ES2277195T3 - Mutantes destoxificados inmunogenos de toxina del coleray de la toxina lt, su preparacion y uso en la preparacion de vacunas. - Google Patents

Abstract

Una proteína inmunógena destoxificada que comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT - A) o un fragmento de la misma o la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT - A) o un fragmento de la misma, en la que el aminoácido en, o en la posición correspondiente al Val - 53, Val - 97 ó Tyr - 104 se reemplaza por otro aminoácido.

Description

Mutantes destoxificados inmunógenos de toxina del cólera y de la toxina LT, su preparación y uso en la preparación de vacunas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las proteínas destoxificadas inmunógenas de toxinas de cólera (CT), o de toxinas lábiles al calor (LT) producidas por las cepas enterotoxigénicas de Escherichia coli (E. coli) que tienen sustituciones en uno o más aminoácidos Val-53, Val-97, Tyr-104 y a su uso en vacunas que son útiles para la prevención o tratamiento de cólera o infecciones por E. coli enterotoxigénicas. Las proteínas pueden producirse adecuadamente usando técnicas de DNA recombinante mediante mutagénesis dirigida al sitio de DNA que codifica las toxinas de tipo salvaje.

Antecedentes de la invención

El cólera es una enfermedad contagiosa ampliamente distribuida en el mundo, en particular en el tercer mundo, donde, en ciertas áreas, es endémica. Los trastornes graves que se desarrollan en el sistema intestinal resultan fatales en un alto porcentaje de los casos registrados de la enfermedad.

El agente etiológico del cólera es el microorganismo Gram-negativo Vibrio cholerae (V. cholerae). Éste coloniza el tracto intestinal de los individuos que han estado en contacto con él a través de la ingestión de alimento o agua contaminada, y se multiplica hasta concentraciones muy altas. El síntoma principal es diarrea grave como resultado de la cual el paciente puede perder tanto como 10-15 litros de líquidos al día mediante las heces. Como resultado de la grave deshidratación y pérdida de electrolitos, el paciente no resiste la infección el 50%-60% de los casos, y muere. La diarrea producida por V. cholerae se debe a la secreción de la toxina de cólera, CT, que actúa estimulando la actividad de la enzima adenilato ciclasa de manera que induce alteraciones a nivel celular.

Aunque el cólera se puede curar eficazmente mediante rehidratación controlada e intensa, la distribución de una vacuna es deseable con una visión para el control completo y futura erradicación de la enfermedad.

En el momento actual, existe una vacunación contra el cólera, que consiste en la administración parenteral de bacterias muertas. Aunque algunos países insisten en la vacunación contra la enfermedad, existen dudas serias de su utilidad real, dado que la vacuna celular actual protege contra las consecuencias de la infección en solamente el 50% de los casos y que la protección también se limita extremadamente en duración, a menos de 6 meses.

En Bangladesh, está en marcha un ensayo experimental (1990-92) de una vacuna oral que consiste en bacterias muertas con la adición de la subunidad B de la toxina del cólera, que se sabe que es altamente inmunógena. Este producto tiene éxito en la inducción de la última protección, sin efectos secundarios especiales (Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sánchez J. y Svennerholm AM; "Oral Immunization against cholera" Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1988), 146, 197-204).

La toxina del cólera se parece a las toxinas lábiles al calor de las cepas enterotoxigénicas de Escherichia coli en la secuencia de aminoácidos, la estructura y el modo de acción.

Las consecuencias de la infección con una cepa enterotoxigénica de E. coli son similares a, aunque menos graves que, las del cólera, y constan de trastornos de diarrea e intestinales graves.

Todas las toxinas CT y LT comprenden una sola subunidad A (o protómero A) responsable de la actividad enzimática de la toxina (en esta memoria descriptiva CT-A o LT-A) y cinco unidades B idénticas (o promotor B) que están implicadas en la unión de la toxina a las células epiteliales intestinales (en esta memoria descriptiva CT-B o LT-B).

La subunidad A penetra la membrana celular y produce la activación de la adenilato ciclasa mediante la ADP-ribosilación dependiente de NAD de una proteína de unión a GTP que controla la actividad de la enzima. El efecto clínico de esto es producir pérdida masiva de fluidos en el intestino.

Se ha llevado a cabo una investigación considerable sobre la toxina del cólera y las toxinas lábiles al calor de E. coli.

Se conoce la secuencia de CT y se ha descrito (Mekalanos J. J. y col., Nature 306, página 551 (1983)).

La secuencia de LT de cepas enterotoxigénicas de E. coli es, como se ha mencionado, 80% homóloga a la CT y se conoce y se describe sobradamente en la bibliografía científica. Spicer E. K. y col., (Biol. Chem. 257 p. 5716-5721 (1982)) describen la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina lábil al calor de la cepa enterotoxigénica de E. coli encontrada en cerdos.

Una forma cromosómica bacteriana de la LT se ha identificado y secuenciado por Pickett C. L. y col., (J. Bacteriol. 169, 5180-5187, (1987)).

La secuencia de la subunidad A de la LT de una cepa de E. coli que se conoce que afecta a los seres humanos también se ha secuenciado (Yamamoto y col., J. Biol. Chem. 259, 5037-5044, (1984)).

En vista de la significación clínica potencial de una vacuna contra el cólera y las bacterias enterotoxigénicas existe un continuo y gran interés en producir una toxina destoxificada capaz de inmunización contra el cólera y las bacterias enterotoxigénicas. Las técnicas de ingeniería genética permiten mutaciones específicas a introducir en los genes que codifican las toxinas y la producción de las toxinas mutadas usando ahora técnicas convencionales de expresión génica y purificación de proteínas.

Diversos grupos han intentado identificar mutaciones de los genes, que implican la pérdida de las características de toxicidad de las proteínas codificadas. Los estudios se están llevando a cabo predominantemente con respecto al gen para la toxina LT, de E. coli.

Harford, S. y col., (Eur. J. Biochem. 183, página 311 (1989)) describen la producción de un toxoide mediante mutagénesis in vitro del gen LT-A de E. coli patogénico para cerdos. La mutación exitosa resultante contenía una sustitución Ser-61-Phe y una sustitución Gly-79-Lys, siendo la anterior considerada la más importante. Harford y col., sugieren que, debido a las similitudes entre los genes LT-A en E. coli patogénica para los seres humanos y cerdos y el gen CT-A, y debido a que se cree que las toxinas operan mediante un mecanismo común, puede ser posible producir un holotoxoide de cólera introduciendo la mutación Ser-61-Phe en el gen CT-A.

Tsuji, T. y col., (J. Biol. Chem. 265, p. 22520 (1990)) describen la mutación del gen LT-A del plásmido EWD299 para producir una sustitución individual Glu-112 Lys que afecta la toxicidad del mutante LT todavía no cambia la inmunogenicidad de la proteína.

Grant, C. C. R. y col., (Resumen B289 de la 92ª Reunión General de la Sociedad Americana de Microbiología, 26-30 de mayo de 1992) describen las sustituciones conservadoras de histidinas en 44 y 70 y triptófano en 127 en LT-A que da como resultado reducciones significativas en al actividad enzimática.

Se ha llevado a cabo algún trabajo sobre las mutaciones de CT.

Kaslow, H. R. y col., (Resumen B291 de la 92ª Reunión General de la Sociedad Americana de Microbiología, 26-30 de mayo de 1992) describen Asp-9 e His-44 mutantes y truncamiento después del aminoácido 180 en CT-A que esencialmente eliminan la actividad. El Arg-9 mutante se dice que atenúa notablemente la actividad. Los otros sitios de aminoácidos mutantes tuvieron poco efecto sobre la toxicidad.

Burnette, W. N. y col., (Inf. and Immun. 59 (11), 4266-4270, (1991)) describen las mutagénesis específicas del sitio de CT-A para producir una mutación de Arg-7-Lys paralela a la de una mutación de destoxificación conocida en la subunidad A de la toxina de Bordetella pertussis. La mutación dio como resultado la abolición completa de la actividad detectable de la ADP-ribosiltransferasa.

