CN110527744A - 一组与同源重组修复缺陷相关的基因组特征性突变指纹的鉴定方法 - Google Patents

一组与同源重组修复缺陷相关的基因组特征性突变指纹的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种与hHRD类型同源重组修复缺陷相关的基因组特征性突变指纹，包括其单核苷酸变异(SNV)和插入缺失(Indel)的基因组指纹的组合特征，及其鉴定方法。该指纹特征可以利用高通量全基因组重测序、生物信息学软件解析和统计学相关性分析，用其鉴定带有该特征性突变指纹的传染病或肿瘤，特别是乙型肝炎病毒感染及其相关疾病，包括肝硬化、肝纤维化和肝癌。还可利用该突变指纹指导针对同源重组缺陷的靶向药物对带有此类hHRD同源重组修复缺陷的多种肿瘤的治疗，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌、胃癌、皮肤癌、乙型肝炎病毒感染或者相关的肝硬化、肝癌和胆管细胞癌的方法和用途。

Description

一组与同源重组修复缺陷相关的基因组特征性突变指纹的鉴 定方法
技术领域
本发明属于基因检测和检测试剂领域，具体涉及一种鉴定同源重组修复缺陷 的基因组突变的标记物及生物信息学的鉴定方法，该标记物具有特征性体细胞突 变(Somatic mutation)指纹(Fingerprint)，以该标记物检测带有此特征的 病毒感染、肿瘤或中间病理状态的用途。
背景技术
同源重组修复缺陷类型的疾病越来越受到肿瘤领域的关注。乳腺癌基因 BRCA1和BRCA2的突变或表达异常导致同源重组修复缺陷，也是促进乳腺癌、 卵巢癌、前列腺癌和胃癌发生的重要病因，该类疾病被统称为BRCA类型的肿 瘤(BRCAness)。但以BRCA1及BRACA2基因突变检测作为此类疾病的临床 分类与临床决策具有极大局限性。其原因在于：1)现有基因诊断局限于特定基 因的有限突变位点，这些突变位点具有明确的生物学意义，如无义突变 (non-sense)和缺失(truncation)等，可指明该突变造成蛋白质功能的丧失 或减低。然而，该方法无法对生物学意义不明确或尚未研究报道的突变位点或突 变形式做出有效评估，如乳腺癌中存在大量的VUS(Variant of Uncertain Significance，意义未明变体)即为同源重组缺陷的临床诊断造成很大障碍；2) 无法有效诊断出不具有现有技术可检出的BRCA1及BRCA2突变的同源重组缺 陷病例，例如Rucaparib(一种PARP)抑制剂的临床2期试验中，意外发现药 物对某些BRCA1野生型的卵巢癌病例产生较的治疗效果，后期证明这些病例中 肿瘤细胞BRCA基因表现出杂合性缺失。又如BRCA1/BRCA2基因可能由于启 动子突变，启动子甲基化异常，或大片段转位(这种情况下未发生基因序列丢失 或改变)，现有技术难以定量评估这些基因组特征或改变对BRCA相关基因的影 响，因此不能与同源重组缺陷本身有效地联系；3)更为复杂的是，同源重组修 复缺陷不仅仅由于BRCA1/BRCA2的突变或功能障碍造成，还可能涉及更多的 基因突变或表达异常，如SWI/SNF蛋白复合体的组分亚基(ARID1A，ARID1B 和SMARCD1)是调控同源重组修复的关键因子，而SWI/SNF组分的基因突变 (ARID1A，ARID1B，ARID2，PBRM1，SMARCA4和SMARCB1等)存在于约 20％的肿瘤基因组中，这些突变的一部分或全部可造成同源重组修复缺陷，进一 步使同源重组缺陷的临床诊断复杂化。
由此可见，现有的基于BRCA1/BRAC2基因突变对同源重组缺陷进行临床 诊断的技术是不可靠、不全面的，不能覆盖所有的同源重组缺陷病例。本专利中 所提出的同源重组修复缺陷的基因组特征性突变指纹可在临床检测中具有更广 泛的检测范围和更可靠的判定标准。此外，到目前为止根据全基因组突变指纹对 带有特定基因组特征的疾病进行诊断或病症指导的技术尚无先例。本专利通过基 因组特征性重排指纹对带有CRL4WDR70-uH2B信号通路或SWI/SNF蛋白复 合体亚基缺陷的HBV感染相关疾病(及不带有BRCA基因突变或功能缺陷的相 似疾病类型，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌、胃癌和皮肤癌等)的同源重组缺陷进行鉴定。根据此前文献或专利发明的检 索，我们利用基因组特征性重排指纹表征此类疾病的鉴定方法具有首发创新型。 2013年英国剑桥桑格研究所在Cosmic突变指纹框架项目(Cosmic Mutational Signature Framework)研究中通过对7042例不同类型的肿瘤样 本进行深度测序，分析其基因组特征，针对单核苷酸变异(Single nucleotide variation，SNV)聚类解析出30种不同特征性标签(Signature)，即由于不同 机制的基因突变过程所产生独特类型的突变组合，即被定义为“特征标签″(Nature.2013Aug 22；500(7463)：415-21)。这类标签代表了人体内多种体系 突变过程的结果，覆盖了几乎所有类型的肿瘤。这些突变通常由于内源性DNA 复制机制的失真、外源或内源性突变诱导暴露、DNA的酶促修饰和DNA修复 缺陷产生。这些标签及其标准解析方法成为之后肿瘤基因组学研究种界定肿瘤相 关机制的重要标准。已知这30种单核苷酸变异基本特征标签中仅有特征标签3 明确与同源重组缺陷相关联，也是目前唯一解析出的同源重组缺陷点突变特征。 2017年10月，盖茨研究组在Nat Genet最新发表的文章中指出，标签3可以作 为判断带有BRCA1/BRCA2突变的乳腺癌是否具有同源重组缺陷的单一指标。
