CN115089600B - 麦冬皂苷d在制备抗轮状病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麦冬皂苷D在制备轮状病毒药物中的应用，通过实验证实，在麦冬皂苷D的药物浓度为1.2‑1.8mM范围内，麦冬皂苷D对轮状病毒有直接杀灭作用，并且麦冬皂苷D对细胞没有药物毒性。所述麦冬皂苷D通过抑制MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达，从而发挥其抗轮状病毒作用。因此，本发明提出了以麦冬皂苷D为主要活性成分，有望研制出安全有效的特异性抗轮状病毒药物，并对抗轮状病毒药物研究提供了指导价值。

Description

麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及麦冬皂苷D技术领域，具体涉及麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用。

背景技术

轮状病毒(rotavirus，RV)是呼肠孤病毒家族(Reoviridae)的一员，其外表为二十面体形结构，三层同心蛋白外衣壳包围着由11条dsRNA构成的基因组，负责编码6种结构蛋白和6种非结构蛋白。轮状病毒是导致婴幼儿腹泻的主要病原体，轮状病毒的高度传染性和致病性对整个社会造成极大的危害，全球每年约有1.3亿人发生感染，死亡人数约20万。迄今为止，人们对轮状病毒感染机制研究还不够充分，临床上主要是对症治疗，缺乏直接针对轮状病毒的特效药物。目前唯一的一种在美国上市的轮状病毒疫苗RotaTeq，价格非常昂贵，且由于轮状病毒毒株的变异性、多样性使其预防毒株的范围有限。因此，如何防治轮状病毒感染是重大的难题，为了降低轮状病毒感染率和死亡率，亟需提出更多对抗轮状病毒的特效药物研究及应用。

麦冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)是一种从麦冬(Thunb.)Ker Gawl中提取的甾体皂苷，具有抗炎和抗氧化作用等，但目前尚无麦冬皂苷D抗轮状病毒的作用报道，麦冬皂苷D的结构式如附图1所示。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足提出了麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用，为防治轮状病毒感染的药物研究或临床治疗提供了一种新策略。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用。

本发明创造性地发现可以将麦冬皂苷D用于制备抗轮状病毒药物，通过体外实验研究发现，麦冬皂苷D对轮状病毒具有明显的直接杀灭作用，并且麦冬皂苷D的药物药物浓度在0.4-2mM之间对细胞均没有药物毒性。

进一步的，在所述抗轮状病毒药物中，所述麦冬皂苷D的药物浓度为0.6-1.8mM。

进一步的，麦冬皂苷D对轮状病毒具有直接杀灭作用。

本发明通过采用MA104细胞模型探究麦冬皂苷D对体外抗轮状病毒感染的作用，实验结果表明，麦冬皂苷D的药物浓度在1.2-1.8mM范围内，麦冬皂苷D对轮状病毒有明显的直接杀灭作用，且在药物浓度为1.4mM时，麦冬皂苷D对轮状病毒的抑制率高达79.8％。

进一步的，所述麦冬皂苷D抑制轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达。

本发明探究了麦冬皂苷D对轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响，实验结果发现，麦冬皂苷D的药物浓度为0.6、1.0和1.4mM时，VP6基因表达量均明显降低，具有统计学差异，且存在剂量效应相关性。由此表明，麦冬皂苷D可通过抑制VP6的基因表达来发挥其抗轮状病毒作用。

本发明提供了一种抗轮状病毒药物，所述抗轮状病毒药物的有效成分包括麦冬皂苷D。

进一步的，所述抗轮状病毒药物为麦冬皂苷D的单方或复方制剂。

进一步的，所述抗轮状病毒药物的制剂形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液、注射剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂、半固体制剂、注射剂、乳剂或喷雾剂中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用，揭示了麦冬皂苷D能够应用于制备抗轮状病毒药物，该应用能够为开发安全有效的药物以防治轮状病毒感染提供新策略。

(2)本发明采用MA104细胞模型探究麦冬皂苷D对体外抗轮状病毒感染的作用，结果显示麦冬皂苷D的药物浓度在1.2-1.8mM范围内，麦冬皂苷D对轮状病毒有明显的直接杀灭作用，且在药物浓度为1.4mM时，麦冬皂苷D对轮状病毒的抑制率高达79.8％。本发明还探究了麦冬皂苷D对轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响，结果显示麦冬皂苷D的药物浓度为0.6、1.0和1.4mM时，VP6基因表达量均明显降低，具有统计学差异，且存在剂量效应相关性。由此表明麦冬皂苷D可通过抑制VP6的基因表达来发挥其抗轮状病毒作用。因此，本发明提出了以麦冬皂苷D为主要活性成分，有望研制出安全有效的特异性抗轮状病毒药物，为防治轮状病毒感染药物临床应用提供了指导价值。

