CN111671749A - 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 - Google Patents
双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111671749A CN111671749A CN202010533169.9A CN202010533169A CN111671749A CN 111671749 A CN111671749 A CN 111671749A CN 202010533169 A CN202010533169 A CN 202010533169A CN 111671749 A CN111671749 A CN 111671749A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbx
- inhibitor
- nqo1
- hepatitis
- dic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/365—Lactones
- A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
- A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供一种双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途。申请人通过实验发现利用HBx蛋白稳定性抑制剂,特别是双香豆素,可以有效的降低HBx的稳定性,进而抑制HBV病毒的复制,达到治疗乙肝的目的,为乙肝的治疗提供了新的路径,对人类的健康事业具有十分积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是涉及一种双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染,是一种严重威胁人类健康的重要公共卫生问题,据WHO报道,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所导致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。近年来,随着医疗技术的发展以及肝癌疫苗的使用,我国在预防HBV感染以及慢性HBV感染患者向肝硬化、肝癌等终末期肝病转化等方面已经取得了令人瞩目的成绩,但目前我国携带者数量仍高达7800万,HBV感染依然是严重威胁人们健康的公共卫生问题。目前用于临床治疗主要有两类:靶向pol蛋白的核苷类似物(Nucleotide analog,NAs)和靶向病毒转录的干扰素类(Interferons,IFNs)。但仅有不到30%的患者对干扰素敏感,且副反应大;核苷类似物可有效降低患者体内的病毒载量,但不能彻底清除病毒尤其是cccDNA,且长期用药会带来耐药等问题。因此,发展新的治疗手段、开发新的治疗药物对HBV的治疗就显得尤为重要。
尽管乙肝病毒研发思路也在不断更新,一些特异性更高的针对病毒特有结构和抑制病毒表面受体识别的药物不断在进入临床试验,但是其效果仍待临床的检验。其中病毒蛋白HBx对病毒复制是必须的,且序列相似度和宿主细胞蛋白差异性很大,作为一个新的病毒靶点越来越被重视。病毒蛋白HBx是HBV基因组上最小的开放阅读框编码形成,由154个氨基酸残基构成。HBx是重要的非结构蛋白,具有反式激活作用,已报道发现HBx可反式激活癌基因、病毒基因及细胞信号转导系统等。越来越多的观点认为HBx对病毒复制是必须的,其对cccDNA转录的启动和维持发挥着不可或缺的作用,并且HBx能够表观调控cccDNA转录。抑制HBx可有效沉默或关闭cccDNA转录,开发靶向HBx的药物可能为HBV治疗提供新的方向。同时,目前研究发现病毒蛋白HBx是诱导肝细胞向肝癌细胞转化的重要病毒蛋白,因此,开发靶向HBx的药物可能为HBV相关的肝癌治疗提供新的靶标。
香豆素又称为香豆精,为苯并吡喃酮类化合物,广泛存在于花草植物中,最初人们提取香豆素类化合物主要用于天然香料制备。随着分离提取技术的发展,越来越多的香豆素及其衍生物被分离鉴定,且其功能也不再限于香料制备,其具有抗炎、抗肿瘤等效能使香豆素及其衍生物在医疗领域的潜在价值被逐渐发现。双香豆素dicoumarol(DIC)属于香豆素类,也是一种苯并吡喃酮类有机化合物。双香豆素具有抗肿瘤、抗菌、抗凝血和抗病毒等活性。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途,用于解决现有技术中乙肝缺乏有效的治疗手段的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明的第一方面提供了双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途。
本发明第二方面提供一种HBx蛋白稳定性抑制剂在制备治疗乙肝治疗药物中的用途。
所述乙肝是指由HBV引起的病毒性乙型肝炎。
所述HBx蛋白稳定性抑制剂是指具有降低HBx蛋白稳定性的物质。
进一步地,所述HBx蛋白稳定性抑制剂为NQO1抑制剂。
进一步地,所述NQO1抑制剂是指对NQO1具有抑制效果的分子。
对于NQO1具有抑制效果包括但不限于:抑制NQO1活性,或者抑制NQO1基因转录或表达。
所述NQO1抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述NQO1抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述NQO1抑制剂可以为小分子化合物,如双香豆素、ES936或FAA。
于一实施例中,双香豆素通过降低HBx稳定性达到抑制HBV复制目的。
所述乙肝治疗药物必然包括HBx蛋白稳定性抑制剂,并以HBx蛋白稳定性抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述乙肝治疗药物中,发挥前述功用的有效成分可仅为HBx蛋白稳定性抑制剂,亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即,HBx蛋白稳定性抑制剂为所述乙肝治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述乙肝治疗药物可以为单成分物质,亦可为多成分物质。
