CN110833546B

CN110833546B - 通佐溴胺在治疗胃癌中的用途

Info

Publication number: CN110833546B
Application number: CN201910753411.0A
Authority: CN
Inventors: 周兆才; 焦石; 聂平平; 汪雯佳; 赵允
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110833546A

Abstract

本发明涉及胃癌的治疗，具体是使用通佐溴胺作为活性成分用于治疗胃癌。本发明发现，通佐溴铵能明显抑制胃癌细胞增殖，可单独或与其它胃癌治疗药物联用，用于治疗胃癌。

Description

通佐溴胺在治疗胃癌中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及通佐溴胺在治疗胃癌中的用途。

背景技术

胃癌是消化系统的常见肿瘤，属于世界范围内尤其是中国病人致死率较高的恶性肿瘤，其病程隐匿，早期诊断极为困难。胃癌具有较大的地域差异，全世界新增胃癌病例70％以上在发展中国家，而东亚地区主要是中国、日本和韩国。目前世界上缺乏有效的针对胃癌的诊疗手段，形势极为严峻。

通佐溴铵(thonzonium bromide，TB)，CAS编号553-08-2，分子式为C₃₂H₅₅N₄O⁺·Br^-，为单阳离子去垢剂，其结构式如下所示：

目前已知通佐溴铵的生物学功能包括用于包被非病毒载体，作为潜在的、用于人类基因治疗的、安全的基因投递方式；酸化酵母细胞质，抑制液胞膜上ATP依赖的质子泵，破坏V-ATPase的功能，引起pH敏感导致的酵母细胞生长缺陷。在制药上，通佐溴铵目前仅有作为缓冲液成分添加于药物溶剂中。现有技术中并未见通佐溴铵用于治疗胃癌。

发明内容

本发明提供通佐溴铵和任选的PI3K抑制剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。

在一个或多个实施方案中，所述胃癌的细胞存在PI3KCA或KRAS突变。

在一个或多个实施方案中，所述PI3K抑制剂为LY294002。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物含有通佐溴铵作为活性成分。

在一个或多个实施方案中，所述药物组合物还含有其它胃癌治疗药物。

在一个或多个实施方案中，所述其它胃癌治疗药物为PI3K抑制剂，优选为LY294002。

本发明还提供一种药盒，所述药盒含有通佐溴铵、药学上可接受的辅料和任选的其它胃癌治疗药物。

在一个或多个实施方案中，所述通佐溴铵、药学上可接受的辅料和任选的其它胃癌治疗药物独立包装。

在一个或多个实施方案中，所述药盒含有通佐溴铵的药物组合物和任选的其它胃癌治疗药物，任选地，所述药物组合物和其它胃癌治疗药物独立包装。

本发明还提供一种胃癌治疗方法，所述方法包括给予胃癌患者治疗有效量的通佐溴铵或其药物组合物。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括同时或先后给予该胃癌患者其它胃癌治疗药物。

附图说明

图1：通佐溴铵对胃癌细胞增殖的影响。A-C分别显示0μm、1μm、2μm、4μm不同浓度的通佐溴铵处理不同胃癌细胞系以及正常细胞后细胞增殖的抑制率。D显示软琼脂糖克隆形成实验检测通佐溴铵及CB-5083对细胞增殖的影响。

图2：通佐溴铵对不同分子分型胃癌细胞的增殖抑制的影响。A、PI3KCA或KRAS突变胃癌细胞系与非突变细胞系，通佐溴铵处理后的IC50。B、统计分析突变细胞与非突变细胞的IC50差异。C、通佐溴铵与PI3K抑制剂LY294002共处理细胞对细胞增值抑制的影响。

图3：通佐溴铵在小鼠胃癌模型中对肿瘤的作用。A、小鼠胃癌模型制备流程图。B、通佐溴铵、CB-5083以及5-氟尿嘧啶对小鼠模型中肿瘤数量的影响。C、小鼠模型中胃的组化染色。D、免疫荧光检测HGC-27及GES-1细胞在通佐溴铵处理后，CHOP的免疫荧光水平。E、QPCR检测Bip、Chop、Dr5在不同条件下mRNA的表达水平。

