CN104093421A

CN104093421A - 纳米乳液呼吸道合胞病毒(rsv)亚单位疫苗

Info

Publication number: CN104093421A
Application number: CN201280054495.5A
Authority: CN
Inventors: V·毕缇寇; T·韩缪达
Original assignee: Nanobio Corp
Current assignee: Nanobio Corp
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2014-10-08
Also published as: CA2848163A1; US10596251B2; US20170360919A1; JP6460792B2; JP2014526471A; JP6615151B2; US20130064867A1; US9561271B2; CA2848163C; EP2753354A4; JP2017206514A; EP2753354A1; EP3488863A1; BR112014005406A2; WO2013036907A1

Abstract

本申请涉及免疫学领域，具体地，涉及呼吸道合胞病毒(RSV)表面蛋白的疫苗组合物，融合物(F)和糖蛋白(G)蛋白质亚单位疫苗，优选与免疫细胞靶向和增强物——纳米乳液混合，以引起保护性免疫应答和避免疫苗疫苗引起的疾病加重。

Description

纳米乳液呼吸道合胞病毒(RSV)亚单位疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求美国临时申请号61/533,062——2011年9月9日提交——的权益，其通过引用被具体并入。

本申请的领域

本申请涉及免疫学领域，尤其地，涉及纳米乳液呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗组合物，其包括与纳米乳液佐剂组合的至少一种RSV免疫原。RSV免疫原可以是任意合适的RSV抗原，诸如RSV表面蛋白质、融合物(F)和糖蛋白(G)蛋白质，以形成亚单位疫苗。纳米乳液RSV疫苗引起保护性免疫应答并且避免疫苗引起的疾病加重。

发明的背景

呼吸道合胞病毒(RSV)是世界范围内幼儿和老人中严重呼吸疾病的主要原因，并且，没有疫苗可对抗该病原体。人呼吸道合胞病毒(HRSV)是婴儿急性下呼吸道疾病的最常见病原，并且，在一生中可导致反复感染。其被归于副黏液病毒科(paramyxoviridae)肺病毒(pneumovirus)属。如该科中的其他成员一样，HRSV具有两种主要的表面糖蛋白(G和F)，其在感染周期的初始阶段发挥重要作用。G蛋白介导病毒到细胞表面受体的附着，而F蛋白促进病毒和细胞膜的融合，使得病毒核糖核蛋白进入细胞质。

呼吸道合胞病毒(RSV)感染常常导致细支气管炎，并且是发达国家中婴儿住院的主要原因。另外，RSV日益被描述为老年患者、移植患者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中的主要病原体(Hacking and Hull,2002)。开发安全和免疫原性疫苗以解决婴儿和老年群体展现出独特的时机。

之前的疫苗制剂的病毒灭活方法诸如甲醛导致肺疾病加重和死亡率增加。对于病毒疫苗开发以解决RSV的广泛研究已经取得有限的成功。RSV疫苗开发的一些主要挑战包括，感染的早期、先天免疫逃避、不引起预防感染的免疫性的自然感染失败和与疫苗稳定性、纯度、再现性和效价有关问题有关联的疫苗-加重疾病的证明(Graham,2011；Swanson and Settembre,2011)。

方法已经包括用福尔马林灭活病毒和在感染RSV时证明疫苗引起的疾病加重。如下的观察对于产生中和抗体是必要的：福尔马林灭活的疫苗已经显示疾病加重，包括显示对于预防加重重要的偏移的免疫应答对于保护性免疫应答和使F蛋白质处于其原始状态以维持构象表位是必要的(Krujigen,2011；Swanson2011；McLellan等,2011)。对于福尔马林-灭活的RSV疫苗疾病加重不归因于G蛋白质和G蛋白质抗体可降低病毒滴度和实际上保护免受疾病加重的证明表明，G蛋白质可被并入到候选疫苗中(Radu等,2010；Haynes等,2009；Johnson等,2004)。减毒活疫苗的应用已经取得有限的成功，因为已经显示疫苗是最低免疫原性的(Gomez等2009)。重组病毒表达的F和G蛋白质疫苗的应用显示与下列有关的免疫原性降低：低抗原表达水平、瞬时表达水平、细胞特异性和对于纯化F蛋白质在结构上可以是不成熟的并且不是引起中和抗体的适当形式的证明(Singh and Dennis,2007；Kim等,2010)。在应用亚单位疫苗时，具有最佳F蛋白质水平对于引起适当的免疫应答是至关重要的，因为亚单位疫苗已经通过F和G蛋白质的低效和不适当表达而被阻止(Nallet等,2009；Huang and Lawlor2010)。对于含有F蛋白质、甚至还有佐剂的亚单位疫苗不是完全保护性的和最佳的观察(Langley等,2009)表明，病毒体内F蛋白质以其初始状态的呈递对于用作疫苗是重要的。

与纳米乳液有关的之前的教导描述在美国专利号6,015,832中，该专利涉及灭活革兰氏阳性细菌、细菌芽孢或革兰氏阴性细菌的方法。该方法包括使革兰氏阳性细菌、细菌芽孢或革兰氏阴性细菌与灭活细菌的(或灭活细菌芽孢的)乳液接触。美国专利号6,506,803涉及利用乳液杀死或中和人体上或人体中的微生物剂(例如，细菌、病毒、孢子、真菌的方法。美国专利号6,559,189涉及净化样品(人、动物、食品、医疗器械等)的方法，包括使样品与纳米乳液接触。纳米乳液在与细菌、病毒、真菌、原生动物或孢子接触时杀死病原体或使病原体失去能力。抗微生物纳米乳液包括季铵化合物、乙醇/甘油/PEG之一和表面活性剂。美国专利号6,635,676涉及两种不同的组合物和通过用任一组合物处理样品而净化样品的方法。组合物1包括乳液，其是抵抗细菌、病毒、真菌、原生动物和孢子的抗微生物乳液。乳液包括油和季铵化合物。美国专利号7,314,624涉及引起对免疫原的免疫应答的方法，包括用免疫原和纳米乳液的组合通过黏膜表面处理对象。纳米乳液包括油、乙醇、表面活性剂、季铵化合物和蒸馏水。US-2005-0208083和US-2006-0251684涉及纳米乳液，其含具有优选尺寸的小滴。US-2007-0054834涉及包括季铵卤化物的组合物和利用其治疗感染状况的方法。季铵化合物可被提供作为乳液的部分。US-2007-0036831和US2011-0200657涉及纳米乳液，其包括抗炎剂。描述纳米乳液的其它出版物包括美国专利号8,226,965，“Methods of treating fungal,yeast andmold infections”；US2009-0269394，“Methods and compositions for treatingonychomycosis”；US2010-0075914，“Methods for treating herpes virus infections”；US2010-0092526，“Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using thesame”；US2010-0226983，“Compositions for treatment and prevention of acne,methods of making the compositions,and methods of use thereof”；US2012-0171249，“Compositions for inactivating pathogenic microorganisms,methods of making thecompositions,and methods of use thereof”；和US2012-0064136，“Anti-aging andwrinkle treatment methods using nanoemulsion compositions”。然而，这些参考文献均未教导本发明的方法、组合物和试剂盒。

尤其地，美国专利号7,314,624描述纳米乳液疫苗。然而，该参考文献没有教导利用本发明的免疫原引起对RSV的保护性免疫应答的能力。

涉及疫苗的现有技术包括，例如美国专利号7,731,967，“Composition forinducing immune response”(Novartis)，其描述抗原/佐剂复合物——包括至少两种佐剂。美国专利号7,357,936，“Adjuvant systems and vaccines”(GSK)，描述佐剂和抗原的组合。美国专利号7,323,182，“Oil in water emulsion containing saponins”(GSK)，描述疫苗组合物和油/水制剂。美国专利号6,867,000，“Method of enhancingimmune response to herpes”(Wyeth)，描述病毒抗原和细胞因子(IL12)的组合。美国专利号6,623,739、6,372,227和6,146,632，名称均为“Vaccines”(GSK)，涉及包括抗原和/或抗原组合物的免疫原性组合物和由可代谢的油和水包油乳液形式的α生育酚组成的佐剂。美国专利号6,451,325，“Adjuvant formulation comprising asubmicron oil droplet emulsion”(Chiron)，涉及佐剂组合物，包括可代谢的油、乳化剂和抗原物质，其中油和乳化剂以水包油乳液的形式存在。佐剂组合物不含有任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；和抗原物质不存在于佐剂组合物的内相中。最后，US20040151734，“Vaccine and method of use”(GSK)，描述治疗患有或容易患有一种或多种性传播疾病(STDs)的女性对象的方法。该方法包括给需要的女性对象施用有效量的疫苗制剂，该制剂包括一种或多种抗原，所述抗原源自或结合导致STD的病原体和佐剂。

在本领域中对于有效的RSV疫苗及其制造和应用方法仍存在需要。本发明满足这些需要。

发明概述

本发明提供通过组合至少一种关键免疫原性病毒表面抗原例如F和G蛋白质或其抗原片段与递送型和免疫增强型水包油纳米乳液而递送和引起针对RSV感染的保护性免疫应答的新方法。例如，本发明纳米乳液RSV亚单位疫苗引起Th1免疫应答、Th2免疫应答、Th17免疫应答、或其任意组合。

纳米乳液RSV亚单位疫苗包括至少一种RSV免疫原，其是RSV F蛋白质、RSV G蛋白质、RSV F蛋白质的免疫原性片段、RSV G蛋白质的免疫原性片段、或其任意组合。另外，纳米乳液RSV亚单位疫苗包括平均直径小于约1000nm的小滴。存在于RSV亚单位疫苗中的纳米乳液包括：(a)含水相，(b)至少一种油，(c)至少一种表面活性剂，(d)至少一种有机溶剂，和(e)任选地至少一种螯合剂。优选地，RSV免疫原存在于纳米乳液小滴中。在另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗可经鼻内施用。在本发明再另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗不含有机溶剂。而且，另外的佐剂可加入至纳米乳液RSV疫苗。

在本发明的另外实施方式中，RSV病毒体颗粒还存在于纳米乳液RSV亚单位疫苗中。优选地，RSV病毒体颗粒存在于纳米乳液小滴中。RSV病毒体颗粒可经纳米乳液灭活。在一个实施方式中，RSV病毒基因组包括至少一个减毒突变。

纳米乳液RSV亚单位疫苗可被配制成任何药学上可接受的剂型，诸如液体分散体、凝胶、气溶胶、肺气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜或固体剂型。

RSV表面抗原和/或RSV病毒体颗粒可来自任意RSV毒株。在一个实施方式中，RSV表面抗原和/或RSV病毒体颗粒源自呼吸道合胞病毒(RSV)毒株L19(RSV-L19)。在另外的实施方式中，RSV-L19病毒是与病毒颗粒结合的融合物(F)和糖蛋白(G)结构蛋白质的超级生产者。在再另外的实施方式中，RSV-L19病毒是减毒的人呼吸道合胞病毒(HRSV)毒株L19。在一个实施方式中，疫苗组合物包括人呼吸道合胞病毒，其以HRSV-L19保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在一个实施方式中，RSV表面抗原还包括至少一种指示减毒表型的核苷酸修饰。在另外的实施方式中，RSV表面抗原或其抗原片段存在于融合蛋白质中。RSV表面抗原可以是RSV F蛋白质的肽片段、RSV G蛋白质的肽片段、或其任意组合。另外，RSV表面抗原可以是多价的。

在本发明的另外实施方式中，提供制备免疫原性制剂的方法，由此RSV毒株，诸如HRSV-L19，通过导致减毒表型的减毒突变和缺失被遗传工程化。所得减毒RSV病毒在适当的细胞系中培养和收获。然后，纯化收获的病毒去除细胞和血清成分。然后，纯化病毒混合在可接受的制药学载体中用于疫苗组合物。因此，描述的是这样的疫苗组合物，其包括包含至少一个减毒突变的RSV病毒基因组(诸如RSV毒株L19)，优选与以下物质组合：F蛋白质、G蛋白质、F和/或G蛋白质的抗原片段、或其任意组合。在再另外的实施方式中，疫苗组合物包括RSV病毒基因组(诸如RSV毒株L19)，其包含指示减毒表型的核苷酸修饰。

在本发明的另外实施方式中，疫苗组合物对于对象不是全身毒性的，并且在施用后产生最小炎症或不产生炎症。在另外的实施方式中，对象在单一施用疫苗后经历血清转换。

在一个实施方式中，描述的是增强对人呼吸道合胞病毒感染的免疫性的方法，包括给对象施用纳米乳液制剂——其包括RSV F和/或G蛋白质和/或其抗原片段。本发明的另外实施方式涉及引起针对由人呼吸道合胞病毒引起的疾病增强的免疫性的方法，包括给对象使用有效量的本发明疫苗组合物的步骤。在一些实施方式中，对象在至少单一施用纳米乳液RSV疫苗后可产生保护性免疫应答。另外，免疫应答针对一种或多种RSV毒株可以是保护性的。对HRSV增强的免疫性的诱导取决于最佳水平抗原的存在。而且，对抗原临界水平的鉴定对于提供有力的免疫应答是重要的。对于RSV F蛋白质水平与中和抗体的存在和持续以及针对病毒攻击的保护直接相关的证明，表明使产生最佳水平的关键免疫原性F蛋白质的病毒毒株以其自然方向表达对于用作候选疫苗是基本的。

在本发明进一步的实施方式中，RSV F和/或G蛋白质和/或其抗原片段和/或RSV病毒体颗粒被灭活，并辅助以纳米乳液制剂，以提供非感染性并且免疫原性病毒制剂。纳米乳液与候选疫苗的简单混合已经被显示同时产生黏膜和系统性免疫应答。RSV病毒体颗粒与纳米乳液的混合导致小滴的油核心中离散的抗原颗粒。抗原并入核心中，这使其处于促进正常抗原构象的自由形式。

RSV疫苗可被配制为液体分散体、凝胶、气溶胶、肺气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜或固体剂型。另外，RSV疫苗可经任意药学上可接受的方法施用，诸如肠胃外、经口、经鼻内或经直肠。肠胃外施用可通过皮内、皮下、腹膜内或肌肉内注射进行。

在本发明的另外实施方式中，纳米乳液RSV疫苗组合物包括(a)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂；(b)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂；(c)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中非阳离子表面活性剂是聚山梨醇酯非离子表面活性剂、波洛沙姆非离子表面活性剂、或其组合；(d)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙姆407、或其组合；(e)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙姆407、或其组合，并且其中非离子表面活性剂以约0.01％至约5.0％、或以约0.1％至约3％存在；(e)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂，其中非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，并且非离子表面活性剂以约0.05％至约10％、约0.05％至约7.0％、约0.1％至约7％或约0.5％至约4％的浓度存在；(f)至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，其中阳离子表面活性剂以约0.05％至约2％或约0.01％至约2％的浓度存在；或(g)其任意组合。

在本发明再另外的实施方式中，RSV疫苗包括低分子量脱乙酰壳多糖、中分子量脱乙酰壳多糖、高分子量脱乙酰壳多糖、葡聚糖、或其任意组合。低分子量脱乙酰壳多糖、中分子量脱乙酰壳多糖、高分子量脱乙酰壳多糖、葡聚糖、或其任意组合可存在于纳米乳液中。

上面的一般性描述和下面对附图的简述以及详细描述均是示例性的和说明性的，并意图对所要求保护的发明提供进一步的说明。其它目标、优势和新特征通过以下对本发明的详细描述对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图简介

图1:显示具有和不具有30μg总HA的20％W₈₀5EC NE的TEM横截面图。右边的图图示HA抗原位于油小滴中。染成深色的抗原位于NE颗粒外面。

图2：显示用RSV免疫的BALB/c小鼠血清中RSV特异性IgG的终点滴度。仅用20％W₈₀5EC混合F-蛋白质免疫的组响应接种。条表示组平均水平。

图3：显示用NE+Fptn免疫的BALB/c小鼠血清中RSV特异性IgG1(A)、IgG2a(B)、IgG2b(C)和IgE(D)的终点滴度。血清在第二次免疫后两周获得。

图4：显示用纳米乳液(NE)-F-蛋白质接种小鼠的结果在经活RSV鼻内攻击后减轻疾病。免疫的小鼠经鼻内(i.n.)接种两次——在第0和28天——以NE+F-蛋白质、单独的F-蛋白质，或仅以PBS进行处理。对照和接种的小鼠在通过105PFU活RSV加强(i.n.)后两周被攻击。病毒转录物的表达在感染后第八天通过肺RNA的QPCR测定。

图5：显示与未接种小鼠相比时，纳米乳液(NE)-RSV免疫不促进免疫强化。如下所述用NE-RSV接种小鼠。对照和接种的小鼠在第56天被攻击。气道高反应性在攻击后第八天经体积描述法评估。柱表示在单一、最优的静脉内剂量的乙酰甲基胆碱之后气道阻力的增加。

图6：显示纳米乳液(NE)+F-蛋白质接种的小鼠中炎症和黏液产生与对照并无不同。(A)描述在感染后第八天RSV感染的对照和NE+F-蛋白质接种的小鼠的代表性组织学(过碘酸希夫，PAS；苏木精和曙红，H&E)。嗜伊红粒细胞不存在。在(B)中，Muc5ac和Gob5的表达在感染后第八天经肺RNA的QPCR评估。

图7：显示纳米乳液(NE)+F-蛋白质接种促进混合的Th1和Th2应答。小鼠被接种NE+F-蛋白质、单独的F-蛋白质，如下所述，并被活RSV攻击。在(A)中，IL-12(p40)和(B)IL-17细胞因子的表达由肺RNA经QPCR评估。在(C)中，肺相关淋巴结(LALN)细胞悬浮液用RSV(MOI,0.5)再刺激。收集上清液用于分析Bioplex，以分析每个样品中细胞因子产量。

图8：显示F蛋白质单位，其在通过以下各种制剂施用/免疫后被测量：(1)4.5μg F蛋白质；(2)2.5μg F蛋白质；(3)5.5μL RSV/β-丙酸内酯(β-PL)；(4)5.6μL RSV；(5)0.5μg F/5.6μL RSV；(6)1μg F/5.6μL RSV/β-丙酸内酯(β-PL)；和(7)2.5μg F/5.6μL RSV。

