CN109364079B - 塔拉帕尼在制备治疗或者预防肝炎病毒相关疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PARP抑制剂塔拉帕尼或其盐、溶剂合物在制造治疗肝炎病毒所致相关疾病药物中的用途。所述疾病为乙型肝炎病毒感染及与乙型肝炎病毒感染相关性疾病，包括急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌或胆管细胞癌等，塔拉帕尼单药或与其它抗癌药联用可以有效清除乙型肝炎病毒宿主细胞以及抑制乙肝病毒阳性肿瘤细胞的生长，与其他类型的PARP抑制剂如奥拉帕尼相比较等，塔拉帕尼具有明显的剂量和疗效优势：塔拉帕尼在较低剂量范围内(0.015‑0.275mg/kg/天)，可以更有效地控制乙型肝炎病毒感染和抑制乙肝病毒阳性肿瘤的进展，可以更有效地控制相对晚期，较大体积(不小于400mm³)乙肝病毒阳性肿瘤的增殖，是目前唯一可以治愈此类肿瘤的抗癌药物。

Description

塔拉帕尼在制备治疗或者预防肝炎病毒相关疾病药物中的 用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及PARP抑制剂塔拉帕尼在制备治疗或者预防乙肝病毒感染及其引起的相关疾病的药物中的用途。

背景技术

急性乙型肝炎病毒（Hepatitis virus B，HBV）感染后常常转化为慢性感染，长期乙型肝炎病毒活动造成肝细胞损伤和坏死，刺激促发肝细胞再生和增殖，局部免疫反应，引起肝脏病变，包括肝纤维化、肝硬化和肝癌等。

原发性肝癌是目前第四位的常见恶性肿瘤及第三位的肿瘤致死病因。乙型肝炎病毒引起的肝细胞肝癌占原发性肝癌的90%以上，根据其临床及病理分期，可采用手术切除、局部消融、介入治疗（TACE）、放化疗及姑息治疗等主要手段。肝癌的分期对于预后的评估、合理治疗方案的选择至关重要。对于体积较小的早期肝癌（Ia期和Ib期）患者趋向于使用根治疗法，包括手术切除、肝移植及局部消融，患者5年存活率可达70%；中期肝癌（IIa期和IIb期）患者首选介入治疗，其估计的中期生存率为26月。然而，因大多数患者确诊时已处于中晚期，在美国仅有30%患者有采用此类治疗的机会。多数病人就诊时已处于晚期（IIIa期和IIIb期），此类病人主要采用化疗，多激酶抑制剂索拉菲尼（Sorafenib）是目前唯一FDA批准的晚期肝癌化疗有效药物，可延长患者生存期8-11月，在中国仅延长3个月，患者经常出现腹泻、高血压、体重减轻、皮肤毒及低磷酸盐血症等毒副作用；而其他常用化疗药如阿霉素、顺铂类及紫杉醇类药物等，均无明显治疗效果。而终末期（IV期）病人，则只能采用支持或姑息疗法改善患者症状和生活质量。由此可见，大多数肝癌患者确诊时属于晚期且体积较大的肝癌，还有约70%早期根治性治疗患者会出现肿瘤复发，治疗效果极不理想，研究开发新的更有效的治疗药物和方法成为当前肝癌治疗领域的迫切需求。

目前还未发现能够有效消除乙型肝炎病毒感染细胞和针对肝癌的有效治疗方法。肝癌对化学药物的抵抗性高，易于发生耐药，要达到暂时控制肿瘤生长、延长患者生存时间的目标都很困难，因此开发新一代肝癌化学疗法或靶向治疗的临床需求特别迫切，其关键是发现能够有效杀伤乙型肝炎病毒宿主细胞或病毒阳性肝癌细胞的化学药物。