图4：通佐溴铵、CB-5083及双硫仑在小鼠胃癌模型中对肿瘤的作用。A、小鼠胃癌模型制备流程图。B-C、小鼠中胃部肿瘤的大小。D、小鼠模型中肿瘤的抑制率。

图5：通佐溴铵的肿瘤治疗效果与肿瘤免疫相关。A、小鼠中胃部肿瘤的大小。B、小鼠模型中肿瘤的抑制率。C、小鼠中胃部肿瘤中CD8阳性T细胞的数量。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明发现，目前在制药上仅作为缓冲液成分添加于药物溶剂中的通佐溴铵能明显抑制胃癌细胞增殖。本发明因而提出使用通佐溴铵作为药物的活性成分来治疗胃癌。

因此，本发明提供一种胃癌治疗方法，包括给予胃癌患者治疗有效量的通佐溴铵。本文中，胃癌可以是现有技术已知的各种分类的胃癌，如大体形态分类，可分为早期胃癌和进展期胃癌；按组织病理学分类，可分为腺癌、腺鳞癌、鳞癌、类癌等，绝大多数是胃腺癌；按发病部位分类，可分为胃底贲门癌、胃体癌和胃窦癌等；按分子分型，包括EBV感染型、微卫星不稳定型、基因组稳定型和染色体不稳定型；按致病原因分，可包括幽门螺杆菌感染引发的胃癌等。使用通佐溴铵可治疗各种胃癌，尤其是具有PI3KCA和/或KRAS突变的胃癌，以及幽门螺杆菌感染引发的胃癌。

本文中，治疗有效量是指足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。例如，单一剂量中通佐溴铵的含量可以为0.1-100mg。

通佐溴铵可配制于药物组合物中，作为药物组合物中起治疗作用的活性成分。另外，该药物组合物还可任选地含有其它治疗胃癌的药物以及任选的药学上可接受的载体。常用于治疗胃癌的口服化疗药物包括但不限于替加氟、优福定和氟铁龙等。常用于治疗胃癌的静脉化疗药物包括但不限于氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉、依托泊苷和甲酰四氢叶酸钙等。常用于胃癌治疗的其它药物还包括紫杉醇、草酸铂、拓扑酶抑制剂和希罗达等。也可使用胃癌靶向治疗药物，包括但不限于表皮生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、细胞凋亡促进剂和基质金属蛋白酶抑制剂等。在其它实施方案中，可将通佐溴铵或其药物组合物与胃癌的免疫治疗共同施与。合适的免疫治疗包括非特异生物反应调节剂如卡介苗、香菇多糖等；细胞因子如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等；以及过继性免疫治疗如淋巴细胞激活后杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等的临床应用。

在某些实施方案中，将通佐溴铵与PI3K抑制剂同时或先后给予需要的患者。可使用本领域周知的PI3K抑制剂，包括但不限于Dactolisib、Dactolisib(BEZ235,NVP-BEZ235)、Pictilisib(GDC-0941)、LY294002、Idelalisib(CAL-101,GS-1101)、Buparlisib(BKM120,NVP-BKM120)、2-D08、Tenalisib(RP6530)、IPI-3063、Autophinib、Serabelisib(INK-1117,MLN-1117,TAK-117)、IPI-549、SF2523、PI-103、NU7441(KU-57788)、TGX-221、IC-87114、Wortmannin、XL147类似物、ZSTK474、Alpelisib(BYL719)、AS-605240、PIK-75HCl、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、A66、Voxtalisib(SAR245409,XL765)Analogue、PIK-93、Omipalisib(GSK2126458,GSK458)、PIK-90、AZD6482、PF-04691502、Apitolisib(GDC-0980,RG7422)、GSK1059615、Duvelisib(IPI-145,INK1197)、Gedatolisib(PF-05212384,PKI-587)、TG100-115、AS-252424、BGT226(NVP-BGT226)、CUDC-907、PIK-294、AS-604850、GSK2636771、Copanlisib(BAY 80-6946)、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584(SB2343)、Taselisib(GDC 0032)、CZC24832、AMG319、GSK2292767、GDC-0084、740Y-P(PDGFR 740Y-P)、GDC-0326、HS-173、Quercetin、VPS34抑制剂1(PIK-III类似物)、Voxtalisib(XL765,SAR245409)、GNE-317、umbralisib(TGR-1202)、Nemiralisib(GSK2269557)、LY3023414、VPS34-IN1、SAR405、PIK-III、PI-3065、Pilaralisib(XL147)、AZD8835、Deguelin、PF-4989216、LY294002和AZD8186等。更多的PI3K抑制剂的信息可参见：http://www.selleck.cn/PI3K.html，本文将其所公开的全部内容以引用的方式纳入本文。

可通过本领域常规的方式给予患者通佐溴铵或其药物组合物。常用的胃癌治疗药物途径包括但不先于口服、静脉、腹膜腔给药、动脉插管区域灌注给药等。

在某些实施方案中，本发明也提供一种药物组合物，尤其是用于治疗胃癌的药物组合物，该药物组合物含有作为活性成分的通佐溴铵以及药学上可接受的辅料。应理解的是，现有的药物制剂中可能会含有通佐溴铵，但这些药物制剂中通佐溴铵仅仅是作为辅料如缓冲液成分添加。而本发明中，药物组合物中的通佐溴铵是该药物组合物的活性成分，起到治疗目的。在某些实施方案中，该药物组合物中还可含有其它胃癌治疗药物，如前文所述的胃癌治疗药物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物中的活性成分仅为通佐溴铵。在某些实施方案中，本发明的药物组合物中的活性成分还包括其它胃癌治疗药物，尤其是PI3K抑制剂。

在某些实施方案中，本发明还提供一种药盒，其含有作为治疗活性成分的通佐溴铵。药盒中还可含有其它药学上可接受的辅料，以及任选的其它胃癌治疗药物。例如，药盒中可含有独立包装的通佐溴铵、药学上可接受的辅料以及任选的其它胃癌治疗药物。当需要使用药盒给药时，可使用该药学上可接受的辅料配制通佐溴铵成相应的制剂，如注射剂或灌注液，并与任选提供的其它胃癌治疗药物同时或先后给予。或者，药盒中可含有已配制成药物制剂的通佐溴铵制剂(即含有通佐溴铵和药学上可接受的辅料)和任选的其它胃癌治疗药物。

在某些实施方案中，本发明也包括通佐溴铵在制备胃癌治疗药物中的应用。在某些实施方案中，本发明也包括用于治疗胃癌的通佐溴铵或其药物组合物。所述胃癌可以是本领域周知的各种胃癌，包括前文所述的胃癌。

p97属于II型ATP酶家族，它参与包括内质网及线粒体参与的蛋白降解，自噬，细胞膜重组，DNA修复，细胞周期以及性别决定等一系列的生理过程。p97与其辅助因子Npl4，Ufd1，p47，UBXD7以及FAF1结合，并利用其分离酶的活性将底物从其细胞环境中剥离，最终多数进入蛋白酶体降解。已有的研究表明p97与其辅因子Npl4组成复合物参与内质网及线粒体降解途径等一系列生理过程，p97-Npl4复合物能够通过介导IκBα的降解来促进TNFα诱导的NF-κB信号通路。现有技术未曾披露p97-Npl4通路与胃癌之间的关系。本发明发现，给予p97抑制剂或Npl4抑制剂，可以抑制胃癌。因此，本发明还提供p97抑制剂和/或Npl4抑制剂在制备胃癌治疗药物中的应用。示例性的p97抑制剂包括但不限于CB-5083、NMS-873、DBeQ、ML240、NMS-859和NM241盐酸盐等，这类抑制剂可从例如MCE公司购买得到；示例性的Npl4抑制剂包括双硫仑和Npl4的抗体等。本发明还提供用于治疗胃癌的p97抑制剂、Npl4抑制剂或其组合。

在一些实施方案中，本发明还提供通佐溴铵与PI3K抑制剂、p97抑制剂和Npl4抑制剂中的任意一种、任意两种或全部三种在制备胃癌治疗药物中的应用。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物和药盒中，除含有通佐溴铵外，还可含有PI3K抑制剂、p97抑制剂和Npl4抑制剂中的任意一种、任意两种或全部三种。视情况，在本发明的治疗方法中，也可给予通佐溴铵外的PI3K抑制剂、p97抑制剂和Npl4抑制剂中的任意一种、任意两种或全部三种。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和常规的市售试剂。

基本实验方法：

1、细胞培养：SNU-16、HGC-27、SNU-1、MKN-45、AGS、MNK-28、SH-10-TC、MKN-1、NC-NH、SNU-216、KE-39、BGC-823、GES-1细胞从市售途径获得，分别培养于RPMI1640(Invitrogen)培养液中，培养液中添加10％血清，100μg/ml盘尼西林，100μg/ml链霉素。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。

2、细胞增殖实验：使用ATP细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖(Promega公司CellTiter-