图9：显示在仅经(1)F蛋白；仅经(2)RSV病毒；和经(3)RSV病毒+F蛋白质免疫后，肺中IL-4、IL-5、IL-13、IFNγ、IL-17A和Gob5的mRNA表达。

图10：显示被免疫和攻击的小鼠的组织学检查。图10A显示初始RSV感染的组织学检查；图10B显示RSV-NE免疫动物的组织学检查；图10C显示F蛋白质免疫动物的组织学检查；和图10D显示RSV+F蛋白质免疫动物的组织学检查。

图11：显示通过L19和A2的HRSV感染的细胞溶胞产物(SDS处理的)的SDSPAGE。

图12：显示RSV毒株L19和RSV毒株A2HRSV细胞溶胞产物(细胞&上清液)的SDS-PAGE。

图13：显示HRSV毒株L19和毒株A2纯化病毒的SDS PAGE。

图14：显示HRSV毒株L19和毒株A2F的蛋白质印迹和病毒感染后24小时的G蛋白质表达。

图15：通过蛋白质印迹评估显示病毒灭活，其中泳道含有：(1)W₈₀5EC(泳道1)，(2)W₈₀5EC+0.03％B1,3葡聚糖(泳道2)，(3)W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖(中分子量)+乙酸(泳道3)，(4)W₈₀5EC+0.3％P407(泳道4)，(5)W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖(低分子量)+0.1％乙酸(泳道5)，(6)仅介质(泳道6)；(7)βPL–灭活的病毒(泳道7)和(8)L19阳性对照(泳道9)。

图16：显示利用抗-RSV抗体(抗-G)进行的蛋白质印迹分析；L19病毒4×10⁶PFU/泳道、2×10⁶PFU/泳道和1×10⁶PFU/泳道+/-βPL灭活组合W₈₀5EC，如所指示。在开始时(图8A)或14天后在4℃或室温(RT)(图8B)下分析样本。MM＝分子量。

图17：显示在用具有和不具有脱乙酰壳多糖的不同纳米乳液制剂IM接种的小鼠中接种后第三周的免疫应答(IgG，μg/ml)：(1)RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC+0.1％低分子量脱乙酰壳多糖；(2)RSV毒株L19+5％W₈₀5EC；(3)RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC；(4)RSV毒株L19+βPL灭活的病毒；和(5)未接种小鼠(没有疫苗)。

图18：显示接种时间表，用于在棉鼠中评估两种纳米乳液-辅助的疫苗(实施例13)。评估的两种制剂包括W₈₀5EC和W₈₀P₁₈₈5EC(1:1:5)(见下面表5和6)。棉鼠接收两种剂量的30μl IN的纳米乳液-辅助的疫苗，其含有6.6μg F-ptn。它们在23周时被5×10⁵pfu RSV毒株A2攻击。一半动物在第4天被处死，而另一半在第8天被处死。

图19：显示棉鼠中W₈₀P1885EC纳米乳液灭活的RSV疫苗的免疫原性研究的结果。在左图中，Y轴显示特异性抗体对F蛋白质的终点滴度，和X轴以周为单位显示时间段。在右图中，Y-轴显示血清抗体水平，为μg/ml，和X-轴以周为单位显示时间段。D4和D8显示攻击后血清中的抗体水平。

图20：显示棉鼠中W₈₀₅EC纳米乳液灭活的RSV疫苗的免疫原性研究的结果。Y轴显示特异性抗体对F蛋白质的终点滴度，和X轴以周为单位显示时间段。

图21：显示棉鼠中RSV中和的免疫原性。棉鼠被经鼻内接种30μl疫苗，在4周时加强和在0、4、6和8周时抽血。研究组包括两组，其接收混合以1.6×10⁵PFURSV毒株L19——含3.3μg F蛋白质(n＝8)——或3.2×10⁵PFU RSV毒株L19——含6.6μg F蛋白质(n＝8)20％W₈₀5EC纳米乳液，以及这样的两组，其接收混合以1.6×10⁵PFU RSV毒株L19——含3.3μg F蛋白质(n＝8)——或3.2×10⁵PFU RSV毒株L19——含6.6μg F蛋白质(n＝8)的20％W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液。中和单位(NEU)表示导致50％空斑减少的最高稀释度的倒数。NEU测量在4周(加强前)和6周(加强后2周)时进行。在6周时获得的样本产生的体液免疫应答足以允许进行NEU分析。数据表示为几何平均值，具有95％置信区间(CI)(图21A)。利用施佩尔曼秩相关系数在6周时对所有动物进行EU和NEU相关。

图22：显示第4天和第8天的中和抗体。图22A显示W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，和图22B显示W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。所有棉鼠均显示针对疫苗RSV毒株L19的高中和抗体(NU)。中和抗体在攻击后稳定增加(Y轴)。第8天中和单位(NU)高于第4天NU。未接种小鼠在其血清中不显示任何中和活性。

图23：显示血清抗体的特异性活性，当与攻击后第4天相比时，显示血清抗体的特异性活性(中和单位/ELISA单位)趋于在第8天提高。图23A显示在第4天和第8天，W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果(NU/EU，Y轴)。图23B显示在第4天和第8天，W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果(NU/EU，Y轴)。

图24：显示接收3剂量的RSV L19辅助的疫苗，然后被RSV毒株A2攻击的棉鼠在第4天的交叉保护。图24A显示W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，和图24B显示W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。血清中和活性显示针对RSV毒株L19或RSV毒株A2相当的NU，表明两个RSV毒株之间的交叉保护。

图25：显示第4天在棉鼠肺中的病毒清除(RSV毒株A2)。接种的棉鼠(接种W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19或W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19)显示从棉鼠肺中完成清除RSV毒株A2激发的病毒。未接种动物的肺显示>10³pfuRSV毒株A2/克。

图26：显示IM棉鼠接种和攻击时间表。

图27：显示IM接种混合1.6×10⁵PFU RSV毒株L19——含3.3μg F蛋白质——的20％W₈₀5EC纳米乳液的棉鼠中的血清免疫应答。Y轴显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的血清IgG，μg/mL。

图28：显示IM接种混合1.6×10⁵PFU RSV毒株L19——含3.3μg F蛋白质——的20％W₈₀5EC纳米乳液的棉鼠中的血清免疫应答。图28A显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的终点滴度(Y轴)。图28B显示14周周期内在攻击后第4天和攻击后第8天的ELISA单位(Y轴)。

图29：显示IM接种的棉鼠，与未接种动物相比，其在攻击后4天显示完全清除RSV4。显示第4天在棉鼠肺中的病毒清除(RSV毒株A2)。IM接种的棉鼠(接种W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19)显示从棉鼠肺中完全清除RSV毒株A2激发的病毒。未接种动物显示肺的10³pfu RSV毒株A2或更高/克。

图30：显示IM或IN接种RSV疫苗——含2×10⁵空斑形成单位(PFU)的L19RSV病毒——和由20％W₈₀5EC纳米乳液佐剂灭活的1.7μg的F蛋白质的小鼠在8周周期(X轴)内的抗-F抗体(Y轴)的测量结果。BALB/C小鼠(n＝10/臂)在第0和4周被IN或IM接种。分析血清的抗-F抗体。

图31：显示RSV-特异性细胞因子的测量结果。在BALB/C小鼠(n＝10/臂)在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗——含2×10⁵空斑形成单位(PFU)的L19RSV病毒——和由20％W₈₀5EC纳米乳液佐剂灭活的1.7μg的F蛋白质后，在来自脾、子宫颈和肠淋巴结(LN)细胞中测量细胞因子。被测量的细胞因子包括IFNg、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-17。

图32：显示在BALB/C小鼠(n＝10/臂)在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗——含2×10⁵空斑形成单位(PFU)的L19RSV病毒——和由20％W₈₀5EC纳米乳液佐剂灭活的1.7μg的F蛋白质后，肺组织中细胞因子IL-4、IL-13和IL-17的测量结果。在IM施用后，IL-4和IL-13显示较高的表达，其中IL-17在IN施用后显示较高的表达。

图33：显示在BALB/C小鼠(n＝10/臂)在第0和4周IN或IM接种RSV疫苗——含2×10⁵空斑形成单位(PFU)的L19RSV病毒——和1.7μg F蛋白质后，小鼠中气道阻力(cm H₂0/mL/sec)的测量结果。

发明描述

I.概述

本发明提供RSV表面抗原、F和G蛋白质混合纳米乳液的新制剂，以解决在RSV疫苗的之前的数据中观察到的不足的免疫应答。针对RSV的最佳疫苗不仅要预防急性病毒感染，而且还要预防再感染。

纳米乳液RSV亚单位疫苗包括至少一种RSV免疫原，其是RSV F蛋白质、RSV G蛋白质、RSV F蛋白质的免疫原性片段、RSV G蛋白质的免疫原性片段、或其任意组合。另外，纳米乳液RSV亚单位疫苗包括纳米乳液小滴，其平均直径小于约1000nm。优选地，RSV免疫原存在于纳米乳液小滴中。在本发明的另外实施方式中，RSV病毒体颗粒还存在于纳米乳液RSV亚单位疫苗中。优选地，RSV病毒体颗粒存在于纳米乳液小滴中。

本发明提供新方法，其通过组合关键免疫原性RSV病毒表面抗原、F和/或G蛋白质与递送型和免疫增强型水包油纳米乳液，递送和引起针对RSV感染的保护性免疫应答。分离的RSV病毒表面抗原——显示为独立于其它病毒成分，诸如病毒蛋白质NS1，的主要病毒免疫原——可使导致疾病加重的免疫应答偏移，其是亚单位疫苗的重要基础。进一步，混合一种或多种RSV表面抗原与纳米乳液加强本发明的新颖性，其中所述纳米乳液优先封装抗原和充当适当的免疫细胞的递送系统而且还充当有效的免疫增强型组分。与其它亚单位疫苗和结果缺乏全功能的人疫苗的重组疫苗相比，纳米乳液RSV亚单位病毒表面抗原提供相比于之前的候选物在产生强的、可持续和保护性免疫应答的能力方面明显的新颖性。

对RSV的增强的免疫性的引发取决于最佳水平的抗原的存在和呈递。组合分离的RSV表面抗原与纳米乳液提供新的方法，以将疫苗递送至免疫应答的合适的抗原呈递细胞。

本发明纳米乳液组合物用作疫苗佐剂。佐剂用于：(1)使抗原—刺激特异性保护性免疫应答的物质—与免疫系统接触和影响产生的免疫的类型以及免疫应答的质量(量级或持续时间)；(2)降低某些抗原的毒性；(3)降低保护性应答所需的抗原的量；(4)降低保护所需要的剂量数；(5)增强差的响应亚群的免疫性和/或(7)提供一些疫苗成分的溶解度。

在一个实施方式中，可利用衍生自RSV和与纳米乳液混合的表面抗原F和G蛋白质构建多价亚单位疫苗。

在另外的实施方式中，衍生物和融合蛋白质可自RSV表面抗原F和G蛋白质设计，然后与纳米乳液混合以产生亚单位疫苗。

在一个实施方式中，亚单位疫苗可用一种或多种RSV表面抗原——即，F和G蛋白质——混合纳米乳液构建。完全有可能使F和G蛋白质一起加入并与纳米乳液混合在所得亚单位疫苗组合物中。在另外的实施方式中，混合纳米乳液的F或G蛋白质是根据本发明的合适的亚单位疫苗。F和/或G蛋白质的抗原片段也可用于本发明的纳米乳液RSV疫苗中。

纳米乳液是水包油乳液，其由纳米尺寸的小滴与油-水界面处的表面活性剂(一种或多种)组成。由于其尺寸，纳米乳液小滴被树突细胞胞饮，所述树突细胞控制细胞成熟和对免疫系统有效抗原呈递。当混合不同的抗原时，纳米乳液佐剂引起并上调强的体液和细胞T_H1-型应答以及黏膜免疫性(Makidon等,“Pre ClinicalEvaluation of a Novel Nanoemulsion-Based Hepatitis B Mucosal Vaccine”,PLoS ONE.3(8):2954；1-15(2008)；Hamouda等,“A Novel Nanoemulsion Adjuvant Enhancing TheImmune Response from Intranasal Influenza Vaccine in Mice in National Foundationfor Infectious Disease”,11th Annual Conference on Vaccine Research.Baltimore,MD(2008)；Myc等,“Development of immune response that protects mice from viralpneumonitis after a single intranasal immunization with influenza A virus andnanoemulsion”,Vaccine,21(25-26):3801-14(2003)；Bielinska等,“MucosalImmunization with a Novel Nanoemulsion-Based Recombinant Anthrax ProtectiveAntigen Vaccine Protects against Bacillus anthracis Spore Challenge”,Infect Immun.,75(8):4020-9(2007)；Bielinska等,“Nasal Immunization with a Recombinant HIVgp120and Nanoemulsion Adjuvant Produces Th1Polarized Responses and NeutralizingAntibodies to Primary HIV Type1Isolates,”AIDS Research and Human Retroviruses,24(2):271-81(2008)；Bielinska等,“A Novel,Killed-Virus Nasal Vaccinia VirusVaccine,”Clin.Vaccine Immunol.,15(2):348-58(2008)；Warren等,“Pharmacologicaland Toxicological Studies on Cetylpyridinium,A New Germicide,”J.Pharmacol.Exp.Ther.,74:401-8)(1942))。这样的抗原的实例包括炭疽病(Bielinska等,Infect.Immun.,75(8):4020-9(2007))、全牛痘病毒(Bielinska等,Clin.Vaccine Immunol.,15(2):348-58(2008))或人免疫缺陷病毒的gp120蛋白质(Bielinska等,AIDS Research andHuman Retroviruses.24(2):271-81(2008))的保护性抗原(PA)。这些研究表明纳米乳液佐剂与各种抗原——包括RSV抗原——的广泛应用。

在本发明的一个实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括平均直径小于约1000nm的小滴和：(a)含水相；(b)约1％油至约80％油；(c)约0.1％至约50％有机溶剂；(d)约0.001％至约10％的表面活性剂或洗涤剂；或(e)其任意组合。在本发明的另外实施方式中，纳米乳液疫苗包括：(a)含水相；(b)约1％油至约80％油；(c)约0.1％至约50％有机溶剂；(d)约0.001％至约10％的表面活性剂或洗涤剂；和(e)RSV的F和G表面抗原或其免疫原性片段。在本发明的另外实施方式中，纳米乳液不含有机溶剂。

纳米乳液和/或纳米乳液疫苗中存在的每种组分的量涉及治疗性纳米乳液和/或纳米乳液RSV疫苗。

方法包括给对象施用纳米乳液RSV疫苗，其中纳米乳液疫苗包括平均直径小于约1000nm的小滴。在本发明的示例性实施方式中，纳米乳液RSV疫苗还包括(a)含水相，(b)至少一种油，(c)至少一种表面活性剂，(d)至少一种有机溶剂，(e)RSV表面抗原、F和G蛋白质，和(f)任选地包括至少一种螯合剂、或其任意组合。在本发明的另外实施方式中，纳米乳液不含有机溶剂。

在一个实施方式中，对象选自成年人、老年对象、青少年对象、婴儿、高风险对象、孕妇和无免疫应答对象。在另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗可经鼻内施用。

纳米乳液RSV亚单位疫苗组合物可经任意药学上可接受的途径递送，所述途径诸如通过鼻内途径或其它黏膜途径。其它示例性的药学上可接受的方法包括鼻内、口腔、舌下、口、直肠、眼、肠胃外(静脉内、皮内、肌肉内、皮下、脑池内、腹膜内)、肺部、阴道内、局部化(locally)施用、局部(topically)施用、划破后局部施用、黏膜施用、通过气溶胶或通过口腔或鼻喷雾制剂。进一步，纳米乳液RSV疫苗可被配制成任意药学上可接受的剂型，诸如液体分散体、凝胶、气溶胶、肺气溶胶、鼻气溶胶、软膏、霜、半固体剂型、或悬浮体。进一步，纳米乳液RSV疫苗可以是控释制剂、缓释制剂、速释制剂、或其任意组合。进一步，纳米乳液RSV疫苗可以是经皮递送系统，诸如贴剂或经加压或气动装置(即，“基因枪”)施用。

A.RSV毒株L19

在本发明的一个实施方式中，纳米乳液RSV疫苗中利用的RSV毒株是RSV毒株L19。另外，纳米乳液RSV毒株中利用的F和/或G蛋白质或其抗原片段可来自RSV毒株L19。

令人惊讶地发现，与感染RSV A2病毒的细胞相比，感染RSV L19病毒的细胞产生的RSV病毒蛋白质的量高3-11倍之间(见下面实施例6)。在本发明的一个实施方式中，存在于本发明疫苗中的RSV抗原是RSV L19病毒，和更优选地，人RSV L19病毒，包括纯化的减毒人呼吸道合胞病毒(HRSV)毒株L19(HRSV-L19)。在本发明的再另外的实施方式中，RSV病毒基因组可包括至少一个减毒突变，包括但不限于，指示减毒表型的核苷酸修饰。另外，本发明纳米乳液RSV疫苗可包括来自RSV L19病毒的F或G蛋白质、或其抗原片段。

发现RSV L19毒株在小鼠中引起感染和加重的呼吸疾病(ERD)。而且公布的数据显示其在用纳米乳液配制时给予保护而不在小鼠中引起ERD。

RSV毒株L19分离菌于1967年1月3日，在Ann Arbor,Michigan，分离自患有呼吸疾病的RSV-感染的婴儿的WI-38细胞，并在SPAFAS原发性鸡肾细胞中传代，然后在SPAFAS原发性鸡肺细胞中传代，然后转移到MRC-5细胞(Herlocher1999)，随后转移到Hep2细胞(Lukacs2006)。RSV L19基因组(15,191-nt；基因库登录号FJ614813)与RSV毒株A2(15,222-nt；基因库登录号M74568)的比较显示，98％的基因组是一致的。L19和A2之间的大部分编码差异是在F和G基因中。两个毒株的氨基酸比对显示，F蛋白质具有14个(97％一致)而G蛋白质具有20个(93％一致)氨基酸差异。

