ES2566646T3 - Vacunas en nanoemulsión - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena que comprende un virus sincicial respiratorio inactivado con una nanoemulsión (VSR).

Description

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DESCRIPCION

Vacunas en nanoemulsion Campo de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones y se refiere a procedimientos y composiciones para la estimulacion de respuestas inmunitarias. Espedficamente, la presente invencion proporciona composiciones inmunogenas como se definen en las reivindicaciones 1-9, una vacuna que comprende dicha composicion inmunogena como se define en las reivindicaciones 10-11 y la mencionada composicion inmunogena para su uso en el tratamiento o prevencion de una infeccion debida al virus sincicial respiratorio como se define en la reivindicacion 12. En otras palabras, la invencion como se define en las reivindicaciones se refiere a procedimientos para utilizar las composiciones inmunogenas para inducir respuestas inmunitarias (por ejemplo, inmunidad (por ejemplo, inmunidad protectora)) contra un virus patogeno de la familia paramyxoviridae un virus Pneumovirinae (concretamente el virus sincicial respiratorio)). Las composiciones de la presente invencion son de utilidad en, entre otras cosas, aplicaciones clmicas (por ejemplo, terapeuticas y de medicina preventiva (por ejemplo, de vacunacion)) asf como aplicaciones de investigacion.

Antecedentes

La inmunizacion es una caractenstica principal para mejorar la salud de las personas. A pesar de la disponibilidad de una variedad de vacunas satisfactorias contra muchas enfermedades comunes, las enfermedades infecciosas siguen siendo una causa conducente a problemas de salud y muerte. Los problemas significativos inherentes a las vacunas existentes incluyen la necesidad de inmunizaciones repetidas, y la ineficacia de los sistemas de administracion de las vacunas actuales para un amplio espectro de enfermedades.

A fin de desarrollar vacunas contra patogenos que han sido resistentes al desarrollo de vacunas, y/o para superar los defectos de las vacunas comercialmente disponibles (por ejemplo, debido a los resultados adversos, coste elevado, complejidad, y/o infrautilizacion), deben desarrollarse nuevos procedimientos de expresion de antfgenos que permitan un numero menor de inmunizaciones, una utilizacion mas eficaz, y/o menos efectos secundarios de la vacuna.

Se conocen en la tecnica anterior composiciones que comprenden virus inactivados. En particular Meyer y col., 2008 [MEYER Y COL: "Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development" COMPARATIVE IMMUNOLOGY, MICROBIOLOGY AND INFRCTIOUS DISEASES, PERGAMON PRESS, OXFORD, GB, vol. 31, n.° 2-3, 1 de marzo de 2008, paginas 191-225]] y Becker, 2006 [YECHIEL BECKER: "Respiratory syncytial virus (RSV) evades the human adaptive immune system by skewing the Th1/Th2 cytokine balance toward increased levels of Th2 cytokines and IgE, markers of allergy -a review", VIRUS GENES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 33, n.° 2, 1 de octubre de 2006, paginas 235-252] describe la vacuna del VSR inactivada con formaldetndo (FI-VSR). Se divulga la administracion de composiciones que contienen virus inactivados con una nanoemulsion en Makidon y col., 2008 [PAUL E MAKIDON Y COL: "Pre-Clinical Evaluation of a Novel Nanoemulsion-Based Hepatitis B Mucosal Vaccine", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, EE.UU., vol. 3, n.° 8, 1 de agosto de 2008, paginas E2954.1-E2954.15], documento WO-A-2004/030608 y Bielinska y col., 2008 [ANNA U BIELINSKA EZ AL: "A Novel, Killed-Virus Nasal Vaccinia Virus Vaccine" CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, EE.UU., vol. 15, n.° 2, 1 de febrero de 2008, paginas 348-358]. Como nota al margen, el documento WO-A-2009/143524 y Dennis y col., 2007 [DENNIS M. LINDELL Y COL: "A Novel Inactivated Intranasal Respiratory Syncytial Virus Vaccine Promotes Viral Clearance without Th2 Associated Vaccine-Enhanced Disease", PLOS ONE, vol. 6, n.° 7, 15 julio de 2011, pagina e21823], que puede considerarse como una divulgacion antecedente con respecto a la teona o principio sobre la que subyace la invencion, se ha publicado despues la fecha de presentacion de la presente solicitud y por tanto no se puede citar como tecnica anterior de la novedosa etapa inventiva de la presente invencion.

El hecho de que la composicion de nanoemulsion reivindicada, como se divulga en la presente solicitud, sea suficiente para inactivar el VSR no era algo esperado. Partiendo de Meyer y col., 2008 Becker, 2006, como la tecnica anterior mas proxima, la persona experta enfrentada con el problema tecnico objetivo "suministro de una composicion de VSR inmunogena mejorada adecuada para su uso como vacuna segura" no anticipana que la inactivacion del VSR podna conseguirse con la propia nanoemulsion, sino que en su lugar inactivana el virus de antemano.

Sumario de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones. En detalle: la presente invencion proporciona una composicion inmunogena que comprende un virus sincicial respiratorio inactivado con una nanoemulsion (VSR). En una realizacion preferida de la invencion, la nanoemulsion de dicha composicion inmunogena puede utilizarse para inactivar el virus sincicial respiratorio (VSR) y comprende una fase acuosa, una fase oleosa, y un disolvente. En realizaciones preferidas adicionales, dicha nanoemulsion utilizada para inactivar el virus sincicial respiratorio (VSR) comprende a) aproximadamente 5 % en vol. de TWEEN 80, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente 64 % en vol. de aceite, y

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aproximadamente 22 % en vol. de agua, o b) aproximadamente un 5 % en vol. de TWEEN 20, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente 64 % en vol. de aceite, y aproximadamente 22 % en vol. de agua. La composicion inmunogena que se ha mencionado anteriormente puede comprender 1,0 % -10 %, 5 % -15 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, o 50 % - 60 % de una solucion en nanoemulsion. Adicionalmente, dicha composicion inmunogena puede comprender entre 10 y 1010 unidades formadoras de placas (UFP) de virus sincicial respiratorio inactivado, por ejemplo, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 unidades formadoras de placas (UFP) de virus sincicial respiratorio inactivado. En una realizacion preferida de la invencion, dicha composicion inmunogena es termicamente estable. La composicion inmunogena de la invencion puede comprender ademas un transportador farmaceuticamente aceptable. Ademas, puede incluirse un adyuvante en dicha composicion inmunogena. La composicion inmunogena anterior puede comprender una vacuna, y dicha vacuna podria formularse para su administracion a una superficie mucosal. La composicion inmunogena que se ha descrito anteriormente puede ser para su uso en el tratamiento o la prevencion de la infeccion por el virus sincicial respiratorio.

Por razones de precision, se proporcionan a continuacion algunos ejemplos adicionales. En algunos casos, la nanoemulsion es W805EC. La composicion puede comprender una solucion en nanoemulsion al 1-50%, aunque encuentran tambien uso cantidades mayores y menores. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 1,0% - 10%, aproximadamente 10%-20%, aproximadamente 20 %- 30 %, aproximadamente 30 %-40 %, aproximadamente 40 %-50 %, aproximadamente 50 %-60 % o mas de una solucion en nanoemulsion como se ha mencionado ya anteriormente. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 10% de una solucion en nanoemulsion. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 15 % de una solucion en nanoemulsion. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 20 % de una solucion en nanoemulsion. La composicion inmunogena puede comprender aproximadamente 12 % de una solucion en nanoemulsion. La composicion inmunogena puede comprender aproximadamente 8 % de una solucion en nanoemulsion. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 5 % de una solucion en nanoemulsion. La composicion inmunogena puede comprender aproximadamente 2 % de una solucion en nanoemulsion. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende aproximadamente 1 % de una solucion en nanoemulsion. En algunas realizaciones, una composicion inmunogena como se define en las reivindicaciones comprende 2x106 unidades formadoras de placas (UFP) de virus patogeno inactivado VSR t, aunque se puede utilizar mas, por ejemplo, aproximadamente 4x106 UFP, 8x106 UFP, 1x107 UFP, 2x107 UFP, 4x107 UFP, 8x107 UFP, 1x108 UFP, 1x109 UFP, o mas UFP de VSR inactivado mediante nanoemulsion, y menos, por ejemplo, aproximadamente 1x106 UFP, 5x105 UFP, 1x105 UFP, 5x104 UFP, 1x104 UFP, 5x103 UFP, 1x103 UFP o menos UFP de virus del VSR inactivado mediante cantidades en nanoemulsion. En algunas realizaciones, la composicion es estable (por ejemplo, a temperatura ambiente (por ejemplo, durante 12 horas, un dfa, dos dfas, tres dfas, cuatro dfas, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, 9 meses, un ano o mas). En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende un transportador farmaceuticamente aceptable. La presente invencion no se limita a ningun transportador farmaceuticamente aceptable concreto. De hecho, se puede utilizar cualquier transportador adecuado incluyendo, pero sin limitacion, los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la composicion inmunogena comprende ademas un adyuvante. La presente invencion no se limita a ningun adyuvante concreto, y uno cualquiera o mas adyuvantes descritos en el presente documento son de utilidad en la composicion de la invencion incluyendo, pero no de forma limitativa, los adyuvantes orientados hacia una respuesta inmunitaria Th1. La superficie mucosal a la que se va a dirigir la vacuna como se define en la reivindicacion 11 puede comprender la mucosa nasal. La composicion inmunogena que se define en las reivindicaciones puede estimular una respuesta inmunitaria y puede inducir la inmunidad al VSR en el sujeto. Dicha inmunidad puede comprender la inmunidad sistemica. Dicha inmunidad puede comprender la inmunidad mucosal. La respuesta inmunitaria puede comprender un aumento de la expresion de IFN-y en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede comprender un aumento de la expresion de IL-17 en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede comprender la ausencia de un aumento de la expresion de las citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5 y IL-13). La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta sistemica de la IgG al virus inactivado de la familia paramyxoviridae (VSR). La inmunidad puede proteger al sujeto de mostrar signos o smtomas de la enfermedad producida por el virus de la familia paramyxoviridae VSR. La inmunidad puede proteger al sujeto del estfmulo con una posterior exposicion al virus vivo de la familia paramyxoviridae VSR. El sujeto puede ser un ser humano.

Se describen en el presente documento una variedad de composiciones en nanoemulsion como se definen en las reivindicaciones. Se contempla una variedad de aceites que forman parte de la nanoemulsion como se define en las reivindicaciones, que incluyen, pero no de forma limitativa, soja, aguacate, escualeno, oliva, canola, mafz, semilla de colza, cartamo, girasol, pescado, el aroma, y vitaminas insolubles en agua. Los disolventes pueden ser de utilidad como se define en la reivindicacion 2, que incluyen, pero no de forma limitativa, un alcohol (por ejemplo, que incluyen, pero no de forma limitativa, metanol, etanol, propanol, y octanol), glicerol, polietilenglicol, y un disolvente basado en fosfato organico. Los componentes de la nanoemulsion incluyen aceites, disolventes y otros que se describen con mayor detalle a continuacion.

La emulsion puede comprender ademas CPC, como un compuesto cationico que contiene halogeno que se define en la reivindicacion 3.

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La invencion se describe en las reivindicaciones adjuntas. Los casos de la descripcion que no se encuentran comprendidos en las reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invencion.

Descripcion de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva. La invencion puede comprenderse mejor por referencia a una o mas de estas figuras combinadas con la descripcion de los ejemplos espedficos presentados en el presente documento.

La Figura 1 muestra la destruccion del virus sincicial respiratorio (VSR) por la nanoemulsion.

La Figura 2 muestra la induccion de anticuerpos espedficos de VSR tras la inmunizacion con VSR inactivado por la nanoemulsion (NE-VSR).

La Figura 3 muestra que la administracion de NE-VSR a sujetos da como resultado respuestas potenciadas de linfocitos T CD8 espedficas de VSR.

La Figura 4 muestra que la administracion de NE-VSR a sujetos potencia las citoquinas antivmcas en fluido BAL procedente de las vfas aereas de ratones estimulados con VSR.

La Figura 5 muestra que la vacunacion de ratones con NE-VSR potencia la produccion de IL-17 en los pulmones tras el estfmulo con la lmea de VSR.

La Figura 6 muestra que la administracion de NE-VSR a sujetos proporciona un aclaramiento mejorado e induce una respuesta protectora tras el posterior estfmulo del virus vivo.

La Figura 7 muestra la expresion de varios genes en ratones a los que se ha administrado NE-VSR frente a los controles.

La Figura 8 muestra la tincion periodica de acido de Schiff (PAS) de secciones histologicas de pulmon en ratones a los que se ha administrado NE-VSR frente a los controles.

La Figura 9 muestra la expresion de citoquinas en ratones a los que se ha administrado NE-VSR frente a los controles.

La Figura 10 muestra que se generaron sistemicamente respuestas de anticuerpos espedficas de VSR significativas en ratones tras la vacunacion con NE-VSR (A) e Ig total en fluido de lavado broncoalveolar de ratones vacunados en el dfa 2 despues de estfmulo con virus vivo.

Descripcion general de la invencion

La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas y en la anterior seccion "SUMARIO DE LA INVENCION". Los ejemplos de la descripcion que no se encuentran comprendidos en las reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invencion. La presente divulgacion proporciona composiciones para la estimulacion de respuestas inmunitarias. Espedficamente, la presente divulgacion proporciona composiciones inmunogenas que inducen respuestas inmunitarias (por ejemplo, inmunidad (por ejemplo, inmunidad protectora)) contra el virus sincicial respiratorio. Las composiciones de la presente invencion son de utilidad en, entre otras cosas, aplicaciones clmicas (por ejemplo, terapeuticas y de medicina preventiva (por ejemplo, de vacunacion)) asf como aplicaciones de investigacion.

El tratamiento con NE preserva probablemente importantes epftopos antigenicos (por ejemplo, que puede reconocer el sistema inmunitario de un sujeto) del virus (por ejemplo, neutralizando y/o erradicando simultaneamente a la vez la infectividad potencial del virus), estabilizando sus componentes hidrofobos e hidrofilos en la interfase aceite / agua de la emulsion (por ejemplo, proporcionando por tanto uno o mas inmunogenos (por ejemplo, antfgenos estabilizados) contra los cuales un sujeto pude establecer una respuesta inmunitaria). Se observa que, como las formulaciones de NE penetran en la mucosa a traves de los poros, pueden transportar inmunogenos a la localizacion submucosal de las celulas dendnticas (por ejemplo, iniciando y/o estimulando de esta forma una respuesta inmunitaria). La combinacion de NE y VSR parece estabilizar los inmunogenos vmcos y proporciona un material inmunologico adecuado para la generacion de una respuesta inmunitaria.

Las celulas dendnticas fagocitan con avidez las gotmulas de aceite de la nanoemulsion (NE) y esto proporcionana un medio para internalizar los inmunogenos vmcos (por ejemplo, protemas antigenicas o fragmentos peptfdicos de las mismas generados tras la inactivacion del VSR con una nanoemulsion para la presentacion del antfgeno. Mientras que otras vacunas se basan en las toxinas inflamatorias u otros estfmulos inmunitarios para la actividad adyuvante (Vease, por ejemplo, Holmgren y Czerkinsky, Nature Med. 2005, 11; 45-53), no se ha mostrado que las NE sea inflamatorias cuando se colocan sobre la piel o las membranas mucosas en estudios en animales y en seres humanos. De esta manera, una composicion que comprende una NE de la presente invencion puede actuar como un adyuvante "ffsico" (por ejemplo, que transporta y/o presenta composiciones inmunogenas (por ejemplo, peptidos y/o antfgenos de un virus de la familia paramyxoviridae) al sistema inmunitario. La administracion mucosal de una composicion de la presente invencion puede generar inmunidad mucosal (por ejemplo, signos de inmunidad mucosal (por ejemplo, generacion de tftulos de anticuerpos de IgA)) asf como inmunidad sistemica.

La inmunidad celular y la humoral juegan un papel en la proteccion frente a multiples patogenos y ambas se pueden inducir con las formulaciones de NE de la presente invencion. La administracion (por ejemplo, administracion mucosal) de una composicion de la presente invencion (NE-inactivacion del VSR) a un sujeto puede dar como

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resultado la induccion de respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, desarrollo de anticuerpos espedficos) y celulares (por ejemplo, linfocitos T citotoxicos) contra el VSR. Se usa una composicion de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones (VSR inactivado con NE) como vacuna, como se define en la reivindicacion 10.

Una composicion de la presente invencion como se define en las reivindicaciones puede inducir (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto) inmunidad sistemica y mucosal. De esta manera, la administracion de una composicion de la presente invencion como se define en las reivindicaciones a un sujeto puede dar como resultado proteccion frente a una exposicion (por ejemplo, una exposicion mucosal letal) a vSr. La administracion mucosal (por ejemplo, la vacunacion) puede proporcionar proteccion contra una infeccion vmca (por ejemplo, que se inicia en una superficie mucosal). Aunque hasta ahora se ha demostrado diffcil estimular respuestas de IgA secretoras y proteccion contra patogenos que invaden las superficies mucosales (vease, por ejemplo, Mestecky y col, Mucosal Immunology. 3a ed. (Academic Press, San Diego, 2005)), la presente invencion proporciona composiciones para estimular la inmunidad mucosal (por ejemplo, una respuesta de IgA protectora) frente a VSR.

DEFINICIONES

Para facilitar la comprension de la presente invencion, se definen a continuacion varios terminos y frases:

Tal como se usa en el presente documento, el termino "microorganismo" se refiere a cualquier especie o tipo de microorganismo, incluyendo pero sin limitacion, bacterias, virus, archaea, hongos, protozoarios, micoplasmas, priones, y organismos parasitos. El termino microorganismo abarca aquellos organismos que son en sf mismos patogenos para otros organismos (por ejemplo, animales, incluyendo seres humanos, y plantas) y aquellos organismos que producen agentes que son patogenos para otros organismos, aunque el propio organismo no sea directamente patogeno o infectivo para el otro organismo.

Como se usa en el presente documento, el termino "patogeno", y equivalentes gramaticales, se refiere a un organismo (por ejemplo, agente biologico), incluyendo microorganismos, que produce una patologfa (por ejemplo, infeccion, dolencia patologica, enfermedad, etc.) en otro organismo (por ejemplo, animales y vegetales) infectando directamente al otro organismo, o produciendo agentes que dan lugar a enfermedades en otros organismos (por ejemplo, bacterias que producen toxinas patogenas y similares). "Patogenos" incluyen, pero no de forma limitativa, virus, bacterias, archaea, hongos, protozoarios, micoplasmas, priones, y organismos parasitos.

Los terminos "bacterias" y "bacteria" se refieren a todos los organismos procariotas, incluyendo aquellos comprendidos en todos los filum del Reino Procaryotae. Se pretende que el termino abarque todos los microorganismos considerados como bacterias incluyendo Mycoplasma, Chlamydia, Actinomyces, Streptomyces, y Rickettsia. Se incluyen en esta definicion todas las formas de bacterias incluyendo los cocos, bacilos, espiroquetas, esferoplastos, protoplastos, etc.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "hongos" se usa en referencia a organismos eucariotas tales como mohos y levaduras, incluyendo hongos dimorficos.

Como se usa en el presente documento los terminos "enfermedad" y "dolencia patologica" se usan de manera indistinta, salvo que se indique otra cosa en el presente documento, para describir una desviacion de la dolencia con respecto a los miembros normales o en promedio de una especie o grupo (por ejemplo, seres humanos), y que sea perjudicial para un individuo afectado en condiciones que no sean adversas para la mayona de individuos de la especie o grupo. Dicha desviacion puede manifestarse como un estado, signos, y/o smtomas (por ejemplo, diarrea, nauseas, fiebre, dolor, ampollas, forunculos, prurito, inmunosupresion, inflamacion, etc.) que estan asociadas con cualquier deterioro del estado normal de un sujeto o de cualquiera de sus organos o tejidos que interrumpe o modifica el comportamiento de las funciones normales. Una enfermedad o dolencia patologica puede estar producida por o ser el resultado del contacto con un microorganismo (por ejemplo, un patogeno u otro agente infectivo (por ejemplo, virus o bacterias)), puede ser sensible a factores ambientales (por ejemplo, desnutricion, riesgos industriales, y/o clima), puede ser sensible a un defecto inherente del organismo (por ejemplo, anomalfas geneticas) o a combinaciones de estos y otros factores.

Los terminos "hospedador" o "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refieren a un individuo que se va a tratar mediante (por ejemplo, que va a recibir) las composiciones de la presente invencion. Los sujetos incluyen, pero no de forma limitativa, mairnferos (por ejemplo, murinos, simios, equinos, bovinos, porcinos, canes, felinos, y similares), y lo mas preferentemente incluye seres humanos. En el contexto de la invencion, el termino "sujeto" se refiere en general a un individuo al que se administrara o al que se ha administrado una o mas composiciones de la presente invencion (por ejemplo, una composicion para inducir una respuesta inmunitaria).

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "inactivar", "inactivacion" y sus equivalentes gramaticales, cuando se usan en referencia a un microorganismo (por ejemplo, un patogeno (por ejemplo, un virus)), se refiere a la destruccion, eliminacion, neutralizacion y/o reduccion de la capacidad del microorganismo (por ejemplo, un patogeno (por ejemplo, un virus)) de infectar y/o producir una respuesta patologica y/o una enfermedad en un hospedador. Por ejemplo, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un virus sincicial respiratorio (VSR)

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inactivado con una nanoemulsion (NE), como se define en la reivindicacion 1. De acuerdo con ello, tal como se cita en el presente documento, las composiciones que comprenden "VSR inactivado con NE", "VSR destruido con NE", "VSR neutralizado con NE", "NE-VSR" o sus equivalentes gramaticales que se refieren a las composiciones que, cuando se administran a un sujeto, se caracterizan por la ausencia de, o la presencia significativamente reducida de, replicacion de VSR (por ejemplo, durante un periodo de tiempo (por ejemplo, durante un periodo de dfas, semanas, meses, o mas)) en el hospedador.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "fusigenico" se refiera a una emulsion que es capaz de fusionarse con la membrana de un agente microbiano (por ejemplo, una bacteria, espora bacteriana o capsida vrnca). Se describen en el presente documentos ejemplos espedficos de emulsiones fusigenicas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "lisogenico" se refiere a una emulsion (por ejemplo, una nanoemulsion) que es capaz de perturbar la membrana de un agente microbiano (por ejemplo, un virus (por ejemplo, una envoltura vrnca) o una bacteria o espora bacteriana). La presencia de un agente lisogenico y un agente fusigenico en la misma composicion puede producir un efecto potenciado inactivante en comparacion con cualquier agente en solitario. Se describen en detalle en el presente documento las composiciones (por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, usada como vacuna) utilizando esta composicion antimicrobiana.

El termino "emulsion" tal como se usa en el presente documento, incluye dispersiones o gotmulas clasicas de aceite en agua o de agua en aceite, asf como otras estructuras lipfdicas que se pueden formar como resultado de las fuerzas hidrofobas que impulsan los restos apolares (por ejemplo, cadenas largas de hidrocarburos) lejos del agua y que impulsan los grupos de cabeza polares hacia el agua, cuando una fase oleosa inmiscible en agua se mezcla con una fase acuosa. Estas otras estructuras lipfdicas incluyen, pero no de forma limitativa, vesmulas lipfdicas unilamelares, paucilamelares, y multilamelares, micelas, y fases lamelares. De manera similar, el termino "nanoemulsion", tal como se usa en el presente documento, se refiere a dispersiones de aceite en agua que comprenden estructuras lipfdicas pequenas. Por ejemplo, las nanoemulsiones pueden comprender una fase oleosa que tiene gotmulas con un tamano de partmulas promedio de aproximadamente 0,1 a 5 micrometros (por ejemplo, 150 +/-25 nm de diametro), aunque se contemplan tamanos de partmulas mas pequenos y mas grandes. Los terminos "emulsion" y "nanoemulsion" se usan a menudo en el presente documento, de manera indistinta, para referirse a las nanoemulsiones de la presente invencion.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "contacto", "puesto en contacto", "exponer" y "expuesto", cuando se usan en referencia a una nanoemulsion y un microorganismo vivo, se refieren a poner una o mas nanoemulsiones en contacto con un microorganismo (por ejemplo, un patogeno) de tal manera que la nanoemulsion inactiva el microorganismo o el agente patogeno, si esta presente. Se describen en presente documento y en otros lugares una variedad de nanoemulsiones (por ejemplo, las nanoemulsiones descritas en las solicitudes de patente de Estados Unidos 20020045667 y 20040043041, y las patentes de Estados Unidos numeros 6.015.832, 6.506.803, 6.635.676, y 6.559.189). Las relaciones y cantidades de nanoemulsion (por ejemplo, suficientes para inactivar el microorganismo (por ejemplo, la inactivacion del virus)) y los microorganismos (por ejemplo, suficientes para proporcionar una composicion antigenica (por ejemplo, una composicion capaz de inducir una respuesta inmunitaria)) se describen en el presente documento.

El termino "tensioactivo" se refiere a cualquier molecula que tiene un grupo de cabeza polar, que energeticamente prefiere la solvatacion en agua, y una cola hidrofoba que no se solvata bien en agua. El termino "tensioactivo cationico" se refiere a un tensioactivo con un grupo de cabeza cationico. El termino "tensioactivo anionico" se refiere a un tensioactivo con un grupo de cabeza anionico.

Los terminos "numero del mdice del balance hidrofilo-lipofilo" y "numero del mdice HLB" se refieren a un mdice que correlaciona la estructura qrnmica de las moleculas tensioactivas con su actividad superficial. El numero del mdice HLB puede calcularse mediante una variedad de formulas empmcas como se describe, por ejemplo, en Meyers, (Vease, por ejemplo, Meyers, Surfactant Science and Technology, VCH Publishers Inc., Nueva York, pp. 231-245 (1992)). Como se usa en el presente documento cuando resulta adecuado, el numero del mdice del HLB de un tensioactivo es el numero del mdice HLB asignado al dicho tensioactivo en la obra de McCutcheon, Volumen 1: Emulsifiers and Detergents North American Edition, 1996. el numero del mdice HLB vana de 0 a aproximadamente 70 o mas para los tensioactivos comerciales. Los tensioactivos hidrofilos con elevada solubilidad en agua y propiedades solubilizantes estan en el extremo superior de la escala, mientras que los tensioactivos con baja solubilidad en agua que son buenos solubilizantes del agua en aceites estan en el extremo inferior de la escala.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "potenciadores de la interaccion" se refiere a compuestos que actuan para potenciar la interaccion de una emulsion con un microorganismo (por ejemplo, con una pared celular de una bacteria (por ejemplo, una bacteria Gram negativa) o con una envoltura vrnca. Los potenciadores de la interaccion contemplados incluyen, pero no de forma limitativa, agentes quelantes (por ejemplo, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido etilenbis(oxietilenonitrilo)tetraacetico (EGTA), y similares) y determinados agentes biologicos (por ejemplo, albumina de suero bovino (BSA) y similares).

Los terminos "tampon" o "agentes tamponantes" se refieren a materiales que, cuando se anaden a una solucion, dan lugar a que la solucion resista los cambios en el pH.

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Los terminos "agente reductor" y "donante de electrones" se refieren a un material que dona electrones a un segundo material para reducir el estado de oxidacion de uno o mas de los atomos del segundo material.

El termino "sal monovalente" se refiere a cualquier sal en la que el metal (por ejemplo, Na, K, o Li) tiene una carga neta 1+ en solucion (es decir, un proton mas que el electron).

El termino "sal divalente" se refiere a cualquier sal en la que un metal (por ejemplo, Mg, Ca, o Sr) tiene una carga neta 2+ en solucion.

Los terminos "quelador" o "agente quelante" se refieren a cualquier material que tiene mas de un atomo con un par solitario de electrones que estan disponibles para unirse a un ion metalico.