塔拉帕尼（Talazoparib）属于多聚（ADP-核糖）聚合酶（poly(ADP-ribose)polymerase）家族的PARP-1及PARP-2 参与调节核内多聚（ADP-核糖）链式结构，对修复DNA复制过程中产生的DNA损伤发挥关键生化功能。活化的PARP利用NAD+在目标核蛋白上合成聚ADP核糖链。PARP-1对于通过BER通路修复SSBs是必不可少的，其中，PARP-1招募BER关键蛋白如DNA聚合酶β和XRCC1。PARP-1也在DSB修复中发挥作用，其在DSB修复中介导MRE11和NBS，DSB修复通路、NHEJ 和 HRR的关键蛋白的招募。因此，抑制PARP-1能使肿瘤细胞对诱导DNA损伤的化疗药物如铂类、环磷酰胺、喜树碱等变得敏感，导致放化疗细胞毒性的增强。第一代PARP抑制剂（3-AB）及衍生物可以增强辐射毒性效应，但由于缺乏特异性，在临床上不适用。第二代PARP抑制剂如Olaparib、BGB-290、Niraparib和Rucaparib的开发，则具有低毒、高特异性和高效抑制活性，对带有家族性或者散发BRCA1/BRCA2基因突变携带者的乳腺癌，卵巢癌和前列腺癌居于相当不错的临床疗效，有些药物如Olaparib、Niraparib和Rucaparib已经通过了FDA批准上市（。这些实验和临床证据均表明，PARP抑制剂可以通过合成致死（synthetic lethality）的原理用于治疗具有同源重组修复缺陷的肿瘤，其治疗对象不局限于肿瘤的组织来源。

塔拉帕尼是一种新的PARP抑制剂，同样具有低毒、高特异性和高效抑制活性，目前正在III期临床试验用于乳腺癌和卵巢癌适应症的治疗。

本发明人在研究肝癌发生分子机制的过程中，意外的发现乙肝病毒编码的病毒癌基因（HBx）具有抗同源重组修复的功能，其对DNA修复机制的影响类似于乳腺癌和卵巢癌中的BRCA1/BRCA2突变，导致乙肝病毒感染细胞或具有HBx表达的细胞发生DNA修复缺陷，该机制造成HBV慢性感染过程中宿主细胞突变积累和染色体畸变水平增高，是促进肝癌发生的重要病毒源性因素。进一步研究发现塔拉帕尼单药可通过清除乙肝病毒携带细胞，显著降低血清HBV-DNA拷贝数以及乙肝表面抗原（HBsAg）水平，用于预防或治疗乙型肝炎病毒的感染及相关疾病。通过小鼠肿瘤移植实验，还证明塔拉帕尼可以抑制乙肝病毒阳性肝癌的进展。

重要的是，与现有药物和其他PARP抑制剂（奥拉帕尼，尼拉帕尼和BGB-290等）相比较，塔拉帕尼具有明显的剂量和疗效优势：塔拉帕尼在较低剂量范围内（0.015-0.275 mg/kg/天），可以更有效地控制乙肝病毒感染和抑制乙肝病毒阳性肝癌的进展，可以更有效地控制相对晚期和大体积乙肝病毒阳性肿瘤（400 mm³以上）的增殖，并且是唯一有望根除乙肝病毒阳性肝癌的抗癌药物。

因此，本发明人的研究的结果表明PARP抑制剂塔拉帕尼可以有效清除乙型肝炎病毒感染的宿主细胞，对相对晚期和大体积乙肝病毒阳性的肿瘤也有显著的作用和疗效。这一结果在乙型肝炎病毒相关疾病的临床治疗中意义重大，有潜力替代目前肝炎和肝癌治疗中常用的抗病毒药物或抗肿瘤药物，实现对乙型肝炎病毒引起的相关疾病真正的治愈。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种PARP抑制剂塔拉帕尼或其在药学上可接受的盐或酯类化合物在制造预防或治疗乙型肝炎病毒感染及其引起的相关疾病的药物中的用途。

塔拉帕尼（Talazoparib）的化学结构如下：

其化学名为： (8S,9R)-5-氟-8-(4-氟苯基) -9-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)- 2,7,8,9-四氢-3H-吡啶并[4,3,2-DE]酞嗪-3-酮

上述本发明的用途，塔拉帕尼或其在药学上可接受的盐或酯类化合物制造治疗和/或者预防乙型肝炎病毒感染及乙型肝炎病毒感染引起的疾病，和/或控制肝炎病毒感染滴度和病毒载量的药物中的用途。肝炎病毒引起肝胆疾病包括急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌或胆管细胞癌。进一步的，所述与乙型肝炎病毒感染引起的疾病包括乙肝病毒感染导致的生理指标异常、循环系统症状、消化系统症状。

本发明用途还包括制造控制肝炎病毒感染滴度和病毒载量的药物中的用途，包括清除肝细胞和/或胆管细胞中乙型肝炎病毒，清除各类乙型肝炎病毒携带细胞，控制乙型肝炎病毒引起的肝胆疾病中的用途。

