CN111265527B - 萘酚喹及其药学上可接受的盐在制备抗冠状病毒药物中的用途 - Google Patents

Abstract

萘酚喹及其药学上可接受的盐在制备抗冠状病毒药物中的用途。本发明提出了萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途，具体地，是以萘酚喹、其药学上可接受的盐作为活性成分用于抗多种冠状病毒，尤其用于抗新型冠状病毒。

Description

萘酚喹及其药学上可接受的盐在制备抗冠状病毒药物中的 用途

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及萘酚喹及其药学上可接受的盐和含有萘酚喹或其药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途。

背景技术

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。迄今为止，除本次在引起病毒性肺炎暴发疫情的新的冠状病毒外，共发现6种可感染人类的冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV)。其中，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)曾造成严重的社会影响。新型冠状病毒性肺炎疫情自2019年12月爆发以来，全国确诊病例已达80000例以上，死亡人数在2000例以上。寻找能够有效控制抗新型冠状病毒的药物已经迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有有效抗冠状病毒的药物。

根据本发明的一个方面，本发明提出了萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途。现已知萘酚喹的磷酸盐对各种疟原虫裂殖体及一些种株疟原虫配子体和组织期疟原虫有杀灭作用，适用于恶性疟、间日疟和抗药性疟疾等的治疗。而且目前尚未见有关萘酚喹在抗其他病毒方面的研究报道。介于目前新型冠状病毒在全球范围内的迅速传播，如何提高治愈率和更好的防控疫情扩散是当前科研攻关的重中之重。发明人认为“老药新用”是可以满足当前疫情防控迫切需求的最快捷新冠肺炎防治药物研发策略。并通过大量的研究发现萘酚喹在体外对新冠病毒具有较好的抑制作用。

另外，根据本发明上述实施例的萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途。

在本发明的一些实施例中，所述萘酚喹药学上可接受的盐为选自萘酚喹的磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐、马来酸盐等中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述冠状病毒为选自2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述组合物的剂型为选自片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。

附图说明

图1显示了磷酸萘酚喹和氯喹在Vero细胞上抑制病毒感染的定量RT-PCR检测结果。

图2显示了磷酸奈酚喹在Vero细胞上抑制病毒感染的定量RT-PCR检测结果。

图3为NPQ(磷酸萘酚喹)抗冠状病毒的CPE药效(Huh7细胞)。

图4为NPQ(磷酸萘酚喹)抗冠状病毒的CPE药效(H460细胞)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提出了萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途。现已知萘酚喹的磷酸盐对各种疟原虫裂殖体及一些种株疟原虫配子体和组织期疟原虫有杀灭作用，适用于恶性疟、间日疟和抗药性疟疾等的治疗。而且目前尚未见有关萘酚喹在抗其他病毒方面的研究报道。介于目前新型冠状病毒在全球范围内的迅速传播，如何提高治愈率和更好的防控疫情扩散是当前科研攻关的重中之重。发明人认为“老药新用”是可以满足当前疫情防控迫切需求的最快捷新冠肺炎防治药物研发策略。并通过大量的研究发现萘酚喹在体外对新冠病毒具有较强的抑制作用，进而可以用于制备抗冠状病毒药物，并用于治疗新冠肺炎。

根据本发明的具体实施例，萘酚喹(式1)药学上可接受的盐为选自磷酸萘酚喹(式2)、盐酸萘酚喹(式3)、硫酸萘酚喹(式4)和马来酸萘酚喹(式5)中的至少一种。

根据本发明的具体实施例，萘酚喹(式1)药学上可接受的盐优选为磷酸萘酚喹。磷酸萘酚喹是军事医学科学院微生物流行病研究所于上世纪90年代研发的4-氨基喹啉类抗疟药，具有口服吸收速度快、生物利用度高，生物半衰期长等特点，1993年获得国家新药证书，并于1995和1996年分别获得军队科技进步一等奖和国家发明二等奖。因此，磷酸萘酚喹自研发获得新药后一直作为抗疟药使用。鉴于目前冠状病毒的迅速传播扩散，导致全球范围内的新冠肺炎疫情及其严重。发明人通过大量的实验尝试，意外地发现始终用于抗疟的磷酸萘酚喹对新型冠状病毒具有较强的抑制作用。基于磷酸萘酚喹作为抗疟药具有较高的口服生物利用度，且在动物实验中表现的更佳耐受性和更小毒副作用，发明人认为磷酸萘酚喹将是目前新冠肺炎紧急试验性用药的一个选择。