RSV L19毒株已经在动物模型中被证明通过刺激黏液产生和利用1×10⁵空斑形成单位(PFU)/小鼠的接种物经气管内施用明显引起IL-13而模拟人感染(Lukacs2006)。

重要的而且独特的是，RSV L19病毒毒株是独特的，在于其比其它毒株产生明显更高产量的F蛋白质(每PFU多大约10-30倍)。F蛋白质含量可能是免疫原性的关键因子，并且，L19毒株当前引起最强的免疫应答。L19毒株的繁殖时间较短，因而从制造的角度来看将更有效。

最明显地，纳米乳液灭活的和辅助的RSV L19疫苗在普遍接受的棉鼠模型中是高度免疫原性的。棉鼠在一次免疫后引起抗体滴度升高，并在第二次免疫后引起明显加强(增加大约10倍)。产生的抗体在中和活病毒中是高度有效的，并且在中和和抗体滴度之间存在线性关系。而且，在棉鼠中产生的抗体在经RSV L19毒株免疫和被RSV A2毒株攻击时显示交叉保护。IM和IN免疫均建立记忆，其在暴露于作为第二次加强的抗原或暴露于活病毒之后可被提出或回忆。

在本发明的另外实施方式中，本发明RSV疫苗针对至少一种不存在于疫苗中的其它RSV毒株是交叉反应性的(或针对一种或多种RSV毒株是交叉反应性的)。如本领域的普通技术人员所知道的，交叉反应性可通过如下方式测量1)利用ELISA方法来观察接种动物或个体的血清是否将产生针对施用的疫苗中未使用的毒株的抗体；2)当利用施用的疫苗中未使用的毒株进行体外刺激时，免疫细胞将产生细胞因子。当接种一种毒株的动物血清中的抗体将中和施用的疫苗中未使用的另外的病毒的传染性时，可在体外测量交叉保护。

II.定义

如本文中所用的，“约”将被本领域的普通技术人员理解，并将根据其使用的上下文而在一定程度上有所变化。如果存在本领域的普通技术人员考虑到其使用的上下文而不清楚的术语的应用，“约”将意为上至加或减该具体术语的10％。

术语RSV表面抗原的“抗原片段”优选指天然产生的或突变RSV F蛋白质或RSV G蛋白质的具有至少约5个连续氨基酸的肽。抗原片段可以是任意合适的长度，诸如在长度约5个氨基酸上至并包括全长F或G蛋白质之间。F蛋白质长度约为518个氨基酸和G蛋白质长度约为242个氨基酸。例如，抗原片段长度也可以是约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110等上至约242个氨基酸——对于G蛋白质抗原片段，和上至长度约518个氨基酸——对于F蛋白质抗原片段。

如本文中所用的，术语“纳米乳液”包括小的水包油分散体或小滴以及其它脂质结构，脂质结构由于疏水性作用力而形成，该疏水性作用力在水不可混容的油相与含水相混合时远离水驱使非极性残基(即，长烃链)和朝向水驱使极性首基。这些其它脂质结构包括、但不限于，单层、稀少层(paucilamellar)和多层脂泡、微囊和层状相。本发明考虑，本领域的技术人员在有必要理解本文公开的具体实施方式时将理解该区别。

如本文中所用的，术语“抗原”是指可含有一个或多个能引起免疫应答的表位(线性、构象、连续的、T-细胞)的蛋白质、多肽、糖蛋白或衍生物或片段。抗原可被分成分离的病毒蛋白质或肽衍生物。

如本文中所用的，术语“F蛋白质”是指多肽或蛋白质，其具有RSV融合蛋白质的部分或全部氨基酸序列。如本文中所用的，F蛋白质包括F1、F2或RSV融合蛋白质/多肽的两个组分。

如本文中所用的，术语“G蛋白质”是指多肽或蛋白质，其具有RSV G吸附蛋白质/多肽的部分或全部氨基酸序列。

如本文中所用的，术语“分离的”是指独立于其自然位置的蛋白质、糖蛋白、肽衍生物或片段或多核苷酸。通过重组遗传学手段独立地获得的病毒组分通常导致相对纯化的产物。

如本文中所用的，术语“佐剂”是指这样的剂，其提高对抗原(例如，RSV表面抗原)的免疫应答。如本文中所使用的，术语“免疫应答”是指对象(例如，人或其它动物)的免疫系统对对象免疫系统识别为外源的免疫原(即，抗原)的响应。免疫应答包括细胞介导的免疫应答(由抗原-特异性T细胞和免疫系统的非特异性细胞——Th1、Th2、Th17——介导的应答)和体液免疫应答(由抗体介导的应答)。术语“免疫应答”包括最初的对免疫原(例如，RSV表面抗原)的“先天免疫应答”以及由于“获得免疫性”而造成的记忆应答。

如本文中所用的，术语“RSV表面抗原”是指衍生自RSV病毒被膜的蛋白质、糖蛋白和肽片段。优选RSV表面抗原是F和G蛋白质。RSV表面抗原通常通过感染的细胞培养物提取自病毒分离物，或通过合成或利用重组DNA方法产生。RSV表面抗原可通过导致融合蛋白质、肽或片段的化学、遗传或酶手段修饰。

如本文中所用的，术语“免疫原”是指这样的抗原，其能够在对象中引起免疫应答。在优选实施方式中，在与本发明纳米乳液组合施用时，免疫原引起针对免疫原(例如，病原体或病原体产物)的免疫性。

如本文中所用的，术语“增强的免疫性”是指相对于未施用本发明疫苗时的获得免疫性水平，在施用本发明疫苗后对给定病原体的获得免疫性水平提高。

如本文中所用的，术语“病毒体”是指分离的、成熟的呼吸道合胞病毒颗粒，其获自感染的哺乳动物细胞培养物。如本文中所用的，病毒体可指RSV-1或RSV-病毒颗粒。

如本文中所用的，术语“多价疫苗”是指这样的疫苗，其包括单一病毒剂或多个毒株的一个以上的抗原决定簇。如本文中所用的，多价疫苗包括多个RSV病毒表面抗原，F、F1、F2和G蛋白质。多价疫苗可用衍生自RSV-1和RSV-2的抗原构建。

如本文中所用的，术语“灭活的”RSV是指这样的病毒体颗粒，其不能感染宿主细胞，并且在有关动物模型中是没有传染性的。

如本文中所用的，术语“亚单位”是指分离的和通常纯化的RSV糖蛋白，其是独立的，或进一步与包含纳米乳液的疫苗组合物混合。亚单位疫苗组合物不含成熟病毒体、细胞或细胞或病毒体的溶胞产物。获得包括在亚单位疫苗中的病毒表面抗原的方法可利用标准重组遗传学技术和合成方法以及标准纯化方案执行。

III.纳米乳液RSV疫苗的特点

A.稳定性

本发明纳米乳液RSV疫苗可在约40℃和约75％相对湿度稳定至少多至约2天、至少多至约2周、至少多至约1个月、至少多至约3个月、至少多至约6个月、至少多至约12个月、至少多至约18个月、至少多至约2年、至少多至约2.5年或至少上多约3年的时间段。

在本发明的另外实施方式中，本发明纳米乳液RSV疫苗可在约25℃和约60％相对湿度稳定至少多至约2天、至少多至约2周、至约1个月、至少多至约3个月、至少多至约6个月、至少多至约12个月、至少多至约18个月、至少多至约2年、至少多至约2.5年或至少多至约3年、至少多至约3.5年、至少多至约4年、至少多至约4.5年或至少多至约5年的时间段。

进一步，本发明纳米乳液RSV疫苗在约4℃稳定至少多至约1个月、至少多至约3个月、至少多至约6个月、至少多至约12个月、至少多至约18个月、至少多至约2年、至少多至约2.5年、至少多至约3年、至少多至约3.5年、至少多至约4年、至少多至约4.5年、至少多至约5年、至少多至约5.5年、至少多至约6年、至少多至约6.5年或至少多至约7年的时间段。

本发明纳米乳液RSV疫苗可在约-20℃稳定至少多至约1个月、至少多至约3个月、至少多至约6个月、至少多至约12个月、至少多至约18个月、至少多至约2年、至少多至约2.5年、至少多至约3年、至少多至约3.5年、至少多至约4年、至少多至约4.5年、至少多至约5年、至少多至约5.5年、至少多至约6年、至少多至约6.5年或至少多至约7年的时间段。

这些稳定性参数也适用于纳米乳液佐剂和/或纳米乳液RSV疫苗。

B.免疫应答

对象的免疫应答可在施用纳米乳液RSV疫苗之后，通过测定针对RSV免疫原的抗体的滴度和/或存在而测量，以评价对免疫原的体液响应。血清转换是指针对免疫原的特异性抗体的形成，并可用于评价保护性免疫应答的存在。这样的基于抗体的检测常常利用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附(ELISA)试验或血凝抑制试验(HAI)测量。本领域的技术人员将容易选择和利用适当的检测方法。

确定对象的免疫应答的另外的方法是确定细胞免疫应答，诸如通过免疫原-特异性细胞应答，诸如细胞毒性T淋巴细胞或免疫原-特异性淋巴细胞增殖试验。另外，经病原体进行攻击可用于在对象中或更可能地在动物模型中确定免疫应答。本领域的技术人员会掌握确定对象免疫应答的方法，并且，本发明不限于任意具体方法。

在开发本发明过程中进行的试验表明，加入到乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和经鼻内施用的纳米乳液是安全且有效的乙型肝炎疫苗。黏膜疫苗诱导Th1相关的细胞免疫应答，同时伴随中和抗体产生。HBsAg纳米乳液混合物的单一鼻免疫产生血清抗体的快速诱导——相当于当前施用的肌肉内疫苗。进一步，表明在抗体应答中存在亲和力成熟，其可预测疫苗的潜在功效(Makidon等,2008)。

最明显地，如在下面实施例中详细阐述的，配制在纳米乳液中并经鼻内(IN)或肌肉内(IM)施用的所有RSV疫苗均引起预防免疫动物感染的保护性免疫应答。而且，纳米乳液-灭活的和辅助的RSV疫苗在普遍接受的棉鼠模型中是高度免疫原性的。棉鼠在一次免疫后引起抗体滴度增加和在第二次免疫后引起明显加强(大约增加10倍)。产生的抗体在中和活病毒方面是高度有效的，并且，在中和和抗体滴度之间存在线性关系。而且，在棉鼠中产生的抗体在经RSV L19毒株免疫和被RSV A2毒株攻击时显示交叉保护。IM和IN免疫均建立记忆，其在暴露于作为第二次加强的抗原或暴露于活病毒之后可被提出或回忆。

疫苗保护功效的另外出现的构成是对T-辅助-17(Th17)细胞因子应答的诱导。对于IL-17有助于对病原体的正常免疫应答的证明已经被进一步用于显示接种策略中的相关性(DeLyrica等,2009；Conti等,2009)。在开发本发明过程中，用纳米乳液进行黏膜免疫在激活Th1和Th17免疫性中可产生辅助作用。用纳米乳液进行黏膜免疫导致先天免疫失活，所述先天免疫直接帮助诱导Th1和Th17细胞。结果进一步阐明纳米乳液的免疫增强特征，在接种领域中对于针对灭活RSV病毒体的细胞免疫性的诱导是重要的(Bielinska等,2010；Lindell等,2011)。

C.病毒灭活

疫苗需要包括灭活的病毒，尤其在疫苗包括全病毒的情况下，例如确保疫苗不引起其正在治疗和/或预防的疾病。换言之，灭活病毒确保疫苗不包括有传染性的颗粒。方法已经包括用福尔马林灭活病毒。然而，福尔马林-灭活的疫苗已经显示疾病加重，包括显示对预防疾病加重重要的偏移的免疫应答和被成熟的树突细胞引发，其对于保护性免疫应答是必要的。减毒活疫苗的应用已经取得有限的成功，因为疫苗已经被显示是最小免疫原性的。

在本发明方法和组合物中，纳米乳液用于灭活和辅助全病毒和/或病毒抗原，以提供非感染和免疫原性病毒。可选地，病毒(全部或抗原)可在与纳米乳液组合前被灭活。病毒灭活的化学方法包括、但不限于，福尔马林或β-丙酸内酯(β-PL)，病毒灭活的物理方法包括利用热或辐射或通过分子遗传学手段来产生非感染颗粒。已经显示简单混合纳米乳液与候选疫苗同时产生黏膜和系统免疫应答。RSV病毒体颗粒与纳米乳液的混合导致小滴的油核心中离散的抗原颗粒。抗原结合到核心中，这使其处于促进正常抗原构象的自由形式中。

IV.纳米乳液RSV疫苗

A.RSV免疫原

存在于本发明纳米乳液RSV疫苗中的RSV免疫原是RSV表面抗原，诸如F蛋白质、G蛋白质和/或其抗原片段。F蛋白质、G蛋白质和其抗原片段可获自任意已知的RSV毒株。另外，RSV疫苗可包括全RSV病毒，包括RSV的天然、重组和突变毒株，其组合一种或多种RSV抗原。在本发明的一个实施方式中，RSV病毒可抵抗一种或多种抗病毒药物，诸如抵抗无环鸟苷。任何已知RSV毒株均可用于本发明疫苗。纳米乳液RSV疫苗可包括来自一个以上RSV毒株的RSV全病毒以及来自一个以上RSV毒株的RSV抗原。

有用的RSV毒株的实例包括、但不限于，任意RSV毒株，包括亚组A和B基因型以及以保藏在ATCC的RSV毒株，诸如：(1)人RSV毒株A2，ATCC保藏号VR-1540；(2)人RSV毒株长(Long)，ATCC保藏号VR-26；(3)牛RSV毒株A51908，ATCC保藏号VR-794；(4)人RSV毒株9320，ATCC保藏号VR-955；(5)牛RSV毒株375，ATCC保藏号VR-1339；(6)人RSV毒株B WV/14617/85，ATCC保藏号VR-1400；(7)牛RSV毒株Iowa(FS1-1)，ATCC保藏号VR-1485；(8)山羊RSV毒株GRSV，ATCC保藏号VR-1486；(9)人RSV毒株18537，ATCC保藏号VR-1580；(10)人RSV毒株A2，ATCC保藏号VR-1540P；(11)人RSV突变毒株A2cpts-248，ATCC保藏号VR-2450；(12)人RSV突变毒株A2cpts-530/1009，ATCC保藏号VR-2451；(13)人RSV突变毒株A2cpts-530，ATCC保藏号VR-2452；(14)人RSV突变毒株A2cpts-248/955，ATCC保藏号VR-2453；(15)人RSV突变毒株A2cpts-248/404，ATCC保藏号VR-2454；(16)人RSV突变毒株A2cpts-530/1030，ATCC保藏号VR-2455；(17)RSV突变毒株亚组B cp23克隆1A2，ATCC保藏号VR-2579；和(18)人RSV突变毒株亚组B，毒株B1，cp52克隆2B5，ATCC保藏号VR-2542。

任意合适量的RSV免疫原均可用于本发明纳米乳液RSV疫苗。例如，纳米乳液RSV疫苗可包括小于约100μg的RSV免疫原(总RSV免疫原，而不是每一RSV免疫原)。在本发明的另外实施方式中，纳米乳液RSV疫苗可包括小于约90μg、小于约80μg、小于约70μg、小于约60μg、小于约50μg、小于约40μg、小于约30μg、小于约20μg、小于约15μg、小于约10μg、小于约9μg、小于约8μg、小于约7μg、小于约6μg、小于约5μg、小于约4μg、小于约3μg、小于约2μg、或小于约1μg的RSV免疫原(总RSV免疫原，而不是每一RSV免疫原)。

在本发明的另外实施方式中，本发明RSV疫苗包括约1.0×10⁵pfu(空斑形成单位(pfu)多至约1.0×10⁸pfu以及其间的任意量的RSV病毒或抗原。RSV病毒或抗原通过纳米乳液佐剂的存在而被灭活。例如，RSV疫苗可包括约1.0×10⁵、1.1×10⁵、1.2×10⁵、1.3×10⁵、1.4×10⁵、1.5×10⁵、1.6×10⁵、1.7×10⁵、1.8×10⁵、1.9×10⁵、2.0×10⁵、2.1×10⁵、2.2×10⁵、2.3×10⁵、2.4×10⁵、2.5×10⁵、2.6×10⁵、2.7×10⁵、2.8×10⁵、2.9×10⁵、3.0×10⁵、3.1×10⁵、3.2×10⁵、3.3×10⁵、3.4×10⁵、3.5×10⁵、3.6×10⁵、3.7×10⁵、3.8×10⁵、3.9×10⁵、4.0×10⁵、4.1×10⁵、4.2×10⁵、4.3×10⁵、4.4×10⁵、4.5×10⁵、4.6×10⁵、4.7×10⁵、4.8×10⁵、4.9×10⁵、5.0×10⁵、5.5×10⁵、6.0×10⁵、6.5×10⁵、7.0×10⁵、7.5×10⁵、8.0×10⁵、8.5×10⁵、9.0×10⁵、9.5×10⁵、1.0×10⁶、1.5×10⁶、2.0×10⁶、2.5×10⁶、3.0×10⁶、3.5×10⁶、4.0×10⁶、4.5×10⁶、5.0×10⁶、5.5×10⁶、6.0×10⁶、6.5×10⁶、7.0×10⁶、7.5×10⁶、8.0×10⁶、8.5×10⁶、9.0×10⁶、9.5×10⁶、1.0×10⁷、1.5×10⁷、2.0×10⁷、2.5×10⁷、3.0×10⁷、3.5×10⁷、4.0×10⁷、4.5×10⁷、5.0×10⁷、5.5×10⁷、6.0×10⁷、6.5×10⁷、7.0×10⁷、7.5×10⁷、8.0×10⁷、8.5×10⁷、9.0×10⁷、9.5×10⁷、1.0×10⁸pfu的RSV病毒。