所述乙肝治疗药物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述乙肝治疗药物主要针对的对象为哺乳动物,如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第三方面,提供了一种治疗乙肝的方法,为向对象施用HBx蛋白稳定性抑制剂。
进一步地,所述HBx蛋白稳定性抑制剂可以为NQO1抑制剂。
所述NQO1抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述NQO1抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述NQO1抑制剂可以为小分子化合物,如双香豆素、ES936或FAA。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的感染HBV的细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患乙肝的患者或者期待治疗的乙肝的个体。或者所述对象为乙肝患者或者期待治疗乙肝的个体的病毒性细胞。
所述HBx蛋白稳定性抑制剂可以在接受乙肝治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第四方面,提供一种乙肝治疗药物,包括有效剂量的HBx蛋白稳定性抑制剂。
进一步地,所述HBx蛋白稳定性抑制剂为NQO1抑制剂。
所述NQO1抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述NQO1抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述NQO1抑制剂可以为小分子化合物,如双香豆素、ES936或FAA。
进一步地,所述乙肝治疗药物,包括有效剂量的HBx蛋白稳定性抑制剂及药用载体。
所述乙肝治疗药物必然包括HBx蛋白稳定性抑制剂,并以HBx蛋白稳定性抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述乙肝治疗药物中,发挥前述功用的有效成分可仅为HBx蛋白稳定性抑制剂,亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即,HBx蛋白稳定性抑制剂为所述乙肝治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述乙肝治疗药物可以为单成分物质,亦可为多成分物质。
所述乙肝治疗药物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述乙肝治疗药物主要针对的对象为哺乳动物,如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第五方面,提供一种乙肝联合治疗药物组合,包括有效量的HBx蛋白稳定性抑制剂和至少一种其他乙肝治疗药物。
进一步地,所述HBx蛋白稳定性抑制剂为NQO1抑制剂。
所述NQO1抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述NQO1抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述NQO1抑制剂可以为小分子化合物,如双香豆素、ES936或FAA。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种:
一)将HBx蛋白稳定性抑制剂和其他乙肝治疗药物分别制成独立的制剂,制剂的剂型可相同或不同,给药途径亦可相同或不同。
当其他乙肝治疗药物为抗体时,一般采用胃肠外给药型。当其他乙肝治疗药物为化学药物时,给药形式可以比较丰富,可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。
二)将HBx蛋白稳定性抑制剂和其他乙肝治疗药物配置成复方制剂,在将HBx蛋白稳定性抑制剂和其他乙肝治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时,可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第六方面,提供一种治疗乙肝的方法,为向对象施用有效量的HBx蛋白稳定性抑制剂以及向对象施用有效量的其他乙肝治疗药物和/或向对象实施其他乙肝治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的HBx蛋白稳定性抑制剂和至少一种有效量的其他乙肝治疗药物。
其他的乙肝治疗药物包括但不限制于:抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述HBx蛋白稳定性抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他乙肝治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物,一般采用胃肠外给药。
本发明的第七方面提供了双香豆素在制备抑制HBV病毒复制制剂中的用途。
如上所述,本发明的具有以下有益效果:
本申请通过实验证实了HBx蛋白稳定性抑制剂可以降低HBx的稳定性,进而抑制HBV病毒的复制,达到治疗乙肝的目的,为乙肝的治疗提供了新的路径,对人类的健康事业具有十分积极的意义。
附图说明
图1显示HiBiT裂解检测系统检测DIC对HiBiT-HBx表达的影响。
图2显示MTT实验检测DIC对细胞活性的影响。
图3显示Western blot检测DIC对外源性HBx表达的影响。
图4显示Western blot检测DIC对内源性HBx表达的影响
图5显示Western blot检测NQO1对HBx蛋白水平的影响
图6显示RT-PCR检测NQO1对HBx mRNA水平的影响
图7显示Western blot检测NQO1对HBx蛋白稳定性的影响
图8显示Western blot检测DIC对HBx蛋白质稳定性的影响
图9显示Real time PCR检测DIC对HBV RNA水平的影响