Luminescent Cell Viability Assay)。在一块壁不透明的96孔板上准备好带培养基的细胞，100μl/孔，细胞数3000/孔，待第二天贴壁后加不同浓度的TB(0，1，2，3，4μM)，同时准备只含培养基不含细胞的对照孔，以得到背景发光值。48h后用PromegaCellTitter试剂测定细胞活力。将平板及其内容物平衡到室温，大约需要30分钟。向每孔中加入与细胞培养基体积相等的CellTiter-

试剂100μl。在一个定轨振荡器上混合内容物2分钟，诱导细胞裂解，然后将平板室温孵育10分钟，使萤光信号值稳定，记录发光信号。

3、软琼脂糖细胞克隆形成实验：细胞在细胞数量达到10⁴个后，接种至6孔板中的软琼脂糖上，14天后对直径大于0.05毫米的克隆进行计数。

4、细胞IC₅₀：利用Graphpad Prism软件处理数据细胞增殖实验结果，获得IC₅₀数值。

5、免疫荧光：2×10⁵个HGC-27或GES-1细胞接种于带有盖玻片的6孔板中，以不同浓度的通佐溴铵处理细胞。细胞经4％多聚甲醛及预冷的甲醇固定。以CHOP抗体对细胞进行染色,再以DAPI复染细胞核，蔡司LSM 710激光共聚焦显微镜检测细胞。

6、MNNG/HP幽门螺旋杆菌诱导建立小鼠胃癌模型

小鼠饲养于传染性疾病动物模型专用的培养室内，接受12小时光照，12小时黑暗的日夜节律。刮取培养与固体培养基中的幽门螺旋杆菌SS1，注射于小鼠，单次胃内注射量为1×10⁷CFU/ml。对照组小鼠注射等量生理盐水，隔离饲养。

动物培养及动物实验遵照中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会相关章程和动物福利政策。

7、免疫组化：组织样本按照BD Pharmingen^TM IHC Zinc Fixative手册(手册编号:550523)，采用锌剂固定(BD Biosciences)并进行石蜡包埋。组织切片(厚度5μm)通过加热固定，切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90％乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mMEDTA，pH8.0，或10mM Tris,pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。加入5％脱脂牛奶封闭60分钟。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。适当比例稀释一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入PBST，洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入PBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。选用DAB进行后续检测。DAB染色后进行HE染色。最后进行.脱水，透明，中性树脂封片。

8、组织中RNA的抽提：动物组织25-50mg，用液氮研磨成粉末，加入500μl TrizolReagent，室温处理5分钟。将裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中。每份样品加入100μl的氯仿，涡旋低速混匀后静置5分钟。4℃，12000g离心15分钟，转移240μl的上层水相至新的Eppendorf管中。每份样品加入240μl的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃，12000g离心15分钟，弃去上清，留下白色的RNA沉淀。每份样品加入500μl的75％乙醇，颠倒混匀。4℃，12000g离心5分钟，弃尽上清。室温晾干。加入适量DEPC处理过的去离子水，充分溶解。用

ND1000测定所提取的RNA的浓度，260nm的吸光值与280nm的吸光值的比值应维持在1.9-2.0之间。将所提取的RNA用于逆转录或直接冻到-80℃保存。

所需试剂的配制：

磷酸缓冲盐溶液(PBS)：800ml蒸馏水溶解0.2g KCl，8g NaCl，0.24g KH₂PO₄和1.44g Na₂HPO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，定容至1L。高压蒸汽灭菌或过滤除菌。

9、QPCR：实时定量荧光PCR采用Applied Biosystems公司两步法实时PCR(Realtime-PCR)系统，检测相对CT值。使用定量荧光PCR预混液(Toyobo公司提供2x

Green Realtime PCR试剂)配置反应体系检测并定量目标基因的表达水平，GAPDH作为内参。

10、数据分析：采用SAS数据软件分析包(9.1.3)对数据进行分析，统计数据的平均数±标准差。单因子变异数分析(ANOVA)以及Student’s t-test用于分析连续变量。置信区间为P<0.05。

实施例1：通佐溴铵对胃癌细胞的生长有抑制作用

1、实验目的：确定通佐溴铵对胃癌细胞生长的影响

2、实验方法：细胞培养及细胞增殖实验方法如基本实验方法1、2所述。细胞克隆形成实验如基本实验方法3所述。

3、实验结果及分析：

使用不同浓度(1μm、2μm、3μm、4μm)的通佐溴铵处理细胞，不添加通佐溴铵处理的细胞作为对照组(即0μm)。48h后用Promega公司的CellTiter-

试剂测定细胞活力。

结果如图1所示。通佐溴铵对细胞增殖具有抑制作用，其抑制率随浓度的增加而升高。其中通佐溴铵对胃癌细胞系SNU-16、HGC-27、SNU-1、AGS、MKN-1有明显的抑制增殖的作用，4μm通佐溴铵的抑制率超过80％(图1，A)；对胃癌细胞系MNK-28、NC-NH、SNU-216、BGC-823有较强的抑制增殖的作用，4μm通佐溴铵的抑制率超过60％(图1，B)；对胃癌细胞系MKN-45、SH-10-TC、KE-39以及正常细胞GES-1有一定的抑制作用，4μm通佐溴铵的抑制率在50％左右(图1，C)。以上结果表明，不同细胞对通佐溴铵的敏感性不同，通佐溴铵可以明显抑制胃癌细胞增殖，而对正常细胞的增殖抑制作用有限。

进一步地，通过软琼脂糖细胞克隆形成实验，分别以通佐溴铵以及已知的p97抑制剂，肿瘤先导化合物CB-5083处理癌细胞系。其中DMSO作为化合物的溶剂，作为空白对照。结果表明，CB-5083对癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，而通佐溴铵对癌细胞的抑制作用更为显著(图1，D)。

实施例2：通佐溴铵对不同分子分型胃癌细胞的生长的抑制效率

1、实验目的：确定胃癌细胞易感性与其分子分型是否存在相关性

2、实验方法：细胞IC50检测方法如基本实验方法4所述。胃癌细胞的生长的抑制效率检测同实施例1。

3、实验结果及分析：

由于实施例1中不同胃癌细胞表现出的对通佐溴铵的敏感性不同，我们根据目前的胃癌常用分子分型，选择以胃癌中突变率较高的PI3KCA以及KRAS突变作为检测目标，分析胃癌细胞对通佐溴铵的敏感性与分子分型的关系。结果如图2所示。结果表明，存在PI3KCA或KRAS突变的胃癌细胞，通佐溴铵的IC50值较低，而不存在上述突变的细胞，IC50值相对较高(图2，A)。综合比较PI3KCA或KRAS突变的胃癌细胞与不存在上述突变的细胞，统计结果表明PI3KCA或KRAS突变的胃癌细胞对通佐溴铵的敏感性更高(图2，B)。而在细胞中进一步加入PI3K抑制剂LY294002，与通佐溴铵联合用药可以进一步提高其抑制增殖的效果(图2，C)。

实施例3：通佐溴铵在小鼠胃癌模型中对肿瘤的作用

1、实验目的：在小鼠胃癌模型中研究通佐溴铵对胃癌的作用

2、实验方法：

(1)小鼠胃癌模型构建方法如基本实验方法6所述。180天后，处死小鼠，对其胃壁上的肿瘤进行计数，并取样进行免疫组化实验。免疫组化实验方法如基本实验方法7所述。

(2)对HGC-27及GES-1细胞进行免疫荧光的实验方法如基本实验方法8所述。

(3)Bip，Chop以及Dr5在细胞中转录水平的检测：细胞抽提总RNA方法如基本实验方法8所述，AMV逆转录酶合成第一链，并以其为模板，在DNA taq酶的作用下用对应的引物进行PCR扩增；逆转录体系见表1，逆转录反应程序见表2，细胞样品扩增PCR引物见表3，Realtime-PCR反应体系见表4，Realtime-PCR扩增程序见表5。

表1：逆转录反应体系

表2：逆转录程序

37℃	15min
		50℃	5min
95℃	5min
		4℃	20min

表3：引物序列

表4：Realtime-PCR反应体系

表5：PCR反应体系程序设定

3、实验结果及分析：

实验小鼠采用MNNG/HP幽门螺旋杆菌诱导建立小鼠胃癌模型(图3，A)，180天后处死小鼠，取出小鼠的胃部，对胃壁上的肿瘤进行计数。结果表明，喂食通佐溴铵的小鼠，胃壁上的肿瘤数量远小于对照小鼠，且具有剂量依赖效应。而喂食了p97抑制剂的CB-5083以及化疗药物5-氟尿嘧啶的小鼠，其肿瘤数量相对对照组也有明显下降，但所需剂量更大(图3，B)。组化实验也显示了相同的结果(图3，C)。因而，在小鼠胃癌模型中，通佐溴铵比CB-5083及5-氟尿嘧啶有更明显的肿瘤抑制作用。

进一步地，在胃癌细胞HGC-27及正常细胞GES-1中检测通佐溴铵处理后，内质网应激介导细胞凋亡的特异性转录因子CHOP的免疫荧光水平。结果表明，4μm通佐溴铵处理后HGC-27细胞中CHOP的免疫荧光水平明显上升，而正常细胞GES-1中CHOP的免疫荧光水平无明显变化(图3，D)。同样，对上述小鼠提取组织，通过QPCR检测内质网应激介导细胞凋亡相关的基因Bip、Chop以及Dr5的mRNA表达水平。通佐溴铵处理后，上述基因的表达水平上调，CB-5083也有同样的趋势，但通佐溴铵的上调水平更高(图3，E)。以上结果表明，通佐溴铵在胃癌中具有抑制肿瘤增殖的作用。

实施例4：通佐溴铵与p97抑制剂CB-5083及Npl4抑制剂双硫仑在小鼠胃癌模型中对肿瘤的作用

1、实验目的：已有研究表明通佐溴胺可以抑制p97与Npl4的相互作用。因而选取p97抑制剂CB-5083及Npl4抑制剂双硫仑，在小鼠胃癌模型中，比较通佐溴铵、CB-5083及双硫仑对胃癌的作用。

2、实验方法：小鼠注射5X10⁵个小鼠胃癌细胞(MFC细胞)。1周后开始皮下注射通佐溴胺或CB-5083或双硫仑，注射量为50mg/kg，对照组注射PBS，共注射4次。2周后，处死小鼠，对其胃壁上肿瘤的体积进行检测，以肿瘤的体积计算抑制率。

3、实验结果及分析：实验小鼠建立胃癌模型并使用药物处理(图4，A)。以未注射药物的小鼠作为对照组。结果表明，采用通佐溴胺、CB-5083及双硫仑处理的小鼠对胃肿瘤组织大小均小于对照组。其中，通佐溴胺(TB)处理的小鼠胃肿瘤组织的大小最小(图4，B)。进一步地进行定量分析，CB-5083及双硫仑(DSF)的肿瘤抑制率接近40％，而通佐溴胺的肿瘤抑制率超过80％(图4，C和D)。因而，在小鼠模型中，通佐溴胺展示出比现有p97及Npl4抑制剂更为显著的肿瘤治疗效果。

实施例5：通佐溴铵的肿瘤治疗效果与肿瘤免疫相关

1、实验目的：研究通佐溴胺治疗肿瘤的机制。

2、实验方法：在正常小鼠以及先天性免疫缺陷的小鼠BALB/c nude/nude中进行小鼠胃癌模型构建并用通佐溴胺处理，实验方法同实施例4。

3、实验结果及分析：先天性免疫缺陷的小鼠的胃部肿瘤体积均大于正常小鼠(图5，A和B)。正常小鼠和先天性免疫缺陷小鼠在通佐溴胺(TB)处理后，胃部肿瘤体积均减少，在正常小鼠中肿瘤抑制率超过80％，而在先天性免疫缺陷小鼠中抑制率仅接近40％。这表明通佐溴胺对肿瘤的治疗效果与肿瘤免疫相关。

进一步地，将小鼠的胃部肿瘤取出，消化为单细胞，标记CD8流式抗体，进行流式检测。结果表明，通佐溴胺处理后，肿瘤细胞中的CD8阳性T细胞的数量显著增加(图5，C)，通佐溴胺具有肿瘤免疫作用。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 通佐溴胺在治疗胃癌中的用途

<130> 185559

<150> CN 201810940216.4

<151> 2018-08-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acttggggac cacctattcc t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcctggta tgaggatctg c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctgggga tgagatatag gtg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtagaaa cccgatgcaa c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgtcagtgc agttagagca 20

Claims

1.通佐溴铵在制备治疗胃癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌的细胞存在PI3KCA或KRAS突变，或所述胃癌为幽门螺杆菌感染引发的胃癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌为胃腺癌。

4.通佐溴铵和PI3K抑制剂LY294002的组合在制备治疗胃癌的药物或药盒中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胃癌的细胞存在PI3KCA或KRAS突变，或所述胃癌为幽门螺杆菌感染引发的胃癌。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胃癌为胃腺癌。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药盒含有通佐溴铵、药学上可接受的辅料和所述PI3K抑制剂LY294002。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述通佐溴铵、药学上可接受的辅料和所述PI3K抑制剂LY294002独立包装。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药盒含有通佐溴铵的药物组合物和所述PI3K抑制剂LY294002。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物组合物和所述PI3K抑制剂LY294002独立包装。