在本发明的一个实施方式中，RSV疫苗包括RSV毒株的F和/或G蛋白质，诸如但不限于RSV毒株L19的F和/或G蛋白质。在另外的实施方式中，RSV疫苗包括约0.1μg多至约100μg以及其间的任意量的RSV F和/或G蛋白质，诸如RSV毒株L19的F和/或G蛋白质。例如，RSV疫苗可包括约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1.0μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、约3.0μg、约3.1μg、约3.2μg、约3.3μg、约3.4μg、约3.5μg、约3.6μg、约3.7μg、约3.8μg、约3.9μg、约4.0μg、约4.1μg、约4.2μg、约4.3μg、约4.4μg、约4.5μg、约4.6μg、约4.7μg、约4.8μg、约4.9μg、约5.0μg、约5.1μg、约5.2μg、约5.3μg、约5.4μg、约5.5μg、约5.6μg、约5.7μg、约5.8μg、约5.9μg、约6.0μg、约6.1μg、约6.2μg、约6.3μg、约6.4μg、约6.5μg、约6.6μg、约6.7μg、约6.8μg、约6.9μg、约7.0μg、约7.5μg、约8.0μg、约8.5μg、约9.0μg、约9.5μg、约10.0μg、约10.5μg、约11.0μg、约11.5μg、约12.0μg、约12.5μg、约13.0μg、约13.5μg、约14.0μg、约14.5μg、约15.0μg、约15.5μg、约16.0μg、约16.5μg、约17.0μg、约17.5μg、约18.0μg、约18.5μg、约19.0μg、约19.5μg、约20.0μg、约21.0μg、约22.0μg、约23.0μg、约24.0μg、约25.0μg、约26.0μg、约27.0μg、约28.0μg、约29.0μg、约30.0μg、约35.0μg、约40.0μg、约45.0μg、约50.0μg、约55.0μg、约60.0μg、约65.0μg、约70.0μg、约75.0μg、约80.0μg、约85.0μg、约90.0μg、约95.0μg或约100.0μg的RSV F蛋白质，诸如RSV毒株L19的F蛋白质。

存在于本发明疫苗中的RSV免疫原可以是(1)RSV F蛋白质；(2)RSV G蛋白质；(3)RSV F蛋白质的免疫原性片段；(4)RSV G蛋白质的免疫原性片段；(5)RSVF蛋白质的衍生物；(6)RSV G蛋白质的衍生物；(7)融合蛋白质，包括RSV F蛋白质或RSV F蛋白质的免疫原性片段；(8)融合蛋白质，包括RSV G蛋白质或RSVG蛋白质的免疫原性片段；(9)或其任意组合。优选地，本发明RSV疫苗包括至少一种F蛋白质免疫原和至少一种G蛋白质免疫原。

在本发明的实施方式中，G蛋白质的免疫原性片段包括RSV G蛋白质的至少4个连续氨基酸。在其它实施方式中，RSV G蛋白质片段包括约4、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约280、约285、约289、约290、约295或约299个连续的RSV G蛋白质的氨基酸。RSV G糖蛋白具有约289至约299个氨基酸(取决于病毒毒株)。保守氨基酸取代可在G免疫原性蛋白质片段中进行，以产生G蛋白质衍生物。

在本发明的另外实施方式中，F蛋白质的免疫原性片段包括RSV F蛋白质的至少4个连续氨基酸。在其它实施方式中，RSV F蛋白质片段包括约4、约5、约10、约15、约20、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475或约500个连续的RSV F蛋白质的氨基酸。保守氨基酸取代可在F免疫原性蛋白质片段中进行，以产生F蛋白质衍生物。

在一些实施方式中，F蛋白质衍生物是免疫原性的，其与F蛋白质具有选自下列的％同一性：99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、或50％。在一些实施方式中，G蛋白质衍生物是免疫原性的，并且与G蛋白质具有选自下列的％同一性：99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、或50％。

在一个实施方式中，疫苗组合物将由分离的病毒表面抗原、F和G蛋白质组合分离的全RSV病毒体颗粒构建，所述病毒颗粒与优选的水包油纳米乳液混合在一起。

B.纳米乳液

1.小滴尺寸

本发明纳米乳液RSV疫苗包括的小滴的平均直径尺寸为小于约1,000nm、小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约220nm、小于约210nm、小于约205nm、小于约200nm、小于约195nm、小于约190nm、小于约175nm、小于约150nm、小于约100nm、大于约50nm、大于约70nm、大于约125nm或其任意组合。在一个实施方式中，小滴的平均直径尺寸大于约125nm并小于或等于约600nm。在不同的实施方式中，小滴的平均直径尺寸大于约50nm或大于约70nm并且小于或等于约125nm。

2.含水相

含水相可包括任意类型的含水相，包括但不限于，水(例如，H₂O、蒸馏水、纯化水、注射用水、去离子水、自来水)和溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)。在某些实施方式中，含水相包括水，其pH为约4至10，优选地，约6至8。水可以去离子化(下文称为“DiH₂O”)。在一些实施方式中，含水相包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。含水相可进一步是消毒的和无热原的。

3.有机溶剂

本发明纳米乳液RSV疫苗中的有机溶剂包括、但不限于，C₁-C₁₂醇、二醇、三醇、二烷基磷酸盐、三烷基磷酸盐，诸如三-正-丁基磷酸盐、其半合成衍生物及其组合。在本发明的一个方面中，有机溶剂是醇，其选自非极性溶剂、极性溶剂、质子溶剂或非质子溶剂。

适于纳米乳液RSV疫苗的有机溶剂包括、但不限于，乙醇、甲醇、异丙醇、丙醇、辛醇、甘油、中链甘油三酯、二乙基醚、乙基醚、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸、正-丁醇、丁二醇、香料醇、异丙醇、正-丙醇、甲酸、丙二醇、山梨醇、工业甲基化酒精、三醋汀、己烷、苯、甲苯、二乙基醚、氯仿、1,4-二烷、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酸、聚乙二醇、有机磷酸盐基溶剂、其半合成衍生物、和其任意组合。

4.油相

本发明纳米乳液RSV疫苗中的油可以是任意美容或药学上可接受的油。油可以是挥发性的或非挥发性的，并可选自动物油、植物油、天然油、合成油、烃油、硅油、其半合成衍生物及其组合。

合适的油包括、但不限于，矿物油、角鲨烯油、调味油、硅油、精油、水不溶性维生素、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、辛基棕榈酸酯、鲸蜡基棕榈酸酯、十三烷基山嵛酸酯、二异丙基己二酸酯、二辛基癸二酸酯、邻氨基苯甲酸薄荷酯、鲸蜡基辛酸酯、辛基水杨酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、新戊二醇鲸蜡醇二癸酸酯、癸基油酸酯、二异丙基己二酸酯、C_12-15烷基乳酸酯、鲸蜡基乳酸酯、月桂基乳酸酯、异硬脂酰新戊酸酯、肉豆蔻基乳酸酯、异鲸蜡基硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯、烃油、异链烷烃、液体石蜡、异十二烷、矿脂、Argan油、油菜油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、葡萄籽油、芥末油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、松子油、罂粟子油、南瓜子油、米糠油、红花油、茶油、松露油、植物油、杏(仁)油、霍霍巴油(油蜡树(simmondsiachinensis)籽油)、葡萄籽油、澳洲胡桃(Macadamia)油、小麦胚芽油、杏树油、油菜籽油、葫芦油、大豆油、芝麻油、榛子油、玉米油、向日葵油、麻油、木香(Bois)油、夏威夷果(Kuki nut)油、鳄梨油、胡桃油、鱼油、浆果油、众香子(allspice)油、刺柏油、种子油、杏仁油、茴芹子油、芹菜子油、孜然子油、肉豆蔻种子油、叶油、罗勒叶油、月桂叶油、肉桂叶油、普通鼠尾草叶油、桉树叶油、柠檬草叶油、白千层油、牛至(oregano)叶油、广藿香叶油、欧薄荷(peppermint)叶油、松针油、迷迭香叶油、薄荷油、茶树叶油、百里香叶油、冬青叶油、花油、春黄菊油、鼠尾草油、丁子香油、天竺葵花油、海索草(hyssop)花油、茉莉花油、熏衣草花油、纤精澳洲茶树油、马郁兰(Marhoram)花油、橙花油、玫瑰花油、衣兰花油、树皮油、山扁豆皮油、肉桂皮油、黄樟皮油、木油、樟木油、雪松木油、蔷薇木油、檀香木油)、根茎(姜)木油、树脂油、乳香油、没药油、果皮油、香柠檬果皮油、葡萄柚果皮油、柠檬果皮油、白柠檬果皮油、橙子果皮油、柑橘果皮油、根油、颉草油、油酸、亚油酸、油醇、异硬脂酰醇、其半合成衍生物及其任意组合。

油还可包括硅氧烷组分，诸如挥发性硅氧烷组分，其可以是硅氧烷组分中的唯一的油或可组合其它硅氧烷和非硅氧烷、挥发性和非挥发性油。合适的硅氧烷组分包括、但不限于，甲基苯基聚硅氧烷、二甲硅油、聚二甲基硅氧烷、苯基聚三甲基硅氧烷(或其有机改性形式)、聚硅氧烷的烷基化衍生物、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、月桂基聚三甲基硅氧烷、聚硅氧烷的羟基化衍生物，诸如聚二甲基硅氧烷醇、挥发性硅油、环状和线性硅氧烷、环甲基硅烷、环甲基硅烷的衍生物、六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、挥发性线性二甲基聚硅氧烷、异十六烷、异二十烷、异二十四烷、聚异丁烯、异辛烷、异十二烷、其半合成衍生物及其组合。

挥发性油可以是有机溶剂，或除了有机溶剂以外还可存在挥发性油。合适的挥发性油包括、但不限于，萜、单萜、倍半萜、驱风剂、甘菊环、薄荷醇、樟脑、苧酮、百里酚、橙花醇、里哪醇、苧烯、牻牛儿醇、紫苏子醇、橙花叔醇、法呢醇、衣兰烯、红没药醇、法呢烯、驱茴萜、藜油、香茅醛、柠檬醛、香茅醇、母菊薁、蓍草、愈创木薁、春黄菊、半合成衍生物、或其组合。

在本发明的一个方面中，硅氧烷组分中的挥发性油不同于油相中的油。

5.表面活性剂

本发明纳米乳液RSV疫苗中的表面活性剂可以是药学上可接受的离子表面活性剂、药学上可接受的非离子表面活性剂、药学上可接受的阳离子表面活性剂、药学上可接受的阴离子表面活性剂或药学上可接受的两性离子表面活性剂。

示例性的有用表面活性剂描述在Applied Surfactants:Principles andApplications.Tharwat F.Tadros,Copyright82005WILEY-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim ISBN:3-527-30629-3)中，其通过引用特别被并入本文。

进一步，表面活性剂可以是药学上可接受的离子聚合表面活性剂、药学上可接受的非离子聚合表面活性剂、药学上可接受的阳离子聚合表面活性剂、药学上可接受的阴离子聚合表面活性剂或药学上可接受的两性离子聚合表面活性剂。聚合表面活性剂的实例包括、但不限于聚(甲基丙烯酸甲酯)骨架与多种(至少一种)聚乙烯氧化物(PEO)侧链的接枝共聚物、多羟基硬脂酸、烷氧基化烷基苯酚甲醛缩合物、聚亚烷基1,2-乙二醇改性的聚酯与脂肪酸疏水物、聚酯、其半合成衍生物或其组合。

表面活性剂是由附着到极性或离子亲水部分的非极性疏水部分组成的两性分子，所述非极性疏水部分通常是含8-18个碳原子的直链或分支的烃或碳氟链。亲水部分可以是非离子的、离子的或两性离子的。烃链与水分子在含水环境中相互反应弱，而极性或离子首基(head group)通过偶极或离子-偶极相互作用与水分子相互反应强。基于亲水基的性质，表面活性剂被分成阴离子、阳离子、两性离子、非离子和聚合表面活性剂。

合适的表面活性剂包括、但不限于，乙氧基化壬基苯酚——包括9至10单位的乙二醇、乙氧基化十一醇——包括8单位的乙二醇、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化氢化蓖麻蛋白(ricin)油、月桂基硫酸钠、环氧乙烷和环氧丙烷的二嵌段共聚物、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物和基于环氧乙烷和环氧丙烷的四官能嵌段共聚物、甘油单酯、甘油癸酸酯、甘油辛酸酯、甘油椰油酸酯(cocate)、甘油芥酸酯(erucate)、甘油羟基硬脂酸酯、甘油异硬脂酸酯、甘油羊毛脂酸酯(lanolate)、甘油月桂酸酯、甘油亚油酸酯、甘油肉豆蔻酸酯、甘油油酸酯、甘油基PABA、甘油棕榈酸酯、甘油蓖麻醇酸酯(ricinoleate)、甘油硬脂酸酯、甘油基thiglycolate、甘油二月桂酸酯、甘油二油酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油倍半油酸酯、甘油硬脂酸盐乳酸酯、聚氧乙烯鲸蜡基/十八烷基醚、聚氧乙烯胆甾醇醚、聚氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯肉豆蔻基醚、类固醇、胆甾醇、β谷甾醇、红没药醇、醇的脂肪酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、脂肪族-异丙基正-丁酸酯、异丙基正-酸酯、异丙基正-癸酸酯、异丙基棕榈酸酯、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、烷氧基化醇、烷氧基化酸、烷氧基化酰胺、烷氧基化糖衍生物、天然油和蜡的烷氧基化衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、壬苯聚醇-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺(Cocoamide)、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二酯、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯肉豆蔻基醚、和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、甘油基dimystate、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物或其混合物。

另外的合适的表面活性剂包括、但不限于，非离子脂质，诸如甘油基月桂酸酯、甘油基肉豆蔻酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蔻酸酯、其半合成衍生物及其混合物。

在另外的实施方式中，表面活性剂是具有范围为约2至约100个基团的聚氧乙烯首基的聚氧乙烯脂肪醚或具有结构R₅--(OCH₂CH₂)_y–OH的烷氧基化醇，其中R₅是分支或未分支的烷基基团，具有约6至约22个碳原子，和y在约4和约100之间，并且优选地在约10和约100之间。优选地，烷氧基化醇是这样的种类，其中R₅是月桂基基团和y的平均值为23。

在不同的实施方式中，表面活性剂是烷氧基化醇，其是羊毛脂醇的乙氧基化衍生物。优选地，羊毛脂醇的乙氧基化衍生物是羊毛脂醇聚醚-10，其是羊毛脂醇的聚乙二醇醚，平均乙氧基化值为10。

非离子表面活性剂包括、但不限于，乙氧基化表面活性剂、乙氧基化醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化单链烷醇酰胺、乙氧基化失水山梨糖醇酯、乙氧基化脂肪氨基、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、壬苯聚醇-9、双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、癸乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正-癸基α-D-吡喃葡糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、正-十二烷酰-正-甲基葡糖酰胺、正-十二烷基α-D-麦芽糖苷、正-十二烷基β-D-麦芽糖苷、正-十二烷基β-D-麦芽糖苷、庚乙二醇单癸基醚、庚乙二醇单十二烷基醚、庚乙二醇单十四烷基醚、正-十六烷基β-D-麦芽糖苷、六甘醇单十二烷基醚、六甘醇单十六烷基醚、六甘醇单十八烷基醚、六甘醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-O-(正-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡糖苷、壬乙二醇单十二烷基醚、正-壬酰-正-甲基葡糖胺、正-壬酰-正-甲基葡糖胺、辛乙二醇单癸基醚、辛乙二醇单十二烷基醚、辛乙二醇单十六烷基醚、辛乙二醇单十八烷基醚、辛乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二环氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树皮的皂苷、 Tergitol，类型15-S-12、Tergitol，类型15-S-30、Tergitol，类型15-S-5、Tergitol，类型15-S-7、Tergitol，类型15-S-9、Tergitol，类型NP-10、Tergitol，类型NP-4、Tergitol，类型NP-40、Tergitol，类型NP-7、Tergitol，类型NP-9、Tergitol、Tergitol，类型TMN-10、Tergitol，类型TMN-6、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、曲拉通(Triton)CF-21、曲拉通CF-32、曲拉通DF-12、曲拉通DF-16、曲拉通GR-5M、曲拉通QS-15、曲拉通QS-44、曲拉通X-100、曲拉通X-102、曲拉通X-15、曲拉通X-151、曲拉通X-200、曲拉通X-207、泰洛沙泊、正-十一烷基β-D-吡喃葡糖苷、其半合成衍生物、或其组合。

另外，非离子表面活性剂可以是波洛沙姆。波洛沙姆是由聚氧乙烯嵌段，然后是聚氧丙烯嵌段，然后是聚氧乙烯嵌段制成的聚合物。聚氧乙烯和聚氧丙烯的单元数目根据结合聚合物的数目而不同。例如，最小的聚合物波洛沙姆101由具有平均2单元的聚氧乙烯的嵌段、具有平均16单元的聚氧丙烯的嵌段、然后是具有平均2单元的聚氧乙烯的嵌段组成。波洛沙姆范围从无色液体和糊至白色固体。在美容和个人护理产品中，波洛沙姆被用于配制皮肤清洁剂、沐浴产品、洗发水、护发素、漱口液、眼部卸妆液和其它护肤和护发产品。波洛沙姆的实例包括、但不限于，波洛沙姆101、波洛沙姆105、波洛沙姆108、波洛沙姆122、波洛沙姆123、波洛沙姆124、波洛沙姆181、波洛沙姆182、波洛沙姆183、波洛沙姆184、波洛沙姆185、波洛沙姆188、波洛沙姆212、波洛沙姆215、波洛沙姆217、波洛沙姆231、波洛沙姆234、波洛沙姆235、波洛沙姆237、波洛沙姆238、波洛沙姆282、波洛沙姆284、波洛沙姆288、波洛沙姆331、波洛沙姆333、波洛沙姆334、波洛沙姆335、波洛沙姆338、波洛沙姆401、波洛沙姆402、波洛沙姆403、波洛沙姆407、波洛沙姆105Benzoate和波洛沙姆182二苯甲酸酯。