上述本发明的用途，包括含有塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物的药物组合物治疗乙型肝炎病以及与乙型肝炎病毒感染相关性疾病，所述组合物中，塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物的单位剂量为每日剂量为0.05-30mg,优选0.1-16.5 mg，更优选0.1-10mg。每日一次或2次。

上述本发明的用途，进一步包括塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物与铂类等细胞毒抗癌药物联合用药，所述联合用药可以是一并服用，也可是一先一后间隔服用。所述铂类抗癌药物包括但不限于卡铂、顺铂、乐铂、奈达铂和奥沙利铂。

一种治疗由乙型肝炎病毒感染引起的相关疾病的药物组合物，包含有效量的塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物和其它抗癌药，优选铂类抗癌药。

上述本发明的用途，所述乙型肝炎病毒感染引起的肝胆疾病，包括但不限于急性肝炎、慢性肝炎、肝癌、胆管细胞癌，以及乙型肝炎病毒感染导致的生理异常（例如生理指标异常，循环系统症状，消化系统症状等）。

上述本发明的用途，塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物能够清除活动性乙型肝炎病毒感染细胞，特异性的清除携带乙型肝炎病毒的细胞而对未感染病毒的细胞没有明显杀伤作用，因此对未感染乙型肝炎病毒的正常肝细胞没有明显毒性。

本发明人研究发现，HBx表达导致乙型肝炎病毒宿主细胞的DNA损伤修复缺陷，利用塔拉帕尼能有效抑制HBx表达和乙肝病毒宿主肝细胞的增殖。通过细胞和小鼠模型中证实塔拉帕尼可以有效抑制并清除携带乙肝病毒或有HBx表达的肝细胞；PARP抑制剂塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物能够抑制或清除相似感染状态的胆管上皮细胞。

本发明的另一目的是提供应用塔拉帕尼或其药用盐治疗或者预防慢性乙型肝炎病毒感染患者的方法，包括乙型肝炎病毒感染滴度和病毒载量的控制，所述方法包括给予所述患者有效剂量的塔拉帕尼。

本发明的再一目的是提供应用PARP抑制剂塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物用于治疗或者预防肝炎病毒引起的疾病，尤其是乙肝病毒感染所致的肝纤维化、肝硬化、肝癌患者的方法和用途，所述方法包括给予所述患者有效剂量的PARP抑制剂塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物。

本发明再一目标是提供应用塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物治疗或者预防晚期肝纤维化、肝硬化、肝癌患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的PARP抑制剂塔拉帕尼。

另一方面，本发明的目的在于将塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物与放疗或其他抗肿瘤药物的联合使用，用于治疗或预防乙型肝炎病毒阳性的肿瘤，包括肝细胞肝癌和胆管细胞癌。

本发明的又一目的在于塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物与其它类抗癌药物联合用药治疗乙型肝炎病毒相关疾病，所述联合用药可以是两种药物各自先后间隔服用或者同时服用，或者塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物与其它类抗癌药物组成药物组合物。所述抗癌药物为铂类、喜树碱或HDAC（组蛋白去乙酰化酶,histone deacetylase）抑制剂。所述铂类抗癌药选自卡铂、顺铂、乐铂、奈达铂和奥沙利铂。其中，所述乙型肝炎病毒感染所致的相关疾病是急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌、乙肝病毒感染导致的生理异常（例如生理指标异常，循环系统症状，消化系统症状等）。优选乙型肝炎病毒感染，最优选乙型肝炎病毒感染引起的急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌。特别是乙肝病毒阳性的肝癌或胆管细胞癌。

在本发明方案中，其中所述药物塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物可以通过口服或者胃肠外途径给予。

在细胞和裸鼠的乙肝病毒感染和肝癌模型中，PARP抑制剂塔拉帕尼具有显著的治疗和预防效果。

塔拉帕尼可以大幅提高HBx表达和乙肝病毒宿主细胞的染色体断裂几率，产生星状染色体等染色体畸变，而对照细胞的染色体组对塔拉帕尼的致畸作用无响应。

塔拉帕尼单药或其与放疗、铂类、喜树碱、HDAC抑制剂的组合用药，可以特异性抑制HBx表达和乙肝病毒阳性肝细胞的增殖，其细胞存活率低于1‰，而对照细胞的存活率约40%，并持续增殖。