El termino "solucion" se refiere a una mezcla acuosa o no acuosa.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "una composicion para inducir una respuesta inmunitaria", "composicion inmunogena" o los equivalentes gramaticales se refieren a una composicion que, una vez administrada a un sujeto (por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o mas (por ejemplo, con una separacion de semanas, meses o anos)), estimula, genera y/o desencadena una respuesta inmunitaria en el sujeto (por ejemplo, dando como resultado una inmunidad total o parcial a un microorganismo (por ejemplo, patogeno) capaz de producir una enfermedad). La composicion puede comprender una nanoemulsion y un inmunogeno, y puede comprender ademas uno o mas compuestos o agentes diferentes incluyendo, pero no de forma limitativa, agentes terapeuticos, lfquidos fisiologicamente tolerables, geles, transportadores, diluyentes, adyuvantes, excipientes, salicilatos, esteroides, inmunosupresores, inmunoestimulantes, anticuerpos, citoquinas, antibioticos, aglutinantes, cargas, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, y/o tampones. Una respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria innata (por ejemplo, una respuesta inmunitaria no espedfica) o una respuesta inmunitaria aprendida (por ejemplo, adquirida) (por ejemplo, que disminuye la infectividad, morbilidad, o el inicio de la mortalidad en un sujeto (por ejemplo, producido por la exposicion a un microorganismo patogeno) o que evita la infectividad, morbilidad, o el inicio de la mortalidad en un sujeto (por ejemplo, producido por la exposicion a un microorganismo patogeno)). De esta manera, una composicion que comprende una nanoemulsion y un inmunogeno se pueden administrar a un sujeto como vacuna (por ejemplo, para prevenir o atenuar una enfermedad (por ejemplo, proporcionando al sujeto inmunidad total o parcial frente a la enfermedad o la atenuacion total o parcial (por ejemplo, la supresion) de un signo, smtoma o dolencia de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que puede estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria mucosal). Algunos adyuvantes pueden producir la activacion de una celula del sistema inmunitario (por ejemplo, un adyuvante puede dar lugar a que una celula inmunitaria produzca y secrete una citoquina). Los ejemplos de adyuvantes que pueden dar lugar a la activacion de una celula del sistema inmunitario incluyen, pero no de forma limitativa, saponinas purificadas procedentes de la corteza del arbol Q. saponaria, tales como QS21 (un glucolfpido que eluye en el pico 21° con fraccionamiento mediante HPLC; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.); poli(di(carboxilatofenoxi)fosfaceno (polfmero PCPP; Virus Research Institute, EE.UU.); derivados de lipopolisacaridos tales como monofosforil lfpido A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), dipeptido de muramilo (MDP; Ribi) y dipeptido de treonil-muramilo (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacarido de glucosamina relacionado con el lfpido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza); y el factor de alargamiento de Leishmania (una protema purificada de Leishmania; Corixa Corporation, Seattle, Wash.). Se conocen bien en la tecnica los adyuvantes tradicionales e incluyen, por ejemplo, fosfato de aluminio o sales de hidroxido ("alum"). Las composiciones de la presente invencion que comprenden VSR inactivado con una nanoemulsion como se define en las reivindicaciones pueden administrarse con uno o mas adyuvantes (por ejemplo, para desviar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 o Th2).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria" (por ejemplo, de una composicion para inducir una respuesta inmunitaria), se refiere al nivel de dosificacion requerido (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto) para estimular, generar y/o desencadenar una respuesta inmunitaria en el sujeto. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o mas administraciones (por ejemplo, mediante la misma o diferente ruta), aplicaciones o dosificaciones y no se pretende que se limite a una formulacion o ruta de administracion concreta.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "en condiciones tales que dicho sujeto genera una respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier induccion, generacion, y/o estimulacion de una respuesta inmunitaria cualitativa o cuantitativa (por ejemplo, innata o adquirida).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta del sistema inmunitario de un sujeto. Por ejemplo, las respuestas inmunitarias incluyen, pero no de forma limitativa, una alteracion detectable (por ejemplo, un aumento) en la activacion del receptor Toll, la expresion y/o la secrecion de linfoquinas (por ejemplo, la expresion y/o expresion de citoquinas (por ejemplo, citoquinas de tipo Th1 o Th2) o quimioquinas), activacion de macrofagos, activacion de celulas dendnticas, activacion de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4+ o CD8+), activacion de linfocitos NK, y/o activacion de linfocitos B (por ejemplo, generacion y/o

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secrecion de anticuerpos). Los ejemplos adicionales de respuestas inmunitarias incluyen la union de un inmunogeno (por ejemplo, un antigeno (por ejemplo, un polipeptido inmunogeno)) a una molecula MHC y la induccion de una respuesta de los linfocitos T citotoxicos ("LTC"), induccion de una respuesta de los linfocitos B (por ejemplo, la produccion de anticuerpos), y/o una respuesta de los linfocitos T auxiliares, y/o una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) frente al antigeno del cual se deriva el polipeptido inmunogeno, la expansion (por ejemplo, el crecimiento de una poblacion de celulas) de celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B (por ejemplo, de cualquier etapa de desarrollo (por ejemplo, celulas plasmaticas), y un aumento del procesamiento y la presentacion de antigenos por las celulas presentadoras de antigenos. Una respuesta inmunitaria puede ser contra inmunogenos que el sistema inmunitario del sujeto reconoce como extranos (por ejemplo, no a los autoantigenos procedentes de microorganismos (por ejemplo, patogenos), o autoantfgenos reconocidos como extranos). De esta manera, debe entenderse que, tal como se usa en el presente documento, "respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier tipo de respuesta inmunitaria, que incluye, pero no de forma limitativa, respuestas inmunitarias innatas (por ejemplo, la cascada de senalizacion del receptor Toll), respuestas inmunitarias mediadas por celulas (por ejemplo, respuestas mediadas por linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T espedficos de antfgenos) y celulas no espedficas del sistema inmunitario) y respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, respuestas mediadas por linfocitos B (por ejemplo, mediante la generacion y secrecion de anticuerpos en el plasma, linfa, y/o fluidos tisulares). Se entiende que el termino "respuesta inmunitaria" abarca todos los aspectos de la capacidad del sistema inmunitario de un sujeto para responder a antigenos y/o inmunogenos (por ejemplo, la respuesta inicial a un inmunogeno (por ejemplo, un patogeno) asf como las respuestas adquiridas (por ejemplo, la memoria) que son el resultado de una respuesta inmunitaria adaptativa).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "inmunidad" se refiere a la proteccion contra la enfermedad (por ejemplo, la prevencion o atenuacion (por ejemplo, la supresion) de un signo, smtoma o dolencia de la enfermedad) tras su exposicion a un microorganismo (por ejemplo, patogeno) capaz de producir la enfermedad. La inmunidad puede ser innata (por ejemplo, respuestas inmunitarias no adaptativas (por ejemplo, no adquiridas) que existen en ausencia de una exposicion previa a un antfgeno) y o adquiridas (por ejemplo, respuestas inmunitarias que estan mediadas por linfocitos B y T tras una exposicion previa a un antfgeno (por ejemplo, que presentan una especificidad y reactividad aumentadas al antigeno)).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "inmunogeno" se refiere a un agente (por ejemplo, un microorganismo (por ejemplo, una bacteria, virus u hongo) y una parte o componente del mismo (por ejemplo, una protema antigenica)) que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Los inmunogenos pueden estimular la inmunidad frente al inmunogeno (por ejemplo, un microorganismo (por ejemplo, un patogeno o un producto patogeno)) cuando se administra en combinacion con una nanoemulsion.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "producto patogeno" se refiere a cualquier componente o producto derivado de un patogeno, incluyendo, pero no de forma limitativa, polipeptidos, peptidos, protemas, acidos nucleicos, fracciones de membranas, y polisacaridos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "inmunidad potenciada" se refiere a un aumento en el nivel de la inmunidad adaptativa y/o adquirida en un sujeto hacia un inmunogeno dado (por ejemplo, un microorganismo (por ejemplo, patogeno)) tras la administracion de una composicion relativa al nivel de inmunidad adaptativa y/o adquirida en un sujeto al que no se ha administrado la composicion.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "purificado" o "para purificar" se refieren a la eliminacion de contaminantes o compuestos indeseados de una muestra o composicion. Tal como se usa en el presente documento, el termino "sustancialmente purificado" se refiere a la eliminacion de entre aproximadamente 70 a 90 %, hasta el 100 %, de los contaminantes o compuestos indeseados de una muestra o composicion.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "administracion" y "administrar" se refieren al acto de proporcionar una composicion a un sujeto. Las rutas de administracion ilustrativas hacia el cuerpo humano incluyen, pero no de forma limitativa, a traves de los ojos (oftalmica), la boca (oral), la piel (transdermica), la nariz (nasal), los pulmones (mediante inhalacion), la mucosa oral (bucal), los ofdos, rectal, mediante inyeccion (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, etc.), topica, y similares.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "coadministracion" y "coadministrar" se refieren a la administracion de al menos dos agente(s) o tratamientos a un sujeto. La coadministracion de dos o mas agentes o tratamientos puede ser simultanea, o un primer agente/tratamiento se administra antes de un segundo agente/tratamiento. La coadministracion puede ser mediante la misma o diferente ruta de administracion. Los expertos en la materia entienden que las formulaciones y/o rutas de administracion de los diversos agentes o tratamientos pueden variar. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente la dosificacion adecuada para la coadministracion. Cuando se coadministran agentes o tratamientos, los agentes o tratamientos respectivos pueden administrarse a dosificaciones mas bajas que las adecuadas para su administracion en solitario. De esta manera, la coadministracion es especialmente deseable cuando la coadministracion de los agentes o los tratamientos disminuyen la dosificacion requerida de un agente(s) potencialmente perjudicial (por ejemplo, toxico), y/o cuando la coadministracion de dos o mas agentes da como resultado la sensibilizacion de un sujeto a los efectos beneficiosos de uno de los agentes mediante la coadministracion del otro agente. La coadministracion puede ser preferible para

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estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto a dos o mas inmunogenos diferentes (por ejemplo, microorganismos (por ejemplo, patogenos)) en o practicamente al mismo tiempo (por ejemplo, cuando es improbable que un sujeto este disponible para una posterior administracion de una segunda, tercera, o composicion adicional para inducir una respuesta inmunitaria).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "topicamente" se refiere a la aplicacion de composiciones de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones a la superficie de la piel y/o a las celulas y tejidos mucosales (por ejemplo, mucosa alveolar, bucal, lingual, masticatorio vaginal o nasal, y otros tejidos y celulas que revisten organos huecos o cavidades corporales).

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden administrar tambien en la forma de emulsiones topicas, composiciones inyectables, soluciones ingeribles, y similares. Por razones de precision, se ha senalado que dicha administracion no esta cubierta por la invencion como se define en las reivindicaciones. Cuando la ruta es topica, la forma puede ser, por ejemplo, un pulverizador (por ejemplo, un pulverizador nasal), una crema, u otra solucion viscosa (por ejemplo, una composicion que comprende una nanoemulsion y un inmunogeno en polietilenglicol).

Los terminos "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" tal como se usan en el presente documento, se refieren a composiciones que no producen sustancialmente reacciones adversas (por ejemplo, reacciones toxicas, alergicas o inmunologicas) cuando se administran a un sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "transportador farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los transportadores farmaceuticos normalizados incluyendo, pero no de forma limitativa, solucion salina tamponada con fosfato, agua, y varios tipos de agentes mojantes (por ejemplo, lauril sulfato sodico), todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, laurilsulfato de sodio, agentes isotonicos y de retraso de la absorcion, disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato de almidon sodio), polietilenglicol, y similares. Las composiciones pueden incluir tambien estabilizantes y conservantes. Se han descrito ejemplos de transportadores, estabilizantes y adyuvantes y se conocen en la tecnica (vease por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed, Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975)).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal (por ejemplo, obtenida mediante reaccion con un acido o una base) de una composicion que es fisiologicamente tolerada en el sujeto diana. Las "sales" de las composiciones pueden derivarse de acidos y bases inorganicos u organicos. Los ejemplos de acidos incluyen, pero no de forma limitativa, acido clortndrico, bromlddrico, sulfurico, mtrico, perclorico, fumarico, maleico, fosforico, glicolico, lactico, salidlico, sucdnico, p-toluenosulfonico, tartarico, acetico, dtrico, metanosulfonico, etanosulfonico, formico, benzoico, malonico, sulfonico, naftaleno-2-sulfonico, bencenosulfonico, y similares. Pueden emplearse otros acidos, tales como el acido oxalico, aunque no sean por si mismos farmaceuticamente aceptables, en la preparacion de sales utiles como intermedios en la obtencion de las composiciones y sus sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables.

Los ejemplos de bases incluyen, pero no de forma limitativa, hidroxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), hidroxidos de metales alcalinoterreos (por ejemplo, magnesio), amoniaco, y compuestos de formula NW+, en los que W es alquilo C, y similares.

Los ejemplos de las sales incluyen, pero no de forma limitativa: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, cloruro, bromuro, yoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, y similares. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos constituidos con un cation adecuado tales como Na+, NH4, y NW4+ (en el que W es un grupo alquilo C1-4), y similares. Para el uso terapeutico, se contemplan las sales de los compuestos que son farmaceuticamente aceptables. Sin embargo, pueden tambien ser de utilidad las sales de acidos y bases que no sean farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, en la preparacion o purificacion de un compuesto farmaceuticamente aceptable.

Para el uso terapeutico, se contemplan las sales de las composiciones que son farmaceuticamente aceptables. Sin embargo, pueden tambien ser de utilidad las sales de acidos y bases que no sean farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, en la preparacion o purificacion de una composicion farmaceuticamente aceptable.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "en riesgo de enfermedad" se refiere a un sujeto que esta predispuesto a experimentar una enfermedad concreta. Esta predisposicion puede ser genetica (por ejemplo, una tendencia genetica concreta a experimentar la enfermedad, tal como trastornos heredables), o debido a otros factores (por ejemplo, edad, las condiciones ambientales, exposiciones a compuestos perjudiciales presentes en el ambiente, etc.).

"Aplicacion nasal", tal como se usa en el presente documento, significa aplicada a traves de la nariz en los pasos nasales o sinusales o en ambos. La aplicacion puede, por ejemplo, llevarse a cabo mediante gotas, pulverizadores,

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nebulizaciones, revestimientos o sus mezclas aplicadas en los pasos nasales y sinusales.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "kit" se refiere a cualquier sistema de administracion para administrar materiales. En el contexto de los agentes inmunogenos (por ejemplo, las composiciones que comprenden una nanoemulsion y un inmunogeno), dichos sistemas de administracion incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, el transporte, o la administracion de agentes inmunogenos y/o materiales de soporte (por ejemplo, instrucciones escritas para utilizar los materiales, etc.) de una localizacion a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o mas cerramientos (por ejemplo, cajas) que contienen los agentes inmunogenos relevantes (por ejemplo, nanoemulsiones) y/o los materiales de soporte. Tal como se usa en el presente documento, el termino "kit fragmentado" se refiere a sistemas de administracion que comprenden dos o mas recipientes separados, que contienen cada uno una subporcion de los componentes totales del kit. Los envases pueden administrarse al receptor previsto juntos o separados. Por ejemplo, un primer envase puede contener una composicion que comprende una nanoemulsion y un inmunogeno para un uso concreto, a la vez que un segundo envase contiene un segundo agente (por ejemplo, un antibiotico o un aplicador para pulverizacion). De hecho, cualquier sistema de administracion que comprende dos o mas envases separados que contienen cada uno una subporcion de los componentes totales del kit se incluye en el termino "kit fragmentado". Por el contrario, un "kit combinado" se refiere a un sistema de administracion que contiene todos los componentes de un agente inmunogeno necesarios para un uso concreto en un unico envase (por ejemplo, en una caja unica que contiene todos los componentes deseados). El termino "kit" incluye kits fragmentados y combinados.

Descripcion detallada de la invencion

El virus sincicial respiratorio (VSR) infecta a casi todos los bebes de 2 anos de edad y es la causa principal de la bronquiolitis en ninos en todo el mundo. Los CDC estiman que hasta 125.000 hospitalizaciones pediatricas en los Estados Unidos cada ano se deben al VSR, con un coste anual de mas de 300 millones de dolares (1). A pesar de la generacion de respuestas inmunitarias adaptativas espedficas de VSR, el VSR no confiere inmunidad protectora y son comunes las infecciones recurrentes a lo largo de la vida (2, 3). Aunque el VSR es especialmente perjudicial en muchos lactantes cuyas vfas aereas son pequenas y se ocluyen facilmente, VSR se ha reconocido tambien como un importante patogeno en receptores de trasplantes, pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), personas mayores, asf como otros pacientes con enfermedad pulmonar cronica, especialmente asma. Datos recientes sugieren que la mortalidad combinada de todas las edades ha sido aproximadamente de 30/100.000 desde 1990-2000, con una mortalidad promedio anual de mas de 17.000 personas en los Estados Unidos (4, 5). Estas cifras estan probablemente muy subestimadas, ya que no se han investigado a fondo en adultos de una manera consistente. De esta manera, el VSR no solo produce una enfermedad pulmonar significativamente exacerbada en jovenes y personas mayores, sino que se asocia tambien con una cantidad significativa de mortalidad directa. Aunque estan disponibles anticuerpos contra el VSR y parecen aliviar la enfermedad grave, solamente son utiles cuando se administran de forma profilactica y existen pocas opciones para combatir las infecciones por VSR en poblaciones de pacientes susceptibles (6-10).

A finales de 1960 fracasaron los intentos de vacunar ninos con una preparacion de vacuna de VSR inactivada con formol precipitada con alum y produjeron exacerbaciones graves de la enfermedad tras infeccion con el virus VSR vivo. Las manifestaciones clmicas parecieron ser el resultado de una enfermedad Th2 potenciada, con produccion de moco y eosinofilia que no se observo en ninos no vacunados. Estos mismos smtomas pueden aparecer en subconjuntos de lactantes gravemente infectados.

Algunos estudios epidemiologicos vinculan respuestas graves del VSR con el desarrollo final de enfermedad hiperreactiva de las vfas aereas incluso anos despues que se haya resuelto la infeccion (3). Sigurs et. al., han encontrado lactantes con bronquiolitis debida a VSR que tuvieron un riesgo mayor de desarrollar asma y episodios de sibilancias a las edades de 1, 3 y 7 en comparacion con los controles sanos (11-13). Se ha asociado tambien el VSR con exacerbaciones de asma y puede producir episodios prolongados de enfermedad (14). Un interesante estudio ha sugerido un vinculo causal debido a que el tratamiento de los lactantes que ternan enfermedad grave de VSR con globulina inmunitaria de VSR disminuyo significativamente su riesgo final en el desarrollo de asma infantil y disfuncion pulmonar (15). Una caractenstica clmicamente relevante de la enfermedad por VSR que puede predispones a ninos y adultos a enfermedad cronica es la incapacidad de adquirir inmunidad protectora debido a la respuesta inmunitaria alterada. Estudios mas recientes han sugerido que poblaciones de pacientes con funcion pulmonar comprometida (especialmente pacientes con EPOC) estan tambien en riesgo de complicaciones graves debido a la infeccion por vSr que es casi tan frecuente como la asociada con el virus de la gripe (16-20). Estas complicaciones podnan agravarse por el potencial del VSR de tener la capacidad de persistir durante largos periodos en el pulmon incluso despues de haberse resuelto la enfermedad aguda. Se ha teorizado que esto esta asociado con el desarrollo de un entorno inmunitario alterado que aclara menos eficazmente el virus. De esta manera, una vacuna eficaz que se pueda usar en ninos y adultos tiene el potencial de una amplia aplicacion a traves de la poblacion y puede proporcionar una proteccion significativa desde el inicio y la exacerbacion de la enfermedad pulmonar cronica.

De acuerdo con ello, la presente invencion proporciona composiciones de nanoemulsiones inmunogenas como se definen en las reivindicaciones y su uso para inducir respuestas inmunitarias (por ejemplo, inmunidad (por ejemplo, inmunidad protectora)) frente a VSR. Las composiciones de la presente invencion como se definen en las

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reivindicaciones son de utilidad en, entre otras cosas, aplicaciones clmicas (por ejemplo, terapeuticas y de medicina preventiva (por ejemplo, de vacunacion)) as^ como aplicaciones de investigacion. Las composiciones inmunogenas ilustrativas (por ejemplo, las composiciones de vacuna) se describen de manera mas detallada a continuacion.

La presente invencion proporciona composiciones para inducir respuestas inmunitarias que comprenden una nanoemulsion y un virus sincitial respiratorio inactivado como se define en la reivindicacion 1. La reivindicacion 2 especifica nanoemulsiones concretas. De hecho, pueden ser de utilidad una variedad de nanoemulsiones, por ejemplo, las descritas en el presente documento y las descritas en otra parte (por ejemplo, las nanoemulsiones descritas en las solicitudes de patente de Estados Unidos 20020045667 y 20040043041, y las patentes de Estados Unidos numeros 6.015.832, 6.506.803, 6.635.676, y 6.559.189).

Los inmunogenos (virus sincitial respiratorio inactivado) y las nanoemulsiones que se definen en las reivindicaciones pueden combinarse en cualquier cantidad adecuada. Se puede utilizar cualquier formulacion farmaceutica, que incluye, pero no de forma limitativa, las descritas en el presente documento. Se pueden someter a ensayo las formulaciones adecuadas para la inmunogenicidad usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se puede investigar la inmunogenicidad mediante la cuantificacion de los tttulos de anticuerpos y las respuestas espedficas de los linfocitos T. Se pueden someter a ensayo tambien las composiciones en nanoemulsion con modelos animales de patologfas infecciosas. Por razones de precision debe senalarse que este aspecto no esta incluido en la presente invencion. Los modelos animales adecuados, patogenos, y ensayos de inmunogenicidad incluyen, pero no de forma limitativa, los descritos a continuacion.

Las composiciones que se definen en las reivindicaciones pueden proporcionar el desarrollo de inmunidad contra VSR en un sujeto tras la administracion mucosal (por ejemplo, vacunacion mucosal) de una composicion que comprende el VSR inactivado con una nanoemulsion (NE). Tal como se describe en los Ejemplos 1-2, la NE se mezcla con el VSR, dando como resultado una formulacion (por ejemplo, composicion de vSr inactivado con NE) que es estable a temperatura ambiente (por ejemplo, en algunas realizaciones, durante mas de 2 semanas, mas preferentemente mas de 3 semanas, incluso de forma mas preferente mas de 4 semanas, y lo mas preferente durante mas de 5 semanas) y que se puede usar para inducir una respuesta inmunitaria frente a VSR en un sujeto (por ejemplo, que se puede usar tanto solo o como adyuvante para inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra VSR).

La administracion mucosal de una composicion que comprende VSR inactivado con NE a un sujeto dio como resultado respuestas de anticuerpos con un tttulo alto inmunidad celular espedfica de Th1 (Vease, por ejemplo, los ejemplos 1-4). Ademas, se protegieron los animales contra un posterior estfmulo con VSR (Vease, por ejemplo, Ejemplo 4). Ademas, en agudo contraste con una preparacion de vacuna de VSR inactivada con formol precipitada con alum (por ejemplo, descrita anteriormente), descrito anteriormente, el VSR inactivado con NE conduce a una solida respuesta inmunitaria Th1 (por ejemplo, como se ha documentado por la expresion potenciada de la respuesta de IFN-y e IL-17 (Vease, por ejemplo, Ejemplo 4) y no potencia y/o eleva la expresion de las citoquinas Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5 o IL-13) asociada con una respuesta de tipo Th2. Los ratones a los que se administro incluso una unica dosis de una composicion que comprendfa VSR inactivado con NE desarrollaron concentraciones en suero de IgG dirigida contra VSR 4 semanas despues de la administracion que continuo aumentando a 8 semanas despues de la administracion y que se elevo significativamente tras una administracion de refuerzo (Veanse, por ejemplo, Ejemplos 2-4). De esta manera, se ha mostrado que una unica administracion (por ejemplo, administracion mucosal) de una composicion que comprende VSR inactivado con NE es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto (por ejemplo, inmunidad protectora (por ejemplo, inmunidad mucosal y sistemica)). La posterior administracion (por ejemplo, una o mas administraciones de refuerzo posteriores a una administracion primaria) a un sujeto puede proporcionar la induccion de una respuesta inmunitaria potenciada a VSR en el sujeto. De esta manera, se ha demostrado que la administracion de una composicion que comprende VSR inactivado con NE a un sujeto proporciona inmunidad protectora frente a la infeccion por VSR.

La inmunidad celular y humoral juegan probablemente un papel en la proteccion frente al CSR, y ambas se indujeron con las formulaciones de NE (Veanse, por ejemplo, los ejemplos 1-4). Los tttulos de anticuerpos espedficos de VSR se consideran importantes para estimar la inmunidad protectora en sujetos humanos y en modelos animales de vacunacion.

Los datos documentan que NE destruye eficazmente el VSR y genera una composicion de inmunizacion no infecciosa adecuada para el uso en la induccion de una respuesta inmunitaria frente a VSR en un sujeto (por ejemplo, para su uso como una vacuna). Las composiciones inmunogenas inducen tftulos de anticuerpos en suero dirigidos contra VSR espedficos e inician importantes respuestas inmunitarias celulares antivmcas (por ejemplo, que incluyen la produccion creciente de citoquinas antivmcas y el desarrollo de linfocitos T citotoxicos CD8+ espedficos de VSR) tras la administracion a un sujeto. La composicion inmunogena de la invencion proporciona tambien un aclaramiento vmco mejorado tras el estfmulo con el VSR vivo. De acuerdo con ello, las composiciones de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones pueden proporcionar la capacidad de generar respuestas inmunitarias innatas adecuadas (por ejemplo, resultantes de la exposicion a antfgenos mantenida en una forma reconocible en NE que estimula los antfgenos proporcionados por una infeccion activa) proporcionando por tanto una estrategia de vacuna mas adecuada (por ejemplo, en comparacion con el VSR inactivado con formol).

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De esta manera, la administracion (por ejemplo, administracion mucosal) de una composicion de la presente invencion como se define en las reivindicaciones a un sujeto puede proporcionar la induccion de respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, desarrollo de anticuerpos espedficos) y celulares (por ejemplo, linfocitos T citotoxicos) contra el VSR. Se puede usar una composicion de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones 1-9, como vacuna, de acuerdo con las reivindicaciones 10-11.

Generacion de anticuerpos

Se puede usar una composicion inmunogena que comprende un virus sincicial respiratorio inactivado con una nanoemulsion (NE) para inmunizar a un mairnfero, tal como un raton, rata, conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, puede conjugarse un antigeno de un virus sincicial respiratorio con una protema transportadora, tal como albumina serica de bovino, tiroglobulina, hemocianina de lapa californiana u otro transportador descrito en el presente documento. Dependiendo de la especie hospedadora, se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica. Dichos adyuvantes incluyen, pero no de forma limitativa, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidroxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, nanoemulsiones descritas en el presente documento, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, los BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente utiles.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales que se unen espedficamente a un antigeno del virus sincicial respiratorio utilizando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo en lmeas celulares continuas en cultivo. Estas tecnicas incluyen, pero no de forma limitativa, la tecnica del hibridoma, la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos, y la tecnica del hibridoma de VEB (Veanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256, 495 497, 1985; Kozbor y col., J. Immunol. Methods 81, 3142, 1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell. Biol. 62, 109 120, 1984).

Ademas, se pueden usar las tecnicas desarrolladas para la produccion de "anticuerpos quimericos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de raton a genes de anticuerpos humanos para obtener una molecula con especificidad antigenica y actividad biologica adecuadas, (Veanse, por ejemplo, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 68516855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604 608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452 454, 1985). Los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos se pueden tambien "humanizar" para evitar que un paciente desarrolle una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo cuando se usa terapeuticamente. Dichos anticuerpos pueden tener una secuencia lo suficientemente similar en secuencia a la de los anticuerpos humanos que se van a usar directamente en tratamiento o pueden requerir la alteracion de unos pocos restos clave. Las diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedores y secuencias humanas se pueden minimizar sustituyendo restos que difieren de los de las secuencias humanas mediante mutagenesis dirigida al sitio de restos individuales o reticulando regiones completas determinantes de la complementariedad.

Como alternativa, se pueden producir anticuerpos humanizados utilizando procedimientos recombinantes, como se describe mas adelante. Los anticuerpos que se unen espedficamente a un antfgeno concreto pueden contener sitios de union al antfgeno que estan tanto parcial como completamente humanizados, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.565.332.

Como alternativa, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos monocatenarios pueden adaptarse utilizando los procedimientos conocidos en la materia para producir anticuerpos monocatenarios que se unen espedficamente a un antfgeno concreto. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composicion idiotfpica, pueden generarse mediante intercambio de cadenas a partir de bibliotecas de inmunoglobulina combinatorias (Veanse, por ejemplo, Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991).

Se pueden construir anticuerpos monocatenarios utilizando un procedimiento de amplificacion del ADN, tales como la PCR, utilizando un ADNc de hibridoma como molde (Vease, por ejemplo, Thirion y col., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos monocatenarios pueden ser monoespedficos o biespedficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. Se contempla la construccion de anticuerpos monocatenarios biespedficos tetravalentes, por ejemplo, en Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. Se contempla la construccion de anticuerpos monocatenarios biespedficos bivalentes, por ejemplo, en Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.

Se puede construir una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo bicatenario utilizando la smtesis manual o automatizada de nucleotidos, clonarse en una construccion de expresion utilizando procedimientos de ADN recombinante normalizados, e introducirse en una celula que expresa la secuencia de codificacion, como se describe mas adelante. Como alternativa, se pueden producir anticuerpos monocatenarios directamente utilizando, por ejemplo, la tecnologfa de fagos filamentosos (veanse, por ejemplo, Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61,497501; Nicholls y col., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

Se pueden producir tambien anticuerpos que se unen a un antfgeno concreto induciendo la produccion in vivo en la poblacion de linfocitos o seleccionando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de union muy espedficos como se describe en la bibliograffa (Veanse, por ejemplo, Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293 299, 1991).

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Se pueden construir anticuerpos quimericos como se describe en el documento WO 93/03151. Se pueden preparar tambien protemas de union que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespedficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el documento WO 94/13804. Se pueden purificar anticuerpos mediante procedimientos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad mediante paso sobre una columna a la cual se une el antigeno relevante. Los anticuerpos unidos se pueden eluir a continuacion a partir de la columna utilizando un tampon con una elevada concentracion de sal.

Nanoemulsiones

Las composiciones para vacunas en nanoemulsion de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones no estan limitadas a ninguna nanoemulsion concreta. Se puede utilizar cualquier numero de composiciones para emulsion adecuadas en las composiciones de vacunas de la presente invencion, que incluyen, pero no de forma limitativa, las descritas en Hamouda y col., J. Infect Dis., 180:1939 (1999); Hamouda y Baker, J. Appl. Microbiol., 89:397 (2000); y Donovan y col., Antivir. Chem. Chemother., 11:41 (2000), asf como las que se muestran en las Tablas 1 y 2 y en las Figuras 4 y 9. Las nanoemulsiones preferidas de la presente invencion son aquellas que son eficaces en la destruccion o inactivacion de patogenos y que no son toxicas en animales. De acuerdo con ello, las formulaciones de emulsiones preferidas utilizan disolventes no toxicos, tal como etanol, y consiguen mas eficacia de destruccion a bajas concentraciones de la emulsion. En realizaciones preferidas, las nanoemulsiones utilizadas en los procedimientos de la presente invencion son estables, y no se descomponen incluso despues de largos periodos de almacenamiento (por ejemplo, uno o mas anos). Adicionalmente, las emulsiones preferidas mantienen la estabilidad incluso tras la exposicion a alta temperatura y congelacion. Esto es especialmente util si se van a aplicar en condiciones extremas (por ejemplo, en un campo de batalla). En algunas realizaciones, se utiliza una de las nanoemulsiones descritas en la Tabla 1.