附图说明

图1是麦冬皂苷D的化学结构式。

图2是实施例4中显微镜下正常MA104细胞的细胞形态图。

图3是实施例4中显微镜下轮状病毒感染48h后的MA104细胞的细胞形态图。

图4是实施例4中麦冬皂苷D对MA104细胞的毒性作用的实验结果图。

图5是实施例5中麦冬皂苷D抗轮状病毒吸附作用的实验结果图。

图6是实施例6中麦冬皂苷D抗轮状病毒生物合成作用的实验结果图。

图7是实施例7中麦冬皂苷D对轮状病毒的直接杀灭作用的实验结果图。

图8是实施例8中麦冬皂苷D对轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响的实验结果图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

为了使本发明的目的、技术方案和技术效果更加清楚，本发明提供下述实施例所用到的实验材料、仪器、主要实际的配制方法以及下述实施例中实验数据的统计分析方法作如下说明：

(1)实验细胞株和试剂

(2)主要仪器

(3)主要试剂的配制方法

①麦冬皂苷D母液：称取麦冬皂苷D标准品8.6mg，纯度≥98％,批号：P26F9F54695，在超净台内加1ml细胞级DMSO溶解，用一次性无菌针管将药液通过0.22μM滤膜过滤除菌，配置母液为10mM。

②DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)：在超净工作台内将50ml胎牛血清和5ml双抗依次加入400ml的高糖DMEM培养基中，充分混匀后分装置标记好的50ml离心管中，封口，4℃保存。

③10μg/mL不含EDTA的胰酶：不含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液和不含胎牛血清的DMEM培养基以1：250的比例稀释至10μg/mL。

④轮状病毒生长维持液：10μg/mL不含EDTA的胰酶和不含胎牛血清的DMEM培养基以1：10的比例稀释至1μg/mL。

(4)统计数据分析

本发明下述实施例的所有实验均重复三次。实验数据采用均数±标准差表示。采用SPSS软件统计数据，两组间比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。得到的数据结果以平均值±标准差的形式表示。数据分析采用统计分析软件Graphpad prism8.01进行Mann–Whitney统计。P<0.05表示差异具有统计学意义。其中，附图中的标记含义分别表示为：在附图4中，#代表P<0.05，##代表P<0.01，###代表P<0.001，前述三个标记均表示与N组相比。在附图5和7中，△△代表P<0.01，△△△△代表P<0.0001，前述两个标记均表示与Ribavirin组相比。在附图8中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001，前述四个标记均表示与检测药物组相比。

实施例1

本发明提供了麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用。

进一步的，在所述抗轮状病毒药物中，所述麦冬皂苷D的药物浓度为0.6-1.8mM。

进一步的，麦冬皂苷D对轮状病毒具有直接杀灭作用。

进一步的，所述麦冬皂苷D抑制轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达。

实施例2

本发明提供了一种抗轮状病毒药物，所述抗轮状病毒药物的有效成分包括麦冬皂苷D。

进一步的，所述抗轮状病毒药物为麦冬皂苷D的单方或复方制剂。

进一步的，所述抗轮状病毒药物的制剂形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液、注射剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂、半固体制剂、注射剂、乳剂或喷雾剂中的任意一种。

实施例3

本实施例中轮状病毒感染MA104细胞的实验方法如下：

将病毒置于37℃水浴锅中融化，经过胰蛋白酶预处理30min后，将病毒溶液加入到生长到80～90％的MA104细胞中，轮状病毒感染所用的细胞培养基中不添加血清。病毒感染后的MA104细胞会发生细胞病变CPE(Cytopathic effect)，当病变程度达到75％时，-20℃冰箱中冻存。重复冻存和融化过程3次后，低温离心，收取上清，即为所得病毒液。重复上述过程，扩增轮状病毒。

实施例4

本实施例采用CCK8法检测麦冬皂苷D对MA104细胞的毒性的实验方法如下：

根据麦冬皂苷D常用药物浓度范围，本实验在0.2-2mM之间进行细胞毒性预实验。取对数生长期的MA104细胞于显微镜下观察，细胞形态均一饱满，边缘清晰且数量达到80％时，进行消化、离心和重悬，混悬液进一步稀释后取10μl于血细胞计数板上计数，计算所需细胞体积。随后在96孔板中细胞铺板，每孔加100μl细胞混悬液，细胞密度为8×104个/mL。待细胞贴壁成单层时给药。孵育48h后，CCK-8试剂盒检测麦冬皂苷D的细胞毒性。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。细胞的相对存活率公式为：