本发明特别指出，乙肝病毒复制和HBx活跃表达的感染指标在用于指导塔拉帕尼及其盐或酯类衍生物治疗或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病中的用途，包括乙型肝炎病毒的血清学指标，游离或整合的病毒基因组DNA指标，病毒RNA指标，特别是可以指示HBx表达的DNA和/或RNA片段，或HBx蛋白质指标。

进一步地，在小鼠模型中进行塔拉帕尼单药及其与放疗、铂类、喜树碱、HDAC抑制剂的联合用药，乙型肝炎病毒阳性肝癌的进展得到显著抑制。

本发明特别发现，在各种PARP抑制剂用于治疗乙肝病毒感染和病毒阳性肝癌的平行实验中，塔拉帕尼与BGB-290，BGP-15，E7449，卢卡帕尼（rucaparib），奥拉帕尼等药物相比较，塔拉帕尼在极低药物剂量范围内可以有效地控制乙肝病毒的感染，抑制乙肝病毒阳性肝癌的进展，其有效浓度显著低于其他PARP抑制剂（见实施例2）。此外，在与铂类药物联用情况下，塔拉帕尼是已知药物中唯一能够治愈大体积肝癌（>400 mm³）的药物（见实施例4）。

发明有益之处在于，在当前肝癌治疗是基于“泛肝癌”的技术条件下，首次提出了PARP抑制剂塔拉帕尼可以选择性治疗乙肝病毒导致的相关疾病，可以控制乙肝病毒的感染，可以用于治疗乙肝病毒阳性肝癌及胆管细胞癌，而对乙肝病毒活跃复制的肝癌无效。相对于现有肝癌的治疗药物和方案，本发明从乙肝阳性和阴性的角度对肝癌进行区别治疗，极大的提高了肝癌的治疗效果，是肝癌精准治疗的重要进步。再有，本发明在所有类型的PARP抑制剂中筛选出塔拉帕尼可以在很低剂量水平，很低毒性和副作用的前提下治疗乙肝阳性肝癌及胆管细胞癌，进一步指明塔拉帕尼及其盐或酯衍生物是目前已知的唯一一种有希望治愈乙肝病毒阳性肝癌的药物，创造性地指明乙肝病毒阳性肝癌的有效治疗方法。

附图说明

图1. 塔拉帕尼促进HBx表达细胞和乙型肝炎病毒携带细胞染色体断裂。

本实验显示整合了HBV全基因组的人肝细胞系（HL02－H1）与同源细胞系（HL-7702 ），以及表达和未表达HBx的HL-7702（HL-7702/HBx和HL-7702/pLV）在用塔拉帕尼处理 24 小时后，中期染色体的畸变情况。对星状染色体和畸变染色体进行计量表明，塔拉帕尼高效地诱导HL02-H1和HL-7702/HBx细胞的染色体畸变，但对HBV和HBx阴性的同源肝细胞（HL-7702和HL-7702/pLV）没有明显影响。

图2. 低剂量塔拉帕尼对HBx表达和乙型肝炎病毒携带细胞的增殖有显著抑制作用。

A.克隆形成实验表明塔拉帕尼单药对表达HBx和HBV宿主肝细胞的特异性抑制作用。在100 nM浓度下，塔拉帕尼对HL-7702/HBx和HBV阳性的HL02-H1细胞的杀伤效率较对照细胞高500倍以上。

B．塔拉帕尼（3 nM）与顺铂联用表现出对HL02-H1和HL-7702/HBx细胞的协同毒性作用，远远低于塔拉帕尼单药的毒性浓度，且本实验的顺铂单药对所有细胞均无明显毒性作用。

C．多种PARP抑制剂对HL02-H1细胞的IC50测定。细胞生存实验显示，塔拉帕尼的IC50仅为3.94 nM,比其他PARP抑制剂低30-80倍。

图3. 塔拉帕尼是唯一对乙肝病毒阳性肝癌有治愈效果的药物。

A． HBV转基因人肝细胞系 HL02-H1在人-无胸腺裸鼠中恶性增殖。图片显示溶

剂对照、顺铂单药、PARP抑制剂与顺铂联合用药组在实验终止时的肿瘤体积比较。塔拉帕尼联合用药组的肿瘤体积远远低于对照组及其他PARP抑制剂联合用药组，且在实验终点有多个肿瘤呈消亡状态。