图10显示Northern blot检测DIC对HBV RNA水平的影响
图11显示QRT-PCR检测DIC对HBV cccDNA水平的影响
图12显示分析DIC对cccDNA转录活性的影响
图13显示Real time PCR检测DIC对小鼠肝组织HBV RNA水平的影响
图14显示QRT-PCR检测DIC对小鼠肝组织cccDNA水平的影响
图15显示免疫组织化学检测DIC对小鼠肝组织HBx和HBs表达水平的影响
具体实施方式
我们构建了靶向HBx的药物筛选模型。该模型利用了Promega的HiBiT裂解检测系统,首先将由11氨基酸残基构成的短肽HiBiT与HBx进行融合表达,得到HiBiT-HBx融合表达蛋白;而HiBiT与LgBiT结合后可形成具有催化功能的萤光素酶,该酶能够催化底物产生发光信号,且信号强度与HiBiT-HBx在细胞裂解物中的含量成正比。因此,通过检测发光信号值的改变,即可筛选出能够有效抑制HBx表达的候选药物。基于上述模型,我们开展了针对病毒蛋白HBx的药物筛选工作,并成功筛选出双香豆素dicoumarol可以有效抑制HBx的表达。在本研究中,我们通过HiBiT-HBx裂解检测系统发现DIC可以有效抑制HBx的表达,且在多种细胞中证实其药物毒性低;接下来,蛋白稳定性检测发现DIC可以降低HBx蛋白稳定性进而抑制HBx表达。同时,我们将prcccDNA注射到Cre转基因小鼠体内,使其表达HBV,采用DIC处理后发现DIC可以显著减低小鼠肝组织内HBx的表达。综上,双香豆素dicoumarol通过降低HBx稳定性进而抑制HBx表达,是潜在靶向抑制HBx的有效药物。
HBx
HBx为HBV基因组上最小的开放阅读框编码编码,由154个氨基酸残基构成。HBx是重要的非结构蛋白,具有反式激活作用。
HBx稳定性抑制剂
HBx稳定性抑制剂是指可以降低HBx的稳定性,使得HBx蛋白易于分解。
NQO1
NQO1是指醌氧化还原酶1,英文全称为(NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,是氧化还原酶家族成员之一,定位于细胞质,以FAD为辅基,利用NAD(P)H提供电子,催化醌和醌类类似物得到两个电子,还原生成氢醌,从而发挥对醌类物质的解毒作用和抗氧化作用。
NQO1抑制剂
指对于NQO1具有抑制效果的分子。对于NQO1具有抑制效果包括但不限于:抑制NQO1活性,或者抑制NQO1基因转录或表达。所述NQO1抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
抑制NQO1活性是指使NQO1活力下降。优选地,相比抑制前,NQO1活力下降至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,最佳的降低至少90%。
抑制NQO1基因转录或表达是指:使NQO1的基因不转录,或降低NQO1的基因的转录活性,或者使NQO1的基因不表达,或降低NQO1的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对NQO1的基因转录或表达进行调节,如基因敲除、同源重组,干扰RNA等。
NQO1的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地,与野生型相比,NQO1基因转录或表达降低至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,又佳的降低至少90%,最佳地NQO1基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成,分子质量在1000以下的化合物。如本发明一些实施方式中所例举的,双香豆素Dicoumarol、ES936和FAA就属于小分子化合物。
HBx稳定性抑制剂制备乙肝治疗药物
以HBx稳定性抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备乙肝治疗药物。通常,药物中除了有效成分外,根据不同剂型的需要,还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与HBx稳定性抑制剂相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型,可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种:
一)将HBx稳定性抑制剂和其他乙肝治疗药物分别制成独立的制剂,制剂的剂型可相同或不同,给药途径亦可相同或不同。使用时,可几种药同时使用,也可几种药先后使用。先后给药时,应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将HBx稳定性抑制剂和其他乙肝治疗药物配置成复方制剂,在将NQO1抑制剂和其他乙肝治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时,可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的HBx稳定性抑制剂和至少一种有效量的其他乙肝治疗药物。
使用时,可将有效量的HBx稳定性抑制剂和有效量的其他乙肝治疗药物同时使用,也可将有效量的HBx稳定性抑制剂和有效量的其他乙肝治疗药物先后使用。先后给药时,应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等
MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodicupdates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
本申请中的所使用的材料如无特别说明,均来自市购,其中:
细胞名称 | 购买公司 |
PHH细胞系 | ScienCell Research Laboratories |
Huh-7细胞系 | Health Science Research Resource Bank |
HepG2-NTCP | 本实验室自行构建 |
HepAD38 | 厦门大学夏宁邵教授馈赠 |
HepG2.2.15 | Shanghai Second Military Medical University |