合适的阳离子表面活性剂包括、但不限于，季铵盐化合物、烷基三甲基氯化铵化合物、二烷基二甲基氯化铵化合物、含阳离子卤素的化合物，诸如鲸蜡基氯化吡啶鎓、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、吉腊德试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、N,N’,N’-聚氧乙烯(10)-N-动物脂-1,3-二氨基丙烷、通佐溴胺(Thonzonium bromide)、三甲基(十四烷基)溴化铵、1,3,5-三嗪-1,3,5(2H,4H,6H)-三乙醇、1-癸甲基铵(Decanaminium)、N-癸基-N,N-二甲基-、氯化物、二癸基二甲基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵、2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵、烷基1或3苄基-1-(2-羟乙基)-2-氯化咪唑啉盐、烷基双(2-羟乙基)苄基氯化铵、烷基脱甲基苄基氯化铵、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(100％C₁₂)、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(50％C₁₄、40％C₁₂、10％C₁₆)、烷基二甲基3,4-二氯苄基氯化铵(55％C₁₄、23％C₁₂、20％C₁₆)、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵(100％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(100％C₁₆)、烷基二甲基苄基氯化铵(41％C₁₄、28％C₁₂)、烷基二甲基苄基氯化铵(47％C₁₂、18％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(55％C₁₆、20％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(58％C₁₄、28％C₁₆)、烷基二甲基苄基氯化铵(60％C₁₄、25％C₁₂)、烷基二甲基苄基氯化铵(61％C₁₁、23％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(61％C₁₂、23％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(65％C₁₂、25％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(67％C₁₂、24％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(67％C₁₂、25％C₁₄)、烷基二甲基苄基氯化铵(90％C₁₄、5％C₁₂)、烷基二甲基苄基氯化铵(93％C₁₄、4％C₁₂)、烷基二甲基苄基氯化铵(95％C₁₆、5％C₁₈)、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二癸基二甲基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基苄基氯化铵(C_12-16)、烷基二甲基苄基氯化铵(C_12-18)、烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基二甲基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基溴化铵(90％C₁₄、5％C₁₆、5％C₁₂)、烷基二甲基乙基溴化铵(混合的烷基和链烯基基团，如在大豆油脂肪酸中一样)、烷基二甲基乙基苄基氯化铵、烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C₁₄)、烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C₁₂、30％C₁₄、17％C₁₆、3％C₁₈)、烷基三甲基氯化铵(58％C₁₈、40％C₁₆、1％C₁₄、1％C₁₂)、烷基三甲基氯化铵(90％C₁₈、10％C₁₆)、烷基二甲基-(乙基苄基)氯化铵(C_12-18)、二-(C_8-10)-烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基甲基苄基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二异癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基氯化铵、十二烷基双(2-羟乙基)辛基氯化氢铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基甲氨酰甲基二甲基基苄基氯化铵、十七烷基羟乙基咪唑啉盐氯化物、六氢-1,3,5–三(2-羟乙基)-仲-三嗪、六氢-1,3,5-三(2-羟乙基)-仲-三嗪、十四烷基二甲基苄基氯化铵(Myristalkonium chloride)(和)Quat RNIUM14、N,N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物、正-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、辛基癸基二甲基氯化铵、辛基十二烷基二甲基氯化铵、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵、氧联二乙基双(烷基二甲基氯化铵)、季铵化合物、二椰油烷基二甲基、氯化物、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵、三甲氧基甲硅烷季铵化合物、三甲基十二烷基苄基氯化铵、其半合成衍生物及其组合。

示例性含阳离子卤素的化合物包括、但不限于，鲸蜡基卤化吡啶鲸蜡基三甲基卤化铵、鲸蜡基二甲基乙基卤化铵、鲸蜡基二甲基苄基卤化铵、鲸蜡基三丁基卤化膦、十二烷基三甲基卤化铵或十四烷基三甲基卤化铵。在一些具体实施方式中，合适的含阳离子卤素的化合物包括、但不限于鲸蜡基氯化吡啶(CPC)、鲸蜡基三甲基氯化铵、鲸蜡基苄基二甲基氯化铵、鲸蜡基溴化吡啶(CPB)、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、鲸蜡基二甲基乙基溴化铵、鲸蜡基三丁基溴化膦、十二烷基三甲基溴化铵和十四烷基三甲基溴化铵。在具体的优选实施方式中，含阳离子卤素的化合物是CPC，尽管本发明组合物不限于具有含特定阳离子的化合物的制剂。

合适的阴离子表面活性剂包括、但不限于，羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸钠盐、胆酸、牛或羊胆汁、脱氢胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸甲基酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠盐、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、合成的、甘氨胆酸钠盐水合物、合成的、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙基酯、N-月桂酰肌氨酸钠盐、N-月桂酰肌氨酸溶液、N-月桂酰肌氨酸溶液、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、路戈尔碘液、Niaproof4，类型4、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、无水1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、胆酸钠、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠一水合物、十二烷基硫酸钠、无水己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、无水戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠一水合物、Taurohyo脱氧胆酸钠水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠、牛磺熊脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸盐、熊脱氧胆酸、其半合成衍生物、和其组合。

合适的两性离子表面活性剂包括、但不限于，N-烷基甜菜碱、月桂基酰氨基丙基二甲基甜菜碱、烷基二甲基氨基乙酸酯、N-烷基氨基丙酸酯、CHAPS、最小98％(TLC)、CHAPS、SigmaUltra、最小98％(TLC)、CHAPS，用于电泳，最小98％(TLC)、CHAPSO、最小98％、CHAPSO、SigmaUltra、CHAPSO，用于电泳，3-(癸基二甲基铵)丙磺酸盐内盐、3-十二烷基二甲基-铵)丙磺酸盐内盐、SigmaUltra、3-(十二烷基二甲基铵)-丙磺酸盐内盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基辛基-铵)丙磺酸盐内盐、3-(N,N-二甲基棕榈基铵)-丙磺酸盐、其半合成衍生物、和其组合。

在一些实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括阳离子表面活性剂，其可以是鲸蜡基氯化吡啶在本发明其它实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括阳离子表面活性剂，阳离子表面活性剂浓度小于约5.0％并且大于约0.001％。在本发明再另外的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括阳离子表面活性剂，阳离子表面活性剂浓度选自小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％或小于约0.10％。进一步，纳米乳液疫苗中的阳离子剂浓度为大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％、大于约0.010％或大于约0.001％。在一个实施方式中，纳米乳液疫苗中的阳离子剂浓度为小于约5.0％且大于约0.001％。

在本发明的另外实施方式中，纳米乳液疫苗包括至少一种阳离子表面活性剂和至少一种非阳离子表面活性剂。非阳离子表面活性剂是非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(吐温(Tween))，诸如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在一个实施方式中，非离子表面活性剂以约0.01％至约5.0％的浓度存在或非离子表面活性剂以约0.1％至约3％的浓度存在。在本发明再另外的实施方式中，纳米乳液疫苗包括以约0.01％至约2％浓度存在的阳离子表面活性剂，并组合非离子表面活性剂。

在某些实施方式中，纳米乳液还包括含阳离子卤素的化合物。本发明不限于具体的含阳离子卤素的化合物。各种含阳离子卤素的化合物均被考虑，包括、但不限于，鲸蜡基卤化吡啶鲸蜡基三甲基卤化铵、鲸蜡基二甲基乙基卤化铵、鲸蜡基二甲基苄基卤化铵、鲸蜡基三丁基卤化膦、十二烷基三甲基卤化铵和十四烷基三甲基卤化铵。本发明纳米乳液还不限于具体的卤化物。各种卤化物均被考虑，包括、但不限于，选自氯化物、氟化物、溴化物和碘化物的卤化物。

在再另外的实施方式中，纳米乳液还包括含季铵化合物。本发明不限于具体的含季铵化合物。各种含季铵化合物均被考虑，包括、但不限于烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、正-烷基二甲基苄基氯化铵、正-烷基二甲基乙基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵和正-烷基二甲基苄基氯化铵。

在一个实施方式中，纳米乳液和/或纳米乳液疫苗包括阳离子表面活性剂，其是鲸蜡基氯化吡啶(CPC)。CPC在纳米乳液RSV疫苗中的浓度可以为小于约5.0％并且大于约0.001％，或进一步，浓度可以为小于约5％、小于约4.5％、小于约4.0％、小于约3.5％、小于约3.0％、小于约2.5％、小于约2.0％、小于约1.5％、小于约1.0％、小于约0.90％、小于约0.80％、小于约0.70％、小于约0.60％、小于约0.50％、小于约0.40％、小于约0.30％、小于约0.20％、小于约0.10％、大于约0.001％、大于约0.002％、大于约0.003％、大于约0.004％、大于约0.005％、大于约0.006％、大于约0.007％、大于约0.008％、大于约0.009％、和大于约0.010％。

在进一步的实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯表面活性剂，其可以是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，并且浓度可以为约0.01％至约5.0％，或约0.1％至约3％的聚山梨醇酯80。纳米乳液RSV疫苗还可包括至少一种防腐剂。在本发明的另外实施方式中，纳米乳液RSV疫苗包括螯合剂。

6.另外的成分

合适用于本发明纳米乳液RSV疫苗的另外的化合物包括、但不限于，一种或多种溶剂，诸如基于有机磷酸盐的溶剂、膨胀剂、着色剂、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、pH调节剂、缓冲液、螯合剂等。另外的化合物可混合到之前乳化的纳米乳液疫苗中或另外的化合物可加入至待被乳化的最初混合物中。在某些这些实施方式中，一种或多种另外的化合物被混合到现有纳米乳液组合物中后即被应用。

本发明纳米乳液RSV疫苗中的合适的防腐剂包括、但不限于，鲸蜡基氯化吡啶苯扎氯铵、苄基醇、双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、咪唑烷基脲、苯酚、山梨酸钾、苯甲酸、bronopol、氯甲酚、对羟基本甲酸酯、苯氧基乙醇、山梨酸、α-生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、叔丁对甲氧酚、丁羟甲苯、抗坏血酸钠、焦亚硫酸钠、柠檬酸、依地酸、其半合成衍生物及其组合。其它合适的防腐剂包括、但不限于、苄基醇、双氯苯双胍己烷(双(对-氯苯基二胍基)己烷)、氯苯甘醚(chlorphenesin)(3-(-4-氯苯氧基)-丙烷-1,2-二醇)、Kathon CG(甲基和甲基氯异噻唑啉酮)、对羟基本甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基氢化苯甲酸酯)、苯氧基乙醇(2-苯氧基乙醇)、山梨酸(山梨酸钾、山梨酸)、Phenonip(苯氧基乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基对羟基本甲酸酯)、Phenoroc(苯氧基乙醇0.73％、对羟基本甲酸甲酯0.2％、对羟基本甲酸丙酯0.07％)、Liquipar油(异丙基、异丁基、丁基对羟基本甲酸酯)、Liquipar PE(70％苯氧基乙醇、30％liquipar油)、Nipaguard MPA(苄基醇(70％)、甲基&丙基对羟基本甲酸酯)、Nipaguard MPS(丙二醇、甲基&丙基对羟基本甲酸酯)、Nipasept(甲基、乙基和丙基对羟基本甲酸酯)、Nipastat(甲基、丁基、乙基和丙基对羟基本甲酸酯)、Elestab388(丙二醇中的苯氧基乙醇加氯苯甘醚和对羟基本甲酸甲酯)和Killitol(7.5％氯苯甘醚和7.5％对羟基本甲酸酯)。

纳米乳液RSV疫苗还可包括至少一种pH调节剂。本发明纳米乳液疫苗中合适的pH调节剂包括、但不限于，二乙醇胺、乳酸、单乙醇胺、三乙醇胺、氢氧化钠、磷酸钠、其半合成衍生物、和其组合。

另外，纳米乳液RSV疫苗可包括螯合剂。在本发明的一个实施方式中，螯合剂以约0.0005％至约1％的量存在。螯合剂的实例包括、但不限于，乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、肌醇六磷酸、多聚磷酸、柠檬酸、葡糖酸、乙酸、乳酸和二巯基丙醇，并且，优选螯合剂是乙二胺四乙酸。

纳米乳液RSV疫苗可包括缓冲剂，诸如药学上可接受的缓冲剂。缓冲剂的实例包括、但不限于，2-氨基-2-甲基-1,3-丙烷二醇，≥99.5％(NT)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇，≥99.0％(GC)、L-(+)-酒石酸，≥99.5％(T)、ACES，≥99.5％(T)、ADA，≥99.0％(T)、乙酸，≥99.5％(GC/T)、乙酸，用于发光、≥99.5％(GC/T)、醋酸铵溶液，用于分子生物学，～5M于H₂O中、醋酸铵，用于发光，≥99.0％(以干物质计算，NT)、碳酸氢铵，≥99.5％(T)、柠檬酸氢二铵，≥99.0％(T)、甲酸铵溶液，10M于H₂O中、甲酸铵，≥99.0％(以干物质计算，NT)、草酸铵一水合物，≥99.5％(RT)、磷酸氢二铵溶液，2.5M于H₂O中、磷酸氢二铵，≥99.0％(T)、磷酸氢铵溶液，2.5M于H₂O中、磷酸氢铵，≥99.5％(T)、磷酸氢二铵钠四水合物，≥99.5％(NT)、硫酸铵溶液，用于分子生物学、3.2M于H₂O中、酒石酸氢二铵溶液，2M于H₂O中(在20℃为无色溶液)、酒石酸氢二铵，≥99.5％(T)、BES缓冲盐水，用于分子生物学、2×浓缩、BES，≥99.5％(T)、BES，用于分子生物学，≥99.5％(T)、BICINE缓冲液溶液，用于分子生物学，1M于H₂O中、BICINE，≥99.5％(T)、BIS-TRIS，≥99.0％(NT)、碳酸氢盐缓冲液溶液、>0.1M Na₂CO₃、>0.2M NaHCO₃、硼酸，≥99.5％(T)、硼酸，用于分子生物学，≥99.5％(T)、CAPS，≥99.0％(TLC)、CHES，≥99.5％(T)、醋酸钙水合物，≥99.0％(以干物质计算，KT)、碳酸钙，沉淀的，≥99.0％(KT)、柠檬酸氢三钙四水合物，≥98.0％(以干物质计算，KT)、柠檬酸盐浓缩溶液，用于分子生物学、1M于H₂O中、柠檬酸，无水，≥99.5％(T)、柠檬酸，用于发光，无水，≥99.5％(T)、二乙醇胺，≥99.5％(GC)、EPPS，≥99.0％(T)、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物，用于分子生物学，≥99.0％(T)、甲酸溶液，1.0M于H₂O中、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸，≥99.0％(NT)、甘氨酸-甘氨酸，≥99.5％(NT)、甘氨酸，≥99.0％(NT)、甘氨酸，用于发光，≥99.0％(NT)、甘氨酸，用于分子生物学，≥99.0％(NT)、HEPES缓冲盐水，用于分子生物学，2×浓缩、HEPES，≥99.5％(T)、HEPES，用于分子生物学，≥99.5％(T)、咪唑缓冲液溶液，1M于H₂O中、咪唑，≥99.5％(GC)、咪唑，用于发光，≥99.5％(GC)、咪唑，用于分子生物学，≥99.5％(GC)、脂蛋白再折叠缓冲液、醋酸锂二水合物，≥99.0％(NT)、柠檬酸氢三锂四水合物，≥99.5％(NT)、MES水合物，≥99.5％(T)、MES一水合物，用于发光，≥99.5％(T)、MES溶液，用于分子生物学，0.5M于H₂O中、MOPS，≥99.5％(T)、MOPS，用于发光，≥99.5％(T)、MOPS，用于分子生物学，≥99.5％(T)、醋酸镁溶液，用于分子生物学，～1M于H₂O中、醋酸镁四水合物，≥99.0％(KT)、柠檬酸氢三镁九水合物，≥98.0％(以干物质计算，KT)、甲酸镁溶液，0.5M于H₂O中、磷酸氢二镁三水合物，≥98.0％(KT)、用于原位杂交的中和溶液，用于分子生物学、草酸二水合物，≥99.5％(RT)、PIPES，≥99.5％(T)、PIPES，用于分子生物学，≥99.5％(T)、磷酸盐缓冲盐水，溶液(高压灭菌的)、磷酸盐缓冲盐水、蛋白质印迹法中用于过氧化物酶结合物的洗涤缓冲液、10x浓缩、哌嗪，无水的，≥99.0％(T)、D-酒石酸氢钾，≥99.0％(T)、醋酸钾溶液，用于分子生物学、醋酸钾溶液，用于分子生物学、5M于H₂O中、醋酸钾溶液，用于分子生物学，～1M于H₂O中、醋酸钾，≥99.0％(NT)、醋酸钾，用于发光，≥99.0％(NT)、醋酸钾，用于分子生物学，≥99.0％(NT)、碳酸氢钾，≥99.5％(T)、碳酸钾，无水的，≥99.0％(T)、氯化钾，≥99.5％(AT)、柠檬酸氢钾，≥99.0％(干物质，NT)、柠檬酸氢三钾溶液，1M于H₂O中、甲酸钾溶液，14M于H₂O中、甲酸钾，≥99.5％(NT)、草酸钾一水合物，≥99.0％(RT)、磷酸氢二钾，无水的，≥99.0％(T)、磷酸氢二钾，用于发光，无水的，≥99.0％(T)、磷酸氢二钾，用于分子生物学，无水的，≥99.0％(T)、磷酸氢钾，无水的，≥99.5％(T)、磷酸氢钾，用于分子生物学，无水的，≥99.5％(T)、磷酸氢三钾一水合物，≥95％(T)、邻苯二甲酸氢钾，≥99.5％(T)、酒石酸钾钠溶液，1.5M于H₂O中、酒石酸钾钠四水合物，≥99.5％(NT)、四硼酸钾四水合物，≥99.0％(T)、四草酸钾二水合物，≥99.5％(RT)、丙酸溶液，1.0M于H₂O中、STE缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.8、STET缓冲液溶液，用于分子生物学、pH8.0、5,5-二乙基巴比妥酸钠，≥99.5％(NT)、醋酸钠溶液，用于分子生物学，～3M于中H₂O、醋酸钠三水合物，≥99.5％(NT)、醋酸钠，无水的，≥99.0％(NT)、醋酸钠，用于发光，无水的，≥99.0％(NT)、醋酸钠，用于分子生物学，无水的，≥99.0％(NT)、碳酸氢钠，≥99.5％(T)、酒石酸氢钠一水合物，≥99.0％(T)、碳酸钠十水合物，≥99.5％(T)、碳酸钠，无水的，≥99.5％(以干物质计算，T)、柠檬酸氢钠，无水的，≥99.5％(T)、柠檬酸氢三钠二水合物，≥99.0％(NT)、柠檬酸氢三钠二水合物二水合物，用于发光、≥99.0％(NT)、柠檬酸氢三钠二水合物，用于分子生物学，≥99.5％(NT)、甲酸钠溶液，8M于H₂O中、草酸钠，≥99.5％(RT)、磷酸氢二钠二水合物，≥99.0％(T)、磷酸氢二钠二水合物，用于发光，≥99.0％(T)、磷酸氢二钠二水合物，用于分子生物学，≥99.0％(T)、磷酸氢二钠十二水合物，≥99.0％(T)、磷酸氢二钠溶液，0.5M于H₂O中、磷酸氢二钠，无水的，≥99.5％(T)、磷酸氢二钠，用于分子生物学，≥99.5％(T)、磷酸氢钠二水合物，≥99.0％(T)、磷酸氢钠二水合物，用于分子生物学，≥99.0％(T)、磷酸氢钠一水合物，用于分子生物学，≥99.5％(T)、磷酸氢钠溶液，5M于H₂O中、焦磷酸氢二钠，≥99.0％(T)、焦磷酸氢四钠十水合物，≥99.5％(T)、酒石酸氢二钠二水合物，≥99.0％(NT)、酒石酸氢二钠溶液，1.5M于H₂O中(在20℃，下无色溶液)、四硼酸钠十水合物，≥99.5％(T)、TAPS，≥99.5％(T)、TES，≥99.5％(以干物质计算，T)、TM缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.4、TNT缓冲液溶液，用于分子生物学，pH8.0、TRIS甘氨酸缓冲液溶液，10×浓缩，TRIS乙酸–EDTA缓冲液溶液，用于分子生物学、TRIS缓冲盐水，10×浓缩、TRIS甘氨酸SDS缓冲液溶液，用于电泳，10×浓缩、TRIS磷酸盐–EDTA缓冲液溶液，用于分子生物学、浓缩，10×浓缩、麦黄酮(Tricine)，≥99.5％(NT)、三乙醇胺，≥99.5％(GC)、三乙胺，≥99.5％(GC)、三乙基醋酸铵缓冲液，挥发性缓冲液，～1.0M于H₂O中、三乙基磷酸铵溶液，挥发性缓冲液，～1.0M于H₂O中、三甲基醋酸铵溶液，挥发性缓冲液，～1.0M于H₂O中、三甲基磷酸铵溶液，挥发性缓冲液，～1M于H₂O中、Tris-EDTA缓冲液溶液，用于分子生物学、浓缩、100×浓缩、Tris-EDTA缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.4、Tris-EDTA缓冲液溶液，用于分子生物学，pH8.0、乙酸盐，≥99.0％(NT)、碱，≥99.8％(T)、碱，≥99.8％(T)、碱，用于发光，≥99.8％(T)、碱，用于分子生物学，≥99.8％(T)、碳酸盐，≥98.5％(T)、氢氯化物缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.2、氢氯化物缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.4、氢氯化物缓冲液溶液，用于分子生物学，pH7.6、氢氯化物缓冲液溶液，用于分子生物学，pH8.0、氢氯化物，≥99.0％(AT)、氢氯化物，用于发光，≥99.0％(AT)、氢氯化物，用于分子生物学，≥99.0％(AT)和马来酸盐，≥99.5％(NT)。