根据本发明的具体实施例，本发明通过采用核酸定量法测定磷酸萘酚喹在细胞水平抑制新型冠状病毒(2019-nCoVBetaCoV/Beijing/AMMS01/2020)显著效果，其EC₅₀为2.0μM。而目前临床上推荐采用的抗新型冠病毒药氯喹的EC₅₀为5.8μM。显然，磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-nCoV新型冠状病毒的抑制作用显著优于氯喹。

根据本发明的另一个具体实施，发明人还进一步研究了磷酸萘酚喹在其他冠状病毒中的作用，发现磷酸萘酚喹不仅对2019-nCoV有抑制作用，对HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV也具有一定的抑制作用。因此，磷酸萘酚喹不仅可以用于目前新冠肺炎的治疗，还可以用于治疗和预防由HCoV-229E和HCoV-OC43感染引起的呼吸道疾病、SARS-CoV感染引起的急性呼吸道传染病以及MERS-CoV感染引起的中东呼吸综合征。

根据本发明的具体实施例，上述新型冠状病毒药物的进行可以是片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。

另外，由于新型冠状病毒传播迅速，截至2020年3月5日9时，全国累计报告确诊病例80565例，累计死亡病例3015例，累计治愈出院52109例，现有疑似病例522例，并且已经在全球范围内大量蔓延。而磷酸萘酚喹被发现具有抗新型冠状病毒(2019-nCoV)的作用，并且基于磷酸萘酚喹已作为成熟的抗疟用药和目前对有效抗新型冠状病毒药物的迫切需求。发明人认为，可以依据磷酸萘酚喹抗疟的临床研究结果推测其用于抗新型冠状病毒的安全性，进而为磷酸萘酚喹用于治疗新冠肺炎提供支持。

具体地，参照《疟疾抑制性治疗药物磷酸萘酚喹新药临床研究申请资料》，1987年，科研档案A948，军事医学研究院微生物流行病研究所科技档案室。具体内容如下：磷酸萘酚喹I期临床研究中，25名健康男性成人24小时内口服总量≤1.4g(剂量以萘酚喹碱基计，后同)耐受性良好，个别受试者于药后感上腹饱胀，腹部听诊肠鸣音轻度无进，无需处理，不影响食欲，药后2-4小时自行消失。研究期间血压、呼吸、脉搏在正常范围内，X-线胸透、眼底及心电图无明显变化，血液学及尿分析均未见异常，血液生化检查1.2g(n＝6)和1.4g(n＝2)给药各有1例于药后7天和14天血浆GPT和GOT升高，均于1-2周内恢复正常，其余指标无明显改变。在恶性疟临床治疗的剂量探索研究中成人24小时内口服1.0g(首剂0.6g，24小时0.4g)，30例未见明显的药物相关不良反应，如腹痛、腹泻、过敏、耳聋、耳鸣和视觉异常等。磷酸萘酚喹单药成人日剂量1.0g，给药一天在4个独立恶性疟治疗临床试验中，共计317例未见明显不良反应和实验室检查指标异常，68例5-14岁儿童(剂量据成人剂量按年龄递减)亦未见明显不良反应。成人单次口服0.6g治疗间日疟治疗临床试验成人单次口服0.6g 92例，4-14岁儿童按年龄剂量递减24例未明显明显不良反应。此外，成人剂量0.4或0.5g(儿童按年龄递减)顿服用于疟疾预防的临床试验312例亦无不良反应报告。