HepG2 | American Type Culture Collection |
PLC/PRF/5 | Health Science Research Resource Bank |
实施例1细胞培养与转染
HepG2-NTCP细胞系培养于含有10%胎牛血清、2.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基中;PHH细胞培养于HM培养基;Huh-7细胞系培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。所有细胞均在含5%C02,37℃孵箱中常规培养。质粒按照Lipofectamin 3000TM(Invitrogen)的说明书转染。
为了筛选靶向抑制HBx的药物,我们基于Promega的HiBiT裂解检测系统构建了靶向HBx的药物筛选模型。首先将含有11个氨基酸残基的多肽HiBiT与HBx进行融合表达,得到HiBiT-HBx表达质粒并转入HepG2和Huh-7细胞中,再采用候选药物处理;
取出药物处理后的细胞,PBS洗两次,严格按照试剂盒说明书避光操作。配置HiBiT Lytic Reagent:根据每孔100μL计算所需总量,以1个孔的量为例,在无菌EP管中依次加入100μLHiBiT Lytic Buffer,1μLHiBiT LyticLgBiT Protein(1:100)和2μLHiBiT Lytic Substrate(1:100),充分混匀;每孔加入100μLHiBiT Lytic Reagent,室温摇床裂解10min;转移裂解液至无菌EP管后立即测定荧光素酶活性值。
结果如图1显示,NQO1抑制剂Dicoumarol(DIC)呈浓度依赖性抑制HiBiT-HBx在HepG2和Huh-7细胞中的表达,提示DIC可抑制HBx的表达。
实施例3 MTT实验检测Dicoumarol的细胞毒性
为了检测NQO1抑制剂Dicoumarol的细胞毒性,我们首先将不同的细胞(包括HepG2-NTCP、HepAD38、HepG2.2.15、HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5)接种于96孔板后,使用不同浓度的Dicoumarol(DIC)处理细胞72h,具体操作:
用0.13N的NaOH溶解DIC,配制成40mM存储液。将1.5×104Huh-7细胞或HepG2-NTCP细胞接种于96孔板中,24小时后,用生长培养基将DIC存储液进行对比稀释,依次得到含有0μM、1.925μM、3.90μM、7.8125μM、15.625μM、31.25μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μMDIC的培养基;并以无药处理组为对照,纯培养基为空白,每个浓度3个复孔,每孔分别加100μl上述溶液。72h后,加入MTT试剂10ul,37℃孵育4h,加入SDS裂解液,37℃避光孵育6h后于570nm检测OD值,计算CC50值
结果如图2显示,与对照组比较,DIC的CC50均大于400μM;且在HepG2-NTCP、HepAD38和HepG2等3种细胞中CC50大于800μM,以上结果说明DIC的细胞毒性较小。
实施例4 Dicoumarol抑制外源性HBx表达和内源性表达
为了进一步探究DIC对HBx表达的影响,我们接下来在HepG2细胞中分别转染了3×Flag-HBx和2×HA-HBx后,采用不同浓度的DIC处理,具体操作方法为:
取出待检测细胞,加入适量RIPA(含PI)裂解细胞提取总蛋白;取30μg总蛋白95℃变性后采用SDS-PAGE胶分离蛋白;采用BioRad湿式转移法将蛋白转移至PVDF膜,用5%脱脂牛奶室温封闭2h;根据实验目的加入一抗4℃孵育过夜;次日,洗膜后加入对应二抗室温孵育2h;最后,ECL显影,分析数据。以GAPDH为内参。
结果如图3所示,western blot检测HBx蛋白水平发现,DIC可显著抑制外源性HBx蛋白的表达。
为进一步证实DIC对HBx的抑制作用,我们在HepG2细胞中转染了包含1.1倍HBV基因组的HBV表达质粒pCH9/3091,随后在培养基中加入不同浓度的DIC进行处理。Westernblot结果显示,DIC同样可显著抑制内源性HBx蛋白的表达,结果如图4。
实施例5 NQO1通过调控HBx稳定性进而促进HBx表达
前面我们已经证实DIC作为NQO1的抑制剂,可以显著降低病毒蛋白HBx的表达水平,这就提示我们NQO1有可能也参与了HBx表达调控过程。因此,我们检测了NQO1敲减/敲除对HBx蛋白水平的影响;结果显示,相对于对照组细胞,HBx在NQO1敲减/敲除细胞中表达降低;反之,在NQO1过表达细胞中,HBx水平明显升高(图5)。以上结果充分说明NQO1可促进HBx的表达。
RNA提取与检测:采用TRizol法提取细胞总RNA,取1μg RNA利用IScriptTM cDNASynthesis Kit试剂盒将其逆转录为cDNA,然后进行qRT-PCR检测目的基因。HBx引物序列,F:GTCTGTGCCTTCTCATCTGC(SEQ ID NO.1),R:CCCAACTCCTCCCAGTCTTT(SEQ ID NO.2)。每个样品均设3个复孔,每组实验重复3次。以β-actin为内参。
我们检测HBx mRNA水平,发现无论是在NQO1敲减/敲除细胞中,还是NQO1过表达细胞中,HBx mRNA水平均无明显改变(图6)。这就提示我们,NQO1对HBx的调控作用是在蛋白水平,而不是mRNA。
因此,我们大胆猜想NQO1参与HBx蛋白稳定性的维持。为了证实这一猜想,我们检测了NQO1敲减/敲除时,HBx稳定性的改变:与对照组相比,NQO1敲减/敲除时HBx的降解速度明显加快;相反,NQO1过表达时HBx的降解速度明显减慢(图7)。以上结果说明NQO1可以通过调控HBx稳定性进而促进HBx表达。
实施例6 Dicoumarol通过调控HBx稳定性进而抑制HBx表达
之前已经证实NQO1通过调控HBx稳定性进而促进HBx表达。作为NQO1的抑制剂,DIC可有效抑制HBx表达。那么,是否也是通过调控HBx稳定性继而抑制HBx表达的呢?接下来我们探讨了DIC对HBx蛋白稳定性的影响。
具体方法:采用蛋白质合成抑制剂CHX处理转染了3×Flag-HBx的细胞,提取总蛋白后经western blot检测发现,DIC可明显降低HBx蛋白的稳定性,加速其降解(图8)。