En algunas realizaciones preferidas, las emulsiones comprenden (i) una fase acuosa; (ii) una fase oleosa; y al menos un compuesto adicional. Estos compuestos adicionales pueden premezclarse con cualquiera de las fases acuosas u oleosas de la composicion. Estos compuestos adicionales pueden premezclarse en una composicion de emulsion existente inmediatamente antes de su uso. Se pueden premezclar uno o mas compuestos adicionales en una composicion de emulsion existente inmediatamente antes de su uso. Se pueden premezclar uno o mas compuestos adicionales en una composicion de emulsion existente antes del uso inmediato de las composiciones.

Los compuestos adicionales adecuados para el uso en las composiciones de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones incluyen, pero no se limitan a uno o mas de, disolventes organicos, y mas especialmente, disolventes basados en fosfato organico, tensioactivos y detergentes, compuestos que contienen amonio cuaternario, compuestos que contienen halogeno cationico, potenciadores de la germinacion, potenciadores de la interaccion, y compuestos farmaceuticamente aceptables. Se presentan a continuacion determinados compuestos ilustrativos contemplados para su uso en las composiciones de la presente invencion.

Tabla 1 Formulaciones para nanoemulsion

Nombre

Formula de la fase oleosa Relacion de fases acuosa y oleosa (Vol/Vol)

X8P

1 vol. Tri(N-butil)fosfato 4:1

1 vol. TRITON X-100

8 vol. Aceite de soja

NN

86,5 g de monooleato de glicerilo 3:1

60,1 ml de Nonoxinol-9

24,2 g de GENEROL 122

3,27 g de cloruro de cetilpiridinio

554 g de aceite de soja

W808P

86,5 g de monooleato de glicerilo 3,2:1

21,2 g de Polysorbate 60

24,2 g de GENEROL 122

3,27 g de cloruro de cetilpiridinio

4 ml de aceite de menta piperita

554 g de aceite de soja

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(continuacion)

Tabla 1 Formulaciones para nanoemulsion

Nombre

Formula de la fase oleosa Relacion de fases acuosa y oleosa (Vol/Vol)

SS

86,5 g de monooleato de glicerilo 3,2:1

21,2 g de Polysorbate 60 (bismuto al 1 % en agua)

24,2 g de GENEROL 122

3,27 g de cloruro de cetilpiridinio

554 g de aceite de soja

Tabla 2 Formulaciones para nanoemulsion

Nanoemulsion

Composicion

X8P

8 % de TRITON X-100; 8 % de fosfato de tributilo; 64 % de aceite de soja; 20 % de agua

W205EC

5 % de TWEEN 20; 8 % de etanol; 1 % de Cloruro de cetilpiridinio; 64 % de aceite de soja; 22 % de agua

EC

1 % de Cloruro de cetilpiridinio; 8 % de etanol; 64 % de aceite de soja; 27 % de agua

Y3EC

3 % de TYLOXAPOL; 1 % de Cloruro de cetilpiridinio; 8 % de etanol; 64 % de aceite de soja; 24 % de agua

X4E

4 % de TRITON X-100; 8 % de etanol; 64 % de aceite de soja; 24 % de agua

Las emulsiones pueden contener (i) una fase acuosa y (ii) una fase oleosa que contiene etanol como disolvente organico y opcionalmente un potenciador de la germinacion, y (iii) TYLOXAPOL como tensioactivo (preferentemente 2-5 %, mas preferentemente 3 %). Esta formulacion es muy eficaz contra los microorganismos y tambien es no irritante y no toxica para los usuarios mairnferos (y de esta manera, se puede poner en contacto con las membranas mucosales).

Las emulsiones pueden comprender una primera emulsion emulsionada dentro de una segunda emulsion, en la que (a) la primera emulsion comprende (i) una fase acuosa; y (ii) una fase oleosa que comprende un aceite y un disolvente organico; y (iii) un tensioactivo; y (b) la segunda emulsion comprende (i) una fase acuosa; y (ii) una fase oleosa que comprende un aceite y un compuesto que contiene un ion cationico; y (iii) un tensioactivo.

La siguiente descripcion proporciona varias emulsiones ilustrativas que incluyen formulaciones para composiciones de BCTP y X8W60PC. X8P comprende una nanoemulsion de agua en aceite, en la que la fase oleosa esta constituida por aceite de soja, fosfato de tri-n-butilo, y TRITON X-100 al 80 % en agua. X8W60PC comprende una mezcla de volumenes iguales de X8P con W808P. W808P es un compuesto liposomico hecho de monoestearato de glicerilo, esteroles refinados de soja (por ejemplo, los esteroles GENEROL), TWEEN 60, aceite de soja, un CPC de ion cationico que contiene halogeno, y aceite de menta piperita. La familia GENEROL son un grupo de esteroles de soja polietoxilados (Henkel Corporation, Ambler, Pensilvania). En la Tabla 1 se proporcionan determinadas formulaciones para emulsion. Estas formulaciones particulares se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos numeros 5.700.679 (NN); 5.618.840; 5.549.901 (W808P); y 5.547.677.

La emulsion X8W60PC se fabrica preparando en primer lugar la emulsion W808P y las emulsiones X8P por separado. A continuacion, una mezcla de estas dos emulsiones se vuelve a emulsionar para producir una composicion para emulsion reciente denominada X8W60PC. Los procedimientos para producir dichas emulsiones se describen en las patentes de Estados Unidos numeros 5.103.497 y 4.895.452. Estos compuestos tienen una actividad microbiana de amplio espectro, y son capaces de inactivar las bacterias vegetativas a traves de perturbaciones en la membrana.

Las composiciones anteriormente relacionadas son meramente ilustrativas, y los expertos en la tecnica podran alterar las cantidades de los componentes. Los expertos en la tecnica entenderan que la relacion de la fase oleosa a la fase acuosa, asf como del transportador oleoso particular, tensioactivo CPC, y el tampon fosfato organico, y los componentes de cada composicion.

Aunque determinadas composiciones que comprenden X8P tienen una relacion de agua a aceite de 4:1, se entiende que X8P se puede formular para tener mas o menos de una fase acuosa. Por ejemplo, puede haber 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas partes de la fase acuosa por cada parte de la fase oleosa. Lo mismo es valido para la formulacion de W808P. De manera similar, la relacion de tri(N-butil)fofato:TRITON X-100:aceite de soja tambien puede variar.

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Aunque la Tabla 1 relaciona cantidades espedficas de monooleato de glicerilo, Polysorbate 60, GENEROL 122, cloruro de cetilpiridinio, y aceite transportador de W808P, estas son meramente ilustrativas. Puede formularse que una emulsion que tiene las propiedades de W808P tiene diferentes concentraciones de cada uno de estos componentes o a su vez diferentes componentes que cumpliran la misma funcion. Por ejemplo, la emulsion puede tener de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 g de monooleato de glicerilo en la fase oleosa inicial. La emulsion puede tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 g de Polysorbate 60 en la fase oleosa inicial. La composicion puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 g de un esterol de GENEROL, en la fase oleosa inicial.

La estructura de las nanoemulsiones puede jugar un papel en su actividad biocida asf como contribuyendo a la no toxicidad de estas emulsiones. Por ejemplo, el componente activo en X8P, TRITON-X100 muestra menos actividad biocida frente a concentraciones de virus equivalentes a 11 % de X8P. Anadiendo la fase oleosa al detergente y al disolvente se reduce en gran medida la toxicidad de estos agentes en el cultivo tisular a las mismas concentraciones. Se sugiere que la nanoemulsion potencia la interaccion de sus componentes con los patogenos, facilitando de esta forma la inactivacion del patogeno y reduciendo la toxicidad de los componentes individuales. Debe indicarse que, cuando todos los componentes del X8P se han combinado en una composicion, pero no en una estructura en nanoemulsion, la mezcla no es eficaz como antimicrobiano salvo que los componentes esten en una estructura de nanoemulsion.

Se presentan a continuacion numerosos ejemplos adicionales agrupados en clases de formulaciones con composiciones similares. Las siguientes composiciones citan varios intervalos y mezclas de componentes activos. Un experto en la tecnica apreciara que las formulaciones citadas a continuacion son ilustrativas, y que son posibles formulaciones adicionales que comprenden intervalos porcentuales similares de los componentes citados.

La formulacion puede comprender de aproximadamente 3 a 8 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente de 60 a 70 % en vol. aceite (por ejemplo, aceite de soja), aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS), y en algunas formulaciones menos de aproximadamente 1 % en vol. de NaOH 1 N. Algunas de estas formulaciones pueden comprender PBS. Se contempla que la adicion de NaOH 1 N y/o PBS. permita al usuario controlar ventajosamente el pH de las formulaciones, de forma que el pH esta comprendido entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 10,0, y mas preferiblemente para conseguir de aproximadamente 7,1 a 8,5. Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC). Otra formulacion similar comprende aproximadamente 3,5 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,5 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3.5EC). Otra formulacion adicional comprende aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,067 % en vol. de NaOH 1 N, de forma tal que el pH de la formulacion sea de aproximadamente 7,1, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,93 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC pH 7,1). Otra formulacion mas comprende aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,67 % en vol. de NaOH 1 N, de forma tal que el pH de la formulacion sea de aproximadamente 8,5, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC pH 8,5). Otra formulacion similar comprende aproximadamente 4 % de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % de CPC, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y4EC). La formulacion puede comprender aproximadamente un 8 % de TYLOXAPOL, aproximadamente un 8 % de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y8EC). Una formulacion adicional comprende aproximadamente 8 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de 1x PBS (designado en el presente documento como Y8EC PBS).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de etanol, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 27 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS) (designado en el presente documento como EC).

Algunas formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de dodecil sulfato de sodio (SDS), aproximadamente 8 % en vol. de fosfato de tributilo (TBP), y aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 20 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS) (designado en el presente documento como S8P).

La formulacion puede comprender de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TYLOXAPOL, de aproximadamente 7 a 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente de 64 a 57,6 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 23 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas

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formulaciones comprenden ademas aproximadamente 5 mM de L-alanina/inosina, y aproximadamente 10 mM de amonio, cloruro. Algunas de estas formulaciones comprenden PBS. Se contempla que la adicion de PBS en algunas de estas formulaciones permita al usuario controlar ventajosamente el pH de las formulaciones. Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 2% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 2% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de fase acuosa de DiH2O. Otra formulacion comprende aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de etanol, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, aproximadamente 5 mM de L- alanina/Inosina, y aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 57,6% en vol. de aceite de soja, y el resto de 1x PBS (designado en el presente documento como 90 % de X2Y2EC/GE).

En una realizacion preferida de la presente invencion, las formulaciones comprenden aproximadamente 5 % en vol. de Tween 80, de aproximadamente 8 % en vol. de etanol, de aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Ws05EC) como se define en el punto a) de la reivindicacion 3.

En otras realizaciones adicionales de la presente invencion, las formulaciones comprenden aproximadamente 5 % en vol. de Tween 20, de aproximadamente 8 % en vol. de etanol, de aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W205EC) como se define en el punto b) de la reivindicacion 3.

Las formulaciones pueden comprender de aproximadamente 3 a 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, soja, o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Por ejemplo, se contemplan formulaciones que comprenden aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 3 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 25 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X3E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 4 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X4E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 5 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X5E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 6% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X6E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de etanol, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de oliva, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8EO). Las formulaciones pueden comprender 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8EC).

Las formulaciones pueden comprender de aproximadamente 1 a 2% en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TYLOXAPOL, de aproximadamente 6 a 8 % en vol. de TBP, de aproximadamente 0,5 a 1,0 % en vol. de CPC, de aproximadamente 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, soja), y aproximadamente de 1 a 35 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas formulaciones pueden comprender de aproximadamente 1 a 5 % en vol. de caldo de tripticasa soja, de aproximadamente 0,5 a 1,5% en vol. de extracto de levadura, aproximadamente 5 mM de L-alanina/Inosina, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, y de aproximadamente 20-40% en vol. de formula lfquida para bebes. En algunas de las formulaciones que comprenden formulas lfquidas para bebes, la formula comprende un hidrolizado de casema (por ejemplo, Neutramigen, o Progestimil, y similares). En algunas de estas formulaciones, las formulaciones comprenden ademas de aproximadamente 0,1 a 1,0% en vol. de tiosulfato de sodio, y de aproximadamente 0,1 a 1,0% en vol. de citrato de sodio. Otras formulaciones similares que comprenden estos componentes basicos utilizan solucion salina tamponada con fosfato (PBS) como la fase acuosa. Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 2% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 2% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2Y2EC). La formulacion puede comprender aproximadamente 2% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 2 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,9 % en vol. de tiosulfato de sodio, aproximadamente 0,1 % en vol. de citrato de sodio, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2Y2PC STS1). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 1,7 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,7% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 6,8% en vol. de TBP, aproximadamente 0,85 % de CPC, aproximadamente 29,2 % de NEUTRAMIGEN, aproximadamente 54,4 % en vol.

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de aceite de soja, y aproximadamente 4,9 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 85 % de X2Y2PC/baby). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, aproximadamente 5 mM de L-alanina/Inosina, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y el restante % en vol. de 0,1x PBS (designado en el presente documento como 90 % de X2Y2 PC/GE). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 1,8 % en vol. de TRITON X100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2% en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, y aproximadamente 3 % en vol. de caldo de tripticasa soja, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 27,7 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 90 % X2Y2PC/TSB). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 1,8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8 % en vol. de TYLOxApOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, aproximadamente 1 % en vol. de extracto de levadura, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 29,7 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 90 % de X2Y2PC/YE).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3PC).

Las formulaciones pueden comprender de aproximadamente 4 a 8% en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 5 a 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 30 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 0 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas formulaciones comprenden ademas aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de benzalconio, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetilpiridinio, aproximadamente 1 % en vol. bromuro de cetildimetiletilamonio, EDTA 500 pM, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 5 mM de inosina, y aproximadamente 5 mM de L-alanina. Por ejemplo, las formulaciones comprenden aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y

aproximadamente 33% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como ATB-X1001). Las

formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 2 % en vol. de CPC, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y

aproximadamente 32 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como ATB-X002). Otras

formulaciones pueden comprender aproximadamente 4 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 4 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,5% en vol. de CPC, aproximadamente 32% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 59,5 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 50 % de X8PC). Otras formulaciones relacionadas pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,5 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19,5 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC1/2). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 2 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC2). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % de TBP, aproximadamente 1 % de cloruro de benzalconio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P BC). La formulacion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetilpiridinio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P CPB). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetildimetiletilamonio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P CTAB). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 500 pM de EDTA, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 15,8 % en vol. DiH2O (designado en el presente documento como X8PC EDTA). Las formulaciones similares adicionales pueden comprender 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 5 mM de inosina, aproximadamente 5 mM de L-alanina, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O o PBS (designado en el presente documento como X8PC GE-ix). Las formulaciones pueden comprender adicionalmente aproximadamente 5 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 5 % de TBP, aproximadamente

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1 % en vol. de CPC, aproximadamente 40 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 49 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X5P5C).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 6 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como X2Y6E).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, y aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25% en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Algunas formulaciones relacionadas pueden comprender ademas aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico. Por ejemplo, una formulacion particular comprende aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como X8G). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8GVc).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 0,5 a 0,8 % en vol. de TWEEN 60, de aproximadamente 0,5 a 2,0 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Por ejemplo, las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,70 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,3% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8W60PC1). Otra formulacion relacionada comprende aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,29% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W6007X8PC). Las formulaciones pueden comprender de aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,7 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 0,5 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 64 a 70 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,8% en vol. de DH2O (designado en el presente documento como X8W60PC2). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 2 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 17,3 % en vol. de DH2O. Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 25,29 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W6007PC).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, bien aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, o bien aproximadamente 8 % en vol. de TBP, ademas de, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 20 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como D2G). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, y aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como D2P).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de glicerilo, y aproximadamente de 1 a 10 % en vol. de CPC, aproximadamente de 50 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, las composiciones pueden comprender adicionalmente aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico. Por ejemplo, una formulacion particular comprende aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 27 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como GC). Una formulacion adicional relacionada comprende aproximadamente 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 10 % en vol. de CPC, aproximadamente 60 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como GC10). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico, aproximadamente 64 % en vol. de soja o aceite, y aproximadamente 24 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como GCVc).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de sDs, aproximadamente de 50 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30% en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, en algunas de estas formulaciones, las composiciones comprenden adicionalmente aproximadamente 1 % en vol. de lecitina, y aproximadamente 1 % en vol. de ester metflico del acido p-hidroxibenzoico. Las formulaciones ilustrativas

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pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de SDS, 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como S8G). Una formulacion relacionada comprende aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 8 % en vol. de SDS, aproximadamente 1 % en vol. de lecitina, aproximadamente 1 % en vol. de ester metflico del acido p- hidroxibenzoico, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como S8GL1B1).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 4 % en vol. de TWEEN 80, aproximadamente 4 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Wso4Y4EC).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 0,01 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,08 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 10% en vol. de etanol, aproximadamente 70% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19,91 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y.08EC.01).

Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8 % en vol. de laurilsulfato de sodio, y aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como SLS8G).

Las formulaciones espedficas anteriormente descritas son meros ejemplos para ilustrar la variedad de composiciones que pueden ser de utilidad. Se pueden utilizar muchas variaciones de la formulacion anterior, asf como nanoemulsiones adicionales. Para determinar si una emulsion candidata es adecuada para el uso, se deben analizar tres criterios. Usando los procedimientos y patrones descritos en el presente documento, las emulsiones candidatas se pueden someter a ensayo facilmente para ver si son adecuadas. En primer lugar, los ingredientes deseados se preparan usando los procedimientos descritos en el presente documento, para determinar si se puede formar una emulsion. Si no se puede formar una emulsion, el candidato se rechaza. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 4,5 % de tiosulfato de sodio, 0,5 % de citrato de sodio, 10 % de n-butanol, 64 % de aceite de soja, y 21 % de DiH2O no conforma una emulsion.

En segundo lugar, la emulsion candidata debena formar una emulsion estable. Una emulsion es estable si permanece en forma de emulsion durante un periodo de tiempo suficiente para permitir su uso previsto. Por ejemplo, para las emulsiones que se deben almacenar, enviar, etc., puede ser deseable que la composicion permanezca en emulsion de meses a anos. Las emulsiones tfpicas que son relativamente inestables, perderan su forma en el mismo dfa. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 8 % de 1-butanol, 5 % de TWEEN 10, 1 % de CPC, 64 % de aceite de soja, y 22 % de DiH2O no conforma una emulsion estable. Las siguientes emulsiones candidatas mostraron ser estables usando los procedimientos descritos en el presente documento: 0,08 % de TRITON X-100, 0,08 % de glicerilo, 0,01 % de cloruro de cetilpiridinio, 99 % de mantequilla, y 0,83 % de diH2O (designado en el presente documento como 1 % X8GC Mantequilla); 0,8 % de TRITON X-100, 0,8 % de glicerilo, 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 6,4 % de aceite de soja, 1,9 % de diH2O, y 90 % de mantequilla (designado en el presente documento como 10% X8GC Mantequilla); 2% de W205EC, 1 % de Natrosol 250L NF, y 97% de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC L GEL); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral con viscosidad 70, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite mineral 70); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral con viscosidad 350, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC Aceite mineral 350).

En tercer lugar, la emulsion candidata debera tener eficacia para su uso previsto. Por ejemplo, una emulsion antibacteriana debena destruir o desactivar patogenos hasta un nivel detectable. Tal como se usa en el presente documento, algunas emulsiones tienen eficacia contra microorganismos espedficos, pero no contra otros. Usando los procedimientos descritos en el presente documento, se puede determinar la adecuabilidad de una emulsion candidata concreta contra el microorganismo deseado. En general, esto implica exponer los microorganismos a la emulsion durante uno o mas periodos de tiempo en experimentos simultaneos con las muestras de control adecuadas (por ejemplo, un control negativo tal como agua) y determinar si, y hasta que grado, la emulsion destruye

0 desactiva el microorganismo. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 1 % de cloruro de amonio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 22 % DiH2O no mostro ser una emulsion eficaz. Las siguientes emulsiones candidatas mostraron ser eficaces usando los procedimientos descritos en el presente documento: 5 % de TWEEN 20, 5 % de cloruro de cetilpiridinio, 10 % de glicerilo, 60 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC5); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 10 % de glicerilo, 64 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC);

1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de tWeEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de oliva, y 22 % de di^O (designado en el presente documento como W205EC aceite de oliva); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de linaza, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de linaza); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de mafz, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de mafz); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de coco, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de coco); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de semillas de algodon, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de semilla de

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algodon); 8 % de dextrosa, 5 % de TWEEN 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C Dextrosa); 8 % de PEG 200, 5 % de TWEEN 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C PEG 200); 8 % de metanol, 5 % de TWEEN 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C metanol); 8 % de PEG 1000, 5 % de TWEEN 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C PEG 1000); 2% de W205EC, 2% de Natrosol 250H NF, y 96% de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 2, tambien denominado 2 % de W205EC GEL); 2 % de W205EC, 1 % de Natrosol 250H NF, y 97 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 1); 2 % de W205EC, 3 % de Natrosol 250H NF, y 95 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 3); 2 % de W205EC, 0,5 % de Natrosol 250H NF, y 97,5 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 0,5); 2 % de W205EC, 2 % de Methocel A, y 96 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Methocel A); 2 % de W205EC, 2 % de Methocel K, y 96 % de diH2O (designado en el presente documento como 2% W205EC Methocel K); 2% de Natrosol, 0,1 % de X8PC, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y diH2O (designado en el presente documento como 0,1 % de X8PC/GE+2 % Natrosol); 2 % de Natrosol, 0,8 % de TRITON X-100, 0,8 % de fosfato de tributilo, 6,4 % de aceite de soja, 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y diH2O (designado en el presente documento como 10 % de X8PC/GE+2 % Natrosol); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de manteca de cerdo, y 22 % de di^O (designado en el presente documento como W205EC de manteca de cerdo); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite mineral); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 2 % de Nerolidol, 5 % de TWEEN 20, 10 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 18,9 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC01N); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 2 % de Farnesol, 5% de TWEEN 20, 10% de etanol, 64% de aceite de soja, y 18,9% de diH2O (designado en el presente documento como W205EC01F); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 10 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 20,9 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC01); 10 % de cloruro de cetilpiridinio, 8% de fosfato de tributilo, 8% de TRITON X-100, 54% de aceite de soja, y 20% de diH2O (designado en el presente documento como X8PC10); 5% de cloruro de cetilpiridinio, 8% de TRITON X-100, 8% de fosfato de tributilo, 59 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como X8PC5); 0,02 % de cloruro de cetilpiridinio, 0,1 % de TWEEN 20, 10% de etanol, 70% de aceite de soja, y 19,88% de diH2O (designado en el presente documento como W200.1EC0 02); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de TWEEN 20, 8 % de glicerilo, 64 % de Mobil 1, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC Mobil 1); 7,2 % de TRITON X-100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro de cetilpiridinio, 57,6 % de aceite de soja, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y 25,87 % de diH2O (designado en el presente documento como 90 % de X8PC/GE); 7,2 % de TRITON X-100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro de cetilpiridinio, 57,6% de aceite de soja, 1 % de EDTA, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM,

0. 1.% de PBS, y diH2O (designado en el presente documento como 90 % de X8PC/GE EDTA); y 7,2 % de TRITON X-100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro de cetilpiridinio, 57,6 % de aceite de soja, 1 % de tiosulfato de sodio, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 % de PBS, y diH2O (designado en el presente documento como 90 % de X8PC/GE STS).

1. Fase acuosa

En algunas realizaciones, la emulsion comprende una fase acuosa como se define en la reivindicacion 2. La emulsion puede comprender aproximadamente de 5 a 50, preferentemente de 10 a 40, mas preferentemente de 15 a 30, % en vol. de fase acuosa, basado en el volumen total de la emulsion (aunque tambien se contemplan otras concentraciones). La fase acuosa puede comprender agua a un pH aproximadamente de 4 a 10, preferentemente de aproximadamente 6 a 8. El agua es preferentemente agua desionizada (a partir de ahora en el presente documento "DiH2O"). La fase acuosa puede comprender suero salino tamponado con fosfato (PBS). La fase acuosa puede es esteril y esta exenta de pirogenos.

2. Fase oleosa

En algunas realizaciones, la emulsion comprende una fase oleosa como se define en la reivindicacion 2. La fase oleosa (por ejemplo, aceite transportador) de la emulsion puede comprender 30-90, preferentemente 60-80, y mas preferentemente 60-70 % en vol. de aceite, basado en el volumen total de la emulsion (aunque concentraciones mas altas y mas bajas tambien pueden ser de utilidad en las emulsiones descritas en el presente documento).

El aceite de la vacuna en nanoemulsion de la invencion como se define en las reivindicaciones 10-11 puede ser cualquier aceite cosmetica o farmaceuticamente aceptable. El aceite puede ser volatil o no volatil, y se puede seleccionar entre aceite animal, aceite vegetal, aceite natural, aceite sintetico, aceites de hidrocarburo, aceites de silicona, derivados semisinteticos de los mismos, y sus combinaciones.

Los aceites adecuados incluyen, pero sin limitacion, aceite mineral, aceite de escualeno, aceites aromaticos, aceite de silicona, aceites esenciales, vitaminas insolubles en agua, estearato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de octilo, palmitato de cetilo, behenato de tridecilo, adipato de diisopropilo, sebacato de dietilo, antranilato de metilo, octanoato de cetilo, salicilato de octilo, miristato de isopropilo, cetoles de neopentil glicol dicarpato, Ceraphyls®,

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oleato de decilo, adipato de diisopropilo, lactatos de alquilo C12-15, lactato de cetilo, lactato de laurilo, neopentanoato de isostearilo, lactato de miristilo, estearoil estearato de isocetilo, estearoil estearato de octildocecilo, aceites de hidrocarburo, isoparafina, parafinas fluidas, isododecano, vaselina, aceite de argan, aceite de canola, aceite de chile, aceite de coco, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de linaza, aceite de semilla de uva, aceite de mostaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de nuez de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de pino, aceite de semilla de amapola, aceite de semilla de calabaza, aceite de salvado de arroz, aceite de cartamo, aceite de te, aceite de trufa, aceite vegetal, aceite de albaricoque (almendra), aceite de yoyoba (aceite de semilla de simmondsia chinensis), aceite de semilla de uva, aceite de macadamia, aceite de germen de trigo, aceite de almendra, aceite de semillas de colza, aceite de calabacm, aceite de soja, aceite de sesamo, aceite de avellano, aceite de mafz, aceite de girasol, aceite de marihuana, aceite de madera, aceite de nuez de la India, aceite de aguacate, aceite de avellana, aceite de pescado, aceite de baya, aceite de pimienta de Jamaica, aceite de enebro, aceite de semillas, aceite de semillas de almendra, aceite de semilla de ams, aceite de semilla de apio, aceite de semilla de comino, aceite de semilla de nuez moscada, aceite de hoja, aceite de hoja de albahaca, aceite de hoja de laurel, aceite de hoja de canela, aceite de hoja de salvia comun, aceite de hoja de eucalipto, aceite de hoja de limon, aceite de hoja de mirto, aceite de hoja de oregano, aceite de hoja de pachulf, aceite de hoja de piperita, aceite de aguja de pino, aceite de hoja de romero, aceite de hoja de menta verde, aceite de hoja del arbol del te, aceite de hoja de timo, aceite de hoja de gaulteria, aceite de flores, aceite de camomila, aceite de esclarea, aceite de clavo, aceite de flor de geranio, aceite de flor de hisopo, aceite de flor de jazmm, aceite de flor de lavanda, aceite de flor de manuka, aceite de flor de mejorana, aceite de flor de naranja, aceite de flor de rosa, aceite de flor de ylang-ylang, aceite de corteza, aceite de corteza de cassia, aceite de corteza de canela, aceite de sasafras, aceite de madera, aceite de madera de alcanfor, aceite de madera de cedro, aceite de madera de palisandro, aceite de madera de sandalo), aceite de madera de rizoma (jengibre), aceite de resina, aceite de olfbano, aceite de mirra, aceite de peladura, aceite de peladura de bergamota, aceite de peladura de pomelo, aceite de peladura de limon, aceite de peladura de lima, aceite de peladura de naranja, aceite de peladura de tangerina, aceite de rafz, aceite de valeriana, acido oleico, acido linoleico, alcohol oleflico, alcohol isoesteanlico, derivados semisinteticos de los mismos, y cualquier combinacion de los mismos.

El aceite puede comprender ademas un componente de silicona, tal como un componente de silicona volatil, que puede ser el unico aceite en el componente de silicona o se puede combinar con otra silicona o no silicona, aceites volatiles o no volatiles. Los componentes se silicona adecuados incluyen, pero sin limitacion, metilfenilpolisiloxano, simeticona, dimeticona, feniltrimeticona (o una version organomodificada del mismo), derivados alquilados de siliconas polimericas, cetil dimeticona, lauril trimeticona, derivados hidroxilados de siliconas polimericas, tal como dimeticonol, aceites de silicona volatil, siliconas dclicas y lineales, ciclometicona, derivados de ciclometicona, hexametil ciclotrisiloxano, octametilciclotetrasiloxano, decametilciclopentasiloxano, dimetilpolisiloxanos lineales volatiles, isohexadecano, isoeicosano, isotetracosano, poliisobuteno, isooctano, isododecano, derivados semisinteticos de los mismos, y sus combinaciones.

El aceite volatil puede ser el disolvente organico, o el aceite volatil puede estar presente ademas de un disolvente organico. Los aceites volatiles adecuados incluyen, pero no se limitan a, un terpeno, monoterpeno, sesquiterpeno, carminativo, azuleno, mentol, alcanfor, tujona, timol, nerol, linalool, limoneno, geraniol, alcohol perilflico, nerolidol, farnesol, ilangeno, bisabolol, farneseno, ascaridol, aceite de quenopodio, citronelal, citral, citronelol, chamazuleno, milenrama, guaiazuleno, camomila, derivados semisinteticos, o combinaciones de los mismos.