纳米乳液RSV疫苗可包括一种或多种乳化剂，以帮助形成乳液。乳化剂包括这样的化合物，其在油/水界面聚集，以形成防止两个邻近小滴直接接触的连续膜。本发明的某些实施方式以纳米乳液疫苗为特征，该疫苗可容易用水或另外的含水相稀释至期望的浓度而不损害其期望的性质。

7.免疫调节剂

如上所述，RSV疫苗还可包括一种或多种免疫调节剂。免疫调节剂的实例包括、但不限于脱乙酰壳多糖和葡聚糖。免疫调节剂在疫苗组合物中以药学上可接受的任意量存在，所述量包括、但不限于，约0.001％上至约10％和其间的任意量，诸如约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％。

V.药物组合物

本发明纳米乳液RSV亚单位疫苗可被配制成药物组合物，其包括治疗有效量的纳米乳液RSV疫苗和适当的、药学上可接受的赋形剂，用于药学上可接受的递送。这样的赋形剂在本领域中是悉知的。

短语“治疗有效量”意为有效预防、治疗或改善由包含纳米乳液RSV疫苗的组合物中施用的免疫原相关的RSV病原体引起的疾病的的任意量的纳米乳液RSV疫苗。“保护性免疫应答”意为免疫应答与疾病的预防、治疗或改善相关。不要求完全预防，尽管本发明也考虑完全预防。免疫应答可利用本文所述的方法或通过本领域技术人员已知的任何方法进行评估。

鼻内施用包括通过鼻施用——施用过程中伴随或不伴随吸入。这样的施用通常通过包含纳米乳液RSV疫苗的组合物与鼻粘膜、鼻甲或鼻窦腔的接触。通过吸入进行施用包括鼻内施用或可包括口服吸入。这样的施用也可包括与口腔粘膜、支气管粘膜和其它上皮的接触。

用于药学施用的示例性剂型在本文中进行描述。实例包括但不限于，液体、软膏、霜、乳液、洗剂、凝胶、生物粘合剂凝胶、喷雾、气溶胶、糊、泡沫、遮光剂、胶囊、微胶囊、悬浮剂、子宫托、粉剂、半固体剂型等。

药物纳米乳液RSV疫苗可被配制用于速释、缓释、控释、延迟释放或其任意组合至表皮或真皮中。在一些实施方式中，制剂可包括渗透增强剂。合适的渗透增强剂包括、但不限于，醇诸如乙醇、甘油三酯和芦荟组合物。渗透增强剂的量可占按重量计制剂的约0.5％至约40％。

本发明纳米乳液RSV疫苗可利用电泳递送/电泳被应用和/或递送。进一步，组合物可以是经皮递送系统，诸如贴剂或通过加压或气动装置(即，“基因枪”)被施用。包括应用电流的这样的方法在本领域中是悉知的。

用于施用的药学纳米乳液RSV疫苗可在单一施用或在多重施用中被应用。

如果被局部应用，则纳米乳液RSV疫苗可被封闭或半封闭。封闭或半封闭可通过覆盖绷带、聚烯烃膜、服装制品、不渗透性衬垫或半渗透性衬垫于局部制剂上来实施。

根据本发明的示例性纳米乳液佐剂组合物被命名为“W₈₀5EC”佐剂。W₈₀5EC佐剂组合物显示于下面表(表1)中。W₈₀5EC佐剂的平均小滴尺寸为～400nm。纳米乳液的所有组分均包括在FDA批准药物产品的非活性成分清单上。

纳米乳液佐剂通过乳化油、纯化水、非离子洗涤剂、有机溶剂和表面活性剂，诸如阳离子表面活性剂而形成。示例性特异性纳米乳液佐剂被命名为“60％W₈₀5EC”。60％W₈₀5EC-佐剂由下面表2显示的成分组成：纯化水，USP；大豆油，USP；脱水醇，USP[无水乙醇]；聚山梨醇酯80、NF和鲸蜡基氯化吡啶鎓，USP(该示例性纳米乳液的CPC所有组分均包括在FDA批准药物的批准的非活性成分清单上。

治疗的目标患者群体包括、但不限于，婴儿、老人、移植患者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。

VI.制备方法

本发明纳米乳液可利用标准乳液形成技术来形成。见，例如，U.S.2004/0043041。在示例性方法中，油与含水相在相对高的剪切力(例如，利用高液压和机械力)下混合，以获得包括平均直径小于约1000nm的油小滴的纳米乳液。本发明一些实施方式应用这样的纳米乳液，其具有包括醇诸如乙醇的油相。油和含水相可被掺和——利用能够产生足够的剪切力以形成乳液的任意设备，诸如French Presses或高剪切混合器(例如，FDA批准的高剪切混合器可获自例如Admix,Inc.,Manchester,N.H.)。产生这样的乳液的方法描述在美国专利号5,103,497和4,895,452中，通过引用其整体将其并入本文。

在示例性实施方式中，本发明方法中使用的纳米乳液包括分散在含水连续相诸如水或PBS中的油性不连续相的小滴。本发明纳米乳液是稳定的，即使在长时期存储后也不恶化。本发明某些纳米乳液在吞咽、吸入或与对象皮肤接触时是无毒性的和安全的。

本发明组合物可大量产生，并且在大范围的温度下稳定很多个月。纳米乳液的质地范围可从半固体霜质地至稀洗剂质地至液体质地，并可经任意上述药学上可接受的方法，例如经手或鼻滴剂/喷雾被局部施用。

如上所述，至少部分乳液可以是脂质结构的形式，包括、但不限于，单层、多层和稀少层脂泡(paucliamellar lipid vesicles)、微团和层状相。

本发明考虑所述纳米乳液的许多变型在本发明方法中将是有用的。为确定候选纳米乳液是否适合用于本发明，分析三个标准。利用本文所述方法和标准，可容易测试候选乳液，以确定它们是否是合适的。首先，利用本文所述方法制备期望的成分，以确定是否可以形成纳米乳液。如果不能形成纳米乳液，则拒绝该候选物。其次，候选纳米乳液应该形成稳定的乳液。如果纳米乳液保持乳液形式达足够长的时间段以容许计划的用途，则其是稳定的。例如，对于待被存储、航运等的纳米乳液，期望纳米乳液保持乳液形式数月至数年。相对不稳定的典型纳米乳液在将一天内丧失其形式。第三，候选纳米乳液针对其计划的用途应该具有功效。例如，本发明乳液将杀死RSV病毒或使RSV病毒失效至可检测的水平，或诱导保护性免疫应答至可检测的水平。本发明纳米乳液可提供在许多不同类型的容器和递送系统中。例如，在本发明某些实施方式中，纳米乳液被以霜或其它固体或半固体形式提供。本发明纳米乳液可掺入到水凝胶制剂中。

纳米乳液可被递送(例如，给对象或消费者)到任意合适的容器中。可应用合适的容器，其针对期望的应用提供一种或多种单用途或多用途剂量的纳米乳液。在本发明某些实施方式中，纳米乳液以悬浮剂或液体形式被提供。这样的纳米乳液可被递送到任意合适的容器中，包括喷雾瓶和任意合适的加压喷雾设备。这样的喷雾瓶可适于经鼻内或经吸入递送纳米乳液。

这样含纳米乳液的容器还可被包装以说明书，用于形成试剂盒。

制备根据本发明的疫苗以治疗或预防人类中RSV感染的示例性方法包括：(1)在真核宿主中合成全长或片段RSV表面抗原，诸如F蛋白质；和/或(2)在真核宿主中合成全长或片段RSV表面抗原，诸如G蛋白质，其中合成利用重组DNA遗传学载体和构建物进行。然后，一种或多种表面抗原可分离自真核宿主，然后用水包油纳米乳液配制一种或多种RSV表面抗原。在进一步的方法中，全RSV病毒体可在真核宿主中培养，然后，RSV病毒体可从真核宿主分离。分离的RSV病毒体然后可与分离的表面抗原在水包油纳米乳液中被配制。真核宿主可以是例如，哺乳动物细胞、酵母细胞、或昆虫细胞。

VII.实施例

通过参考以下实施例进一步描述本发明，所述实施例仅为说明目的被提供。本发明不限于实施例，而是包括通过本文提供的教导而显而易见的所有变型。本文参考的所有可公开获取的文件——包括但不限于美国专利通过引用被特别并入。

实施例1.

该实施例的目的是描述待被用于纳米乳液RSV疫苗中的纳米乳液的制备。

为制备纳米乳液，首先将水溶性成分溶于水中。然后，加入大豆油，并利用高剪切均化和/或微流化混合混合物，直到形成粘性白色乳液。乳液可进一步用水稀释以产生期望浓度的乳液或阳离子表面活性剂。

纳米乳液(NE)组合物根据表3被配制。

然后，纳米乳液可组合一种或多种RSV免疫原，以形成根据本发明的纳米乳液RSV疫苗。

实施例2.

该实施例的目的是描述用作RSV疫苗的佐剂的示例性纳米乳液。

总计制备10种纳米乳液制剂：单独的W₈₀5EC，六种W₈₀5EC+波洛沙姆407和波洛沙姆188(P407和P188)制剂，以及两种W₈₀5EC+脱乙酰壳多糖和一种W₈₀5EC+葡聚糖制剂均被产生，并在40℃下在加速条件下在2周内评估其稳定性(表4)。所有10种纳米乳液在40℃下均稳定至少2周。

以下制剂是在本发明RSV疫苗中有用的示例性纳米乳液：(1)制剂1，W₈₀5EC(NE80)，包括：(a)CPC/吐温80(比例为1:6)和(b)粒度～500nm(表5)；和制剂2，W₈₀P₁₈₈5EC(NE188)，包括：(a)CPC/吐温80/P188(比例为1:1:5),(b)粒度～300nm(表6)。

实施例3.证明纳米乳液与病毒抗原的结合

材料和方法：电子透射显微照片和切片技术：20mL的NE佐剂——单独或与一起——用1％(w/v)四氧化锇溶液固定。固定的制剂与组织凝胶以1:10比例混合，以形成固体块。固体混合物被切成1mm薄的切片并用双蒸去离子水漂洗。以试剂盒(Fluka,EM#14020)的组分A在双蒸去离子水中的增长的浓度(30％、50％、70％、90％、100％)使横切的样品脱水。将这些样品转移到试剂盒的包埋溶液(组分A、B、C和D的混合物)中。包埋的样品被切成75nm厚度并放置于300目碳包覆的铜网上。网上的切片在蒸馏和去离子水(pH7)中用饱和乙酸双氧铀染色10分钟，然后用柠檬酸铅染色5分钟。用装配有计算机控制的Compustage——一种高分辨率(2K×2K)数码相机——的Philips CM-100TEM观察样品，并利用X-Stream成像软件(SEM Tech Solutions,Inc.,North Billerica,MA)进行数字成像并捕获。

结果：电子显微照片：20％W₈₀5EC NE的横切的TEM显示具有均匀内核心材料的NE小滴。含30μg的HA的NE疫苗显示小滴油核心内部离散的抗原材料/颗粒，其代表抗原。因为抗原结合到核心中，并由核心材料包围，所以其被保护免于经电子致密染色而染色。这导致核心中的白色抵消染色效果(whitecounter staining effect)。抗原在核心中的定位保护乳液中的抗原-敏感性蛋白质亚单位，并可保护抗原免于降解，从而增强稳定性。在NE颗粒外面存在极少的、被染成黑色的颗粒(图1)。

实施例4.

该实施例的目的是评价纳米乳液基重组F-蛋白质疫苗——包括W₈₀5EC(佐剂)和重组F蛋白质——在BALB/c小鼠中的免疫原性潜力，例如对RSV的保护免疫性。该实例的基本原理：利用重组蛋白质而不是杀死的病毒制剂就一致性、安全性和制备而言潜在地提供众多优势。

动物被随机分成三组。在第零天对各组进行免疫，并在第28天经鼻内(至鼻孔中，每鼻孔一半体积)进行加强。在初免前对动物进行抽血，然后在整个研究期间每2周抽一次血。为检验用NE-F蛋白质进行接种是否会影响病毒清除和免疫病理学，在加强免疫后2周小鼠然后用活的传染性RSV经鼻内(10⁵PFU)攻击。

测试材料：(1)60％W₈₀5EC，稀释至终浓度为20％。W₈₀5EC组分显示于下面表7中。

(2)重组F-蛋白质：(杆状病毒宿主–Sino Biological Inc.Cat11049-V08B)；(3)磷酸盐缓冲盐水(无菌的)1×：由CellGro提供；(4)测试动物：_BALB/c小鼠8-10周龄，雌性(The Jackson Laboratory)。

研究设计概述：三组BALB/c小鼠针对F-蛋白质被如下免疫：(1)初免：组I–4.45μg F-蛋白质+20％W₈₀5EC，总体积15μl(n＝8)；组II–4.45μg F-蛋白质，总体积15μl(n＝5)；和组III–PBS，总体积15μl(n＝10)；和(2)加强免疫：组I–10μg F-蛋白质+20％W₈₀5EC，总体积15μl(n＝8)；组II–10μg F-蛋白质，总体积15μl(n＝5)；和组III–PBS，总体积15μl(n＝10)。

动物被随机分成三组。在第零天经鼻内(至鼻孔中，每鼻孔一半体积)对各组进行免疫。在整个试验期间每2周对动物抽一次血。在最后加强后14天小鼠经鼻内接种10⁵PFU L19RSV。

方法：测试制剂：疫苗混合物如下配制。第一次免疫：(1)90μl重组F蛋白质(浓度0.445mg/ml)混合45μl60％W₈₀5EC。终浓度：F蛋白质–0.3mg/ml；NE–20％。体积剂量–15μl/动物.(2)50ul重组F蛋白质(浓度0.445mg/ml)混合25μl PBS1×。终浓度：F蛋白质–0.3mg/ml；NE–0％。体积剂量–15μl/动物。对于免疫加强：(1)90μl重组F蛋白质(浓度1mg/ml)混合45μl60％W₈₀5EC。终浓度：F蛋白质–0.67mg/ml；NE–15％。体积剂量–15μl/动物；和(2)50ul重组F蛋白质(浓度1mg/ml)混合25μl PBS1×。终浓度：F蛋白质–0.67mg/ml；NE–0％。体积剂量–15μl/动物。

测试方法。接种程序：小鼠用异氟烷(isoflurane)麻醉，并以其头斜倚约45°放置，然后，将7.5μl疫苗施用至其左鼻孔。如上再次麻醉和约束动物。剩余的7.5μl疫苗被施用至右鼻孔。身体检查：在研究中，每周监测每个动物的身体姿势、活性和立毛(pilorection)。抽血：第一次免疫后2、4和6周通过隐静脉切开放血术对小鼠抽血。