进一步的，通过近年发展的基因组重测序技术发现BRCA1和BRCA2基因 突变造成广泛的基因组结构变异(SV)和同源重组缺陷相关的单核苷酸变异标 签(标签3)，共同构成BRCAness肿瘤的特征性基因组变化特征，其组合评分 被定义为同源重组缺陷(HRD)指数。到目前为止，仅仅只有乳腺癌被表征了 相对准确的HRD指数。
本发明人研究发现，HBV病毒感染或基因组整合会造成肝细胞的同源重组 修复缺陷，且不涉及BRCA1/BRCA2及其他同源重组修复基因的突变。HBV通 过干扰宿主蛋白复合体的功能干扰组蛋白修饰与同源重组修复机器的协调，干扰 DNA断裂的同源重组修复机制，从而造成突变率增加和染色体不稳定性。
因此，尽管乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，以下简称HBV)感染造成肝细 胞同源重组修复缺陷，但由于其作用机制需要除BRCA1/BRCA2之外的多个信 号转导因子的参与，因此会造成HBV相关肝癌基因组中出现与乳腺癌、卵巢癌 等BRCA系列肿瘤相似但又明显区别的突变基因组指纹。在HBV相关肝癌中， 我们发现基因组范围出现较高水平的突变负荷(tumor mutation burden范围 5-24)，单核苷酸变异谱系(包含同源重组缺陷相关的标签3，及其他特征性标 签5，8，9，16，22，25，28等)。其中标签3是与同源重组缺陷密切关联的 点突变标签；标签8还在乳腺癌和神经胶质细胞瘤基因组中频繁出现；Cosmic 聚类分析表明标签5在大多数肿瘤中被捡出，但首次在HBV相关肝癌基因组中 被解析出来；标签16为Cosmic中肝癌样本中解析出的特征；标签9在慢性淋 巴白血病样本中被解析出，与AID机制激活和突变率增高有关相关；标签22与 肝癌发生和马兜铃碱中毒损伤指纹相关
此外，通过对HBV相关肝癌全基因组小片段插入缺失(Indel)的组分分析 显示，其基因组含有四种小片段插入缺失的组分，并表现出低频的微同源序列和 重复序列的小片段缺失事件(Deletion)和较高频的小片段插入事件 (Insertion)。总的来说，这些突变负荷，单核苷酸变异标签和插入缺失的组成 代表了一种新型的基因组HRD突变谱，称之为hHRD，以区别与BRCAness 中发现的HRD突变类型。所述hHRD突变谱指纹在HBV相关肝癌中占由明显 比重，而在HBV阴性肝癌中没有表现，具有显著统计学差异。
需要指出的是，本发明所述基因组特征性指突变指纹是hHRD类型的同源 重组修复缺陷造成的基因组突变特征，可以证明这些特征是由于HBV感染导致 了CRL4WDR70-H2B单泛素化信号通路功能减低所驱动的基因组突变印迹；此 外，除HBV引起的感染和肝癌，这些突变指纹还可以表征或检测带有CRL4WDR70-uH2B信号通路功能紊乱的其他肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、子宫 内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌、胃癌等。
发明内容
本发明的目的涉及一种作为可用于鉴定同源重组修复缺陷的基因组特征性 突变指纹或具有该指纹特征的标记物，用于鉴定带有此特征的病毒感染、肿瘤或 中间病理状态(如急慢性感染、肝纤维化和肝硬化等)。具体地说，主要用于鉴 定带有hHRD类型基因组特征性突变指纹的细胞、体液或者活检组织。更具体 地，本发明涉及用于鉴定由于HBV病毒感染或细胞CRL4WDR70-H2B单泛素 化信号通路相关基因突变导致的同源重组缺陷疾病的特征性突变指纹，包含单样 本全基因组的单核苷酸变异指纹，突变负荷和小片段插入缺失等指纹，用其鉴定 带有此类hHRD同源重组修复缺陷相关特征的疾病，亦可以指导针对同源重组 缺陷的靶向药物的临床用药、评价治疗效果的方法及其用途，特别是用于诊断或 鉴定HBV病毒感染相关疾病和肝癌及胆管细胞癌，以及一部分乳腺癌、卵巢癌、 子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、皮肤癌、胃癌和前列腺癌的用途或方法。