El aceite volatil del componente de silicona puede ser diferente del aceite de la fase oleosa.

La fase oleosa puede comprender 3-15, y preferentemente 5-10 % en vol. de un disolvente organico, basado en el volumen total de la emulsion. Se contempla que los disolventes organicos de tipo fosfato empleados en las emulsiones sirven para eliminar o perturbar los lfpidos de las membranas de los patogenos. De esta manera, cualquier disolvente que elimine los esteroles o los fosfolfpidos de las membranas microbianas puede ser de utilidad. Los disolventes organicos adecuados incluyen, pero sin limitacion, los disolventes o alcoholes basados en fosfatos organicos. Los alcoholes no toxicos (por ejemplo, etanol) se pueden usar como disolvente. La fase oleosa, y cualquier compuesto adicional proporcionado en la fase oleosa, son preferiblemente esteriles y estan exentos de pirogenos.

3. Tensioactivos y detergentes

Las emulsiones pueden comprender ademas un tensioactivo o detergente. La emulsion puede comprender de aproximadamente 3 a 15 %, y preferentemente de aproximadamente 10 % de uno o mas tensioactivos o detergentes (aunque tambien se contemplan otras concentraciones). Se contempla que los tensioactivos, cuando estan presentes en las emulsiones, ayudan a estabilizar las emulsiones. Se contemplan tensioactivos tanto no ionicos (no anionicos) como ionicos. Adicionalmente, los tensioactivos de la familia BRIJ de tensioactivos puede ser de utilidad en las composiciones reivindicadas de la presente invencion. El tensioactivo se puede proporcionar tanto en la fase acuosa como en la fase oleosa. Los tensioactivos adecuados para su uso en las emulsiones incluyen una variedad de tensioactivos anionicos y no ionicos, asf como otros compuestos emulsionantes capaces de promover la formacion de emulsiones de aceite en agua. Por lo general, los compuestos emulsionantes son relativamente hidrofilos, y las mezclas de compuestos emulsionantes se pueden utilizar para conseguir las calidades necesarias. En algunas formulaciones, los tensioactivos no ionicos tienen ventajas sobre los emulsionantes no ionicos en que

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son sustancialmente mas compatibles con un amplio intervalo de pH y frecuentemente forman emulsiones mas estables de lo que lo hacen los emulsionantes ionicos (por ejemplo, de tipo jabon).

El tensioactivo que puede ser de aplicacion en la vacuna en nanoemulsion de la invencion como se define en las reivindicaciones 10-11 puede ser un tensioactivo ionico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo no ionico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo cationico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo anionico farmaceuticamente aceptable, o un tensioactivo de ion tubrido farmaceuticamente aceptable.

Los tensioactivo ilustrativos utiles se describen en Applied Surfactants: Principles and Applications. Tharwat F. Tadros, Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 3-527-30629-3). Ademas, el tensioactivo puede ser un tensioactivo polimerico ionico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo no ionico polimerico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo cationico polimerico farmaceuticamente aceptable, un tensioactivo anionico polimerico farmaceuticamente aceptable, o un tensioactivo de ion tubrido polimerico farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de tensioactivos polimericos incluyen, pero sin limitacion, un copolfmero de injerto de una estructura principal de poli(metacrilato de metilo) con multiples (al menos dos) cadenas secundarias de poli(oxido de etileno) (POE), acido polihidroxiestearico, un condensado de formaldetudo con alquilfenol alcoxilado, un poliester modificado con polialquilenglicol con hidrofobos de acido graso, un poliester, derivados semisinteticos de los mismos, o combinaciones de los mismos.

Los agentes de superficie activa o tensioactivos, son moleculas anfipaticas compuestas por una parte hidrofoba no polar, habitualmente un hidrocarburo lineal o ramificado o una cadena de fluorocarbono que contiene 8-18 atomos de carbono, unido a una parte polar o hidrofila ionica. La porcion hidrofila puede ser no ionica, ionica o de ion tubrido. La cadena de hidrocarburo interactua debilmente con las moleculas de agua en un entorno acuoso, mientras que el grupo cabeza polar e ionico interactua con las moleculas de agua mediante interacciones de dipolo o ion dipolo. Basandose en la naturaleza del grupo hidrofilo, los tensioactivos se clasifican en tensioactivos anionicos, cationicos, de ion tubrido, no ionico y polimerico.

Los tensioactivos adecuados incluyen, pero sin limitacion, nonilfenil etoxilado que comprende de 9 a 10 unidades de etilenglicol, undecanol etoxilado que comprende de 8 unidades de etilenglicol, monolaurato de sorbitan polioxietilenado (20), monopalmitato de sorbitan polioxietilenado (20), monoestearato de sorbitan polioxietilenado (20), monooleato de sorbitan polioxietilenado (20), monolaurato de sorbitan, monopalmitato de sorbitan, monoestearato de sorbitan, monooleato de sorbitan, aceites de ricino hidrogenados etoxilados, laurilsulfato de sodio, un copolfmero dibloque de oxido de etileno y oxido de propileno, copolfmeros en bloque de oxido de etileno y oxido de propileno, y copolfmeros en bloque tetrafuncionales basados en oxido de etileno y oxido de propileno, monoesteres de glicerilo, caprato de glicerilo, caprilato de glicerilo, cocoato de glicerilo, erucato de glicerilo, hidroxiestearato de glicerilo, isoestearato de glicerilo, lanolato de glicerilo, laurato de glicerilo, linolato de glicerilo, miristato de glicerilo, oleato de glicerilo, PABA de glicerilo, palmitato de glicerilo, ricinoleato de glicerilo, estearato de glicerilo, tiglicolato de glicerilo, dilaurato de glicerilo, dioleato de glicerilo, dimiristato de glicerilo, distearato de glicerilo, sesquioleato de glicerilo, estearato lactato de glicerilo, cetil estearil ester polioxietilenado, eter de colesterol polioxietilenado, laurato o dialurato polioxietilenado, estearato o diestearato polioxietilenado, esteres grasos polioxietilenados, lauril eter polioxietilenado, ester de estearilo polioxietilenado, miristil ester polioxietilenado, un esteroide, colesterol, betasitosterol, bisabolol, esteres grasos de alcoholes grasos, miristato de isopropilo, n-butirato de alifatiisopropilo, n-hexanoato de isopropilo, n-decanoato de isopropilo, palmitato de isopropilo, miristato de octildodecilo, alcoholes alcoxilados, acidos alcoxilados, amidas alcoxiladas, derivados de azucar alcoxilados, derivados de aceites y ceras naturales, copolfmeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno, nonoxinol-14, laurato de PEG-8, cocoamida de PEG-6, sesquiestearato de metilglucosa PEG-20, lanolina PEG40, aceite de ricino PEG-40, aceite de ricino hidrogenado PEG-40, esteres grasos polioxietilenados, diesteres de glicerilo, ester de estearilo polioxietilenado, miristil ester polioxietilenado, lauril eter polioxietilenado, dilaurato de glicerilo, dimiristato de glicerilo, diestearato de glicerilo, derivados semisinteticos de los mismos, o mezclas de los mismos. Los tensioactivos adicionales adecuados incluyen, pero sin limitacion, lfpidos no ionicos, tal como laurato de glicerilo, miristato de glicerilo, dilaurato de glicerilo, dimiristato de glicerilo, derivados semisinteticos de los mismos, y mezclas de los mismos.

El tensioactivo puede ser un ester graso polioxietilenado que tiene un grupo de cabeza de polioxietileno comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 grupos, o un alcohol alcoxilado que tiene la estructura R5 --(OCH2CH2VOH, en la que R5 es un grupo alquilo ramificado o no ramificado que tiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 22 atomos de carbono e y tiene entre aproximadamente 4 y aproximadamente 100, y preferentemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100. Preferentemente, el alcohol alcoxilado es la especie en la que R5 es un grupo laurilo e y tiene un valor medio de 23. El tensioactivo puede ser un alcohol alcoxilado que es un derivado etoxilado del alcohol lanolina. Preferentemente, el derivado etoxilado del alcohol lanolina es laneth-10, que es un eter de propilenglicol del alcohol lanolina con un valor de etoxilacion promedio de 10.

Los tensioactivos no ionicos incluyen, pero sin limitacion, un tensioactivo etoxilado, un alcohol etoxilado, un alquilfenol etoxilado, un acido graso etoxilado, una monoalcanolamida etoxilada, un ester de sorbitan etoxilado, una amina grasa etoxilada, un copolfmero de oxido de etileno y oxido de propileno, bis(polietilenglicol bis[imidazoil carbonilo]), nonoxynol-9, bis(polietilenglicol bis[imidazoil carbonilo]), Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij®

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97, Brij® 58P, Cremophor® EL, Decaetilenglicol monodocecil eter, N-Decanoil-N-metilglucamina, n-decil alfa-D- glucopiranosido, Decil beta-D-maltopiranosido, n-Dodecanoil-N-metilglucamida, n-Dodecil alfa-D-maltosido, n- Dodecil beta-D-maltosido, n-Dodecil beta-D-maltosido, Heptaetilenglicol monodecil eter, Heptaetilenglicol monododecil eter, Heptaetilenglicol monotetradecil eter, n-Hexadecil beta-D-maltosido, Hexaetilenglicol monododecil eter, Hexaetilenglicol monohexadecil eter, Hexaetilenglicol monooctadecil eter, Hexaetilenglicol monotetradecil eter, Igepal CA-630, Igepal CA-630, Metil-6-O-(N-heptilcarbamoil)-alfa-D-glucopiranosido, Nonaetilenglicol monododecil eter, N-Nonanoil-N-metilglucamina, N-Nonanoil-N-metilglucamina, Octaetilenglicol monodecil eter, Octaetilenglicol monododecil eter, Octaetilenglicol monohexadecil eter, Octaetilenglicol monooctadecil eter, Octaetilenglicol monotetradecil eter, Octil-beta-D-glucopiranosido, Pentaetilenglicol monodecil eter, Pentaetilenglicol monododecil eter, Pentaetilenglicol monohexadecil eter, Pentaetilenglicol monohexil eter, Pentaetilenglicol monooctadecil eter, Pentaetilenglicol monooctil eter, Polietilenglicol diglicidil eter, Polietilenglicol eter W-1, Tridecil eter polioxietilenado 10, Estearato polioxietilenado 100, Isohexadecil eter polioxietilenado 20, Oleil eter polioxietilenado 20, Estearato polioxietilenado 40, Estearato polioxietilenado 50, Estearato polioxietilenado 8, bis(Imidazolil carbonilo) polioxietilenado, estearato de propilenglicol polioxietilenado 25, Saponina de corteza de Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol, Tipe 15-S-12, Tergitol, Tipe 15-S-30, Tergitol, Tipe 15-S-5, Tergitol, Tipe 15-S-7, Tergitol, Tipe 15-S-9, Tergitol, Tipe Np-10, Tergitol, Tipe nP-4, Tergitol, Tipe NP-40, Tergitol, Tipe NP-7, Tergitol, Tipe NP9, Tergitol, Tergitol, Tipe TMN-10, Tergitol, Tipe TMN-6, Tetradecil-beta-D-maltosido, Tetraetilenglicol monodecil eter, Tetraetilenglicol monododecil eter, Tetraetilenglicol monotetradecil eter, Trietilenglicol monodecil eter, Trietilenglicol monododecil eter, Trietilenglicol monohexadecil eter, Trietilenglicol monooctil eter, Trietilenglicol monotetradecil eter, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR- 5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X-200, Triton X-207, Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® X-165, Triton® X-305, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, TWEEN® 20, TWEEN® 21, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 61, TWEEN® 65, TWEEN® 80, TWEEN® 81, TWEEN® 85, Tyloxapol, n-Undecil beta-D-glucopiranosido, derivados semisinteticos de los mismos, o combinaciones de los mismos.

Ademas, el tensioactivo no ionico puede ser un poloxamero. Los poloxameros son polioles fabricados a partir de un bloque de polioxietileno, seguido por un bloque de polioxipropileno, seguido por un bloque de polioxietileno. El numero promedio de unidades de polioxietileno y polioxipropileno vana en funcion del numero asociado con el polfmero. Por ejemplo, el polfmero mas pequeno, poloxamero 101, consiste en un bloque con un promedio de 2 unidades de polioxietileno, un bloque con un promedio de 16 unidades de polioxipropileno, seguido por un bloque con un promedio de 2 unidades de polioxietileno. Los poloxameros van desde lfquidos y pastas incoloras hasta solidos de color blanco. En cosmeticos y productos de higiene personal, los poloxameros se utilizan en la formulacion de limpiadores de piel, productos para el bano, champus, acondicionadores de cabello, colutorios, desmaquillantes para ojos y otros productos para la piel y el cabello. Los ejemplos de poloxameros incluyen, pero sin limitacion, poloxamero 101, poloxamero 105, poloxamero 108, poloxamero 122, poloxamero 123, poloxamero 124, poloxamero 181, poloxamero 182, poloxamero 183, poloxamero 184, poloxamero 185, poloxamero 188, poloxamero 212, poloxamero 215, poloxamero 217, poloxamero 231, poloxamero 234, poloxamero 235, poloxamero 237, poloxamero 238, poloxamero 282, poloxamero 284, poloxamero 288, poloxamero 331, poloxamero 333, poloxamero 334, poloxamero 335, poloxamero 338, poloxamero 401, poloxamero 402, poloxamero 403, poloxamero 407, benzoato de poloxamero 105, dibenzoato de poloxamero 182.

Los tensioactivos cationicos adecuados incluyen, pero sin limitacion, un compuesto de amonio cuaternario, un compuesto de cloruro de alquiltrimetilamonio, un compuesto de cloruro de dialquil dimetilamonio, un compuesto que contiene halogeno, tal como cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, cloruro de bencildimetiltetradecilamonio, bromuro de bencildodecildimetilamonio, tetracloroyodato de benciltrimetilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de dodecildimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de etilhexadecildimetilamonio, reactivo T de Girard, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, N,N',N'-N-sebo-1,3- diaminopropano polioxietileno (10), bromuro de tonzonio, bromuro de trimetil(tetradecil)amonio, 1,3,5-Triazina- 1,3,5(2H,4H,6H)-trietanol, 1-Decanaminio, N-decil-N, N-dimetil-, cloruro, Didecil dimetil amonio, cloruro, 2-(2-(p- (Diisobutil)cresoxi)etoxi)etil dimetil bencil amonio, cloruro, 2-(2-(p-(Diisobutil)fenoxi)etoxi)etil dimetil bencilamonio, cloruro, cloruro de alquil 1 o 3 bencil-1 -(2-hidroxetil)-2-imidazolinio, Alquil bis(2-hidroxietil) bencil amonio, cloruro, Alquil demetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio, cloruro (100 % de C12), cloruro de alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio (50 % de C14, 40 % de C12, 10 % de C16), cloruro de alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio (55 % de C14, 23 % de C12, 20 % de C16), Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil bencil amonio, cloruro (100 % C14), Alquil dimetil bencil amonio, cloruro (100 % C16), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (41 % C14, 28 % de C12), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (47 % C12, 18 % de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (55% C16, 20% de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (58% C14, 28% de C16), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (60% C14, 25% de C12), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (61 % C11, 23% de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (61 % C12, 23 % de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (65 % C12, 25 % de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (67 % C12, 24 % de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (67 % C12, 25 % de C14), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (90 % C14, 5 % de C12), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (93% C14, 4% de C12), cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (95% C16, 5% de C18), Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, Alquil didecil dimetil amonio, cloruro, Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil bencil amonio, cloruro (C12-16), Alquil dimetil bencil amonio, cloruro (C12-18), Alquil dimetil bencil amonio,

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cloruro, dialquil dimetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil dimetilbencil amonio, cloruro, bromuro de alquil dimetil etil amonio (90 % de C14, 5 % de C16, 5 % de C12), Alquil dimetil etil amonio, bromuro (mezcla de grupos alquilo y alquenilo en los acidos grasos del aceite de soja), Alquil dimetil etilbencil amonio, cloruro, Alquil dimetil etilbencil amonio, cloruro (60% C14), Alquil dimetil isopropilbencil amonio, cloruro (50% C12, 30% de C14, 17% de C16, 3 % de C18), cloruro de alquil trimetil amonio (58 % C18, 40 % de C16, 1 % de C14, 1 % de C12), cloruro de alquil trimetil amonio (90 % C18, 10 % de C16), Alquildimetil(etilbencil) amonio, cloruro (C12-18), Di-(c8-10)-alquil dimetil amonio, cloruros, Dialquil dimetil amonio, cloruro, Dialquil metil bencil amonio, cloruro, Didecil dimetil amonio, cloruro, Diisodecil dimetil amonio, cloruro, Dioctil dimetil amonio, cloruro, Dodecil bis (2-hidroxietil) octil hidrogenoamonio, cloruro, Dodecil dimetil bencil amonio, cloruro, Dodecilcarbamoil metil dinetil bencil amonio, cloruro, cloruro de heptadecil hidroxietilimidazolinio, Hexahidro-1,3,5-tris(2-hidroxietil)-s-triazina, Hexahidro-1,3,5- tris(2-hidroxietil)-s-triazina, cloruro de miristalconio (y) Quat RNIUM 14, N,N-Dimetil-2-hidroxipropilamonio, cloruro, polfmero, n-Tetradecil dimetil bencil amonio, cloruro monohidrato, Octil decil dimetil amonio, cloruro, Octil dodecil dimetil amonio, cloruro, Octifenoxietoxietil dimetil bencil amonio, cloruro, Oxidietilenebis(alquil dimetil amonio, cloruro), compuestos de amonio cuaternario, dicoco alquildimetilo, cloruro, Trimetoxisili propil dimetil octadecil amonio, cloruro, Trimetoxisililo cuaternario, Trimetil dodecilbencil amonio, cloruro, derivados semisinteticos de los mismos, y sus combinaciones.

Los compuestos cationicos que contienen halogeno ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, haluros de cetilpiridinio, cetiltrimetilamonio, haluros, cetildimetiletilamonio, haluros, cetildimetilbencilamonio, haluros, cetiltributilfosfonio halides, dodeciltrimetilamonio, haluros, o tetradeciltrimetilamonio, haluros. En algunas realizaciones concretas, los compuestos cationicos que contienen halogeno adecuados incluyen, pero sin limitacion, cloruro de cetilpiridinio (CPC), cetiltrimetilamonio, cloruro, cetilbencildimetilamonio, cloruro, bromuro de cetilpiridinio (CPB), cetiltrimetilamonio, bromuro (CTAB), bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de cetiltributilfosfonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, y bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro. El compuesto cationico que contiene halogeno puede ser CPC.

Los tensioactivos anionicos adecuados incluyen, pero sin limitacion, un carboxilato, un sulfato, un sulfonato, un fosfato, acido chenodesoxicolico, una sal de acido chenodesoxicolico, acido colico, bilis de buey o de oveja, acido deshidrocolico, acido desoxicolico, acido desoxicolico, ester metilico del acido desoxicolico, Digitonina, Digitoxigenina, N-oxido de N,N-dimetildodecilamina, sal de docusato sodico, sal sodica del acido glicochenodesoxicolido, hidrato del acido glicocolico, sintetico, hidrato de la sal sodica del acido glicocolico, sintetico, monohidrato del acido glicodesoxicolico, sal sodica del acido glicodesoxicolico, sal sodica del acido glicodesoxicolico, sal disodica del acido 3-sulfatoglicodesoxicolico, ester etflico del acido glicolitocolico, sal sodica de N-lauroilsarcosina, solucion de N-lauroilsarcosina, solucion de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de litio, solucion de Lugol, Niaproof 4, tipo 4, sal sodica del acido 1-octanosulfonico, 1- butanosulfonato de sodio, 1-decanosulfonato de sodio, 1-decanosulfonato de sodio, 1-dodecanosulfonato de sodio, 1-heptanosulfonato de sodio anhidro, 1-heptanosulfonato de sodio anhidro, 1-nonanosulfonato de sodio, 1- propanosulfonato de sodio monohidrato, 2-bromoetanosulfonato de sodio, colato de sodio hidratado, coleato de sodio, desoxicolato de sodio, desoxicolato de sodio monohidratado, dodecil sulfato de sodio, hexanosulfonato de sodio anhidro, octilsulfato de sodio, pentanosulfonato de sodio anhidro, taurocolato de sodio, sal sodica del acido taurochenodesoxicolido, sal sodica del acido taurodesoxicolico monohidrato, hidrato de la sal sodica del acido taurodesoxicolico monohidrato, sal disodica del acido 3-sulfatotaurodesoxicolico, sal sodica del acido taurodesoxicolico, Trizma® dodecil sulfato, TWEEN® 80, acido ursodesoxicolico, derivados semisinteticos de los mismos, y sus combinaciones.

Los tensioactivos de ion hfbrido adecuados incluyen, pero sin limitacion, una N-alquil betama, lauril amino propil dimetil betama, un alquilglicinato de dimetilo, un aminopropionato de N-alquilo, CHAPS, mmimo 98 % (TLC), CHAPS, SigmaUltra, mmimo 98 % (TLC), CHAPS, para electroforesis, mmimo 98 % (TLC), CHAPSO, mmimo 98 %, CHAPSO, SigmaUltra, CHAPSO, para electroforesis, sal interna de 3-(decildimetilamonio)propanosulfonato de sodio, sal interna de 3-dodecildimetilamonio)propanosulfonato de sodio, SigmaUltra, sal interna de 3- (dodecildimetilamonio)propanosulfonato de sodio, 3-(N,N-dimetilmiristilamonio)propanosulfonato de sodio, 3-(N,N- dimetiloctadecilammonio)propanosulfonato de sodio, sal interna de 3-(N,N-dimetiloctilamonio)propanosulfonato de sodio, 3-(N,N-dimetilpalmitilamonio)propanosulfonato de sodio, derivados semisinteticos de los mismos, y sus combinaciones.

Los tensioactivos y detergentes adicionales utiles en las composiciones de la presente invencion se pueden determinar a parir de las obras de referencia (por ejemplo, que incluyen, pero sin limitacion, McCutheon's Volumen 1: Emulsions and Detergents -North American Edition, 2000) y fuentes comerciales.

4. Compuestos cationicos que contienen halogeno

Las emulsiones pueden comprender ademas un compuesto cationico que contiene halogeno. La emulsion puede comprender de aproximadamente 0,5 a 1,0% en peso o mas de un compuesto cationico que contiene halogeno, basado en el peso total de la emulsion (aunque tambien se contemplan otras concentraciones). El compuesto cationico que contiene halogeno se premezcla preferentemente con la fase oleosa; sin embargo, se debe entender que el compuesto cationico que contiene halogeno se puede proporcionar junto con la composicion en emulsion en una formulacion diferente. Los compuestos que contienen halogeno adecuados se pueden seleccionar entre

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compuestos que comprenden iones cloruro, bromuro y yoduro. Los compuestos cationicos que contienen halogeno incluyen, pero sin limitacion, haluros de cetilpiridinio, cetiltrimetilamonio, haluros, cetildimetiletilamonio, haluros, cetildimetilbencilamonio, haluros, cetiltributilfosfonio halides, dodeciltrimetilamonio, haluros, o tetradeciltrimetilamonio, haluros. En algunas realizaciones concretas, los compuestos cationicos que contienen halogeno adecuados incluyen, pero sin limitacion, cloruro de cetilpiridinio (CPC), cetiltrimetilamonio, cloruro, cetilbencildimetilamonio, cloruro, bromuro de cetilpiridinio (CPB), y cetiltrimetilamonio, bromuro (CTAB), bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de cetiltributilfosfonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, y bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro. El compuesto cationico que contiene halogeno puede ser CpC, (vease, por ejemplo, las nanoemulsiones que se han definido en la reivindicacion 2), aunque las composiciones no se limitan a la formulacion con cualquier compuesto que contenga un cation.

5. Potenciadores de la germinacion

Las nanoemulsiones pueden comprender ademas un potenciador de la germinacion. Las emulsiones pueden comprender de aproximadamente 1 mM a 15 mM, y mas preferentemente de aproximadamente 5 mM a 10 mM de uno o mas compuestos potenciadores de la germinacion (aunque tambien se consideran otras concentraciones). El compuesto potenciador de la germinacion se puede proporcionar en la fase acuosa antes de la formulacion de la emulsion. Se contempla que cuando los potenciadores de la germinacion se anaden a las composiciones en nanoemulsion, las propiedades esporicidas de la nanoemulsion se potencian. Se contempla ademas que dichos potenciadores de la germinacion inician la actividad esporicida cerca del pH neutro (entre pH 6 - 8, y preferentemente 7). Dichas emulsiones de pH neutro se pueden obtener, por ejemplo, mediante dilucion con suero salino tamponado con fosfato (PBS) o mediante preparaciones de emulsiones neutras. La actividad esporicida de la nanoemulsion se produce, preferentemente, cuando las esporas inician la germinacion.

Se ha demostrado que las emulsiones utilizadas en las vacunas tienen actividad esporicida. Se cree que el componente fusigenico de las emulsiones actua para iniciar la germinacion y antes de que la reversion a la forma vegetativa sea completa, el componente lisogenico de la emulsion actua para lisar la espora que acaba de comenzar la germinacion. Estos componentes de la emulsion actuan por tanto de forma concertada para dejar la espora susceptible a la perturbacion mediante las emulsiones. La adicion del potenciador de la germinacion facilita adicionalmente la actividad antiesporicida de las emulsiones, por ejemplo, acelerando la velocidad a la que se produce la actividad esporicida.

La germinacion de las endosporas bacterianas y las esporas fungicas se asocia con un aumento del metabolismo y una disminucion en la resistencia al calor y los reactivos qmmicos. Para que se produzca la germinacion, la espora debe detectar que el entorno es adecuado para soportar la vegetacion y la reproduccion. El aminoacido L-alanina estimula la germinacion las esporas bacterianas (vease por ejemplo, Hills, J. Gen. Micro. 4:38 (1950); y Halvorson y Church, Bacteriol Rev. 21:112 (1957)). Tambien se ha notificado que L-alanina y L-prolina inician la germinacion de esporas fungicas (Yanagita, Arch Mikrobiol 26:329 (1957)). Los a-aminoacidos simples, tales como glicina y L- alanina, ocupan una posicion central en el metabolismo. La transaminacion o desaminacion de a-aminoacidos proporciona los hidratos de carbono glicogenicos o cetogenicos y el nitrogeno necesario para el metabolismo y el crecimiento. Por ejemplo, la transaminacion o desaminacion de la L-alanina proporciona piruvato, que es el producto final del metabolismo glicolttico (ruta Embden-Meyerhof Pathway). La oxidacion del piruvato mediante el complejo piruvato deshidrogenasa proporciona acetil-CoA, NADH, H+, y CO2. Acetil-CoA es el sustrato iniciador del ciclo de los acidos tricarboxflicos (ciclo de Kreb), que a su vez es el iniciador de la cadena de transporte electronico mitocondrial. Acetil-CoA es tambien la fuente ultima de carbono en la smtesis de acidos grasos, asf como para la smtesis de esterol. Los a-aminoacidos sencillos pueden proporcionar los equivalentes de nitrogeno, CO2, glicogenico y/o cetogenico necesarios para la germinacion y la actividad metabolica posterior.

Los agentes potenciadores de la germinacion adecuados incluyen, pero sin limitacion, los a-aminoacidos que comprenden glicina y los L-enantiomeros de alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, fenilalanina, tirosina, y los esteres de alquilo de los mismos. se puede encontrar mas informacion sobre los efectos de los aminoacidos sobre la germinacion se puede encontrar en la patente de Estados Unidos N.° 5.510.104. Una mezcla de glucosa, fructosa, asparagina, cloruro de sodio (NaCl), amonio, cloruro (NH4Cl), cloruro de calcio (CaCh) y cloruro de potasio (KCl) tambien son de utilidad. La formulacion puede comprender los potenciadores de la germinacion L- alanina, CaCh, inosina y NH4CL Las composiciones pueden comprender ademas una o mas formas comunes de medios de crecimiento (por ejemplo, caldo de tripticasa soja, y similares) que adicionalmente pueden comprender por sf mismos, o no, potenciadores de la germinacion y tampones.

Las composiciones anteriores son meros potenciadores de la germinacion ilustrativos, y se entiende que otros potenciadores de la germinacion encontraran uso en las nanoemulsiones. Un potenciador de la germinacion candidato debera cumplir dos criterios para su inclusion en las composiciones de la presente invencion: debe ser capaz de asociarse con las emulsiones descritas en el presente documento y debera aumentar la velocidad de germinacion de una espora diana cuando se incorpora a las emulsiones divulgadas en el presente documento. Un experto en la tecnica puede determinar su un agente particular tiene la funcion deseada de actuar como potenciador de la germinacion aplicando dicho agente junto con las nanoemulsiones divulgadas en el presente documento a una diana y comparando la inactivacion de la diana cuando se pone en contacto con la premezcla con inactivacion de dianas similares mediante la composicion sin el agente. Cualquier agente que aumente la germinacion, y que de

esta forma disminuya o inhiba el crecimiento de los organismos, se considera un potenciador adecuado para su uso en las composiciones en nanoemulsion divulgadas en el presente documento.

La adicion de un potenciador de la germinacion (o medio de crecimiento) a una composicion en emulsion neutra puede producir una composicion que es util para inactivar esporas bacterianas ademas de los virus encapsulados, 5 bacterias Gram negativas, y bacterias Gram positivas para su uso en las composiciones de vacuna.

