CN116115617A - 一种抗肺癌的药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肺癌的药物及其应用。属于医药技术领域。本发明采用抑制剂YM155或siRNA靶向Survivin，同时与铁死亡诱导剂Erastin联合使用，能够在一定程度促进Erastin诱导的铁死亡，同时诱导细胞凋亡，对消除于耐药性具有一定的作用。凋亡抑制剂z‑VAD‑fmk和铁死亡抑制剂Lip‑1可以逆转Erastin联合YM155诱导的细胞毒性，同时Erastin联合YM155诱导了自噬的活化和GPX4的降解，同时脂质过氧化水平和线粒体膜电位的增加。抑制Survivin的表达促进了GPX4的自噬性降解，促进非小细胞肺癌细胞发生铁死亡与凋亡。通过将YM155和Erastin联合使用，显著增强了同一剂量下对非小细胞肺癌细胞的细胞毒性，两种药物之间有协同作用，显著增加了药物的抗肿瘤作用。

Description

一种抗肺癌的药物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗肺癌的药物及其应用。

技术背景

原发性支气管肺癌，简称肺癌，是全球范围内最常见一种癌症，也是导致癌症死亡的主要原因，2020年全球新发肿瘤达1.93亿人次，相关死亡达0.10亿人次。肺癌的发病率和死亡率都在迅速增长，阻碍了世界各国预期寿命的提高，预计2020年新增肺癌病例约 247，270例，其中男性 130，340例，女性 116，930 例。与大多数国家相比，中国的肺癌死亡率相对较高，预计2015年至 2030年，中国的肺癌死亡率可能增加约40%。肺癌包括非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC），其中 NSCLC 约占 85%以上。

2012年Dixon首次提出铁死亡这种新的死亡模式。铁死亡是一种铁依赖和活性氧（ROS）依赖的细胞死亡形式，在形态学方面，发生铁死亡的细胞线粒体嵴减少或消失，线粒体外膜破裂，线粒体内膜浓缩。在生化方面，发生铁死亡的细胞表现为铁离子水平升高，ROS水平增加，谷胱甘肽过氧化物酶 4(glutathione peroxidase4，GPX4)失活或耗竭，脂质代谢产物堆积。与正常细胞相比，肿瘤细胞更易发生铁死亡。肿瘤细胞内铁离子含量、氧化应激水平均高于同类型正常细胞，在肿瘤细胞中脂自由基解毒酶表达下调，导致肿瘤细胞对铁死亡诱导剂更为敏感，诱导铁死亡可能是清除肿瘤细胞特别是耐药肿瘤细胞的有效策略。但研究发现，肺癌细胞对铁死亡不敏感，极大的阻碍了诱导铁死亡治疗肺癌的前景，因此，探明肺癌细胞抵抗铁死亡的分子机制至关重要。

目前抗肿瘤的研究主要集中于消除残留或耐药的肿瘤细胞，铁死亡是以此为目的一种新的细胞死亡形式。已获得的高间质细胞状态的癌细胞（如上皮-间质转化（EMT）或癌症干细胞）已被认为是决定癌症转移扩散和化疗抗性的关键。最近，具有高间质状态的癌细胞已经成为对靶向治疗的获得性和新的抗性的重要机制。这种治疗耐药的间充质癌细胞已经培育出一种抑制GPX4的状态，这种抑制将直观地导致铁死亡。通过休眠状态逃避常规细胞毒治疗的顽固性癌细胞显示出对GPX4途径的相同的选择依赖性。

铁死亡也被认为是一种促炎症过程。通过传递化学诱导信号，铁死亡能在肿瘤部位聚集和激活免疫细胞，这为铁死亡诱导剂作为抗肿瘤免疫疗法（如检查点抑制剂）的合适增强剂提供了可能性。Erastin作为一种铁死亡诱导剂可以与各种药物如顺铂、替莫唑胺、多柔比星/阿霉素和阿糖胞苷/阿拉霉素一起用于不同类型的癌症。尽管目前对铁死亡诱导剂参与的铁死亡途径中的详细机制了解有限，但铁死亡可能提供一种新的细胞死亡形式，以对抗耐药性并增强宿主免疫系统。因此，铁死亡被认为是逆转癌症治疗耐药性的可行治疗策略。

IAPs主要包括c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Livin、Survivin等，IAPs在多种类型肿瘤组织和细胞系中高表达，其高表达与肿瘤进展、耐药性产生以及肿瘤患者不良预后密切相关。其中，Survivin表达于胚胎和胎儿期，然而在成人细胞几乎检测不到其表达。Survivin在肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种类型肿瘤中高表达，并与肿瘤患者的不良预后密切相关。Survivin在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭、耐药过程中发挥非常重要的作用，Survivin被认为是非常有希望的肿瘤治疗靶点。

本发明前期实验发现非小细胞肺癌细胞系A549和H460均对铁死亡诱导剂Erastin不敏感，尽管Erastin可抑制A549细胞活性，但并未显著诱导铁死亡，然而肺癌细胞对Erastin等铁死亡诱导剂不敏感的分子机制尚不清楚。本发明推测凋亡抑制蛋白家族（IAPs）可能抵抗Erastin诱导的铁死亡。基于前期实验发现，本发明进一步采用蛋白免疫印迹检测Erastin对肺癌细胞内IAPs表达的影响。结果显示，Erastin显著上调肺癌细胞内Survivin的表达，但并不影响其它IAPs的表达（c-IAP1、c-IAP2、XIAP），更加证实了本发明上述的推测，即Survivin可能与铁死亡抵抗相关。目前还未有Survivin拮抗肺癌细胞铁死亡的机制研究报道。

现有技术存在下述缺点：外科手术治疗是治愈早期肺癌的主要手段,对于早期NSCLC患者(Ⅰ、Ⅱ期)以及部分Ⅲa期NSCLC患者, 手术切除仍是首选的治疗方法。但是由于很多 NSCLC 患者确诊时已处于晚期阶段，失去了最佳手术时机，主要是采用放化疗为主的治疗方案。单纯常规分割放射治疗的效果极不理想, 晚期NSCLC常规放疗的5年生存率仅为3%~10%, 生存时间为6~11个月。化疗在肺癌的治疗中占有非常重要的地位, 几乎适用于各种病理类型的肺癌。化疗可以单独应用于晚期肺癌, 而更多的是与手术、放疗相联合。目前临床上常用化疗方案主要是铂类和第三代细胞毒性药物的联合化疗, 第三代细胞毒性药物主要包括紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨等药物。联合化疗与最佳支持治疗相比, 含铂类药物的联合化疗明显改善和控制患者临床症状, 提高生活质量, 延长生存期。但是, 联合化疗不良反应大，对患者的生活质量造成了较大的影响，同时，最重要的是，长期使用化疗药物，容易对药物产生耐药性，极大的阻碍了肺癌的治疗。随着人们对肿瘤分子生物学和基因水平的深入研究, 分子靶向药物的研究和临床应用已成为当前肺癌领域的热点, 分子靶向药物主要包括:表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂、血管生成抑制剂和棘皮动物微管蛋白样4-间变淋巴瘤激酶 (EML4-ALK) 抑制剂等。多项临床试验显示，将分子靶向药物与化疗药物联合使用能够一定程度上缓解化疗药物的耐药性，作为一线治疗选择之一。但是，靶向治疗是针对癌的驱动基因进行药物抑制和阻断，进而杀死癌细胞，所以需要确定患者具有相应的基因突变，仅部分患者适用。其次，靶向治疗药物的研发时间较长，因此治疗费用较高。并且，目前所有靶向药物产生耐药性的概率为100%，只是针对不同的患者，出现耐药的时间早晚不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肺癌的药物及其应用。本发明采用抑制剂YM155或siRNA靶向Survivin，同时与铁死亡诱导剂Erastin联合使用，能够在一定程度促进Erastin诱导的铁死亡，同时诱导非小细胞肺癌细胞发生凋亡和铁死亡，对消除于耐药性具有一定的作用。有助于解决肿瘤治疗领域的一大难点——耐药性，且有助于拓展对铁死亡调控机制的理解，并为以铁死亡为基础的肺癌治疗方案提供依据，具有较好的临床应用前景。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种抗肺癌的药物，以Survivin 抑制剂 YM155和Erastin为活性成分，两者之间的摩尔浓度比为1︰1000。

一种抗肺癌的药物，以Survivin siRNA和Erastin为活性成分，两者之间的摩尔浓度比为1︰1000。

一种抗肺癌的药物，以JNK抑制剂SP、ERK抑制剂U0126、p38抑制剂SB、Erastin和YM155为活性成分，五者之间的摩尔浓度比为1︰1︰1︰1︰1000。

上述任其一种的技术方案在制备消除耐药性的肺癌药物中的应用。

上述任其一种的技术方案在制备促进Erastin诱导的铁死亡的肺癌药物中的应用。

如所述的药物，其中所述药物成分能够促进Erastin诱导的铁死亡，从而达到治疗肺癌的作用。

如所述的药物，其中所述药物成分能够诱导细胞凋亡和铁死亡，消除耐药性，从而达到治疗肺癌的作用。

如所述的药物，其中所述药物成分YM155或siRNA靶向Survivin，同时与铁死亡诱导剂Erastin联合使用，促进Erastin诱导的铁死亡，从而达到治疗肺癌的作用。

本发明用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99%，优选为0.5-90%的本发明上述组方，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体。所述的药用载体是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射（静注、肌注）和口服两种形式给药。

本发明具备如下的优益性：

本发明采用抑制剂YM155或siRNA靶向Survivin，同时与铁死亡诱导剂Erastin联合使用，能够在一定程度促进Erastin诱导的铁死亡，同时诱导细胞凋亡，对消除于耐药性具有一定的作用。并且进一步阐明了肺癌细胞抵抗铁死亡的分子机制，具有较好的临床应用前景。

本发明的组方简单易行，毒性低，疗效显著，可使疗效有显著的协同增效作用。同时，本发明的组方靶向Survivin，降低了用药量，对于消除耐药性的产生，有很大的帮助，在临床上有良好的应用前景。

凋亡抑制剂z-VAD-fmk和铁死亡抑制剂Lip-1可以逆转Erastin联合YM155诱导的细胞毒性，同时Erastin联合YM155诱导了自噬的活化和GPX4的降解，同时脂质过氧化水平和线粒体膜电位的增加。抑制Survivin的表达促进了GPX4的自噬性降解，促进非小细胞肺癌细胞发生铁死亡与凋亡。通过将YM155和Erastin联合使用，显著增强了同一剂量下对非小细胞肺癌细胞的细胞毒性，两种药物之间有协同作用，显著增加了药物的抗肿瘤作用。

附图说明

图1. Erastin上调肺癌细胞内Survivin的表达。

图2. 干预Survivin表达增敏Erastin诱导的抗肿瘤作用。

图3. 干预Survivin促进Erastin诱导的GPX4降解。

图4. 干预Survivin增敏Erastin诱导的细胞毒性依赖自噬活化。

图5. 干预Survivin增敏Erastin诱导细胞凋亡与铁死亡。

图6. 阻断Survivin增敏Erastin抗肿瘤活性依赖MAPKs通路。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

本发明整个体系主要包含通过靶向Survivin增敏Erastin的抗肺癌作用。本技术通过采用抑制剂YM155或siRNA转染敲低Survivin的表达，研究干预Survivin后Erastin诱导铁死亡的能力及其抗肿瘤作用。结果显示，抑制Survivin的表达明显增强了Erastin诱导非小细胞肺癌细胞死亡的能力，明显增强了其抗非小细胞肺癌的能力。因此，靶向Survivin可增敏Eastin的抗肿瘤能力，Survivin可作为降低非小细胞肺癌细胞对铁死亡拮抗作用的重要靶点。

相应步骤主要有：

1.靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用。

2.根据所述的靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用，其中所述Erastin能够显著上调非小细胞肺癌细胞中Survivin的表达。

3.根据所述的靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用，其中所述靶向Survivin通过使用抑制剂YM155或siRNA转染敲低Survivin的表达。

4.根据所述的靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用，其中所述YM155（10n M）与Erastin能够明显促进肺癌细胞的死亡，并且其抑制效率呈剂量依赖性。

5.根据所述的靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用，其中所述的肺癌细胞的死亡形式为凋亡和铁死亡。