血清ELISA：抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE应答经ELISA测量，其中5μg/ml F-蛋白质用于平板包被。抗-小鼠IgG-碱性磷酸酶结合的抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(West Grove，PA)。碱性磷酸酶(AP)结合的兔抗-小鼠IgG(H&L)、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgE购自Rockland Immunochemicals、Inc.(Gilbertsville,PA)。

用活的L19RSV进行鼻内攻击：加强免疫后2周用活的传染性RSV经鼻内(10⁵PFU)攻击小鼠。

气道高反应性(AHR):AHR利用被专门设计用于低潮气量的Buxco小鼠体积描记器(Buxco)测量。待测试的小鼠用戊巴比妥钠进行麻醉，并通过用18-规格金属管进行气管插管插入管。然后，用Harvard泵呼吸器(潮气量＝0.4ml、频率＝120呼吸/min，正终末呼气压2.5–3.0cm H2O)给小鼠提供氧气。体积描记器被密封，并且由计算机监测读数。因为盒是闭合的系统，所以肺体积的变化将由通过差示转导器测量的盒压力(Pbox)变化代表示。一旦基线水平已经稳定并且获取初始读数，通过尾静脉注射给予乙酰甲基胆碱攻击。确定剂量-响应曲线(0.01–0.5mg)后，选择最佳剂量——0.250mg乙酰甲基胆碱。该剂量在本研究全部剩余的试验中被利用。在进行乙酰甲基胆碱攻击后，监测响应并将峰值气道阻力记录为气道高反应性的测量值。

安乐术和生物材料收获程序：小鼠通过异氟烷窒息实施安乐死。收获肺相关淋巴结，用于进行免疫应答评价。使小鼠鼻内接种谱系19RSV导致感染，其与中等形式的疾病表型，包括黏液分泌过多和炎症相关。利用组织学分析和QPCR针对病毒和细胞因子基因表达以及黏液相关基因Muc5ac和Gob5评估对照和免疫动物中该表型的严重性。

定量PCR：去除最小肺叶并在1ml三唑试剂(Invitrogen)中均化。根据制造商的方案分离RNA，并反转录5μg，以评价基因表达。肺样品中细胞因子mRNA的检测利用预开发的引物/探针组(Applied Biosystems)测定并利用ABI Prism7500序列检测系统(Applied Biosystems)分析。Muc5ac、Gob5的转录水平利用如之前描述的[1]定制引物测定。Gapdh作为内部对照被分析，并且基因表达被归一化至Gapdh。基因表达水平的倍数变化通过与未感染小鼠中的基因表达——被赋予任意值1——进行比较而计算。通过使之前公开的引物组适于匹配谱系19的序列，RSV转录物利用SYBR绿色化学(green chemistry)扩增：

SVG正义：5′-CCAAACAAACCCAATAATGATTT-3′

RSVG反义：5′-GCCCAGCAGGTTGGATTGT-3′

RSVN正义：5′-CATCTAGCAAATACACCATCCA-3′

RSVN反义：5′-TTCTGCACATCATAATTAGGAGTATCAA–3′

RSVF正义：5′-AATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAA-3′

RSVF反义：5′-TGGACATGATAGAGTAACTTTGCTGTCT-3′

肺中RSV转录物水平相对于GAPDH的拷贝数被表示。

空斑分析：切除小鼠的肺、将其称重并在1×EMEM(Lonza)中均化。通过离心(5000×g，10mins)使均浆澄清，对上清液进行系列稀释，并加入至亚铺满的Vero细胞。在使病毒附着一个小时后，去除上清液并替换以0.9％甲基纤维素/EMEM。利用山羊抗-RSV作为一次抗体(Millipore)、HRP-兔抗-山羊抗体作为二次抗体和4-氯萘酚(Pierce)作为底物，通过免疫组织化学技术使空斑在培养第五天显示。

淋巴结再刺激：肺相关淋巴结(LALN)细胞悬浮液以1×10⁶细胞/孔被铺两次，接下来用培养基或RSV(MOI～0.5)进行再刺激。细胞在37℃温育24小时和上清液被收集用于根据制造商的方案在BioRad Bioplex200系统上进行分析。试剂盒(BioRad)——含Th细胞因子(IL-17、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-13)的抗体珠——被用于分析各样品中细胞因子产量。

组织学：分离右肺叶并立即固定在10％中性缓冲福尔马林中。肺样品随后被加工、包埋在石蜡中、被切片并放置于L-赖氨酸涂布的载玻片上并利用标准组织学技术使用苏木精和曙红(H&E)以及过碘酸希夫(PAS)染色。进行PAS染色以鉴别黏液和产生黏液的细胞。

结果.体液响应的评价.特异性血清IgG的评价。初免后2、4和6周从小鼠获取血清，用于利用ELISA评估特异性IgG的终点滴度。终点滴度被定义为产生比背景高三倍吸光度的最高血清稀释。终点滴度结果显示于图2中。仅纳米乳液F-蛋白质免疫的小鼠在第六周以组平均滴度接近5×10⁶的高滴度的特异性抗-F-蛋白质IgG抗体响应接种。

血清中对免疫的特异性IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE体液响应的评价。第二次免疫后两周(第六周)从小鼠获得血清，用于利用ELISA评估特异性IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE的终点滴度(图3)。终点滴度被定义为产生比背景高三倍吸光度的最高血清稀释。NE+F-蛋白质免疫的小鼠产生高水平的特异性IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平(图3A、B和3C)。NE+F-蛋白质免疫的小鼠的血清IgE滴度低但存在，并且平均大约663(图3D)。

RSV攻击：攻击后8天肺中的RSV基因表达。进行攻击研究以确定用NE-F-蛋白质进行接种是否会保护小鼠免于RSV的呼吸攻击。在初免后第六周，用活的传染性RSV经鼻内(10⁵PFU)攻击小鼠。在攻击后第8天，经QPCR和经空斑分析评估肺中的病毒载荷。如经QPCR评估的，与非免疫和仅F-蛋白质免疫的小鼠相比，在NE-F-蛋白质接种的小鼠肺中检测到RSV F和RSV N和RSV G转录水平明显降低(图4)。这些数据表明，NE-F-蛋白质疫苗在以下下呼吸道攻击中明显提高病毒清除。

纳米乳液+-RSV不提高气道高反应性。如之前报道的，用福尔马林固定的RSV进行接种在活病毒攻击时促进气道高反应性(AHR)和嗜曙红细胞增多的发展。考虑到这个，纳米乳液+F-蛋白质接种是否促进气道高反应性或免疫强化的其它证据被评价。与对照RSV感染的小鼠相比，纳米乳液-RSV免疫的小鼠在静脉内乙酰甲基胆碱攻击后仅显示气道阻力的基线增加(图5)。

活的攻击后，纳米乳液+F-蛋白质免疫与黏液分泌相关。以毒株19RSV对小鼠进行鼻内接种导致感染，其与中等形式的疾病表型，包括黏液分泌过多和炎症相关。利用组织学分析和QPCR针对病毒和细胞因子基因表达评估对照和免疫动物中该表型的严重性。在攻击后第8天，与被攻击的非免疫小鼠相比，NE+F-蛋白质接种的小鼠显示类似的黏液分泌过多，如通过组织学分析所评估的(图6A)。与非免疫的对照相比，在NE-F-蛋白质免疫的小鼠中测量黏液相关基因Muc5ac和Gob5的相似表达(图6B)。

纳米乳液+F-蛋白质免疫在攻击后促进诱导混合的Th1和Th2细胞因子。进一步表征免疫表型，其促进纳米乳液+F-蛋白质免疫的小鼠中的病毒清除；我们针对细胞因子基因表达利用QPCR。与对照小鼠相比，纳米乳液+F-蛋白质接种的小鼠不显示IL-12和IL-17，如通过在攻击后第8天在肺中的RSV转录物水平所评估的(分别在图7A和B中)。作为确认的手段，通过基于多抗体的分析(Bioplex)，在气管肺泡灌洗和肺均浆中评估细胞因子分布。NE-RSV接种显示增强的IFN-γ响应。IL-17显示与未接种的小鼠相比产生增加(图7C)。

结论：仅用20％W805EC混合F-蛋白质免疫的组以高滴度的特异性抗-RSVIgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体响应接种。这与IgE的最小产量相关。纳米乳液+F-蛋白质接种还与活RSV攻击后的增强的病毒清除和保护相关。有趣的是，免疫应答的表型与IL-12或IL-17的产生不相关。

针对NE+F-蛋白质免疫的小鼠，在体外用RSV L19再刺激后均在淋巴结中观察到混合的细胞因子释放的Th1、Th2式样。然而，这与免疫强化无关，尽管观察到明显的黏液产生。

实施例5.

RSV是婴儿、老人和无免疫应答的个体中严重下呼吸道疾病的主要原因。当前没有可用的疫苗。认为针对表面蛋白质F的抗体在抵抗RSV感染的宿主防御中是重要的，然而，保护是不完全的，并且持续时间有限。

材料和方法：通过用W₈₀5EC纳米乳液配制灭活L19RSV病毒。BALB/c小鼠在第0和4周经鼻内接种12μL灭活的L19病毒——含1.2μg RSV F蛋白质，1.3×10⁵PFU/剂量+20％W₈₀5EC或重组RSV F，2.5μg/剂量+20％W₈₀5EC。攻击后将两种疫苗制剂均与未免疫动物进行比较。在免疫前和第二次免疫后4周时收集免疫动物的血清。在免疫后10周时动物经口咽被10⁵PFU的L19RSV毒株攻击，并利用PCR测试病毒RNA清除和通过显微镜测试组织病理学变化。

结果：灭活的全病毒和重组F蛋白质均产生免疫应答和在攻击后减少病毒mRNA(p<0.01，Mann Whitney)。抗-F ELISA单位在全病毒接种后达到几何平均值(GM)为51(95％CI14-189)，并且，与F蛋白质接种后的GM为470(95％CI235-942)相比较低(p＝0.02，Mann-Whitney)。见图8。在100％接种全病毒的小鼠中，F蛋白质在攻击后是不可检测的，然而，但是100％接种重组F蛋白质的小鼠在攻击后在肺中具有可检测的F蛋白质mRNA(p＝0.008，Fisher’s精确检验)。见图9和表8。另外，接种全病毒动物的组织病理学比接种F蛋白质动物具有较少的黏液。见图10A-10D。

结论：全病毒和重组F蛋白质在攻击后引导免疫应答和减少病毒mRNA。尽管抗体滴度较低，但以W₈₀5EC纳米乳液灭活和辅助的全病毒疫苗在攻击后导致病毒清除增加和组织病理减少。

实施例6.

该实施例的目的是与RSV L19毒株相比比较RSV A2毒株的HRSV蛋白质表达和细胞溶胞产物对比上清液。

材料和方法：所有样品均通过用相同量pfu的A2或L19病毒感染HEP-2细胞来制备。感染后24小时；感染的细胞用以下之一处理：

(1)细胞溶胞产物，以检查结合细胞的蛋白质；在丢弃上清液介质后，细胞用SDS处理。分析该细胞溶胞产物的与细胞结合的F蛋白质的量。

(2)总细胞和上清液蛋白质；细胞和上清液被冻融三次，以裂解细胞，并且，所有细胞溶胞产物均用于分析细胞和介质中的F蛋白质。

在感染后4天，从HEP-2感染的细胞提取和纯化L19和A2病毒。比较纯化病毒的蛋白质含量。

结果：利用多克隆抗RSV抗体在蛋白质印迹中分析归一化样品。比较L19和A2毒株之间的F和G蛋白质含量。利用图像捕获和Kodak软件比较带密度。制备模拟非感染细胞培养物作为对照。

结果数据在图11-13和表9-11中详述。图11显示用L19和A2HRSV感染的细胞溶胞产物(SDS处理的)的SDS PAGE，图12显示L19和A2HRSV细胞溶胞产物(细胞&上清液)的SDS-PAGE，和图13显示HRSV L19和A2纯化病毒的SDSPAGE。表9显示SDS-PAGE的L19和A2水平的可比较的HRSV F和G蛋白质。表10显示感染的细胞(溶胞产物，上清液)的可比较的HRSV L19和A2F和G蛋白质。最后，表11显示SDS PAGE的可比较的HRSV L19和A2F和G蛋白质。

总结：与A2感染的细胞相比，RSV L19病毒感染的细胞产生3-11倍更多量的RSV病毒蛋白质。

实施例7.

该实施例的目的是比较感染以不同RSV病毒毒株(L19对比A2)的Hep-2细胞在各种感染时间(24小时对比4天)的F蛋白质表达。

材料和方法：Hep-2细胞被感染以L19或A2RSV病毒。2组共计4瓶。

病毒感染后24小时，第一组Hep-2细胞被裂解，具有或没有培养物上清液。样品如下制备：

C+TCCC+T＝细胞+Tris缓冲液(丢弃培养基，并替换以等体积的Tris缓冲液)；

C+M＝细胞+培养基(培养基保留)。

感染后4天，第二组Hep-2细胞被裂解，具有或没有培养物上清液。样品如下制备:

C+T＝细胞+Tris缓冲液(培养基被替换以等体积的Tris缓冲液)；

M＝培养基(分别收集培养基)

C+M＝细胞+培养基(保留培养基)

各样品的大约7.5μL被用于蛋白质印迹分析。F和G蛋白质带密度利用Carestream Molecular成像软件5.X测量。

结果：结果详述在图14中，其显示病毒感染后24小时HRSV L19和A2F和G蛋白质表达的蛋白质印迹。另外，下面表14显示通过蛋白质印迹的HRSV F和G蛋白质带的密度分析。

表14.通过蛋白质印迹进行HRSV F和G蛋白质带密度分析

总结：与感染以RSV A2毒株的那些相比，结合细胞的病毒颗粒和结合培养基的病毒颗粒在L19感染的细胞中均表达高得多的F(平均约6倍)。

另外，与感染以RSV A2毒株的那些相比，结合细胞的病毒颗粒和结合培养基的病毒颗粒在L19感染的细胞中均表达高得多的G。

实施例8.

该实施例的目的是比较若干通过在小鼠中鼻接种灭活RSV的不同方法，包括β-丙酸内酯和W₈₀5EC纳米乳液。

方法：将W₈₀5EC，一种同时具有抗病毒和佐剂活性的水包油纳米乳液与β-丙酸内酯(β-PL)灭活的病毒(毒株L192×105pfu/剂量)比较。两种疫苗均经鼻内(IN)在第0和4周施用至BALB/C小鼠。小鼠在给药前和在加强后3周被抽血，然后被测试其针对F-蛋白质的特异性抗体。

动物在第8周经鼻用1×10⁵pfu RSV L19攻击，并利用PCR检查气道高反应性(AHR)、肺细胞因子和病毒蛋白质mRNA清除。

结果：W₈₀5EC和β-PL均完全灭活RSV和诱导免疫应答。与纳米乳液-灭活的疫苗相比，β-PL疫苗诱导更高的抗体应答(p＝0.006)。然而，接种纳米乳液–灭活的疫苗的动物在攻击后具有较高的RSV清除，这由肺中较低的蛋白质F和G mRNA证明(分别为p＝0.06和0.0004)。而且，接收纳米乳液-灭活的疫苗的动物显示明显较低的AHR(p＝0.02)。两种疫苗均诱导显著水平的肺IL-17——与非接种的对照相比(<0.01)，然而，显著较高的水平由纳米乳液-灭活的疫苗诱导(p＝0.009)。

结论：β-PL灭活的RSV病毒疫苗在RSV感染的小鼠模型中进行病毒攻击后与AHR相关。相比之下，纳米乳液病毒灭活不产生AHR并诱导显著增加的IL-17产量和改善的病毒清除。这表明了一种新的免疫保护途径，其可以提供抵抗RSV的接种优势。

实施例9.

该实施例的目的是描述在本发明疫苗中有用的RSV病毒毒株。

L19RSV毒株作为纳米乳液灭活/纳米乳液辅助的RSV疫苗中的抗原被评价。发现该毒株在小鼠中引起感染和加重呼吸疾病(ERD)。而且，公开的数据显示其与纳米乳液一起配制时在小鼠中给予保护而不引起ERD。将该L19毒株与野生类型A2毒株——获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)——进行比较。

RSV毒株L19分离菌于1967年1月3日，在Ann Arbor,Michigan，分离自患有呼吸疾病的RSV-感染的婴儿的WI-38细胞，并在SPAFAS原发性鸡肾细胞中传代，然后在SPAFAS原发性鸡肺细胞中传代，然后转移到MRC-5细胞(Herlocher1999)，随后转移到Hep2细胞(Lukacs2006)。RSV L19基因组(15,191-nt；基因库登录号FJ614813)与RSV毒株A2(15,222-nt；基因库登录号M74568)的比较显示，基因组的98％是一致的。L19和A2之间的大部分编码差异是在F和G基因中。两个毒株的氨基酸比对显示，F蛋白质具有14个(97％一致)而G蛋白质具有20个(93％一致)的氨基酸差异。

RSV L19毒株已经在动物模型中被证明通过刺激黏液产生和经气管内施用利用1×10⁵空斑形成单位(PFU)/小鼠的接种物明显诱导IL-13而模拟人感染(Lukacs2006)。

选择RSV L19毒株的原理如下：重要的而且独特的是，RSV L19病毒毒株是独特的，在于其比其它毒株产生明显更高产量的F蛋白质(每PFU多大约10-30倍)。F蛋白质含量可能是免疫原性的关键因子，并且，L19毒株普遍地引起最强的免疫应答。L19毒株的繁殖时间较短，因而从制造的角度来看将更高效。NanoBio提议在单一空斑分离L19毒株和纯化病毒后，在合格的Vero细胞系中产生疫苗的RSV L19毒株病毒，以建立主病毒种子库和工作病毒种子库。比较三种病毒毒株的结果提供在表15中。

实施例10.