6. Potenciadores de la interaccion

Las nanoemulsiones comprenden uno o mas compuestos capaces de aumentar la interaccion de las composiciones (es dedr, "potenciador de la interaccion") con patogenos diana (por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram negativas tales como Vibrio, Salmonella, Shigella y Pseudomonas). El potenciador de la interaccion se premezcla 10 preferentemente con la fase oleosa; o el potenciador de la interaccion se proporcionara junto con las composiciones tras la emulsion. El potenciador de la interaccion puede ser un agente quelante (por ejemplo, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) o acido etilenbis(oxietilenonitrilo)tetraacetico (EGTA) en un tampon (por ejemplo, tampon tris)). Se entiende que los agentes quelantes son meros ejemplos de compuestos potenciadores de la interaccion. De hecho, se contemplan otros agentes que aumentan la interaccion de las nanoemulsiones utilizadas 15 con agentes microbianos y/o patogenos. El potenciador de la interaccion puede estar en una concentracion de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 |jM. Un experto en la tecnica podra determinar su un agente particular tiene la funcion deseada de actuar como potenciador de la interaccion aplicando dicho agente junto con las composiciones divulgadas en el presente documento a una diana y comparando la inactivacion de la diana cuando se pone en contacto con la premezcla con inactivacion de dianas similares mediante la composicion sin el agente. 20 Cualquier agente que aumente la interaccion de una emulsion con bacterias, y por tanto aumenta o inhibe e crecimiento de las bacterias, en comparacion con dicho parametro en su ausencia, se considera un potenciador de la interaccion.

La adicion de un potenciador de la interaccion a la nanoemulsion puede producir una composicion que es util para inactivar virus encapsulados, algunas bacterias Gram positivas y algunas bacterias Gram negativas para su uso en 25 las composiciones de vacuna.

7. Compuestos de amonio cuaternario

Las nanoemulsiones de la presente invencion pueden incluir un compuesto que contiene un amonio cuaternario. Los compuestos de amonio cuaternario ilustrativos comprenden, pero sin limitacion, Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, didecil dimetil amonio, cloruro, Alquil dimetil bencil y dialquil dimetil amonio, cloruro, N,N-Dimetil-2-hidroxi- 30 propilamonio, cloruro, polfmero, Didecil dimetil amonio, cloruro, n-Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, n-Alquil dimetil etilbencil amonio, cloruro, Dialquil dimetil amonio, cloruro, n-Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, n-Tetradecil dimetil bencil amonio, cloruro monohidrato, n-Alquil dimetil bencil amonio, cloruro, Dialquil dimetil amonio, cloruro, Hexahidro-1,3,5 -tris(2-hidroxietil)-s-triazina, cloruro de miristalconio (y) Quat RNIUM 14, Alquil bis(2-hidroxietil) bencil amonio, cloruro, Alquil demetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio, cloruro, Alquil 35 dimetil bencil amonio, cloruro, Alquil dimetil bencil dimetilbencil amonio,, Alquil dimetil dimetilbencil amonio, cloruro, Alquil dimetil etil amonio, bromuro, Alquil dimetil etil amonio, bromuro, Alquil dimetil etilbencil amonio, cloruro, Alquil dimetil isopropilbencil amonio, cloruro, Alquil trimetil amonio, cloruro, cloruro de alquil 1 o 3 bencil-1-(2-hidroxetil)-2- imidazolinio, Dialquil metil bencil amonio, cloruro, Dialquil dimetil amonio, cloruro, Didecil dimetil amonio, cloruro, 2- (2-(p-(Diisobutil)cresoxi)etoxi)etil dimetil bencil amonio, cloruro, 2-(2-(p-(Diisobutil)fenoxi)etoxi)etil dimetil bencil 40 amonio, cloruro, Dioctil dimetil amonio, cloruro, Dodecil bis (2-hidroxietil) octil hidrogenoamonio, cloruro, Dodecil dimetil bencil amonio, cloruro, Dodecilcarbamoil metil dinetil bencil amonio, cloruro, cloruro de heptadecil hidroxietilimidazolinio, Hexahidro-1,3,5-tris(2-hidroxietil)-s-triazina, Octil decil dimetil amonio, cloruro, Octil dodecil dimetil amonio, cloruro, Octifenoxietoxietil dimetil bencil amonio, cloruro, Oxidietilenebis(alquil dimetil amonio, cloruro), compuestos de amonio cuaternario, dicoco alquildimetilo, cloruro, Trimetoxisililo cuaternario, y Trimetil 45 dodecilbencil amonio, cloruro.

8. Otros compuestos

Una nanoemulsion puede comprender uno o mas componentes adicionales que proporcionan una propiedad o funcionalidad deseada a las nanoemulsiones. Estos componentes se pueden incorporar a la fase acuosa o fase oleosa de las nanoemulsiones y/o se puede anadir antes de, o despues, de la emulsion. Por ejemplo, las 50 nanoemulsiones pueden comprender ademas (fenoles, triclosano, fenilfenol), agentes acidificantes (por ejemplo, acido dtrico (por ejemplo, 1,5-6%), acido acetico, zumo de limon), agentes alquilantes (por ejemplo, hidroxido de sodio (por ejemplo, 0,3 %)), tampones (por ejemplo, tampon citrato, tampon acetato, y otros tampones utiles para mantener un pH espedfico), y halogenos (por ejemplo, polivinilpirrolidona, hipoclorito de sodio, peroxido de hidrogeno).

55 Las tecnicas ilustrativas para preparar una nanoemulsion (por ejemplo, usadas para inactivar un patogeno y/o generar una composicion inmunogena) se describen a continuacion. Adicionalmente, tambien se definen a continuacion varias recetas espedficas e ilustrativas.

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Tecnicas de formulacion

Las nanoemulsiones se pueden formar usando tecnicas clasicas de formacion de emulsion. En resumen, la fase oleosa se mezcla con la fase acuosa bajo fuerzas de cizalla relativamente elevadas (por ejemplo, usando elevadas fuerzas hidraulicas y mecanicas) para obtener una nanoemulsion de aceite en agua. La emulsion se forma combinando la fase oleosa con una fase acuosa en un intervalo de volumenes de aproximadamente 1:9 a 5:1, preferentemente, de aproximadamente 5:1 a 3:1, mas preferentemente 4:1, de fase oleosa a fase acuosa. Las fases acuosa y oleosa se pueden combinar usando cualquier equipo que pueda producir fuerzas de cizalla suficientes para formar una emulsion tales como cafeteras de embolo o mezcladores de alta cizalla (por ejemplo, mezcladores de alta cizalla autorizados por la FDA estan disponibles, por ejemplo, de Admix, Inc., Manchester, NH). Los procedimientos para producir dichas emulsiones se describen en la patente de Estados Unidos numeros 5.103.497 y 4.895.452.

Las composiciones pueden comprender goticulas de una fase oleosa discontinua dispersada en una fase acuosa continua, tales como agua. Las nanoemulsiones pueden ser estables, y no se descomponen incluso despues de un periodo de tiempo prolongado (por ejemplo, mas de uno o mas anos). Adicionalmente, las nanoemulsiones pueden ser estables (por ejemplo, durante mas de 3 meses, durante mas de 6 meses, durante mas de 12 meses, o durante mas de 18 meses) tras combinacion con un inmunogeno (por ejemplo, un patogeno). Las nanoemulsiones pueden ser no toxicas y seguras cuando se administran (por ejemplo, mediante pulverizacion o puesta en contacto con superficies mucosas, tragada, inhalada, etc.) a un sujeto.

Una parte de la emulsion puede estar en la forma de estructuras lfpidas que incluyen, pero sin limitacion, vesfculas lipfdicas unilamelares, multilamelares y pauclimelares, micelas, y fases lamelares.

Algunas emulsiones pueden utilizar una fase oleosas que contiene etanol. Por ejemplo, las emulsiones pueden contener (i) una fase acuosa y (ii) una fase oleosa que contiene etanol como disolvente organico y opcionalmente un potenciador de la germinacion, y (iii) TYOXAPOL como tensioactivo (preferentemente 2-5 %, mas preferentemente 3 %). Esta formulacion es muy eficaz para inactivar patogenos y tampoco es irritante ni toxica para los sujetos mairnferos (por ejemplo, y por tanto se puede usar para su administracion a una superficie mucosa).

Las emulsiones pueden comprender una primera emulsion emulsionada dentro de una segunda emulsion, en la que (a) la primera emulsion comprende (i) una fase acuosa; y (ii) una fase oleosa que comprende un aceite y un disolvente organico; y (iii) un tensioactivo; y (b) la segunda emulsion comprende (i) una fase acuosa; y (ii) una fase oleosa que comprende un aceite y un compuesto que contiene un ion cationico; y (iii) un tensioactivo.

Formulaciones ilustrativas

La siguiente descripcion proporciona varias emulsiones ilustrativas que incluyen formulaciones para composiciones BCTP y XsW6oPC. BCTP comprende una nanoemulsion de agua en aceite, en la que la fase oleosa esta constituida por aceite de soja, tri-n-butil fosfato, y TRITON X-100 al 80% en agua. XaWaoPC comprende una mezcla de volumenes iguales de BCTP con W808P. W808P es un compuesto liposomico hecho de monoestearato de glicerilo, esteroles refinados de soja (por ejemplo, los esteroles gEnEROL), TWEEN 60, aceite de soja, un CPC de ion cationico que contiene halogeno, y aceite de menta piperita. La familia GENEROL son un grupo de esteroles de soja polietoxilados (Henkel Corporation, Ambler, Pensilvania). Las formulaciones ilustrativas de emulsiones se proporcionan en la Tabla 1B. Estas formulaciones particulares se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos numeros 5.700.679 (NN); 5.618.840; 5.549.901 (W808P); y 5.547.677. Algunas otras formulaciones en emulsion se presentan en la solicitud de patente de Estados Unidos con numero de serie 10/669.865.

La emulsion X8W60PC se fabrica preparando en primer lugar la emulsion W808P y las emulsiones BCTP por separado. Una mezcla de estas dos emulsiones se puede volver a emulsionar para producir una emulsion fresca denominada X8W60PC. Los procedimientos para producir dichas emulsiones se describen en las patentes de Estados Unidos numeros 5.103.497 y 4.895.452.

Tabla 1B

Formula en fase oleosa Relacion de fases acuosa y oleosa (Vol/Vol)

BCTP

1 vol. Tri(N-butil)fosfato 1 vol. TRITON X-100 8 vol. Aceite de soja 4:1

NN

86,5 g de monooleato de glicerilo 60.1 ml de Nonoxynol-9 24.2 g de GENEROL 122 3,27 g de cloruro de cetilpiridinio 554 g de aceite de soja 3:1

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Formula en fase oleosa Relacion de fases acuosa y oleosa (Vol/Vol)

W808P

86,5 g de monooleato de glicerilo 21.2 g de Polysorbate 60 24.2 g de GENEROL 122 3,27 g de cloruro de cetilpiridinio 4 ml de aceite de menta piperita 554 g de aceite de soja 3,2:1

SS

86,5 g de monooleato de glicerilo 21.2 g de Polysorbate 60 24.2 g de GENEROL 122 3,27 g de cloruro de cetilpiridinio 554 g de aceite de soja 3,2:1 (1 % de bismuto en agua)

Las composiciones anteriormente relacionadas son meramente ilustrativas, y los expertos en la tecnica podran alterar las cantidades de los componentes para llegar a una composicion en nanoemulsion estable. Los expertos en la tecnica entenderan que la relacion de la fase oleosa a la fase acuosa, asf como las de los componentes particulares el transportador oleoso particular, tensioactivo CPC y tampon fosfato organico pueden variar.

Aunque determinadas composiciones que comprenden BCTP tienen una relacion de agua en aceite 4:1, se entiende que la BCTP se puede formular para tener mas o menos de una fase acuosa. Por ejemplo, puede haber 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas partes de la fase acuosa por cada parte de la fase oleosa. Lo mismo es cierto para la formulacion Wso8P. De manera similar, la relacion de tri(N-butil)fosfato:TRITON X-100:aceite de soja tambien puede variar.

Aunque la Tabla 1B relaciona cantidades espedfica de monooleato de glicerilo, Polysorbate 60, GENEROL 122, cloruro de cetilpiridinio, y aceite transportador de W808P, estas son meramente ilustrativas. Se puede formular una emulsion que tiene las propiedades de W808P que tenga diferentes concentraciones de cada uno de esos componentes o bien diferentes componentes que puedan cumplir la misma funcion. Por ejemplo, la emulsion puede tener de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 g de monooleato de glicerilo en la fase oleosa inicial. La emulsion puede tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 g de Polysorbate 60 en la fase oleosa inicial. La composicion puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 g de un esterol de GENEROL, en la fase oleosa inicial.

Los componentes individuales de las nanoemulsiones pueden funcionar tanto para inactivar un patogeno como para contribuir a la no toxicidad de las emulsiones. Por ejemplo, el componente activo de BCTP, TRITON-X100, muestra menos capacidad para inactivar un virus a concentraciones equivalentes al 11 % de BCTP. Anadiendo la fase oleosa al detergente y al disolvente se reduce en gran medida la toxicidad de estos agentes en el cultivo tisular a las mismas concentraciones. Se sugiere que la nanoemulsion potencia la interaccion de sus componentes con los patogenos, facilitando de esta forma la inactivacion del patogeno y reduciendo la toxicidad de los componentes individuales. Adicionalmente, cuando todos los componentes del BCTP se han combinado en una composicion, pero no en una estructura en nanoemulsion, la mezcla no es tan eficaz en la inactivacion de patogenos como cuando los componentes estan en una estructura de nanoemulsion.

Se presentan a continuacion numerosas composiciones adicionales. Las siguientes composiciones citan varios intervalos y mezclas de componentes activos. Un experto en la tecnica apreciara que las formulaciones citadas a continuacion son ilustrativas, y que son posibles formulaciones adicionales que comprenden intervalos porcentuales similares de los componentes citados.

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 3 a 8 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS), y en algunas formulaciones menos de aproximadamente 1 % en vol. de NaOH 1 N. Algunas de estas formulaciones comprenden PBS. Se contempla que la adicion de NaOH 1 N y/o PBS en algunas de estas formulaciones, permita al usuario controlar ventajosamente el pH de las formulaciones, de forma que el pH esta comprendido entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0, y mas preferiblemente para conseguir de aproximadamente 7,1 a 8,5. Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 3% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC). Otra formulacion similar comprende aproximadamente 3,5 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,5 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3.5EC). Otra formulacion adicional comprende aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,067 % en vol. de NaOH 1 N, de forma tal que el pH de la formulacion sea de aproximadamente 7,1, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,93 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC pH 7,1). Otra

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formulacion mas comprende aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,67 % en vol. de NaOH 1 N, de forma tal que el pH de la formulacion sea de aproximadamente 8,5, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23,33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y3EC pH 8,5). Otra formulacion similar comprende aproximadamente 4 % de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % de CPC, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y4EC). La formulacion puede comprender aproximadamente un 8 % de TYLOXAPOL, aproximadamente un 8 % de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, y aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Y8EC). Una formulacion adicional comprende aproximadamente 8 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de 1x PBS (designado en el presente documento como Y8EC PBS).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de etanol, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, y aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 27 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS) (designado en el presente documento como EC).

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 8 % en vol. de dodecil sulfato de sodio (SDS), aproximadamente 8 % en vol. de fosfato de tributilo (TBP), y aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 20 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS) (designado en el presente documento como S8P).

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TYLOXAPOL, de aproximadamente 7 a 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente de 64 a 57,6 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 23 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas formulaciones comprenden ademas aproximadamente 5 mM de L-alanina/inosina, y aproximadamente 10 mM de amonio, cloruro. Algunas de estas formulaciones comprenden PBS. Se contempla que la adicion de PBS en algunas de estas formulaciones, permite al usuario controlar ventajosamente el pH de las formulaciones. Por ejemplo, la formulacion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 2 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de fase acuosa DiH2O. La formulacion comprende aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de etanol, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, aproximadamente 5 mM de L- alanina/inosina, y aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 57,6% en vol. de aceite de soja, y el resto de 1x PBS (designado en el presente documento como 90 % de X2Y2EC/GE).

En algunas realizaciones, una nanoemulsion comprende de aproximadamente 5 % en vol. de TWEEN 80, de aproximadamente 8 % en vol. de etanol, de aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como Ws05EC) como se define en el punto a) de la reivindicacion 3.

En otras realizaciones adicionales de la presente invencion, una nanoemulsion comprende de aproximadamente 5 % en vol. de TWEEN 20, de aproximadamente 8 % en vol. de etanol, de aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W205EC) como se define en el punto b) de la reivindicacion 3.

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 2 a 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, soja, o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Por ejemplo, se contemplan formulaciones que comprenden aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2E). Se contempla una nanoemulsion que comprenden aproximadamente 3% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 25 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X3E). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 4 % en vol. Triton de X- 100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X4E). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 5 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X5E). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 6% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X6E). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8E). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de etanol,

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aproximadamente 64 % en vol. de aceite de oliva, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8EO). Una nanoemulsion puede comprender 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8EC).

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 1 a 2 % en vol. de TYLOXAPOL, de aproximadamente 6 a 8 % en vol. de TBP, de aproximadamente 0,5 a 1,0 % en vol. de CPC, de aproximadamente 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, soja), y aproximadamente de 1 a 35 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas nanoemulsiones pueden comprender de aproximadamente 1 a 5 % en vol. de caldo de tripticasa soja, de aproximadamente 0,5 a 1,5 % en vol. de extracto de levadura, aproximadamente 5 mM de L-alanina/inosina, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, y de aproximadamente 20-40 % en vol. de formula lfquida para bebes. En algunas formulaciones que comprenden formula lfquida para bebes, la formula comprende un hidrolizado de casema (por ejemplo, Neutramigen, o Progestimil, y similares). Un nanoemulsion puede comprender ademas de aproximadamente 0,1 a 1,0% en vol. de tiosulfato de sodio, y de aproximadamente 0,1 a 1,0% en vol. de citrato de sodio. Otras formulaciones similares que comprenden estos componentes basicos utilizan solucion salina tamponada con fosfato (PBS) como la fase acuosa. Por ejemplo, una formulacion comprende aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X- 100, aproximadamente 2 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 23 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2Y2EC). La formulacion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 2% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,9 % en vol. de tiosulfato de sodio, aproximadamente 0,1 % en vol. de citrato de sodio, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X2Y2PC STS1). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 1,7% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,7% en vol. de TYLOXAPOL,

aproximadamente 6,8 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,85 % de CPC, aproximadamente 29,2 % de NEUTRAMIGEN, aproximadamente 54,4 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 4,9 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 85 % de X2Y2PC/baby). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL,

aproximadamente 7,2 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, aproximadamente 5 mM de L- alanina/inosina, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y el restante % en vol. de 0,1x PBS (designado en el presente documento como 90% de X2Y2 PC/GE). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC, y aproximadamente 3 % en vol. de caldo de tripticasa soja, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 27,7 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 90 % X2Y2PC/TSB). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 1,8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 1,8% en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 7,2 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,9 % en vol. de CPC,

aproximadamente 1 % en vol. de extracto de levadura, aproximadamente 57,6 % en vol. de aceite de soja, y

aproximadamente 29,7 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como 90 % de X2Y2PC/YE).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 3 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, y aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de soja, y aproximadamente 24 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como Y3PC).

Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 4 a 8 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 5 a 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 30 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 0 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DH2O o PBS). Adicionalmente, algunas de estas formulaciones pueden comprender ademas aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de benzalconio, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetilpiridinio, aproximadamente 1 % en vol. bromuro de cetildimetiletilamonio, EDTA 500 pM, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 5 mM de inosina, y aproximadamente 5 mM de L-alanina. Por ejemplo, una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP,

aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el

presente documento como X8P). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como ATB-X1001). Las formulaciones pueden comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP,

aproximadamente 2 % en vol. de CPC, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 32 %

en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como ATB-X002). Una nanoemulsion puede comprender

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aproximadamente 4 % en vol. de TRITON X100, aproximadamente 4 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,5 % en vol. de CPC, aproximadamente 32 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 59,5 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como 50 % de X8PC). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 0,5 % en vol. de CPC, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19,5% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC1/2). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 2% en vol. de CPC, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8PC2). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % de TBP, aproximadamente 1 % de cloruro de benzalconio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P BC). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetilpiridinio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P CPB). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de bromuro de cetildimetiletilamonio, aproximadamente 50 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 33 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P CTAB). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8% en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 500 |jM de EDTA, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 15,8% en vol. DH2O (designado en el presente documento como X8PC EDTA). Una nanoemulsion puede comprender 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 10 mM de cloruro de amonio, aproximadamente 5 mM de inosina, aproximadamente 5 mM de L-alanina, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O o PBS (designado en el presente documento como X8PC GE-ix). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 5 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 5 % de TBP, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 40 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 49 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X5P5C).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 6 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como X2Y6E).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, y aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25% en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Algunas composiciones en nanoemulsion (por ejemplo, usadas para generar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, para usar como vacuna) comprenden aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico. Por ejemplo, una formulacion particular comprende aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8G). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como X8GVc).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, de aproximadamente 0,5 a 0,8 % en vol. de TWEEN 60, de aproximadamente 0,5 a 2,0 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 25 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DH2O o PBS). Por ejemplo, una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,70 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,3% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8W60PC1). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8% en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,29% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W6007X8PC). Una nanoemulsion puede comprender de aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,7 % en vol. de TWEEn 60, aproximadamente 0,5 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente de 64 a 70 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18,8% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8W60PC2). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 2 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 17,3 % en vol. de DiH2O. Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 0,71 % en vol. de TWEEN 60, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 25,29 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W6007PC).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, bien aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, o bien aproximadamente 8 % en vol. de TBP, ademas de,

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aproximadamente de 60 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 20 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Por ejemplo, una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como D2G). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 2 % en vol. de dioctil sulfosuccinato de sodio, y aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 26 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como D2P).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de glicerilo, y aproximadamente de 1 a 10 % en vol. de CPC, aproximadamente de 50 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, una nanoemulsion puede comprender ademas aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico. Por ejemplo, una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 27 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como GC). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 10 % en vol. de CPC, aproximadamente 60 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como GC10). Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 1 % en vol. de acido L-ascorbico, aproximadamente 64 % en vol. de soja o aceite, y aproximadamente 24 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como GCVc).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de glicerilo, aproximadamente de 8 a 10 % en vol. de SDS, aproximadamente de 50 a 70 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja o aceite de oliva), y aproximadamente de 15 a 30 % en vol. de fase acuosa (por ejemplo, DiH2O o PBS). Adicionalmente, una nanoemulsion puede comprender ademas aproximadamente 1 % en vol. de lecitina, y aproximadamente 1 % en vol. de ester metilico del acido p-hidroxibenzoico. Las formulaciones ilustrativas comprenden aproximadamente 8 % en vol. de SDS, 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como S8G). Una formulacion relacionada comprende aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 8 % en vol. de SDS, aproximadamente 1 % en vol. de lecitina, aproximadamente 1 % en vol. de ester metflico del acido p-hidroxibenzoico, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 18% en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como S8GL1B1).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 4 % en vol. de TWEEN 80, aproximadamente 4 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como W804Y4EC).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 0,01 % en vol. de CPC, aproximadamente 0,08 % en vol. de TYLOXAPOL, aproximadamente 10% en vol. de etanol, aproximadamente 70% en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 19,91 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como Y.08EC.01).

Una nanoemulsion puede comprender aproximadamente 8 % en vol. de laurilsulfato de sodio, y aproximadamente 8 % en vol. de glicerilo, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DH2O (designado en el presente documento como SLS8G).

Las formulaciones espedficas anteriormente descritas son meros ejemplos para ilustrar la variedad de nanoemulsiones que pueden ser de utilidad (por ejemplo, para inactivar y/o neutralizar un patogeno, y para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto (por ejemplo, para usar como vacuna)). Se contemplan muchas variaciones de las formulaciones anteriores, asf como nanoemulsiones adicionales. Las emulsiones candidatas se pueden someter a ensayo facilmente para ver si son adecuadas. En primer lugar, los ingredientes deseados se preparan usando los procedimientos descritos en el presente documento, para determinar si se puede formar una emulsion. Si no se puede formar una emulsion, el candidato se rechaza. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 4,5 % de tiosulfato de sodio, 0,5 % de citrato de sodio, 10 % de n-butanol, 64 % de aceite de soja, y 21 % de DiH2O no conforma una emulsion.

En segundo lugar, la emulsion candidata debena formar una emulsion estable. Una emulsion es estable si permanece en forma de emulsion durante un periodo de tiempo suficiente para permitir su uso previsto (por ejemplo, para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto). Por ejemplo, para las emulsiones que se deben almacenar, enviar, etc., puede ser deseable que la composicion permanezca en emulsion de meses a anos. Las emulsiones tfpicas que son relativamente inestables, perderan su forma en el mismo dfa. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 8 % de 1-butanol, 5 % de Tween 10, 1 % de CPC, 64 % de aceite de soja, y 22 % DH2O no conforma una emulsion estable. Las nanoemulsiones que demuestran ser estables incluyen, pero sin limitacion, 8 % en vol. de TRITON X-100, aproximadamente 8 % en vol. de TBP, aproximadamente 64 % en vol. de aceite de soja, y aproximadamente 20 % en vol. de DiH2O (designado en el presente documento como X8P); 5 % en vol. de TWEEn 20, de aproximadamente 8 % en vol. de etanol, de aproximadamente 1 % en vol. de CPC, aproximadamente 64 % en vol. de aceite (por ejemplo, aceite de soja), y aproximadamente 22 % en vol. de DiH2O

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(designado en el presente documento como W2o5EC); 0,08 % de Triton X-100, 0,08 % de glicerilo, 0,01 % de cloruro de cetilpiridinio, 99 % de mantequilla, y 0,83 % de diH2O (designado en el presente documento como 1 % X8GC Mantequilla); 0,8 % de Triton X-100, 0,8 % de glicerilo, 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 6,4 % de aceite de soja, 1,9 % de diH2O, y 90 % de mantequilla (designado en el presente documento como 10 % X8GC Mantequilla); 2 % de W205EC, 1 % de Natrosol 250L NF, y 97 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC L GEL); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral con viscosidad 70, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite mineral 70); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral con viscosidad 350, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC Aceite mineral 350). Preferentemente dichas nanoemulsiones son estables durante una semana, durante un mes, o durante un ano.

En tercer lugar, la emulsion candidata debera tener eficacia para su uso previsto. Por ejemplo, la nanoemulsion debena inactivar (por ejemplo, destruir o inhibir el crecimiento de) un patogeno hasta un nivel deseado (por ejemplo, una reduccion de 1 log, 2 log, 3 log, 4 log, ... de reduccion). Usando los procedimientos descritos en el presente documento, se puede determinar la adecuabilidad de una emulsion candidata concreta contra el patogeno deseado. En general, esto implica exponer el patogeno a la emulsion durante uno o mas periodos de tiempo en experimentos simultaneos con las muestras de control adecuadas (por ejemplo, un control negativo tal como agua) y determinar si, y hasta que grado, la emulsion inactiva (por ejemplo, destruye y/o neutraliza) el microorganismo. Por ejemplo, una composicion candidata realizada con un 1 % de cloruro de amonio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 22 % DiH2O no mostro ser una emulsion eficaz. Las siguientes emulsiones candidatas mostraron ser eficaces usando los procedimientos descritos en el presente documento: 5 % de Tween 20, 5 % de cloruro de cetilpiridinio, 10 % de glicerilo, 60 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC5); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 10 % de glicerilo, 64 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de oliva, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de oliva); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de linaza, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de linaza); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de mafz, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de mafz); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de coco, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de coco); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite de semillas de algodon, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite de semilla de algodon); 8 % de dextrosa, 5 % de Tween 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C Dextrosa); 8 % de PEG 200, 5 % de Tween 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de di^O (designado en el presente documento como W205C PEG 200); 8 % de metanol, 5 % de Tween 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205C metanol); 8 % de PEG 1000, 5 % de Tween 10, 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 64 % de aceite de soja, y 22 % de di^O (designado en el presente documento como W205C PEG 1000); 2 % de W205EC, 2 % de Natrosol 250H NF, y 96 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 2, tambien denominado 2 % de W205EC GEL); 2 % de W205EC, 1 % de Natrosol 250H NF, y 97 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 1); 2% de W205EC, 3% de Natrosol 250H NF, y 95% de diH2O (designado en el presente documento como 2% W205EC Natrosol 3); 2% de W205EC, 0,5% de Natrosol 250H NF, y 97,5% de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Natrosol 0,5); 2 % de W205EC, 2 % de Methocel A, y 96 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Methocel A); 2 % de W205EC, 2 % de Methocel K, y 96 % de diH2O (designado en el presente documento como 2 % W205EC Methocel K); 2 % de Natrosol, 0,1 % de X8PC, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y diH2O (designado en el presente documento como 0,1 % de X8PC/GE+2 % Natrosol); 2% de Natrosol, 0,8% de Triton X-100, 0,8% de fosfato de tributilo, 6,4 % de aceite de soja, 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y diH2O (designado en el presente documento como 10% de X8PC/GE+2 % Natrosol); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de manteca de cerdo, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC de manteca de cerdo); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de etanol, 64 % de aceite mineral, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC aceite mineral); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 2 % de Nerolidol, 5 % de Tween 20, 10 % de etanol, 64% de aceite de soja, y 18,9% de diH2O (designado en el presente documento como W205EC0,-iN); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 2 % de Farnesol, 5 % de Tween 20, 10 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 18,9 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC0,-iF); 0,1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 10 % de etanol, 64 % de aceite de soja, y 20,9 % de diH2O (designado en el presente documento como W205EC0,1); 10 % de cloruro de cetilpiridinio, 8 % de fosfato de tributilo, 8 % de Triton X-100, 54 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como X8PC10); 5% de cloruro de cetilpiridinio, 8% de Triton X-100, 8 % de fosfato de tributilo, 59 % de aceite de soja, y 20 % de diH2O (designado en el presente documento como X8PC5); 0,02 % de cloruro de cetilpiridinio, 0,1 % de Tween 20, 10 % de etanol, 70 % de aceite de soja, y 19,88 % de diH2O (designado en el presente documento como W200.1EC0,02); 1 % de cloruro de cetilpiridinio, 5 % de Tween 20, 8 % de glicerilo, 64 % de Mobil 1, y 22 % de diH2O (designado en el presente documento como W205GC Mobil 1); 7,2 % de Triton X-100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro de cetilpiridinio, 57,6 % de aceite de soja, 0,1 % de PBS, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, y 25,87% de diH2O (designado en el presente documento como 90 % de X8PC/GE); 7,2 % de Triton X-100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro

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de cetilpiridinio, 57,6 % de aceite de soja, 1 % de EDTA, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 % de PBS, y diH2O (designado en el presente documento como 90% de X8PC/GE EDTA); y 7,2% de Triton X100, 7,2 % de fosfato de tributilo, 0,9 % de cloruro de cetilpiridinio, 57,6 % de aceite de soja, 1 % de tiosulfato de sodio, L-alanina 5 mM, inosina 5 mM, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 % de PBS, y diH2O (designado en el presente documento como 90 % de X8PC/GE STS).