6. 根据所述的靶向Survivin增敏Erastin在抗肿瘤中的作用，其中所述靶向Survivin通过促进GPX4的降解达到促进Erastin的抗肿瘤作用。

7.根据所述的靶向Survivin通过促进GPX4的降解达到促进Erastin的抗肿瘤作用，其中所述GPX4的降解依赖于自噬调控。

8.根据所述的靶向Survivin通过促进GPX4的降解达到促进Erastin的抗肿瘤作用，其中所述GPX4与Survivin发生相互作用并抵抗铁死亡。

9.根据所述的靶向Survivin促进GPX4的降解达到促进Erastin的抗肿瘤作用，其中所述GPX4的降解依赖于MAPKs通路。

实施例1

Erastin上调非小细胞肺癌细胞内Survivin的表达。

具体实施方式如下：

步骤一，采用DMSO溶解Erastin并调整浓度为10μM，非小细胞肺癌细胞A549和H460经Erastin处理 0、2、4、 8、24、36 h，提取总蛋白，采用蛋白免疫印迹检测IAPs家族XIAP、c-IAP1、c-IAP2、和Survivin的表达，明确 Erastin 是否影响 IAPs 蛋白的表达水平。

步骤二，采用DMSO溶解Erastin并调整浓度为20μM，非小细胞肺癌细胞A549和H460经Erastin处理8 h，提取总RNA，逆转录为cDNA，利用q-PCR检测IAPs家族XIAP、c-IAP1、c-IAP2、和Survivin的表达，明确Erastin是否影响IAPs mRNA 的表达水平。

实施例2

干预 Survivin 表达增敏 Erastin 诱导的抗肿瘤作用。

具体实施方式如下：

步骤一，结合 Survivin 抑制剂 YM155（10 n M）或siRNA （10 n M）阻断其表达，联合Erastin（0、5、10、20μM）共同作用于肺癌细胞，利用CCK8、流式细胞术和结晶紫染色检测细胞活性和细胞死亡情况，验证干预 Survivin 表达增强 Erastin 的抗肿瘤作用。

步骤二，采用凋亡抑制剂 z-VAD-fmk、铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1、Liproxstatin、铁离子螯合剂 deferoxamine mesylate 等预处理肺癌细胞 1 h，随后利用Erastin（10 μ M）和 YM155（10 n M）共同处理 60 h，利用 CCK8、流式细胞术、结晶紫染色检测细胞活性和死亡情况，明确干预 Survivin增敏Erastin 诱导的细胞死亡类型。同时，利用蛋白免疫印迹检测细胞凋亡相关蛋白Caspase 3和PARP以及铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的表达。

步骤三，结合 Survivin 抑制剂 YM155（10 n M）阻断其Survivin的表达，联合Erastin（10μM）共同作用于肺癌细胞，为了测量细胞内线粒体膜电位的变化，将细胞与JC-1在37℃，黑暗中孵育30分钟，用PBS洗涤三次，并通过荧光显微镜检测细胞内线粒体膜电位的变化。

步骤四，结合 Survivin 抑制剂 YM155（10 n M）阻断其Survivin的表达，联合Erastin（10μM）共同作用于肺癌细胞，为了测量细胞内ROS产生，将细胞与DCFH-DA(10μm)在37℃，黑暗中孵育30分钟，用PBS洗涤三次，并通过流式细胞仪检测细胞内活性氧含量变化。

步骤五，结合Survivin 抑制剂 YM155（10 n M）阻断其Survivin的表达，联合Erastin（10μM）共同作用于肺癌细胞，为了测量细胞内脂质过氧化水平，将细胞与BODIPY581/591 C11探针在37℃，黑暗中孵育30分钟，用PBS洗涤三次，并通过荧光显微镜观察细胞内脂质过氧化水平的变化。

实施例3

Survivin 调控 GPX4 表达抵抗铁死亡的分子机制。

具体实施方式如下：

（1）Survivin 调控 GPX4 表达的分子机制

采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M）敲低Survivin表达，利用Erastin（10 μ M）处理肺癌细胞 60 h，提取总蛋白，利用蛋白免疫印迹检测GPX4、SLC7A11等铁死亡相关蛋白的表达。

（2）阻断 Survivin 增强 Erastin 抗肿瘤活性依赖自噬

步骤一，采用Erastin（10μM）联合YM155共同作用于肺癌细胞，处理10 h，提取总蛋白，检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达情况。