{(A_实验组-A_空白)/(A_对照组-A_空白)×100％}

本实施例所述正常MA104细胞和轮状病毒感染48h后的MA104细胞在显微镜下的细胞形态如图2-3所示，正常MA104细胞形状为三角形或梭形，细胞轮廓明显清晰；感染轮状病毒后的MA104细胞，细胞发生明显病变，细胞边界变得模糊，细胞间距离增大，细胞内黑色颗粒增加，最后细胞完全脱落，漂浮。

本实施例探究麦冬皂苷D对MA104细胞的毒性结果如图4所示，其中，N代表未用药组，与N组比较，#代表P＜0.05。麦冬皂苷D的药物浓度在0.4-2mM之间，对细胞均没有药物毒性且平均存活率为100％以上，表明麦冬皂苷D对细胞具有一定的生长促进作用。与N组相比，麦冬皂苷D在药物浓度为0.4和2mM时，有促细胞生长作用，且具有统计学差异(P＜0.05)。而在0.6-1.8mM时检测药物组细胞活力与N组无明显差异。因此我们选取的麦冬皂苷D的实验药物浓度为0.6-1.8mM。

实施例5

本实施例采用CCK8法检测麦冬皂苷D抗轮状病毒吸附作用的具体方法如下：

在生长至单层的MA104细胞的96孔培养板内加入药液，每个药液重复6孔，每孔100μL。阳性对照组中加入等体积的利巴韦林(Ribavirin)，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积DMEM培养液(不含血清)。37℃、5％CO2孵育2h。将药液吸出，除正常细胞对照组以外加入100TCID50的病毒(病毒与10μg/mL胰酶37℃作用30min)，每孔100μL，37℃、5％CO2孵育2h，将病毒吸出，加入细胞维持液，每孔200μL，37℃、5％CO2孵育连续观察。培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度，重复实验3次。

本实施例探究麦冬皂苷D的抗轮状病毒吸附作用结果如图5所示，其中，与Ribavirin组比较，△△代表P<0.01，△△△△代表P<0.0001。与Ribavirin组相比，麦冬皂苷D组在1.2mM、1.4mM、1.6mM下抗轮状病毒的抑制率有明显的升高，有统计学差异，但最高抑制率仅为30％左右，表明麦冬皂苷D无明显抗轮状病毒的吸附的作用。

实施例6

本实施例采用CCK8法检测麦冬皂苷D抗轮状病毒生物合成作用的具体方法如下：

将100TCID50病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30mm)加入到生长至单层的MA104-2细胞96孔培养板内，每孔100μL，之前用PBS将细胞冲洗2次。设细胞正常对照，加入等体积DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h，然后将病毒液吸出，分别加入不同浓度药液和Ribavirin，每孔100μL，设病毒对照，只加入细胞维持液，每孔100μL。37℃、5％CO2孵育连续观察。连续培养48h后，用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。

本实施例探究麦冬皂苷D的抗轮状病毒生物合成作用如图6所示。与Ribavirin组相比，各麦冬皂苷D组对轮状病毒抑制率较低，统计学比较无显著性差异，表明麦冬皂苷D无明显抗轮状病毒生物合成的作用。

实施例7

本实施例采用CCK8法检测麦冬皂苷D对轮状病毒的直接杀灭作用的具体方法如下：

将药物与100TCID50的病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30min)等体积混合作用2h。用PBS将细胞冲洗2次后将其加入到生长至单层MA104细胞的96孔培养板内。阳性对照组中将Ribavirin与轮状病毒进行与上述相同的操作，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积DMEM。37℃、5％CO2孵育2h，然后将混合液吸出，加入细胞维持液，每孔200μL，37℃、5％CO2孵育连续观察，培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，1h后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。

本实施例探究麦冬皂苷D对轮状病毒直接杀灭作用结果如图7所示，其中，与Ribavirin组比较，△△代表P<0.01，△△△代表P<0.001，△△△△代表P<0.0001。与Ribavirin组相比，麦冬皂苷D在0.8mM、1mM时对轮状病毒的抑制率分别为60.9％、65.9％，统计学比较无明显差异，表明麦冬皂苷D与Ribavirin对轮状病毒的直接杀灭活性相当；在1.2-1.8mM时对轮状病毒的抑制率明显，且在1.4mM时抑制率最强，达到79.8％，明显高于Ribavirin组，统计学比较有明显差异(P<0.0001)，表明麦冬皂苷D对轮状病毒有明显的直接杀灭作用。