Preferentemente, las nanoemulsiones no son toxicas (por ejemplo, para seres humanos, plantas, o animales), no irritante (por ejemplo, para seres humanos, plantas, o animales), y no corrosivo (por ejemplo, para seres humanos, plantas, o a los animales o para el medio ambiente), mostrando al mismo tiempo potencia contra una amplia gama de microorganismos incluyendo bacterias, hongos, virus, y esporas. Aunque numerosos de los anteriores describen nanoemulsiones que satisfacen estas cualificaciones, la siguiente descripcion proporciona numerosas nanoemulsiones no toxicas, no irritantes, no corrosivas, antimicrobianas (denominadas a partir de ahora en el presente documento como "nanoemulsiones no toxicas").

Las nanoemulsiones no toxicas pueden comprender preparaciones de lfpidos tensioactivos (SLP) para su uso como agentes antimicrobianos de amplio espectro que sean eficaces contra las bacterias y sus esporas, virus encapsulados, y hongos. Estos SLP pueden comprender una mezcla de aceites, detergentes, disolventes, y compuestos cationicos que contienen halogeno ademas de varios iones que potencias sus actividades biocidas. Estos SLP se caracterizan como compuestos estables, no irritantes, y no toxicos, comparados con agentes bactericidas y esporicidas comercialmente disponibles, que son muy irritantes y/o toxicos.

Los ingredientes para su uso en las nanoemulsiones no toxicos incluyen, pero no se limitan a: detergentes (por ejemplo, TRITON X100 (5-15 %) y otros miembros de la familia TRITON, TWEEN 60 (0,5-2 %) u otros miembros de la familia TWEEN, o TYLOXApOl (1-10 %)); disolventes (por ejemplo, fosfato de tributilo (5-15 %)); alcoholes (por ejemplo, etanol (5-15 %) o glicerol (5-15 %)); aceites (por ejemplo, aceite de soja (40-70 %)); compuestos cationicos que contienen halogeno (por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio (0,5-2 %), bromuro de cetilpiridinio (0,5-2 %)), o cetildimetiletil amonio, bromuro (0,5-2 %)); amonio cuaternario, compuestos (por ejemplo, cloruro de benzalconio (0,5-2 %), cloruro de N-alquildimetilbencilamonio (0,5-2 %)); iones (cloruro de calcio (1 mM-40 mM), amonio, cloruro (1 mM-20 mM), cloruro de sodio (5 mM-200 mM), fosfato de sodio (1 mM-20 mM)); nucleosidos (por ejemplo, inosina (50 pM-20 mM)); y aminoacidos (por ejemplo, L-alanina (50 pM-20 mM)). Las emulsiones se preparan, por ejemplo, mezclando en un mezclador de alta cizalla durante 3-10 minutos. Las emulsiones pueden calentarse o no antes de mezclar a 82°C durante 1 hora.

Los compuestos de amonio cuaternario para usar incluyen, pero sin limitacion: sacarinato de N-alquildimetil bencil amonio; 1,3,5-triazina-1,3,5(2H,4H,6H)-trietanol; 1-Decanaminio, N-decil-N, N-dimetil-, cloruro (o) cloruro de didecil dimetil amonio; cloruro de 2-(2-(p-(diisobutil)cresoxi)etoxi)etil dimetil bencil amonio; cloruro de 2-(2-(p- (diisobutil)fenoxi)etoxi)etil dimetil bencil amonio; cloruro de alquil 1 o 3 bencil-1 -(2-hidroxetil)-2-imidazolinio; cloruro de alquil bis(2-hidroxietil) bencil amonio; cloruro de alquil demetil bencil amonio; cloruro de alquil dimetil 3,4- diclorobencil amonio (100 % de C12); cloruro de alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio (50 % de C14, 40 % de C12, 10 % de C16); cloruro de alquil dimetil 3,4-diclorobencil amonio (55 % de C14, 23 % de C12, 20 % de C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio; cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (100% C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (100% C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (41 % C14, 28% de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (47 % C12, 18 % de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (55 % C16, 20 % de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (58 % C14, 28 % de C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (60 % c14, 25 % de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (61 % C11, 23 % de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (61 % C12, 23 % de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (65 % C12, 25 % C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (67 % C12, 24 % C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (67 % C12, 25 % de C14); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (90% C14, 5% de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (93% C14, 4% de C12); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (95% C16, 5% de C18); cloruro de alquil dimetil bencil amonio (y) cloruro de didecil dimetil amonio; cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (como en acidos grasos); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (C12-C16); cloruro de alquil dimetil bencil amonio, (C12-C18); cloruro de alquil dimetil bencil y dialquil dimetil amonio; cloruro de alquil dimetil dimetilbencil amonio; bromuro de alquil dimetil etil amonio (90 % de C14, 5 % de C16, 5 % de C12); bromuro de alquil dimetil etil amonio (mezcla de grupos alquilo y alquenilo en los acidos grasos del aceite de soja); cloruro de alquil dimetil etilbencil amonio; cloruro de alquil dimetil etilbencil amonio (60 % C14); cloruro de alquil dimetil isopropilbencil amonio (50 % C12, 30 % de C14, 17 % de C16, 3 % de C18); cloruro de alquil trimetil amonio (58 % c18, 40 % de C16, 1 % de C14, 1 % de C12); cloruro de alquil trimetil amonio (90% C18, 10% de C16); cloruro de alquildimetil(etilbencil) amonio, (C12-18); cloruro de dialquil (C8-10) dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil dimetil amonio; cloruro de dialquil metil bencil amonio; cloruro de didecil dimetil amonio; cloruro de diisodecil dimetil amonio; cloruro de dioctil dimetil amonio, cloruro; cloruro de dodecil bis (2-hidroxietil) octil hidrogenoamonio; cloruro de dodecil dimetil bencil amonio; cloruro de dodecilcarbamoil metil dinetil bencil amonio; cloruro de heptadecil hidroxietilimidazolinio; hexahidro-1,3,5-tris(2-hidroxietil)-s-triazina; cloruro de miristalconio (y) Quaternium 14; polfmero de cloruro de N,N-dimetil-2-hidroxipropilamonio; cloruro de n-alquil dimetil bencil amonio; cloruro de n-alquil dimetil etilbencil amonio; cloruro de n-tetradecil dimetil bencil amonio monohidratado; cloruro de octil decil dimetil amonio; cloruro de octil dodecil dimetil amonio; cloruro de octifenoxietoxietil dimetil bencil amonio; oxidietilenobis(cloruro de alquil dimetil amonio); compuestos de amonio cuaternario, dicoco alquildimetilo, cloruro; cloruro de trimetoxisilil propil dimetil octadecil amonio; trimetoxisililo cuaternario, cloruro de trimetil dodecilbencil

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amonio; cloruro de n-docecil dimetil etilbencil amonio; cloruro de n-hexadecil dimetil bencil amonio; cloruro de n- tetradecil dimetil bencil amonio; cloruro de n-tetradecil dimetil etilbencil amonio; y cloruro de n-octadecil dimetil bencilamonio.

Por lo general, la nanoemulsiones no toxicas preferidas se caracterizan por lo siguiente: tienen un diametro de aproximadamente 200-800 nm de diametro, aunque se contemplan nanoemulsiones de diametro mayor y menor; la carga depende de los ingredientes; son estable durante periodos de tiempo relativamente prolongados (por ejemplo, hasta dos anos), con conservacion de la actividad biocida; son no irritantes y no toxicos en comparacion con sus componentes individuales debido, al menos en parte, a su contenido en aceite que reducen de forma importante la toxicidad de los detergentes y de los disolventes; son eficaces a concentraciones tan bajas como 0,1 %; tienen actividad antimicrobiana contra la mayona de bacterias vegetativas (incluyendo organismos Gram positivos y Gram- negativos), hongos, y virus encapsulados y no encapsulados en 15 minutos (por ejemplo, 99,99 % de destruccion); y tienen actividad esporicida en 1-4 horas (por ejemplo, 99,99 % de destruccion) cuando se producen con potenciadores de la germinacion.

D. Modelos animales

Las composiciones en nanoemulsion potenciales (por ejemplo, para generar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, para su uso como vacuna) puede someterse a ensayo en modelos animales de enfermedades infecciosas. El uso de modelos animales bien desarrollados proporciona un procedimiento para medir la eficacia y la seguridad de una vacuna antes de la administracion a sujetos humanos. Los modelos animales ilustrativos de la enfermedad se muestran en la Tabla 3. Estos animales estan comercialmente disponibles (por ejemplo, de Jackson Laboratories Charles River; Portage, MI).

Los modelos animales de Bacillus cereus (estrechamente relacionado con Bacillus anthracis) se utilizan para someter a ensayos vacunas del antrax de la presente invencion. Tanto las bacterias como los bacilos Gram positivos formadores de espora y los smdromes patogenos producidos por cada bacteria se debe, en gran medida, a la produccion y los efectos de dichas toxinas del hospedador infectado (Brown y col., J. Bact., 75:499 (1958); Burdon y Wende, J. Infect Dis., 107:224 (1960); Burdon y col., J. Infect. Dis., 117:307 (1967)). La infeccion por Bacillus cereus imita el smdrome patogeno causado por Bacillus anthracis. Se dice que los ratones sucumben rapidamente a los efectos de la toxina de B. cereus y es un modelo util de la infeccion aguda. Las cobayas desarrollan una lesion cutanea despues de una infeccion subcutanea con B. cereus que se parece a la forma cutanea del antrax.

La infeccion por Clostridium perfringens tanto en ratones como en cobayas se utilizo como sistema modelo para el ensayo in vivo de farmacos antibioticos (Stevens y col., Antimicrob. Agents Chemother., 31:312 (1987); Stevens y col., J. Infect. Dis., 155:220 (1987); Alttemeier y col., Surgery, 28:621 (1950); Sandusky y col., Surgery, 28:632 (1950)). Clostridium tetani es bien conocido por infectar y ocasionar enfermedades en una variedad de especie de mairnfero. Ratones, cobayas, y conejos se han utilizado de forma experimental (Willis, Topley y Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity. Wilson, G., A. Miles, y M.T. Parker, eds. paginas 442-475 1983).

La infeccion por Vibrio cholerae se ha iniciado con exito en ratones, cobayas, y conejos. De acuerdo con informes publicados, se prefiere alterar la flora bacteriana intestinal normal para que se establezca la infeccion en estos hospedadores experimentales. Esto se lleva a cabo mediante la administracion de antibioticos para suprimir la flora intestinal normal y, en algunos casos, suprimiendo el alimento de los animales (Butterton y col., Infect. Immun., 64:4373 (1996); Levine y col., Microbiol. Rev., 47:510 (1983); Finkelstein y col., J. Infect. Dis., 114:203 (1964); Freter, J. Exp. Med., 104:411 (1956); y Freter, J. Infect. Dis., 97:57 (1955)).

La infeccion por Shigella flexnerii se ha iniciado con exito en ratones y cobayas. como en el caso de las infecciones por vibrios, se prefiere que la flora bacteriana intestinal normal se altere para ayudar en el establecimiento de la infeccion de estos hospedadores experimentales. Esto se lleva a cabo mediante la administracion de antibioticos para suprimir la flora intestinal normal y, en algunos casos, suprimiendo el alimento de los animales (Levine y col., Microbiol. Rev., 47:510 (1983); Freter, J. Exp. Med., 104:411 (1956); Formal y col., J. Bact., 85:119 (1963); LaBrec y col., J. Bact. 88:1503 (1964); Takeuchi y col., Am. J. Pathol., 47:1011 (1965)).

Los ratones y las ratas se han utilizado ampliamente en estudios experimentales realizados con Salmonella typhimurium y Salmonella enteriditis (Naughton y col., J. Appl. Bact., 81:651 (1996); Carter y Collins, J. Exp. Med., 139:1189 (1974); Collins, Infect. Immun., 5:191 (1972); Collins y Carter, Infect. Immun., 6:451 (1972)).

Los ratones y las ratas son modelos experimentales bien establecidos para la infeccion por el virus Sendai (Jacoby y col., Exp. Gerontol., 29:89 (1994); Massion y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:361 (1993); Castleman y col., Am. J. Path., 129:277 (1987); Castleman, Am. J. Vet. Res., 44:1024 (1983); Mims y Murphy, Am. J. Path., 70:315 (1973)).

La infeccion por el virus Sindbis de ratones habitualmente se lleva a cabo mediante inoculacion intracerebral de ratones recien nacidos. Como alternativa, ratones recien destetados se inocularon por via subcutanea en la almohadilla de la pata (Johnson y col., J. Infect. Dis., 125:257 (1972); Johnson, Am. J. Path., 46:929 (1965)).

Se prefiere que los animales se alojen durante 3-5 dfas para descansar del viaje y adaptarse al nuevo entorno de alojamiento antes de su uso en los experimentos. Al principio de cada experimento, los animales de control se

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sacrificaron y el tejido se recogio para establecer los parametros iniciales. Los animales se anestesiaron mediante cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, que incluyen, pero no de forma limitativa, la inhalacion de isofluorano durante procedimientos cortos o una inyeccion de ketamina/xilazina para procedimientos mas largos).

Tabla 3

Modelos animales de enfermedades infecciosas

Microorganismo

Especia experimental animal Cepas experimentales animales Sexo Edad Via de infeccion

Francisella philomiraga

raton BALB/C M 6 W Intraperitoneal

Neisseria meningitidis

raton BALB/C F 6-10 W Intraperitoneal

ratas COBS/CD M/F 4 D Intranasal

Streptococcus pneumonia

raton BALB/C F 6 W Intranasal

ratas COBS/CD M 6-8 W Intranasal

cobayas Hartley M/F 4-5 W Intranasal

Yersinia pseudotuberculosis

raton BALB/C F 6 W Intranasal

Virus de la gripe

raton BALB/C F 6 W Intranasal

Sendai virus

raton CD-1 F 6 W Intranasal

ratas Sprague-Dawley M 6-8 W Intranasal

Sindbis

raton CD-1 M/F 1-2 D Intracerebral/SC

Vaccinia

raton BALB/C F 2-3 W Intradermica

E. Ensayos de evaluacion de vacunas (no forma parte de la invencion reivindicada)

Las vacunas en nanoemulsion candidatas se pueden evaluar usando uno de varios sistemas modelo adecuados. Por ejemplo, las respuestas inmunitarias mediadas por celulas se pueden evaluar in vitro. Ademas, se puede usar un modelo animal para evaluar la respuesta inmunitaria in vivo y la inmunidad frente a un desaffo de patogenos. Se puede utilizar cualquier modelo animal, que incluyen, pero no de forma limitativa, los descritos en la Tabla 3.

Antes de someter a ensayo una vacuna en nanoemulsion en un sistema animal, se investiga la cantidad de exposicion del patogeno a una nanoemulsion suficiente para inactivar el patogeno. Se contempla que patogenos tales como esporas bacterianas requieren periodos de tiempo mas prolongados para inactivar mediante la nanoemulsion para que quede suficientemente neutralizado para permitir la inmunizacion. El periodo de tiempo necesario para la inactivacion se puede investigar usando cualquier procedimiento adecuado, que incluyen, pero no de forma limitativa, los descritos en los ejemplos ilustrativos siguientes.

Ademas, se evaluo la estabilidad de las vacunas desarrolladas en emulsion, especialmente en funcion del tiempo y las condiciones de almacenamiento, para garantizar que las vacunas son eficaces a largo plazo. La capacidad de otros materiales estabilizantes (por ejemplo, polfmeros dendnticos) para potenciar la estabilidad y la inmunogenicidad de las vacunas se evaluo tambien.

Una vez ase ha formulado una vacuna dada de nanoemulsion/patogeno para dar como resultado la inactivacion del patogeno, se optimiza la capacidad de la vacuna para desencadenar una respuesta inmunitaria y proporcionar inmunidad. Los ejemplos no limitantes de los procedimientos para someter a ensayo la eficacia de la vacuna se han descrito en los Ejemplos 1-4 siguientes. Por ejemplo, se determinaron la programacion y la dosis de la vacuna se pueden variar y se determino la dosis mas eficaz y el calendario de administracion. El nivel de respuesta inmune se cuantifico midiendo los niveles de anticuerpo en suero. Ademas, los ensayos in vitro se utilizaron para realizar un seguimiento de la actividad de proliferacion midiendo la captacion de H3-timidina. Ademas de la proliferacion, las respuestas de las citoquinas Th1 y Th2 (por ejemplo, incluyendo pero sin limitacion, los niveles de IL-2, TNF-y, IFN- Y, IL-4, IL-6, IL-11, IL-12, etc.) se miden para evaluar cualitativamente la respuesta inmunitaria.

Finalmente, se utilizaron modelos animales para evaluar el efecto de una vacuna mucosal en nanoemulsion. Los patogenos purificados se mezclaron en emulsiones (o las emulsiones se ponen en contacto con un animal preinfectado), se administran, y se determina la respuesta inmunitaria. El nivel de proteccion se evalua despues estimulando el animal con el patogeno espedfico y evaluando posteriormente el nivel de smtomas de la enfermedad. El nivel de inmunidad se mide con el tiempo para determinar la necesidad y la separacion de las inmunizaciones de refuerzo.

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III. Composiciones terapeuticas y profilacticas

Las composiciones inmunogenas de las reivindicaciones 1-9 son para uso en el tratamiento o la prevencion de la infeccion por VSR como se reivindica en la reivindicacion 12. Adicionalmente, las composiciones inmunogenas de las reivindicaciones 1-9 pueden estar comprendidas por una vacuna, que a su vez puede formularse para administracion a una superficie mucosal como se define en las reivindicaciones 10-11. El tratamiento del cuerpo humano o animal no esta comprendido por la presente invencion.

Una composicion de la presente invencion puede inducir (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto) inmunidad sistemica y mucosal. De esta manera, la administracion de una composicion de la presente invencion a un sujeto puede ser como proteccion frente a una exposicion (por ejemplo, una exposicion mucosal) al VSR. La administracion mucosal (por ejemplo, la vacunacion) parece proporcionar proteccion frente al VSR (por ejemplo, que se inicia en una superficie mucosal). Aunque hasta ahora se ha demostrado diffcil estimular respuestas de IgA secretoras y proteccion contra patogenos que invaden las superficies mucosales (vease, por ejemplo, Mestecky y col, Mucosal Immunology. 3a ed. (Academic Press, San Diego, 2005)), las presentes composiciones parecen estimular la inmunidad mucosal (por ejemplo, una respuesta de IgA protectora) de un patogeno en un sujeto.

La composicion (por ejemplo, una composicion que comprende una NE y antfgenos de protemas inmunogenas procedentes del VSR (por ejemplo, el peptido m2, la proterna F, y/u otra protema/antigeno peptfdico o factor de virulencia) puede servir como vacuna mucosal. Este material puede producirse facilmente con nE y M2, la proterna F, y/u otra protema/peptido (por ejemplo, proterna derivada de virus, proterna derivada de vector de virus vivo, proterna recombinante, proterna desnaturalizada recombinante/antigenos, segmentos peptfdicos pequenos de proterna/antfgeno, e induce inmunidad mucosal y sistemica). La capacidad de producir esta formulacion rapidamente y administrarla mediante instilacion mucosal (por ejemplo, nasal) proporciona una vacuna que se puede usar en administraciones a gran escala (por ejemplo, a una poblacion de un pueblo, aldea, ciudad, estado o pafs).

Una composicion que comprende una NE y un inmunogeno (por ejemplo, una proterna o un derivado aislado o sintetico purificado, una variante, o uno de sus analogos; o, uno o mas serotipos de VSR inactivados por la nanoemulsion) pueden generar una respuesta inmunitaria. Cuando se administra a un sujeto, una composicion puede estimular una respuesta inmunitaria frente al inmunogeno en el sujeto. La generacion de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, resultante de la administracion de una composicion que comprende una nanoemulsion y un inmunogeno) puede proporcionar una inmunidad total o parcial al sujeto (por ejemplo, de los signos, smtomas o dolencias de una enfermedad (por ejemplo, VSR)). La proteccion y/o la inmunidad de la enfermedad (por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario de un sujeto de prevenir o atenuar (por ejemplo, suprimir) un signo, smtoma o dolencia de la enfermedad) tras la exposicion a una composicion inmunogena puede deberse a respuestas inmunes adaptativas (por ejemplo, adquiridas) (por ejemplo, respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos B y linfocitos T tras la exposicion a una NE que comprende un inmunogeno de la presente divulgacion (por ejemplo, respuestas inmunitarias que presentan una especificidad y reactividad aumentadas hacia el VSR). De esta manera, las composiciones se usan profilactica o terapeuticamente para atenuar un signo, smtoma o dolencia asociada con VSR.

Una NE que comprende un inmunogeno (por ejemplo, una proterna de VSR recombinante) puede administrarse sola. Una composicion que comprende una NE y un inmunogeno (por ejemplo, una proterna de VSR recombinante) puede comprender uno o mas agentes diferentes (por ejemplo, un transportador, adyuvante, excipiente, y similares farmaceuticamente aceptables). Se puede administrar una composicion para estimular una respuesta inmunitaria de manera que induzca una respuesta inmunitaria humoral. Se puede administrar una composicion para estimular una respuesta inmunitaria de manera que induzca una respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, linfocitos T citotoxicos), en lugar de una respuesta humoral. Una composicion que comprende una NE y un inmunogeno puede inducir una respuesta inmunitaria celular y humoral.

Ademas del VSR, se conocen en la tecnica anterior otros virus, por ejemplo, el tipo o la cepa de virus de la familia paramyxoviridae (por ejemplo, un virus Paramyxovirinae (por ejemplo, Paramyxovirus, Rubulavirus y/o Morbillivirus) Cada miembro de la familia de la familia paramyxoviridae, en solitario, o en combinacion con otro miembro de la familia, se puede usar para generar una composicion que comprende una NE y un inmunogeno (por ejemplo, utilizado para generar una respuesta inmunitaria). la cepa A2 del VSR esta disponible de la ATCC, Manassas, VA, ATCC n.° de registro VR-1540). La cepa del virus puede ser la cepa B del VsR (B WV/14617/85, ATCC n.° de registro VR-1400), la cepa 9320 del vSr (n.° de registro ATCC VR-955), la cepa 18537 del VSR (n.° de registro ATCC VR-1580), la cepa Long del VSR (n.° de registro ATCC VR-26), o la cepa Line 19 del VSR (Vease, por ejemplo, Lukacs y col., Immunopathology and Infection, 169, 977-986 (2006)). De esta manera, la cepa del virus (VSR) utilizada puede ser una cepa modificada (por ejemplo, modificada geneticamente (por ejemplo, modificada naturalmente mediante seleccion natural o modificada utilizando tecnicas geneticas recombinantes)) que muestra una mayor capacidad patogenica (por ejemplo, produce una enfermedad inducida por VSR mas grave (por ejemplo, que comprende hiperreactividad potenciada de las vfas aerea y/o produccion en exceso de moco)). Una composicion que comprende una NE y un inmunogeno puede comprender una o mas cepas del VSR y/u otro tipo de virus paramyxoviridae. Adicionalmente, una composicion que comprende una NE y un inmunogeno puede comprender una o mas cepas del VSR y, ademas, una o mas cepas de un virus no VSR inmunogeno.

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El inmunogeno puede comprender uno o mas antigenos derivados de un patogeno (VSR). Por ejemplo, el inmunogeno es una protema purificada, recombinante, sintetica, o aislada de otra forma (por ejemplo, anadida a la NE para generar una composicion inmunogena). De manera similar, la protema inmunogena puede ser un derivado, analogo o modificado de otra forma (por ejemplo, PEGilado) procedente de una protema de un patogeno.

La presente invencion no esta limitada por la formulacion concreta de una composicion que comprende un VSR inactivado con una NE como se define en las reivindicaciones. De hecho, dicha composicion puede comprender uno o mas agentes diferentes ademas del VSR inactivado con la NE. Estos agentes o cofactores incluyen, pero sin limitacion, adyuvantes, tensioactivos, aditivos, tampones, solubilizantes, quelantes, aceites, sales, agentes terapeuticos, farmacos, agentes bioactivos, antibacterianos, y agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibioticos, antivmcos, etc.). Una composicion que comprende un VSR inactivado con una NE puede comprender un agente y/o cofactor que potencie la capacidad del inmunogeno de inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, un adyuvante). La presencia de uno o mas cofactores o agentes puede reducir la cantidad de inmunogeno requerida para la induccion de una respuesta inmunitarias (por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora (por ejemplo, inmunizacion protectora)). La presencia de uno o mas cofactores o agentes se puede usar para desviar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, mediada por linfocitos T) o una respuesta inmunitaria humoral (por ejemplo, mediada por anticuerpos).

Los adyuvantes se describen en general in Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como un gel de hidroxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio. Un adyuvante puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o puede ser una suspension insoluble de tirosina acilada, o azucares acilados, polisacaridos derivatizados de forma cationica o anionica, o polifosfacenos.

Se prefiere que una composicion que comprende NE y un inmunogeno comprenda uno o mas adyuvantes que induzca una respuesta de tipo Th1 o una respuesta de tipo Th2.

Por lo general, se genera una respuesta inmunitaria hacia un antfgeno a traves de la interaccion del antfgeno con las celulas del sistema inmunitario. Las respuestas inmunitarias pueden clasificarse ampliamente en dos categonas: respuestas inmunitarias humorales y mediadas por celulas (por ejemplo, caracterizadas tradicionalmente por un anticuerpo y mecanismos efectores celulares de proteccion, respectivamente). Estas categonas de respuesta se han denominado respuestas de tipo Th1 (respuesta mediada por celula), y respuestas inmunitarias de tipo Th2 (respuesta humoral).

La estimulacion de una respuesta inmunitaria puede ser el resultado de una respuesta directa o indirecta de una celula o componente del sistema inmunitario a una intervencion (por ejemplo, la exposicion a un inmunogeno). Las respuestas inmunitarias se pueden medir de muchas maneras incluyendo la activacion, proliferacion o diferenciacion de celulas del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, celulas dendnticas, APC, macrofagos, linfocitos NK, linfocitos NKT etc.); la expresion regulada por exceso o regulada por defecto de los marcadores y las citoquinas; la estimulacion de tftulos de IgA, IgM, o IgG; esplenomegalia (incluyendo el aumento de la celularidad del bazo); hiperplasia en infiltraciones celulares mixtas en diversos organos. Se conocen en la tecnica otras respuestas, celulas, y componentes del sistema inmunitario que se pueden evaluar con respecto a la estimulacion inmunitarias.

Las composiciones de la presente invencion pueden inducir la expresion y la secrecion de citoquinas (por ejemplo, por los macrofagos, celulas dendnticas y linfocitos CD4+ T). Se puede producir la modulacion de la expresion de una citoquina concreta local o sistemicamente. Se sabe que los perfiles de las citoquinas pueden determinar las funciones reguladoras y efectoras de los linfocitos T en respuestas inmunitarias. Se pueden inducir las citoquinas de tipo Th1, y, de este modo, las composiciones inmunoestimuladoras de la presente invencion como se definen en las reivindicaciones pueden estimular una respuesta inmunitaria de tipo Th1 espedfica de antfgeno incluyendo los linfocitos T citotoxicos (por ejemplo, evitando de esta forma las respuestas inmunitarias de tipo Th2 no deseadas (por ejemplo, la generacion de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-13) implicadas en la potenciacion de la gravedad de la enfermedad (por ejemplo, la induccion de la formacion de moco por IL-13))).

Las citoquinas pueden jugar un papel en dirigir la respuesta de los linfocitos T. Los linfocitos T auxiliares (CD4+) orquestan la respuesta inmunitaria de los mamfferos a traves de la produccion de factores solubles que actuan sobre otras celulas del sistema inmunitario, incluyendo los linfocitos B y otros linfocitos T. Los linfocitos T auxiliares CD4+ expresan uno de los dos perfiles de citoquinas: Th1 o Th2. Los linfocitos T CD4+ de tipo Th1 secretan IL-2, IL-3, IFN- Y, GM-CSF y elevados niveles de TNF-a. Las celulas Th2 expresan IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF y bajos niveles de TNF-a. Las citoquinas de tipo Th1 promueven la inmunidad mediada por celulas, y la inmunidad humoral que se caracteriza por el cambio de clase de la inmunoglobulina a IgG2a en ratones y a IgG1 en seres humanos. Las respuestas de tipo Th1 pueden asociarse tambien con hipersensibilidad de tipo retardado y las enfermedades autoinmunes. Las citoquinas de tipo Th2 inducen principalmente inmunidad humoral e inducen el cambio de clase a IgG1 e IgE. Los isotipos del anticuerpo asociados con respuestas de tipo Th1 tienen generalmente capacidades neutralizantes y opsonizantes mientras que los asociados con respuestas de tipo Th2 se asocian mas con respuestas alergicas.

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Se ha demostrado que algunos factores afectan a la desviacion de una respuesta inmunitaria tanto hacia una respuesta de tipo Th1 o una respuesta de tipo Th2. Los reguladores mejor caracterizados son las citoquinas. IL-12 e IFN-y son reguladores Th1 positivos y reguladores Th2 negativos. IL-12 promueve la produccion de IFN-y, e IFN-y proporciona retroalimentacion positiva para IL-12. IL-4 e IL-10 parecen importantes para el establecimiento del perfil de citoquinas Th2 y para regular por defecto la produccion de citoquinas Thl.