步骤二，采用自噬抑制剂CQ或通过siRNA转染敲低自噬相关基因Beclin1的表达，阻断肺癌细胞自噬活性，随后利用 Erastin（10 μ M）和 YM155（10 n M）共同处理60 h，结合 CCK8和流式细胞术检测细胞活性和死亡情况；

步骤三，研究Erastin和YM155联合诱导的GPX4降解是否依赖自噬，采用自噬抑制剂CQ阻断肺癌细胞的自噬活性，随后利用Erastin（10μM）和YM155（10 n M）共同作用于肺癌细胞，处理60 h，提取总蛋白，用蛋白免疫印迹检测GPX4、SLC7A11等相关蛋白的表达。

（3）阻断Survivin增敏Erastin抗肿瘤活性依赖MAPKs通路

步骤一，采用Erastin（10μM）和YM155（10 n M）共同作用于肺癌细胞，处理4 h，提取总蛋白，利用蛋白免疫印迹检测MAPKs蛋白表达情况。

步骤二，采用JNK抑制剂SP、ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB预处理癌细胞1h，随后利用 Erastin（10μM）和 YM155（10 n M）共同处理60 h，利用 CCK8、流式细胞术和结晶紫染色检测细胞活性和死亡情况，明确干预 Survivin增敏Erastin 抗肿瘤作用是否依赖MAPKs通路。

步骤三，采用JNK抑制剂SP、ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB预处理癌细胞1 h，随后利用 Erastin（10μM）和 YM155（10 n M）共同处理60 h，提取总蛋白，利用蛋白免疫印迹检测GPX4、SLC7A11等相关蛋白的表达，明确抑制MAPKs是否可以恢复GPX4的表达。

上述结果表明，凋亡抑制剂z-VAD-fmk和铁死亡抑制剂Lip-1可以逆转Erastin联合YM155诱导的细胞毒性，同时Erastin联合YM155诱导了自噬的活化和GPX4的降解，同时脂质过氧化水平和线粒体膜电位的增加。可以得出结论，抑制Survivin的表达促进了GPX4的自噬性降解，促进非小细胞肺癌细胞发生铁死亡与凋亡。通过将YM155和Erastin联合使用，显著增强了同一剂量下对非小细胞肺癌细胞的细胞毒性，两种药物之间有协同作用，显著增加了药物的抗肿瘤作用。

制剂实施例

在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定。

1. 采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），用 DMSO 溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为 0.5~5 mg/mL。

2. 采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），用 DMSO 溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。

3. 将采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按其与赋形剂质量比为 9:1 的比例加入赋形剂，制成粉剂。

4. 将采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按其与赋形剂质量比为 5:1 的比例加入赋形剂，制粒压片。

5. 将采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按常规口服液制备方法制成口服液。

6. 将采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按其与赋形剂质量比为 5:1 的比例加入赋形剂，制成胶囊。

7. 将采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按其与赋形剂质量比为 5:1 的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。

8.取采用抑制剂YM155（10 n M）或 Survivin siRNA（10 n M），和，Erastin（10 μM），按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (8)

1.一种抗肺癌的药物，以Survivin 抑制剂 YM155和Erastin为活性成分，两者之间的摩尔浓度比为1︰1000。

2.一种抗肺癌的药物，以Survivin siRNA和Erastin为活性成分，两者之间的摩尔浓度比为1︰1000。

3.一种抗肺癌的药物，以JNK抑制剂SP、ERK抑制剂U0126、p38抑制剂SB、Erastin和YM155为活性成分，五者之间的摩尔浓度比为1︰1︰1︰1︰1000。

4.权利要求1-3任其一在制备消除耐药性的肺癌药物中的应用。

5.权利要求1-3任其一在制备促进Erastin诱导的铁死亡的肺癌药物中的应用。

6.如权利要求1-3所述的药物，其特征在于所述药物成分能够促进Erastin诱导的铁死亡，从而达到治疗肺癌的作用。

7.如权利要求1-3所述的药物，其特征在于所述药物成分能够诱导细胞凋亡和铁死亡，消除耐药性，从而达到治疗肺癌的作用。

8.如权利要求1-3所述的药物，其特征在于所述药物成分YM155和siRNA靶向Survivin，同时与铁死亡诱导剂Erastin联合使用，促进Erastin诱导的铁死亡，从而达到治疗肺癌的作用。

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