La solicitud de patente internacional WO 92/19265 (Burnette, Kaslow y Amgen Inc.) describe mutaciones de CL-A en Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, His-70 y Glu-112.

Las mutaciones en Glu-110 (LT y CT) y Arg-146 (LT) también se han descrito en la bibliografía (Lobet, Inf. Immun., 2870, 1991; Lai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 341 1983; Okamoto J. Bacteriol. 2208, 1988).

La estructura cristalina de LT se ha determinado por Sixma y col., (Nature, 351, 371-377, mayo de 1991) y confirma los resultados de mutagénesis descritos anteriormente en la bibliografía, que explican estructuralmente la significación de Glu-112 y Ser-61 en actividad de la subunidad A y que sugieren que His-44, Ser-114 y Arg-54 que están en la proximidad intermedia pueden ser importantes para catálisis o reconocimiento.

Sumario de la invención

Ahora se ha descubierto mediante el análisis más detallado de la estructura de las toxinas que ciertos aminoácidos adicionales en las secuencias de CT-A y LT-A están en las posiciones capaces de disminuir la actividad enzimática de CT y LT cuando mutan adecuadamente, individualmente o junto con otras mutaciones.

El objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna que proporciona protección total contra el cólera o E. coli enterotoxigénica, mediante un producto de segunda generación constituido por un antígeno individual, un toxoide derivado a partir de CT o LT, que se ha destoxificado genéticamente.

La destoxificación genética de CT o LT conserva las propiedades inmunógenas del toxoide mientras proporciona una toxicidad significativamente reducida y preferiblemente ausente.

Según un primer aspecto de la invención se proporciona una proteína destoxificada inmunógena que comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT-A) o un fragmento de la misma o la subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT-A) o un fragmento de la misma, en el que uno o más aminoácidos en, o en posiciones que corresponden a Val-53, Val-97, Tyr-104 se reemplazan con otro aminoácido.

Los aminoácidos reemplazados están en localizaciones en las secuencias de CT-A o una LT-A que se conservan tanto en la secuencia de aminoácidos como estructuralmente y son por lo tanto comunes a CT y a las diversas LT.

La proteína destoxificada inmunógena de la invención adopta sustancialmente la misma conformación estructural que las toxinas de tipo salvaje de origen natural. Es inmunológicamente activa y reacciona de forma cruzada con los anticuerpos de las toxinas de tipo salvaje.

En esta memoria descriptiva, las referencias a CT y LT abarcan las diversas variantes de las cepas de origen natural así como otras variantes que abarcan cambios de las secuencias descritas en esta memoria descriptiva que no afectan a la inmunogenicidad del toxoide ensamblado.

En esta memoria descriptiva, las referencias a las coordenadas de los aminoácidos tales como "Val-97" connotan los aminoácidos en esa posición en la secuencia de la subunidad A de la toxina de cólera madura (CT-A), que está sin la secuencia señal (véase la Figura 1).

Cuando la memoria descriptiva se refiere a una LT-A, las coordenadas de los aminoácidos de refieren a una LT-A, las coordenadas de los aminoácidos se refieren a la posición correspondiente en CT-A como se muestra en la Figura 1.

Así pues, por ejemplo, Val-53 en CT corresponde a Val-52 en la subunidad LT1 y Ser-63 en CT corresponde a Ser-62 en LT1, que es una diferencia de un solo aminoácido en la numeración de hasta el aminoácido 89 de la secuencia LT1. Val-97 en la secuencia de CT corresponde a Val-93 en la secuencia de LT1 debido a la diferencia de cuatro aminoácidos en ese punto en la secuencia.

Además, la proteína destoxificada inmunógena de la invención puede incluir otras mutaciones tales como, por ejemplo, sustituciones en uno o más de Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser-61, His-70, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 ó Arg-192.

El aminoácido sustituido por el aminoácido de tipo salvaje puede ser un aminoácido de origen natural o puede ser un aminoácido modificado o sintético. La sustitución puede implicar la supresión de un aminoácido en conjunto con tal que el mutante conserve las propiedades inmunógenas necesarias y muestra una toxicidad sustancialmente reducida.

Se prefieren generalmente las sustituciones que alteran la anfotericidad e hidofilidad mientras conserva el efecto estérico del aminoácido de sustitución hasta el punto que sea posible.

Las sustituciones preferidas incluyen: Val-53-Asp, Val-53-Glu, Val-53-Tyr, Ser-63-Lys, Val-97-Lys, Val-97-Tyr, His-107-Glu, Tyr-104-Lys, Tyr-104-Asp, Tyr-104-Ser, Pro-106-Ser, Ser-114-Glu, Ser-114 Lys.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "destoxificado" significa que la composición inmunógena exhibe una toxicidad sustancialmente menor con relación a su toxina homóloga de origen natural. La toxicidad sustancialmente más baja debería ser sustancialmente baja para la proteína que se va a usar en una composición inmunógena en una cantidad inmunológicamente eficaz como una vacuna que produce efectos secundarios significativos. Por ejemplo, la proteína inmunógena destoxificada debería tener una toxicidad inferior al 0,01% de la toxina homóloga de origen natural. La toxicidad se puede medir en células CHO de ratón o preferiblemente mediante la evaluación de los cambios morfológicos inducidos en las células Y1. El término "toxoide" significa una toxina genéticamente destoxificada.

La proteína inmunógena puede ser un toxoide de la subunidad A de CT o LT, pero es preferiblemente una molécula de toxina ensamblada que comprende una subunidad CT-A o LT-A mutada y cinco subunidades B de CT o LT. La subunidad B puede ser una subunidad de origen natural o se puede mutar ella misma.

La proteína inmunógena es preferiblemente una CT-A o LT-A de origen natural modificada adecuadamente como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, se pueden realizar cambios de aminoácidos conservadores que no afectan a la inmunogenicidad o a la toxicidad de la proteína inmunógena y preferiblemente no afectan a la capacidad de la proteína inmunógena de formar la toxina completa con la proteína de la subunidad B. También, la proteína inmunógena puede ser un fragmento de CT-A o una LT-A con tal que el fragmento sea inmunógeno y no tóxico y contenga al menos una de las regiones conservadas que contienen una de las mutaciones según la invención.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunógena para uso como una vacuna que comprende una proteína destoxificada inmunógena del primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición inmunógena puede contener adicionalmente uno o más adyuvantes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona una composición de vacunas que comprende una proteína destoxificada inmunógena según el primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de vacunas puede además comprender un adyuvante.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de vacunación de un mamífero contra Vibrio cholerae o una cepa enterotoxigénica de Eschericia coli que comprende la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una proteína destoxificada inmunógena según el primer aspecto de la invención.

Las proteínas destoxificadas inmunógenas de la invención se pueden sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales, pero se producen preferiblemente mediante medios de DNA recombinantes.

Según un cuarto aspecto de la invención se proporciona una secuencia de DNA que codifica una proteína destoxificada inmunógena según el primer aspecto de la invención.

Preferiblemente la secuencia de DNA contiene una secuencia de DNA que codifica una CT o LT completa que comprende DNA que codifica tanto la subunidad A como la subunidad B destoxificadas en una unidad policistrónica. Como alternativa, el DNA puede codificar solamente la subunidad A destoxificada.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un vector que lleva un DNA según el cuarto aspecto de la invención.

Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona una línea celular huésped transformada con el vector según el quinto aspecto de la invención.

La célula huésped puede ser cualquier huésped capaz de producir CT o LT pero es preferiblemente una bacteria, lo más adecuadamente E. coli o V. cholerae adecuadas modificadas por ingeniería genética para producir la proteína destoxificada inmunógena deseada.

En una realización adicional del sexto aspecto de la invención, la célula huésped puede ella misma proporcionar una especie protectora, por ejemplo, una cepa de E. coli o V. cholerae mutada a un fenotipo que carece de LT o CT de tipo salvaje y que lleva y expresa una proteína destoxificada del primer aspecto de la invención.

En una realización adicional del sexto aspecto de la invención la célula huésped es capaz de expresar un gen LT-A cromosómico según el primer aspecto de la invención.

Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína destoxificada inmunógena según el primer aspecto de la invención que comprende el cultivo de una célula huésped según el sexto aspecto de la invención.

Según un octavo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la producción de DNA según el cuarto aspecto de la invención que comprende las etapas de someter un DNA que codifica una CT-A o una LT-A o un fragmento de las mismas para la mutagénesis dirigida al sitio.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la formulación de una vacuna que comprende poner una proteína destoxificada inmunógena según el primer aspecto de la invención en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente con un adyuvante.

Aplicabilidad industrial

La proteína destoxificada inmunógena de la invención constituye el componente activo de una composición de vacunas útil para la prevención y tratamiento de infecciones por cólera o infecciones por cepas enterotoxigénicas de E. coli. Las composiciones son así aplicables para uso en la industria farmacéutica.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de tipo salvaje a partir de:

i)

toxina de cólera (CT-Mekalanos y col. op cit),

ii)

toxina lábil al calor de una cepa E. coli encontrada en el hombre (LT1_1 Yamamoto y col. op cit)

iii)

toxina lábil al calor de una cepa E. coli encontrada en cerdos (LT1-Spicer y col. op cit), y

iv)

toxina lábil al calor a partir de una fuente cromosómica (LT1_1-Pickett y col. op cit)

Las secuencias señal no se muestran.

En la Figura 1, se usa el código convencional de aminoácidos de una sola letra. El símbolo "." significa un aminoácido ausente y actúa como un espaciador tipográfico para asegurar que las secuencias conservan un alineamiento para facilidad de comparación. El símbolo "-" indica un aminoácido en las secuencias de LT1 y LT2 que es idéntico al aminoácido correspondiente en CT. Los números enfrente de cada línea son el número de aminoácido del primer aminoácido en esa línea.

En la Figura 1 las posiciones de las mutaciones de la presente invención se muestran subrayadas.

Las Figuras 2a y 2b son las comparaciones del aminoácido y las secuencias de DNA de las subunidades A de LT1 y CT.

La Figura 3 es un mapa de restricción del plásmido EWD299 (Dallas y col.), que lleva el gen LT-A.

Descripción detallada de las realizaciones de la invención

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, DNA recombinante, e inmunología, que están dentro de la práctica de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase por ejemplo, Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, EDICIÓN SEGUNDA (1989); DNA CLONING, VOLÚMENES I Y II (D. N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames y S. J. Higgins eds.1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); la serie, METHODS IN ENZIMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller y M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 Y Vol 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente), Mayer y Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, segunda edición (Springer-Verlag, N. Y.), y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLÚMENES I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell eds. 1986).

Se usan las abreviaturas habituales para nucleótidos y aminoácidos en esta memoria descriptiva. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan como referencia.

En particular, se usan las siguientes abreviaturas de aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

	Alanina	A	Ala
	Arginina	R	Arg
	Asparagina	N	Asn
	Ácido aspártico	D	Asp
	Cisteína	C	Cys
	Glicina	G	Gly
	Ácido glutámico	E	Glu
	Glutamina	Q	Gln
	Histidina	H	His
	Isoleucina	I	Ile
	Leucina	L	Leu
	Lisina	K	Lys
	Metionina	M	Met
	Fenilalanina	F	Phe
	Prolina	P	Pro
	Serina	S	Ser
	Treonina	T	Thr
	Triptófano	W	Trp
	Tirosina	Y	Tyr
	Valina	V	Val

Como se ha mencionado anteriormente los ejemplos de la proteína destoxificada inmunógena que se pueden usar en la presente invención incluyen polipéptidos con variaciones de aminoácidos menores de la secuencia de aminoácidos naturales de la proteína diferente de los sitios de la mutación específicamente mencionada.

Una ventaja significativa de producir las proteína destoxificada inmunógena mediante técnicas de DNA recombinante en lugar de aislar y purificar una proteína a partir de fuentes naturales es que se pueden producir cantidades equivalentes de la proteína mediante el uso de menos material de partida que se requeriría para aislar la proteína a partir de una fuente natural. La producción de la proteína mediante técnicas recombinantes también permite que la proteína se aísle en ausencia de algunas moléculas normalmente presentes en las células. De hecho, las composiciones de proteínas completamente libres de cualquier indicio de contaminantes de proteínas humanas se puede producir fácilmente debido a que solamente la proteína humana producida por el huésped recombinante no humano es la proteína recombinante en cuestión. También se evitan los agentes virales potenciales de fuentes naturales y componentes virales patogénicos para los seres humanos. También, las toxinas destoxificadas genéticamente son menos probable que reviertan a un tóxico que las toxinas más tradicionales, destoxificadas químicamente.

Los vehículos farmacéuticamente incluyen cualquier vehículo que no induce él mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente grandes, macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicoles, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivas. Tales vehículos los conocen bien los expertos en la técnica. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (adyuvantes).

Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación: sales de aluminio (alum) tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., formulaciones de emulsiones en aceite, con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo o componentes de las paredes celulares de las bacterias, tales como por ejemplo (1) MF59 (solicitud de patente internacional publicada WO-A-90/14837, que contiene escualeno al 5%, Tween ® 80 al 0,5%, Span ® 85 al 0,5% (conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante), aunque no se requiere) formulado en partículas submicrónicas usando un microfluidificador tal como el microfluidificador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween ® 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con pluronic al 5%, y thr-MPD (véase más adelante) bien microfluidificado en una emulsión submicrónica o agitado en un aparato Vortex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y (3) sistema adyuvante RIBI ™ (abreviadamente en inglés RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween ® 80 al 0,2% y uno o más de los componentes de las paredes celulares de las bacterias a partir de un grupo constituido por el lípido A monofosforilo (abreviadamente en inglés MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y el esqueleto de paredes celulares (CWS) preferiblemente MPL + CWS (Detox ™), péptidos de muramilo tales como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (MTP-PE) etc., y citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF) etc. Adicionalmente, se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon ™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de ellos tales como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes). Además, se pueden usar el adyuvante completo de Freunds (CFA) y el adyuvante incompleto de Freunds (IFA). Los preferidos son alum y MF59.

Las composiciones inmunógenas (por ejemplo, el antígeno, vehículo y adyuvante farmacéuticamente aceptables) típicamente contendrán diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH, y similares, pueden estar presentes en tales vehículos.

Típicamente, las composiciones inmunógenas se preparan en forma de inyectables, bien en forma de soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas para potenciar el efecto adyuvante como se ha descrito anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunógenas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos, así como cualquiera de los otros componentes anteriormente mencionados, según sea necesario. "Cantidad inmunológicamante eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una dosis individual o como parte de una serie, es eficaz para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor de tratamiento de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos rutinarios.

Las composiciones inmunógenas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección bien por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para cada forma de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de dosis múltiple. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmnorreguladores.

El término "polinucleótido recombinante" como se usa en esta memoria descriptiva propone un polinucleótido de origen genómico, cDNA, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido distinto del que está unido en la naturaleza, o (3) no es de origen natural.

El término "polinucleótido" como se usa en esta memoria descriptiva se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Así pues, el término incluye DNA y RNA de cadena doble y de cadena sencilla. También incluye tipos de modificaciones conocidas, por ejemplo, marcadores que se conocen en la técnica, metilación, "caps", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (que incluyen, por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, polipéptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácido nucleicos alfaanoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido.

Un "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación del polinucleótido en el interior de una célula; es decir, capaz de replicación bajo su propio control. Esto puede incluir marcadores seleccionables.

Un "vector" es un replicón en el que está unido otro segmento de polinucleótido, de manera que produzca la replicación y/o expresión del segmento unido.

"Secuencia control" se refiere a las secuencias de polinucleótidos que son necesarios para efectuar la expresión de secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias control" intenta incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede también incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias guías y secuencias partícipes de fusión.

"Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra en condiciones compatibles con las secuencias control.

Una "fase abierta de lectura" (abreviadamente en inglés ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se traduce en un polipéptido, usualmente mediante mRNA, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de comienzo de traducción en el extremo 5' y un codón de parada de traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin limitación a, cDNA, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

"PCR" se refiere a la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa como se describe en el documento de Saiki, y col, Nature 324: 163 (1986); y Scharf y col., Science (1986) 233: 1076-1078; y el documento de Estados Unidos 4.683.195; y el documento de Estados Unidos 4.683.202.

Como se usa en esta memoria descriptiva, x es "heterólogo" con respecto a y si x no está asociado naturalmente con y de idéntica manera; es decir, x no está asociado a y en la naturaleza o x no está asociado a y de la misma manera que se encuentra en la naturaleza.

"Homología" se refiere al grado de similitud entre x e y. La correspondencia entre la secuencia de una forma a otra se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden determinar mediante una comparación directa de la información de la secuencia del polinucleótido. Como alternativa, la homología se puede determinar mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones en las que forman dúplex estables entre las regiones homólogas (por ejemplo, las que se usarían antes de la digestión de S_{1}), seguido de la digestión con nuclea-
sa(s) específica(s) de cadena sencilla, seguido de la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; así pues, los péptidos, oligopéptidos, y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere o excluye las modificaciones después de la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.

Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivada de" una secuencia designada de ácidos nucleicos se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una porción de la misma en la que la porción consiste en al menos 3-5 aminoácidos, y más preferiblemente al menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es inmunológicamente identificable con un polinucleótido codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado a partir de una secuencia de ácido nucleico designada.

La proteína se puede usar para producir anticuerpos, bien monoclonales o policlonales, específicos a la proteína. Los procedimientos para producir estos anticuerpos se conocen en la técnica.

"Células huéspedes recombinantes", "células huéspedes", "células", "cultivos celulares" y otras términos similares significan, por ejemplo, microorganismos, células de insectos, y células de mamíferos, que se pueden, o se han usado como receptores de un vector recombinante u otro DNA de transferencia, e incluyen la descendencia de la célula original que se ha transformado. Se entiende que la descendencia de una célula parental individual puede ser no necesariamente idéntica completamente en morfología o en la parte complementaria de DNA genómico o total como el precursor original, debido a una mutación natural, accidental, o deliberada. Los ejemplos de las células huéspedes de mamíferos incluyen células de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO) y de riñón de mono (abreviadamente en inglés COS).

Específicamente, como se usa en esta memoria descriptiva, "línea celular", se refiere a una población de células capaces de crecimiento continuo o prolongado y división in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una sola célula del progenitor. Además se conoce en la técnica que se pueden producir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de tales poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular de referencia pueden no ser precisamente idénticas a las células o cultivos ancestrales, y la línea celular de referencia incluye tales variantes. El término "líneas celulares" también incluye células inmortalizadas. Preferiblemente, las líneas celulares incluyen desde líneas celulares no híbridas o hibridomas a solamente dos tipos de células.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "microorganismo" incluye especies microbianas procarióticas y eucarióticas tales como bacterias y hongos, estos últimos incluyendo levaduras y hongos filamentosos.

"Transformación", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, acoplamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o como alternativa, puede estar integrado en el genoma del huésped.

"Geonómico" significa una colección o genoteca de moléculas de DNA que se derivan de fragmentos de restricción que se han clonado en vectores. Esto puede incluir todo o parte del material genético de un organismo.

"cDNA" significa una secuencia de DNA complementaria que se hibrida a una cadena complementaria de DNA.

"Purificado" y "aislado" significa, cuando se refiere a una secuencia de polipéptidos o de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado" como se usa en esta memoria descriptiva preferiblemente significa al menos 75% en peso, más preferiblemente al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en peso, y lo más preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presente agua, tampones, y otras pequeñas moléculas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular inferior a 1000).

Una vez que se aísla la secuencia codificadora apropiada, se puede expresar en una diversidad de sistemas de expresión diferentes; por ejemplo los usados con células de mamíferos, baculovirus, bacterias y levaduras.

i. Sistemas de mamíferos

Los sistemas de expresión de mamíferos se conocen en la técnica. Un promotor mamífero es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a la RNA polimerasa de mamíferos y que inicia la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que se sitúa usualmente proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora, y una caja TATA, usualmente localizada 25-30 pares de bases (abreviadamente en inglés bp) cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. La caja TATA se cree que dirige la RNA polimerasa II para que comience la síntesis de RNA en el sitio correcto. Un promotor mamífero también contendrá un promotor un elemento promotor cadena arriba, usualmente localizado entre 100 y 200 pares de bases hacia arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina la velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación [Sambrook y col., (1989) "Expresión of Cloned Genes in Mammalian Cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, edición 2ª 1].

Los genes virales de mamíferos a menudo se expresan altamente y tienen una gama amplia de huéspedes; por lo tanto las secuencias que codifican genes virales de mamíferos proporcionan secuencias de promotores particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simplex. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metaloproteína murina, también proporcionan secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser bien constitutiva o regulada (inducible), dependiendo del promotor se puede inducir con glucocorticoide en células receptoras para las hormonas.

La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, usualmente incrementará los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia reguladora de DNA que puede estimular la transcripción hasta 1.000 veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de inicio normal del RNA. Los potenciadores son también activos cuando se colocan cadena arriba o cadena abajo del sitio de iniciación de la transcripción, en bien la orientación normal o la inclinada, o a una distancia de más de 1.000 nucleótidos del promotor [Maniatis y col., (1987) Science 236: 1237; Alberts y col. (1989) Molecualr Biology of the Cell, edición 2ª]. Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que usualmente tienen una gama más amplia de huéspedes. Los ejemplos incluyen el potenciador temprano del gen SV40 [Dijkema y col (1985) EMBO J. 4: 761] y los potenciadores/promotores derivados de la repetición terminal larga (abreviadamente en inglés LTR) del virus de sarcoma de Rous [German y col., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci 79: 6777] y del citomegalovirus humano [Boshart y col., (1985) Cell 41: 521]. Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y se hacen activos solamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o ion metálico [Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis y col., (1987 Science 236: 1237].

Una molécula de DNA se puede expresar intracelularmente en células de mamíferos. Una secuencia promotora se puede unir directamente a la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante siempre será una metionina que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, el extremo N se puede escindir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Como alternativa, las proteínas foráneas también se pueden secretar desde la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia guía que facilita la secreción de la proteína foránea en células de mamíferos. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento guía y el gen foráneo que se puede escindir bien in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia guía usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La guía tripartita de adenovirus es un ejemplo de una secuencia guía que facilita la secreción de una proteína foránea en células de mamíferos.

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación reconocidas por las células de mamíferos son regiones reguladoras localizadas en 3' para el codón de parada de traducción y por lo tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificadora. El extremo 3' del mRNA maduro se forma mediante la escisión post-transcripcional específica del sitio y poliadenilación [Birnstiel y col., (1985) Cell 41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988) ``Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. En Transcription and splicing (ed. B. D. Hames y D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que se pueden traducir en el polipéptido codificado por el DNA. Los ejemplos de señales de terminación de la transcripción/poliadenilación incluyen las derivados de SV40 [Sambrook y col., (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." En Molecular cloning: A Laboratory Manual].

Algunos genes se pueden expresar más eficazmente cuando los intrones (también llamados secuencias intermedias) están presentes. Sin embargo, varios cDNA se han expresado eficazmente a partir de vectores que carecen de las señales de ayuste (también llamado sitios donantes y aceptores de ayuste) [véase, por ejemplo, Gothing y Sambrook (1981) Nature 293: 620]. Los intrones son secuencias no codificadoras intermedias dentro de una secuencia codificadora que contienen sitios de donantes y aceptores de ayuste. Se eliminan mediante un procedimiento llamado "ayuste", seguido de la poliadenilación de la transcripción primaria [Nevins (1993) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet 20: 671; Padgett y col., (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 1119; Krainer y Maniatis (1988) "RNA splicing." En Transcription and splicing (ed. B. D. Hames D. M. Glover)].

Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, la señal de poliadenilación, y secuencia de la terminación de transcripción se ponen juntas en las construcciones de expresión. Los potenciadores, intrones con sitios funcionales donantes y aceptores de ayuste, y las secuencias guías también se pueden incluir en una construcción de expresión, si se desea. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenerse estables en un huésped, tal como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de replicación de mamíferos incluyen los derivados de virus animales, que requieren factores de actuación trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175] o poliomavirus, se replican a número de copias extremadamente altos en presencia de un antígeno T viral apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados de papilonavirus ovinos y virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, que, por lo tanto, le permiten mantenerse, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión y en un huésped procariótico para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores de lanzamiento de mamíferos-bacterias incluyen pMT2 [Kaufman y col., (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] y pHEBO [Shimizu y col., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074].

El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformar. Los procedimientos para la introducción de polinucléotidos heterólogos en células de mamíferos se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido(s) en liposomas, y dirigen la microinyección del DNA en los núcleos.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la colección americana de cultivos tipo (abreviadamente en inglés ATCC), que incluyen pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO), células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (abreviadamente en inglés BHK), células de riñón de mono (abreviadamente en inglés COS), células de carcinoma hepatocelular (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras líneas celulares.

ii. Sistemas de baculovirus

El polinucleótido que codifica la proteína también se puede insertar en un vector de expresión de insecto adecuado, y está unido operativamente a los elementos de control dentro de ese vector. La construcción del vector emplea técnicas que se conocen en la técnica.

Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus de tipo salvaje con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y células huéspedes de insectos y medios de crecimiento apropiados.

Después de insertar la secuencia de DNA que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo salvaje se transfectan en una células huésped de insecto donde al vector y al genoma viral se les permite recombinarse. El virus recombinante encapsidado se expresa y las placas recombinantes se identifican y se purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus y de células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit, entre otros, de Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Los expertos en la técnica conocen en general estas técnicas y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (de aquí en adelante "Summers y Smith").

Antes de insertar la secuencia de DNA que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una guía (si se desea), una secuencia codificadora de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente en una construcción intermedia de sustitución (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un solo gen y elementos reguladores unidos operativamente; genes múltiples, cada uno con su conjunto propio de elementos reguladores unidos operativamente; o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de sustitución intermedias se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenerse estables en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiéndole, por lo tanto, mantenerse en un huésped adecuado para clonación y amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia mas comúnmente usado para introducir genes foráneos en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los expertos en la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de inicio de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI de 32 pares de bases cadena abajo del ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17: 31.

El plásmido usualmente también contiene la señal de poliadenilación (Miller y col., (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen de resistencia a la ampicilina (amp) procariótico y origen de la replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen usualmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a una RNA polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que usualmente está colocada proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de la transcripción usualmente incluye un sitio de unión a la RNA polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio llamado potenciador, que, si está presente, es usualmente distal al gen estructural. La expresión puede estar regulada o ser constitutiva.

Los genes estructurales, transcritos abundantemente en los últimos momentos en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias de promotores particularmente útiles. Los ejemplos incluyen las secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedron viral, Friesen y col., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expresión," en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); publicación EPO Números 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.

Las secuencias señal adecuadas que codifican DNA se pueden derivar a partir de genes para proteínas de insectos o baculovirus secretadas, tal como el gen de polihedrina de baculovirus (Carbonell y col., (1988) Gene, 73: 409). Como alternativa, ya que las señales las modificaciones postraduccionales de células de mamíferos (tales como escisión de péptidos señal, escisión proteolítica, y fosforilación) parecen reconocerse por las células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y acumulación nuclear parecen conservarse entre las células de invertebrados y las células de vertebrados, las guías de origen no insecto, tales como las derivadas de genes que codifican el interferón \alpha humano, Maeda y col., (1985), Nature 315: 592; péptido humano de liberación de gastrina, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; la IL-2 humana, Smith y col., (1985) Proc Nat'l. Acad. Sci. USA, 82: 8404; la IL-3 de ratón, (Miyajima y col., (1987) Gene 58: 273; y la glucocerebrosidasa humana, Martin y col., (1988) DNA, 7: 99, también se pueden usar para facilitar la secreción en insectos.

Un polipéptido o poliproteína recombinante se puede expresar intracelularmente o, se puede secretar si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas. La buena expresión intracelular de las proteínas foráneas no condensadas usualmente requiere genes heterólogos que tienen idealmente una secuencia guía corta que contiene señales de iniciación de la traducción que preceden a una señal de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Como alternativa, las poliproteínas o las proteínas recombinantes que no se secretan naturalmente se pueden secretar desde la célula de insecto creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de una secuencia guía que permite la secreción de la proteína foránea en insectos. El fragmento de la secuencia guía usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína en el retículo endoplásmico.

Después de la inserción de la secuencia de DNA y/o del gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, un huésped de células de insecto se co-transforma con el DNA heterólogo del vector de transferencia y el DNA genómico de un baculovirus de tipo salvaje, usualmente mediante co-transfección. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción usualmente comprenderá una sección de 2-5 kb del genoma del baculovirus.

Los procedimientos para introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y Smith anteriormente; Ju y col., (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede estar en un gen tal como el gen de polihedrina, mediante recombinación de doble entrecruzamiento homóloga; la inserción también puede ser en un sitio de la enzima de restricción modificado por ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4: 91. La secuencia de DNA, cuando se clona en lugar del gen de polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada tanto en 5' como en 3' mediante las secuencias específicas de la polihedrina y está posicionada cadena abajo del promotor de la polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus recientemente formado se encapsida posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); por lo tanto, la mayoría de los virus producidos después de la cotransfección es todavía un virus de tipo salvaje. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite que se distingan los virus recombinantes. La proteína de la polihedrina, que se produce en el virus nativo, se produce a niveles muy altos en los núcleos de las células infectadas en los últimos momentos después de la infección viral. La poliproteína de la polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta 15 \mum de tamaño, son altamente reflectantes, proporcionándoles una apariencia brillante que se visualiza fácilmente bajo la microscopía óptica. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus de tipo salvaje, el sobrenadante de transfección se siembra en placas sobre una monocapa de células de insectos mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. A saber, las placas se seleccionan bajo microscopía óptica para evaluar la presencia (indicativa de virus de tipo salvaje) o ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" vol. 2 (Ausubel y col., eds) a 16,8 (Supp. 10, 1990); Summers y Smith, anteriormente Miller y col., (1989).

Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para la infección en varias células de insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (publicación PCT Nº WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol 3: 2156; y véase en general, Fraser y col., (1989) In vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).

Las células y medios de cultivo celulares están comercialmente disponibles para tanto la expresión directa como para la fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de baculovirus/de expresión; los expertos en la técnica conocen en general la tecnología de cultivo celular. Véase, por ejemplo, Summers y Smith anteriormente.

Las células de insecto modificadas se pueden entonces desarrollar en un medio nutriente apropiado, que permite el mantenimiento estable del (de los) plásmido(s) presente(s) en el huésped de insecto modificado. Cuando el gen del producto de expresión está bajo control inducible, el huésped se puede desarrollar hasta una alta densidad, e inducirse la expresión. Como alternativa, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará continuamente en el medio y el medio nutriente debe estar continuamente circulando, mientras se retira el producto de interés y aumentan los nutrientes agotados. El producto se puede purificar mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación en gradiente de densidad; extracción por disolventes, o los similares. Según sea apropiado, el producto se puede purificar posteriormente, según se requiera, de manera que se retire sustancialmente cualquier proteína de insectos que se secreta también en el medio o se produce por la lisis de las células de insectos, de manera que proporcionen un producto que está al menos sustancialmente libre de desechos del huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y
polisacáridos.

Con el fin de obtener la expresión de proteínas, las células huéspedes recombinantes derivadas de los transformantes se incuban en condiciones que permiten la expresión de la secuencia codificadora de las proteínas recombinantes. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones las pueden determinar fácilmente los expertos en la técnica, basándose en lo que se conoce en la técnica.

iii. Sistemas bacterianos

Las técnicas de expresión bacteriana se conocen en la técnica. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a una RNA polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3'') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca usualmente proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de la iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de unión a la RNA polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también un segundo dominio llamado un operador, que puede solapar un sitio de unión a la RNA polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de RNA. El operador permite la transcripción negativa regulada (inducible), como una proteína represora del gen se puede unir al operador y por consiguiente inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva se puede producir en ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva se puede lograr mediante una secuencia de unión a la proteína activadora del gen, que, si está presente es usualmente proximal (5') a la secuencia de unión a la RNA polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora del gen es la proteína activadora de catabolito (abreviadamente en inglés CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col., (1984) Annu. Rev Genet. 18: 173]. La expresión regulada puede por lo tanto ser bien positiva o negativa, por consiguiente bien potenciando o reduciendo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col., (1977) Nature 198: 1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como los sistemas promotores de triptófano (trp) [Goeddel y col., (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton y col., (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; patente de Estados Unidos Nº 4.738.921; publicación EPO Números 036 776 y 121 775]. El sistema promotor de la g-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." En Interferon 3 (ed. I. Grosser)], el bacteriófago lambda PL [Shimatake y col., (1981) Nature 292: 128] y el T5 [patente de Estados Unidos Nº 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no son de origen natural también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago se pueden unir con las secuencias del operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente de Estados Unidos Nº 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor de tac es un promotor híbrido trp-lac constituido por tanto las secuencias del promotor trp como del operón lac que están reguladas por el represor lac [Amann y col., (1983) Gene 25: 167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a la RNA polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano también se puede acoplar con una RNA polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema RNA polimerasa del bacteriófago T7/promotor es un ejemplo de un sistema promotor adecuado [Studier y col., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor bacteriófago y una región del operador de E. coli (publicación EPO Nº 267 851).

Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz también es útil para la expresión de genes foráneos en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se llama la secuencia Shine-Dalgarno (abreviadamente en inglés SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación [Shine y col., (1975) Nature 254: 34]. La secuencia SD se cree que promueve la unión de mRNA al ribosoma mediante el apareamiento de bases entre la secuencia SD y la 3' y de rRNA de 16S de E. coli [Steitz y col., (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)]. Para expresar los genes eucarióticos y los genes procarióticos con un sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col., (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una molécula de DNA se puede expresar intracelularmente. Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir a partir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante bien la incubación in vivo o in vitro con una peptidasa N-terminal de metionina bacteriana (publicación EPO Nº 219 237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para dirigir la expresión. Usualmente, una secuencia de DNA que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se condensa al extremo 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen celular del bacteriófago lambda se puede unir en el extremo 5' de un gen foráneo y expresarse en bacterias. La proteína de fusión resultante preferiblemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago del gen foráneo [Nagai y col., (1984) Nature 309: 810]. Las proteínas de fusión también se pueden preparar con secuencias de los genes lacZ [Jia y col., (1987) Gene 60: 197], trpE [Allen y col., (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff y col., (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11], y Chey [publicación EPO Nº 324 647]. La secuencia de DNA en la confluencia de las dos secuencias de aminoácidos puede o no puede codificar un sitio de escisión. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubiquitina. Tal proteína de fusión se realiza con la región de la ubiquitina que preferiblemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, la proteasa de procesamiento específica de la ubiquitina) para escindir la ubiquitina desde la proteína foránea. Mediante este procedimiento, se puede aislar la proteína foránea nativa [Miller y col., (1989) Bio/Tecnology 7: 698].

Como alternativa, las proteínas foráneas también se pueden secretar desde la célula creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de la secuencia de péptido señal que facilita la secreción de la proteína foránea en bacterias [patente de Estados Unidos Nº 4.336.336]. El fragmento de la secuencia señal usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína se secreta bien en el medio de crecimiento (bacterias gram-positivas) o en el espacio periplásmico (bacterias gram-negativas) o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y la externa de la célula (bacterias gram-negativas). Preferiblemente existen sitios de procesamiento, que se pueden escindir bien in vivo o in vitro codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen foráneo.

El DNA que codifica las secuencias señal adecuadas se puede derivar de genes para las proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) [Masui y col., (1983), en: Experimental Manipulation of Gen Expression; Ghrayeb y col., (1984) EMBO J. 3: 2437] y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci 82: 7212]. Como ejemplo adicional, la secuencia señal del gen de la amilasa alfa de diversas cepas de Bacillus se pueden usar para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis [Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; publicación EPO Nº 244 042].

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3' para el codón de parada de traducción, y por lo tanto junto con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que se puede traducir en el polipéptido codificado por el DNA. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente las secuencias de DNA de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras en forma de tallo y bucle que ayudan en la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen las secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosíntéticos.

Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, la secuencia señal (si se desea), la secuencia codificadora de interés, y la secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntas en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenerse estables en un huésped, tales como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, así pues permitiéndole que se mantenga en un huésped procariótico bien para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de número de copias bien alto o bajo. Un plásmido de número de copias alto tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y usualmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de número alto de copias preferiblemente contendrá al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede seleccionar cualquier vector de número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína foránea sobre el huésped.

Como alternativa, las construcciones de expresión se pueden integrar en el genoma bacteriano con un vector de integración.

Los vectores de integración usualmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen producirse a partir de las recombinaciones entre DNA homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con DNA de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (publicación EPO Nº 127 328). Los vectores de integración también pueden estar constituidos por bacteriófagos o de secuencias de trasposones.

Usualmente, las construcciones de expresión extracromosómica y de integración pueden contener marcadores seleccionables que permiten la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores seleccionables se pueden expresar en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina), y tetraciclina [Davies y col., (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como aquellos en las rutas biosintéticas de histidina, triptófano, y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente se pueden poner juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente constituidos por un marcador seleccionable que se mantiene bien en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en el interior de muchas bacterias. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para, entre otros, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; publicación EPO Números 036 259 y 063 953; publicación PCT Nº WO 84/04511], Escherichia coli [Shimatake y col (1981) Nature 292: 128; Amann y col., (1985) Gene 40: 183; Studier y col., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; publicaciones EPO Números 036 776, 136 829 y 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [patente de Estados Unidos Nº 4.745.056].

Los procedimientos de introducción de DNA exógeno en huéspedes bacterianos se conocen bien en la técnica, y usualmente incluyen bien la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes tales como cationes divalentes y DMSO. El DNA también se puede introducir en células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies bacterianas a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson y col., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; publicación EPO Números 036 259 y 063 953; publicación PCT Nº WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang y col., (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen y col., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower y col., (1988) Nucleic Acid. Res. 16: 6127; Kushner (1978) ``An improved method for trasnformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (ed. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col., (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy y col., (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler y col., (1988) Anal. Biochem. 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin y col., (1990) FEMS Micobiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany y col., (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferreti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981), Infec. Immun. 32: 1295; Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col., (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus"].

iv. Expresión de levaduras

Los sistemas de expresión de levaduras los conocen bien los expertos en al técnica. Un promotor de levaduras es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a la RNA polimerasa de levaduras e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se coloca usualmente proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de la transcripción usualmente incluye un sitio de unión a la RNA polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor de levaduras también puede tener un segundo dominio llamado una secuencia activadora cadena arriba (abreviadamente en inglés UAS), que, si está presente, es usualmente distal gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser bien positiva o negativa, por lo tanto, bien potenciadora o reductora de la transcripción.