已有磷酸萘酚喹单药(成人首剂0.6g，24小时0.4g，总剂量1.0g)、联合用药或复方(萘酚喹总剂量通常为成人0.4g顿服)用于疟疾治疗的临床报道未发现有严重不良反应，临床病例常见有头痛、头晕、食欲不振、恶心呕吐、腹泻、乏、力周身不适等轻度反应，无需处理，通常可于治疗后随体温恢复和原虫转阴而相继缓解并消失。部分病例有服药后腹部不适、腹胀或皮肤瘙痒，可能与药物有关，但同样可在停药后自行消失。实验室检查尚未发现具有临床显著意义和药物相关的血液学、尿与心电图检测指标异常，血液生化检测除血浆转氨酶的轻度升高较为常见外，无其它异常指标报道，考虑到疟疾患者本身可能存在肝损伤状况且治疗后7-14天内可恢复至正常范围，这种血浆转氨酶的轻度升高应无临床意义。

疟疾高发地区季节性疟疾预防的研究中，海南与云南地区磷酸萘酚喹成年人0.4或0.5g顿服，14岁以下儿童依年龄剂量递减，共计14211人次服药，仅1人出现药后皮肤瘙痒，85人空腹服药出现头痛或头晕，未见其它不良反应，东南亚地区成年人200或400mg萘酚喹与等剂量阿奇霉素顿服未发现任何与药物相关的不良反应。

在巴布新几内亚开展的复方萘酚喹治疗儿童疟疾的临床研究提示了更高剂量磷酸萘酚喹临床应用的安全性。在一项48例5-12岁儿童患者的研究中，给予含萘酚喹最高9mg/kg/day的复方萘酚喹2天(相当成人总剂量1.08g)未发现具有临床意义的脉搏、血压、QTc或常规生化与血液学指标改变及听力改变。另一项0.5-5岁儿童疟疾患者复方萘酚喹和复方蒿甲醚对比随机试验中，青蒿素与8mg/kg/day萘酚喹连续3天治疗组(相当成人总剂量1.44g)较复方蒿甲醚治疗组多见的不良反应仅有轻度及短暂的腹痛，血流动力学、血液学或生化指标未见显著差异，QTc值在最后一次服药后4小时后较基线值略有上升，但多数可在第7天恢复，且在随访中未发现心率失常、呼吸困难或晕厥及其它暂态神经系统事件，无后续临床后果。入组病例治疗后6个月的随访研究未发现两组患者非疟疾发病有显著差异，表明无萘酚喹相关的晚发型毒性。

总体而言，口服磷酸萘酚喹临床常见不良反应较为轻微，与疟疾发作时常见症状无法区别，且多数无需处理，可随疾病治疗缓解并消失，应与药物无关。相比磷酸氯喹(目前临床推荐使用的抗新型冠状病毒药物)已明确的临床毒副反应，迄今上万例磷酸萘酚喹单药或复方治疗患者中未见有类似药物相关的低血压、心率不齐、心衰等严重心脏副反应，临床偶见QT间期延长不具显著意义，除1例风湿性心脏病患者服药前QT间期延长经磷酸萘酚喹抗疟治疗后未恢复正常，无需处理可在药后7-14天恢复正常。其余如低血糖、视网膜损伤、急性锥体外反应、骨骼或神经肌无力、皮肤病恶化等均未见有报道。这与动物毒性研究中磷酸萘酚喹除肝脏毒性外，总体毒性低于氯喹的结果相符。实验室检查常见有一过性的血浆转氨酶升高，多数可在7-14天内恢复正常，未见血糖水平异常，溶血或其它血液学反应的报道，虽然动物研究显示磷酸萘酚喹的肝脏毒性大于磷酸氯喹，但临床观察未发现有重于后者的肝脏毒性表现。这表明在现行临床应用剂量下，磷酸萘酚喹的安全性要优于氯喹。

进一步地，根据磷酸萘酚喹的药代动力学数据结果，磷酸萘酚喹具有较高的生物利用度(96.4％)，进而也可以判定，其用于抗冠状病毒尤其是新型冠状病毒的也将具有较高口服生物利用度。

