CN117883431A - 瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents
瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，属于兽药技术领域。解决了现有技术中针对猪血凝性脑脊髓炎尚无特效的治疗药物的技术问题。本发明具体通过对体外猪血凝性脑脊髓炎病毒感染细胞模型和体内猪血凝性脑脊髓炎病毒感染小鼠模型试验进行研究，结果显示瑞沙托维在体内外均能直接在基因和蛋白水平上抑制猪血凝性脑脊髓炎病毒的复制，降低病毒滴度，证明瑞沙托维有显著的抗猪血凝性脑脊髓炎病毒的作用，可用于制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染新药的开发，并对药物靶标的确认有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用。
背景技术
瑞沙托维(TAK-242)是TOII样受体4(TLR4)信号的小分子选择性抑制剂，具有抗炎活性。TAK-242通过与TLR4胞内区域的Cys747残基直接结合，破坏TLR4与其衔接分子MYD88和TRIF的相互作用，进而抑制TLR4信号阻滞病原微生物诱导的NO、TNF-α、IL-6的生成。
猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitisvirus，PHEV)属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属的单股正链RNA病毒，病毒呈球形，直径70～130nm，有囊膜，囊膜表面有20～30nm的花瓣状纤突。冠状病毒在自然界中广泛存在，自从严重急性呼吸综合征(SARS)发生以来，冠状病毒性疾病新发的频率不断加快，危害程度也越来越大。PHEV与SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2同属于β冠状病毒属成员，是最早发现的感染猪的冠状病毒，也是唯一已知能够引起猪严重中枢神经系统感染的嗜神经性冠状病毒。PHEV感染引起的猪血凝性脑脊髓炎是一种急性、高度接触性传染病，根据临床表现可分为脑脊髓炎型、呕吐消耗型和流感型，三者可同时存于同一猪群，也可发生于不同猪群或地区。目前针对该病尚无特效的治疗药物和疫苗制品，因此迫切需要寻求新型的抗PHEV感染药物，为指导临床上疫病综合防控提供技术储备。
发明内容
本发明的目的是提供一种瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，本发明首次发现瑞沙托维具有抗PHEV感染的作用。
本发明实现上述目的采取的技术方案如下。
本发明提供一种瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，所述应用为以下(a1)、(a2)中的一种或两种：
(a1)瑞沙托维在制备治疗PHEV感染的药物中的应用；
(a2)瑞沙托维在制备预防PHEV感染的药物中的应用。
优选的是，所述抗PHEV感染药物是以瑞沙托维为唯一的活性成份，包含瑞沙托维的药物组合物。
更优选的是，所述药物组合物是指瑞沙托维与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
优选的是，所述抗PHEV感染药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。
优选的是，所述抗PHEV感染药物的给药途径为静脉注射型、腹腔注射型、口服给药型、雾化吸入型或脑内给药型。
优选的是，在细胞中，所述抗PHEV感染药物中瑞沙托维的浓度为1μM～20μM。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的瑞沙托维在制备抗PHEV感染药物中的应用，通过对体外PHEV感染细胞模型进行研究，结果显示瑞沙托维在1μM～20μM下能够抑制病毒在细胞中的增殖，并在病毒滴度、基因和蛋白水平上均有表现。并且瑞沙托维在无细胞毒性下对PHEV有显著的抑制效果，选择指数高。表明瑞沙托维可用于制备抗PHEV感染新药的开发，并对药物靶标的确认有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中不同浓度的瑞沙托维溶液对小鼠脑神经瘤母细胞(N2a)的活力影响。横坐标为瑞沙托维的浓度，左侧纵坐标为瑞沙托维对细胞活力的影响。
图2为本发明实施例1中在mRNA水平上，0.01μM～20μM瑞沙托维溶液在体外对PHEV感染细胞4小时的抑制效果。
图3为本发明实施例1中在mRNA水平上，0.01μM～20μM瑞沙托维溶液在体外对PHEV感染细胞24小时的抑制效果。
图4中，A为本发明实施例1中在蛋白质水平上，0.01μM～20μM瑞沙托维溶液在体外对PHEV感染细胞4小时的抑制效果；B为PHEV蛋白质水平分析图。
图5中，A为本发明实施例1中在蛋白质水平上，0.01μM～20μM瑞沙托维溶液在体外对PHEV感染细胞24小时的抑制效果；B为PHEV蛋白质水平分析图。
图6为本发明实施例1中在细胞水平上，浓度为20μM的瑞沙托维溶液孵育不同时间对PHEV的抑制效果。
图7为本发明实施例2中不同组别小鼠体重变化曲线。
图8为本发明实施例2中不同组别小鼠存活曲线。
图9为本发明实施例2中在蛋白质水平上，瑞沙托维溶液在体内对PHEV的抑制效果。
图10为本发明实施例2中在蛋白质水平上，瑞沙托维溶液在体内对PHEV的抑制效果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，可以为(a1)、(a2)中的一种或两种：