B-E. 塔拉帕尼与铂类联合用药抑制HL02-H1在人-无胸腺裸鼠的肿瘤增殖。塔拉帕尼联合用药组平均肿瘤体积远远低于对照组，显示出治愈的效果。平行实验中其他PARP抑制剂与铂类联合用药治疗同样肿瘤，发现这些PARP抑制剂在较高用药剂量下，仅能限制肿瘤于无进展状态，并未产生肿瘤治愈效果。因此塔拉帕尼相较于其他抑制剂有显著的剂量和治疗效果优势。

图4. 塔拉帕尼是唯一可用以治愈大体积肝癌的药物。

无胸腺裸鼠接种HL02-H1细胞建立～400 mm³的肿瘤模型，随机分为DMSO和PARP抑制剂药物治疗组，与顺铂（3 mg/kg, 2次/周）联合用药12天。结果显示塔拉帕尼在较低剂量下对大体积肿瘤的治疗效果远远优于其他三种PARP抑制剂，并有治愈趋势。实验终点对比其最终肿瘤体积，塔拉帕尼相较于其他三类PARP抑制剂具有显著的肿瘤抑制效果。（塔拉帕尼对比奥拉帕尼有统计学差异P=0.001,对比BGB-290 P=0.003，对比尼拉帕尼 P= 0.005。t-检验）

图5.塔拉帕尼可以快速并持续抑制裸鼠HBV感染模型中血清病毒载量和抗原滴度。

A．无胸腺裸鼠尾静脉注射HL02-H1细胞建立HBV小鼠感染模型，使用塔拉帕尼可以有效降低感染模型中的血清病毒水平，并在塔拉帕尼停药后15天仍然保持阴性临界值以下的低水平状态。

B. 使用塔拉帕尼有效降低HBV感染模型中的血清表面抗原水平，并且在塔拉帕尼停药后 20 天仍然保持低水平状态。

C. 平行比较塔拉帕尼、奥拉帕尼、BGB-290和尼拉帕尼降低HBV感染模型中血清表面抗原滴度的治疗效果。结果显示塔拉帕尼更快、有效地降低HBsAg血清滴度。

具体实施方式

以下非限制性实施例用来进一步阐明和理解本发明的实质。应当理解的是，所示组分的比例变化和操作方法对本领域技术人员而言是显而易见的，因此也落入本发明的范围内。

下列实施例中人肝细胞系HL-7702 (又名L-02，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，编号：GNHu 6)，人肝癌细胞系HepG2(来源于ATCC，保藏号：HB-8065)，HepG2.2.15(携带HBV全基因组转基因稳定细胞系HepG2，成都中科院生物研究转赠)，裸鼠(BALB/c-Nude品系,SPF级，雌性，来源于四川大学实验动物中心）为本发明中实验用，不作为其他用途。实施例中使用的顺铂 (131102, Supertrack Bio-pharmaceutical)、卡铂（H20020180，齐鲁制药有限公司），乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（S10910113，上海科华生物工程股份有限公司），乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（S20030059，海科华生物工程股份有限公司）及其他各种试剂均为本发明中实验用，不作他用。

实施例中所有小鼠模型中剂量确定根据人-小鼠药剂换算公式得到初步确定：小鼠药剂用量=人药剂用量*9.01（折算系数），再参照细胞学实验及前期经验进行调整获得。

表1. 使用主要试剂列表

表2. 重要名词和缩写列表

实施例1 塔拉帕尼诱导HBx表达和的携带乙型肝炎病毒肝细胞的染色体畸变。

实验方法:

1. HBx蛋白表达及乙型肝炎病毒基因组整合细胞系的构建。

HL02-H1为HBV全基因组稳定表达的人肝细胞系。HL02-H1保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC，保藏号：C201554)。HBx蛋白表达细胞HL-7702/HBx及其对照细胞HL-7702/pLV通过慢病毒感染系统构建，慢病毒包装及感染具体方法已是常规技术，不在此赘述。