该实施例的目的是描述用不同的纳米乳液佐剂灭活RSV L19病毒毒株。

纳米乳液(1)W₈₀5EC；(2)W₈₀5EC与P407；(3)W₈₀5EC与P188；(4)W₈₀5EC与高和低分子量脱乙酰壳多糖；和(5)W₈₀5EC与葡聚糖，已经通过RSV L19病毒毒株测试，以确定病毒灭活。

用20％纳米乳液灭活在室温下进行2小时和用0.25％βPL灭活在4℃进行16小时，然后在37℃进行2小时。处理的病毒在Hep-2细胞中被传代三次，并且，对细胞溶胞产物进行蛋白质印迹分析，以确定活病毒的存在。见图15。尤其地，图15显示通过蛋白质印迹评估病毒灭活，其中泳道包括：(1)W₈₀5EC(泳道1)、(2)W₈₀5EC+0.03％B1,3葡聚糖(泳道2)、(3)W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖(中分子量)+乙酸(泳道3)、(4)W₈₀5EC+0.3％P407(泳道4)、(5)W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖(低分子量)+0.1％乙酸(泳道5)、(6)仅培养基(泳道6)；(7)βPL–灭活的病毒(泳道7)和(8)L19阳性对照(泳道8)。

RSV L19被纳米乳液制剂完全灭活并通过βPL评价。图15显示在细胞培养物中三次连续传代NE-处理的病毒在蛋白质印迹中针对RSV抗体印记时导致没有检测的病毒抗原。该三次细胞培养物传代测试是确立的和公认的测定病毒灭活的方法。值得注意的是，图15中所有泳道均具有浓的背景带，其不是病毒带而是牛血清白蛋白。病毒蛋白质仅可在阳性对照(泳道8)中被检测到。

实施例11.

该实施例的目的是评价RSV疫苗的短期稳定性。

配制RSV L19病毒制剂的目标剂量，以实现纳米乳液终浓度为20％。疫苗存储在室温(RT)和4℃下。稳定性测试参数包括物理和化学分析(表16)。

对于RSV毒株L19，在RT和4℃下存储14天(最久测试的)伴随W₈₀5EC+/-βPL灭活后，满足物理表观、平均粒度、ζ电势和蛋白质印迹接纳标准。W₈₀5EC+3％P407、W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖-LMW和W₈₀5EC+0.3％脱乙酰壳多糖-MMW被测试最多7-8天，并且也显示稳定性。W₈₀5EC/P188(1:1:5)和W₈₀5EC/P188(1:5:1)制剂也用活病毒RSV A2毒株而不是RSV L19毒株测试最多14天；1:1:5制剂显示稳定性，而1:5:1制剂显示潜在的附聚作用(表17)。

表17：按照物理和化学参数和蛋白质印迹的疫苗稳定性

图16显示通过蛋白质印迹在第零天(图16A)和在RT或4℃下存储的随后14天(图16B)，W₈₀5EC+/-βPL灭活的RSV毒株L19的G带密度的实施例。尤其地，图16显示利用抗-RSV抗体(抗-G)进行的蛋白质印迹分析；L19病毒4×10⁶PFU/泳道、2×10⁶PFU/泳道和1×10⁶PFU/泳道+/-βPL灭活组合W₈₀5EC，如所示。分析新鲜样本(图16A)或在4℃或室温(RT)下14天后分析(图16B)。

实施例12.

该实施例的目的是在小鼠中评价RSV疫苗的免疫原性。

小鼠经肌肉内免疫，如显示于表18。小鼠在0周IM接收50μl RSV辅助的疫苗。在0和3周对小鼠抽血和测试血清抗体。脱乙酰壳多糖被用做免疫调节剂以增强免疫应答——除了有助于纳米乳液的佐剂活性之外。

表18：用于接种小鼠的不同臂

与不含脱乙酰壳多糖的纳米乳液相比，接种含脱乙酰壳多糖的纳米乳液的小鼠在单一剂量的纳米乳液辅助的RSV疫苗之后显示更增强的免疫应答(图17)。尤其地，图17显示在IM接种具有和不具有脱乙酰壳多糖的不同纳米乳液制剂的小鼠中接种后3周时的免疫应答(IgG，μg/ml)：(1)RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC+0.1％低分子量脱乙酰壳多糖；(2)RSV毒株L19+5％W₈₀5EC；(3)RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC；(4)RSV毒株L19+βPL灭活的病毒；和(5)未接种小鼠(没有疫苗)。图17中描述的结果显示在接种RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC+0.1％低分子量脱乙酰壳多糖的小鼠中发现最高水平的IgG，在接种RSV毒株L19+2.5％W₈₀5EC的小鼠中发现次高水平的IgG，接下来是接种RSV毒株L19+5％W₈₀5EC的小鼠。在接种小鼠中观察到的最低水平的IgG是针对RSV毒株L19+βPL灭活的病毒。

实施例13.

该实施例的目的是测定根据本发明的RSV疫苗在棉鼠中的免疫原性。

棉鼠是被认可的用于评价RSV疫苗免疫原性和功效的动物种类。利用在小鼠中产生的数据，两种纳米乳液被选择用于在棉鼠中进行评价。研究的两种初始制剂包括W₈₀5EC和W₈₀P₁₈₈5EC(1:1:5)(见上面表5和6)。

棉鼠接收两次剂量：30μl IN的纳米乳液-辅助的疫苗——含6.6μg F-ptn。它们在23周被5×10⁵pfu RSV毒株A2攻击。一半动物在第4天被处死，另一半在第8天被处死。接种时间表显示于图18。

下面示出的免疫原性数据显示，在用RSV-纳米乳液疫苗IN免疫后，观察到积极免疫应答。在施用第二剂量后，实现抗体滴度的快速和显著提高。图19中示出的数据显示，在21周，所有动物中的抗体水平约为在4周时施用第一次加强后即刻获得的最大值的十分之一。在攻击之前施用第二次加强产生这样的免疫应答：其几乎与在6周——第一次加强后两周时实现的水平一致。两种纳米乳液在引起强的和显著的免疫应答方面是等效的(图19和20)。(图19和20中的Y轴显示F蛋白质的特异性抗体的终点滴度或抗体量，和X轴以周为单位显示时间段)。

ELISA单位/μg/ml：F蛋白质的特异性抗体的量通过与被赋予任意100EU的定义的参考血清有关的ELISA中的曲线下面积来计算。

实施例14.

该实施例的目的是确定根据本发明的RSV疫苗对中和抗体的作用以及包含RSV毒株L19的RSV疫苗在IN施用后针对其它RSV毒株的交叉反应性。

棉鼠经鼻内被接种30μl疫苗，在4周时加强和在0、4、6和8周抽血。在23周用5×10⁵pfu的RSV毒株A2攻击动物。研究组包括两组，其接收混合有含3.3μgF蛋白质的1.6×10⁵PFU RSV毒株L19(n＝8)或含6.6μg F蛋白质的3.2×10⁵PFURSV毒株L19(n＝8)的20％W₈₀5EC纳米乳液，还包括两组，其接收混合有含3.3μgF蛋白质的1.6×10⁵PFU RSV毒株L19(n＝8)或含6.6μg F蛋白质的3.2×10⁵PFUL19RSV(n＝8)的20％W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液。

一半动物在第4天被处死和另一半在第8天被处死。测试单独的棉鼠血清的中和抗体。中和单位(NEU)表示导致50％空斑减少的最高稀释度的倒数。NEU测量在4周(加强前)和6周(加强后2周)时进行。在6周时获得的样本产生的体液免疫应答足以允许进行NEU分析。数据以几何平均值表示，具有95％置信区间(CI)(图21A)。利用施佩尔曼秩相关系数在6周时对所有动物进行EU和NEU相关。

尤其地，图21显示在6周时间点的中和抗体滴度(图21A)。值得注意的是，接种以60％W₈₀5EC或60％W₈₀P₁₈₈5EC灭活的3.2×10⁶PFU RSV毒株L19的所有动物都产生强的中和抗体。在EU和中和抗体(NEU)之间存在统计学上显著的正相关(图21B)。

中和单位(NU)：减少病毒空斑50％的最高血清稀释度的倒数

特异性活性(NU/EU)：病毒中和抗体(NU)/EU F-蛋白质抗体(图21B)

图22显示第4天和第8天的中和抗体。图22A显示W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，图22B显示W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。所有棉鼠均显示针对疫苗RSV毒株L19的高的中和抗体(NU)。在攻击后中和抗体稳定上升(Y轴)。第8天中和单位(NU)高于第4天NU。未接种小鼠在其血清中不显示任何中和活性。血清中和抗体和特异性活性显示从攻击后第4天至第8天增加的趋势。

图23显示血清抗体的特异性活性。与攻击后第4天相比时，血清抗体的特异性活性(中和单位/ELISA单位)趋于在第8天增加。图23A显示第4天和第8天W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果(NU/EU，Y轴)。图23B显示第4天和第8天W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果(NU/EU，Y轴)。所有棉鼠均显示高的中和活性(图23)。

在攻击后第4天，接种棉鼠的血清显示针对RSV毒株A2(除了RSV毒株L19之外)的交叉保护(图24)。尤其地，图24显示接收三剂量的RSV L19辅助的疫苗然后被RSV毒株A2攻击的棉鼠在第4天的交叉保护。图24A显示W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果，和图24B显示W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19的结果。血清中和活性显示针对RSV毒株L19或RSV毒株A2相等的NU，表明两种RSV毒株之间的交叉保护。与未接种棉鼠相比时，接种的棉鼠在攻击后第4天清除所有攻击的RSV病毒(图25)。如到第8天所预期的，所有动物均已经清除病毒。尤其地，图25显示通过测量棉鼠肺中的RSV毒株A2病毒滴度(PFU/g)，在第4天在棉鼠肺中的病毒清除。接种的棉鼠(接种W₈₀P₁₈₈5EC纳米乳液组合RSV毒株L19和W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19)显示从棉鼠肺中完全清除RSV毒株A2激发的病毒。相比之下，未接种动物显示>10³pfu RSV毒株A2/克肺(检测的界限是2.1×10¹pfu/g)。

实施例15.

该实施例的目的是评价在棉鼠中肌肉内接种根据本发明的RSV疫苗。

根据显示在图26中的时间表对棉鼠进行IM接种。动物接收50μl RSV辅助的RSV疫苗——含3.3μg F-蛋白质(20％W₈₀5EC纳米乳液，混合1.6×10⁵PFURSV毒株L19——含3.3μg F蛋白质)。棉鼠针对RSV产生特异性免疫应答。抗体水平减少直到在14周施加第二次加强。在攻击后抗体水平轻微增加(图27和28)。尤其地，图27显示在接种棉鼠中的血清免疫应答。Y轴显示14周周期内攻击后第4天和攻击后第8天的IgG，μg/mL。图28显示接种棉鼠中的血清免疫应答。图28A显示14周周期内攻击后第4天和攻击后第8天的终点滴度(Y轴)。图28B显示14周周期内攻击后第4天和攻击后第8天的ELISA单位(Y轴)。

IM免疫的功效通过用RSV活A2毒株——引起人类中疾病的毒株——攻击动物来评估。5×10⁵pfu剂量的RSV毒株A2在RSV L19纳米乳液-辅助的疫苗加强免疫后两周被施用给动物。未免疫年龄匹配的组也被攻击。各组中的一半动物在攻击后第4天被处死，此时在棉鼠肺中显示最大病毒载荷。另一半在第8天被处死。

病毒清除：肺培养物显示，在攻击后4天所有接种动物的肺中均没有病毒，而未接种动物肺组织的病毒载荷为10³pfu RSV毒株A2/g(图21)。尤其地，图29显示通过测量测试棉鼠肺中的RSV毒株A2病毒滴度(PFU/g)，在第4天棉鼠肺中的病毒清除。接种棉鼠(接种W₈₀5EC纳米乳液组合RSV毒株L19)显示完全从棉鼠肺中清除RSV毒株A2激发的病毒。相比之下，未接种动物显示肺病毒载荷为10³pfu RSV毒株A2/克或更高(检测的界限为2.1×10¹pfu/g)。

棉鼠总结：配制在纳米乳液中并IN或IM施用的所有RSV疫苗均引起防止免疫动物感染的保护性免疫应答。而且，纳米乳液-灭活和辅助的RSV L19疫苗在广泛接受的棉鼠模型中是高度免疫原性的。棉鼠在一次免疫后引起抗体滴度升高，并在第二次免疫后引起显著加强(大约增加10倍)。产生的抗体高效中和活病毒，并且，在中和和抗体滴度之间存在线性关系。而且，在用RSV L19毒株免疫和被RSV A2毒株攻击时，棉鼠中产生的抗体显示交叉保护。IM和IN免疫均建立这样的记忆：其在暴露于作为第二次加强的抗原或暴露于活病毒之后可被提出或回忆。

实施例16.

该实施例的目的是比较鼻内(IN)对比肌肉内(IM)施用W₈₀5EC纳米乳液辅助的RSV疫苗。

方法：含2×10⁵空斑形成单位(PFU)的L19RSV病毒和1.7μg F蛋白质的RSV疫苗经20％W₈₀5EC纳米乳液佐剂灭活。BALB/C小鼠(n＝10/臂)在第0和4周被IN或IM接种。分析血清的抗-F抗体(图30)。分析来自脾、子宫颈和肠淋巴结(LN)的细胞的RSV-特异性细胞因子(图31)。小鼠在第8周经口咽被5×10⁵PFU L19攻击。气道高反应性通过体积描述法评估。攻击后第8天分析肺，以评估细胞因子mRNA、病毒蛋白质和组织病理学。

结果：与IN接种的小鼠相比，在攻击后，IM接种的小鼠具有更高的抗-F抗体(GM396[95％CI240-652]对2[95％CI0-91])(图22)并产生更多IL-4和IL-13(p<0.05)(图31)。相比之下，脾细胞、子宫颈LN和肠LN的IL-17在IN接种后比IM接种高(分别为GM:57对比1、119对比3和51对比4pg/mL，p<0.05)(图31)。图32显示IN或IM接种后肺组织中细胞因子IL-4、IL-13和IL-17的测量结果。IL-4和IL-13在IM施用后以较高的量被表达，其中IL-17在IN施用后显示更高的表达。在攻击后，两种免疫途径均导致清除F和G蛋白质，但在证实的组织病理学的情况下，IM组中气道阻力较高(p＝0.03)(图33)。肺IL-4和IL-13与)气道高反应性具有强的正相关(分别为r＝0.89；p＝0.001和r＝0.8；p＝0.007。肺IL-17仅产生在IN接种的小鼠中(p＝0.008)，并与气道高反应性具有强的负相关(r＝-0.81p＝0.007)。

结论，与IM接种相比，IN接种新的纳米乳液佐剂W₈₀5EC导致较低的气道高反应性，与高的IL-17产量强烈相关。通过黏膜接种产生的IL-17可能是RSV感染中气道高反应性降低的重要标志。

说明书中提及的文件的全部引文

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Claims

1.疫苗组合物，包括：

(a)至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)表面抗原或其抗原片段；和

(b)免疫增强型纳米乳液或其稀释物，包括小滴，其平均大小为约1000nm或更小，和：

(i)含水相；

(ii)至少一种油；

(iii)至少一种表面活性剂；和

(iv)至少一种有机溶剂；

其中所述至少一种RSV表面抗原包括在所述纳米乳液中。

2.权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述表面抗原是RSV F蛋白质、RSVG蛋白质、RSV F蛋白质的抗原片段、RSV G蛋白质的抗原片段、或其任意组合。

3.权利要求1或权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原来自人呼吸道合胞病毒，其以HRSV-L19保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

4.权利要求1-3任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原还包括至少一种指示减毒表型的核苷酸修饰。

5.权利要求1-4任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原或其抗原片段存在于融合蛋白质中。

6.权利要求1-5任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原是RSV F蛋白质的肽片段、RSV G蛋白质的肽片段、或其任意组合。

7.权利要求1-6任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV表面抗原是多价的。

8.权利要求7所述组合物，其中所述多价表面抗原是RSV F蛋白质、RSV G蛋白质、RSV F蛋白质的抗原片段、RSV G蛋白质的抗原片段、或其任意组合。

9.权利要求1-8任一项所述疫苗组合物，其中所述免疫增强型纳米乳液能够诱发Th1免疫应答、Th2免疫应答、Th17免疫应答、或其任意组合。

10.权利要求1-9任一项所述疫苗组合物，还另外包括佐剂。

11.权利要求1-10任一项所述疫苗组合物，还包括至少一种药学上可接受的载体。

12.权利要求1-11任一项所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物被配制，用于经肠胃外、口服、鼻内或直肠施用。

13.权利要求12所述疫苗组合物，其中所述肠胃外施用是通过皮内、皮下、腹膜内或肌肉内注射。

14.权利要求1-13任一项所述疫苗组合物，还包括分离的RSV病毒体颗粒。

15.权利要求14所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒体颗粒来自人呼吸道合胞病毒，其以HRSV-L19保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

16.权利要求14或权利要求15所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒体颗粒通过所述纳米乳液失活。

17.权利要求14-16任一项所述疫苗组合物，其中所述RSV病毒基因组包括至少一个减毒突变。

18.权利要求1-17任一项所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物：

(a)对于对象不是全身毒性的；

(b)在施用后产生最小炎症或不产生炎症；或

(c)其任意组合。

19.权利要求1-18任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液小滴的平均直径选自小于约1000nm、小于约950nm、小于约900nm、小于约850nm、小于约800nm、小于约750nm、小于约700nm、小于约650nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、大于约50nm、大于约70nm、大于约125nm、大于约125nm并且小于约600nm，和其任意组合。

20.权利要求1-19任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液包括：

(a)含水相；

(b)约1％油至约80％油；

(b)约0.1％有机溶剂至约50％有机溶剂；和

(c)约0.001％表面活性剂至约10％表面活性剂。

21.权利要求1-20任一项所述疫苗组合物，其中所述纳米乳液包括：

(a)含水相；

(b)约1％油至约80％油；

(c)约.01％有机溶剂至约50％有机溶剂；

(d)约0.001％至约10％的一种或多种非离子表面活性剂；和

(3)阳离子表面活性剂。

22.权利要求1-21任一项所述的疫苗组合物，其中在施用给对象之后，所述对象在单一施用所述疫苗后经历血清转换。

23.权利要求1-22任一项所述的疫苗组合物在制备药物中的用途。

24.权利要求23所述的用途，其中所述药物用于治疗婴儿。

25.权利要求23所述的用途，其中所述药物用于治疗老年对象、移植对象、患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的对象、或其任意组合。