De esta manera, se puede proporcionar la estimulacion de una respuesta inmune de tipo Th1 en un sujeto administrando al sujeto una composicion que comprende una NE y un inmunogeno. Adicionalmente, se puede proporcionar la estimulacion de una respuesta inmunitaria de tipo Th2 en un sujeto (por ejemplo, si se desea equilibrar una respuesta mediada por linfocitos T) administrando a un sujeto una composicion que comprende una nE y un inmunogeno. Se pueden usar adyuvantes (por ejemplo, se pueden administrar simultaneamente con una composicion) para desviar una respuesta inmunitaria hacia cualquiera de una respuesta inmunitaria de tipo Th1 o Th2. Por ejemplo, los adyuvantes que inducen respuestas debiles de tipo Th2 o Th1 incluyen, pero sin limitacion, alum, saponinas, y SB-As4. Los adyuvantes que inducen respuestas de tipo Th1 incluyen, pero no de forma limitativa MPL, MDP, ISCOMS, IL-12, IFN-y, y SB-AS2.

Se pueden usar algunos otros tipos de inmunogenos de tipo Th1 (por ejemplo, como un adyuvante). Estos incluyen, pero sin limitacion, los siguientes. Monofosforil lfpido A (por ejemplo, en particular, se puede utilizar monofosforil ifpido A 3-des-O-acilado (3D-MPL)). 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Qmmicamente, se suministra a menudo como una mezcla de monofosforil lfpido A 3-des-O-acilado con cualquiera de 4, 5, o 6 cadenas aciladas. Se puede usar difosforil lfpido A, y sus variantes 3-O-desaciladas. Cada uno de estos inmunogenos se puede purificar y prepararse mediante los procedimientos descritos en el documento GB 2122204B. Se han descrito otros lipopolisacaridos purificados y sinteticos (Veanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.005.099 y el documento EP 0 729 473; Hilgers y col., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers y col., 1987, Immunology, 60(1):141-6; y el documento EP 0 549 074). 3D-MPL se puede usar en forma de una formulacion particulada (por ejemplo, que tiene un tamano de partfcula pequena menor de 0,2 pm de diametro, descrito en el documento EP 0 689 454).

Se conocen tambien las saponinas como inmunogeno (por ejemplo, un adyuvante de tipo Th1) en una composicion. Las saponinas son adyuvantes bien conocidos (Vease, por ejemplo, Lacaille-Dubois y Wagner (1996) Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Los ejemplos de saponinas incluyen Quil A (derivada de la corteza del arbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y sus fracciones (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.057.540; Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1 -2):1 -55; y el documento EP 0 362 279). Se contemplan tambien por ser utiles las saponinas hemoltticas QS7, QS17, y QS21 (fracciones purificadas mediante HPLC de Quil A; Vease, por ejemplo, Kensil y col. (1991). J. Immunology 146,431-437, patente de Estados Unidos N.° 5.057.540; documentos WO 96/33739; WO 96/11711 A1 y EP 0 362 279 A1). Se contemplan tambien por ser utiles combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina(Vease, por ejemplo, documento WO 99/10008.

Se puede usar un oligonucleotido inmunogeno que contiene dinucleotidos CpG sin metilar ("CpG") como adyuvante. CpG es una abreviatura de los motivos dinucleotidos de citosina-guanosina presentes en el ADN. Se conoce en la tecnica CpG como un adyuvante cuando se administra por rutas sistemicas y mucosales (Veanse, por ejemplo, documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis y col., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6; y la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20050238660). Por ejemplo, la secuencia inmunoestimuladora es purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina; en el que el motivo CG no esta metilado.

La presencia de uno o mas oligonucleotidos CpG parece activar varios subgrupos inmunes incluyendo linfocitos citolfticos naturales (que producen IFN-y) y macrofagos. Se pueden formular oligonucleotidos CpG en una composicion para inducir una respuesta inmunitaria. Se puede administrar simultaneamente una solucion exenta de CpG junto con un antfgeno (por ejemplo, presente en una solucion de NE (Vease, por ejemplo, documento WO 96/02555). Se puede conjugar de forma covalente un oligonucleotido CpG con un antfgeno (Vease, por ejemplo, documento WO 98/16247), o formularse con un transportador tal como hidroxido de aluminio (Vease, por ejemplo, Brazolot-Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 1998, 95(26), 15553-8).

Adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, citoquinas (por ejemplo, interleuquinas (por ejemplo, IL-2, IFN-y, IL-4, etc.), factor estimulador de colonias de macrofagos, factor de necrosis tumoral, etc.), mutantes detoxificados de una toxina ribosilante de ADP bacteriano tal como una toxina del colera (TC), una toxina pertussis (PT), o una toxina de E. Coli termicamente labil (TL), particularmente LT-K63 (donde lisina se sustituye por el aminoacido natural en la posicion 63) LT-R72 (donde arginina se sustituye por el aminoacido natural en la posicion 72), CT-S109 (donde serina se sustituye por el aminoacido natural en la posicion 109), y PT- K9/G129 (donde lisina se sustituye por el aminoacido natural en la posicion 9 y glicina sustituida en la posicion 129) (Veanse, por ejemplo, los documentos WO93/13202 y WO92/19265), y se pueden usar otras sustancias inmunogenas (por ejemplo, que potencian la eficacia de una composicion de la presente invencion) con la composicion como se define en las reivindicaciones.

Los ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden encontrar uso incluyen poli(di(carboxilatofenoxi)fosfaceno (polfmero PCPP; Virus Research Institute, EE.UU.); derivados de lipopolisacaridos tales como monofosforil lfpido A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), dipeptido de muramilo (MDP; Ribi) y dipeptido de treonil-

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muramilo (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacarido de glucosamina relacionado con el Upido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza); y el factor de alargamiento de Leishmania (una protema de Leishmania purificada; Corixa Corporation, Seattle, Wash.).

Se pueden anadir adyuvantes a una composicion que comprende VSR inactivado con NE, o, el adyuvante puede formularse con transportadores, por ejemplo, liposomas, o sales metalicas (por ejemplo, sales de aluminio (por ejemplo, hidroxido de aluminio)) antes de combinar con o la administracion simultanea con dicha composicion.

Una composicion que comprende un VSR inactivado con NE puede comprender un unico adyuvante, o dos o mas adyuvantes (Veanse, por ejemplo, documentos WO 94/00153; documentos WO 95/17210; documentos WO 96/33739; documentos WO 98/56414; documentos WO 99/12565; documentos WO 99/11241; y el documento WO 94/00153).

Una composicion que comprende un VSR inactivado con NE puede comprender uno o mas mucoadhesivos (Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20050281843). Se contemplan por su utilidad una variedad de mucoadhesivos incluyendo, pero no de forma limitativa, derivados reticulados de poli(acido acnlico) (por ejemplo, carbopol y policarbofil), poli(alcohol vimlico), polivinilpirrolidona, polisacaridos (por ejemplo, alginato y quitosan), hidroxipropil metilcelulosa, lectinas, protemas ffmbricas, y carboximetilcelulosa. El uso de un mucoadhesivo (por ejemplo, en la composicion reivindicada) puede potenciar la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto (por ejemplo, al que se ha administrado una composicion de la presente invencion) debido a un aumento en la duracion y/o la cantidad de exposicion a un inmunogeno que un sujeto experimenta cuando se usa un mucoadhesivo en comparacion con la duracion y/o la cantidad de exposicion a un inmunogeno en ausencia de utilizar el mucoadhesivo.

Una composicion como se define en las reivindicaciones puede comprender preparaciones acuosas esteriles. Los vehfculos y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitacion, agua, solucion de Ringer, solucion salina tamponada con fosfato y solucion isotonica de cloruro de sodio. Ademas, se emplean convencionalmente aceites fijos esteriles como solvente o medio de suspension. Para este fin se puede emplear cualquier aceite mineral o no mineral fijo blando incluyendo monogliceridos o digliceridos sinteticos. Ademas, acidos grasos tales como acido oleico son de utilidad en la preparacion de sustancias inyectables. Se pueden encontrar formulaciones transportadoras adecuadas para la administracion mucosal, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o mediante otras rutas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.

Se puede usar terapeuticamente una composicion como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, para potenciar una respuesta inmunitaria) o como profilactico (por ejemplo, para la inmunizacion (por ejemplo, para prevenir signos o smtomas de la enfermedad)). Se puede administrar una composicion como se define en las reivindicaciones a un sujeto mediante numerosas rutas y procedimientos de administracion diferentes.

Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar a un sujeto (por ejemplo, mucosalmente (por ejemplo, mucosa nasal, mucosa vaginal, etc.)) mediante procedimientos multiples, que incluyen, pero no de forma limitativa: suspenderse en una solucion y aplicarse a una superficie; suspenderse en una solucion y pulverizarse sobre una superficie utilizando un aplicador de pulverizacion; mezclarse con un mucoadhesivo y aplicarse (por ejemplo, pulverizarse o frotarse) sobre una superficie (por ejemplo, superficie mucosal); colocarse sobre o impregnarse sobre un aplicador nasal y/o vaginal y aplicarse; aplicarse mediante un mecanismo de liberacion controlada; aplicarse como un liposoma; o aplicarse sobre un polfmero.

Las composiciones se pueden administrar mucosalmente (por ejemplo, usando tecnicas convencionales; Vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a edicion, 1995 (por ejemplo, para las tecnicas de administracion mucosal, incluyendo las tecnicas intranasal, pulmonar, vaginal y rectal), asf como la publicacion europea N.° 517.565 e Illum y col., J. Controlled Rel., 1994, 29:133-141 (por ejemplo, para las tecnicas de administracion intranasal)). Como alternativa, las composiciones pueden administrarse dermica o transdermicamente, utilizando tecnicas normalizadas (Vease, por ejemplo, Remington: The Science arid Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a edicion, 1995).

La vacunacion mucosal parece ser la ruta de administracion preferida ya que se ha mostrado que la administracion mucosal de antfgenos tiene una mayor eficacia para inducir respuestas inmunitarias protectoras en las superficies mucosales (por ejemplo, inmunidad mucosal), la ruta de entrada de muchos patogenos. Ademas, la vacunacion mucosal, tal como la vacunacion intranasal, puede inducir la inmunidad mucosal no solo en la mucosa nasal, sino tambien en sitios mucosales distantes tales como la mucosa genital (Vease, por ejemplo, Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265-276, 1987). Mas ventajosamente, ademas de inducir respuestas inmunitarias mucosales, la vacunacion mucosal puede inducir tambien inmunidad sistemica. La administracion no parenteral (por ejemplo, la administracion mucosal de vacunas) puede proporcionar un medio eficaz y conveniente para reforzar la inmunidad sistemica (por ejemplo, inducida por la vacunacion parenteral o mucosal (por ejemplo, en los casos donde se usan multiples refuerzos para sostener una inmunidad sistemica vigorosa)).

Se puede usar una composicion como se define en las reivindicaciones para proteger o tratar a un sujeto susceptible de, padecer, una enfermedad mediante la administracion de dicha composicion a traves de una ruta mucosal (por

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ejemplo, una ruta alimentaria oral o nasal). Las rutas mucosales alternativas incluyen rutas intravaginales e intrarrectales. Se puede usar una ruta de administracion nasal, denominada "administracion intranasal" o "vacunacion intranasal" en el presente documento. Son bien conocidos en la tecnica los procedimientos de vacunacion intranasal, incluyendo la administracion en forma de goticula o pulverizacion de la vacuna en la nasofaringe de un sujeto que se va a inmunizar. puede proporcionarse una composicion nebulizada o aerosolizada que comprende un VSR inactivado con NE. Formulaciones entericas tales como capsulas gastrorresistentes para la administracion oral, son tambien una opcion los supositorios para la administracion rectal o vaginal. Dichas composiciones farmaceuticas pueden administrarse tambien por via oral. En estas circunstancias, una composicion que comprende VSR inactivado con NE puede comprender un excipiente farmaceuticamente aceptable y/o incluye tampones alcalinos, o capsulas entericas. Las formulaciones para la administracion nasal pueden incluir aquellas con dextrano o ciclodextrano y saponina como un adyuvante.

Se pueden administrar tambien las composiciones que se definen en las reivindicaciones mediante una ruta vaginal. En esos casos, dicha composicion puede comprender excipientes y/o emulsionantes farmaceuticamente aceptables, polfmeros (por ejemplo, cArBOPOL), y otros estabilizantes conocidos de cremas vaginales y/o supositorios. Dichas composiciones pueden administrarse mediante una ruta rectal. En esos casos, dicha composicion puede comprender excipientes y/o ceras y polfmeros conocidos en la materia para formar supositorios rectales.

Puede seleccionarse la misma ruta de administracion (por ejemplo, administracion mucosal) para una vacunacion de cebado y refuerzo. Se pueden utilizar multiples rutas de administracion (por ejemplo, al mismo tiempo, o, como alternativa, secuencialmente) para estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, utilizando una composicion como se define en las reivindicaciones).

Por ejemplo, se puede administrar una composicion como se define en las reivindicaciones a una superficie mucosal de un sujeto tanto en un regimen de vacunacion de cebado o refuerzo. Como alternativa, dicha composicion puede administrarse sistemicamente en cualquier regimen de vacunacion de cebado o refuerzo. Se puede administrar una composicion como se define en las reivindicaciones a un sujeto en un regimen de vacunacion de cebado mediante la administracion mucosal y en un regimen de refuerzo mediante administracion sistemica. Se puede administrar una composicion como se define en las reivindicaciones a un sujeto en un regimen de vacunacion de cebado mediante administracion sistemica y en un regimen de refuerzo mediante administracion mucosal. Los ejemplos de rutas de administracion sistemicas incluyen, pero sin limitacion, la administracion parenteral, intramuscular, intradermica, transdermica, subcutanea, intraperitoneal o intravenosa. Se puede usar una composicion como se define en las reivindicaciones para fines profilacticos y terapeuticos.

Se pueden administrar composiciones como se define en las reivindicaciones mediante administracion pulmonar. Por ejemplo, se puede administrar una composicion a los pulmones de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) mediante inhalacion (por ejemplo, atravesando por tanto el revestimiento epitelial del pulmon al torrente sangumeo (Vease, por ejemplo, Adjei, y col. Pharmaceutical Research 1990; 7:565-569; Adjei, y col. Int. J. Pharmaceutics 1990; 63:135-144; Braquet, y col. J. Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146; Hubbard, y col. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212; Smith, y col. J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146; Oswein, y col. "Aerosolization of Proteins", 1990; Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado; Debs, y col. J. Immunol. 1988; 140:3482-3488; y la patente de Estados Unidos N.° 5.284.656 de Platz, y col). Se describe un procedimiento y una composicion para la administracion pulmonar de farmacos para efectos sistemicos en la patente de Estados Unidos N.° 5.451.569 de Wong; Vease tambien la patente de Estados Unidos N.° 6.651.655 de Licalsi y col.)).

Se contemplan ademas para el uso en la practica un amplio intervalo de dispositivos mecanicos disenados para la administracion mucosal pulmonar y/o nasal de agentes farmaceuticos incluyendo, pero no de forma limitativa, nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores en polvo, todos ellos conocidos de los expertos en la materia. Algunos ejemplos espedficos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la practica de la presente invencion son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); el nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, Colo.); el inhalador de dosis medida Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); y el inhalador para polvo Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, Mass.). Todos los mencionados dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensacion del agente terapeutico. Normalmente, cada formulacion es espedfica del tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente adecuado, ademas de los diluyentes usuales, adyuvantes, tensioactivos, transportadores y/u otros agentes utiles en el tratamiento. Asimismo, se contempla el uso de liposomas, microcapsulas o microesferas, complejos de inclusion, u otros tipos de transportadores.

De esta manera, se puede usar una composicion para proteger y/o tratar a un sujeto susceptible a, o que padece, una enfermedad mediante la administracion de dichas composiciones mediante la ruta mucosal, intramuscular, intraperitoneal, intradermica, transdermica, pulmonar, intravenosa, subcutanea u otra ruta de administracion descrita en el presente documento. Los procedimientos de administracion sistemica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringuillas y agujas, o dispositivos para la administracion balfstica de vacunas solidas (Vease, por ejemplo, documento WO 99/27961), o un dispositivo inyector de lfquido a presion sin aguja (Vease, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 4.596.556; patente de Estados Unidos N.° 5.993.412), o parches transdermicos (Veanse, por ejemplo, documentos WO 97/48440; documento WO 98/28037). La inmunogenicidad de los antfgenos se puede

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potenciar mediante la aplicacion a la piel (administracion transdermica o transcutanea, Vease, por ejemplo, los documentos WO 98/20734; WO 98/28037). De esta manera, se puede usar un dispositivo de administracion para la administracion sistemica, precargado con la composicion de vacuna.

Se contemplan una amplia variedad de sujetos para beneficiarse de la administracion de una composicion como se define en las reivindicaciones. El sujeto puede ser un ser humano. Los sujetos humanos pueden ser de cualquier edad (por ejemplo, adultos, ninos grandes, ninos pequenos, etc.) que se han expuesto o que han llegado probablemente a estar expuestos al VSR). Los sujetos humanos pueden ser sujetos con mayor probabilidad de recibir una exposicion directa al VSR o que es mas probable que muestren signos y smtomas de la enfermedad del VSR tras la exposicion al VSR (por ejemplo, sujetos inmunosuprimidos). Se puede administrar al publico general (por ejemplo, vacunado con) una composicion de la presente invencion (por ejemplo, para prevenir la incidencia o la diseminacion de la enfermedad). Por ejemplo, se utilizan composiciones como se definen en las reivindicaciones para vacunar un grupo de personas (por ejemplo, una poblacion de una region, ciudad, estado y/o pafs) para su propia salud (por ejemplo, para prevenir o tratar la enfermedad). Los sujetos pueden ser mairnferos no humanos (por ejemplo, cerdos, ganado, cabras, caballos, ovejas, u otra ganadena; o ratones, ratas, conejos u otros animales). Se pueden utilizar composiciones como se define en las reivindicaciones en escenarios de investigacion (por ejemplo, con animales de investigacion).

Se puede formular una composicion de la presente invencion como se define en las reivindicaciones para la administracion mediante cualquier ruta, tal como la ruta mucosal, oral, topica, parenteral u otra ruta descrita en el presente documento. Las composiciones pueden estar en una cualquiera o mas formas diferentes incluyendo, pero no de forma limitativa, comprimidos, capsulas, polvos, granulos, pastillas para chupar, espumas, cremas o preparaciones lfquidas.

Se pueden presentar formulaciones topicas como, por ejemplo, pomadas, cremas o lociones, espumas, y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales adecuados tales como conservantes, disolventes (por ejemplo, para ayudar a la penetracion), y emolientes en pomadas y cremas.

Las formulaciones topicas pueden incluir tambien agentes que potencian la penetracion de los principios activos a traves de la piel. Los agentes ilustrativos incluyen una combinacion binaria de N-(hidroxietil) pirrolidona y un compuesto que desordena la envoltura celular, un ester de azucar en combinacion con un sulfoxido u oxido de fosfina, y monooleato de sacarosa, decil metil sulfoxido, y un alcohol.

Otros materiales ilustrativos que aumentan la penetracion en la piel incluyen tensioactivos o agentes mojantes que incluyen, pero no de forma limitativa, monooleato de sorbitan polioxietilenado (Polisorbato 80); monooleato de sorbitan (Span 80); polfmero de fenol-p-isooctilo polioxietilenado (Triton WR-1330); trioleato de sorbitan polioxietilenado (Tween 85); sulfosuccinato de dioctil sodio; y sarcosinato de sodio (Sarcosil NL-97); y otros tensioactivos farmaceuticamente aceptables.

Las composiciones pueden comprender ademas uno o mas alcoholes, compuestos que contienen cinc, emolientes, humectantes, agentes espesantes y/o gelificantes, agentes neutralizantes, y tensioactivos. El agua usada en las formulaciones es agua preferentemente desionizada que tiene un pH neutro. Los aditivos adicionales en las formulaciones topicas incluyen, pero sin limitacion, fluidos de silicona, colorantes, fragancias, ajustadores del pH, y vitaminas.

Las formulaciones topicas pueden contener tambien transportadores compatibles, tales como bases de crema o de pomada y etanol o alcohol oleflico para lociones. Dichos transportadores pueden estar presentes de aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 98 % de la formulacion. La base de pomada puede comprender uno o mas de vaselina, aceite mineral, ceresina, alcoholes de lanolina, pantenol, glicerina, bisabolol, manteca de cacao y similares.

Las composiciones farmaceuticas pueden formularse y utilizarse como espumas. Las espumas farmaceuticas incluyen formulaciones tales como, pero no de forma limitativa, emulsiones, microemulsiones, cremas, jaleas y liposomas. Aunque basicamente similares en la naturaleza, estas formulaciones vanan en los componentes y en la consistencia del producto final.

Las composiciones de la presente invencion como se define en las reivindicaciones puede contener otros componentes adyuvantes que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmaceuticas. De esta manera, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmaceuticamente activos convencionales adicionales, compatibles, tales como, por ejemplo, antiprunticos, astringentes, anestesicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles en la formulacion ffsica de diversas formas de dosificacion de las composiciones de la presente invencion, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se anaden, preferentemente no interfieren indebidamente con las actividades biologicas de los componentes de las composiciones de la presente invencion. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para variar la presion osmotica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromaticas y similares)

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que no interactuan perjudicialmente con el VSR inactivado con NE de la formulacion. Las composiciones inmunoestimuladoras se pueden administrar en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable. Cuando se usan las sales, deben ser farmaceuticamente aceptables, pero pueden utilizarse convenientemente sales no farmaceuticamente aceptables para preparar sus sales farmaceuticamente aceptables. Dichas sales incluyen, pero sin limitacion, las preparadas a partir de los siguientes acidos: clortudrico, bromtHdrico, sulfurico, mtrico, fosforico, maleico, acetico, salidlico, p-toluenosulfonico, tartarico, cftrico, metanosulfonico, formico, malonico, succmico, naftaleno-2-sulfonico, y benceno sulfonico. Asimismo, dichas sales pueden prepararse como sales de metales alcalinos o alcalinoterreos, tales como las sales de sodio, sales de potasio o de calcio del grupo del acido carboxflico.

Los agentes tamponantes adecuados incluyen, pero sin limitacion, acido acetico y una sal (1-2 % p/v); acido cftrico y una sal (1-3 % p/v); acido borico y una sal (0,5-2,5 % p/v); y acido fosforico y una sal (0,8-2 % p/v). Los conservantes adecuados pueden incluir cloruro de benzalconio (0,003-0,03 % p/v); clorobutanol (0,3-0,9 % p/v); parabenos (0,010,25 % p/v) y timerosal (0,004-0,02 % p/v).

Se puede administrar simultaneamente una composicion que comprende VSR inactivado con NE con uno o mas antibioticos. Por ejemplo, se pueden administrar uno o mas antibioticos con, antes y/o despues de la administracion de una composicion que comprende una NE y un inmunogeno. Se pueden administrar simultaneamente una variedad de antibioticos que incluye, pero no de forma limitativa, antibioticos de p-lactama, penicilinas (tales como penicilinas naturales, aminopenicilinas, penicilinas resistentes a las penicilinasas, carboxi penicilinas, ureido penicilinas), cefalosporinas (primera generacion, segunda generacion, y cefalosporinas de tercera generacion), y otras p-lactamas (tales como imipenemo, monobactamas), inhibidores de la p-lactamasa, vancomicina, aminoglicosidos y espectinomicina, tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, lincomicina, clindamicina, rifampina, metronidazol, polimixinas, doxiciclina, quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina), sulfonamidas, trimetoprim, y quinolinas.

Existen una enorme cantidad de agentes antimicrobianos actualmente disponibles para uso en el tratamiento de las infecciones bacterianas, fungicas y vfticas. Para un tratamiento comprehensivo de las clases generales de dichos farmacos y sus mecanismos de accion, los tecnicos expertos se refieren a Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" Eds. Hardman y col., 9a Edicion, publicada McGraw Hill, capftulos 43 a 50, 1996. En general, estos agentes incluyen agentes que inhiben la smtesis de la pared celular (por ejemplo, penicilinas, cefalosporinas, cicloserina, vancomicina, bacitracina); y los agentes antifungicos de imidazol (por ejemplo, miconazol, ketoconazol y clotrimazol); los agentes que actuan directamente perturban la membrana celular del microorganismo (por ejemplo, detergentes tales como polimixina y colistimetato y la nistatina y anfotericina B antifungicas); los agentes que afectan las subunidades ribosomicas inhiben la smtesis de protemas (por ejemplo, cloranfenicol, las tetraciclinas, eritromicina y clindamicina); agentes que alteran la smtesis de protemas y conducen a la muerte celular (por ejemplo, aminoglicosidos); agentes que afectan al metabolismo del acido nucleico (por ejemplo, las rifamicinas y las quinolonas); los antimetabolitos (por ejemplo, trimetoprim y sulfonamidas); y los analogos de acidos nucleicos tales como zidovudina, gangciclovir, vidarabina, y aciclovir que actua para inhibir las enzimas vmcas esenciales para la smtesis del ADN. Se pueden emplear varias combinaciones de agentes antimicrobianos.

La administracion simultanea de una composicion como se define en las reivindicaciones con uno o mas principios activos adicionales y/o agentes inmunoestimuladores (por ejemplo, una composicion que comprende una NE y un inmunogeno diferente, un antibiotico, antioxidante, etc.) tambien parece ser una opcion. Pueden potenciarse los procedimientos inmunoestimuladores de la tecnica anterior (por ejemplo, los procedimientos de inmunizacion) y/o las composiciones farmaceuticas mediante la administracion simultanea de una composicion de la presente invencion. En los procedimientos de administracion simultanea, los agentes se pueden administrar simultanea o secuencialmente. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse antes de los otro(s) principio(s) activo(s). Las formulaciones farmaceuticas y los modos de administracion pueden ser cualquiera de los descritos en el presente documento. Ademas, los dos o mas agentes administrados simultaneamente pueden administrarse cada uno utilizando diferentes modos (por ejemplo, rutas) o diferentes formulaciones. Los agentes adicionales que se van a administrar simultaneamente (por ejemplo, antibioticos, adyuvantes, etc.) pueden ser cualquiera de los agentes bien conocidos en la materia, que incluyen, pero no de forma limitativa, aquellos que estan actualmente en uso clmico.

Se puede administrar una composicion como se define en las reivindicaciones a un sujeto mediante mas de una ruta. Por ejemplo, un sujeto que se beneficiana de tener una respuesta inmunitaria protectora (por ejemplo, inmunidad) hacia un microorganismo patogeno puede beneficiarse de recibir la administracion mucosal (por ejemplo, la administracion nasal u otras rutas mucosales descritas en el presente documento) y, adicionalmente, recibir una o mas rutas de administracion diferentes (por ejemplo, administracion parenteral o pulmonar (por ejemplo, mediante un nebulizador, inhalador, u otros procedimientos descritos en el presente documento). La administracion mediante la ruta mucosal puede ser suficiente para inducir la inmunidad mucosal, asf como la sistemica hacia un inmunogeno u organismo a partir del cual se deriva el inmunogeno. La administracion mediante multiples rutas puede servir para proporcionar la inmunidad mucosal y sistemica. Se contempla que un sujeto al que se ha administrado una composicion mediante multiples rutas de administracion (por ejemplo, inmunizacion (por ejemplo, mucosal, asf como administracion a traves de las vfas aereas o parenteral) puede tener una respuesta inmunitaria mas fuerte a un

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inmunogeno que un sujeto al que se ha administrado una composicion mediante solamente una ruta.

Otros sistemas de administracion pueden incluir los sistemas de liberacion temporalizada, liberacion retardada o liberacion continua. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de las composiciones, aumentando la conveniencia al sujeto y al medico. Estan disponibles muchos tipos de sistemas de administracion de la liberacion y son conocidos por las personas normalmente expertas en la tecnica. Incluyen sistemas basados en polfmeros tales como poli(lactido-glicolido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoesteres, acido polihidroxibutmco, y polianhndridos. Se describen las microcapsulas de los anteriores polfmeros que contienen farmacos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.075.109. Los sistemas de administracion incluyen sistemas no polimericos que son: lfpidos que incluyen esteroles tales como colesterol, esteres de colesterol y acidos grasos o grasas neutras tales como monogliceridos, digliceridos y triglicerido; sistemas de liberacion de hidrogeles; sistemas silasticos; sistemas basados en peptidos; revestimientos cereos; comprimidos fabricados por compresion utilizando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos espedficos incluyen, pero no de forma limitativa: (a) sistemas erosionables en los que esta contenido un agente de la invencion en una forma comprendida en una matriz tal como la descrita en las patentes de Estados Unidos numeros 4.452.775, 4.675.189, y 5.736.152, y (b) sistemas difusionales en los que un componente activo permea a una velocidad controlada desde un polfmero tal como se describe en las patentes de Estados Unidos numeros 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Ademas, se pueden utilizar sistemas de administracion mediante bomba, algunos de los cuales se estan adaptados para su implante.

Una composicion que comprende el VSR inactivado con NE puede comprender una cantidad adecuada de dicho inmunogeno para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto cuando se administra al sujeto. La respuesta inmunitaria puede ser suficiente para proporcionar la proteccion del sujeto (por ejemplo, proteccion inmunitaria) frente a una posterior exposicion al inmunogeno o al microorganismo (VSR) a partir del cual se deriva el inmunogeno. Se puede seleccionar la cantidad de inmunogeno como la cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios graves significativos. La cantidad variara dependiendo de que inmunogeno espedfico o combinacion del mismo se emplea, y puede variar de sujeto a sujeto, dependiendo de numerosos factores que incluyen, pero no de forma limitativa, la especie, edad y dolencia general (por ejemplo, salud) del sujeto, y del modo de administracion. Se conocen bien en la tecnica los procedimientos para determinar la cantidad adecuada de inmunogeno administrada a un sujeto para estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora (por ejemplo, inmunidad protectora)) en un sujeto.