综合以上结果,我们初步猜想DIC可能通过调控HBx蛋白稳定性进而降低HBx表达水平。
实施例7 Dicoumarol抑制HBV转录
作为重要的病毒蛋白,HBx参与了HBV转录复制过程中多个环节的调控,尤其是cccDNA转录过程。既然DIC可以降低病毒蛋白HBx的稳定性,那么DIC是否能调控HBV的转录复制过程?为了回答这个问题,我们用DIC处理了HBV感染的HepG2-NTCP细胞,并进行了相关检测。
具体方法:采用不同浓度的DIC处理HBV感染的HepG2-NTCP细胞,收集不同时间点的细胞。
采用TRizol法提取细胞总RNA,取1μg RNA利用IScriptTM cDNA Synthesis Kit试剂盒将其逆转录为cDNA,然后进行qRT-PCR检测目的基因的mRNA水平,HBV 3.5-kb RNA引物为F:CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT(SEQ ID NO.3),R:AGCACTGTGTTGGCGTACAG(SEQ ID NO.4),total HBV RNAs引物为F:ACCGACCTTGAGGCATACTT(SEQ ID NO.5),R:GCCTACAGCCTCCTAGTACA(SEQ ID NO.6)。每个样品均设3个复孔,每组实验重复3次。以β-actin为内参。
采用Hirt法提取cccDNA,然后按下述步骤对样品进行预处理:(1)80℃变性5min后立即置于冰上;(2)核酸外切酶Ⅴ37℃酶切30min;(3)100℃孵育20min,4℃冷却。预处理后的样品采用Taqman探针法检测cccDNA水平。HBV cccDNA引物,F:CTCCCCG TCTGTGCCTTCT(SEQ ID NO.7),HBV cccDNA引物R:GCCCCAAAGCCACCCAAG(S EQ ID NO.8),probe:FAM-ACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC-TAM(SEQ ID N O.9),每个样品均设3个复孔,每组实验重复3次。
我们检测了DIC对HBV转录水平的影响,包括剂量依赖性和时间依赖性。Real timePCR结果显示,DIC可以持续的剂量依赖性的抑制Total HBV RNAs和pgRNA的水平(图9)。同时,northern blot结果也提示DIC可以持续的剂量依赖性的抑制HBV 3.5-kb RNA和2.1/2.4-kb RNA的水平(图10)。
cccDNA含有HBV全部基因组信息,是病毒转录复制的模板。接下来我们检测了DIC对cccDNA水平的影响。
结果显示,DIC对cccDNA水平无明显影响(图11)。进一步分析cccDNA转录活性(total RNAs/cccDNA和pgRNA/cccDNA比值)发现,虽然DIC对HBV cccDNA水平无明显作用,但是可显著抑制cccDNA转录活性(图12)。
综上,我们发现NQO1抑制剂可以通过抑制cccDNA转录活性进而抑制HBV转录。
实施例8 NQO1抑制剂Dicoumarol体内毒性检测
为了探究NQO1抑制剂Dicoumarol(DIC)在体内的抗病毒效应,我们首先检测了DIC在小鼠体内的毒性。将15只6-8周龄的Cre-Tg小鼠随机分别为3组,分别采用不同剂量的DIC进行处理(分别为DIC 0mg/kg组、10mg/kg组、20mg/kg组),每两天经腹腔给药一次,监测体重。第21天经眼球采血检测血常规和血生化指标。如表1所示:
表1 Dicoumarol对小鼠体重、血常规以及血生化指标的影响
数据以平均数±标准差表示。
缩写:WBC,白细胞;红细胞,红细胞;ALT,丙氨酸氨基转移酶;AST、天冬氨酸氨基转移酶;高山,碱性磷酸酶;GGT,γ-glutamyl转肽酶;治疗组总胆红素;克雷亚,肌酐;尿素氮。与0mg/kg/2d双香豆素组比较,ns无显著性差异(p>0.05)。
采用SPSS 17.0软件进行统计,两组间比较采用配对t检验和多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。
DIC处理对小鼠体重、白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、总蛋白、白蛋白、ALT、AST、GGT、总胆红素、血肌酐和血尿素均无明显影响。说明DIC在体内毒性较小,即使在20mg/kg的浓度下均无明显肝肾毒性。因此,我们采用了20mg/kg的浓度进行后续实验。
实施例9 NQO1抑制剂Dicoumarol抑制小鼠体内HBV转录
为了探讨NQO1抑制剂DIC是否能抑制小鼠体内HBx的表达,我们首先将prcccDNA注射到Cre转基因小鼠体内,使其表达HBV,建模一周后将小鼠随机分为3组进行药物处理,采用免疫组织化学技术检测了小鼠肝组织内病毒蛋白HBx表达水平。具体方法为:
繁殖培养Cre转基因小鼠(C57BL/6-Tg[Alb-cre]21Mgn/J),准备6-8周龄(体重约20g/只)小鼠96只;将提取的prcccDNA质粒溶于PBS使其终浓度为2.5μg/mL;采用尾静脉高压注射法按4μg/只的剂量将prcccDNA质粒注射入小鼠体内,构建HBV感染模型。建模一周后,经眶后静脉丛采集血液,检测血清HBV DNA水平;选取HBV复制水平相近的小鼠进行后续实验。
将建模后的小鼠随机分为三组:对照组(每只每次注射生理盐水200μL)、DIC组(按20mg/kg/2days DIC计算给药量,腹腔给药)、ETV组(按0.02mg/kg/2days ETV计算给药量,口服给药)。钝性分离小鼠肝脏,提取肝脏组织RNA和DNA,检测HBV RNA和cccDNA水平。
乙肝病毒具有嗜肝性,因此检测小鼠肝组织内HBV的转录复制情况有利于进一步了解DIC在体内的抗病毒效应。紧接着,我们持续关注了小鼠肝组织内乙肝病毒转录复制相关指标。之前的研究已经证实,DIC可以在体外抑制cccDNA转录,而对cccDNA水平无明显影响。所以,我们首先关注了DIC在体内对cccDNA水平以及转录活性的影响。与体外实验结果一致,DIC可以显著降低小鼠肝组织内HBV total RNA和3.5-kb RNA水平(图13),然而对cccDNA水平无明显影响(图14),说明DIC可以有效降低HBV在体内的转录水平。