2. 塔拉帕尼诱导HBx蛋白表达细胞及乙型肝炎病毒宿主细胞的染色体畸变。

HL-7702、HL02-H1、HL-7702/pLV及HL-7702/HBx细胞分别接种2个6 cm直径培养皿，过夜培养后每种细胞分别加入塔拉帕尼（塔拉帕尼终浓度为100 nM）及等体积的DMSO处理16小时，加入秋水仙素（终浓度200 ng/ml）处理1.5小时。细胞用胰酶消化，PBS清洗1次。去上清，加入250 ml PBS混匀细胞沉淀。滴加6ml 75 mM KCl（37℃预热）。37℃温育25分钟。加入200 ml固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），混匀，1000 rpm离心10分钟。加入甲醇与冰醋酸固定液5 ml，混匀，4℃静置20分钟。1000 rpm离心10分钟，余少许固定液重悬细胞。如有需要反复固定细胞3次，加入500 ml固定液混匀细胞，4℃保存。

载玻片-20℃预冷。将固定液重悬细胞，从大于20 cm高度处滴落至载玻片上。玻片晾干。吉姆萨染色液染色10分钟，树脂封片。1000倍光学显微镜下观察拍照并进行计数。

实验结果：

塔拉帕尼处理后细胞染色体结构畸数量变化见图1。其中，乙肝病毒宿主细胞（HL02-H1）和HBx表达细胞（HL-7702/HBx）中染色体畸变（如星状染色体）的数目远高于对照细胞（HL-7702和HL-7702/pLV）和对照组（DMSO）。这类染色体畸变结构物多由细胞在双链断裂时修复机制异常造成，具有极高的细胞毒性，尤其是星状染色体，可导致细胞死亡。

结论：以上实验可证明，PARP抑制剂塔拉帕尼可使表达HBx和乙型肝炎病毒宿主细胞中毒性染色体结构显著增高（统计学检验***：p<0.001），塔拉帕尼对表达HBx和乙型肝炎病毒复制的细胞具有特异性的细胞毒性作用。

实施例2 低剂量塔拉帕尼特异性抑制HBx表达和乙型肝炎病毒宿主肝细胞的增殖

实验方法:

采用克隆形成实验进一步验证塔拉帕尼对表达HBx和乙型肝炎病毒宿主肝细胞的特异性抑制作用。

将HL-7702、HL02-H1、HL-7702/pLV和HL-7702/HBx细胞分别接种于10 cm直径培养皿中，每个培养皿中加入800个细胞。过夜培养，次日加入塔拉帕尼或相同体积的DMSO（对照组）。用塔拉帕尼持续处理培养10天后甲醇固定细胞，吉姆萨染液染色，计算克隆数。所有实验均做3次重复。

药物处理包括塔拉帕尼单药及其与铂类化合物（顺铂）联合用药。塔拉帕尼单药处理浓度为0、5、10、20、50 nM；联合用药组塔拉帕尼浓度为3 nM，顺铂浓度为0、5、10、25、50、100 nM（见图2A-B）。该浓度范围内的顺铂单独处理对四种细胞的生存无显著杀伤效应。

将多种PARP抑制剂（BGB-290，BGP-15，E7449，卢卡帕尼，奥拉帕尼，尼拉帕尼，塔拉帕尼）与塔拉帕尼平行比较单药对HL02-H1的细胞毒性，每种抑制剂浓度梯度设定定见图2C。

根据上述数据使用spss中二分类Probit模型计算各组药物针对HL02-H1细胞作用的IC50。比较各组药物之间的剂量差别。

实验结果：

克隆形成实验显示PARP抑制剂塔拉帕尼单独作用时对表达HBx和携带乙型肝炎病毒基因组的细胞有明显毒性作用，即HL02-H1和HL-7702/HBx在100 nM塔拉帕尼处理时的存活率均低于1‰，而相同条件下对照组HL-7702和HL-7702/pLV的生存率约40%（见图2A）。

在联合用药实验中，塔拉帕尼（7.5 nM）与铂类药物联合使用时对HL02-H1及HL-7702/HBx都有显著地抑制效果。在与塔拉帕尼联合使用时，铂类药物浓度达到0.1 mM，HL02-H1及HL-7702/HBx细胞存活率仅为1-1.5‰左右，而HL-7702和HL-7702/pLV在同样条件下的生存率不低于30%（见图2B）。因此，塔拉帕尼可以特异性杀伤HBx表达和乙型肝炎病毒复制的细胞。

塔拉帕尼可以在很低浓度范围内发挥对HL02-H1的毒性作用（浓度100 nM时，HL02-H1细胞的生存率低于1‰），如图2C显示，而其他PARP抑制剂在相同浓度下的细胞毒效应明显较弱(生存率大于20%)。

通过细胞生存实验，测定7种PARP抑制剂针对HL02-H1细胞的IC50。结果显示，塔拉帕尼对HBV携带细胞的IC50最低，仅为3.94nM，远低于其他PAPR抑制剂。

结论：因此，较之于其他PARP抑制剂，塔拉帕尼在杀灭HBx表达和乙型肝炎病毒携带细胞的用途上具有明显的低剂量优势。同时针对HBV携带细胞，塔拉帕尼在临床使用剂量上有显著优于其他抑制剂的剂量使用优势。

实施例3 塔拉帕尼对乙型肝炎病毒阳性肝癌的治愈效果

实验方法

6周龄的无胸腺雌性裸鼠27只，随机分为9组，每只小鼠于腋下及腹股沟处接种HL02-H1，接种数量为4x10⁶。待瘤体体积约70-100 mm³时开始注射药物。药物注射方案为塔拉帕尼与铂类药物（顺铂）联合用药，同时设溶剂对照组（DMSO）及顺铂单药对照组。具体用药剂量如下：塔拉帕尼联合用药剂量为2.5 mg/kg/天，其他抑制剂用药剂量分别为：BGB-290：10 mg/kg/天，BGP-15：10 mg/kg/天，E7449：4 mg/kg/天，卢卡帕尼：10 mg/kg/天，顺铂用量3 mg/kg，一周两次。药物注射时间为12天，取 2、5、7、8、9、12天测量肿瘤体表体积。根据如下公式计算肿瘤体积=长x宽x宽/2。结果见图3。

实验结果：

塔拉帕尼与顺铂联合用药组中小鼠肿瘤生长与各对照组相比被明显抑制。图3 A显示实验终点时DMSO对照组平均体积为479 mm³，顺铂单药注射组肿瘤平均体积为409 mm³，两组均在整个实验过程中呈现恶性增殖的状态；而塔拉帕尼联合用药组平均肿瘤体积约为40 mm³，低于对照组10倍以上，且在实验终点有多个肿瘤呈消亡状态（已不可提取残余肿瘤组织）。图3B-E显示塔拉帕尼与其他PARP抑制剂对肿瘤的抑制曲线的平行比较，塔拉帕尼有效剂量最低，且效果最好，因此具有显著的低剂量优势，且表现出治愈效果。

结论：肝癌荷瘤动物模型有效证明塔拉帕尼与顺铂的联合用药方案可有效抑制乙型肝炎病毒阳性肝癌的进展，且有治愈的效果。

实施例4 塔拉帕尼可以有效治愈大体积肝癌的进展

实验方法：

无胸腺裸鼠接种HL02-H1细胞建立较大肿瘤模型（用药初始体积约400 mm³），随机分为DMSO、塔拉帕尼（2.5 mg/kg/天）、奥拉帕尼（168 mg/kg/天）、BGB-290（10 mg/kg/天）和尼拉帕尼（50 mg/kg/天）等5组，与顺铂（3 mg/kg，2次/周）联合用药10天。同上方法检测肿瘤进展。

实验结果：

如图4显示，所有PARP抑制剂均对大体积肿瘤生长有显著抑制效果（P<0.001）。其中塔拉帕尼用药组在给药终点出现肿瘤明显回缩现象，部分肿瘤完全消失。与其他用药组相比，效果非常明显(P<0.05)。

结论：塔拉帕尼是一种最有效的PARP抑制剂，可以用于治愈乙型肝炎病毒阳性的肿瘤，包括具有较大体积的相对晚期肿瘤。这一结果在病毒阳性的肝癌和胆管细胞癌的临床治疗中具有重大意义，很有可能替代目前临床治疗中常用的抗肿瘤药物，实现对乙型肝炎病毒阳性肿瘤真正的临床治愈。

实施例5 低剂量塔拉帕尼快速并持续降低小鼠模型中HBV感染指标

实验方法：

针对乙型肝炎病毒患者治疗效果评价可以采纳检测血清中病毒拷贝数和表面抗原（HBsAG）的检测指标。

采用6周龄的无胸腺雌性裸鼠21只，随机分为7组，每只小鼠于腋下及腹股沟处接种HL02-H1细胞，建立HBV小鼠感染模型，细胞接种数量为4x10⁶。接种细胞后每隔3天尾静脉血取血，使用乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒监测血液中HBV拷贝数变化情况，待拷贝数升至血清中最高值4000UI/ml左右时开始用药。药物注射用量如下：塔拉帕尼2.5 mg/kg/天；恩替卡韦（entecavir），0.07 mg/kg/天；拉夫米定（lamivudine），1.6 mg/kg/天，同时设置DMSO对照组。塔拉帕尼单药连续处理16天，1、3、8、10、13、16天进行尾静脉血取血，监测血清中HBV基因组拷贝数，并采用ELISA方法检测HBsAg滴度变化。第16天停药，继续在注射起始日后第17、20、22、25、30、32天取尾静脉血清中HBV-DNA拷贝数及HBsAg滴度的变化情况。

设置奥拉帕尼（168 mg/kg/天）、BTB-290（10 mg/kg/天）和尼拉帕尼(50 mg/kg/天)对照组，在第1、3、8、10、13、15、17、22、25、32天检测小鼠尾静脉血清中HBsAg滴度的变化情况。

实验结果：

实验证实（图5A），塔拉帕尼与目前临床上最为常用的核苷类肝病药物恩替卡韦（entecavir）和拉夫米定（lamivudine）均可以使模型小鼠血清中的HBV-DNA含量及HBsAg抗原OD值由1.3（此时血清中HBsAg抗原含量达到最高值，表示HL02-H1细胞肝癌小鼠模型中，病毒进入稳定的高水平活跃复制期）左右降至0.05，接近或低于临床阴性（>0.05，此时 OD值为检测最低阈值）的指标。在药物停止注射后的15天内，恩替卡韦和拉夫米定用药组小鼠血清中HBV基因组拷贝数及HBsAg抗原水平很快回升至最高水平，说明病毒复制和分泌的恢复；而塔拉帕尼用药组小鼠血清中HBV拷贝数及HBsAg表达则一直处于稳定的阴性范围之内。图5B显示塔拉帕尼比其他PARP抑制剂能够更快更有效地降低血清HBsAg抗原的滴度，说明塔拉帕尼具有最强的清除乙型肝炎病毒宿主细胞的能力。

结论：塔拉帕尼是一种最有效的PARP抑制剂，可以快速持久地清除乙型肝炎病毒感染的宿主细胞。这一结果在乙型肝炎病毒的临床治疗中意义重大，具有巨大潜力替代目前肝炎临床治疗中常用的核苷类抗病毒药物，实现对乙型肝炎病毒真正的临床治愈。

Claims (11)

1.多聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂塔拉帕尼或其在药学上可接受的盐用于制备治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染引起的肝胆疾病或乙肝病毒感染导致的生理异常或控制乙型肝炎病毒感染滴度和病毒载量的药物中的用途，所述乙型肝炎病毒引起的肝胆疾病为急性肝炎、慢性肝炎或肝癌。

2.根据权利要求1所述用途，其特征在于，所述控制乙型肝炎病毒感染滴度和病毒载量包含降低肝脏和/或血清中的乙型肝炎病毒载量，清除肝细胞和/或胆管细胞中乙型肝炎病毒，清除各类乙型肝炎病毒携带细胞。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎病毒感染导致的生理异常包括乙肝病毒感染导致的生理指标异常、循环系统症状或消化系统症状。

4.根据权利要求1-3任一所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎病毒感染的相关指标，包括乙型肝炎病毒的血清学指标，游离或整合的病毒基因组DNA指标，病毒RNA指标。

5.如权利要求4所述的用途，所述病毒基因组DNA指标，病毒RNA指标为指示HBx表达的DNA和/或RNA片段，或HBx蛋白质指标，在用于指导塔拉帕尼及其盐治疗或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病中的用途。

6.根据权利要求1-3任一项所述的用途，包括塔拉帕尼或其药学上可接受的盐与放疗联合应用。

7.根据权利要求1-3任一项所述的用途，包括塔拉帕尼或其药学上可接受的盐与其它抗癌药物联合应用。

8.根据权利要求7所述的用途，所述其它抗癌药物选自铂类、喜树碱和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的细胞毒性药物。

9.根据权利要求8所述的用途，所述铂类选自卡铂、顺铂、乐铂、奈达铂和奥沙利铂。

10.根据权利要求1-3任一所述的用途，塔拉帕尼或其药学上可接受的盐的单位日剂量为0.05-30 mg。

11.根据权利要求10所述的用途，塔拉帕尼或其药学上可接受的盐的单位日剂量为0.1-10 mg。

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