在实施方案中，本发明发现并鉴定了一种与hHRD类型同源重组修复缺陷 相关的特征性基因组突变指纹，具有如选自图1-4中任意一图所示的指纹特征。 所述指纹是由离体的HBV相关肝癌的体液、细胞和活检组织通过全基因组测序 后经1)由本发明实施例中涉及的离体体液、细胞和活检组织全基因组重测序后 数据获得；2)进一步的，测序数据由muTect/deconstructSigs及Strelka软 件进行处理，分别检测单核苷酸变异和小片段插入缺失突变；3)进一步由 ANNOVAR软件进行数据注释；4)根据不同数据库(1000GenomesProject， ExAC，dbsnp142)进行多态分析；上述筛选纯化后的数据进行特征分析计算所 获得的图谱即为指纹(delineating mutational processes in single tumorsdistinguishes DNA repair deficiencies and patterns of carcinomaevolution.Genome Biol.2016Feb 22；17：31.。其中单核苷酸多态性(SNP) 指纹分析根据2016年Rosenthal R等人研发流程，采用deconstructSigs软 件进行解析，小片段插入缺失指纹分析具体参数见实施例。
另一方面，本发明的目的在于提供一种与hHRD类型同源重组修复缺陷相 关的基因组突变标记物，具有如选自图1-4中任意一图所示的指纹特征。
在一具体实施方案中，上述本发明的基因组突变标记物，包括具有以下在 独立样本的肿瘤基因组中存在的核心指纹：
A.单核苷酸变异特征解析包含单核苷酸变异标签3，并同时包含肝癌特征性标 签4/12/16/22/24/25的其中之一(图3)；
B.CRL4WDR70-H2B单泛素化信号通路缺陷特有的小片段插入缺失模式(图4)， 其特征在于4.5-40％；较低的重复序列的小片段缺失事件，其比例＜6％；且同 时伴有较高频小片段插入事件，其比例为24％-60％。。
上述本发明的基因组突变标记物，所述优选的特征指纹包括具有以下在独立 样本的肿瘤基因组中存在的单核苷酸变异附加指纹(图3)：C.单样本全基因组的 突变负荷2.5-25突变/兆碱基(图1)；D.基因组还可含有单核苷酸变异标签1， 5，标签8，或标签9，或标签28。
本发明基于本发明人首次发现：HBV病毒感染或基因组整合可导致肝细胞 同源重组修复缺陷；HBV导致的同源重组修复缺陷造成肝细胞特征性的基因组 和染色体不稳定；单核苷酸变异指纹和小片段缺失插入指纹，统称为肝癌相关的 同源重组修复缺陷(hHRD)基因组指纹或标记物；而非HBV相关肝癌不具有 以上基因组指纹的组合特征；该指纹与现有文献(Nature.2016Jun 2；534(7605)：47-54.)中报道带有BRCA1/2突变系列的乳腺癌和卵巢癌的相应 基因组特征指纹明显不同。此外，该基因组突变指纹与HBV编码癌基因HBx密切相关，HBx表达的细胞或组织亦表现出与HBV相关肝癌相同的hHRD突变指 纹特征(图5)，说明乙肝病毒相关肝癌与乳腺癌病因与致病机制不同。
在本发明中，HBV感染性相关疾病指的是HBV感染引起的各种疾病，再优 选HBV感染病毒感染相关性急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌和 胆管细胞癌，还包括HBV感染导致的生理异常(例如生理指标异常，免疫抑制， 循环系统症状，消化系统症状等)。
除HBV感染所致的上述hHRD同源重组修复缺陷，细胞功能性信号通路(CRL4WDR70-组蛋白H2B单泛素化)功能减低或者基因突变亦可导致hHRD 指纹特征(图5)。因此，本发明所述hHRD基因组突变指纹包括由于HBV破 坏同源重组修复导致的基因组变异特征，但不仅仅局限于HBV感染，还包括相 关的组蛋白H2B泛素化、CRL4WDR70等基因突变和蛋白质功能障碍等原因导 致的区别于BRCA1/2突变导致的HRD类型。
需要指出的是，虽然本专利所述基因组特征性基因组重排指纹是hHRD类 型的同源重组基因组的特征性指纹图谱的一部分，具有独立鉴定由于 CRL4WDR70-uH2B信号通路功能紊乱造成的肿瘤基因组印迹特征。
此外，由于基因突变，CRL4WDR70-uH2B的功能异常亦会出现在HBV感 染以外的疾病中，这些hHRD类型同源重组修复缺陷疾病包括不带有 BRCA1/BRCA2突变的肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明 细胞癌、前列腺癌、皮肤癌和胃癌等。
此外，所述hHRD突变指纹鉴定的同源重组修复缺陷疾病还包括药物诱导 上述信号转导途径的功能紊乱的DNA修复异常，包括但不限于去甲基化酶、去 乙酰化酶抑制剂等可以诱导hHRD特征性指纹的药物处理方式及组合。
本发明提供一种利用hHRD鉴定HBV感染及相关疾病的基因组突变指纹， 可用于从组织和体液中鉴定HBV感染和相关疾病的发生与进展状况，也可以用 于指导带有hHRD指纹特征的肿瘤的靶向用药和评价治疗效果。
上述的基因组突变标记物或特征性突变指纹在制造检测离体的体液、细胞或 病理组织中与HBV感染相关疾病的基因突变的试剂或试剂盒的用途，或者在制 造监测与HBV感染相关疾病的进展的试剂或试剂盒的用途，或者在制造用于与 HBV感染相关疾病治疗药物的筛选或疗效评价的试剂或试剂盒的用途，或者在 制造用于预测与HBV感染相关疾病的靶向药物的治疗效果预测或评估的试剂或 试剂盒的用途。此类用途也包括具有hHRD指纹特征的其他种类的疾病如乳腺 癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌、皮肤癌和胃癌等。