(a1)瑞沙托维在制备治疗PHEV感染的药物中的应用；
(a2)瑞沙托维在制备预防PHEV感染的药物中的应用。
上述技术方案中，抗PHEV感染药物是以瑞沙托维为唯一的活性成份，包含瑞沙托维的药物组合物，其中，药物组合物是指瑞沙托维与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
上述技术方案中，抗PHEV感染药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。需要说明的是，抗PHEV感染药物的剂型不限于此，本领域技术人员公知的其他剂型也适用于本发明。
上述技术方案中，抗PHEV感染药物的给药途径为静脉注射型、腹腔注射型、口服给药型、雾化吸入型或脑内给药型。需要说明的是，抗PHEV感染药物的给药方式不限于此，本领域技术人员公知的其他给药方式也适用于本发明。
上述技术方案中，优选在细胞中，抗PHEV感染药物中瑞沙托维的浓度为1μM～20μM。
本发明中，瑞沙托维为现有技术，化学结构式如下：
可通过商购获得。
本发明中使用的术语，一般具有本领域普通技术人员所理解的含义，除非另有说明。
以下结合实施例进一步说明本发明。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
瑞沙托维体外抗PHEV作用试验
1.1瑞沙托维的溶解和储存
称取10mg瑞沙托维(Selleck，S745501)，加入552.8μL DMSO溶液配制成50mM的瑞沙托维溶液放于-80℃保存。
1.2小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞)的培养
于液氮中取出细胞，37℃快速溶解，使用含有8wt％胎牛血清的DMEM重悬细胞，使用含有8wt％胎牛血清的DMEM培养细胞。
1.3瑞沙托维细胞毒性浓度的测定
将N2a细胞接种到96孔板中，每孔100μL细胞悬液，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待其生长至70％～80％时，将瑞沙托维用DMEM配置成不同浓度的溶液，浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM，以换液的形式将其加入96孔板中，并设置空白对照组。孵育24h后，配制含8wt％CCK-8的培养基，以换液的形式加入。培养箱内培养24h时显色，测定450nm吸光度，并计算细胞的存活率。
计算公式如下：
细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％
实验结果如图1所示。瑞沙托维浓度为0.01μM～20μM时对细胞活力无明显影响。30μM时细胞活力明显降低。
1.4瑞沙托维对PHEV感染的抑制作用
选取浓度为0.01μM～20μM的瑞沙托维溶液探索对PHEV的抑制作用，试验将从mRNA水平、蛋白质表达水平以及细胞水平进行验证。
1.4.1RT-PCR检测方法
将N2a细胞接种于12孔板中，待其生长至70％～80％时，分别以MOI为2和MOI为1进行PHEV接毒，1h后，将其中1个孔换为含有2wt％胎牛血清及最高药物浓度DMSO的DMEM溶液作为DMSO对照组、其他7个孔分别换含有0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM的瑞沙托维及含有2wt％胎牛血清的DMEM溶液作为药物组，每孔三个重复。培养箱孵育4h和24h后，提取贴壁细胞内总RNA，检测细胞内PHEVN的mRNA表达水平。
提取细胞内总RNA(RNA提取与反转录)的方法：待孵育完毕后，将上清收集，用PBS洗三次。每孔加入1mL RNAiso plus，待细胞裂解完全后，将裂解液收集到1.5mL离心管中。每管样品加200μL氯仿并用力摇晃，后冰上静置10min；待静置结束后，4℃、12000rmp离心15min，离心结束吸取400μL上层液相到1.5mL离心管内并加入400μL异丙醇，混匀后-20℃静置30min；待静置结束后，4℃、12000rmp离心10min，离心结束弃去异丙醇。再向每管样品中加入1mL 75％乙醇，混匀后4℃、12000rmp离心5min，离心结束后弃去乙醇并静置3min。每管加入20μL不含RNA酶的无核酸酶水(DEPC)溶液吹打混匀得RNA溶液并测定样品浓度。根据样品浓度进行反转录，总体系为40μL，其中Oligo(dT)18primer 4μL、5×ReverseTranscriptate M-MLV Buffer 8μL、2.5mM dNTP 8μL、RRI 1μL、M-MLV-RT 1μL、RNA4μg，剩余用DEPC溶液补齐。42℃水浴1h后70℃水浴10min得cDNA。以逆转录的cDNA为模板，进行实时荧光PCR检测。cDNA扩增反应体系为20μL：10μL SYBRGreenMix、1μL正向引物、1μL反向引物、6μL水、2μL cDNA模板。
PHEV正向引物：5′-TCTGGGAATCCTGACGAG-3′；
PHEV反向引物：5′-AGGCGCTGCAACACTTAC-3′；
GAPDH正向引物：5′-CTCAACTACATGGTCTACATGTTC-3′；
GAPDH反向引物：5′-ATTTGATGTTAGTGGGGTCTCGCTC-3′；
检测程序依次为：95℃2min；94℃15s；60℃15s，40个循环；72℃10min。
以管家基因GAPDH为对照，用2﹣△△CT分析PHEV的mRNA转录水平的变化。
试验结果如图2、图3所示，浓度为1μM～20μM的瑞沙托维对PHEV的复制有显著的抑制作用。
1.4.2 Westernblotting检测方法
将N2a细胞接种于12孔板，待细胞生长至70～80％时，依旧按照7个浓度进行接毒加药处理。待孵育完毕后，提取细胞内蛋白质，检测细胞内PHEV的蛋白质表达水平。
提取细胞内蛋白质的方法：待孵育完毕，将12孔板从细胞培养箱拿出后，使用PBS洗三次。弃去后加入1mL PBS，用细胞刮将细胞刮起，加入1.5mL离心管中，于4℃离心机中转速12000rpm离心10min，弃上清后，每管加入200μL的体积比为100:1的RIPA蛋白裂解液与蛋白抑制剂(PMSF)吹打混匀，冰上裂解30min后，于4℃离心机中转速12000rpm离心10min吸取上清液体180μL，并加入5X上样缓冲液45μL，沸水煮10min。随后使用SDS-PAGE分离蛋白样品，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，使用5wt％脱脂奶粉进行封闭，先后用一抗和二抗孵育，最后利用化学发光底物(ECL)显色。一抗使用PHEV的自制抗体，二抗使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，使用浓度为1:10000。
试验结果如图4、图5所示，浓度为1μM～20μM瑞沙托维对PHEV的复制有显著的抑制作用。
1.4.3间接免疫荧光试验检测方法
将N2a细胞接种于12孔板细胞爬片中，待细胞生长至60％～70％时，以MOI为1进行PHEV接毒1h后给药，此时药物浓度为20μM。分别在给药0h、4h、8h、12h、24h、48h时用4％多聚甲醛溶液对细胞进行固定，检测细胞水平的PHEV含量。
间接免疫荧光试验步骤：将12孔板中的营养液弃掉，用37℃预热的4wt％的多聚甲醛于室温固定10min，随后弃掉，使用-40℃预冷的甲醇于4℃冰箱固定10min。随后弃掉，PBS洗三次后，使用0.5wt％Triton X-100于室温透膜5min，PBS洗三次后，使用5wt％的脱脂奶粉于37℃封闭1h，PBS洗三次后，将爬片取出置于载玻片上标记好放于暗盒中，孵育自制PHEV-N蛋白抗体，4℃过夜。PBS洗15min后，避光孵育山羊抗兔红色荧光抗体，37℃孵育1h后，PBS冲洗15min，使用抗荧光猝灭封片剂进行封片，使用荧光显微镜观察并拍照记录。
试验结果如图6所示，瑞沙托维在不同时间段均对PHEV的复制产生显著的影响。
实施例2
瑞沙托维体内抗PHEV作用试验
2.1瑞沙托维溶液的配制、给药方式及用量：将实施例1中的瑞沙托维粉末依次溶于DMSO、PEG300、Tween 80、ddH2O溶剂中，最终各溶剂占比分别为5％、40％、5％、50％。每只小鼠腹腔注射3mg/kg/天。
2.2实验分组
3周龄BALB/c雄性小鼠分为4组，分别为空白对照组(MOCK)3只、接药组(TAK-242)3只、接毒组(PHEV)6只、接毒接药组(PHEV+TAK-242)6只。
2.3检测方法
RT-PCR检测方法：0.1g脑组织加入1mL RNAiso plus，其余操作同1.4.1。
Western Boltting检测方法：0.1g脑组织加入蛋白裂解液1mL，其余操作同1.4.2。
不同组别小鼠平均日体重变化如图7所示，MOCK组与TAK-242组小鼠平均日体重曲线基本呈持续上升趋势，PHEV组和PHEV+TAK-242组小鼠平均日体重曲线均呈现先升高后降低趋势，但PHEV+TAK-242组的小鼠较PHEV组体重增加较快，体重下降变化较小。
不同组别小鼠存活率如图8所示，MOCK组与TAK-242组小鼠未出现死亡现象，PHEV+TAK-242组小鼠较PHEV组存活时间大大延长。
PHEV组与PHEV+TAK-242组中的PHEV mRNA与蛋白质表达水平变化如图9、图10所示，与接毒组相比，接药组的PHEV mRNA与蛋白质表达水平均明显降低，表明在体内实验中，瑞沙托维能够明显抑制PHEV的复制，且能够发挥较好的防治作用。
显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述应用为以下(a1)、(a2)中的一种或两种：
(a1)瑞沙托维在制备治疗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染的药物中的应用；
(a2)瑞沙托维在制备预防猪血凝性脑脊髓炎病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物是以瑞沙托维为唯一的活性成份，包含瑞沙托维的药物组合物。
3.根据权利要求2所述的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物是指瑞沙托维与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
4.根据权利要求1所述的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。
5.根据权利要求1所述的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物的给药途径为静脉注射型、腹腔注射型、口服给药型、雾化吸入型或脑内给药型。
6.根据权利要求1所述的瑞沙托维在制备抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，在细胞中，所述抗猪血凝性脑脊髓炎病毒感染药物中瑞沙托维的浓度为1μM～20μM。
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