实施例8

本实施例采用qPCR检测轮状病毒结构蛋白VP6基因的表达量的具体方法如下：

(1)总RNA的提取及定量

①为了进一步验证麦冬皂苷D是否对轮状病毒有直接杀灭作用，麦冬皂苷D对轮状病毒直接杀灭作用48h后，选择高、中、低药物组、Ribavirin组、N组和RV组，去上清液，PBS清洗两次，添加1ml Trizol试剂，静置5min，收集于1.5mL的无酶EP管中。向管中加入200μL的氯仿，涡旋震荡15s，后室温静置3min，离心(4℃，12000r/min，15min)，离心后的样品分三层，即无色的上层、白色中间层和红色的下层。

②小心吸取上清液至新的1.5mL无酶的EP管中(体积约500μL)，加入等体积的预冷的异丙醇，上下剧烈震荡混匀，4℃静置10min，离心(4℃，12000r/min，10min)

③离心后EP管底部可见白色沉淀，去上清保留沉淀，加入配制好的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无酶水按照3：1比例配制)1mL，摇晃混匀，离心(4℃，12000r/min，5min)，弃去上清液，室温放置15min-20min，晾干。

④晾干后向EP管中加入20μL DEPC水，轻轻吹打管壁溶解RNA。NanoDrop微量紫外分光光度计测定样品的RNA浓度后可直接用于实验或-80℃保存样品备用。

(2)mRNA的逆转录反应

①去除基因组DNA反应

在冰上按照下列成分配制反应混合液，反应体积为20μL，操作按照Evo M-MLV RTKit with gDNA Clean for qPCR II说明书进行。该实验下所用耗材皆为Axygen无酶耗材。

表1 去基因组DNA反应体系

反应条件：42℃2min

4℃

*1：RNA量可根据需要添加。在20μL反转录体系中，最多使用1μg total RNA；使用探针法时，最多使用2μg total RNA。

②反转录反应

按照下表2内容进行反应液的配制，进行反转录反应。

表2 反转录反应体系

反应条件：37℃15min

85℃5sec

4℃

(3)Real Time PCR反应

实时定量PCR的采用SYBR Green I荧光标记，检测药物组、Ribavirin组、N组和RV组的VP6表达水平，采用Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II试剂盒，内参选用GAPDH。实验用Axygen专用的Real-time PCR板，按照下列下表3-5配制实时荧光定量PCR扩增反应体系，反应液配制在冰上进行操作(反应总体系为10μL)。

表3 PCR反应体系

表4 qPCR反应条件

表5 引物序列

本实施例旨在探究麦冬皂苷D对轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响，结果如图8所示，其中，与RV组比较，*代表P<0.05，***代表P<0.001，****代表P<0.0001。由图可知，N组不表达VP6，与RV组相比，Ribavirin组VP6基因表达明显降低，有统计学差异(p<0.0001)，表明Ribavirin具有抗轮状病毒的作用。与RV组相比，检测药物组在0.6mM、1.0mM和1.4mM浓度下的VP6表达量均明显降低，有统计学差异，且存在剂量效应相关性。其中，检测药物组在1.4mM时抑制VP6的表达最为显著(p<0.0001)，但与Ribavirin组相比无统计学差异，由此表明麦冬皂苷D可通过抑制VP6的基因表达发挥抗轮状病毒的作用。

由上述实施例1-8的结果可以判定，麦冬皂苷D能够抑制轮状病毒感染MA104细胞，并且在药物浓度范围为1.2-1.8mM内的麦冬皂苷D对轮状病毒有明显的直接杀灭作用。另外，麦冬皂苷D可通过抑制结构蛋白VP6基因表达发挥抗轮状病毒的作用。上述结果表明，麦冬皂苷D能够作为活性成分，单独应用或与其它活性组分组成复方，采用药学上可接受的辅料和制剂常规方法，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液、注射剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂、半固体制剂、注射剂、乳剂或喷雾剂等各种剂型的防治轮状病毒感染药物，供临床使用。

上述的具体实施例是对本发明技术方案和有益效果的进一步说明，并非对实施方式的限定。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用，其特征在于：在所述抗轮状病毒药物中，所述麦冬皂苷D的药物浓度为0.6-1.8 mM。

3.根据权利要求1所述的麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用，其特征在于：麦冬皂苷D对轮状病毒具有直接杀灭作用。

4.根据权利要求1所述的麦冬皂苷D在制备抗轮状病毒药物中的应用，其特征在于：所述麦冬皂苷D抑制轮状病毒感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达。