science
236:1237]。
プロモーター配列はDNA分子と直接連結し得、その場
合、組換えタンパク質のN末端の第1アミノ酸は、常に
ATG開始コドンによってコードされるメチオニンであ
る。所望なら、臭化シアンを用いてインビトロでインキ
ュベートすることによって、N末端はタンパク質から切
断され得る。
すリーダー配列フラグメントから構成され、そして融合
タンパク質をコードするキメラDNA分子を形成すること
によって、異種タンパク質もまた、細胞から増殖培地へ
分泌され得る。リーダーフラグメントと異種遺伝子との
間でコードされ、そしてインビボまたはインビトロで切
断され得るプロセシング部位があることが好ましい。リ
ーダー配列フラグメントは、通常、細胞からタンパク質
を分泌させる疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプ
チドをコードする。アデノウイルス3分節系(triparit
e)リーダーは、哺乳類細胞内で異種タンパク質を分泌
するリーダー配列の一例である。
リアデニル化配列は、翻訳終止コドンから3'側に位置す
る調節領域であるため、プロモーター要素と共にコード
配列に隣接する。成熟mRNAの3'末端は、部位特異的転写
後切断およびポリアデニル化によって形成される[Birn
stielら、(1985)Cell 41:349;Transcription and spl
icing(B.D.HamesおよびD.M.Glover編)中のProudfoot
およびWhitelaw、(1988)「真核生物のRNAの終結およ
び3'末端プロセシング」;Proudfoot、(1989)Trends B
iochem.Sci.14:105]。これらの配列は、DNAによってコ
ードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写をも
たらす。転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナル
の例としては、SV40由来のものが挙げられる[Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual中のSambrookら、(198
9)「培養哺乳類細胞におけるクローン化遺伝子の発
現」]。
いくらかの遺伝子はより効率的に発現され得る。しか
し、いくつかのcDNAは、スプライシングシグナル(スプ
ライス供与およびスプライス受容部位とも呼ばれる)を
欠失するベクターから効率的に発現された[例えば、Go
thingおよびSambrook(1981)Nature 293:620を参照の
こと]。イントロンは、スプライス供与部位およびスプ
ライス受容部位を含むコード配列内の介在非コード配列
である。これらは、一次転写産物のポリアデニル化に続
く「スプライシング」と呼ばれる過程によって除去され
る。[Nevins(1983)Annu.Rev.Biochem.52:441;Green
(1986)Annu.Rev.Genet.20:671;Padgettら(1986)Ann
u.Rev.Biochem.55:1119;Transcription and splicing
(B.D.HamesおよびD.M.Glover編)中のKrainerおよびMa
niatis(1988)による「RNAスプライシング」]。
化シグナル、および転写終結配列を包含し、共に発現構
築物を形成する。エンハンサー、機能的スプライス供与
部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダ
ー配列もまた、所望であれば、発現構築物中に含まれ得
る。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞または細菌の
ような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素(例え
ば、プラスミド)のようなレプリコン中に維持され得
る。哺乳類の複製系は、複製にトランス作用因子を必要
とする動物ウイルス由来の複製系を含む。例えば、SV40
[Gluzman(1981)Cell 23:175]またはポリオーマウイ
ルスのようなパポーバウイルスの複製系を有するプラス
ミドは、適切なウイルス性T抗原の存在下で、極端に多
いコピー数に至るまで複製する。哺乳類のレプリコンの
さらなる例として、ウシパピローマウイルスおよびエプ
スタイン−バールウイルス由来のレプリコンが挙げられ
る。さらに、このレプリコンは、2種の複製系を有し得
るため、レプリコンは、例えば、哺乳類細胞中には発現
のために、そして原核宿主中にはクローニングおよび増
幅のために維持され得る。このような哺乳動物−細菌シ
ャトルベクターの例として、pMT2[Kaufmanら、(198
9)Mol.Cell.Biol.9:946]およびpHEBO[Shimizuら、
(1986)Mol.Cell.Biol.6:1074]が挙げられる。
存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞中へ導入す
るための方法は、当業者に周知であり、デキストラン介
在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポ
リブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融
合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌ
クレオチドのカプセル化、および核中へのDNAの直接的
なマイクロインジェクションを包含する。
者に周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(ATCC)から入手可能な多くの不死化
細胞系を含み、これらとして、チャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞、ヒーラ細胞、シリアンハムスター腎
(BHK)細胞、コス細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例
えば、Hep G2)、および他の多くの細胞系を挙げること
ができるが、それらに限定されない。
切な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そしてそのベク
ター内の制御要素に、作動可能に連結される。ベクター
構築は、当業者に周知の技術を用いる。
ムのフラグメントと異種遺伝子または発現されるべき遺
伝子の挿入に都合のよい制限部位との両方を含み、そし
て通常は細菌のプラスミドである転移ベクター;転移ベ
クター中のバキュロウイルスに特異的なフラグメントと
相同の配列を有する野生型バキュロウイルス(これは、
異種遺伝子のバキュロウイルスゲノム中への相同的組換
えを考慮に入れる);および適切な昆虫宿主細胞および
増殖培地を有する。
に挿入した後、そのベクターとウイルスゲノムとが再結
合することが可能な昆虫宿主細胞中に、そのベクターお
よび野生型ウイルスゲノムをトランスフェクトする。パ
ッケージされた組換えウイルスを発現し、組換えプラー
クを同定し、そして精製する。バキュロウイルス/昆虫
細胞発現系の材料および方法は、キットの形状で、特
に、Invitrogen、San Diego CA(「マックスバック(Ma
xBac)」キット)から、市販されている。これらの技術
は、一般に当業者に周知であり、SummersおよびSmith、
Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 155
5号(1987)(以後、「SummersおよびSmith」と記載)
中に完全に記載されている。
DNA配列を挿入する前に、プロモーター、(所望なら
ば)リーダー、目的とするコード配列、および転写終結
配列を含む上記構成要素を、通常、中間転位(transpla
cement)構築物(転移ベクター)に組み立てる。この構
築物は、単一の遺伝子、および作動可能な連結された調
節要素;それぞれが作動可能に連結された一連の調節要
素を有する同義遺伝子;または、それと同じ一連の調節
要素により調節される同義遺伝子を含み得る。中間転位
構築物は、しばしば、細菌のような宿主中で安定に維持
され得る染色体外要素(例えば、プラスミド)のような
レプリコン中に維持される。このレプリコンは、複製系
を有するため、レプリコンが、クローニングおよび増幅
のために適切な宿主中に維持され得る。