La levadura es un organismo de fermentación con una ruta metabólica activa, por lo tanto, las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen la alcohol deshidrogenasa (abreviadamente en inglés ADH) (publicación EPO Nº 284 044), la enolasa, la glucoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (abreviadamente en inglés GAP o GAPDH), la hexoquinasa, la fosfofructoquinasa, la 3-fosfogliceratomutasa, y la piruvato quinasa (abreviadamente en inglés PyK) (publicación EPO Nº 329 203). El gen PHO5 de levaduras, que codifica la fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles [Myanohara y col., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1].

Además, los promotores sintéticos que no son de origen natural también funcionan como promotores de levaduras. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levaduras se puede unir con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levaduras, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de la ADH unida a la región de activación de la transcripción de la GAP (patente de Estados Unidos números 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen los promotores constituidos por secuencias reguladoras de cualquiera de los genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de las enzimas glicolíticas tales como la GAP o la PyK (publicación EPO Nº 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no levadura que tienen la capacidad de unirse a la RNA polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros, [Cohen y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff y col., (1981) Nature 283: 835; Hollenberg y col., (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg y col., (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes i the Yeast Saccharomyces cerevisiae," en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K > N > Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col., (1980) Gene 11: 163; Panthier y col., (1980) Curr. Genet. 2: 109].

Una molécula de DNA se puede expresar intracelularmente en levaduras. Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de partida ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para los sistemas de expresión de levaduras, así como en sistemas de expresión de mamíferos, de baculovirus, y de bacterias. Usualmente, una secuencia de DNA que codifica la porción N-terminal de una proteína de levadura exógena, se condensa al extremo 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la levadura o el gen de la superóxido dismutasa (abreviadamente en inglés SOD), se pueden unir en el extremo 5' de un gen foráneo y expresado en levaduras. La secuencia de DNA en la confluencia de las dos secuencias de aminoácidos puede o no puede codificar un sitio escindible. Véase, por ejemplo, la publicación EPO Nº 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubiquitina. Tal proteína de fusión está hecha con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, la proteasa de procesamiento específica de la ubiquitina) para escindir la ubiquitina desde la proteína foránea. Por lo tanto, mediante este procedimiento, se puede aislar la proteína foránea nativa (véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 88/024066).

Como alternativa, las proteínas foráneas también se pueden secretar desde la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de DNA quiméricos que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia guía que facilita la secreción en levaduras de la proteína foránea. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento guía y el gen foráneo que se puede escindir bien in vivo o in vitro. El fragmento de la secuencia guía usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula.

El DNA que codifica secuencias señal adecuadas se pueden derivar de genes para las proteínas de levaduras secretadas, tales como el gen de la invertasa de levadura (publicación EPO Nº 012 873; publicación JPO Nº 62.096.086) y el gen del factor A (patente de Estados Unidos Nº 4.588.684). Como alternativa, existen las guías de origen no levadura, tales como una guía de interferón, que también permiten la secreción en levaduras (publicación EPO
Nº 060 057).

Una clase preferida de guías de secreción son las que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levaduras, que contiene tanto una secuencia señal "pre", como una región "pro". Los tipos de fragmentos del factor alfa que se pueden emplear incluyen la guía del factor alfa pre-pro de longitud completa (aproximadamente residuos de 83 aminoácidos) así como guías del factor alfa truncadas (usualmente residuos de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos) (patentes de Estados Unidos números 4.546.083 y 4.870.008; publicación EPO Nº 324 274). Las guías adicionales que emplean un fragmento guía del factor alfa que permiten la secreción incluyen guías del factor alfa híbridas hechas con una presecuencia de una levadura primera, y con una pro-región de un segundo factor alfa de levadura. (Véase, por ejemplo, publicación PCT Nº WO 89/02463.)

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por levaduras son regiones reguladoras localizadas en 3' hacia el codón de parada de traducción, y por lo tanto junto con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que se puede traducir en el polipéptido codificado por el DNA. Los ejemplos de la secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas en la levadura, tales como las que codifican las enzimas glicolíticas.

Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, guía (si se desea), secuencia codificadora de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntas en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenerse establemente en un huésped, tal como una levadura o una bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, por lo tanto permitiéndole que se mantenga, por ejemplo, en una levadura para expresión y en un huésped procariótico para clonación e identificación. Los ejemplos de tales vectores de lanzamiento de bacterias y levaduras incluyen YEp24 [Botstein y col., (1979) Gene 8: 17-24], pCl/1 [Brake y col Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 4642-4646], e YRp17 [Stinchcomb y col., (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Además, un replicón puede ser bien un plásmido de número de copias alto o bajo. Un plásmido de alto número de copias generalmente tendrá un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y usualmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de número alto de copias preferiblemente contendrá al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Se puede seleccionar cualquier vector de número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína foránea sobre el huésped. Véase por ejemplo, Brake y col., anteriormente.

Como alternativa, las construcciones de expresión se pueden integrar en el genoma de levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferiblemente contienen dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen producirse de las recombinaciones entre DNA homólogo en el vector y el cromosoma de levadura [Orr-Weaver y col., (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245]. Un vector de integración se puede dirigir a un locus específico en levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., anteriormente. Una o más construcciones de expresión se pueden integrar, posiblemente afectando a los niveles de proteína recombinante producida [Rine y col., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden producirse bien como un segmento individual en el vector, que da como resultado la integración del vector entero, o dos segmentos homólogos a los segmentos adyacentes en el cromosoma y flanqueando la construcción de expresión en el vector, que puede dar como resultado la integración estable de la construcción de expresión solamente.

Usualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables que permiten la selección de cepas de levaduras que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en el huésped de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, y el gen de resistencia a G418, que confieren resistencia en células de levaduras a la tunicamicina y al G418, respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede también proporcionar levaduras con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tal como un metal. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que las levaduras crezcan en presencia de iones de cobre [Butt y col., (1987) Microbiol. Rev. 51: 351].

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente se pueden poner juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente constituidos por un marcador seleccionable que se mantiene bien en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en el interior de muchas levaduras. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para, entre otros, las levaduras siguientes: Candida albicans [Kurtz, y col (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltose [Kunze, y col., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, y col., (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302 Kluyveromyces fragilis [Das, y col., (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt y col., (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col., (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze y col., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 14-1], Pichia pastoris [Cregg, y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; patentes de Estados Unidos números 4.837.148 y 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen y col., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929: Ito y co., (1983) J. Bateriol. 153: 163, Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706], y Yarrowia lipolytica [Davidow, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, y col., (1985) Curr. Genet. 10: 49].

Los procedimientos de introducción DNA exógeno en huéspedes de levaduras se conocen bien en la técnica, y usualmente incluyen bien la transformación de esferoplastos o de células intactas de levaduras tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies de levaduras a transformar. Véase, por ejemplo, [Kurtz y col., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; Gleeson y col., (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula; [Das y col., (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt y col., (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y col., (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col., (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; patente de Estados Unidos números 4.837.148 y 4.929.555; Pichia]; [Hinnen y col., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito y col., (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow y col., (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].