Se espera que cada dosis comprenda 0,05-5000 |jg de cada inmunogeno (por ejemplo, protema recombinante y/o purificada), por ejemplo, cada dosis comprendera 1-500 jg, 350-750 jg, 50-200 jg, o 25-75 jg de inmunogeno. Cada dosis puede comprender una cantidad suficiente del inmunogeno para generar una respuesta inmunitaria. Una cantidad eficaz del inmunogeno en una dosis necesaria no necesita cuantificarse, siempre que la cantidad de inmunogeno genere una respuesta inmunitaria en un sujeto cuando se administra al sujeto. Un experto en la tecnica puede discernir una cantidad opcional para una administracion concreta (por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora (por ejemplo, inmunidad protectora))) utilizando estudios normalizados que implican la observacion de tttulos de anticuerpo y otras respuestas en sujetos.

Se espera que cada dosis sea de 0,001 a 15 % o mas (por ejemplo, 0,001-10 %, 0,5-5 %, 1-3 %, 2 %, 6 %, 10 %, 15 % o mas) en peso de inmunogeno. Una dosis de administracion inicial o de cebado puede contener uno o mas inmunogenos que una dosis de refuerzo posterior.

Cuando se utiliza una NE para inactivar un microorganismo vivo (VSR), se espera que cada dosis (por ejemplo, administrada a un sujeto induzca una respuesta inmunitaria)) comprenda entre 10 y 109 ufp del virus por dosis; entre 105 y 108 ufp del virus por dosis; entre 103 y 105 ufp del virus por dosis; entre 102 y 104 ufp del virus por dosis; 10 ufp del virus por dosis; 102 ufp del virus por dosis; 104 ufp del virus por dosis mas de 109 ufp del virus por dosis o 103 ufp del virus por dosis.

Para inactivar los microorganismos vivos (VSR), se puede usar un 0,1 % - 5 % de solucion de NE, se puede usar un 5 %-20 % de solucion de NE, se puede usar un 20 % de solucion de NE, y se puede usar una solucion de NE mayor del 20 % a fin de inactivar un microorganismo patogeno. En particular, se puede usar un 15 % de solucion de NE.

El microorganismo puede incubarse durante 1-3 horas en NE, durante 3-6 horas en NE, durante mas de 6 horas en NE, o durante 3 horas en NE (por ejemplo, un 10% de solucion de NE). La incubacion puede llevarse a cabo a 37°C, o a una temperatura mayor que o menor de 37°C. La cantidad de microorganismo utilizado para la inactivacion puede depender de numerosos factores que incluyen, pero no de forma limitativa, la cantidad total de composicion inmunogena deseada, la concentracion de la solucion deseada (por ejemplo, antes de la dilucion para la administracion), el microorganismo y la NE. La cantidad de microorganismo utilizada en el procedimiento de inactivacion puede ser la cantidad que produce la cantidad deseada de inmunogeno como se describe en el presente documento que se va a administrar en una unica dosis (por ejemplo, diluida a partir de una disolucion madre concentrada) a un sujeto.

Se puede formular una composicion como se define en las reivindicaciones en una dosis concentrada que se puede diluir antes de la administracion a un sujeto. Por ejemplo, se pueden administrar diluciones de una composicion

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concentrada a un sujeto de tal manera que el sujeto reciba una cualquiera de mas de las dosificaciones espedficas proporcionadas en el presente documento. Puede prepararse una dilucion de una composicion concentrada de tal manera que se administre a un sujeto (por ejemplo, en una unica dosis) una composicion que comprenda 0,5-50 % del VSR inactivado con NE presente en la composicion concentrada. Se puede administrar a un sujeto en una unica dosis una composicion que comprende un 1 % del VSR inactivado con NE presente en la composicion concentrada. Se contempla que las composiciones concentradas sean utiles en un escenario en el que se puede administrar a grandes cantidades de sujetos una composicion de la presente invencion (por ejemplo, un centro de vacunacion, hospital, escuela, etc.). Una composicion que comprende un VDR inactivado con NE (por ejemplo, una composicion concentrada) puede ser estable a temperatura ambiente durante mas de 1 semana, durante mas de 2 semanas, durante mas de 3 semanas, durante mas de 4 semanas, durante mas de 5 semanas, y durante mas de 6 semanas.

En general, las composiciones en emulsion pueden comprender al menos 0,001 % a 100 %, preferentemente 0,01 a 90 %, de emulsion por ml de composicion lfquida. Se considera que las formulaciones pueden comprender aproximadamente un 0,001 %, aproximadamente un 0,0025 %, aproximadamente un 0,005 %, aproximadamente un 0,0075%, aproximadamente un 0,01%, aproximadamente un 0,025 %, aproximadamente un 0,05%, aproximadamente un 0,075%, aproximadamente un 0,1%, aproximadamente un 0,25%, aproximadamente un 0,5%, aproximadamente un 1,0%, aproximadamente un 2,5%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 7,5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 12,5%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un

20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un

40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un

65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un

85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 % de emulsion por ml de composicion lfquida. Debe entenderse que se contempla espedficamente que un intervalo entre cualquiera de dos figuras relacionadas anteriormente se encuentre abarcado dentro de las medidas y lfmites de la presente divulgacion. Se producira alguna variacion en la dosificacion dependiendo de la dolencia del patogeno espedfico y del sujeto que se esta inmunizando.

Tras una administracion inicial de una composicion de la presente invencion como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, una vacunacion inicial), un sujeto puede recibir una o mas administraciones de refuerzo (por ejemplo, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas, alrededor de 4 semanas, alrededor de 5 semanas, alrededor de 6 semanas, alrededor de 7 semanas, alrededor de 8 semanas, alrededor de 10 semanas, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 1 ano, alrededor de 2 anos, alrededor de 3 anos, alrededor de 5 anos, alrededor de 10 anos) posteriormente a una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, octava, novena, decima, y/o mas de la decima administracion. La reintroduccion de un inmunogeno en una dosis de refuerzo parece permitir una inmunidad sistemica vigorosa en un sujeto. El refuerzo puede realizarse con la misma formulacion dada para la primera respuesta inmunitaria, o puede ser con una diferente formulacion que contiene el inmunogeno. El regimen de dosificacion tendra, al menos en parte, que determinarse por la necesidad del sujeto y dependera del criterio de un especialista medico.

Las unidades de dosificacion pueden aumentar o disminuir proporcionadamente basandose en diversos factores que incluyen, pero no de forma limitativa, el peso, la edad, y el estado de salud del sujeto. Ademas, se pueden aumentar o disminuir las unidades de dosificacion para las posteriores administraciones (por ejemplo, las administraciones de refuerzo).

Se contemplara que las composiciones de la presente invencion, como se definen en las reivindicaciones encontraran uso en diversos escenarios, incluyendo escenarios de investigacion. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion, como se definen en las reivindicaciones, seran de utilidad en los estudios del sistema inmunitario (por ejemplo, la caracterizacion de respuestas inmunitarias adaptativas (por ejemplo, respuestas inmunitarias protectoras (por ejemplo, inmunidad mucosal o sistemica))). Los usos de las composiciones proporcionadas por la presente invencion, como se definen en las reivindicaciones, abarca sujetos humanos y no humanos y muestras de estos sujetos, y abarcan tambien las aplicaciones de investigacion que utilizan estos sujetos. Las composiciones de la presente invencion, como se definen en las reivindicaciones, son tambien utiles en el estudio y la optimizacion de las nanoemulsiones, inmunogenos, y otros componentes y para la seleccion de nuevos componentes.

Las formulaciones pueden someterse a ensayo in vivo en numerosos modelos animales desarrollados para el estudio de las rutas de administracion mucosales y otras rutas. Como es facilmente evidente, las composiciones de la presente invencion que se definen en las reivindicaciones son utiles para la prevencion y/o el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades e infecciones producidas por virus, bacterias, parasitos, y hongos, asf como para estimular una respuesta inmunitaria frente a una variedad de antfgenos. No solamente pueden las composiciones utilizarse profilactica o terapeuticamente, como se ha descrito anteriormente, las composiciones se pueden usar tambien para preparar anticuerpos, policlonales y monoclonales (por ejemplo, para fines diagnosticos), asf como para la inmunopurificacion de un antfgeno de interes. Si se desean anticuerpos policlonales, se puede inmunizar un mairnfero seleccionado (por ejemplo, un raton, conejo, cabra, caballo, etc.) con las composiciones de la presente invencion. El animal se refuerza usualmente 2-6 semanas despues con una o mas administraciones del antfgeno. A continuacion se pueden obtener antisueros policlonales procedentes de los animales inmunizados y usarse de acuerdo con los procedimientos conocidos (Vease, por ejemplo, Jurgens y col., J. Chrom. 1985, 348:363-370).

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Puede proporcionarse un kit que comprende una composicion que comprende un VSR inactivado con NE. Dicho kit puede proporcionar ademas un dispositivo para administrar la composicion. No existen Ifmites con respecto al tipo de dispositivo incluido en el kit. El dispositivo puede configurarse para la aplicacion nasal de la composicion (por ejemplo, un aplicador nasal (por ejemplo, una jeringuilla) o inhalador nasal o nebulizador nasal). Un kit puede comprender una composicion como se define en las reivindicaciones en una forma concentrada (por ejemplo, que se puede diluir antes de la administracion a un sujeto).

Todos los componentes del kit pueden estar presentes en un unico recipiente (por ejemplo, vial o tubo). Cada componente del kit puede localizarse en un unico recipiente (por ejemplo, vial o tubo). Uno o mas componentes del kit pueden localizarse en un unico recipiente (por ejemplo, vial o tubo) localizandose otros componentes del mismo kit en un recipiente separado (por ejemplo, vial o tubo). Un kit puede comprender un tampon. El kit puede comprender ademas instrucciones para el uso.

Ejemplos

En la divulgacion experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); p (micra); M (Molar); pM (micromolar); mM (milimolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); ng (nanogramos); l (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centimetros); mm (milfmetros); pm (micrometros); nM (nanomolar);'C (grados centfgrados); y PBS (solucion salina tamponada con fosfato).

Ejemplo 1

Composiciones que comprenden el virus sincitial respiratorio inactivado con una nanoemulsion y procedimientos para utilizar las mismas

Materiales y procedimientos

Ratones. Los ratones Balb/c se adquirieron a Jackson Laboratories. Todas las operaciones con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la polftica de la University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.

Ensayo de placas vmcas. Se extrajo el lobulo derecho de los pulmones de ratones infectados y se molio con arena usando un mortero y un almirez. Las muestras de los pulmones se agitaron 2x o se tomaron tras incubacion con nanoemulsion y sobrenadantes diluidos en serie sobre una monocapa confluente al ~90 % de celulas Vero. Las muestras se incubaron a 37' con rotacion suave durante 2 h, a continuacion, los sobrenadantes infectados se retiraron y se sustituyeron con 0,9% de metilcelulosa. Tras la incubacion a 37 °C durante 5 dfas, se retiro la metilcelulosa, se sustituyo con metanol, y se incubo a -80° C durante 1 h. Tras la retirada del metanol, las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el revelado de la placa. Las placas se revelaron usando un protocolo ELISA modificado. En resumen, se bloquearon las celulas durante 1 h a 37 °C con 25 % de Blotto (leche en polvo diluida con solucion salina tamponada con fosfato), se lavaron y se incubaron durante 1 h a 37 °C con Ab policlonal de cabra dirigido contra VSR humano (Chemicon International). Las celulas se lavaron de nuevo y se incubaron durante 1 h con IgG de oveja dirigido contra IgG de cabra conjugada con peroxidasa de rabano picante (Serotec). Se lavaron las celulas y se incubaron a temperatura ambiente con cloronaftol y se enumeraron las placas.

Preparacion de nanoemulsion de VSR. VSR (cepa Line 19 de VSR (Vease, por ejemplo, Lukacs y col., Immunopathology and Infection, 169, 977-986 (2006)) (2 X 106 ufp) se incubo con 15% Ws05EC nanoemulsion durante 60 minutos, un tiempo determinado en experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de las realizaciones de la invencion para inactivar el virus completamente. La preparacion de la vacuna de VSR se realizo de forma reciente para cada una de las inmunizaciones. Cada animal recibio 10 pl de la emulsion o la emulsion + VSR en el orificio nasal izquierdo en el dfa 0 y en el dfa 28. Esto significa que se uso un total de 1 X 104 ufp para la vacunacion/raton.

Medida de citoquinas en el lavado broncoalveolar. Se llevo a cabo el lavado broncoalveolar (BAL) en ratones infectados usando 1 ml de PBS esteril. Se centrifugaron las suspensiones celulares y se recogieron los sobrenadantes para el analisis de las citoquinas mediante Bioplex utilizando los kits adquiridos de R&D systems.

Dispersion pulmonar y reestimulacion de VSR in vitro. Se extrajeron los pulmones despues de un lavado con 1 ml de PBS-EDTA y se dispersaron con colagenasa (0,2 %, Tipo IV, Sigma) durante 45 minutos en un bano de agua rotatorio (37 °C). A continuacion se contaron las celulas dispersas. A continuacion se sembro en placa la suspension de celulas individuales a una concentracion de 2 x 106/ml y se incubo con VSR (MOI-0,5). Se recogieron los sobrenadantes exentos de celulas despues de 36 h y se evaluaron mediante Bioplex para los niveles de citoquinas que se produjeron. Este ensayo permitio a los inventores evaluar la respuesta global en los pulmones de los grupos de ratones vacunados frente a los grupos de ratones no vacunados.

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Ejemplo 2

La nanoemulsion inactiva eficazmente el VSR

A fin de someter a ensayo la capacidad de la emulsion de inactivar VSR, se incubo el VSR (106 unidades formadoras de particulas (UFP) con una nanoemulsion a concentraciones variables (0 % - 20 %) y tiempos variables (1 h - 3 h) (Vease la Figura 1). Se determino el numero de virus infeccioso mediante un ensayo de placas utilizando celulas Vero. Se uso el virus incubado con la nanoemulsion para infectar celulas Vero subconfluentes. Se visualizaron las placas de VSR utilizando tecnicas inmunohistoqmmicas. En tan poco como un 1 % de nanoemulsion incubada durante 3 h, no hubo deteccion de virus activos como se evaluo mediante el ensayo de placas normalizado (Vease la Figura 1). De esta manera, la nanoemulsion es eficaz para destruir completamente el VSR a una concentracion del 2 % en tan poco como una hora, o tan poco como un 1 % en tres horas. De acuerdo con ello, se ha proporcionado una nanoemulsion que es eficaz en reducir y/o inactivar completamente la infectividad por VSR.

Ejemplo 3

La inmunizacion con la nanoemulsion potencia la inmunidad tras el estimulo del VSR

Se determino a continuacion si la nanoemulsion podna utilizarse como un agente inmunopotenciador para inducir respuestas inmunitarias importantes para la proteccion frente a la infeccion por un virus. Para examinar este aspecto, se utilizo un protocolo de inmunizacion que comprendfa la inmunizacion de animales mediante sensibilizacion intranasal con un virus inactivado con una nanoemulsion (mezcla de VSR nanoemulsion (15 %) (10 pl total, 5 pl /orificio de la nariz)) en el dfa 0 y se reforzo en el dfa 28 o la nanoemulsion sola sin VSR como grupo control. A continuacion, los animales se estimularon con VSR infeccioso vivo en el dfa 56 (8 semanas) y se evaluaron para determinar la evidencia de inmunidad protectora. Un objetivo era vigilar la produccion de anticuerpos espedficos de VSR durante el protocolo de inmunizacion. Se determino la inversa del tftulo de anticuerpos espedficos de VSR en suero mediante enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA) frente al extracto de protemas de VSR. Se extrajo la sangre y se recogio el suero en puntos temporales espedficos tras la inmunizacion incluyendo el dfa 0, 1 semana, 4 semanas y 8 semanas (en el momento del estimulo del VSR) y se evaluo la IgG en suero total espedfica de VSR. Tal como se muestra en la Figura 2, el tftulo de IgG dirigido contra VSR no se pudo detectar 1 semana despues de la inmunizacion, aumento despues de 4 semanas antes del refuerzo y aumento significativamente en las 8 semanas despues de la inmunizacion inicial. De esta manera, la inmunizacion (por ejemplo, la inmunizacion intranasal) de un sujeto con VSR inactivado mediante nanoemulsion induce una respuesta inmunitaria dirigida contra VSR en un sujeto. Se indujo una respuesta inmunitaria dirigida contra VSR en un sujeto en las cuatro semanas tras la administracion al sujeto del vSr inactivado con la nanoemulsion. Se indujo una respuesta inmunitaria dirigida contra VSR en un sujeto tras una segunda administracion al sujeto del VSR inactivado con la nanoemulsion (por ejemplo, tras la administracion de un "refuerzo"). Se ha proporcionado una composicion que comprende un VSR inactivado con una nanoemulsion util para generar una respuesta inmunitaria espedfica dirigida contra VSR en un sujeto al que se administro la composicion.

Ejemplo 4

La inmunizacion con la nanoemulsion de VSR induce respuestas inmunitarias antivrncas citotoxicas y de tipo Th1.

Debido a los graves problemas asociados con otros tipos de vacunas para el VSR (por ejemplo, la generacion de una enfermedad exacerbada grave tras infeccion despues de la administracion a sujetos de VSR inactivado con formol), se determino a continuacion que tipo de respuesta inmunitaria se genero tras la administracion a sujetos de un VSR inactivado con una nanoemulsion.

La administracion de NE-VSR potencio las citoquinas antivrncas en el fluido BAL procedente de las vfas aereas de ratones a los que se estimulo con VSR. Se utilizo 1 ml de lavado de PBS de las vfas aereas y se determinaron los niveles de citoquinas en los pulmones mediante el analisis multiplexado del fluido BAL (Bioplex, R&D systems) procedente de pulmones en el dfa 8 despues del estimulo, un tiempo en el que las citoquinas de los linfocitos T alcanzan un maximo.

Tal como se muestra en la Figura 3, los sujetos a los que se administro (por ejemplo, por via nasal) VSR inactivado con nanoemulsion, presento cantidades crecientes de linfocitos T citotoxicos CD8+ espedficos del peptido M2 en comparacion con el grupo control de inmunizacion de la nanoemulsion. Se determino el numero de linfocitos T CD8 espedficos de M82-90 de VSR mediante analisis citometrico de flujo pulmonar enzimaticamente digerido en el dfa 4 despues del estimulo usando un tetramero de clase I espedfico de MHC que reconoce espedficamente el TCR del peptido inmunodominante de M82-90. Ademas, la evaluacion de un entorno antivftico en las vfas aereas utilizando el fluido BAL indico una produccion aumentada de IFN-y e IL-17 en los sujetos, pero no un aumento en las citoquinas Th2 patogenas, IL-4, IL-5 y IL-13, durante la etapa de estimulacion vftica (Vease la Figura 4). Tal como se ha descrito anteriormente, se ha identificado que las citoquinas de tipo Th2 tienen un papel causativo en los ensayos de vacunas anteriores llevados a cabo con VSR inactivado con formol. Ademas, la citoquina Th2, interleuquina-13 (IL- 13), es un mediador de la secrecion de moco pulmonar (Vease Hershey, G. K. 2003. J. Allergy Clin. Immunol. 111:677-690, Walter y col., 2001 J. Immunol. 167:4668-4675; Zhu y col., 1999 J. Clin. Investig. 103:779-788) y se

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encuentran linfocitos T espedficos de VSR que expresan IL-13 en bronquiolitis por VSR (deWaal, 2003 J. Med. Virol. 70:309-318). De esta manera, se han proporcionado composiciones inmunogenas que comprenden NE inactivan VSR y los procedimientos para utilizar las mismas generan respuestas inmunitarias a VSR en un sujeto sin produccion potenciada de moco, constriccion de las vfas aereas, hipersensibilidad de las vfas aereas, atrapamiento de aire, hipoxia y/o el colapso parcial del pulmon (por ejemplo, dando como resultado la expresion potenciada de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-13)).

Para evaluar adicionalmente la respuesta de las citoquinas en sujetos que recibieron NE-RSV, se aislaron pulmones de animales que o bien no estaban infectados, o bien se hadan vacunado y estimulado y se compararon con animales sin vacunar y estimulados con VSR. Se extirparon los pulmones y se dispersaron con colagenasa en una suspension de celulas individuales seguido por una reestimulacion in vitro con el virus. Los leucocitos pulmonares totales se aislaron de pulmones de ratones de control sin infectar (UC), vacunados y estimulados (Vaccine), o ratones de control estimulados con VSR (sin vacunar). Se cultivaron las celulas a una concentracion de 2 x 107ml durante 36 horas en presencia de VSR vivo (MOI = 0,5). Se midieron las concentraciones de citoquina en los sobrenadantes mediante el ensayo multiplexado bioplex.

Se observo que aunque la produccion de IL-17 se regulo de nuevo significativamente en exceso y aumento IFN, la citoquina IL-4 de tipo Th2 no se altero (Vease la Figura 5). De esta manera, la vacunacion con NE-VSR no presensibiliza a los ratones a una respuesta mas patogena (por ejemplo, en contraste con los resultados obtenidos con el VSR inactivado con formol). Un aumento en IFN-y e ILl7 parece reflejar un entorno inmunitario antivmco inducido por un protocolo de inmunizacion con VSR inactivado con una nanoemulsion.

Muy importante para el resultado de cualquier protocolo de inmunizacion es determinar si existe un aumento en el aclaramiento vmco despues de la inmunizacion y exposicion al virus vivo. Se inmunizaron los ratones dos veces por via intranasal por separado durante cuatro semanas con 106 UFP de VSR en 15 % de NE (NE-VSR), o 15 % de NE sola (NE) como control. A continuacion se estimularon los ratones cuatro semanas despues de la segunda vacunacion (un total de ocho semanas), y se determino el numero de partmulas de virus viables mediante ensayo de placas de los pulmones del lado derecho. Cuando se evaluaron los sujetos mediante el ensayo de placas para determinar los recuentos de virus vivos presentes en los pulmones de sujetos vacunados y posteriormente infectados vmcamente, los sujetos inmunizados con VSR en nanoemulsion demostraron un aclaramiento aumentado significativo (placas vmcas disminuidas) en comparacion con los sujetos sin inmunizar (vease la Figura 6). De esta manera, la administracion de VSR inactivado con nanoemulsion (NE-VSR) establece una respuesta protectora en sujetos.

Ejemplo 5

Inmunizacion de VSR con la nanoemulsion y asma alergica

Los estudios epidemiologicos han sugerido un vinculo entre la infeccion grave inicial por VSR y el posterior desarrollo del asma alergica. De esta manera, para determinar si la vacunacion con NE-VSR seguida por el estfmulo con el virus vivo afectana a la posterior respuesta a un modelo de asma alergica, los ratones se vacunaron dos veces con NE-RSV, se estimularon intranasalmente con 105 UFP de VSR, y se sensibilizaron con el alergeno de la cucaracha. En este modelo, los ratones reciben una administracion intraperitoneal/subcutanea de alergeno de cucaracha de calidad de ensayo clmico cutaneo (100 Ig) emulsionado en adyuvante incompleto de Freund en el dfa 21 despues del estfmulo del VSR. Los ratones recibieron a continuacion un estfmulo intranasal cuarenta dfas despues (15 Ig) y dos estfmulos intratraqueales (40 Ig) cinco y siete dfas despues del estfmulo intranasal. Se evaluaron los ratones para determinar la enfermedad alergica 24 horas despues del ultimo estfmulo intratraqueal.

Uno de los hitos de la enfermedad pulmonar alergica es la hipersecrecion de moco. En comparacion con los ratones sin vacunar, los ratones NE-VSR vacunados presentaron respuestas mucosales atenuadas inducidas por alergenos como se evaluo mediante la tincion de Schiff acida periodica (PAS) de secciones histologicas de pulmon (Vease la Figura 8), asf como la expresion reducida del gen del moco Gob5 en el ARN total de pulmon (Veanse las Figuras 7 y 8). Analogamente al estfmulo vmco solo, los animales vacunados con NE-VSR estimulado con alergeno tuvieron una induccion significativamente mayor de IL-17 en los pulmones, como se evaluo mediante QPCR (Vease la Figura 9A). Las citoquinas Th2 son importantes para promover la enfermedad pulmonar alergica. Los ratones vacunados con NE-VSR presentaron una produccion atenuada de citoquinas de tipo Th2, incluyendo IL-4 (pulmones homogeneizados y BAL) e IL-5 (pulmones) (Vease la Figura 9B). Se senalo una tendencia hacia la disminucion del ARNm de IL-13, tambien. No hubo potenciacion de la enfermedad alergica en animales vacunados con NE-VSR. Adicionalmente, los ratones vacunados tuvieron una expresion significativamente menor del marcador de macrofagos activado alternativamente Fizz-1. Como alternativa, los macrofagos activados se asociaron con respuesta de tipo Th2, asf como enfermedad fibrotica. La disminucion en Fizz-1 parece reflejar una consecuencia de la disminucion de citoquinas Th2 en ratones vacunados, y proporciona tambien un mecanismo por el cual, la vacunacion de NE-VSR protege frente al posterior desarrollo de la enfermedad pulmonar alergica.

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Ejemplo 6

La inmunizacion de VSR con la nanoemulsion induce la produccion de anticuerpos espedficos de VSR

La vacunacion intranasal de ratones con NE/VSR da como resultado la produccion de anticuerpos espedficos de VSR. Se llevaron a cabo experimented durante el desarrollo de las realizaciones de la invencion para determinar si la vacunacion con NE-VSR estimulana respuestas de anticuerpos en sujetos a los que se administro la composicion de NE-VSR (por ejemplo, implicada en la proteccion frente a la infeccion por el virus). Se utilizo un protocolo de inmunizacion con ratones vacunados que recibieron dos dosis intranasales de NE-RSV, separadas por 28 dfas. Se inmunizaron los ratones con NE/VSR que contema 105 partteulas del virus Line 19 en el dfa 0 y el dfa 28. Se determinaron los niveles de anticuerpos espedficos de VSR total en suero en el dfa 55 mediante ELISA utilizando extracto de protema de VSR purificado. Tal como se muestra en la Figura 10, se generaron respuestas espedficas de VSR significativas sistemicamente tras la vacunacion con NE-VSR (Vease por ejemplo, Figura 10A). Estas incluyeron la induccion drastica de la Ig espedfica de VSR total, sin la potenciacion en el tftulo de IgE espedfica de VSR (Vease, por ejemplo, Figura 10A).

Se llevaron a cabo tambien experimentos durante el desarrollo de las realizaciones de la invencion a fin de determinar si la vacunacion promovena la induccion de anticuerpos espedficos de VSR localmente en los pulmones. Se evaluo la presencia de Ig e IgA total espedficas de VSR mediante ELISA de muestras de lavado broncoalveolar (BAL) en el dfa 2 despues del estfmulo intratraqueal con el VSR vivo (105). Espedficamente, se determinaron los niveles de anticuerpos espedficos de VSR total en suero en el dfa 55 mediante ELISA utilizando extracto de protema de VSR purificado. Se evaluo la Ig medida a partir del suero en muestras diluidas 1:1600, se evaluaron otras muestras a 1:50. (B)

Como se muestra en la Figura 10B, en comparacion con los ratones del control sin vacunar (Ctrl no expuesto anteriormente a tratamiento) y con los ratones que recibieron un estfmulo primario con NE-VSR (VSR primario), los ratones vacunados recibieron dos dosis intranasales de NE-VSR separadas por 28 dfas (NE-VSR) que mostraron una IgA espedfica de VSR aumentada y una Ig total espedfica de VSR en el fluido de lavado broncoalveolar en el dfa 2 despues del estfmulo con el virus vivo (Vease, por ejemplo, Figura 10B). Estos datos demuestran claramente que la vacunacion con NE-VSR induce anticuerpos espedficos de VSR significativos, y potencia la induccion local de anticuerpos espedficos de VSR tras el estfmulo del virus vivo.

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion inmunogena que comprende un virus sincicial respiratorio inactivado con una nanoemulsion (VSR).
2. 2. La composicion inmunogena de la reivindicacion 1, en la que la nanoemulsion utilizada para inactivar el virus sincitial respiratorio (VSR) comprende una fase acuosa, una fase oleosa, y un disolvente.
3. 3. La composicion inmunogena de la reivindicacion 1 o 2, en la que la nanoemulsion utilizada para inactivar el virus sincicial respiratorio (VSR) comprende

   a) aproximadamente 5 % en vol. de TWEEN 80, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente 64 % en vol. de aceite, y aproximadamente 22 % en vol. de agua, o

   b) aproximadamente un 5 % en vol. de TWEEN 20, aproximadamente 8 % en vol. de etanol, aproximadamente 1 % en vol. de cloruro de cetilpiridinio (CPC), aproximadamente 64 % en vol. de aceite, y aproximadamente 22 % en vol. de agua.
4. 4. La composicion inmunogena de la reivindicacion 1 a 3, en la que la composicion comprende 1,0 % - 10 %, 5 % - 15 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, o 50 % - 60 % de una solucion en nanoemulsion.
5. 5. La composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha composicion comprende entre 10 y 1010 unidades formadoras de placa (PFU) del virus sincitial respiratorio.
6. 6. La composicion inmunogena de la reivindicacion 5, en la que dicha composicion comprende 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 unidades formadoras de placa (PFU) de virus sincitial respiratorio.
7. 7. La composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha composicion es termicamente estable.
8. 8. La composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas comprende un transportador farmaceuticamente aceptable.
9. 9. La composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas un adyuvante.
10. 10. Una vacuna que comprende la composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. La vacuna de la reivindicacion 10 formulada para su administracion a una superficie mucosa.
12. 12. Una composicion inmunogena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento o la prevencion de una infeccion por el virus sincicial respiratorio.