具体地，参照现有的磷酸萘酚喹的药代动力学实验和结果，磷酸萘酚喹口服快速、完全地通过胃肠道吸收，并以较快速度地向组织分布，清除速度较慢，半衰期较长。健康成人单次口服磷酸萘酚喹可在2～4小时血药浓度可达峰值，相对生物利用度为96.4％，以药后120小时为采样终点，空腹和半空腹半衰期为41和57小时，以药后216小时为采样终点，半衰期达250-300小时，以药后720小时为采样终点，半衰期可达529.19±212.36(359.73-1125.43)小时，主要参数详见下表。药后1小时起血球药物浓度高于血浆，药后4-120小时，血球药物浓度为血浆的2.4-5.4倍，并趋动态平衡。人血浆蛋白结合率为95.36±6.14％。

表1单次口服磷酸萘酚喹主要药代动力学参数

a抗疟新药磷酸萘酚喹申请新药证书申报资料(下)》，1995年，科研档案95-054-02，军事医学研究院微生物流行病研究所科技档案室

b Qu HY,Gao HZ,Hao GT,Li YY,Li HY,Hu JC,et al.Single dose safety,pharmacokinetics,and food effects studies of compound naphthoquine phosphatetablets in healthy volunteers.J Clin Pharmacol.2010；50(11):1310–8.

c 高洪志 郝光涛 李海燕 陈其格 张丽娟 刘伟丽 胡锦超 王晓芳.复方萘酚阿奇片在中国健康成年受试者药代动力学研究.复方萘酚阿奇片新药申请资料，临床研究资料项32临床研究试验报告.2009.

根据本发明的实施例，本发明还提出了一种含有萘酚喹或者萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途，根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面实施例所述的萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐。当本发明的萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐以药物的形式施用于哺乳动物，例如人时，其可以以萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐本身的形式被给予或者可以以含有例如0.1至99.5％(更优选0.5至90％)活性成分以及药学可接受的载体的药物组合物的形式被给予。并且基于前面磷酸萘酚喹对新型冠状病毒的较强抑制作用，因此利用含有其的药物组合物制备得到的抗冠状病毒药物仍具有较强的抑制冠状病毒作用。

根据本发明的具体实施例，发明人还发现，上述实施例的含有萘酚喹或所述萘酚喹药学上可接受的盐的药物组合物不仅对新型冠状病毒(2019-nCoV)具有较强的抑制作用，其对HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV也具有一定的抑制作用。因此，该药物组合物不仅可以用于目前新冠肺炎的治疗，还可以用于治疗和预防由HCoV-229E和HCoV-OC43感染引起的呼吸道疾病、SARS-CoV感染引起的急性呼吸道传染病以及MERS-CoV感染引起的中东呼吸综合征。

定义或一般术语

本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977.所记载的。本发明的萘酚喹的药学上可接受的盐包括但不限于磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐、马来酸盐。

简单地讲，药物组合物可以通过有效成分与药学上可接受的载体制备得到。

措辞“药学可接受的载体”在本领域中是公认的，包括适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。所述载体包括参与携带主题物质或将其从一个器官或机体的一部分转移到另一个器官或机体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。各载体在与制剂中的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中所用的其它无毒的可相容的物质。

实施例1、磷酸萘酚喹对新型冠状病毒的抑制作用

1)实验目的

评价磷酸萘酚喹在细胞水平抑制2019-nCoV新型冠状病毒的抑制效果。

2)主要实验材料

磷酸萘酚喹(批号：170301-1)由四川自豪时代药业有限公司提供。

磷酸氯喹(批号：BCBJ1498V)Sigma公司。

Vero细胞由军事医学研究院微生物流行病研究所病毒学研究室保存。

新型冠状病毒北京分离株(2019-nCoV BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020)由军事医学研究院微生物流行病研究所病毒学研究室保存