实施例10 NQO1抑制剂Dicoumarol抑制小鼠体内HBx的表达
将建模后的小鼠随机分为三组:对照组(每只每次注射生理盐水200μL)、DIC组(按20mg/kg/2days DIC计算给药量,腹腔给药)、ETV组(按0.02mg/kg/2days ETV计算给药量,口服给药)。钝性分离小鼠肝脏,切取较大完整的组织块,由谷歌生物公司进行石蜡包埋切片。
将石蜡包埋切片置于55℃烤箱过夜;次日置于95℃烤箱,10min;立即依次置于二甲苯和浓度梯度的乙醇中进行脱蜡处理。高温抗原修复后置于0.1%Triton-100/PBS中透膜20min;内源性过氧化物酶阻断剂去除内源性过氧化物酶;滴加山羊工作血清封闭非特异性位点后加入HBx抗体孵育过夜;次日,洗片后依次滴加生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂;最后滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色3-5min;苏木素室温复染10min,自来水冲洗返蓝;脱水封片,镜下观察。
与对照组相比,DIC处理组HBx的表达水平均明显降低,但ETV组的蛋白表达水平没有明显改变(图15)。以上结果提示我们,DIC可以抑制HBV感染小鼠体内HBx的表达。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctgtgcct tctcatctgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaactcct cccagtcttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcttccagc cttccttcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcactgtgt tggcgtacag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accgaccttg aggcatactt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctacagcc tcctagtaca 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctccccgtct gtgccttct 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccccaaagc cacccaag 18
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgtcgcatg gagaccaccg tgaacgcc 28
Claims (10)
1.双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途。
2.HBx蛋白稳定性抑制剂在制备治疗乙肝治疗药物中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于:所述HBx蛋白稳定性抑制剂为NQO1抑制剂。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于:所述NQO1抑制剂选自双香豆素、ES936或FAA。
5.根据权利要求2所述的用途,其特征在于:所述HBx蛋白稳定性抑制剂为所述乙肝治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
6.一种乙肝治疗药物,其特征在于,包括有效剂量的HBx蛋白稳定性抑制剂。
7.根据权利要求6所述的乙肝治疗药物,其特征在于:所述HBx蛋白稳定性抑制剂为NQO1抑制剂。
8.根据权利要求7所述的乙肝治疗药物,其特征在于:所述NQO1抑制剂选自双香豆素、ES936或FAA。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括如权利要求6-8任一项所述的乙肝治疗药物。
10.双香豆素在制备抑制HBV病毒复制制剂中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010533169.9A CN111671749A (zh) | 2020-06-12 | 2020-06-12 | 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010533169.9A CN111671749A (zh) | 2020-06-12 | 2020-06-12 | 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111671749A true CN111671749A (zh) | 2020-09-18 |
Family
ID=72454686
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010533169.9A Pending CN111671749A (zh) | 2020-06-12 | 2020-06-12 | 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111671749A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113304165A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-08-27 | 重庆医科大学 | 单体化合物Ciliatoside A在制备乙型肝炎治疗药物中的用途 |
CN116509843A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-08-01 | 中山大学附属第三医院 | 双香豆素及其衍生物作为内质网应激抑制剂在制备治疗肝损伤药物中的应用 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001057189A2 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-09 | Quark Biotech, Inc. | Fas pathway genes |