本发明人特别发现hHRD在HBV感染和相关疾病中的高度可重复性表现， 使该基因组突变指纹成为鉴定HBV感染和相关疾病的发生与进展状况，并用于 指导带有hHRD指纹特征的肿瘤的用药和评价治疗效果。
另一方面，本发明的另一目标是基于本发明提供的基因组突变指纹特征的一 项或多项组合，高通量基因组重测序技术应用于检测高危人群(如HBV感染者) 血液样本中循环DNA(ctDNA)，由此对hHRD类型肿瘤进行早期鉴定。
本发明的再一目标是，基于本发明提供的突变指纹特征的一项或多项组合， 在肿瘤治疗期间，可以用基因组重测序与ctDNA结合的技术定量监测肿瘤细胞 死亡后大量释放的hHRD类型的突变，以评价抗肿瘤药物的治疗效果；
再一方面，最新的同源重组靶向药物如PARP抑制剂对BRCA1/2突变的肿 瘤具有良好治疗效果。已有的药物包括：酞嗪酮类化合物，2-[4-((3S)-3-哌啶基) 苯基]-2H-吲唑-7-甲酰胺，BGB-290、维利帕尼、尼拉帕尼、鲁卡帕尼、E7449、 Talazoparib及BGP-15等，以及这些药物的中性或盐类衍生物。我们亦发现 PARP类抑制剂对HBV相关肝癌，或对带有CRL4-uH2B信号通路缺陷或突变 的hHRD类型的细胞、组织有明显的靶向杀伤作用。因此，本发明的再一目标 是基于本发明提供的特征性突变指纹的一项或多项组合，可以作为针对hHRD类型同源重组缺陷的PARP抑制剂治疗方法的伴随鉴定指标，用于指导此类药物 的临床使用，特别是HBV感染和HBV相关的肝癌和胆管细胞癌，以及部分带 有hHRD特征的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、胰腺 癌、胃癌、皮肤癌、或前列腺癌。
本发明提供一种鉴定同源重组修复缺陷(hHRD)的基因组的方法，包括以下步 骤：
1)由离体的体液、细胞或活检组织经全基因测序；
2)将测序获得的数据采用muTect软件解析或使用Strelka软件运算抽取；
3)经软件处理后获基因组指纹图谱；
4)将步骤3)获得的指纹图谱与本发明的基因组重排指纹比对，或者
5)将基因组与权利要求2的基因组重排标记物进行比对。
如果比对结果与本发明的基因组重排指纹基本具有相同的指纹特征，表明被 检基因组存在同源重组修复缺陷的突变。
在本发明方案中，其中所述hHRD突变指纹可以通过细胞、新鲜病理组织、 冰冻组织、石蜡固定组织、血液、尿液或者唾液等来源的生物材料进行鉴定。
在本发明方案中，其中所述hHRD突变指纹可以通过基因组重测序、多聚 酶链反应(PCR)，核酸杂交和芯片等核酸分析技术进行鉴定。
在本发明方案中，其中所述hHRD可与其它肿瘤诊断、药物评价的生物标 记物联合应用。
4、附图说明
图1、HBV相关肝癌全基因组的突变负荷及突变组成。
A图:灰色柱状图显示16例HBV相关肝癌中突变负荷(包括单核苷酸变异及小 片段插入缺失数量)。单样本HBV相关肝癌全基因组的突变负荷平均水平为8.3 个突变/兆碱基，范围2.5-25突变/兆碱基；
B图:显示六类核苷酸突变类型在每个样本体细胞的基因组中所占比例，纵坐 标表示突变数量的绝对数量，不同灰度代表六种核苷酸突变类型。
图2、muTect软件解析HBV相关肝癌的基因组单核苷酸变异(SNV)谱系。 8个代表性肿瘤样本单核苷酸变异突变频谱显示图。柱状图显示独立样本中96 类三核苷酸突变类型(横坐标)所占不同比例(纵坐标)。
图3、运用deconstructSigs软件解析16例HBV相关肝癌全基因组的单核苷 酸变异特征性指纹标签。
a图.16例肝癌样本中各个单核苷酸变异突变标签所占比重的点状图。横坐标表示30类经典的COSMIC特征性单核苷酸变异标签，每个标签对应的数据点表 示出现该特征的独立样本，纵坐标表示每个标签在独立样本中所占的贡献值。可 以看出代表同源重组修复缺陷的标签3在16例样本中高频出现。这些肝癌基因 组中，还往往带有代表肝癌的特征性标签4/12/16/22/24/25，这些标签与标签3的组合即代表HBV相关肝癌的核心单核苷酸变异突变特征谱。
b图.柱状图显示独立肿瘤样本中解析出的15种指纹组成及其贡献值。其中单 核苷酸变异标签3在大部分肝癌样本中被解析出(15/16)，显示HBV肝癌样本 具有明显的同源重组缺陷特征。
图4、Strelka软件解析HBV相关肝癌全基因组中hHRD类型的小片段插入缺 失组成
采用Strelka软件分析10例代表性肝癌的四种小片段插入缺失组成特征，结果 显示微同源序列的小片段缺失事件和重复序列的小片段缺失事件组成偏低，小片 段插入事件比例偏高的特征。纵坐标代表小片段插入缺失组分所占百分比值，横 坐标显示样本编号。
图5、HBV阴性肝癌的突变指纹特征
a图：从TAGC数据库分别提取50例HBV阳性和阴性肝癌的基因组数据，分析其突变数量并计算其突变/兆碱基；b图和c图：采取deconstructSigs软件分析4例HBV 阴性肿瘤的突变谱系组成图，发现其带有包含肝癌特征性指纹标签1,5，9，16， 22及25，但是缺乏单核苷酸变异突变指纹标签3。横坐标表示样本编号，纵坐标 表示各样本突变指纹标签的组成比例。
图6、HBV相关肝癌hHRD基因组突变指纹的相关性分析
分析HBV相关和阴性肝癌突变负荷差异(P＝0.003)和hHRD突变指纹(单 核苷酸变异和小片段插入缺失)与两种肿瘤的相关性，结果显示单核苷酸变异标 签3所占指纹比重的样本间均值与HBV相关肝癌高度相关，且与HBV阴性肝 癌表现统计学差异(P＜0.001)。
图7、HBx表达和WDR70沉默驱动小鼠基因组中hHRD类型的突变指纹
a图饼图显示HBx表达和WDR70基因沉默的C57/B6小鼠基因组中各种单 核苷酸突变标签的贡献值。两种模型小鼠的肝脏中均可解析出代表同源重组缺陷 的标签3，显示突变小鼠肝脏中存在明显的同源重组缺陷特征。
b图小片段插入缺失组成表现出明显的微同源序列和重复序列的小片段缺失 事件频率偏低，小片段插入事件偏高的特征，与HBV相关肝癌的变化特征谱相 同。纵坐标代表小片段插入缺失组分所占百分比值，横坐标显示转基因小鼠突变 类型。
图8、小片段插入缺失具体解析方法流程图
5、具体实施方式
以下非限制性实施例用来阐明本发明的选定实施方案。应当理解的是，所示 组分的比例变化和备选要素对本领域技术人员而言是显而易见的，因此是落入本 发明实施方案的范围内的。
实施例中C57/B6(SPF级，雌性，来源于四川大学实验动物中心)， C57/B6-HBx转基因小鼠(由赛业公司构建提供)，C57背景WDR70基因沉默小 鼠及p53缺陷型WDR70基因沉默小鼠为自行构建，仅作本发明中实验用，不 作为其他用途。实施例中使用的HBV相关肝癌样本来自德阳市人民医院。基因 组学分析及检测软件为所有基因组特征类分析流程框架均为根据相关文献基础 信息，自主研发。各种试剂盒和化学试剂均为商购产品，为本发明中实验用，不 作为其他用途。
实施例1 HBV相关肝癌基因组肿瘤突变负荷
方法：手术取样新鲜肝癌及血液组织，取样体积＞1cm3，血样本为5毫升抗凝 血，并离心抽取血细胞。样本液氮速冻后置于单独密封包装中，防止样本间污染， 包装容器上标记基本临床信息。样品储存于-80℃于两周内置于干冰中运送至测 序公司进行样本质检及核酸提取及测序。基因组提纯后运用Qubit，1％AGE检 测样本降解情况，浓度≥20ng/ul，总量≥500ng，样本无明显降解带可用于下游 分析测序。
测序平台使用illumina2000测序仪，基于illumina配套技术测序平台采 用HiseqX-ten双末端(paireed-End)桥式测序法进行全基因组重测序。采用 自主研发软包XTenseq-(liver cancer)-LC--quality control进行质控。所有样 本Q30≥80％。
测序策略遵从以下流程：
1.测序文库构建。独立样本的总DNA超声断裂为350bp片段。进一步地，片 段末端补平，片段3′端加A，加上接头序列。进一步地，PCR法扩增文库，扩 增产物AM Pure XPsystem纯化。进一步地，Agilent 2100 Bioanalyzer分析 文库中片段大小分布情况，实时定量PCR定量文库浓度(3Nm).进一步地，使 用HiSeq X PE Cluster Kit V2.5试剂盒完成文库DNA簇生成流程。最终，完成 簇生成的DNA文库可上机测序。测序采用桥式扩增，最终读取片段(read)大 小为150bp。
2.有效数据筛选分析。测序原始数据储存为FASTQ格式。随后进行数据进行除 重，筛选处理。筛选策略在于除去1)接头序列，2)读取序列中不确定的序列 部分，3)去除序列中低质量的序列部分，4)去除数据中不可识别的序列部分。
3.数据比对及基因组变异监测策略。有效的测序数据通过Burrows-WheelerAligner(BWA)进行比对，参考基因组为B37。比对结果以BAM格式生成。 SAM tools，Picard(http：//broadinstitute.github.io/picard/)，and GATK软 件对BAM文件进行排序，重复标记，局部调整，碱基校准，进一步地生成可用 的BAM文档，并检测出测序深度及覆盖度。
4.体系突变检测策略。muTect检测单核苷酸变异，Strelka检测小片段插入缺 失。至少需要14X测序深度在肿瘤，8X测序深度在正常组织中用于一个位点上 的突变检测。ANNOVAR对数据进行注释，进一步生成VCF文件。
结果：通过16例HBV相关肝癌样本全基因组测序分析性，结果显示肝癌全基 因组具有高频单单核苷酸变异及小片段插入缺失，平均水平为8个突变/兆碱基， 范围2.5-25突变/兆碱基(图1)。该水平上的突变负荷远大于HBV阴性肝癌平 均数0.016667突变/兆碱基(数据来源：TCGA数据库，US)。这一数据提示 HBV相关肝癌基因组高度不稳定，存在促进高效突变的内在驱动因素或机制， 结合我们前期针对乙肝病毒致病机制的研究结果，对HBV相关肝癌突变指纹的 研究(见图2-4)，以及对HBx表达和CRL4WDR70沉默后基因组突变特征的 比较研究(见图5)，我们确立这种新型突变形式为hHRD类型的同源重组修复 缺陷。该技术参数此前未被报道。
实施例2 HBV相关肝癌基因组中hHRD类型的单核苷酸变异特征
方法：根据2013年英国剑桥的桑格研究所公布的全基因组30类点突变特征标 签的定义(Nature.2013 Aug22；500(7463)：415-21)，进一步对实施例1的16例HBV 相关肝癌样本单核苷酸变异聚类特征进行解析。单核苷酸变异标签抽取策略采用 在单样本中根据COSMIC数据库中定义的30类标准单核苷酸变异特征，利用 deconstructSigs软件分解出单个肿瘤样本中的突变特征及其组成比例(
Genome Biol.2016 Feb22；17：31.，全文引入参考)。deconstructSigs软件分析方法能 够对单一样本进行单核苷酸变异的标签解析，相对于传统的大容量样本中抽提单 核苷酸变异标签的算法，更适合于临床上针对个人病患进行基因组特征分析。 该软件信息运算示例如下：
Version：1.8.0 Date 2016-07-26
Description：Takes sample information in the form of the fraction ofmutations in each of 96 trinucleotide contexts and identifies the weightedcombination of published signatures that，when summed， most closelyreconstructs the mutational profile.
License：GPL(＞＝2)
Imports：reshape2，BSgenome，BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19，
GenomeInfoDb，grDevices，graphics，utils
Suggests：VariantAnnotation
LazyData：yes
URL：https：//github.com/raerose01/deconstructSigs
BugReports：https：//github.com/raerose01/deconstructSigs/issues
RoxygenNote：5.0.1
NeedsCompilation：no
Repository CRAN Date/Publication：2016-07-29 18：27：06
以下为解析单个样本饼状图信息：
makePie Plots the weights from whichSignatures()
Description
Uses the output from whichSignatures()and creates a pie chart of theweights outputted
Usage
makePie(sigs.output，sub＝″″，add.color＝NULL)
Arguments
sigs.output The list output from whichSignatures()sub A charactervector that specities cancer subtype for plot title.if wanted add.colorOptional character vector to assign additional colors for novel signaturesValue
Plots a pie chart of the weights calculated in the given tumor sampleExamples
makePie(example.output)
4 mut.to.sigs.input
结果：单核苷酸变异解析显示，HBV相关肝癌不同样本具有高度相似的单核苷 酸变异谱系(图2)。HBV相关肝癌还具有标签1，3，4，5，6，8，9，12，15， 16，22，24，25，26和28等突变特征标签，其中标签4/12/16/22/24/25是 代表肝癌的特征性标签。特别的是，代表同源重组修复缺陷的标签3出现在 15/16个肿瘤基因组中(图3)，肝癌特异的标签与标签3的组合即代表HBV相 关肝癌的单核苷酸变异突变特征谱。该技术参数此前未在肝癌中被发现或报道， 该指纹组合也未在之前乳腺癌，卵巢癌和HBV阴性肝癌中被检出。
实例3 HBV相关肝癌全基因组小片段插入缺失突变的组成特征
方法：小片段插入缺失具体解析方法如图8显示：
小片段插入缺失检测软件采用Strelka。小片段插入缺失特征解析策略或方 法为
1.定义出重复序列的小片段缺失事件为1-50bp小片段缺失发生在短串联重复 区域。
2.定义出微同源序列的小片段缺失事件为非短串联重复区域的1-50bp小片段 缺失，同时伴有两侧同源序列＞3bp.
3.定义出其他类型的缺失为非短串联重复区域的1-50bp小片段缺失，同时不 伴有有两侧同源序列＞3bp，同源序列范围定义为1-20bp。
4.定义出小片段插入为任意区域1-50bp的短片段插入。
结果：小片段插入缺失特征分析显示，与BRCA1/2缺陷型乳腺癌相似，HBV相 关肝癌具有4类小片段插入缺失特征(见图3)，其中代表同源重组缺陷的包括：： 1).微同源序列区的缺失(实施例样本中比例范围：0.046-0.373)2).两边无同 源序列的缺失(实施例样本中比例范围：0.222-0.536)所占比例最高；重复序 列的小片段缺失事件贡献较低，其比例＜1.1％；3)特别突出的，HBV相关肝癌 中代表经典非同源末端连结方式的两边无同源序列的缺失比例均值为0.396，高 出BRCA1/2乳腺癌中这一类型特征比例两倍以上(0.156)(NatMed.2017Apr； 23(4)：517-525)；4)小片段插入的比例均值达到0.408，明显区别于BRCA1/2缺陷型乳腺癌(均值为0.234)，这种特征显示HBV相关肝癌中hHDR类型的 小片段插入缺失组成特征显著区别于BRCA1/2缺陷型乳腺癌。该参数此前未在 肝癌中被发现或报道。
实施例4 HBV阴性肝癌的突变指纹特征
方法：从ICGC数据库提取50例乙肝病毒阴性肝癌组织的基因组测序数据，对 其突变率进行基础分析和比较，并计算单样本中突变负荷。进一步地，同上手术 取样四例HBV阴性的新鲜肝癌及对应个体的血液组织(抽取血细胞)，采取前述 基因组突变分析方法，使用deconstructSigs软件分解肿瘤单样本中的突变特 征及其组成比例，Strelka软件检测小片段插入缺失组成和分类。
结果：ICGC数据库中提取的阴性肝癌基因组数据显示，HBV阴性肝癌突变负荷 均值为2.8/兆碱基。与实施例一中HBV阳性肝癌数据对比，HBV阴性肝癌突变 负荷显著低于HBV相关肝癌(8.3/兆碱基)。(注：ICGC数据库采用全基因组测 序方法，2015年)。
单核苷酸变异解析显示，四例HBV阴性肝癌具有标签4，5，8，16，22及 25，，但是不包含代表同源重组修复缺陷的标签3(图5)。因此，肝癌特异的标 签与标签3组合形成的单核苷酸变异特征谱可以区别HBV相关和HBV阴性的 肝癌。
实施例5 HBV相关肝癌hHRD基因组突变指纹的相关性分析
比较HBV阴性及阳性肝癌中突变负荷差异，二者有显著差异(P＝0.003)。进一 步的，采用deconstructSigs软件分析出hHRD突变谱系(单核苷酸变异)在 HBV相关和阴性肝癌的中所占比值，结果显示单核苷酸变异标签3所占指纹比 重的样本间均值与HBV相关肝癌高度相关，且与HBV阴性肝癌表现统计学的 显著性差异(t检验，P＜0.001)(图6)。
实施例6 HBx表达和CRL4WDR70的基因沉默驱动的转基因小鼠基因组中 hHRD突变指纹的形成
方法：之前研究发现乙肝病毒编码癌蛋白HBx可干扰CRL4WDR70-H2B单泛 素化通路在细胞同源重组修复过程中的正常功能，造成宿主细胞同源重组缺陷。 我们采用对HBx表达和CRL4WDR70基因沉默的动物模型进行测序分析进一步 验证HBx表达和CRL4WDR70功能减低对基因组中hHRD突变指纹的驱动作 用。
其中关于转基因及基因沉默小鼠的构建如下：
1.肝特异性表达(白蛋白基因启动子)的HBx转基因小鼠由广州赛业公司进行 构建。
2.WDR70基因沉默小鼠采用体内干扰技术进行基因沉默。用以干扰WDR70 基因表达及对照用体内小片段siRNA((siG1117130927， 5-CUGCCAGAAUGGAAGCAUA-3′，)由广州瑞博公司(Ribobio，Guangzhou， China)合成。siRNA与体内转染试剂(Biotool，B45215)混合后尾静脉注射4-6 周龄C57小鼠，注射频率为每周一次。持续注射3个月，在小鼠达4月龄左右 与对照组同龄C57/B6小鼠取肝脏部位，送检基因组测序。
3.p53突变背景下的WDR70基因沉默小鼠模型所由采用C57背景下Trp53敲 出品系(B6.129S2-Trp53tm1/Nju)，由南京大学模式动物中心构建。根据上述 同样的实验方法对4-6周龄p53缺陷型小鼠进行WDR70基因沉默获得p53 突变背景下的WDR70基因沉默小鼠模型。
所有小鼠样本送测方式及检测，测序，分析平台均与前述(实施例1)的一 致。突变小鼠基因组数据均与C57/B6标准基因组 (GCF_000001635.26_GRCm38.p6_genomic.fna)进行比对。
结果：小片段插入缺失和单核苷酸变异特征性标签分析显示小鼠模型及HBV相 关肿瘤的临床样本在突变指纹上的一致性。两种模型小鼠的基因组中同样解析出 同源重组缺陷特征的单核苷酸变异标签3，与HBV相关肝癌一致。由此可见， CRL4WDR70功能缺失是造成HBV相关肝癌或其他肿瘤基因组中hHRD突变 指纹的驱动因素(见图7)。

Claims (17)

1.一种与hHRD类型同源重组修复缺陷相关的基因组特征性突变指纹，具有如选自图1-4中至少一图所示的指纹特征。
2.一种与hHRD类型同源重组修复缺陷相关的基因组突变标记物，具有如选自图1-4中至少一图所示的指纹特征。
3.如权利要求2的基因组突变标记物，所述指纹特征是由离体的体液或活检组织通过全基因组重测序后得到的数据经体细胞突变特征分析，抽提出样品中具有机制特征的基因组印记特征，处理后得到的突变指纹。
4.如权利要求2的基因组突变标记物，所述hHRD类型同源重组修复缺陷是由于乙型肝炎病毒感染所致CRL4WDR70-H2B单泛素化信号通路功能缺陷所致特殊类型的同源重组修复缺陷。
5.如权利要求2的基因组突变标记物，所述hHRD同源重组修复缺陷还包括由于CRL4WDR70-H2B单泛素化信号通路相关的细胞基因突变所致特殊类型的同源重组修复缺陷。
6.权利要求2所述的基因组突变标记物，包括具有在独立样本的肿瘤基因组中存在以下任易一项特征：A.单核苷酸变异特征解析包含单核苷酸变异标签3，并同时包含肝癌特征性标签4/12/16/22/24/25的其中之一；B.合有小片段插入缺失的组成，其特征在于含有微同源序列的小片段缺失事件，其比例4.5-40％；较低的重复序列的小片段缺失事件，其比例＜6％；且同时伴有较高频小片段插入事件，其比例为24％-60％。
7.权利要求2所述的基因组突变标记物，进一步包括在独立样本的肿瘤基因组中存在以下一种或多种附加特征：C.单样本全基因组的突变负荷2.5-25突变/兆碱基；D.基因组还可合有单核苷酸变异是标签1和5，或标签8，或标签9，或标签28。
8.权利要求6-7所述的基因组突变标记物，所述单核苷酸变异标签由改进的muTect软件解析，其抽提策略采用在单样本中根据桑格研究所Cosmic突变指纹框架所定义的单核苷酸变异特征谱系，利用deconstructSigs分析方法分解单个样本中的突变标签及其组成比例。
9.权利要求6所述的基因组突变标记物，所述小片段插入缺失特征使用Strelka软件运算抽取，其计算原理在于根据不同修复机制下断裂位点处具有相对应的小片段插入缺失序列特征，其定义为：A.定义出重复序列区的缺失为1-50bp小片段缺失发生在短串联重复区域；B.定义出微同源序列区的缺失为非短串联重复区域的1-50bp小片段缺失，同时伴有两侧同源序列＞3bp；C.定义出其他类型缺失为非短串联重复区域的1-50bp小片段缺失，同时不伴有两侧同源序列＞3bp，同源序列范围定义为1-20bp；D.定义出小片段插入为任意区域1-50bp的短片段插入。
10.权利要求2-7的至少一项基因组突变标记物或权利要求1的特征性突变指纹在制造检测离体的体液或病理组织中与乙肝病毒感染相关的疾病的试剂或试剂盒的用途，或者在制造检测乙肝病毒感染相关疾病的进展的试剂或试剂盒的用途，或者制造用于乙肝病毒感染相关疾病的药物治疗的指导性试剂或试剂盒的用途，或者在制造用于预测与乙肝病毒感染相关疾病的治疗创新药物的研究的试剂或试剂盒的用途。
11.如权利要求10所述的用途，所述乙型肝炎感染病毒感染性相关疾病包括乙型肝炎病毒感染所致急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆管细胞癌，优选肝癌，以及这些疾病所致的生理指标异常、循环系统症状或消化系统症状。
12.权利要求2-7的基因组突变标记物，在鉴定带有hHRD类型的同源重组修复缺陷的细胞或相关疾病的用途。
13.权利要求12所述的用途，所述hHRD类型同源重组修复缺陷，包括特定机制引起的与CRL4WDR70-H2B单泛素化信号通路功能障碍，例如CUL4A、DDB1、WDR70和组蛋白H2B单泛素化相关的基因突变或蛋白质功能减低，以及由于乙型肝炎病毒编码的癌基因HBx表达所造成的CRL4WDR70复合体组装障碍。
14.如权利要求12-13所述的用途，其hHRD类型同源重组修复缺陷的相关疾病，包括乙型肝炎病毒感染及所致相关疾病、部分乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜(样)癌、卵巢透明细胞癌、皮肤癌、胃癌或前列腺癌。
15.权利要求2-7所述基因组特征性突变指纹在采用靶向药物治疗hHRD类型的同源重组缺陷相关疾病过程中的指导性应用，特别是对乙肝病毒感染及其所致的肝癌，肝纤维化和肝硬化的治疗应用。
16.如权利要求15所述的应用，所述靶向药物选自酞嗪酮类化合物，2-[4-((3S)-3-哌啶基)苯基]-2H-吲唑-7-甲酰胺，BGB-290、维利帕尼、尼拉帕尼、鲁卡帕尼、E7449、Talazoparib及BGP-15，和它们可药用盐的PARP抑制剂。
17.一种鉴定同源重组修复缺陷(hHRD)的基因组的方法，包括以下步骤：
1)由离体的体液、细胞或活检组织经全基因测序；
2)将测序获得的数据采用muTect软件解析或使用Strelka软件运算抽取；
3)经软件处理后获基因组指纹图谱；
4)将步骤3)获得的指纹图谱与权利要求1的的基因组重排指纹比对，或者
5)将基因组与权利要求2的基因组重排标记物进行比对。
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