3)实验方法

(1)采用MTS法测定药物的TD₅₀，具体如下：Vero细胞按10000/孔浓度接种到96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂培养过夜，待细胞长满单层加入含不同浓度药物的2％FBSDMEM维持液100μl/孔，每个浓度测3～4个复孔。继续培养，每天显微镜下观察细胞状态。直至加药第4天，加入20μl MTS溶液，37℃孵育1小时，测定OD490值。

(2)采取核酸定量法测定药物的EC₅₀。提前一天将Vero细胞以40000/孔浓度接种48孔板。吸弃细胞培养上清，加入不同浓度的磷酸萘酚喹(200μl/孔)，每个药物3复孔，37℃预处理1h，然后每孔补加100TCID₅₀病毒液，并设立阳性药物对照(磷酸氯喹)、病毒对照和正常细胞对照组，放置37℃5％CO₂孵箱培养。吸弃病毒液，加入含不同浓度药物的2％FBS DMEM维持液(200μl/孔)，放置37℃5％CO₂孵箱培养，每天观察细胞病变(CPE)。在感染后2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量RT-PCR检测病毒载量。

(3)选择指数SI＝TD₅₀/EC₅₀。

4)实验结果

首先，MTS法测定了不同浓度的磷酸萘酚喹对Vero细胞的细胞毒性。并计算药物的最大无毒浓度TD₀和半数中毒浓度(TD₅₀)(图1)。结果显示，磷酸萘酚喹对Vero细胞的TD_50＝13.5μM。

然后，采用核酸定量法测定磷酸萘酚喹在细胞水平抑制2019-nCoV新型冠状病毒的抑制效果，并计算药物的EC₅₀。结果显示，磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-nCoV新型冠状病毒具有抑制作用，其EC₅₀为2.0μM(图2)。最终，根据CC₅₀和EC₅₀，计算出磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-nCoV新型冠状病毒的选择指数SI＝6.75。并且从图2中可以看到，阳性药物对照(磷酸氯喹)在细胞水平对2019-nCoV新型冠状病毒具有抑制作用，其EC₅₀为5.8μM。显然，磷酸萘酚喹在细胞水平对2019-nCoV新型冠状病毒的抑制作用显著优于氯喹。进一步结合磷酸萘酚喹具有较高的临床安全性和较高的生物利用度，磷酸萘酚喹可以安全地有效地用于抗击新型冠状病毒，进而用于治疗新冠肺炎。

实施例2磷酸萘酚喹与磷酸氯喹动物毒性的比较^#

经口单次给药磷酸萘酚喹对小鼠和大鼠的半数致死剂量(LD₅₀)分别为磷酸氯喹的2.2和1.6倍，对狗的近似致死剂量和最大耐受剂量是磷酸氯喹的两倍(表2)。

表2磷酸萘酚喹与磷酸氯喹动物单次经口给药毒性剂量的对比

^#剂量按碱基量计算，包括下文所述剂量

^a 10次重复实验，^b 4次重复实验，^c单次实验，剂量为计算值[95％可信区间]

连续给药14天，磷酸萘酚喹对大鼠毒性的表现与磷酸氯喹基本相同，但在高剂量组(80mg/kg/day)中，氯喹给药动物中毒表现较磷酸萘酚喹更为严重，且出现半数以上动物死亡(萘酚喹给药动物仅有1只动物死亡)。组织病理检查，除肝损伤程度和发生率更高外，磷酸萘酚喹对其它脏器的损伤程度与发生率都低于磷酸氯喹，尤其以心肌损伤的差别最为明显。磷酸萘酚喹仅高、中剂量(80和40mg/kg/day)可见轻度心肌变性，而氯喹给药动物心肌损伤严重，甚至有肌溶性和崩解性心肌坏死，并且低剂量组(20mg/kg/day)仍有心肌损伤。停药恢复28天后，磷酸萘酚喹除高剂量组动物肝、肾损伤仅见好转未完全恢复外，其余组织损伤皆可完全恢复，而磷酸氯喹动物心、肾损伤仅低剂量组动物得以完全恢复。

磷酸萘酚喹20、10和5mg/kg/day连续灌胃14天动物食量、体重、肛温、呼吸和心率等未见异常，但20和10mg/kg/day剂量给药动物在给药后6-11天出现不同程度的后肢或全身震颤，持续4-9天，停药后自行缓解，恢复正常。心电图查，除10mg/kg/day以上剂量组动物有药后QT间期延长，其余未见明显改变。化验检查，除20mg/kg/day组动物药物7、14天血浆转氨酶升高，10mg/kg/day组动物转氨酶升高但在正常范围内，血液学和血液生化其余各项指标均未见明显改变。骨髓和眼底检查未见有异常改变。病理检查20mg/kg/day给药动物可见明显肝脏损伤，其余未见药物相关的病理改变。停药28天的恢复期检查，各剂量组动物各项指标均未见异常改变，肝脏病理改变亦已恢复正常。

与磷酸氯喹相比，狗经口给予15mg/kg/day磷酸萘酚喹，连续14天，6只动物中2只出现较明显的中毒症状，化验检查除在给药14天时有GOT轻度升高，其余血液生化、尿检查各项指标和心电检查均未见异常，GOT升高停药14天可恢复正常，病理检查有轻度肝损伤。而磷酸氯喹相同剂量给药，6只动物在第2次给药、第3次给药和第8次给药后先后全部死亡。

结论：由此可见，磷酸萘酚喹对动物的急性毒性和长期毒性均小于磷酸氯喹，其临床应用的安全剂量范围应可大于磷酸氯喹。

实施例3

1、实验目的

为研究NPQ(磷酸萘酚喹)在体外抗冠状病毒的药效，拟用细胞病变效应(CPE)实验测定NPQ对Huh7和H460细胞的细胞毒性(TC₅₀)，以及对冠状病毒(HCoV-229E和HCoV-OC43)的半数抑制浓度(IC₅₀)及SI。采用利巴韦林(RBV)作为阳性对照药物，并以磷酸氯喹(CQ)为参考药物。

2、材料

供试品：NPQ(磷酸萘酚喹)，为四川自豪时代药业有限公司产品，由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所提供；9.1.2批号：170301-1；理化性质：淡黄色结晶性粉末；保存条件：4℃。

阳性对照药：利巴韦林注射液，购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司；批号为31712252；规格为100mg/ml；用时稀释至所需浓度；4℃冰箱保存。磷酸氯喹：Sigma公司产品；批号BCBJ1498V；由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所提供。

细胞：传代人肝癌细胞Huh7细胞和人肺癌细胞H460细胞均为本室传代保存，在含10％胎牛血清(inactivated fetal bovine serum)和1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。2-3天传代一次。

毒株：HCoV-229E于Huh7.5细胞中传代，保存于-80℃冰箱。HCoV-OC43于HCT-8细胞中传代，保存于-80℃冰箱。

试剂：DMEM液体培养基、胎牛血清(fetal bovine serum)、青霉素和链霉素溶液(penicillin-streptomycin)、PBS(PH＝7.4)和0.25％Trypsin-EDTA均购自Invitrogen公司。

实验用品及仪器：细胞培养瓶、96孔培养板和移液管为美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱(Model 3111)为美国Thermo公司产品；生物安全柜为美国NUAIRE公司产品；倒置显微镜，奥林巴斯公司产品；真空泵为INTEGRA Biosciences公司产品；12道移液器和单道移液器为Eppendorf产品。

3、实验方法

细胞培养：以H460细胞为例：在长满H460细胞的培养瓶内加0.25％Trypsin-EDTA3ml，37℃消化1～2分钟，弃消化液，加培养液吹打，1:3传代，2-3天传代一次，种板时配制成每毫升15万个细胞，接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO₂培养过夜，细胞长成单层后进行实验。

抗HCoV-229E的活性测定(CPE法)

实验在传代Huh7细胞中进行，Huh7细胞1.5×10⁴个/孔接种于96孔板中，过夜培养后将100TCID₅₀ HCoV-229E病毒液感染96孔板内Huh7细胞，待测药物用维持液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个剂量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(公式如下)及选择指数(SI＝IC₅₀/TC₅₀)。

其中：A＝累积抑制率<50％的药物浓度，B＝累积抑制率>50％的抑制率，C＝累积抑制率<50％的抑制率，D＝log稀释倍数

抗HCoV-OC43的活性测定(CPE法)

实验在传代H460细胞中进行，细胞以1.5×10⁴个/孔接种于96孔板中，过夜培养后将100TCID₅₀ HCoV-OC43病毒液感染96孔板内细胞，待测药物用培养液液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个剂量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(公式如下)及选择指数(SI＝IC₅₀/TC₅₀)。

其中：A＝累积抑制率<50％的药物浓度，B＝累积抑制率>50％的抑制率，C＝累积抑制率<50％的抑制率，D＝log稀释倍数。

CPE评价标准：以细胞死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％～100％)、3+(细胞死亡比例50％～75％)、2+(细胞死亡比例25％～50％)、1+(细胞死亡比例0～25％)、0+(细胞全部存活)。

统计方法：用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)，并计算选择指数(SI＝TC₅₀/IC₅₀)。

4、实验结果

(1)药物对细胞毒性

在Huh7细胞中，1.5×10⁴个/孔浓度时，CPE法测定NPQ的半数有毒浓度(TC₅₀)为6.97±3.75μg/ml；阳性对照药RBV半数有毒浓度TC₅₀为100μg/ml；磷酸氯喹(CQ)半数有毒浓度TC₅₀为37.02±18.36μg/ml。

在H460细胞中，1.5×10⁴个/孔浓度时，CPE法测定NPQ的半数有毒浓度(TC₅₀)为>50±0μg/ml；阳性对照药RBV半数有毒浓度TC₅₀为77.61±0μg/ml；磷酸氯喹(CQ)半数有毒浓度TC₅₀为>50±0μg/ml。

(2)在Huh7细胞内对HCoV-229E毒株的抑制作用

如表3和图3所示，在Huh7细胞中，CPE法测定NPQ的TC₅₀为6.97±3.75μg/ml，其对HCoV-229E毒株的IC₅₀为1.24±0.87μg/ml，选择指数SI为5.6；RBV的TC₅₀为100μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为3.77±1.36μg/ml，选择指数SI为26.5；CQ的TC₅₀为37.02±18.36μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为4.51±3.75μg/ml，选择指数SI为8.2。

表3：药物在Huh7细胞内HCoV-229E的抑制作用(IC₅₀)(CPE法)

(3)在H460细胞对HCoV-OC43毒株的抑制作用

如表4和图4所示，在H460细胞中，CPE法测定NPQ的TC₅₀为>50±0μg/ml，其对HCoV-OC43的IC₅₀为3.53±0.45μg/ml，选择指数SI为>14.2；RBV的TC₅₀为77.61±0μg/ml，其对HCoV-OC43的IC₅₀为5.06±1.92μg/ml，选择指数SI为15.3；CQ的TC₅₀为>50±0μg/ml，其对HCoV-OC43的IC₅₀为1.63±0.31μg/ml，选择指数SI为>30.7。

表4：药物在H460细胞内对HCoV-OC43的抑制作用(IC₅₀)(CPE法)

5、结论

本实验条件下，NPQ对HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变CPE均有抑制作用；阳性对照药RBV和CQ对HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变CPE均有抑制作用。在本实验条件下，NPQ具有明确的体外抗冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43活性。RBV的抗冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43活性与文献和本实验之前的结果相当，说明实验系统成立。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.萘酚喹、所述萘酚喹药学上可接受的盐、含有所述萘酚喹或者所述萘酚喹药学上可接受盐的组合物在制备抗冠状病毒药物中的用途，所述冠状病毒为选自2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萘酚喹药学上可接受的盐为选自萘酚喹的磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐、马来酸盐等中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的剂型为选自片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。

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