US20030175938A1 (en) * | 1999-05-07 | 2003-09-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Serine protease polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
CN101129473A (zh) * | 2007-08-21 | 2008-02-27 | 河源市金源绿色生命有限公司 | 一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途 |
CN101537138A (zh) * | 2009-04-23 | 2009-09-23 | 唐维居 | 一种消除乙型肝炎病毒(hbv)复制的中药乙肝散及其制造方法 |
CN101983191A (zh) * | 2008-02-01 | 2011-03-02 | 武田药品工业株式会社 | 作为hsp90抑制剂的肟衍生物 |
WO2011145885A2 (ko) * | 2010-05-18 | 2011-11-24 | 연세대학교 산학협력단 | B형 간염 치료활성 물질의 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법 |
CN102675422A (zh) * | 2011-03-15 | 2012-09-19 | 天津托普泰克生物科技有限公司 | 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物 |
US20160158248A1 (en) * | 2007-01-19 | 2016-06-09 | Hananja Ehf | Methods and systems for the delivery of a therapeutic agent |
CN108310383A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-07-24 | 重庆医科大学 | Nqo1抑制剂在制备肝癌治疗药物中的用途 |
CN108904478A (zh) * | 2018-09-19 | 2018-11-30 | 山东大学 | 烯丙基甲基三硫化物在制备防治药物性肝损伤的产品中的应用 |
CN109364079A (zh) * | 2018-10-08 | 2019-02-22 | 四川大学华西第二医院 | 塔拉帕尼在制备治疗或者预防肝炎病毒相关疾病药物中的用途 |
-
2020
- 2020-06-12 CN CN202010533169.9A patent/CN111671749A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030175938A1 (en) * | 1999-05-07 | 2003-09-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Serine protease polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
WO2001057189A2 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-09 | Quark Biotech, Inc. | Fas pathway genes |
US20160158248A1 (en) * | 2007-01-19 | 2016-06-09 | Hananja Ehf | Methods and systems for the delivery of a therapeutic agent |
CN101129473A (zh) * | 2007-08-21 | 2008-02-27 | 河源市金源绿色生命有限公司 | 一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途 |
CN101983191A (zh) * | 2008-02-01 | 2011-03-02 | 武田药品工业株式会社 | 作为hsp90抑制剂的肟衍生物 |
CN101537138A (zh) * | 2009-04-23 | 2009-09-23 | 唐维居 | 一种消除乙型肝炎病毒(hbv)复制的中药乙肝散及其制造方法 |
WO2011145885A2 (ko) * | 2010-05-18 | 2011-11-24 | 연세대학교 산학협력단 | B형 간염 치료활성 물질의 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법 |
CN102675422A (zh) * | 2011-03-15 | 2012-09-19 | 天津托普泰克生物科技有限公司 | 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物 |
CN108310383A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-07-24 | 重庆医科大学 | Nqo1抑制剂在制备肝癌治疗药物中的用途 |
CN108904478A (zh) * | 2018-09-19 | 2018-11-30 | 山东大学 | 烯丙基甲基三硫化物在制备防治药物性肝损伤的产品中的应用 |
CN109364079A (zh) * | 2018-10-08 | 2019-02-22 | 四川大学华西第二医院 | 塔拉帕尼在制备治疗或者预防肝炎病毒相关疾病药物中的用途 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
TAKEUCHI F,ET AL: "Screening for inhibitor of episomal DNA identified dicumarol as a hepatitis B virus inhibitor", 《PLOS ONE》 * |