一般的に使用される転移ベクターはpAc373である。当業
者に周知の多くの他のベクターもまた、設計された。こ
れらには、例えば、(ポリヘドリン開始コドンをATGか
らATTに変換し、そのATTから32塩基対下流にBamH Iクロ
ーニング部位を導入する)pVL985が包含される;Luckow
およびSummers、Virology(1989)17:31を参照のこと。
ニル化シグナル(Millerら、(1988)Ann.Rev.Microbi
o.、42:177)、および、E.coli.中の選択および増殖の
ための原核生物のアンピリシン耐性(amp)遺伝子およ
び複製起点をも含有する。
ルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモ
ーターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼを結合
し、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへ
の下流(5'から3')転写を開始し得る、あらゆるDNA配
列である。プロモーターは、コード配列の5'末端の付近
に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領
域は、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を
通常含有する。バキュロウイルス転写ベクターはまた、
エンハンサーと呼ばれる第2ドメインを有し得、これが
存在する場合、通常、このエンハンサーは構造遺伝子に
対して遠位にある。発現は、調節されるかあるいは構成
的(constitutive)である。
遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例
として、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする
遺伝子から得られる配列、The Molecular Biology of B
aculoviruses(Walter Doerfler編)中のFriesenら、
(1986)「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」;欧州
特許公開第127839号および第155476号;およびp10タン
パク質をコードする遺伝子、Vlakら、(1988)、J.Gen.
Virol.69:765が挙げられる。
イルスポリヘドリン遺伝子(Carbonellら(1988)Gen
e、73:409)のような、分泌された昆虫あるいはバキュ
ロウイルスタンパク質の遺伝子から得られ得る。あるい
は、哺乳類細胞の翻訳後の(シグナルペプチド切断、タ
ンパク質分解性切断、およびリン酸化のような)改変に
対するシグナルが昆虫細胞に認識されるらしく、また分
泌および核蓄積に必要なシグナルも、無脊椎動物細胞と
脊椎動物細胞との間で保存されるらしいので、ヒトα−
インターフェロン、Maedaら、(1985)、Nature 315:59
2;ヒトガストリン放出ペプチド、Lebacq−Verheyden
ら、(1988)、Molec.Cell.Biol.8:3129;ヒトIL−2、
Smithら、(1985)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA、82:8404;
マウスIL−3、(Miyajimaら、(1987)Gene 58:273;お
よびヒトグルコセレブロシダーゼ、Martinら、(1988)
DNA、7:99をコードする遺伝子から得られるリーダーの
ような非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を促すた
めに用い得る。
で発現され得るか、または適当な調節配列により発現さ
れる場合に分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好
な細胞内発現は、通常、ATG開始シグナルの前に、適切
な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理想
的に有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、N
末端のメチオニンを、成熟したタンパク質から、臭化シ
アンを用いるインビトロのインキュベーションで切断し
得る。
質またはタンパク質は、昆虫内で、外来タンパク質の分
泌を可能にするリーダー配列フラグメントを含む融合タ
ンパク質をコードするキメラDNA分子を作製すること
で、昆虫細胞から分泌され得る。このリーダー配列フラ
グメントは、通常、タンパク質を小胞体中に輸送する疎
水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
よび/または遺伝子の挿入の後、昆虫細胞宿主を、転移
ベクターの異種DNAおよび野生型バキュロウイルスのゲ
ノムDNAを用いて、同時形質転換する−−通常は、同時
トランスフェクションによる。構築物のプロモーターお
よび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの2
〜5kbのセグメントを含む。異種DNAをバキュロウイルス
中の所望の部位に導入する方法は、当業者に周知であ
る。(SummersおよびSmith,上記;Juら(1987);Smith
ら、Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156;およびLuckowおよ
びSummers(1989)を参照のこと)。例えば、挿入は、
相同的二重交差組換え(homologous double crossover
recombination)により、ポリヘドリン遺伝子のような
遺伝子中に行われ得る;挿入は、所望のバキュロウイル
ス遺伝子中に設計される制限酵素部位中にも行われ得
る。Millerら、(1989)、Bioessays 4:91。このDNA配
列は、発現ベクター中のポリヘドリン遺伝子の場所にク
ローニングされた場合、5'および3'の両方がポリヘドリ
ン特異的配列により隣接され、ポリヘドリンプロモータ
ーの下流に位置する。
続いて、感染性の組換えバキュロウイルス中にパッケー
ジする。相同的組換えは、低い頻度(約1%と約5%と
の間)で発生する;そのため、同時トランスフェクショ
ンの後に生産されるウイルスの大半は、まだ野生型ウイ
ルスである。従って、組換えウイルスを同定する方法が
必要である。この発現系の利点は、組換えウイルスの識
別を可能にする視覚スクリーンである。天然のウイルス
により生産されるポリヘドリン遺伝子は、感染細胞の核
中で、ウイルス感染の後遅い時期に、非常に高いレベル
で生産される。蓄積されたポリヘドリンタンパク質は、
包埋された粒子もまた含有する閉塞体(occlusion bodi
es)を形成する。これらの閉塞体は、サイズが15μmま
でであり、屈折率が高いので、光学顕微鏡下で容易に可
視化される、明るい光沢のある外観を与えられる。組換
えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。野生型
ウイルスから組換えウイルスを識別するために、トラン
スフェクション上清液を、当業者に周知の技術を用い
て、昆虫細胞の単層上にプラークを形成させる。すなわ
ち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在(野生型
ウイルスを示す)または非存在(組換えウイルスを示
す)についてスクリーニングする。「Current Protocol
s in Microbiology」第2巻(Ausubelら編)の16.8(1
0、1990増補);SummersおよびSmith、上記;Millerら(1
989)。
昆虫細胞中へ感染させるために開発されている。例え
ば、組換えバキュロウイルスが、とりわけ以下の種のた
めに開発されている:Aedes aegypti、Autographa calif
ornica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spod
optera frugiperda、およびTrichoplusia ni(PCT公開W
O 89/046699号;Carbonellら、(1985)J.Virol.56:153;
Wright(1986)Nature 321:718;Smithら、(1983)Mol.
Cell.Biol.3:2156;および一般的にはFraserら(1989)
In Vitro Cell.Dev.Biol.25:225を参照のこと)。
の、異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方
のために、市販され入手可能である;細胞培養技術は、
通常、当業者に周知である。例えば、SummersおよびSmi
th,上記を参照のこと。
増殖させ得、改変された昆虫宿主中に存在するプラスミ
ドを安定して維持させる。発現産物の遺伝子が、誘導可
能な制御下におかれている場合、宿主は高密度に増殖し
得、そして発現を誘導し得る。または、発現が構成性で
ある場合、生産物は培地中に継続的に発現させ、そし
て、目的の生産物を除去して消耗した栄養分を増加させ
る間、栄養培地は継続して一部取り換えなければならな
い。産物は、クロマトグラフィー、例えば、HPLC、アフ
ィニィティークロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィーなど;電気泳動;密度勾配遠心分離;溶媒抽
出などのような技術により精製され得る。好適には、こ
の生産物は、必要であれば、培地中に分泌されるか、ま
たは昆虫細胞の溶解から生じるいかなる昆虫タンパク質
をも実質的に除去するために、宿主のデブリ(例えば、
タンパク質、脂質および多糖類)を少なくとも実質的に
含まない産物を提供するために、さらに精製され得る。
組換え宿主細胞を、組換えタンパク質コード配列を発現
させる条件下でインキュベートする。これらの条件は、
選択される宿主に依存して変化し得る。しかしながら、
この条件は、当該分野で周知の技術に基づいて、当業者
が容易に確定し得る。
ーターは、細菌RNAポリメラーゼを結合し得、コード配
列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの順方向(3'')転
写を開始させ得る、いずれものDNA配列である。プロモ
ーターは、通常コード配列の5'末端の近位に位置する転
写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNA
ポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌
プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第2のドメイ
ンもまた含み、これはRNA合成が始まる、隣接するRNAポ
リメラーゼ結合部位に重複し得る。遺伝子リプレッサー
タンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特定
の遺伝子の転写を阻害するので、オペレーターは、負に
調節された(誘導可能)転写を可能にする。構成性発現
は、オペレーターのような負の調節要素の非存在下で起
こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベーター
タンパク質結合配列により達成され得る。この遺伝子ア
クチベータータンパク質結合配列は、存在する場合、通
常、RNAポリメラーゼ結合配列の近位(5')にある。遺
伝子アクチベータータンパク質の例には、Escherichia
coli(E.coli)のlacオペロンの転写の開始を助けるカ
タボライト活性化タンパク質(CAP)[Raibaudら(198
4)Annu.Rev.Genet.18:173]がある。従って、調節発現
は、正または負のいずれかであり得、それにより、転写
を増大または低下させる。
ーター配列を提供する。例には、ガラクトース、ラクト
ース(lac)[Changら(1977)Nature 198:1056]およ
びマルトースのような糖類を代謝する酵素に由来するプ
ロモーター配列が包含される。さらに、例として、トリ
プトファン(trp)[Goeddelら(1980)Nuc.Acids Res.
8:4057;Yelvertonら(1981)Nucl.Acids Res.9:731;
米国特許第4,738,921号;欧州特許公開第036 776号およ
び第121 775号]のような生合成酵素に由来するプロモ
ーター配列が挙げられる。g−ラオタマーゼ(bla)プ
ロモーター系[interferon 3(I.Gresser編)中のWeis
smann(1981)「インターフェロンおよび他の誤り(mis
takes)のクローニング」]、バクテリオファージラム
ダPL[Shimatakeら(1981)Nature 292:128]およびT5
[米国特許第4,689,406号]プロモーター系もまた、有
用なプロモーター配列を提供する。
た、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細
菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化
配列を、他の細菌またはバクテリオファージプロモータ
ーのオペロン配列と連結し得、合成ハイブリッドプロモ
ーターを生成する[米国特許第4,551,433号]。例え
ば、tacプロモーターは、lacリプレッサーにより調節さ
れるtrpプロモーターおよびlacオペロン配列の両方を含
むハイブリッドtrp−lacプロモーターである[Amannら
(1983)Gene 25:167;de Boerら(1983)Proc.Natl.Aca
d.Sci.80:21]。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNA
ポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する、
非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。
非細胞起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合
するRNAポリメラーゼと結合し得、原核細胞において、
いくつかの遺伝子の高い発現レベルを生じさせる。バク
テリオファージT7のRNAポリメラーゼ/プロモーター系
は、結合されたプロモーター系の例である[Studierら
(1986)J.Mol.Biol.189:113;Taborら(1985)Proc Nat
l.Acad.Sci.82:1074]。さらに、ハイブリッドプロモー
ターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびE.
coliオペレーターから構成され得る(欧州特許公開第26
7 851号)。
ボソーム結合部位もまた、原核細胞での外来遺伝子の発
現に有用である。E.coliでは、リボソーム結合部位は、
シャイン−ダルガルノ配列(SD)と呼ばれ、開始コドン
(ATG)および開始コドンの3〜11ヌクレオチド上流に
位置する3〜9ヌクレオチド長の配列を含む[Shineら
(1975)Nature 254:34]。SD配列は、SD配列とE.coli
16S rRNAの3'末端との間の塩基の対合により、リボソー
ムへのmRNAの結合を促進すると考えられる[Biological
Regulation and Development:Gene Expression(R.F.G
oldberger編)中のSteitzら(1979)「メッセンジャーR
NA中の遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列」]。弱い
リボソーム結合部位で真核遺伝子および原核遺伝子を発
現させること[Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l中のSambrookら(1989)「Escherichia coli.中でのク
ローニングされた遺伝子の発現」]。
列は、DNA分子と直接連結され得、この場合N末端の最
初のアミノ酸は、常にメチオニンでありこのメチオニン
は、ATG開始コドンでコードされる。所望であれば、N
−末端のメチオニンは、臭化シアンを用いるインビトロ
のインキュベーションにより、または、細菌N末端ペプ
チダーゼを用いるインビボまたはインビトロでのいずれ
かのインキュベーションによりタンパク質から切断し得
る(欧州特許公開第219 237)。
常、内在性細菌タンパク質のN末端部分または他の安定
なタンパク質ををコードするDNA配列を、異種コード配
列の5'末端に融合する。発現の際に、この構築物は、2
種のアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリ
オファージラムダ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5'末端に
連結され、細菌中で発現され得る。得られる融合タンパ
ク質は、好適には、プロセシング酵素(因子X a)に対
する部位を保持し、外来遺伝子からのバクテリオファー
ジタンパク質を切断する[Nagaiら(1984)Nature 309:
810]。融合タンパク質はまた、lacZ[Jiaら(1987)Ge
ne 60:197]、trpE[Allenら(1987)J.Biotechnol.5:9
3;Makoffら(1989)J.Gen.Microbiol.135:11]、および
Chey[欧州特許公開第324 647号]の遺伝子由来の配列
を用いても作製され得る。2つのアミノ酸配列の連結部
のDNA配列は、切断部位をコードしても、しなくてもよ
い。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。この
ような融合タンパク質は、好適には、外来タンパク質か
らユビキチンを切断するプロセシング酵素(例えば、ユ
ビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)に対する部
位を保持するユビキチン領域で作られる。この方法によ
り、天然の外来タンパク質が単離され得る[Millerら
(1989)Bio/Technology 7:698]。
質を分泌させるシグナルペプチド配列フラグメントを含
む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製す
ることにより細胞から分泌させ得る[米国特許第4,336,
336号]。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞か
らのタンパク質の分泌を支配する疎水性アミノ酸を含む
シグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培
地(グラム陽性菌)中、または細胞の内膜と外膜との間
に位置する細胞周辺腔(グラム陰性菌)中のいずれかに
分泌される。好適には、シグナルペプチドフラグメント
と外来遺伝子との間でコードされた、インビボまたはイ
ンビトロで切断され得るプロセシング部位がある。
タンパク質遺伝子(ompA)[Experimental Manipulatio
n of Gene Expression中のMasuiら(1983);Ghrayebら
(1984)EMBO J.3:2437]およびE.coliアルカリホスフ
ァターゼシグナル配列(phoa)[Okaら(1985)Proc.Na
tl.Acad.Sci.82:7212]のような、分泌された細菌タン
パク質に対する遺伝子に由来する。追加の例として、種
々のBacillus株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル
配列を、B.subtilis由来の異種タンパク質を分泌するた
めに使用し得る[Palvaら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 79:5582;欧州特許公開第244 042号]。
止コドンの3'に位置する調節領域であり、そのため、プ
ロモーターと共に、コード配列の側面に位置する。これ
らの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻
訳され得るmRNAの転写を支配する。転写終結配列は、し
ばしば、転写の終了を助けるステムループ構造(stem l
oop structures)を形成し得る約50ヌクレオチドのDNA
配列を含む。例としては、E.coliのtrp遺伝子および他
の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有する
遺伝子由来の転写終結配列が挙げられる。
目的のコード配列、および転写終結配列を包含する上記
構成要素を組立てて、発現構築物を生成する。発現構築
物は、しばしば、細菌のような宿主中に安定して維持さ
れ得る染色体外要素(例えばプラスミド)のようなレプ
リコン中に維持される。レプリコンは複製系を有し、そ
のため、発現またはクローニングおよび増幅のいずれか
のために、原核生物宿主中で維持されることが可能にな
る。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー
数のいずれのプラスミドでもあり得る。高コピー数のプ
ラスミドは、一般的に約5〜約200、通常は約10〜約150
に及ぶコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含
む宿主は、好適には、少なくとも約10、より好適には少
なくとも約20のプラスミドを含有する。高コピー数また
は低コピー数のいずれかのベクターを、宿主におけるベ
クターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択し
得る。
細菌ゲノム中に組込み得る。組込みベクターは、通常、
ベクターへの組込みを可能にする細菌染色体に相同であ
る少なくとも1つの配列を含む。組込みは、ベクター中
の相同DNAと細菌染色体との間の組換えの結果生じると
思われる。例えば、種々のBacillus株由来のDNAを用い
て構築される組込みベクターは、Bacillus染色体中に組
込む(欧州特許公開第127 328号)。組込みベクターは
また、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を
含み得る。
ーカーを含み得、形質転換された細菌株の選別を可能に
する。選択可能なマーカーは、細菌宿主中で発現され
得、アンピリシン、クロラムフェニコール、エリスロマ
イシン、カナマイシン(ネオマイシン)、およびテトラ
サイクリンのような薬剤に対する抵抗性を細菌に与える
遺伝子を含み得る[Daviesら(1978)Annu.Rev.Microbi
ol.32:469]。選択可能なマーカーはまた、ヒスチジ
ン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路にお
ける遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
ター中に組み立て得る。形質転換ベクターは、通常、上
記のように、レプリコン中で維持されるか、または組込
みベクターに発展される選択可能なマーカー(selectab
le market)を含む。
び形質転換ベクターが、多数の細菌への形質転換のため
に開発されている。例えば、発現ベクターが、とりわけ
以下の細菌用に開発されている:Bacillus subtilis[Pa
lvaら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5582;欧州特
許公開第036 259号および第063 953号;PCT公開WO 84/04
541号]、Escherichia coli[Shimatakeら(1981)Natu
re 292:128;Amannら(1985)Gene 40:183;Studierら(1
986)J.Mol.Biol.189:113;欧州特許公開第036 776号、
第136 829号および第136 907号]、Streptococcus crem
oris[Powellら(1988)Appl.Environ.Microbiol.54:65
5];Streptococcus lividans[Powellら(1988)Appl.E
nviron.Microbiol.54:655]、Streptomyces lividans
[米国特許第4,745,056号]。
周知であり、通常、CaCl2処理した細菌の形質転換、ま
たは二価のカチオンおよびDMSOのような他の薬剤のいず
れかを包含する。DNAはまた、細菌細胞中にエレクトロ
ポーレーションによっても導入され得る。形質転換手順
は、通常、形質転換される細菌の種により異なる。例え
ば、以下を参照のこと:[Massonら(1989)FEMS Micro
biol.lett.60:273;Palvaら(1982)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 79:5582;欧州特許公開第036 259号および第063 9
53号;PCT公開WO 84/04541号、Bacillus]、[Millerら
(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:856;Wangら(1990)J.
Bacteriol.172:949、Campylobacter]、[Cohenら(197
2)Proc.Natl.Acad.Sci.69:2110;Dowerら(1988)Nucle
ic Acids Res.16:6127;Genetic Engineering:Proceedin
gs of the International Symposium on Genetic Engin
eering(H.W.BoyerおよびS.Nicosia編)中のKushner(1
978)「ColE1−誘導プラスミドを用いるEscherichia co
liの形質転換の改良法」;Mandelら(1970)J.Mol.Biol.
53:159;Taketo(1988)Biochem.Biophys.Acta 949:318;
Escherichia]、[Chassyら(1987)FEMS Microbiol.Le
tt.44:173 Lactobacillus];[Fiedlerら(1988)Ana
l.Biochem 170:38、Pseudomonas];[Augustinら(199
0)FEMS Microbiol.Lett.66:203、Staphylococcus]、
[Baranyら(1980)J.Bacteriol.144:698;Streptococca
l Genetics(J.FerrettiおよびR.Curtiss III編)中のH
arlander(1987)「エレクトロポーレーションによるSt
reptococcus lactisの形質転換」;Perryら(1981)Infe
c.Immun.32:1295;Powellら(1988)Appl.Environ.micro
biol.54:655;Somkutiら(1987)Proc.4th Evr.Cong.Bio
technology 1:412、Streptococcus]。
モーターは、酵母RNAポリメラーゼを結合し、そしてコ
ード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3')
の転写を開始し得るあらゆるDNA配列である。プロモー
ターは、通常、コード配列の5'末端の近くに位置する転
写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNA
ポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写
開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチ
ベーター配列(UAS)と呼ばれる第2ドメインを有し
得、この上流アクチベーター配列は、もし存在するなら
ば、構造遺伝子の遠方にある。UASは、調節された(誘
導可能な)発現が可能である。構成性発現は、UASが存
在しない場合に起こる。調節された発現は正または負の
いずれかであり得、それにより転写を促進するか、また
は減退するかのいずれかであり得る。
って、代謝経路中の酵素をコードする配列は、特に有用
なプロモーター配列を提供する。例としては、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ(ADH)(欧州特許公開第284044
号)、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−
リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸
デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、3−ホスホグリセレート
ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK)(欧州特
許公開第329203号)が挙げられる。酵母PH05遺伝子はま
た、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモータ
ー配列を提供する(Myanoharaら(1983)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:1)。
母プロモーターとして作用する。例えば、ある酵母プロ
モーターのUAS配列は、別の酵母プロモーターの転写活
性化領域と連結して、合成ハイブリッドプロモーターを
創り得る。このようなハイブリッドプロモーターの例と
しては、GAP転写活性化領域に連結したADH調節配列が挙
げられる(米国特許第4,876,197号および第4,880,734
号)。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、AD
H2、GAL4、GAL10またはPH05遺伝子のいずれかの調節配
列からなるプロモーターが挙げられ、これらは、GAPま
たはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と結
合している(欧州特許公開第164556号)。さらに、酵母
プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼと結合して転写
を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在する
プロモーターを包含し得る。このようなプロモーターの
例としては、特に、(Cohenら(1980)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 77:1078;Henikoffら(1981)Nature 283:835;H
ollenbergら(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.9
6:119;Hollenbergら(1979)Plasmids of Medical,Envi
ronmental and Commercial Importance(K>N> Timm
isおよびA.Puhler編)の「酵母Saccharomyces cerevisi
ae中での細菌抗生物質耐性遺伝子の発現」;Mercerau−P
uigalonら(1980)Gene 11:163;Panthierら(1980)Cur
r.Genet.2:109;)が挙げられる。
ター配列は、DNA分子と直接連結し得、その場合には、
組換えタンパク質のN末端の最初のアミノ酸は常にメチ
オニンであり、そのメチオニンは、ATG開始コドンによ
りコードされる。所望ならば、N末端のメチオニンは、
インビトロで臭化シアンとインキュベーションすること
によりタンパク質から切り放され得る。
動物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系において、
代替物を提供する。通常、内在性酵母タンパク質、また
は他の安定タンパク質のN末端部分をコードするDNA配
列は、異種コード配列の5'末端に融合する。発現する
と、この構築物は2つのアミノ酸配列の融合を提供す
る。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスム
ターゼ(SOD)遺伝子は、外来遺伝子の5'末端で連結さ
れ得、そして酵母中で発現し得る。2つのアミノ酸配列
との連結部でのDNA配列は、切断可能な部位をコードし
得るか、またはし得ない。例えば、欧州特許公開第1960
56号を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質
である。そのような融合タンパク質は、外来タンパク質
からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素(例
えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)に
対する部位を好ましくは保持するユビキチン領域を用い
て作られる。従って、この方法により、天然外来タンパ
ク質が単離され得る(例えば、PCT公開公報WO88/024066
号を参照のこと)。
酵母中で分泌するリーダー配列フラグメントを含有する
融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を創り出す
ことにより細胞から増殖培地内へ分泌され得る。好まし
くは、インビボまたはインビトロのいずれかで切り離さ
れ得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコ
ードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列
フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を
命令する疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドを
コードする。
酵母タンパク質の遺伝子、例えば、酵母インベルターゼ
遺伝子(欧州特許公開第012873号;JPO公告公報第62,09
6,086号)およびA因子遺伝子(米国特許第4,588,684
号)から誘導され得る。あるいは、酵母中でも分泌す
る、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリ
ーダーが存在する(欧州特許公開第060057号)。
配列および「プロ」領域の両方を含む、酵母アルファ因
子遺伝子のフラグメントを用いるリーダーである。用い
られ得るアルファ因子フラグメントのタイプは、全長の
プレ−プロアルファ因子リーダー(約83個のアミノ酸残
基)、および切形型アルファ因子リーダー(通常、約25
〜約50個のアミノ酸残基)を包含する(米国特許第4,54
6,083号および4,870,008号;欧州特許公開第324274
号)。分泌を行うアルファ因子リーダーフラグメントを
用いる付加的リーダーは、2番目の酵母アルファ因子か
らのプロ領域ではなくて、1番目の酵母のプレ配列で作
られるハイブリッドアルファ因子リーダーを含有する
(例えば、PCT公開公報WO 89/02463号を参照のこと)。
止コドンの3'側に位置する調節領域であり、従って、プ
ロモーターと共にコード配列の側面に位置する。これら
の配列は、DNAによりコードされる、ポリペプチドへ翻
訳され得るmRNAの転写を命令する。転写終結配列、およ
び酵母に認識される他の終結配列の例としては、解糖酵
素をコードする配列などがある。
ならば)、関連したコード配列、および転写終結配列を
含み、発現構築物へ共に入れられる。発現構築物は、し
ばしば、レプリコン、(例えば、酵母または細菌のよう
な宿主内で安定した維持が可能な染色体外要素(例え
ば、プラスミド)内に維持される。レプリコンは、2つ
の複製系を有し得ることにより、例えば、発現のための
酵母内で、そしてクローニングおよび増幅のための原核
生物宿主内で維持され得る。そのような酵母−細菌シャ
トルベクターの例としては、YEp24(Botsteinら(197
9)Gene 8:17−24)、pC1/1(Brakeら(1984)Proc.Na
tl.Acad.Sci USA 81:4642〜4646)、およびYRp17(Stin
chcombら(1982)J.Mol.Biol.158:157)が挙げられる。
さらに、レプリコンは、高または低コピー数のプラスミ
ドのいずれでもあり得る。高コピー数のプラスミドは、
一般に、約5〜約200、そして通常は約10〜約150の範囲
のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有す
る宿主は、好ましくは、少なくとも約10、そしてさらに
好ましくは少なくとも約20を有する。高または低コピー
数のベクターを入れることが、宿主上のベクターおよび
外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例え
ば、Brakeら上述を参照のこと。
酵母ゲノム内へ組み込まれ得る。組み込みベクターは、
通常、ベクターが組み込ませる酵母染色体と相同な、少
なくとも1つの配列を含有し、そして好ましくは、発現
構築物の側面に位置する2つの相同な配列を含有する。
ベクター内の相同DNAと酵母染色体との間の組換えによ
り、組み込みが生じると考えられる(Orr−Weaverら(1
983)Methods in Enzymol.101:228〜245)。組み込みベ
クターは、ベクター内に含有される適切な相同配列を選
択することにより、酵母内の特異的遺伝子座へ導かれ得
る。Orr−Weaverら上述を参照のこと。1つまたはそれ
以上の発現構築物が組み込み得、あるいは産生する組換
えタンパク質のレベルに影響する(Rineら(1983)のPr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6750)。ベクター内に含有さ
れる染色体配列は、ベクター内の1つのセグメント(ベ
クター全体の組み込みが生じる)として存在し得るか、
または染色体内の隣接するセグメントと相同であり、ベ
クター内の発現構築物の側面に位置する2つのセグメン
ト(発現構築物のみの安定な組み込みが生じ得る)とし
て存在し得るかのいずれかである。
換された酵母の菌株の選択を可能にする選択可能なマー
カーを含有し得る。選択可能なマーカーは、酵母宿主内
で、例えば、酵母細胞内でツニカマイシンおよびG418に
対して耐性をそれぞれ与える、ADE2、HIS4、LEU2、TRP
1、およびALG7、ならびにG418耐性遺伝子)内で発現さ
れ得る生合成遺伝子を含有し得る。さらに、適切な選択
可能なマーカーはまた、金属のような毒性化合物が存在
しても増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例え
ば、CUP1が存在すると、酵母は銅イオンが存在しても増
殖し得る(Buttら(1987)Microbiol.Rev.51:351)。
内に共に入れられ得る。形質転換ベクターは、通常、上
記のように、レプリコン内で維持されるか、または組込
みベクターへと開発される、選択可能なマーカーを含有
し得る。
または組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母
への形質転換に対して開発された。例えば、発現ベクタ
ーは、特に以下の酵母に対して開発された:Candida alb
icans(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6:142)、Cand
ida maltose(Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:1
41)、Hansenula polymorpha(Gleesonら(1986)J.Ge
n.Microbiol.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.G
enet.202:302)、Kluyveromyces fragilis(Dasら(198
4)J.Bacteriol.158:1165)、Kluyveromyces lactis(D
e Louvencourtら(1983)J.Bacteriol.154:737;Van den
Bergら(1990)Bio/Technology 8:135)、Pichia gui
llerimondii(Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:1
41)、Pichia pastris(Creggら(1985)Mol.Cell.Bio
l.5:3376;米国特許第4,837,148号および第4,929,555
号)、Saccharomyces cerevisiae(Hinnenら(1978)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929;Itoら(1983)J.Bacter
iol.153:163)、Schizosaccharomyces pombe(Beachお
よびNurse(1981)Nature 300:706)、およびYarrowia
lipolytica(Davidowら(1985)Curr.Genet.10:380471;
Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49)。
は周知であり、そして通常は、スフェロプラストまたは
アルカリカチオンで処理した無傷の酵母細胞の形質転換
のいずれかを含有する。形質転換の手法は、通常、形質
転換される酵母の種によりさまざまである。例えば、
(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6:142;Kunzeら(198
5)J.Basic Microbiol.25:141;Candida);(Gleesonら
(1986)J.Gen.Microbiol.132:3459;Roggenkampら(198
6)Mol.Gen.Genet.202:302;Hansenula);(Dasら(198
4)J.Bacteriol.158:1165;De Louvencourtら(1983)J.
Bacteriol.154:1165;Van den Bergら(1990)Bio/Techn
ology 8:135;Kluyveromyces);(Creggら(1985)Mo
l.Cell.Biol.5:3376;Kunzeら(1985)J.Basic Microbi
ol.25:141米国特許第4,837,148号および4,929,555号;Pi
chia);(Hinnenら(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
5:1929;Itoら(1983)J.Bacteriol.153:163;Saccharomy
ces);(BeachおよびNurse(1981)Nature 300:706;Sc
hizosaccharomyces);(Davidowら(1985)Curr.Gene
t.10:39;Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49;Yarro
wia)を参照のこと。
Tの遺伝子のフラグメントをプラスミドEWD299(Dallas
W.S.、Gill D.M.およびFalkow S.,1979,J.Bacteriol.,1
39,850−858)から抽出し、そしてDNAの一本鎖を生成す
るのに適切なベクターBluescript KS内で再クローンし
た(Sambrook J.,Fritsch E.およびManiatis,T.の「Mol
ecular Cloning」Cold Spring Harbor)。
形質転換し、そして1μg/mlのウリジンを添加したルリ
アブロス(Luria Broth)からなる培養培地中で、その
細胞を14時間増殖させた。
は、突然変異、または天然塩基の代わりに所望の塩基、
および、天然塩基と同一である、同様の突然変異の10塩
基上流および10塩基下流の配列を含有し、まず最初に化
学的に合成され、次いでその1.5pmolを37℃で、キナー
ゼ5単位を用いてリン酸化した。
間加熱し、そして氷中で約1時間ゆっくりと冷却するこ
とにより、そのオリゴヌクレオチドをLT遺伝子を含有す
る一本鎖にアニールした。
ド、酵素DNAリガーゼおよび酵素DNAポリメラーゼからな
る溶液を加えて、最終容量が100μlになるようにし
た。
温度で5分間、そして37℃で2時間保った。
物で形質転換し(Sambrook J.、Fritsch E.およびMania
tis T.の「Molecular Cloning」Cold Spring Harbo
r)、そして得られたクローンの配列決定により部位特
異的変異誘発を検討した。
ントを、プラスミドEWD299中の元のSma I−EcoR I挿入
片に対して置換した。
で12時間、10mlのルリアブロス中で増殖させた。
を、25%ショ糖およびpH8の50mM Tris緩衝液を含有す
る溶液300ml中に再懸濁させ、そしてこの混合物を周囲
温度で1時間、1mg/mlのポリミキシン(polymixin)B
溶液で処理した。
が、ウェスタンブロットより実証され、そしてその毒性
を、Y1細胞内の形態変化の誘発、または誘発の欠如によ
り評価した(表1を参照のこと)。
さらに著しく丸くなる副腎腫瘍上皮細胞である(Yasamu
re Y.、Buonassisi V.およびSato G.の「動物細胞培養
における分化機能のクローン解析」Cancer Res.,1966,2
6,529−535)。CTおよびLTの毒性は、この形態トランジ
ションと相関している。周辺細胞質の上清液を、F10培
地、ウマ血清1.5%、できるだけ低濃度のグルタミンお
よびゲンタマイシンの溶液で希釈し、そしてY1細胞(25
0000個細胞/ml)を、CO2雰囲気下37℃で48時間、上記で
得られた溶液でインキュベートする。細胞の形態を評価
する。
体により、およびトキソイドと野生型LTに対する抗体と
の交差反応により、免疫原性が示された。
を意味する: +++ 1:2000に希釈後の毒性あり(野生型の毒性) ++ 1:250に希釈までは毒性あり + 1:64に希釈までは毒性あり − 希釈しなくても毒性なし セリンの2種の突然変異体(Ser−114−Glu:477−GGA
GGTGAAGCGTTAGG−494およびSer−114−Lys:477−GGAGGT
TAAAGCGTTAGG−494)もまた実質的に毒性の減少を示し
た。
ロトキシン(holotoxin)AB5は全く形成されない。) 実施例2−無毒化CT トキシンCTの遺伝子の場合における手法は、上記と同
様である。
T322からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により増幅
させた。CT遺伝子の代わりとなり、かつ同等の遺伝子源
(source)はプラスミドpJM17である(Pearsonら、PNAS
USA,79,(1982),2976−2980)。
部位(下線で示す)を含有する。
塩基対の長さを有し、2つのサブユニットであるAおよ
びBのコドンを含有するが、Aサブユニットのリーダー
ペプチドをコードする配列を含有しない。このフラグメ
ントをBluescript KSベクター内で再クローン化させ、
そしてLTに対して上記の手法に従って処理することによ
り、部位特異的変異誘発を起こす。
れた:107−Asn(TACAGTCCTAACCCAGATGAA)、Glu−110−
Ser(TCATCCAGATTCGCAAGAAGT)、Glu−112−Ala(CAGAT
GAACAAGCTGTTTCTG)およびSer−114−Glu(CAAGAAGTTGA
AGCTTTAGGT)。
そして詳細な改変が、本発明の範囲および意図内で行わ
れ得ることが理解される。
Claims (17)
- 【請求項1】コレラトキシンのサブユニットA(CT−
A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列、あるい
は、Escherichia coli非耐熱性トキシンのサブユニット
A(LT−A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を
含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、
コレラトキシンのサブユニットAのPro−106またはこれ
に対応する位置にあるアミノ酸が他のアミノ酸と置換さ
れており、該免疫原性無毒化タンパク質は、免疫学的に
活性であり、かつ野生型トキシンに対する抗体と交差反
応する、免疫原性無毒化タンパク質。 - 【請求項2】コレラトキシンのサブユニットA(CT−
A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列、あるい
は、Escherichia coli非耐熱性トキシンのサブユニット
A(LT−A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を
含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、
コレラトキシンのサブユニットAのPro−106またはこれ
に対応する位置にあるアミノ酸がセリンと置換されてい
る、免疫原性無毒化タンパク質。 - 【請求項3】請求項1または請求項2に記載の免疫原性
無毒化タンパク質であって、ここで、コレラトキシンの
サブユニットAのArg−7、Asp−9、Arg−11、His−4
4、Val−53、Arg−54、Ser−61、Ser−63、His−70、Va
l−97、Tyr−104、His−107、Glu−110、Glu−112、Ser
−114、Trp−127、Arg−146、またはArg−192またはこ
れらに対応する位置にある、1つまたはそれより多いア
ミノ酸がさらに置換されている、免疫原性無毒化タンパ
ク質。 - 【請求項4】1つまたはそれより多い、次のアミノ酸置
換:Val−53−Asp、Val−53−Glu、Val−53−Tyr、Ser−
63−Lys、Val−97−Lys、Val−97−Tyr、His−107−Gl
u、Tyr−104−Lys、Tyr−104−Asp、Tyr−104−Ser、Se
r−114−Glu、Ser−114−Lysを含有する、請求項3に記
載の免疫原性無毒化タンパク質。 - 【請求項5】請求項1から4のいずれか1項に記載の免
疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャ
リアを含有するワクチンとして用いられる、免疫原性組
成物。 - 【請求項6】請求項1から4のいずれか1項に記載の免
疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャ
リアを含有する、ワクチン組成物。 - 【請求項7】アジュバントをさらに含有する、請求項6
に記載のワクチン組成物。 - 【請求項8】請求項1から4のいずれか1項に記載の免
疫原性無毒化タンパク質をコードする、DNA配列。 - 【請求項9】請求項8に記載のDNA配列を保有するベク
ター。 - 【請求項10】請求項9に記載のベクターで形質転換さ
れる、宿主細胞。 - 【請求項11】請求項10に記載の宿主細胞を培養する工
程を包含する、請求項1から4のいずれか1項に記載の
免疫原性無毒化タンパク質の製造方法。 - 【請求項12】CT−AまたはLT−AをコードするDNAあ
るいはそれらのフラグメントを部位特異的変異誘発に供
する工程を包含する、請求項8に記載のDNAの製造方
法。 - 【請求項13】請求項1から4のいずれか1項に記載の
免疫原性無毒化タンパク質を薬学的に受容可能なキャリ
アと結合させる工程を包含する、請求項6に記載のワク
チンの処方の方法。 - 【請求項14】請求項1から4のいずれか1項に記載の
免疫原性無毒化タンパク質をアジュバントと結合させる
工程を包含する、請求項7に記載のワクチンの処方の方
法。 - 【請求項15】ワクチン接種するための医薬品として使
用するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫
原性無毒化タンパク質。 - 【請求項16】ワクチンとして使用するための請求項1
〜4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク
質。 - 【請求項17】Vibrio choleraeまたはEscherichia col
iの腸内毒素原性株に対して哺乳動物をワクチン接種す
るための医薬の調製のための、請求項1〜4のいずれか
に記載の免疫原性無毒化タンパク質の使用方法。
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