Ejemplo 1 LT destoxificada

Un fragmento del gen para LT se extrajo del plásmido EWD299 [Dallas W. S., Gill D. M. y Falkow S., 1979, J. Bacteriol., 139, 850-858] mediante digestión con las enzimas de restricción SmaI y EcoRI, y se volvió a clonar en el vector Bluescript KS adecuado para producir cadenas sencillas de DNA [Sambrook J., Fritsch E. y Maniatis, T. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor].

Las células BW313 se transformaron mediante los clones así obtenidos y se dejaron crecer durante 14 horas en un medio de cultivo que consistía en caldo Luria con la adición de 1 \mug/ml de uridina.

Una serie de oligonucleótidos sintéticos (enumerados en la Tabla 1 más adelante), que contenían la mutación, o las bases deseadas en lugar de las naturales, y una secuencia de 10 bases cadena arriba y 10 cadena abajo de la misma mutación, idénticas a las naturales, primero de todo se sintetizaron químicamente y después se fosforilaron, 1,5 pmoles de los mismos se trató a 37ºC con 5 unidades de quinasa.

Después de detener la reacción con una solución 100 mM de EDTA, los oliginucleótidos se hibridaron a la cadena sencilla que contenía el gen LT, mediante calentamiento durante 5 minutos a 70ºC y se enfriaron lentamente durante aproximadamente una hora en hielo.

En esa fase se añadió a esta solución fría (25 \mul) una solución de nucleótidos libres, la enzima DNA ligasa y la enzima DNA polimerasa, en un volumen final de 100 \mul.

La solución así obtenida se mantuvo durante cinco minutos en hielo, cinco minutos a temperatura ambiente y dos horas a 37ºC.

Células adecuadas de E. coli se transformaron con la mezcla de reacción, de acuerdo con las técnicas usuales [Sambrook J., Fritsch E. y Maniatis T. "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor], y la mutagénesis dirigida al sitio se comprobó mediante la secuenciación de los clones obtenidos.

El fragmento SmaI-EcoRI que contenía las diversas mutaciones se sustituyó por la inserción SmaI-EcoRI original en el plásmido EWD299.

Las cepas que codifican la toxina mutada se hicieron crecer después en 10 ml de caldo Luria durante 12 horas a 37ºC.

Los cultivos se centrifugaron y el precipitado que contenía las células se volvieron a suspender en 300 ml de una solución que contenía 25% de sacarosa y 50 mM de tampón Tris a pH 8, y la mezcla se trató durante una hora a temperatura ambiente con 1 mg/ml de una solución de Polimixina B.

La presencia del toxoide en el licor sobrenadante periplasmático se verificó mediante la transferencia de Western y se evaluó la toxicidad mediante la inducción o pérdida de inducción de cambios morfológicos en las células Y1 (véase la tabla 1).

Las células Y1 son células epiteliales tumorales de las cápsulas suprarrenales que se hicieron notablemente más redondas cuando se trataron con una solución que contenía CT o LT [Yasamure Y., Buonassisi V. y Sato G., "Clonal análisis of differentiated function in animal cell cultures", Cancer Res., 1966, 26, 529-535]. La toxicidad de CT y LT se correlaciona con esta transición morfológica. El sobrenadante periplásmico se diluye con una solución de medio F10, 1,5% de suero de caballo, glutamina y gentamicina a concentraciones cada vez menores y células Y1 (250.000 células/ml) se incubaron con las soluciones resultantes durante 48 horas a 37ºC en atmósfera de CO_{2}. Se evaluó la morfología de las células.

En todas las clases, la inmunogenicidad se mostró mediante un ensamblaje correcto del toxoide completo y mediante reacción cruzada del toxoide con el anticuerpo a la LT de tipo salvaje.

Los resultados se muestran en la Tabla I más adelante.

En esta Tabla (y en la Tabla II más adelante) los símbolos de toxicidad significan como sigue:

\mas{3}

tóxico después de dilución 1:2.000 (toxicidad de tipo salvaje)

\mas{2}

tóxico hasta dilución 1:250

+

tóxico hasta dilución 1:64

-

no tóxico, incluso sin diluir

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TABLA I

1

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Dos mutaciones de serina (Ser-114-Glu: 477-GGAGGTGAAGCGTTAGG-494 y Ser-114-Lys: 477-GGAGGT
TAAAGCGTTAGG-494 se mostraron también que exhibían toxicidad sustancialmente reducida.

2

(NA significa "no ensamblado", es decir la holotoxina AB_{5} no se forma en modo alguno.

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Ejemplo 2 CT destoxificada

El procedimiento seguido en el caso del gen para la toxina CT es análogo al descrito anteriormente.

Un fragmento que contiene el gen para una CT se amplificó por medio de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del plásmido pCT322. Una fuente alternativa y equivalente del gen CT es el plásmido pJM17 (Pearson y col., documento PNAS USA 79, (1982), 2976-2980.

Se usaron los dos siguientes cebadores sintéticos:

1)

GGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAA

2)

TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGCAT

que contienen respectivamente un sitio XbaI y un sitio HindIII artificial (mostrados subrayados).

El fragmento resultante amplificado, XbaI-HindIII, que tiene una longitud de 1074 pares de bases, contiene los codones de las dos subunidades, A y B, pero no la secuencia que codifica el péptido guía de la subunidad A. Este fragmento se volvió a clonar en el vector Bluescript KS y se trató de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente para LT, de manera que efectúe la mutagénesis dirigida al sitio.

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TABLA II

3

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4

\newpage

Las siguientes mutaciones también demostraron que suprimen la toxicidad:

100

Se entenderá que la invención se ha descrito anteriormente a modo de ejemplo solamente y se pueden realizar las modificaciones de detalles dentro del alcance y espíritu de la invención.

Claims (19)

1. Una proteína inmunógena destoxificada que comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT-A) o un fragmento de la misma o la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT-A) o un fragmento de la misma, en la que el aminoácido en, o en la posición correspondiente al Val-53, Val-97 ó Tyr-104 se reemplaza por otro aminoácido.

2. Una proteína destoxificada inmunógena según la reivindicación 1, que comprende el reemplazo Val-53-Asp, Val-53-Glu ó Val-53-Tyr.

3. Una proteína destoxificada inmunógena según la reivindicación 1, que comprende el reemplazo Val-97-Lys ó Val-97-Tyr.

4. Una proteína destoxificada inmunógena según la reivindicación 1, que comprende el reemplazo Tyr-104-Lys, Tyr-104-Asp ó Tyr-104-Ser.

5. Una proteína destoxificada inmunógena según la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en la que adicionalmente uno o más aminoácidos en, o en las posiciones que corresponden a Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser-61, Ser-63, His-70, Pro-106, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 ó Arg-192 están reemplazadas.

6. Una proteína destoxificada inmunógena según la reivindicación 5, que comprende uno o más de los siguientes reemplazos de aminoácidos: Ser-63 Lys, Pro-106-Ser, His-107-Glu, Ser-114-Glu, Ser-114-Lys.

7. Una composición inmunógena para uso como una vacuna, que comprende una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición de vacuna que comprende una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición de vacuna según la reivindicación 8, que comprende además un adyuvante.

10. Una secuencia de DNA que codifica una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Un vector que lleva una secuencia de DNA según la reivindicación 10.

12. Una célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 11.

13. Un procedimiento para la producción de una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el cultivo de una célula huésped según la reivindicación 12.

14. Un procedimiento para la producción de un DNA según la reivindicación 10, que comprende las etapas de someter un DNA que codifica una CT-A o una LT-A o un fragmento de las mismas a mutagénesis dirigida al sitio.

15. Un procedimiento para la formulación de una vacuna según la reivindicación 8, que comprende poner una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un procedimiento para la formulación de una vacuna según la reivindicación 9, que comprende poner una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en asociación con un adyuvante.

17. Una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como un producto farmacéutico.

18. Una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como una vacuna.

19. El uso de una proteína destoxificada inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para vacunar un mamífero contra Vibrio cholerae o una cepa enterotoxigénica de Escherichia coli.