吴云丽: "乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对人FABP1和NQO1基因调控及机制研究", 《万方数据-学位论文》 * |
程胜桃: "NQO1抑制剂Dicoumarol调控HBx稳定性对乙肝病毒转录复制的重要作用", 《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)基础科学辑》 * |
陈娟,等: "醌氧化还原酶1抑制剂双香豆素促进HBV X蛋白降解进而抑制cccDNA转录的机制研究", 《临床肝胆病杂志》 * |
黄雅杰: "民族医药治疗慢性乙肝的研究进展", 《畜牧与饲料科学》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113304165A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-08-27 | 重庆医科大学 | 单体化合物Ciliatoside A在制备乙型肝炎治疗药物中的用途 |
CN116509843A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-08-01 | 中山大学附属第三医院 | 双香豆素及其衍生物作为内质网应激抑制剂在制备治疗肝损伤药物中的应用 |
CN116509843B (zh) * | 2023-04-28 | 2023-12-15 | 中山大学附属第三医院 | 双香豆素及其衍生物作为内质网应激抑制剂在制备治疗肝损伤药物中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6147123A (en) | Treatment and prevention of hepatic disorders | |
US10959963B2 (en) | Method for the treatment of fatty liver disease | |
EP3290034A1 (en) | Use of trimethazine in preparation of drugs for preventing and treating liver diseases | |
WO2016137037A1 (ko) | Dpp-4 억제제를 포함하는 판막 석회화의 예방 또는 치료용 조성물 | |
CN111671749A (zh) | 双香豆素在制备HBx蛋白稳定性抑制剂中的用途 | |
CN115089600B (zh) | 麦冬皂苷d在制备抗轮状病毒药物中的应用 | |
CN105899211A (zh) | 使用cbp/连环蛋白的抑制剂治疗肝纤维化 | |
WO2022237007A1 (zh) | 牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途 | |
Yang et al. | Stimulation of epithelial sodium channels in endothelial cells by bone morphogenetic protein‐4 contributes to salt‐sensitive hypertension in rats | |
CN114796233A (zh) | 积雪草酸在制备乙型肝炎治疗药物中的用途 | |
US20170368077A1 (en) | Method for treatment of hyperglycemia and hyperlipidemia | |
KR100597612B1 (ko) | 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물을 포함하는 식품 조성물 | |
KR100535266B1 (ko) | 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물 | |
CN114452280B (zh) | 苍术酮在制备胶质瘤治疗药物中的应用 | |
EP4424317A1 (en) | Medicine for preventing or treating enteritis and intestinal cancer | |
CN116059200A (zh) | 一种钩吻绿碱在制备治疗关节炎的药物中的应用 | |
WO2024005289A1 (ko) | 테노포비르 알라페나미드를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
US20240058311A1 (en) | Use of smo inhibitor in preparation of drug for preventing, delaying or alleviating access stenosis of arteriovenous fistula | |
US20230181662A1 (en) | Uses of antrodia cinnamomea extract in manufacturing products for reducing expression and treating associated diseases of angiotensin converting enzyme 2 | |
CN108904520B (zh) | 肉苁蓉多糖在制备治疗骨关节炎药物方面的应用 | |
WO2022145512A1 (ko) | 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
Sugita et al. | In vivo administration of a thiol protease inhibitor, E‐64‐C, to hereditary dystrophic chicken | |
CN115487213A (zh) | Akk菌在制备抗肝中毒的药物中的应用 | |
CN114848632A (zh) | 4-甲基-5,6-二氢吡喃-2酮在制备nlrp3炎症小体活性抑制剂中的应用 | |
CN117065027A (zh) | Aibp作为靶点在制备治疗急性肝炎药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |