CN107536838A - 硝唑尼特及其活性形式替唑尼特在治疗寨卡病毒感染方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式(I)硝唑尼特及其活性形式式(II)替唑尼特类化合物，及其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，及含有此化合物的药物组合物，用于治疗寨卡病毒感染。

Description

硝唑尼特及其活性形式替唑尼特在治疗寨卡病毒感染方面的 应用

技术领域

本发明涉及下面式(I)化合物硝唑尼特以及其活性形式式(II)化合物硝唑尼特，两者的几何异构体及其药物上可接受的盐和/或两者溶剂化物和/或两者水合物，及含上述化合物的药物组合物，用于治疗寨卡病毒感染方面的用途。

背景技术

硝唑尼特(式I化合物)，化学名为邻[N-(5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰]苯酚乙酸酯(2-(acetyloxy)-N-(5-nitro-2-thiazolyl)benzamide)，是一种噻唑类药物，在上世纪七十年代首次合成(Rossignol，J.F.，Cavier，R.，1975.Synthesis and antiparasiticactivity of 2-benzamidonitrothiazoles.Chem.Abstr.83，28216n.)。硝唑尼特是一种前药，给药后在体内很快水解为其活性代谢产物替唑尼特(Tizoxanide，TIZ)从而发挥药效作用。

硝唑尼特最初作为一种口服抗寄生虫药物进行研究，在体外及不同的动物模型中均具有良好的抗原虫活性，其首次临床研究为治疗人类肠道绦虫。随后的体外及体内研究发现，其对新发原虫及隐孢子虫具有良好抑制效果。1998年，美国FDA批准硝唑尼特作为成人和一岁以上儿童感染微小隐孢子虫和贾第鞭毛虫的临床治疗药物。2006年，临床研究证实硝唑尼特可以有效治疗轮状病毒感染导致的儿童腹泻。此外，硝唑尼特也被证实对成人病毒性胃肠炎以及丙型肝炎有良好的临床治疗效果(Rossignol JF，Nitazoxanide：afirst-in-class broad-spectrum antiviral agent，Antiviral Res.2014；110：94-103.)。

近年来多项实验室研究证实，硝唑尼特具有广谱抗病毒活性，一系列实验室研究显示，硝唑尼特能够在翻译后阶段阻断流感病毒血凝素蛋白的成熟，对甲型流感、乙型流感均具有高效抑制活性。临床研究结果显示，一日两次、每次600mg、连续服用5天硝唑尼特能够有效降低普通流感的病程(Haffizulla J，Hartman A，Hoppers M，et al，Effect ofnitazoxanide in adults and adolescents with acute uncomplicated influenza：adouble-blind，randomised，placebo-controlled，phase 2b/3trial，Lancet InfectDis.2014；14(7)：609-18.)。

寨卡病毒病常见临床症状为低热、斑状丘疹、头痛、关节痛、肌痛、无力和非化脓性结膜炎。人体被蚊叮咬后通常二到七天发病，发病率约为五分之一。感染者临床症状不明显，通常持续几天至一周。重症病例需要入院治疗，少见死亡(Lucey，D.R.et al；Zikavirus infection，Pan American Health Organization/World Health Organization)。2015年5月，巴西爆发大规模寨卡病毒疫情。在此次疫情中，人们首次发现寨卡病毒与新生儿小头症以及其它胚胎中枢神经系统发育异常相关，该病毒逐步成为国际医学研究热点。寨卡病毒的主要传播媒介为埃及伊蚊，但越来越多的研究表明，寨卡病毒不但在唾液、尿液等体液中可检出，而且可长期存在于男性精液。目前已证实，寨卡病毒可以通过男传男、男传女的性传播途径进行传播。临床研究显示，孕妇在怀孕三个月左右感染寨卡，可能影响胚胎神经系统发育，造成流产、新生儿小头症以及其它新生儿神经系统发育异常疾病。目前，针对寨卡病毒感染以对症支持治疗为主，无特异抗病毒药物可用。在我国寨卡输入风险加剧的背景下，加快抗寨卡病毒药物的研发对我国有重要意义。

发明内容

本发明目的是寻找对寨卡病毒有抗病毒活性的药物，可用于寨卡病毒感染的救治。本发明通过创造性的研究发现硝唑尼特(式I)及其活性形式替唑尼特(式II)，具有保护寨卡病毒感染的细胞，抑制寨卡病毒复制方面的功能，在治疗寨卡病毒病方面具有很好的效果。

本发明提供具有式I及式II结构的噻唑类化合物，其几何异构体，及其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物或其水合物：

根据本发明，本发明化合物的可药用盐包括其无机或有机酸盐，以及无机或有机碱盐，本发明涉及上述盐的所有形式。其中包括但不限于：钠盐、钾盐、钙盐、锂盐、葡甲胺盐、盐酸盐，氢澳酸盐，氢腆酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐等。

根据本发明，式(I)、式(II)化合物可保护细胞因病毒感染所导致的细胞病变效应(CPE)，并在细胞上抑制病毒复制，减少细胞培养物中病毒核酸载量。

本发明的发明人在经过长期研究后，发现了式(I)、式(II)化合物在细胞内的一些新作用特点：

第一，式(I)、式(II)化合物在体外抗病毒实验中，可以在微摩尔级浓度下降低寨卡病毒感染的细胞CPE水平；

第二，式(I)、式(II)化合物可以在微摩尔级浓度下降低寨卡病毒感染的细胞病毒核酸载量水平；

本发明还涉及含有式(I)、式(II)化合物及其药学上可接受的盐和/或其药物上可接受的溶剂化物或其水合物和药物上可接受的载体的药物组合物。该药物组合物可以经多种途径施用，例如口服片剂，胶囊，粉剂，口服液，注射剂和透皮制剂。根据常规的药物上的惯例，药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加剂。典型的药学上可接受的载体包括例如微晶纤维素、淀粉、交连聚维酮、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖醇，柠檬酸，十二烷基磺酸钠或硬脂酸镁等。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物至少一种药学上可接受的载体。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。

附图说明

图1.替唑尼特和硝唑尼特有效保护寨卡病毒感染的vero细胞CPE。(a)硝唑尼特在不同浓度下，能够对寨卡病毒感染细胞之后的CPE产生有效保护，且抑制率与给药剂量之间具有量效关系。(b)替唑尼特在不同浓度下，能够对寨卡病毒感染细胞之后的CPE产生有效保护，且抑制率与给药剂量之间具有量效关系。

图2.替唑尼特和硝唑尼特有效降低寨卡病毒感染的vero细胞中病毒核酸载量。(a)硝唑尼特和替唑尼特在细胞感染寨卡病毒80h后能够抑制细胞中的病毒载量，其中10μM的药物浓度可完全抑制病毒在细胞中的增殖。(b)10μM的硝唑尼特在细胞感染后不同时间检测，均可观察到对病毒的抑制活性。(c)10μM的替唑尼特在细胞感染后不同时间检测，均可观察到对病毒的抑制活性。(d)不同浓度的硝唑尼特和替唑尼特在单独对受试细胞处理80h，观察不到细胞毒性。

具体实施方式

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。

实施例1：硝唑尼特和替唑尼降低寨卡病毒感染细胞CPE实验

本发明中用到的实验材料和实验方法：

(1)细胞培养和细胞系

实验过程中所用非洲绿猴肾细胞(Vero)为本室保存，来源及传代次数明确。细胞培养于37℃，5％CO₂的湿度饱和细胞培养箱中。通常按1∶3-1∶6传代，培养过程中每48h换液一次，约2-5天(细胞铺满单层)用0.25％的EDTA胰酶消化2min进行传代。细胞生长所用完全培养基为添加10％FBS和青链霉素双抗的DMEM高糖培养基，维持培养基为添加2％FBS和青链霉素双抗的DMEM高糖培养基。

(2)细胞活力检测

细胞活力用Luminescent Cell Viability Assay测定。铺满瓶底的Vero细胞在0.25％EDTA胰酶消化后用完全培养基重悬，制备单细胞悬液，计数后以每孔10000细胞的密度接种96孔板，在37℃、湿度饱和的5％CO₂条件下培养24小时。用维持培养基稀释ZIKA病毒原液，加入96孔板，使其终浓度为100TCID50；同时，将硝唑尼特和替唑尼特用维持培养基倍比稀释加入96孔板，其终浓度分别为10μM，3.3μM，1.1μM，0.3μM，0.1μM，0.03μM，0.01μM和0.003μM，设置细胞对照组和病毒对照组。处理80h后弃上清，每孔加入用PBS缓冲液2倍稀释的Luminescent Cell Viability检测液，避光震荡裂解5min，静置3min，最后用Molecular Devices M5酶标仪测定荧光信号强度。药物保护细胞CPE的抑制率计算公式为：

实施例2：硝唑尼特和替唑尼特降低寨卡病毒感染的细胞病毒核酸载量实验

(1)药物处理

用2％细胞维持液将ZIKA病毒稀释成相应浓度，然后加入6孔板中使每孔含有病毒量为100TCID50，再用2％细胞维持液将硝唑尼特和替唑尼特分别稀释成相应浓度，加入到对应的孔中，使药物最终浓度分别为10μM、1μM和0.1μM，然后放37℃、5％CO2孵箱孵育2小时，弃培养液，每孔加入2ml2％细胞维持液继续培养不同时间h，细胞对照组只加2％细胞维持液。

(2)RNA提取

1)板中每孔加入350μL Buffer RLT，用移液枪吹吸混匀使其充分裂解后，转移到无核酸酶EP管中，离心取上清；

2)加入等体积的70％乙醇，混匀；

3)将上述混合液转入无RNA酶的离心柱中，12000rpm离心15s，弃废液；

4)加入700μL Buffer RW1，12000rpm离心15s，弃废液；

5)加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心15s，弃废液；

6)加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心2min，弃废液；

7)换新的无RNA酶的2ml收集管，12000rpm离心1min，使滤柱干燥；

8)换上新的1.5ml收集管，每管加入50μl不含RNA酶的水，12000rpm离心2min，洗脱液即含有相应的RNA，加入RNA酶抑制剂，用Nano Drop检测各RNA浓度。

(3)RNA反转录

实验采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser，货号RR047Q)进行RNA反转录，步骤如下。

①gDNA去除：收集各实验组RNA样品，分别取1μg进行反转录。首先，向各实验组RNA中加入2μl 5×gDNA Eraser Buffer，用RNase Free水补足反应体系至10μl，充分混匀，42℃水浴2min去除样品中可能存在的g DNA；

②逆转录：向①所得样品中加入适量的酶和引物Mix及反应缓冲液，用RNase Free水补足体积至20μl，37℃水浴反应15min，之后投入85℃水中5sec，既可转录得到cDNA。

(4)Real-time PCR

Real-time PCR采用TaKaRa公司生产的实时定量PCR试剂盒(货号RR820Q)进行，步骤如下：

①以β-actin为内参基因调整PCR反应过程中所加cDNA浓度：取步骤(3)所得cDNA，设置系列浓度梯度分别为原液、10倍稀释液、20倍稀释液、50倍稀释液和100倍稀释液，加入10μl 2×SYBR Premix Ex Taq II及β-actin引物(反应体系为20μl)进行Real-time PCR反应，扩增条件为：40个循环，95℃10s，60℃30s，取Cp值在15-16之间的cDNA浓度进行后续操作；

②cDNA用量确定后，检测样品中ZIKARNA载量，条件同上，实验完成后用2^-ΔΔCT法计算细胞上清病毒核酸载量。实验过程中所用引物序列如下(均为5’-3’方向表示)：

ZIKV-ASF：GGTCAGCGTCCTCTCTAATAAACG

ZIKV-ASR：GCACCCTAGTGTCCACTITITCC

β-actin-F：TGTCCACCTTCCAGCAGATGT

β-actin-R：AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA

(3)药物对细胞毒性测试

药物对细胞毒性的检测利用Luminescent Cell ViabilityAssay测定。铺满瓶底的Vero细胞在0.25％EDTA胰酶消化后用完全培养基重悬，制备单细胞悬液，计数后以每孔10000细胞的密度接种96孔板，在37℃、湿度饱和的5％CO₂条件下培养24小时。将硝唑尼特和替唑尼特用维持培养基倍比稀释加入96孔板，其终浓度分别为100μM，50μM，30μM，10μM，1μM，0.1μM，设置细胞对照组。处理80h后弃上清，每孔加入用PBS缓冲液2倍稀释的Luminescent Cell Viability检测液，避光震荡裂解5min，静置3min，最后用Molecular Devices M5测定荧光信号强度。

Claims (4)

1.具有通式I、通式II的化合物，其几何异构体及其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，在治疗寨卡病毒感染及寨卡病毒引起新生儿神经系统发育异常疾病中的用途。

2.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的式I和/或式II化合物、其可药用盐、其异构体、其水合物或溶剂合物，

优选地，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料，具体地，所述药物组合物为固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂、或复方制剂。

3.权利要求2的药物组合物或权利要求1所述的化合物、其可药用盐、其异构体、其水合物或溶剂合物在制备在制备寨卡病毒引起的病毒感染性疾病(如小头症、新生儿神经系统发育异常疾病)的药物中的用途。

4.一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防疾病的方法或者在有需要的哺乳动物中抑制寨卡病毒的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的权利要求3的药物组合物或权利要求1所述的化合物、其可药用盐、其异构体、其水合物或溶剂合物，其中所述的疾病包括寨卡病毒引起的病毒感染性疾病。